DE2649848A1

DE2649848A1 - Traegergebundene peptide, pth-peptidzwischenprodukte sowie ihre herstellung

Info

Publication number: DE2649848A1
Application number: DE19762649848
Authority: DE
Inventors: Robert L Colescott
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1975-10-31
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1977-05-05
Also published as: FR2347335A1; GB1559610A; FR2347335B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Peptidsynthese, insbesondere auf trägergebundene Peptide, die zur Herstellung biologisch aktiver Peptide verwendbar sind. Die Erfindung umfaßt dabei sowohl die Peptide als neue Verbindungen als auch ihre Herstellungsverfahren.

Seit langem werden bestimmte natürliche biologisch aktive Substanzen aus dem Material tierischer Drüsen gewonnen, die zur Behandlung von Krankheiten und Mangelerscheinungen in der Humanmedizin Verwendung finden. Eine derartige Substanz ist das Nebenschilddrüsenhormon, üblicherweise kurz als PTH bezeichnet, das lange Zeit aus

542-(case

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tierischen Nebenschilddrüsen, insbesondere von Schweinen und Rindern, gewonnen wurde.

Die große Mühe, die mit der Gewinnung der relativ kleinen Nebenschilddrüsen von Tieren unmittelbar nach dem Schlachten verbunden ist, die nur begrenzte Menge derart gewonnener Drüsen sowie das aufwendige Reinigungsverfahren, das zur Herstellung in der Humanmedizin verwendbarer Peptide erforderlich ist, stellen außerordentlich große Nachteile bei der Herstellung natürlicher Peptidhormone aus tierischen Drüsen dar. Obgleich infolgedessen auf diesem Gebiet ein außerordentliches Interesse an der Entwicklung praktischer Methoden sowie neuer Verbindungen besteht, die eine kommerzielle Synthese von Peptiden wie etwa des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons (HPTH) ermöglichen, wurde nach Wissen der Erfinder bisher kein verfahrensmäßiger oder stofflicher Zugang zur Lösung dieses Problems gefunden,

Für das menschliche NebenschilddrUsenhormon (HPTH) wurde eine Sequenz von 84 Aminosäuren ermittelt, deren aminoterminale Sequenz 1-34 folgende Struktur aufweist:

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

"Met-GIu-Arg-Vnl-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Vnl-His-Asn-Phe 18 19 20 21 22 23' 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Die Abkürzungen Phe,Asn, His etc. stehen dabei für die verschiedenen Aminosäuregruppierungen in der Peptidkette; die Zahlen stellen die Positionen der Aminosäuregruppe in der Kette entsprechend der üblichen Nomenklatur dar (vgl. Niall et al,, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (1974)

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8Pi). Das obengenannte Fragment hat offensichtlich im Vergleich mit dem Gesamtmolekül die volle biologische Aktivität.

Zur Synthese gewisser Peptide mit relativ kurzer Aminosäurekettenlänge sind einige Laboratoriumsverfahren vorgeschlagen worden; hierzu sind zu nennen: R.B. Merrifield: ''Solid Phase Peptide Synthesis. I. "The Synthesis of a Tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc. Vol. 85 (I963), 2149 - 54; J.Vi. Stewart und J.D. Young: "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Company, San Francisco, California. In diesen Publikationen finden sich jedoch keinerlei Angaben über trägergebundene Peptide mit Aminosäuren der erfindungsgemäßen Art und Sequenz.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, intermediäre trägergebundene Peptide anzugeben, aus denen biologisch aktive Peptide abgeleitet werden können, insbesondere Peptide mit der Aktivität des menschlichen NebenschilddrUsenhormons, sowie ein Verfahren für die kommerzielle Herstellung derartiger Peptide. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Synthese in bzw. an fester Phase gelöst, wobei zunächst ein unlösliches Polystyrolharz, das durch katalytisch^ Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhalten ist, chlormethyliert wird, worauf an das .chlormethvlierte -

/Harz zunächst .Phenylalanin, dann Asparagin sowie die anderen Aminosäuren der Kette in vorgegebener Sequenz unter Verwendung eines Systems der Bildung und Wiederabspaltung von Schutzgruppen der aktiven Amino- und Carboxylgruppen ansynthetisiert werden. Nach dem Ankuppeln der letzten Aminosäure der Kette werden die Peptidketten vom Harz abgespalten und die verbliebenen Schutzgruppen entfernt.

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Alle eingesetzten Aminosäuren sind dabei, wenn nichts anderes angegeben, die natürlich vorkommenden L-Isomeren.

Die Erfindung gibt also trägergebundene Peptide an, die sich insbesondere zur Herstellung von Peptiden mit

biologischer Aktivität eignen, insbesondere trägergebundene Peptide mit (R) -CHo-O-Phe-Asn-His-Val-Asp-Gln-Leu-Lys an einem Ende der Aminosäurekette, wobei (r) das Harz und Phe, Asn, His, VaI, Asp, Gin, Leu und Lys die Aminosäuren Phenylalanin, Asparagin, Histidin, Valin, Asparaginsäure, Glutamin, Leucin bzw. Lysin bedeuten, ferner Verfahren zur Herstellung dieser trägergebundenen Peptide.

Die Aminosäureketten der erfindungsgemäßen Peptidharze sind dabei identisch mit den Aminosäureketten natürlicher Peptide mit biologischer Aktivität. Es werden ferner auch andere Peptide mit Aminosäureketten angegeben, deren Aminosäuren hinsichtlich Art und Sequenz von den Aminosäureketten natürlicher biologisch aktiver Peptide verschieden sind, von denen jedoch Peptide mit biologischer Aktivität abgeleitet werden können, ferner entsprechende Zwischenprodukte.

Die Totalsynthese der erfindungsgemäßen Peptide natürlicher oder modifizierter Sequenz umfaßt zahlreiche Reaktionen, bei denen ebenfalls zahlreiche neue Peptid-Zwischenstufen gebildet werden, die im folgenden hinsichtlinh ihrer Strukturformel Schritt für Sohrltt anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert werden.

Herstellung eines unlöslichen Harzes

Das mit dem Symbol (r) abgekürzte unlösliche Harz ist ein Polymermaterial, das in den bei der Peptidsynthe-

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se verwendeten Lösungsmitteln unlöslich, jedoch von ihnen solvatisierbar und penetrierbar ist und als aktive Rezeptorphase für die erste Aminosäure, im vorliegenden Fall Phenylalanin, dienen kann.

Praktisch bevorzugt ist die Verwendung eines unlöslichen Polystyrolharzes, das durch katalytische Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhältlich ist. Das in dieser Weise erhaltene ^Harz wird mit Chlormethy]-methyl äther und Zinntetrachlorid als Katalysator nach folgender Reaktionsgleichung chlormethyliert:

+ Cl-CH₂OCH₃ Q -CH₂-Cl + CH₃OH,

Die Reaktion wird im einzelnen durch das folgende Beispiel erläutert.

Beispiel 1

1 kg eines zu 2 % mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes von 0,055 - 0,075 mm (200 - 400 mesh) Korngröße wurde dreimal mit je 2 1 Methylenchlorid gewaschen. Feine Partikel wurden durch jeweiliges Abziehen des Methylenchlorids vom Boden entfernt. Das Harz wurde anschließend durch Suspendieren, 10 minütiges RUhren und Filtrieren durch eine Glasfritte unter Verwendung von jeweils 2 1 folgender Lösungsmittel gewaschen: mit 2 Teilen Tetrahydrofuran, mit 2 Teilen Wasser, mit 1 Teil IN NaOH, mit 2 Teilen Wasser, mit 2 Teilen Dimethylformamid (DMF), mit 2 Teilen Dioxan sowie mit 5 Teilen Methanol. Das gewaschene Harz wurde anschließend im Vakuum bei 60 ⁰C getrocknet.

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500 g des gewaschenen Polystyrolharzes wurden mit 5 1 ChIormethyl-methyläther bei Raumtemperatur gerührt; die Temperatur wurde anschließend In einem Eis-Wasser-Bad auf 0 - 5 °C erniedrigt. Anschließend wurden 75 g wasserfreies Zinnchlorid in 925 ml eiskaltem Chlormethylmethyläther zugesetzt und das Gemisch 2 h im Eisbad gerührt. Das Harz vmrde durch eine Glasfritte abfiltriert und mit jeweils 2 1 der folgenden Lösungsmittel gewaschen: 25 % Wasser in Dioxan, 25 % 2-N HCl in Dioxan, Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das gewaschene Harz wurde bei 45 - 50 ⁰C im Vakuum getrocknet. Nach diesem Verfahren beträgt der übliche Chloridgehalt 0,7 - 1,0 mäq/g (mäq = Milliäquivalent).

Phenylalanin-Veresterung an das Polystyrolharz

Zunächst wird Phenylalanin an das Polystyrolharz gebunden. Die Reaktion geschieht nach folgender Gleichung:

(R)-CH₇Cl

K^

BA

0 H

« I

-CH₂-O-C-C-CH₂ NH

I ρ

BA-HCl

Kupplungsreaktion 1

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2849848 - ψ-

in der Formel bedeuten:

(r) das Polystyrolharz,
BA eine geeignete Base wie Triäthylamin, Diisopropylamin, Diisopropyläthylamin oder ein Alkalimetallsalz

sowie

P eine Aminoschutzgruppe wie etwa Amyloxycarbonyl (AMOC), o-Nitrophenylsulfenyl (NPS) oder vorzugsweise t-Butyloxycarbonyl (BOC).

Wie aus der obigen Formel hervorgeht, wird das t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin in Gegenwart eines Säureakzeptors mit dem chiormethyIierten Harz verknüpft.

Die Reaktion geht aus dem folgenden Ausführungsbeispiel 2 hervor.

Beispiel 2

50 g des wie zuvor beschrieben hergestellten chlormethylierten Polystyrolharzes mit einem Chlorgehalt von 0.74 mäq/κ (37 mäq Chlor) wurden mit 19,6 g BOC-L-Phenylalanin (74 mäq) in 150 ml absolutem Äthanol gerührt, worauf anschließend 9,77 ml Triäthylamin (72 mäq) zugesetzt wurden; das Gemisch wurde unter Rühren 24 h am Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde anschließend abgekühlt, durch einen Büchner-Trichter mit Glasfritte filtriert und auf der Fritte mit 500-ml-Teilen folgender Lösungsmittel ge-

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JS

waschen: zweimal mit denaturiertem Alkohol (mit 5 % Methanol denaturierter Alkohol), zweimal mit Dioxan, zweimal mit denaturiertem Alkohol, zweimal mit Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das Harz wurde anschließend bei 40 - 45 ⁰C im Vakuum getrocknet. Die Stickstoffanalyse ergab Werte zwischen etwa 0,50 - 0,70 mäq/g. Nach der (im folgenden beschriebenen) Abspaltung der BOC-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure wurde der Gehalt des Harzes an freien terminalen Aminogruppen durch Titration zu etwa 0,38 mäq/g bestimmt.

Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation:

OHH

H I I

R \ -CH₂-O-C-C-N-P

CH„

1. Säure

2. Base

0 H

H I

R \-CH₂-O-C-C-NH₂

Das resultierende Peptidharz wird als Verbindung 1 bezeichnet.

Die Abspaltung der Schutzgruppe von der Aminofunktion des Phenylalanine geschieht durch Verwendung einer geeigneten Säure wie Trifluoressigsäure oder Salzsäure. Das resultierende Aminsalz wird anschließend durch Behandeln mit einer starken organischen Base neutralisiert. Ein Ausführungsbeispiel für dieses Verfahren gibt das folgende Bei-

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spiel

Beispiel 5

6 g des BOC-Phenylalaninharzes nach Beispiel 2 wurden in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur eingebracht. Die Probe wurde zweimal mit je 40 ml Methylen chlorid jeweils 2 min gewaschen. Darauf wurden 4o ml 50 Trifluoressigsäure in Methylenchlorid zugegeben und das Ge misch 30 min zur Reaktion gebracht. Nach Filtration wurde das Harz dreimal mit je 40 ml Methylenchlorid, zweimal mit je 40 ml Methanol und dreimal mit je 40 ml Chloroform jeweils 2 min gewaschen. Anschließend wurde mit 40 ml einer 10 $igen Lösung von Diisopropylamin in Chloroform 5 min neutralisiert. Das Harz wurde darauf dreimal mit 40 ml Chloroform und dreimal mit 40 ml Methylenchlorid gewaschen.

Kupplung

OH 0

Il I η Il

R J -CH₂-O-C-C-NH₂ + . AOOC-C-CH₂-C-NH₂

NH

I
P

ο ο

H Il H H

Θ H η Il η η -CH₉-O-C-C-N-C-C-N-P + AOH I I

oder

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(r\ -CH-O-C-C-NH₀

H H CA.

+ HOOC-C-CH₉-C-NH₀

NH

j H g H H

R )-CH₂-0-C-C-N-C-C-N-P

In der Formel bedeuten:

P eine Aminoschutzgruppe wie oben beschrieben, A einen aktiven Ester wie p-Nitrophenyl, o-Nitro-

phenyl oder Pentachlorphenyl

und

CA ein Kupplungsagens, das Peptidbindungen zu bilden vermag, wie etwa Diimide, Azide, gemischte Anhydride und vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).

Die genannten Symbole (r) ,P, A und CA haben im folgenden einschließlich der Ansprüche die zuvor definierte Bedeutung.

Da F¹Ormelangaben wie die obige zuviel Platz beanspruchen, werden die Reaktionsprodukte nachfolgend in der entsprechenden abgekürzten Schreibweise dargestellt:

-CHg-O-Phe-Asn-P ₅

in der Phe Phenylalanin- und Asn Asparaginreste bedeuten und(R) und P die obige Bedeutung besitzen.

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Ur -

Diese vereinfachte Nomenklatur wird im folgenden bei allen Reaktionen verwendet.

Die Abspaltung der Schutzgruppe führt, wie im Zusammenhang mit dem Phenylalaninharz erläutert, zu einem Produkt folgender Struktur:

-CH₂-O-Phe-Asn-NH₂ (Verbindung 2).

Von den Erfindern wurde ferner die bedeutsame Fest stellung gemacht, daß die Vollständigkeit der Kupplungs reaktion durch Ninhydrin-Test geprüft werden kann (vgl. E. Kaiser, R. Colescott, CD. Bossinger und P. Cook, Anal. Biochem. ^4 (1970) 595-98). Wenn die Ninhydrinreaktion negativ ist, kann die Schutzgruppe vom Harz abgespalten und zur folgenden Kupplungsreaktion übergegangen werden. Bei positivem Ausfall der Ninhydrinreaktion wird der Kupplungsschritt wiederholt, bis die Ninhydrinreaktion schließlich negativ ist.

Die folgenden Ausführungsbeispiele beziehen sich auf die Kupplung von Asparagin.

Beispiel

Zu dem von Schutzgruppen befreiten Phenylalaninharz

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nach Beispiel 3 mit 3*5 mäq Aminogruppen wurde eine Lösung von 21 mmol (etwa 300 % Überschuß) BOC-L-Asparagin in 40 ml Methylenchlorid zugesetzt. Nach 2 min wurde eine Lösung von 21 mäq Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und das Gemisch 45 min gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert und zweimal mit jeweils 4o ml Chloroform und Methylenchlorid gewaschen. Die NinhydrinReaktion wurde an einer 3-5 mg-Probe des Peptidharz-Reaktionsprodukts vorgenommen und ergab sich als negativ. Anschließend wurden die Schutzgruppen nach Beispiel 3 abgespalten.

Beispiel 5

2 g Phenylalaninharz wurden von den Schutzgruppen befreit und wie in Beispiel 3 beschrieben neutralisiert; anschließend wurde dreimal mit 25 ml Dimethylformamid gewaschen und 20 h mit 6 mäq von in 25 ml Dimethylformamid (DMF) gelöstem BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester geschüttelt. Das Produkt wurde mit 2 Teilen Dimethylformamid, 2 Teilen Methylenchlorid, 2 Teilen Methanol und 3 Teilen Methylenchlorid gewaschen.

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ID

Peptidsynthese

In der folgenden Tabelle 1 sind die entsprechend aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte 2-34 unter Bezeichnung der jeweiligen VerknUpfungsposition in der Kette unter Nennung des in jedem Schritt ansynthetisierten Aminosäurereaktanten sowie der bevorzugten Schutzgruppen aufgeführt.

Tabelle

Reaktion Position ansynthetisierte Nr. Nr. Aminosäure

Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe

2	33	Asparagin	BOC-L-Asparagin-p-nitro phenylester
3	32	Histidin	BOC-L-im-Carbobenzyloxy L-histidin
4	31	Valin	BOC-L-Valln
5	30	Asparaginsäure	BOC-L-ß-Benzylaspartat
6	29	Glutamin	BOC-L-Glutamin-p-nitro- phenylester
7	28	Leucin	BOC-L-Leucin
8	27	Lysin	BOC-ε-Trifluoracetyl-

10

11

26 25 24

Lysin

Arginin

Leucin

L-lysin in 10 % DMF zur Löslichkeit

BOC- 6 - Trifluoracetyl-L-lysin in 10 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L-Tosylarginin in 20 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L-Leucin

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(Tabelle l, Fortsetzung)

12	23	Tryptophan
13	22	Glutaminsäure
14	21	Valin
15	20	Arginin
16	19	Glutaminsäure
17	18	Methionin
18	17	Serin
19	16	Asparagin
20	15	Leucin
21	14	Histidin

Lysin

BOC-L-Tryptophan in 10 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L-y-Benzylglutaminat BOC-L-Valin

BOC-L-Tosylarginln in 20 % DMF zur Löslichkeit

BOC-L- y-Benzylglutamat BOC-L-Methionin BOC-0-Benzyl-L-serin BOC-L- Asparagin-p-nitrophenyl-BOC-L-Leucin ester

BOC-im-Carbobenzyloxy-L-histidin

BOC- β - Trifluoracetyl-

L-lysin in 10 ^ DMF zur Löslichkeit

23	12	Glycin	BOC-Glycin
24	11	Leucin	BOC-L-Leucin
25	10	Asparagin	BOC-L-A sparagin-p-nitropheny] λ er* 4- α vi
26	9	Histidin	BOC-im-Carbobenzyloxy-L- histidin
27	8	Methionin	BOC-L-Methionin
28	7	Leucin	BOC-L-Leucin
29	6	Glutamin	BOC-L-Glutamin-p-nitrophenyl- ester
30	5	Isoleucin	BOC-L-Isoleualn
31	4	Glutaminsäure	BOC-L- γ-Benzylglutamat
32	3	Serin	BOC-0-Benzyl-L-serin
33	2	Valin	BOC-L-Valin
34	1	Serin	BOC-0-Benzyl-L-serin

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Jeder folgende Reaktionsschritt der Verknüpfung einer weiteren Aminosäuregruppe verläuft dabei in gleicher V/eise wie in Zusammenhang mit der Verknüpfung von Asparagin in Reaktion 2 (vgl. Beispiel 4) beschrieben, indem das jeweils zuvor erhaltene Peptidharz mit der folgenden Aminosäure in geschütztem Zustand gekuppelt, die Schutzgruppe vom neu angekuppelten Peptid abgespalten und neutralisiert wird. Im einzelnen werden dabei jeweils folgende Reaktionsschritte vorgenommen:

Kupplung:

7 mmol der jeweiligen BOC-Aminosäure (0,43 Äquivalent Überschuß in 40 ml Methylenchlorid oder DMF-Gemisch, falls erforderlich^

7 mmol Dicyclohexylcarbodiimid (Kupplungsagens) in 15 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 45 min, zweimaliges Waschen mit je 40 ml Chloroform, jeweils 2 min und

zweimaliges Waschen mit je 40 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min;

Abspaltung der Schutzgruppe:

zweimaliges Waschen mit je 40 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

50 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, 5 min, 40 ml (nach Reaktion Nr. 12 wird 1 % 2-Mercaptoäthanol oder A'thandithiol zu der 50 #igen Tri fluor- . essigsäure in Methylenchlorid zugesetzt).

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(Fortsetzung:)

dreimaliges Waschen mit je 40 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

zweimaliges Waschen mit je 40 ml Methanol, jeweils 2 min _} und

dreimaliges Waschen mit je 40 ml Chloroform, jeweils 2 min ;

Neutralisation:

zweimal je 40 ml 10 % Diisopropylamin in Chloroform, jeweils 5 min und

viermaliges Waschen mit je 40 ml Chloroform, jeweils 2 min.

Die Schritte der Kupplung, Abspaltung der Schutzgruppen sowie der Neutralisation bei den Reaktionen 3 - J4 entsprechen dabei den bei Reaktion 2 beschriebenen mit Ausnahme folgender Abweichungen:

Wie bereits angegeben weist die aus Reaktion Nr. 2 herrührende Verbindung 2 nach Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation folgende Struktur auf:

(r) -CH₂-0-Phe-Asn-NH₂,·

nach Reaktion 3 liegt Verbindung 3 vor:

-CH₂0-Phe-ASn-HiS-NH₂; W

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nach Reaktion 4 liegt Verbindung 4 vor:

(R) -CH₀-O-PtLe-ASn-HiS-VaI-NH₀J

nach Reaktion 5 liegt Verbindung 5 vor:

-CH₀-O-PlIe-ASn-HiS-VaI-ASp-NH * \ \

W Bz

In Reaktion 3, wo in Position 32 Histidin angekuppelt wird, wird zum Schutz der Imidazolgruppe vorzugsweise Carbobenzyloxy (CBZ) verwendet, jedoch kann hierfür in gleicher Weise auch Tosyl oder Dinitrophenyl (DNP) als Schutzgruppe eingesetzt werden. Die Abkürzung W bezeichnet dabei CBZ, Tosyl oder DNP.

In Reaktion 5* wo in Position 30 Asparaginsäure angekuppelt wird, wird als Schutzgruppe vorzugsweise Benzyl oder ein Benzylderivat eingesetzt. Unter der Abkürzung Bz wird entsprechend Benzyl oder ein Benzylderivat verstanden.

Unter Benzylderivaten im hier verwendeten Sinne werden Derivate der Benzylgruppe wie etwa halogeniertes Benzyl, alkyliertes Benzyl oder alkoxyliertes Benzyl ο.dgl. verstanden. Derartige Derivate sind in der Peptidchemie üblich, weshalb sich eine nähere Erläuterung erübrigt.

Bei der Synthese wird in der angegebenen Weise bis zur Verknüpfung von GIn in Position 29 verfahren. In dieser

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Position kann DCC als Kupplungsagens nur dann verwendet werden, wenn das Glutamin über eine geeignete Schutzgruppe wie etwa Benzhydryl oder Xanthydryl verfügt; dabei können die genannten Gruppen entweder daran gebunden sein oder Schutzkatalysatoren den entsprechenden Lösungen zugesetzt sein. Ohne einen derartigen Schutz verursacht DCC eine Nebenreaktion, die einen Teil des Glutamins verbraucht. Alternativ dazu kann Glutamin in ungeschützter Form als aktiver Ester wie in Beispiel 5 angekuppelt werden.

Das von Schutzgruppen befreite trägergebundene Peptid (±m folgenden kurz als Peptidharz bezeichnet) wird mit einem aktiven Ester des Glutamins wie etwa dem p-Nitrophenylester, dem o-Nitrophenylester oder dem Pentachlorphenylester bewegt bzw. gerührt.

Der entsprechende Kupplungsschritt wird im folgenden Beispiel 6 näher erläutert.

Beispiel 6

Das der Verbindung 5 nach Reaktion 5 entsprechende Peptidharz (nach Abspalten der Schutzgruppe und Neutralisation) wurde dreimal mit^O ml- Dimethylformamid jeweils

2 min gewaschen. 12 mmol in 40 ml Dimethylformamid gelöster BOC-L-GIutamin-p-nltrophenylester wurden 20 h mit dem Harz geschüttelt und anschließend mit 5 Teilen Dimethylformamid,

3 Teilen Methanol und J5 Teilen Methylenchlorid gewaschen. Das Glutamin in Position 6, Reaktion 29, wird in gleicher Weise angekuppelt.

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Beispiel 7

Die Asparagine in den Positionen 16 und 10 wie in Position 33 werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 unter Verwendung von BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester angekuppelt.

Beispiel 8

Anstelle der p-Nitrophenylester der Beispiele 5, 6 und 7 können in gleicher Weise auch o-Nitrophenylester oder Pentachlorphenylester eingesetzt werden, wobei die Reaktion zur Vervollständigung der Kupplung von Glutamin und Asparagin wie in den Beispielen 5, 6 und 7 ausgeführt wird.

An die Kupplung in Position 27 schließt sich die übliche Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation an; dabei resultiert ein Peptidharz (Verbindung 8) folgender Struktur:

(R) -CH^-O-Phe-Asn-His-Val-Asp-Gln-Leu-Lys-NHp

Il 1

W Bz TFA

(Verbindung 8).

Bei der Verknüpfung von Lysin (Lys) wird als £"-Amino-Schutzgruppe vorzugsweise Trifluoracetyl verwendet.

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Nach Wissen der Erfinder handelt es sich hierbei um die erstmalige Herstellung dieses Peptidharzes, was einen bedeutenden Schritt bei der Synthese von HPTH bzw. dem HPTH-Fragment darstellt.

An die Kupplung in Position 16 schließt sich die übliche Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation an; dabei resultiert ein Peptidharz (Verbindung 19) folgender Struktur:

LR) -CH₀-O-Phe-Asn-His-Val-Asp-Gln-Leu-Lys-Lys-Arg-Leu- ^ 1 I l|l

W Bz TFA TFA T

-Trp-Glu-Val-Arg-Glu-Met-Ser-Asn-NHg _(Verbindung 19) Bz T Bz Bz

Zur Kupplung der Aminosäure Arginin in Reaktion Nr.10 bzw. Position 25. wird als Schutzgruppe zum Schutz der Guanidino-Funktion vorzugsweise die .Tosylgruppe (p-Toluolsulfonylgruppe) verwendet, jedoch kann in gleicher Weise auch eine Nitrogruppe eingesetzt werden; als Kurzbezeichnung wird hierfür entsprechend das Symbol T verwendet, das Tosyl oder Nitro bedeutet.

Das Symbol T besitzt ebenfalls wie die übrigen Abkürzungen an allen verwendeten Stellen einschließlich der Ansprüche die gleiche Bedeutung.

Nach jeder Kupplungsreaktion und vor der Schutzgruppenabspaltung vom Peptidharz wird der Ninhydrin-Test durchgeführt. Wenn der Test positiv verläuft, wird die zuletzt durchgeführte Kupplungsreaktion wiederholt. Wenn der Test

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- 24 -

negativ ist, wird zur Schutzgruppenabspaltung vom Peptidharz übergegangen.

Nach der Verknüpfung des Serins in Reaktion Nr. 34 in Position 1 nach der oben beschriebenen Verfahrensweise und Sequenz sowie nach der Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation des gekuppelten Peptidharzes wird Verbindung Jk mit folgender Struktur erhalten:

Il III III

W Bz TFA TFA T Bz T Bz

-Ser-Asn-Leu-His-Lys-Gly-Leu-Asn-His-Met-Leu-Gln-Ile-Glu-Ser-Val-Ser-NH-

I ι I III

Bz W TFA W Bz Bz Bz

(Verbindung Jk).

Dieses Peptidharz wird anschließend zur Abspaltung des Harzes und der verbliebenen Schutzgruppen weiterbehandelt. Das Harz sowie alle noch verbliebenen Schutzgruppen können geeigneterweise durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt' werden. Die Reaktions gleichung hierfür ist:

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Q*

Θ -CH₂-O-PhB-ASn-HIs-VaI-Asp-Gln-Leu-Lys-Lys-Arg-Leu-Trp-Glu-Val-Arg-Glu-Il III I Il

W Bz TFA TFA T Bz T Bz

-Met-Ser-Asn-Leu-His-Lys-Gly-Leu-Asn-Hls-Met-Leu-Gln-Ile-Glu-Ser-Val-Ser-NH

I Ii I III²

W TFA W Bz Bz Bz

HF

(Reaktion 35) TFA

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

TFA TFA

I I

-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-Hls-Asn-Phe 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 (Verbindung

Das folgende Beispiel 9 erläutert diese Spaltungsreaktion.

Beispiel 9

2 g des blockierten HPTH-Peptidharzes wurden zusammen mit 2 ml Anisol in ein Gefäß aus KeI-F eingebracht, worauf 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde anschließend 1 h bei 0 ⁰C gerührt. Darauf wurde der Fluorwasserstoff durch Vakuumdestillation entfernt und der Rückstand viermal mit Äthylacetat gewaschen und anschließend mit Eisessig extrahiert. Der Essigsäureextrakt wurde dann zu 779 mg eines flaumig-weißen Pulvers lyophilisiert. Durch dieses Verfahren wird das Peptid vom Harz abgespalten, wobei zugleich sämtliche Blockierungsgruppen an den bifunktionellen Aminosäuren außer den TFA-Blockierungsgruppen der Lysinreste entfernt werden. Dieses Produkt wird ent-

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sprechend als TPA-HPTH-Peptid (Verbindung 35) bezeichnet.

Die Verbindung 35 kann mit einer wäßrigen Base wie etwa einer 1 M Piperidinlösung oder einer 2 N Ammoniumhydroxidlösung zur Entfernung der TFA-Schutzgruppen am Lysin behandelt werden, wobei das 1-34-HPTH-Fragment (Verbindung 36) folgender Struktur erhalten wird:

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-HIs-Asn-Leu-Gly-Lys-HIs-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 (Verbindung 36)

Beispiel 10

In derselben V/eise wie bei den vorhergehenden Beispielen wurde ein 1-34-Peptidharz hergestellt, bei dem das L-Serin in Position 1 durch Behandlung der Verbindung 33 mit BOC-0-Benzyl-D-serin anstelle von BOC-0-Benzyl-L-serin durch D-Serin ersetzt war. Nach der Abspaltung des Harzes sowie der verbliebenen Schutzgruppen lag folgendes Reaktionsprodukt vor:

D-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Hls-Leu-Asn-Ser-Met- ! 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 _32 33 34

(Verbindung 37).

Dieses Analogon besaß aufgrund des Küken-Hypokalzämie-Tests (vgl. J.A. Parsons, B. Reit und G.J. Robinson, Endocrinology %2 (1973) 454) biologische Aktivität.

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Reinigung

Nach Gelfiltration an Biogel P-6 (Hersteller Biorad) wurde das rohe menschliche 1-34-Nebenschilddrüsenhormonpeptid (HPTH (1-34)) an Carboxymethylcellulose (CMC) (Whatman CM52) unter Verwendung eines linearen Oradienten von Ammoniumacetat-Puffer chromatographiert. Nach Entsalzen an Polyacrylamidgel wurde die Homogenität des synthetischen Peptids durch Dünnschichtchromatographie an Cellulose (Brinkmann Celplate-22, Eastman 6065) und Silicagel platten (Merck) geprüft. Die aufgegebene Probenmenge betrug 30 /Ug in 5 ul 0,IM Essigsäure. Dabei wurden folgende Lösungsmittelsysteme verwendet: R^ n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:5; R_f Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 5:5:1:3; R° n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser 15:10:3:12; R^ n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Äthylacetat 1:1:1:1. Die Peptidflecken wurden durch Besprühen der Platten mit Ehrlich-Reagens und 0,5 % Ninhydrin in Äthanol sichtbar gemacht. Das gereinigte synthetische HPTH-(1-34)-Peptid ergab einen einzigen Fleck mit R^ (Cellulose, Brinkman) 0,19; R^ (Kieselsäure) 0,11; R° (Kieselsäure) 0,17; R^ (Cellulose, Brinkman) 0,40; R° (Cellulose, Eastman 6065) 0,66 und R^ (Cellulose, Brinkman) 0,48.

Die biologische Aktivität des synthetischen HPTH-(1-34)-Peptids in vitro aufgrund des Rattennieren-Adenylatcylase-Tests sowie des Küken-Hyperkalzämie-Tests geht aus der nachstehenden Tabelle 2 hervor. Zu Vergleichszwecken sind ferner entsprechende Daten an nativem Rinder-PTH-(1-84) [bPTH-(1-84) (nativ)3 und synthetisch hergestelltem Rinder-PTH- (1-34) [bPTH-(1-34)J sowie von nativem menschlichen PTH-(1-84) angegeben.

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Tabelle 2

Biologische Aktivität synthetischer und natürlicher Nebenschilddrüsenhormone

in vitro in vivo

Rattennieren-Adenylat- Küken-Hyperkalzämie cyclase [MRC u/mg]] [JMRC u/mgl

HPTH-(1-84) (nativ) 350 unbekannt HPTH-(1-34) (gereinigt, _{g 32}

Verbindung 36) ^^DUU ^y ^υυ

BPTH-(1-84) (nativ) 3000 2500

BPTH-(1-34) ■ 5400 7700

Aus den angeführten Beispielen ist ersichtlich, daß die Synthese von PTH-Peptiden mit biologischer Aktivität mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie über die entsprechenden Peptid-Zwischenprodukte in bemerkenswert günstiger Weise durchführbar ist, was angesichts des Stands der Technik bei der technischen Peptidsynthese völlig unerwartet war.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die Synthese von PTH-Peptiden beschränkt, sondern läßt sich z.B. auch auf andere Reaktionen an festen Trägern übertragen, bei denen ähnliche Sequenzen aufgebaut werden.

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Claims

Ansprüche .

1, Trägergebundenes Peptid der Struktur

^-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-O-CH^-f^R^

iii ^z Vl/

TFA Bz W

(R) = unlösliches Polystyrolharz, W= Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl,

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Mitrobenzyl oder Benzhydryl und

TFA =" Trifluoracetyl.
2. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Glr^-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-"' ' I Il I Il

Bz Bz Bz W TFA W

-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-

I Il I III I I

Bz Bz T Bz T TFA TFA Bz W

-Phe-O-CH -( K

(r) = unlösliches Polystyrolharz, T - Tosyl oder Nitro,
TFA = Trifluoracetyl,

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Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl und

W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl.
3. Peptid der Struktur

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-

TFA

-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe

I I

TFA TFA

TPA = Trifluoracetyl.
4. Peptid der Struktur D-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-
TFA
-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe
I I TFA TFA
TPA = Trifluoracetyl.
E
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Patentanwälte
DlPL-ING. R.
BEETZ SEM. - DiPL-I NG. K.
LAMPRECHT DR -ING. Π.
BEETZ JR. - RA DIPL-P=YS. U. HF.iDRlCH DR.-IN3. W. -IiMPE - DiPL-!KG. J.
SIEGFRIED Steinsdorfstraße .10 -. 8000 München TS.
542-26.219P-FSBk
2849848 } nachqereiqhtJ
19. 1. 1977

Neuer Anspruch 5

5. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen peptids, dadurch gekennzeichnet, daß-

P-Bz-L-Serin angekuppelt wird an
NH^-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-

Il I Il I

Bz Bz

TFA W

Bz

-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-O-

III «II I I

Bz T Bz T TFA TFA Bz W

-CH₂

-Θ

mit:

(ff) = unlösliches Polystyrolharz,

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl,

VJ = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl, TFA = Trifluoracetyl,
T = Tosyl oder Nitro und

ρ = t-Butyloxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder o-Nitrophenylsulfenyl als Amino-Schutzgruppen.

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- 88 -

■'-d-art

ΝΗ,-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asp^Ser-

f I I I ' ■

Bz W TFA W / Bz

-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-^l-His-Asn-Phe-O-

Il I III X

Bz T Bz T TFA TFA /Bz W

(r) = unlösliches Po^/styrolharz, Bz

Vi
TFA

P =

Benzyl, p-J^thoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitroferenzyl oder Benzhydryl, Captfobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl, Trifluoracetyl,

Tosyl oder Nitro und

t-Butyl oxy carbonyl, Atnyloxycarbonyl oder o-Nitro -P-

6. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß

P-Bz-D-Serin angekuppelt wird an
^-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-

• I ι ι ti ι

Bz Bz W TFA W Bz

-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-O- > i > III I I

^Bz T Bz T TFA TFA Bz W

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(R) = unlösliches Polystyrolharz,

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl,

W = Carbobenzyloxy, Tosyl, oder Dinitrophenyl,

TFA = Trifluoracetyl,

T = Tosyl oder Nitro und

P = t-Butyloxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder o-Nitrophenylsulfenyl als Amino-Schutzgruppen.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt ferner zur Abspaltung der Gruppen (r) -CHp, Bz, T und W mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt ferner zur Abspaltung der TFA-Schutzgruppen mit einer wäßrigen Base behandelt wird.

9. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß

-Leu

Bz W

P-Ly s
I

TFA

-Gln-Asp-Val-His-ASn-PhB-O-CH₂-Γ r)

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gekuppelt wird zu einem trägergebundenen Peptid der Struktur

P-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-O-CH₂-( R )

I I I ^-^

TFA Bz W

(r) = unlösliches Polystyrolharz, P = t-Butyloxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder

o-Nitrophenylsulfenyl als Amino-Schutzgruppen,

TFA = Trifluoracetyl,

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl und

W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl.

10. Verfahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, daß ferner die Schutzgruppe P vom Peptid abgespalten wird

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt von Anspruch 10 mit P-L-Lys zu einem

trägergebundenen Peptid der Struktur TFA

P-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-O-CH,-( R

Il I t ^V

TFA TFA Bz W

gekuppelt wird
mit:

(r) = unlösliches Polystyrolharz, W = Carbobenzyloxy, Tosyl oder Dinitrophenyl,

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Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl,

TPA = Trifluoracetyl und

ρ = t-Butyloxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder o-Nitrophenylsulfenyl als Amino-Schutzgruppen.

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