CN101018803A - 肽合成法 - Google Patents

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Abstract

发明了一种新的酰胺化肽的C－末端羧基的方法，该方法避免了不希望的C－末端氨基酸的α－碳差向异构，产生酰胺化肽的非对映异构变体。

Description

肽合成法
本发明涉及药用多肽领域，即涉及增强这种肽生物活性的各种化学衍生方法。发明了通过化学方法酰胺化多肽C-末端的方法。
已经清楚小肽药物是一类重要且有用的药物活性成分。例如，抗感染肽尤其是阳离子肽—US2003/0219854A1发明了它的工业生物技术制造方法—是一类新的广谱抗微生物物质，它可帮助抵抗病原微生物中多药物抗性向标准抗生素迅速传播。
天然存在的抗感染肽包括翻译后修饰，如C-末端酰胺化，这对于持续的生物活性极为重要(Boman，Immunol.Rev.173：5，2000)。例如，C-末端酰胺化除去了潜在的电荷并进一步防止被普遍存在的外肽酶迅速降解。尽管完全化学合成可以在合成过程中适当引入C-末端酰胺官能团(amidfunction)(例如，Han等，J.Org.Chem.1996，61，6326-6339；Albericio，F.和Barany，G.，Int.J.Peptide Protein Res.30，1987，206-216)，但处理来自大的头-尾肽多联体的单个肽的更经济的生物技术途径缺乏这种可能性。因此，按照US2003/0219854A1通过生物技术方法制造的肽必须在下游加工步骤中被C-末端酰胺化。然而迄今为止描述过的化学酰胺化方法需要在相当程度上外消旋肽主链。
US2003/0219854描述了通过在存在近化学计量量(6当量(eq.))的脲偶联剂(HATU：O-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)和辅活化剂N-羟基-9-氮杂苯并三唑时在非质子溶剂DMF中使过量的氨和碱试剂(20eq)反应，来末端酰胺化富含色氨酸的Boc保护的12聚体。酰胺化的、去保护的肽衍生物的产率号称为47％。
小心重现该反应过程和反应产物分析(实施例部分)显示，低产率主要是由于不需要的C-末端氨基酸的差向异构，这导致了比例几乎为1∶1的两种酰胺化的非对映体，采用Tween20和Cyclodextrin CE法得到的电泳图证明了这一点。按照该申请实施例部分的详细描述，使用Marfey试剂作为水解肽的手性衍生剂，通过反向LC/ESI-MS串联色谱也证实了这一比例。这就是说，一半的产物由于C-末端氨基酸的有效外消旋而在酰胺化中损失。
另一种仅用于固相合成的方法描述于Albericio，F.和Barany，G.，Int.J.PeptideProtein Res.30，1987，206-216。然而，该方法需要制备特别的FMOC-三烷氧基-苄基酰胺把手(handle)以功能化树脂支持物，因此比较复杂。将肽偶联并合成到支持物之后，从如此修饰的树脂上切下肽得到容易酰胺化的肽，所需非对映异构体或非对映体的光学纯度约为80％，加上较低的切割效率，使得所需酰胺化的肽的非对映异构体总产率仅为约60-70％。采用化学上略有不同的酰胺-把手的类似方法也由相同作者描述于US5306562。
本发明的目的是避免现有技术的缺点和提供另一种或改进的酰胺化肽或氨基酸的未保护的α-羧基的化学的非酶方法。根据本发明，该目的是通过酰胺化氨基酸或肽的游离α-羧基的方法实现的，该方法包括使所述氨基酸或者优选所述肽在存在碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐的有机溶剂中与肽偶联剂反应的第一个步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，且其中所述氨基酸或肽的侧链和α-氨基官能团(function)被非碱不稳定性保护基保护。
应理解，所述碱试剂和盐的铵阳离子优选不相同，因此不会形成共轭酸碱对。而且有第一种碱和第二种碱，且本发明中第二种碱是铵阳离子。下文中，术语“碱”通常仅指所述第一种碱。第二种碱将始终被称为铵化合物或铵阳离子。
本发明方法的优点在于可使实际在其α-羧基上被酰胺化的氨基酸残基中α-碳原子的不利的差向异构最小化。在二肽或较高n聚肽中，该氨基酸残基是肽的C-末端残基，这是本发明特别优选的实施方案。
本发明的肽或多肽可以是任何肽。保护侧链和α-氨基官能团能使适当保护的肽或氨基酸在有机溶剂中获得足够的溶解度。理所当然，本发明的溶剂条件被证明在保留构型时对于高效酰胺化是有利的，但考虑到不伤害较长肽的二级结构甚至三级结构，尤其是当这种二级或三级结构未被共价链内碱或类似结构稳定时，可以考虑使可能的非天然结构元件变性。优选地，本发明的肽包含100个或更少氨基酸残基，更优选包含50个或更少氨基酸残基，最优选包含20个或更少氨基酸残基。该定义包括含有非天然组成的肽，如D-氨基酸、具有修饰的侧链或异常侧链的L-或D-氨基酸、或者可能是连接上述肽内肽链不同部分的非氨基酸构件块。固相合成能够有效合成接近50个残基的肽，然而进一步液相片段缩合反应能够制造出更长的完整的合成肽。现在对通过生物技术制造的肽有长度限制。降低反应混合物的含水量以及适当排除其它质子溶剂，尤其是排除水之外的低级C1-C5烷基醇如甲醇、异丙醇或乙醇，对于本发明是优选的。
优选地，所述肽是抗微生物或抗感染的杀菌肽，优选阳离子抗微生物肽，如ILRWPWWPWRRK、indolicidin，它们在其C-末端酰胺化形式更加有效。抗感染肽，尤其是阳离子肽如indolicidin衍生物以及尤其是ILRWPWWPWRRK-它们的工业生物技术制造方法描述于US2003/0219854A1—是一类新的广谱抗微生物物质，它可帮助抵抗病原微生物中多药物抗性向标准抗生素迅速传播。
优选酰胺化反应在水含量低于25％(v/v)，更优选低于15％(v/v)，最优选低于5％(v/v)时进行。在另一优选实施方案中，反应在基本上不含水的条件下进行。这可包括采用例如新鲜蒸馏的溶剂或采用保护性氮气。
优选有机溶剂是非质子有机溶剂，更优选是极性非质子有机溶剂。合适的例子有乙腈、二甲亚砜、二氯甲烷和N，N-二甲基-甲酰胺。最优选有机非质子溶剂是N，N-二甲基甲酰胺。
优选酰胺化反应在-15℃至50℃下进行，且反应期间pH被控制在约pH8-9，优选被控制在约pH8.5。
上述试剂类型如偶联剂、偶联添加剂和保护基是标准肽合成中熟知的，其本质是酰胺化反应，并描述于例如Bodansky，M.的《肽合成原则》(Principles of PeptideSynthesis)，第二版，Springer Verlag Berlin/Heidelberg，1993)。
非碱不稳定性保护基是本领域熟知的，术语“碱不稳定”如本领域常规理解用来指在碱性pH下分离和/或被伯胺或仲胺氨解。合适的例子有，例如，2-硝基-甲氧基苯基氧硫基-、Aloc(烯丙氧基羰基)-、Z(苯甲酸基羰基)-、Boc(叔-丁氧基-羰基)-、Bpoc-(联苯基-基-异丙氧基-羰基)-基。包括碱不稳定的保护在内的正交保护方法当然不包括在本发明之内。是否需要用单一类型的保护基全面保护或用不同类型的保护基保护相同的肽或氨基酸取决于通过化学或生物技术方法合成的肽的来源以及该肽或氨基酸中所含侧链的类型。值得注意的是，这种非碱不稳定性基团的除去可能会受不同方法或不同反应条件的影响。例如，Nps(邻硝基-苯基氧硫基-)基团可通过巯基亲核试剂顺利除去，Z-基团可通过氢解除去，或者Alloc基团可通过Pd(I)-催化氢化除去。根据本发明，非碱不稳定性保护基宜在酸解酰胺化之后除去，例如Boc-、Z-、三苯甲基-、Nps-或Bpoc-基团。
根据本发明的要点，保护可能存在于本发明所述肽中的天冬氨酰基-和谷氨酰基-侧链是显而易见的，并需要合适的羧基保护基来选择性保护或掩蔽ω-羧基，留下C-末端α-羧基。这可通过以下方法实现，例如，用苄基卤化物全面酯化羧基以产生苄基酯，随后在丙酮中用LiOH位置选择性切除α-酯(Bryant，P.等，1959，J.Chem.Soc.，p.3868ff.)，或者在存在Cu(II)盐时用烷基卤化物选择性酯化ω-羧基，Cu(II)盐在酯化过程中通过形成复合物来掩蔽α-官能团(Ledger，R.，1965，Austral.J.Chem.18：1477ff)；用Cu(II)催化也有助于ω-羧基的去保护(Prestidge，R.，1975，J.Org.Chem.40：3287ff.)。
在本发明的另一优选实施方案中，要被酰胺化的肽或氨基酸不含除要被酰胺化的C-末端α-羧基之外的羧基，优选不含谷氨酰基-或天冬氨酰基残基。
假设最终和ω-羧基一起产生的谷氨酰胺酰基-或天冬酰胺酰基-残基是需要的并且是本发明所述肽或氨基酸全面合成策略所考虑的，本发明的另一个独立的目的是发明酰胺化氨基酸或肽游离α-羧基的方法，该方法包括使所述氨基酸或肽在存在第一种碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐时与肽偶联剂反应的步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，其中所述氨基酸或肽的侧链和α-氨基官能团被非碱不稳定性保护基保护，但各天冬氨酰基-或谷氨酰基-残基的ω-羧基未被保护，且其中所述残基和其中所述ω-羧基在反应中与游离α-羧基一起被酰胺化。当出于为产生天然氨基酸酰胺即天冬酰胺酰基和/或谷氨酰胺酰基这一明显原因而采用盐化合物的氨时，特别优选所述第二个目的。
上文或以下章节给出了本发明的所有技术说明和优选实施方案的描述，它们涉及本发明的第一个目的，并且除非与本发明的第二个目的显然相左(例如当要求肽中完全不含任何天冬氨酰基-或谷氨酰基-残基时)也同样延及该第二个目的。
肽合成的偶联剂是本领域熟知的(参见例如，Bodanszky，同上)。偶联剂可以是混合的酐(例如T3P∶丙烷磷酸酐)或者其它酰化剂如活化的酯或酸卤化物(例如ICBF，异丁基-氯甲酸酯)，或者它们可以是碳二亚胺，活化的苯并三嗪衍生物(DEPBT∶3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)或苯并三唑的脲或盐衍生物。在本发明的一个优选实施方案中，上述偶联剂是除碳二亚胺之外的偶联剂。
在一优选实施方案中，偶联剂选自脲盐或盐，发现在本发明的方法中它们能得到最佳总产量和最好的抗外消旋保护作用。
此外，更优选的是能够活化所述α-羧基的苯并三唑的脲盐或盐，且反应在一种弱碱存在时进行。合适且同样优选的这种脲或偶合盐的例子有，例如，HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)，TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸盐)、HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧基二-(吡咯烷基)-脲六氟磷酸盐。
优选地，碱或第一种碱是弱碱，其共轭酸的pKa值为pKa7.5-15，更优选为pKa7.5-10，不包含肽或氨基酸或氨基酸衍生物的α-氨基官能团，且所述碱优选是空间位阻叔胺。这种碱和其它优选的碱的例子是Hünig碱(N，N-二异丙基乙胺)、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基-吗啉，所述烷基为直链和支链C1-C4烷基，更优选是N-甲基吗啉或可力丁(2，4，6-三甲基吡啶)，最优选是可力丁。上文和下文描述的所有优选实施方案特别优选与该章节所述的第一种弱碱试剂组合使用。
在另一优选实施方案中，所述酰胺化方法用碳二亚胺作为偶联剂进行，且特别优选在叔胺时进行。更优选地，碳二亚胺偶联剂选自二异丙基-碳二亚胺、二环己基-碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)，最优选是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺。尽管出于技术原因碳二亚胺不太适合工业方法合成过程。优选地，用碳二亚胺作为偶联剂的反应在存在除所述铵盐之外的第二种偶联添加剂时进行，所述第二种添加剂是被保护的，即符合下面即将给出的定义的非离子N-羟基苯并三唑或N-羟基苯并三唑衍生物。
也可使用偶联添加剂，尤其是苯并三唑类型的偶联添加剂。因此还优选所述偶联剂添加剂是能够形成活化的酯的亲核羟基化合物，更优选具有酸性亲核N-羟基官能团，其中的N是酰亚胺或是N-酰基或N-芳基取代的三氮烯基，最优选所述偶联添加剂是N-羟基-苯并三唑衍生物(或1-羟基-苯并三唑衍生物)或是N-羟基-苯并三嗪衍生物。这种N-羟基化合物偶联添加剂已经充分且广泛描述于WO94/07910和EP-410182，其各自的内容被纳入本文作为参考。例子有，例如N-羟基-琥珀酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪、1-羟基-7-氮杂苯并三唑和N-羟基-苯并三唑。N-羟基-苯并三嗪衍生物特别优选，在最优选的实施方案中，所述偶联剂添加剂是羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪。
偶联添加剂的铵盐化合物是已知的，并也已描述于，例如，US4806641。
在另一个特别优选的实施方案中，所述脲或盐偶联剂是脲盐试剂，优选是HCTU、TCTU或HBTU，且更优选与N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪的铵盐组合用于反应。
注意，在本发明文中，定义HCTU和TCTU包括在术语“脲盐试剂”之内，但式I的化合物及其类似物除外，这是由于通过晶体结构分析显示其包括肟基部分而不是脲部分(O.Marder，Y Shvo和F.Albericio“新偶联剂HCTU和TCTU的开发和工业应用”(HCTU and TCTU：New Coupling Reagents：Development and IndustrialApplications”，Poster，Presentation Gordon Conference 2002/02)，杂环核上的N-脒基取代基造成了胍(guanidium)结构替代。因此，式I的这类化合物被称为本发明所述脲盐试剂的胍型亚类：
Figure A20058002372900111
式中，R1、R2、R3、R4各自为烷基，优选独立为乙基或甲基，且其中的原子A是N或C，R5是H或者优选为吸电子取代基，更优选是氯，优选X是复杂的阴离子，更优选是六氟磷酸根或四氟硼酸根。
就用于本发明的盐的铵阳离子而言，该铵阳离子是+H2NR1R2，其中R1、R2各自独立为H或为C1-C10，优选C1-C5，脂肪族烃或者单独或一起形成脂环族烃，所述烃还可任选被芳基、烷氧基、芳烷氧基、烷基芳基、芳氧基、羟基或卤素取代，优选不包括N-杂芳族部分。优选地，R1、R2未被进一步取代并且独立为上面定义的烷基。更优选地，R1是H且R2是甲基、乙基、丙基或异丙基，或者R1、R2都是H，即阳离子是NH4 +。NH4 +是最优选的。
优选地，在所述第一个反应步骤之后的第二个步骤中，酰胺化的氨基酸或肽被分离，并在第三个步骤中被去保护以生成游离的侧链和α-氨基官能团，酰胺化的氨基酸或肽优选通过酸解部分或完全去保护。在本发明一个可能的但不十分优选的实施方案中，用这种方法酰胺化氨基酸并获得了适当保留侧链掩蔽基或保护基的纯的L-氨基酸羧酰胺，以将这种过量的氨基酸酰胺和第二种肽片段一起用于常规的区段缩合肽合成方案。采用这种方法，可以节省来自例如固相合成的比较昂贵的肽，避免由于酰胺化造成的外消旋带来的不必要的损失，同时可更加便宜地大量使用氨基酸酰胺进行有效偶联。如上文在本发明方法的酰胺化反应中所述，该实施方案特别适用于氨或低级烷基胺。
在另一优选实施方案中，本发明的保护的肽通过侧链锚定到树脂的功能性接头部分以偶联常规的树脂支持物。因此，为进行酰胺化，C-末端应游离。这种支持物可以是本领域通常使用的任何树脂，如CTC、Wang或Merrifield树脂。通过这种方法，本发明的方法能有效回收和去保护酰胺化的产物。
进一步优选的是，在所述第一个反应步骤之后的第二个步骤中，酰胺化的、保护的氨基酸或者优选肽被分离，并在第三个步骤中被去保护以生成游离的侧链和α-氨基官能团，优选通过酸解部分或完全去保护。
在本发明的另一个实施方案中，发明了酰胺化例如通过生物技术方法制造的具有游离α-羧基的未保护的肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)从所述肽的多联融合蛋白回收并分离所述肽，所述融合蛋白可进一步包含散布的接头序列，
b)用非碱不稳定性保护基至少衍生未保护的肽的α-氨基官能团，优选通过非碱不稳定性保护基同时保护各氨基酸侧链的亲核基团，
c)优选通过用水沉淀回收保护的肽，
d)用上述方法酰胺化C-末端羧基，
e)优选分离酰胺化的肽，
f)以及去保护侧链和α-氨基官能团。
上面描述的所有优选实施方案同样可用于本发明的肽，尤其且优选用于(在C-末端)酰胺化抗微生物肽，优选用于抗微生物肽，更优选且最优选用于ILRWPWWPWRRK和/或其它indolicidin衍生物。
实施例
Boc-保护12聚体(N到C末端，OH表示不含α-羧基：ILRWPWWPWRRK-OH)
基本上如公开的申请US2003/0219854A1的描述保护肽，但通过沉淀而不是冻干回收产物。二-Boc-ILRWPWWPWRRK-OH(ESR-MS：m/z 1980)无需进一步纯化即可用于随后的酰胺化。
叔-丁氧基-羰基(Boc)化用二-叔丁基二碳酸酯(Boc2O)在乙腈/1N NaOH/H2O中进行。室温搅拌反应混合物，然后将pH调至pH4.6并在真空下除去有机溶剂。再将pH调至2。加水，将悬浮液冷却至4℃，然后分离如此形成的沉淀。用水洗涤固体并真空干燥。
C-末端酰胺化Boc-ILRWPWWPWRRK(Boc)-OH(diBoc-肽-OH)
在DMF(36ml)中diBoc-MBI 11B7(900mg，0.455mmol)、N-甲基吗啉(150μl，1.365mmol)和NH3/HOOBt(250mg，1.365mmol)的溶液中加入在HCTU(209mg，0.5mmol)，并在氮气下于25℃搅拌。如果需要，用N-甲基吗啉将pH调至pH8.5(±0.5)。反应混合物在25℃搅拌2小时，并将pH控制在8.5(±0.2)。
然后减压蒸发DMF(水浴温度＜50℃)。加水(90ml)，使悬浮液在4℃保持至少2小时，然后分离。滤出固体，滤饼用水洗涤(25ml，洗涤2次)。粗制的肽真空干燥15小时(温度＜50℃)。所得白色粉末(910mg)用于进一步分析。
分析法：肽完全水解后衍生单个氨基酸
Figure A20058002372900131
用6N HCl处理肽使其水解成单个氨基酸。在该处理过程中，C-末端赖氨酸酰胺被转化成相应的羧酸(Lys-OH)，如Marfey等所述(Marfey，P.，Carlsberg Res.Commun.，49，(1984)，591)。这种完全水解不能促进除Cys之外的氨基酸外消旋。简言之，该方法被用来用FDAA(1-氟-2，4-二硝基苯基-5-1-丙氨酸)在水解产物中衍生氨基酸的光学异构体。这种简单的衍生化过程可在90分钟内完成。
本文中，赖氨酸衍生物容易通过反相HPLC分离和量化。衍生物的吸收系数约为3×104，并可通过UV在340nm处以皮摩尔灵敏度检测。先水解和衍生L-LyS-NH2和D-Lys-NH2。通过HPLC从离析物分离酰胺化的非对映体可确定转化率和总产率(转化％)。用Marfey等的方法鉴定末端赖氨酸-酰胺保留L-构型的产物，并通过HPLC确定非差向异构的L-Lys产物对比D-Lys产物的相对过量(％P)。基本如Marfey等的描述，建立了用于分析非对映异构体的HPLC法，并获得了良好的分离。
为酰胺化相同的肽，测试了偶联剂和添加剂的不同组合(表I)。为进行比较，用特别指出的氨水和单独的偶联添加剂代替本发明的偶联添加剂的铵盐(表I)。“SM”表示反应的Boc-ILRWPWWPWRRX(Boc)-OH的量。
表I
    SM[mg]  偶联剂 辅活化剂   碱   溶剂     “NH3”   浓度％   ％P
    26.0   T3P -   NMM   DMF NH3/HOOBt     80   92.0
    51.0   HCTU -   NMM   DMF NH3ZHOOBt     100   92.5
    51.2   HBTU -   NMM   DMF NH3ZHOOBt     93   93.7
    51.0   EDC Cl-HOBt   TMP   DMF NH3/HOOBt/CuCl2     79   90.3
    51.0   EDC Cl-HOBt   TMP   DMF NH3ZHOOBt     98   95.2
    50.0   IBCF -   NMM   DMF NH3ZHOOBt     82   80.1
    50.4   IBCF -   TMP   DMF NH3ZHOSu     88   82.2
    50.9   TCTU -   NMM   DMF NH3/HOOBt     89   94.2
    50.1   IBCF -   NMM   DMF 氨水     85   52.6
    304.0   HCTU -   NMM   DMF NH3ZHOOBt     94   94.3
    49.8   HCTU   NMM   DMF NH3ZHOOBt     100   94.8
采用辅活化剂的铵盐有助于保持C-末端氨基酸构型。
Boc-ILRWPWWPWRRK(Boc)-OH的去保护
在添加了0.2mL三氟乙酸的0.8ml DMF中去保护100mg DiBoc-肽。将混合物室温搅拌30分钟。未保护的肽-酰胺然后通过反相HPLC进一步纯化，最后冻干(ESI-MS：m/z 1779)。

Claims (41)

1.一种酰胺化氨基酸或者优选肽的游离α-羧基的方法，所述方法包括使所述氨基酸或肽在存在第一种碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐时在有机溶剂中与肽偶联剂反应的第一个步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，且其中所述氨基酸或肽的侧链和α-氨基官能团被非碱不稳定性保护基保护。
2.一种酰胺化氨基酸或者优选肽的游离α-羧基的方法，所述方法包括使所述氨基酸或肽在存在第一种碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐时与肽偶联剂反应的步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，其中所述氨基酸或肽的侧链和α-氨基官能团被非碱不稳定性保护基保护，但各天冬氨酰基-或谷氨酰基-残基的ω-羧基未被保护，且其中所述ω-羧基在反应中与游离α-羧基一起被酰胺化。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一种碱是弱碱，其共轭酸的pKa值为pKa7.5-15，优选为pKa7.5-10。
4.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述偶联剂是除碳二亚胺之外的偶联剂。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述偶联剂选自能够活化所述α-羧基的苯并三唑的脲盐或盐，且反应在第一种弱碱存在时进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脲或盐偶联剂选自HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸盐)、HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧基二-(吡咯烷基)-脲六氟磷酸盐。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述弱碱是2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基-吗啉，优选所述烷基为直链和支链C1-C4烷基。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述弱碱是N-甲基吗啉或是2，4，6-三甲基吡啶。
9.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是非质子有机溶剂，优选是极性非质子有机溶剂。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自乙腈、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二氯甲烷或N，N-二甲基-甲酰胺，优选是N，N-二甲基甲酰胺。
11.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述偶联剂添加剂是能够形成活化的酯的亲核性N-羟基化合物。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述偶联剂添加剂选自N-羟基-琥珀酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪、1-羟基-7-氮杂苯并三唑或N-羟基-苯并三唑。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述偶联剂添加剂是羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪。
14.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，反应期间pH被控制在约pH8-9，优选被控制在约pH8.5。
15.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法用碳二亚胺作为偶联剂进行，且优选在存在质子化的N-羟基苯并三唑作为第二种偶联添加剂时进行。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺偶联剂选自二异丙基-碳二亚胺、二环己基-碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)，优选是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述脲或盐偶联剂是脲盐试剂，优选是HCTU、TCTU或HBTU，且更优选与N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪的铵盐组合用于反应。
18.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述铵阳离子是+H2NR1R2，其中R1、R2各自独立为H或为C1-C10，优选C1-C5，脂肪族或脂环族烃。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，R1是H，R2是甲基、乙基、丙基或异丙基，或者R1、R2都是H。
20.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，在所述第一个反应步骤之后的第二个步骤中，酰胺化的、保护的氨基酸或者优选肽被分离，并在第三个步骤中被去保护以生成游离的侧链和α-氨基官能团，优选通过酸解部分或完全去保护。
21.一种酰胺化ILRWPWWPWRRK的游离α-羧基的方法，所述方法包括使所述ILRWPWWPWRRK在存在第一种碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐时在有机溶剂中与肽偶联剂反应的第一个步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，且其中所述ILRWPWWPWRRK的侧链和α-氨基官能团被非碱不稳定性保护基保护。
22.一种酰胺化抗微生物肽优选阳离子抗微生物肽的游离α-羧基的方法，所述方法包括使所述肽在存在第一种碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐时在有机溶剂中与肽偶联剂反应的第一个步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，且其中所述肽的侧链和α-氨基官能团被非碱不稳定性保护基保护。
23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述碱是弱碱，其共轭酸的pKa值为pKa7.5-10。
24.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述偶联剂是除碳二亚胺之外的偶联剂。
25.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述偶联剂选自能够活化所述α-羧基的苯并三唑的脲盐或盐，且反应在第一种弱碱存在时进行。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述脲或盐偶联剂选自HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸盐)、HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧基二-(吡咯烷基)-脲六氟磷酸盐。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述弱碱是2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基-吗啉，优选所述烷基为直链和支链C1-C4烷基。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述弱碱是N-甲基吗啉或是2，4，6-三甲基吡啶。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述弱碱是Hückel碱、N，N-二异丙基乙胺、2，4，6-三甲基吡啶或N-烷基-吗啉，优选是N-烷基吗啉，所述烷基为直链和支链C1-C4烷基，最优选是N-甲基吗啉。
30.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是非质子有机溶剂，优选是极性非质子有机溶剂。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自乙腈、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二氯甲烷或N，N-二甲基-甲酰胺，优选是N，N-二甲基甲酰胺。
32.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述偶联剂添加剂是能够形成活化的酯的亲核性N-羟基化合物。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述偶联剂添加剂选自N-羟基-琥珀酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪、1-羟基-7-氮杂苯并三唑或N-羟基-苯并三唑。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述偶联剂添加剂是羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪。
35.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，反应期间pH被控制在约pH8-9，优选被控制在约pH8.5。
36.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法用碳二亚胺作为偶联剂进行，且优选在存在质子化的N-羟基苯并三唑时进行。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺偶联剂选自二异丙基-碳二亚胺、二环己基-碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)，优选是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺。
38.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述脲或盐偶联剂是脲盐试剂，优选是HCTU、TCTU或HBTU，且更优选与N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪的铵盐组合用于反应。
39.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述铵阳离子是+H2NR1R2，其中R1、R2各自独立为H或为C1-C10，优选C1-C5，脂肪族或脂环族烃。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，R1是H，R2是甲基、乙基、丙基或异丙基，或者R1、R2都是H。
41.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，在所述第一个反应步骤之后的第二个步骤中，酰胺化的、保护的ILRWPWWPWRRK或抗微生物肽，优选阳离子抗微生物肽被分离，并在第三个步骤中被去保护，以生成游离的侧链和α-氨基官能团，优选通过酸解部分或完全去保护。
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CN114867734A (zh) * 2019-12-27 2022-08-05 中外制药株式会社 肽化合物的合成法

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