DE2902015C2

DE2902015C2 -

Info

Publication number: DE2902015C2
Application number: DE2902015A
Authority: DE
Inventors: Mauro Galantino; Roberto De Mailand/Milano It Castiglione
Original assignee: FARMACEUTICI ITALIA SpA MAILAND/MILANO IT Soc
Current assignee: FARMACEUTICI ITALIA SpA MAILAND/MILANO IT Soc
Priority date: 1978-02-23
Filing date: 1979-01-19
Publication date: 1987-08-27
Also published as: GB2016478A; JPS55100348A; BE873272A; JPS6136760B2; IT1207202B; GB2016478B; DE2902015A1; IT7920415A0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Decapeptids Ceruletid und seiner Salze gemäß dem voranstehenden Patentanspruch.

Nach der Nomenklatur, die gewöhnlich in der Peptid-Chemie gebraucht wird, kann das therapeutisch wertvolle Decapeptid gemäß der Erfindung durch die Formel

d. h. Pyroglutamyl-Glutaminyl-Asparaginyl-Tyrosyl (O-Sulfat)- Threonyl-Glycyl-Tryptophyl-Methionyl-Asparaginyl- Phenylalaninamid, worin die phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosin-Restes mit einer Sulfatgruppe verestert ist und worin alle Aminosäuren (mit Ausnahme von Glycin) die L-Konfiguration haben, dargestellt werden.

Bei dem Syntheseverfahren gemäß US-PS 34 72 832 erfolgt die Herstellung durch Sulfatierung des geschützten Decapeptids

worin die Hydroxylgruppe des Threoninrestes acetyliert ist, und anschließende Verseifung der Acetylgruppe. Bei diesem Verfahren entstehen als Folge sowohl der Sulfatierungsbedingungen im wasserfreien Medium als auch der Verseifungsstufe mehrere Nebenprodukte, hauptsächlich polysulfatierte, desamidierte und oxidierte Nebenprodukte neben anderen nicht identifizierten Verunreinigungen. Alle diese Verunreinigungen konnten nur durch sorgfältige Reinigung durch Gegenstromverteilung mit dem hiermit verbundenen Verlust an Zeit und Ausbeute entfernt werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das ungeschützte Decapeptid

in einem wäßrigen Medium sulfatiert, wobei keine abschließende Verseifung erforderlich ist. Unter diesen milderen Bedingungen wird das Ceruletid in hohen Ausbeuten (Umsatz 95% und mehr) und in hoher Reinheit (etwa 90% gemäß HPLC) erhalten. Eine weitere Reinigung kann durch Gegenstromverteilung vorgenommen werden.

Das ungeschützte Decapeptid III wird nach einem Syntheseschema erhalten, bei dem nicht nur die Gefahr der Racemisierung vermieden, sondern auch die Gefahr des Abbaus des Tryptophanrestes durch wiederholte Behandlung mit starken Säuren vermindert wird. Die Synthese dieses Decapeptids besteht im wesentlichen in geeigneten aufeinanderfolgenden Kondensationen von geschützten Aminosäuren oder Peptidfragmenten. Die Kupplung wird so durchgeführt, daß das erhaltene Decapeptid die gewünschte Sequenz von zehn Aminosäuren hat. In den Aminosäuren und Peptidfragmenten, die nach Verfahren, die in der Peptid- Chemie an sich bekannt sind, kondensiert werden, sind die Aminogruppen und Carboxylgruppen, die an der Bildung der Peptidbindung unbeteiligt, jedoch reaktionsfähig sind, durch eine Schutzgruppe, die durch Acidolyse, Verseifung oder Hydrogenolyse entfernbar ist, blockiert.

Für den Schutz der Aminofunktion können beispielsweise die folgenden Schutzgruppen verwendet werden: Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl), t-Butoxy (t-Butyloxycarbonyl), Trityl (Triphenylmethyl), Formyl oder Trifluoracetyl.

Für den Schutz der Carboxylfunktion können beispielsweise die folgenden Schutzgruppen verwendet werden: Methyl, Äthyl, t-Butyl und Benzyl.

Die Kupplung zwischen einer Aminogruppe eines Moleküls und einer Carboxylgruppe eines anderen Moleküls zur Bildung einer Peptidbindung kann mit einem aktivierten Acylderivat, z. B. einem gemischten Anhydrid, einem Azid, einem p-Nitrophenyl- oder 2,4,5-Trichlorphenyl- oder N-Hydroxysuccinimidylester oder durch direkte Kondensation zwischen einer freien Aminogruppe und einer freien Carboxylgruppe mit Hilfe eines Kondensationsmittels, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Cyclohexyl-3- morpholinylcarbodiimid, allein oder in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxysuccinimid und 8-Hydroxychinolin erfolgen. Die Kondensation kann in einem Lösungsmittel, beispielsweise einem N,N-Di-niederalkylformamid, einem niederen aliphatischen Nitril, einem Pyridin oder Tetrahydrofuran, beispielsweise in Dimethylformamid, Acetonitril, Pyridin oder Tetrahydrofuran, durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur kann zwischen -20°C und Raumtemperatur liegen. Die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen 6 bis 120 Stunden.

Die Sulfatierung wird in einem wäßrigen Medium mit dem Komplex B : SO₃, worin B: eine tertiäre Base ist, durchgeführt. Beispiele geeigneter tertiärer Basen sind Pyridin oder substituierte Pyridine, Trimethyl-, Triäthyl- oder niedere Trialkylamine, N-Niederalkyl- morpholine, Dimethylanilin, Imidazol oder substituierte Imidazole und Chinolin. Das Decapeptid III wird in Wasser bei pH 9,5-10,5 durch Zusatz einer organischen oder anorganischen Base oder beider Basen gelöst. Als organische Basen kommen die vorstehend genannten Basen infrage. Als anorganische Basen können NaOH, KOH oder Na₂CO₃ verwendet werden. Der Komplex wird als solcher oder als Lösung in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Dimethylformamid, Aceton und Acetonitril, zugesetzt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zusatz einer der vorstehend genannten Basen im Bereich von 8,5-12,5 gehalten. Die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen 2-120 Stunden. Die erfindungsgemäße Synthese von Ceruletid umfaßt die im Beispiel beschriebene Sulfatierung mit anschließender Aufarbeitung des Decapeptids. Das Decapeptid III wird durch Kupplung des Hexapeptids IV mit dem Tetrapeptid V nach der in Beispiel 3 beschriebenen Azidmethode hergestellt. Die beiden Zwischenprodukte IV und V werden durch stufenweise Verlängerung gemäß den Beispielen 1 bzw. 2 synthetisiert. Das vorstehend genannte Syntheseschema kann wie folgt dargestellt werden:

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter erläutert.

Beispiel 1. Herstellung des Zwischenprodukts IV

Zu einer Lösung von 17,5 g Boc-Gly-OH in 300 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran werden 10,99 ml N-Methylmorpholin und 9,60 ml Äthylchlorformiat nacheinander bei einer Temperatur von -15°C gegeben. Das Gemisch wird 2 Minuten bei dieser Temperatur gerührt, worauf 20,3 g NH₂-NH-Z·HCl (Z=Benzyloxycarbonyl) in 200 ml wasserfreiem Dimethylformamid, das 10,99 ml N-Methylmorpholin enthält, zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei -10°C gerührt. Man läßt dann die Temperatur in 2 Stunden von -10°C auf 0°C steigen. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen und nacheinander mit 1N-HCl bei 0°C, mit einer 5%igen wäßrigen Lösung von NaHCO₃ und mit einer gesättigten NaCl-Lösung neutral gewaschen. Nach Entfernung des Lösungsmittels wird der Rückstand aus Petroläther kristallisiert, wobei

29,1 g (Ausbeute 90%) Boc-Gly-NH-NH-Z (VI)

vom Schmelzpunkt 84-87°C erhalten werden.

29,1 g Boc-Gly-NH-NH-Z (VI)

werden in 300 ml 99%iger Ameisensäure gelöst und 6 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck bei 30°C entfernt und der ölige Rückstand aus Diäthyläther kristallisiert, wobei

23,0 g (Ausbeute 95%) H-Gly-NH-NH-Z·HCOOH (VII)

vom Schmelzpunkt 135-136°C erhalten werden.

18,75 g Boc-Thr-OH werden mit

23,0 g H-Gly-NH-NH-Z·HCOOH (VIII)

über das Äthoxyameisensäureanhydrid auf die für die Herstellung der Verbindung VI beschriebene Weise kondensiert, wobei

32,3 g (Ausbeute 89%) Boc-Thr-Gly-NH-NH-Z (VIII)

vom Schmelzpunkt 70-73°C erhalten werden.

32,3 g Boc-Thr-Gly-NH-NH-Z (VIII)

werden mit 350 ml Trifluoressigsäure bei 0°C 30 Minuten behandelt. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck bei 0°C abgedampft und der ölige Rückstand aus Diäthyläther kristallisiert, wobei

33,0 g (Ausbeute 99%) H-Thr-Gly-NH-NH-Z·CF₃COOH (IX)

vom Schmelzpunkt 140-145°C erhalten werden.

21,2 g Boc-Tyr-OH werden mit

33 g H-Thr-Gly-NH-NH-Z·CF₃COCH (IX)

durch das Äthoxyameisensäureanhydrid auf die für die Herstellung der Verbindung VI beschriebene Weise kondensiert. Nach Kristallisation aus Äthylacetat- Petroläther werden

39,0 g (Ausbeute 88%) Boc-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z (X)

vom Schmelzpunkt 138-142°C erhalten.

Durch Acidolyse von

39,0 g Boc-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z (X)

mit Trifluoressigsäure auf die für die Herstellung der Verbindung IX beschriebene Weise werden

39,9 g (Ausbeute 100%) H-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z·CF₃COOH (XI)

vom Schmelzpunkt 145-150°C erhalten.

15,5 g Boc-Asp(OBzl)-OH werden mit

39,9 g H-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z·CF₃COOH (XI)
durch das Äthoxyameisensäureanhydrid in üblicher Weise kondensiert. Durch Kristallisation aus Äthylacetat werden

48,9 g (Ausbeute 93%) Boc-Asp(OBzl)-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z (XII)

vom Schmelzpunkt 134-138°C erhalten.

Durch Acidolyse von

48,9 g Boc-Asp(OBzl)-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z (XII)

mit Trifluoressigsäure in üblicher Weise werden

49,2 g (Ausbeute 99%) H-Asp(OBzl)-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z·CF₃COOH (XIII)

vom Schmelzpunkt 135-138°C erhalten. In analoger Weise werden durch Kondensation von 15,0 g Boc-Gln-OH mit

49,2 g H-Asp(OBzl)-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z·CF₃COOH (XIII)

durch das Äthyoxyameisensäureanhydrid nach Kristallisation aus Methanol

49,5 g (Ausbeute 88%) Boc-Gln-Asp(OBzl)-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z (XIV)

vom Schmelzpunkt 200-203°C erhalten. Durch Behandlung von

49,5 g Boc-Gln-Asp(OBzl)-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z (XIV)

mit Trifluoressigsäure in üblicher Weise werden

50,2 g (Ausbeute 100%) H-Gln-Asp-(OBzl)-Tyr-Thr-Gly-NH-NH-Z·CF₃COOH (XV)

vom Schmelzpunkt 160-162°C erhalten.

Durch übliche Kondensation von

durch Äthoxyameisensäureanhydrid werden nach Kristallisation aus Methanol,

vom Schmelzpunkt 220-225°C (Zers.) erhalten.

werden in 500 ml Dimethylformamid, das 2 Äquivalente HCl enthält, gelöst und in einem offenen Gefäß in strömendem Wasserstoff in Gegenwart von 14 g 10%iger Palladiumkohle, die innerhalb von 12 Stunden portionsweise zugesetzt wird, hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Dimethylformamid gut gewaschen. Der ölige Rückstand wird aus absolutem Äthanol kristallisiert, wobei

vom Schmelzpunkt 145-150°C (Zers.) erhalten werden.

2. Herstellung des Zwischenprodukts H-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂ (V)

23,2 g Boc-Asp(OBzl)-OH werden mit 20,0 g H-Phe-NH₂ durch das Äthoxyameisensäureanhydrid in der für die Herstellung der Verbindung VI beschriebenen Weise kondensiert. Nach Kristallisation aus Äthylacetat werden

39,9 g (Ausbeute 85%) Boc-Asp(OBzl)-Phe-NH₂ (XVII)

vom Schmelzpunkt 141 bis 142°C erhalten.

39,9 g Boc-ASp(OBzl)-Phe-NH₂ (XVII)

das in 180 ml Dimethylformamid gelöst ist, werden bei Normaldruck in Gegenwart von 29 g 10%iger Palladiumkohle hydrogenolysiert. Nach Kristallisation aus Isopropanol werden

29,0 g (Ausbeute 90%) Boc-Asp-Phe-NH₂ (XVIII)

vom Schmelzpunkt 196-198°C erhalten. -50,0° (c=1, DMF).

29,0 g Boc-Asp-Phe-NH₂ (XVIII)

werden in 300 ml trockener 1,33N-HCl in Eisessig (HCl/AcOH) gelöst. Nach 25 Minuten bei Raumtemperatur wird die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aus Diäthyläther kristallisiert, wobei

24,2 g (Ausbeute 100%) H-Asp-Phe-NH₂·HCl (XIX)

vom Schmelzpunkt 100-150°C (Zers.) erhalten werden.

Durch Kondensation von

19,1 g Boc-Met-OH mit 24,2 g H-Asp-PHe-NH₂·HCl (XIX)

durch das Äthoxyameisensäureanhydrid in üblicher Weise und Kristallisation aus Äthylacetat werden

36,0 g (Ausbeute 92%) Boc-Met-Asp-Phe-NH₂ (XX)

vom Schmelzpunkt 194-198°C erhalten. Durch Acidolyse von

36,0 g Boc-Met-Asp-Phe-NH₂ (XX)

mit HCl/AcOH auf die für die Herstellung der Verbindung XIX beschriebene Weise werden

31,5 g (Ausbeute 100%) H-Met-Asp-Phe-NH₂·HCl (XXI)vom Schmelzpunkt 191-192°C erhalten.

21,5 g Boc-Trp-OH werden mit 31,5 g H-Met-Asp-Phe-NH₂·HCl (XXI)

durch das Äthoxyameisensäureanhydrid in üblicher Weise kondensiert, wobei nach Kristallisation aus Äthylacetat

44,2 g (Ausbeute 90%) Boc-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂ (XXII)

vom Schmelzpunkt 199-200°C erhalten werden. -34,5° (c=1, 95%iges AcOH).

44,2 g Boc-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂ (XXII)

werden in 450 ml 99%iger Ameisensäure gelöst. Nach 5 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei 30°C abgedampft und der Rückstand aus Isopropanol kristallisiert, wobei

33,7 g (Ausbeute 89%) H-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂ (V)

vom Schmelzpunkt 205-207°C erhalten werden.

3. Herstellung des Zwischenprodukts (III)

Zu einer Lösung von

in 160 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden nacheinander 24 ml trockene 2,44 N-HCl in wasserfreiem Tetrahydrofuran und 3,5 ml n-Butylnitrit bei einer Temperatur von -25°C gegeben. Bei dieser Temperatur wird 25 Minuten gerührt, worauf 13,1 ml N-Methylmorpholin und anschließend eine Lösung von

14,8 g H-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂ (V)

in einem Gemisch von 120 ml wasserfreiem Dimethylformamid und 40 ml Hexamethylphosphoramid, das 2,8 ml N-Methylmorpholin enthält, zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden bei -10°C stehen gelassen. Nach dem Abdampfen der flüchtigen Lösungsmittel unter vermindertem Druck wird das Produkt durch Verdünnen mit kalter wäßriger Lösung von Zitronensäure in Wasser ausgefällt. Das rohe Material ergibt nach Kristallisation aus Methanol

vom Schmelzpunkt 201-206°C (Zers.).

4. Herstellung der Verbindung

werden bei Raumtemperatur in 400 ml Wasser gelöst, indem mit 1N-NaOH auf pH 10,5 eingestellt wird. 72 g des Komplexes von Pyridin und Schwefeltrioxid werden portionsweise zugesetzt, während 5 Stunden gerührt und der pH-Wert mit 1N-NaOH bei 9-11 gehalten wird. Nach Neutralisation der alkalischen Lösung mit festem CO₂ wird die Lösung durch Entfernen des Lösungsmittel unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Dimethylformamid aufgenommen und zur Entfernung der unlöslichen anorganischen Salze filtriert. Das Filtrat wird erneut unter vermindertem Druck zu einem öligen Rückstand eingedampft. Das Produkt wird dann in 400 ml eines 1 : 1-Gemisches von Dimethylformamid und Wasser gelöst und bei 0°C mit dem Ionenaustauscherharz "Dowex 50W"® (H⁺) 5 Minuten unter Rühren behandelt. Das Gemisch wird filtriert und mit Diäthylamin alkalisch gemacht. Das Lösungsmittel wird durch Eindampfen auf ein kleines Volumen unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt (13,5 g) durch Zusatz von Diäthyläther ausgefällt. Durch Entsalzen mit Hilfe einer Säule des Adsorptionsmittels "Sephadex G 10"® werden

als Diäthylaminsalz erhalten. -22° (c=1, DMF).

Claims

Verfahren zur Herstellung des Decapeptids Ceruletid der Formel und seiner Salze mit pharmazeutisch unbedenklichen Basen, worin alle Aminosäuren die L-Konfiguration haben, dadurch gekennzeichnet, daß man das Decapeptid der Formel in Wasser bei einem pH-Wert von 9,5-10,5 löst und im wäßrigen Medium mit einem Sulfatierungsmittel der Formel B : SO₃, worin B: eine tertiäre Base bedeutet, bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 12,5 umsetzt, das hierbei gebildete Produkt in bekannter Weise isoliert und gegebenenfalls in ein Salz mit einer pharmazeutisch unbedenklichen Base überführt.