DE2807220A1

DE2807220A1 - Peptide und ihre herstellung

Info

Publication number: DE2807220A1
Application number: DE19782807220
Authority: DE
Inventors: Robert L Colescott; Emil Kaiser
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1977-05-02
Filing date: 1978-02-20
Publication date: 1978-11-16
Also published as: FR2389599A1; FR2389599B1; GB1599796A; US4301045A

Description

Armour Pharmaceutical Company, Phoenix, Arizona

V.St.A.

Peptide und ihre Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf die Peptidsynthese, insbesondere auf trägergebundene -Peptide, die zur Herstellung biologisch aktiver Peptide verwendbar sind. Die Erfindung umfaßt dabei sowohl die Peptide als neue Verbindungen als auch ihre Herstellungsverfahren. Das sogenannte adrenocorticotrope Hormon (ACTH) besteht nach Lee et al.(vgl. T. H. Lee, A. B. Lerner und V. Büttner»-Janusch, J. Biol. Chem.^ 236 (I96I) 2970) aus einer Sequenz von 39 Aminosäuren, deren aminoterminale Sequenz 1-25 folgende Struktur aufweist:

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-123 45 6 7 8910 11

Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Tyr-Pro-Asp
23 24 25

809846/0605

(P /

28Q7220

Die Abkürzungen Phe_s GIu, Leu usw. stehen dabei für die verschiedenen Aminosäuregruppierungen in der Peptidkette, wobei die angegebenen Zahlen die Positionen der Aminogruppen in der Kette nach der üblichen Nomenklatur bedeuten.

Der Erfindung liegt die Hauptaufgabe zugrunde , intermediäre trägergebundene Peptide anzugeben, von denen biologisch aktive Peptide abgeleitet werden können, insbesondere Peptide mit adrenocorticotroper Hormonaktivität, sowie wirksame Verfahrensweisen für die kommerzielle Herstellung derartiger Peptide zu entwickeln.

Zur Synthese bestimmter Peptide mit relativ kurzer Aminosäurekettenlänge sind bereits einige Laboratoriumsverfahren vorgeschlagen worden; hierzu sind zu nennen: R. B. Merrifield "Solid Phase Peptide Synthesis I"; "The Synthesis of a Tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc. VoI, 85 (1963), 2149 bis 2154, sowie J. W. Stewart und J. D. Young: "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Company, San Francisco, California.

In den genannten Publikationen sind jedoch keine trägergebundenen Peptide mit Aminogruppen der erfindungsgemäßen Art und erfindungsgemäß zugrundeliegenden Sequenz angegeben.

Die erfindungsgemäße Totalsynthese umfaßt zahlreiche Reaktionen, bei denen neue intermediäre trägergebundene Peptide gebildet werden; sie wird im nachfolgenden schrittweise erläutert _s wobei die jeweiligen Strukturformeln unter entsprechender allgemeiner Erläuterung zusammen mit spezifischen Ausführungsbeispielen angegeben sind.

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Die erfindungsgeruäße Synthese verläuft allgemein an fester Phase, wobei ein unlösliches, durch katalytische Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhaltenes vernetztes Harz zunächst chlormethyliert wird. An das chlormethylierte Harz wird zunächst Asparaginsäure angekuppelt, worauf Prolin und die übrigen Aminosäuren der Kette in vorgeschriebener Sequenz unter Verwendung eines Systems der Bildung und Wiederabspaltung von Schutzgruppen der aktiven Amino- und Carboxylgruppen ansynthetisiert werden. Anschließend an das Ankuppeln der letzten Aminosäure der Kette werden die Peptidketten vom Träperharz abgespalten und die verbliebenen Schutzgruppen entfernt.

Wenn nichts anderes angegeben ist, liegen alle eingesetzten Aminosäuren in Form ihrer natürlich vorkommenden L-Isomeren vor«

Herstellung des unlöslichen Trägerharzes

Das mit dem Symbol (r) bezeichnete Trägerharz ist ein Polymermaterial, das in den bei der Peptidsynthese verwendeten Lösungsmitteln unlöslich ist, jedoch von ihnen solvatisiert und penetriert wird und befähigt ist, für die erste bei der erfindungsgemäßen Synthese verwendete Aminosäure, nämlich Asparaginsäure, aktive Rezeptorstellen zu bieten.

Aus praktischen Gründen ist erfindungsgemäß ein unlösliches Polystyrolharz bevorzugt, das durch katalytische Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhalten ist. Das Harz wird unter Verwendung von Chlormethylmethyläther und Zinnchlorid als Katalysator nach folgender Reaktionsgleichung chlormethyliert:

809846/06Ö5

SnCl₄
+ Cl-CH₂OCH₃ ^ (r) -CH₂-Cl + CH₃OH

Die Chlormethylierungsreaktion wird im einzelnen durch das nachstehende Beispiel 1 erläutert.

Beispiel 1

1 kg eines mit 2 % Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes von 0,035 bis 0,075 mm (200 - 400 mesh) Korngröße wurde dreimal mit je 2 1 Methylenchlorid gewaschen. Feine Partikel wurden durch jeweiliges Abziehen des Methylenchlorids vom Boden entfernt. Das Harz wurde anschließend durch Suspendieren, 10 min Rühren und Filtration durch eine Glasfritte unter Verwendung von jeweils 2-1-Portionen folgender Lösungsmittel gewaschen: Mit zwei Portionen Tetrahydrofuran, mit zwei Portionen Wasser, mit einer Portion 1 η NaOH, mit zwei Portionen Wasser, mit zwei Portionen Dimethylformamid, mit zwei Portionen Dioxan sowie mit drei Portionen Methanol. Das gewaschene Harz wurde anschließend im Vakuum bei 60 ⁰C getrocknet.

500 g des gewaschenen Polystyrolharzes wurden mit 5 1 Chlormethylmethyläther bei Raumtemperatur gerührt; die Temperatur wurde anschließend in einem Eis-Wasser-Bad auf 0 bis 5 °C erniedrigt. Anschließend wurden 75 g wasserfreies Zinnchlorid in 925 mm eiskaltem Chlormethylmethyläther zugesetzt und das Gemisch 2 h im Eisbad gerührt. Das Harz wurde danach durch eine Glasfritte abfiltriert und mit jeweils 2-1-Portionen folgender Lösungsmittel gewaschen: 25 % Wasser in Dioxan, 25 % 2 η HCl in Dioxan, Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das gewaschene Harz wurde

809846/060 δ

bei JJ5 bis 50 ⁰C im Vakuum getrocknet. Nach diesem Verfahren beträgt der übliche Chloridgehalt 0,7 bis 1,0 mäq/g (mäq = Milliäquivalent).

Asparaginsäure-Veresterung an das Polystyrol-Trägerharz

Nach dem erfindungsgemäßen Syntheseverfahren wird zunächst Asparaginsäure an das Trägerharz gebunden, was nach folgendem Reaktionsschema erfolgt:

OH 0

Il I II

BA ^

[R) -CH₂Cl + HOC-C-CH₂-COBz

NH

Kupplungsreaktion 1 OH 0

^ Il I Il

(R) -CH₀-O-C-C-CH₀-COBz + BA-HCl ,

NH

I
ρ

Dabei bedeuten:

das mit Divinylbenzol vernetzte Polystyrolharz,

BA eine geeignete Base wie Triäthylamin, Diisopropylamin, Diisopropyläthylamin oder ein Alkalimetallsalz,

P eine Aminoschutzgruppe, vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonyl (BOC), jedoch gleichermaßen auch Amyloxycarbonyl (AMOC) oder ο-Nxtrophenylsulfenyl (NPS), und

Bz Benzyl oder ein Benzylderivat.

8098A6/060B

Unter Benzylderivat werden Derivate der Benzylgruppe wie die Benzylgruppe selbst, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl, Benzhydroxyl oder diesen Gruppen äquivalente Gruppen verstanden, wie sie in der Peptidehemie geläufig sind.

Wie aus dem obigen Reaktionsschema hervorgeht, wird tert.-Butyloxycarbonyl-L-ß-benzylaspartat an das chlormethylierte Harz in Gegenwart eines Säureakzeptors gebunden. Die Reaktion wird im nachstehenden Beispiel 2 näher erläutert.

Beispiel 2

5 g des wie zuvor beschrieben hergestellten chlormethylierten Polystyrolharzes mit einem Chlorgehalt von 0,74 mäq/g (3,7 mäq Chlor) wurden mit 2,5 g BOC-L-ßbenzylaspartat (7,4 mäq) in 25 ml absolutem Äthanol gerührt, worauf anschließend 0,99 ml Triäthylamin (7,2 mäq) zugesetzt wurden; das Gemisch wurde unter Rühren 24 h am Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde anschließend abgekühlt, durch einen Büchner-Trichter mit Glasfritte filtriert und auf der Pritte mit 100-ml-Portionen folgender Lösungsmittel gewaschen: Zweimal mit denaturiertem Alkohol (mit 5 % Methanol denaturierter Alkohol), zweimal mit Dioxan, zweimal mit denaturiertem Alkohol, zweimal mit Wasser und zweimal mit Methanol. Das Harz wurde anschließend bei 40 bis 45 °C im Vakuum getrocknet. Nach der im folgenden beschriebenen Abspaltung der BOC-Schutzgruppe mit chlorwasserstoffgesättigtem Dioxan wurde der Gehalt des Harzes an freien terminalen Aminogruppen durch Titration zu etwa O_s38 mäq/g bestimmt.

S09846/06Ö

-IH-

Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation

O H

R) -CH-O-C-C-CH₂-C-OBz

NH

I
ρ

1.

Säure

2.

Base

0 H

R] -CH₀-O-C-C-CH₀-C-OBz
<S Z ι Z

NH

Die Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation erfolgt nach dem obigen Reaktionsschema, wobei (r) , P und Bz die bereits genannte Bedeutung besitzen.

Das resultierende Produkt ist als Verbindung 1 bezeichnet. Die Abspaltung der Schutzgruppen von der Aminofunktion des Benzylaspartats erfolgt durch Entfernung der Schutzgruppen unter Verwendung einer geeigneten Säure wie Trifluoressigsäure oder Salzsäure. Das resultierende Aminosalz wird durch Behandlung mit einer starken organischen Base neutralisiert.

Das Verfahren ist im nachstehenden Beispiel 3 näher erläutert.

Beispiel 3

Eine Probe von 1 g des in Beispiel 2 hergestellten BOC-benzylaspartats wurde in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur eingebracht. Die Probe wurde

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zweimal mit je 20 ml Trichloräthylen jeweils 2 min gewaschen. Anschließend wurde ein Gemisch von 10 ml chlorwasserstoffgesättigtem Dioxan und 10 ml Trichloräthylen zugesetzt und das Gemisch 20 min zur Reaktion gebracht. Nach Filtration wurde das Trägerharz dreimal mit je 20 ml Chloroform, zweimal mit je 20 ml Methanol und zweimal mit je 20 ml Chloroform gewaschen₃ wobei jeder Waschvorgang 2 min dauerte. Die Neutralisation wurde durch 10 min Umsetzung mit 20 ml einer 10 %igen Triäthylaminlösung in Chloroform durchgeführt. Im Anschluß daran wurde das Harz dreimal mit 20 ml Chloroform und dreimal mit 20 ml Methylenchlorid gewaschen.

Ankuppeln der zweiten Aminosäure

OH- 0 CH₀—CH₀

^ HI Il I ² I ²

(S) -CH₀-O-C-C-NH₀ + AOC-CH CH₀

CH₀ N

I ² I

COBz P

Il

OH 0 CH₀—CH₀

Il I Ul²I²

-CH₀-O-C-C-NH-O-C-CH CH₀ + AOH

² I \ / ²

CH₂ N

OBz P

Il

809846/0605

oder	-CH₂	0 H Il i
		Il I -O-C-C-NH I CH₂
(R)		COBz

O H

-ΙO CH₂—CH₂

I I HOC-CH

I CH

O CHo—CH

(R) -CH₂-O-C-C-NH-O-C-CH

2 j 2 CHo

CH₉

I COBz

Il

N P

CA

Verbindung 1 ,

Dabei bedeuten:

P eine Aminoschutzgruppe wie oben beschrieben,

A einen aktiven Ester wie p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl oder Pentachlorphenyl und

CA ein Kupplungsmittel, vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), wobei jedoch auch jedes andere Kupplungsmittel, mit dem Peptidbindungen erzeugt werden können, geeignet ist, beispiels- · weise Diimide, Azide oder gemischte Anhydride.

Die Symbole Hy , P, A und CA haben hier und im folgenden einschließlich der Ansprüche die oben definierte Bedeutung.

809846/060B

Zur Vereinfachung wird die Formel des oben erhaltenen Reaktionsprodukts kurz als

Bz

bezeichnet. Dabei stehen Asp für den Asparaginsäurerest und Pro für den Prolinrest, wobei P und Bz die obige Bedeutung besitzen.

Zur Beschreibung der nachfolgenden Einzelschritte der erfindungsgemäßen Synthese wird entsprechend die international für Peptide übliche vereinfachte Nomenklatur herangezogen, gemäß der das aminoterminale Ende der Sequenz auf der linken Seite und die Carboxylgruppe auf der rechten Seite liegt; das obige Reaktionsprodukt wird entsprechend als

P-Pro-Asp-CH₂- (r)
Bz

bezeichnet, wobei

P BOC, AMOC oder NPS und

Bz Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl- p-Nitrobenzylj Benzhydryl oder diesen äquivalente Gruppen bedeuten.

Die Schutzgruppenabspaltung und Neutralisation wie oben beim Aspartatharz beschrieben führt zu einem Produkt folgender Formel;

46/

NH₂-Pro-Asp-CH₂-(R)
Bz

Hierbei handelt es sich erfindungsgemäß um die erste Synthese dieses trägergebundenen Peptids, das einen bedeutenden Schritt bei der Synthese des ACTH-Hormonfragments darstellt.

Es ist ferner von Wichtigkeit, daß jede der Kupplungsreaktionen vollständig ist; in diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß der von E. Kaiser, R. Colescott, C. D. Bossinger und P. Cook in Anal. Biochem. 3_4 (1970) 595 - 98 beschriebene Ninhydrintest zur Bestimmung herangezogen werden kann, wann die Kupplungsreaktion ausreichend vollständig abgelaufen ist. Wenn der Ninhydrintest negativ ist, kann zur Abspaltung der Schutzgruppen vom trägergebundenen Peptid und zu den nachfolgenden Kupplungsreaktionen übergegangen werden. Wenn der Test andererseits positiv ausfällt, wird der Kupplungsschritt wiederholt, bis der Ninhydrintest schließlich negativ ist.

Im folgenden wird die Kupplung von Prolin an Beispielen erläutert.

Beispiel 4

Zu dem nach Beispiel 3 hergestellten und von Schutzgruppen befreiten ß-Benzylaspartat-Harz mit 0,38 mäq Aminogruppen wurde eine Lösung von 0,8 mmol (etwa 100 % Überschuß) o-Nitrophenylsulfenylprolin (NPS-Pro) in 20 ml Methylenchlorid zugesetzt. Nach 2 min wurde eine Lösung von 0,8 mäq Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hinzugegeben,

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worauf das Gemisch 45 min gerührt wurde. Danach wurde das Produkt abfiltriert und dreimal mit jeweils 20 ml Methylenchlorid, Methanol und Trichloräthylen gewaschen. Der Ninhydrintest wurde an einer 3"bis 5 mg-Probe des Peptidharz-Reaktionsprodukts durchgeführt und erwies sich als negativ. Das Harz wurde anschließend wie im Beispiel 3 von Schutzgruppen befreit.

Beispiel 5

2 g ß-Benzylaspartat-Harz wurden wie in Beispiel 3 von Schutzgruppen befreit und neutralisiert. Danach wurden mmol BOC-prolin in Lösung in 20 ml Methylenchlorid sowie anschließend 2 mmol Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 h gerührt, filtriert und mit

2 Portionen Methylenchlorid, 2 Portionen Methanol und

3 Portionen Methylenchlorid gewaschen.

Beispiel 6

Anstelle des BOC-Derivats in Beispiel 5 kann das AMOC-Derivat in der gleichen mäq-Menge eingesetzt werden, wobei gleiche Resultate erzielt werden.

Beispiel 7

1 g des ß-Benzylaspartat-Harzes wurde wie in Beispiel 3 von Schutzgruppen befreit und neutralisiert, dreimal mit 20 ml Dimethylformamid gewaschen und 20 h mit 3,0 mäq in 20 ml Dimethylformamid gelöstem BOC-prolin-p-nitrophenylester geschüttelt. Das erhaltene Produkt wurde mit zwei Portionen Dimethylformamid, zwei Portionen Methylenchlorid, zwei Portionen Methanol und drei Portionen Trichloräthylen gewaschen.

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Beispiel 8

Anstelle des p-Nitrophenylesters von Beispiel .7
können auch die o-Nitrophenylester, Pentachlorphenylester oder andere aktive Ester Verwendung finden, wo*· bei die Reaktion wie in Beispiel 7 durchgeführt wird.

Synthese des Peptids

In der folgenden Tabelle 1 sind die entsprechend aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte 2 bis 25 unter Bezeichnung der jeweiligen Verknüpfungsposition in
der Kette unter Nennung des in jedem Schritt ansynthetisierten Reaktanten sowie der bevorzugten
Schutzgruppen aufgeführt:

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	Position	Tabelle 1
Reaktion	Nr.	ansynthetisierte
Nr.	24	Aminosäure
2	23	Prolin
3	22	Tyrosin
4	21	Valin
5	20	Lysin
6	19	Valin
7	18	Prolin
8	17	Arginin
9	16	Arginin
10	Lysin

15

Lysin

12	14	Glycin
13	13	Valin
14	12	Prolin
15	11	Lysin
16	10	Glycin
17	9	Tryptophan
18	8	Arginin
19	7	Phenylalanin
20	6	Histidin
21	5	Glutaminsäure
22	4	Methionin
23	3	Serin
24	2	Tyrosin
25	1	Serin

Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe

BOC-L-prolin

BOC-L-tyrosin

BOC-L-valin

BOC-e -trifluoracetyl-L-lysin

BOC-L-valin
BOC-L-prolin
BOC-L-tosylarginin BOC-L-tοsy!arginin

BOC-S -trifluoracetyl-L-lysin

BOC-ε -trifluoracetyl-L-lysin

BOC-glycin

BOC-L-valin

BOC-L-prolin

BOG-£-trifluoracetyl-L-lysin

BOC-glycin
BOC-L-tryptophan BOC-L-tosylarginin BOC-L-phenylalanin

BOC-im-carbobenzyloxy-L-histidin

BOC-L-benzylglutamat BOC-L-methionin BOC-0-benzyl-L-serin BOC-L-tyrosin

BOC~0-benzyl-L-serin

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. Jeder folgende Reaktionsschritt der Verknüpfung einer weiteren Aminosäuregruppe verläuft dabei in der gleichen allgemeinen Weise wie bei der Verknüpfung von Prolin in Reaktion 2 (vgl. Beispiel 5) beschrieben, wobei das jeweils zuvor erhaltene Peptidharz mit der folgenden Aminosäure in geschütztem Zustand gekuppelt und die Schutzgruppe vom neu angekuppelten Peptid abgespalten und neutralisiert wird. Im einzelnen werden dabei jeweils folgende Reaktionsschritte vorgenommen:

Kupplung:

0,8 mmol der jeweiligen Aminosäure (100 % Äquivalent Überschuß in 15 ml Methylenchlorid oder DMF-Gemisch, falls erforderlich),

0,8 mmol Dicyclohexylcarbodiimid (Kupplungsmittel) in 5 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 45 min,

3 x Waschen mit je 20 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

2 χ Waschen mit je 20 ml Methanol, jeweils 2 min, und

3 x Waschen mit je 20 ml Trichloräthylen, jeweils 2 min.

Abspaltung der Schutzgruppe:

10 ml chlorwasserstoffgesättigtes Dioxan + 10 ml Trichloräthylen, Reaktionszeit 20 min. (Nach Reaktion 16 wird 1 % 2-Mercaptoäthanol oder Äthandithiol zu dem säuregesättigten Dioxangemisch zugesetzt),

2 χ Waschen mit je 20 ml Chloroform, jeweils 2 min,

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2 χ Waschen mit je 20 ml Methanol_s jeweils 2 min₅ und

3 χ Waschen mit je 20 ml Chloroform, jeweils 2 min.

Neutralisation:

20 ml 10 % Triäthylamin in Chloroform, 10 min, 3 χ Waschen mit je 20 ml Chloroform, jeweils 2 min, und 3 χ Waschen mit je 20 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Wie bereits angegeben, weist die aus Reaktion herrührende Verbindung 3 nach Schutzgruppenabspaltung und Neutralisation folgende Struktur auf:

(3) NH₀-Tyr-Pro-Asp-Cli₉- (R) ζ I I

Y Bz

Bz Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl und

Y Wasserstoff, Bz oder 2-Bromcarbobenzyloxy bedeuten.

Nach Reaktion 4 liegt Verbindung 4 vor:

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(4) NI^-Val-Tyr-Pro-Asp-CH^ . Y Bz

mit Bz und Y wie bei Verbindung 3.

Bei der Verknüpfung von Lysin in Reaktion 5, .Position 21, wird als Schutzgruppe für die £ -Aminogruppe Trifluoracetyl (TPA) bevorzugt, jedoch können in gleicher Weise auch Carbobenzyloxy (CBZ), 2-Bromcarbobenzyloxy, 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy oder 2-Chlorcarbob'enzyloxy (Cl-CBZ) verwendet werden. Das Symbol V bezeichnet dabei die β -Amino-Schutzgruppe in den Fällen der oben genannten Gruppen.

Nach der Kupplung in Position 21, anschließender Schutzgruppenabspaltung und Neutralisation in üblicher Weise liegt ein trägergebundenes Peptid folgender Struktur vor:

NH₂-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-CH₂-V Y Bz

Zur Kupplung der Aminosäure Arginin in Reaktion 8 und Position 18 wird vorzugsweise zum Schutz der Guanidinogruppe die Tosylgruppe (p-Toluolsulfonyl) herangezogen, jedoch kann auch eine Nitrogruppe Verwendung finden; hier und im folgenden wird für die Nitro- oder Tosylgruppe, das Symbol T verwendet.

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Nach dem Ankuppeln von Arginin in Position 18 und Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation in üblicher Weise liegt ein trägergebundenes Peptid folgender Struktur vor:

NH₉-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-CH₀~

ι- ι ι ι

T V Y Bz

wobei V, Y und Bz wie für Verbindung 5 definiert sind und T die obige Bedeutung besitzt.

Zur Kupplung des Histidins in Reaktion 20 und Position 6 wird zum Schutz der Imidazolgruppe vorzugsweise die Carbobenzyloxygruppe (CBZ) verwendet, jedoch können auch Tosyl, Dinitrophenyl, Benzyl oder Benzylderivate Verwendung finden; auch kann ohne Anwendung einer Schutzgruppe verfahren werden. Mit dem Symbol W ist entsprechend entweder keine Schutzgruppe oder eine der oben
genannten Gruppen bezeichnet.

Nach dem Ankuppeln des Histidins in Reaktion 20,
Position 6, und in üblicher Weise vorgenommener Schutzgruppenabspaltung und Neutralisation liegt ein trägergebundenes Peptid folgender Struktur vor:

NH^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys- ^Z I I I I

WT V V

Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-AsP-CH₀-ill I I I ²

VTT V Y ' Bz

8098A6/06ÖB

wobei T, ν, Y und Bz wie bei "Verbindung 5 definiert sind und W die obige Bedeutung besitzt.

Nach jeder Kupplungsreaktion sowie vor der Schutzgruppenabspaltung des trägergebundenen Peptide wird der Ninhydrintest durchgeführt. Wenn der Test positiv ist, wird die zuletzt durchgeführte Kupplungsreaktion wiederholt; fällt der Test negativ aus, wird zur Schutzgruppenabspaltung am trägergebundenen Peptid übergegangen.

Nach der Verknüpfung des Serins in Reaktion 25 in Position 1 nach der oben angegebenen Reaktionsweise und in der beschriebenen Sequenz wird nach Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation des trägergebundenen Peptids die Verbindung 25 folgender Struktur erhalten:

N^-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys Bz Y Bz Bz ¥ T V

Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr VVTT V Y

I
Bz

bei der W, T, V, Y und Bz dieselbe Bedeutung wie bei Verbindung 20 besitzen.

809846/0601

Die trägergebundenen Peptide können anschließend zur Abspaltung vom Trägerharz sowie zur Abspaltung der Schutzgruppen wie in den Beispielen 8 und 9 behandelt werden. So können die Abspaltung des Peptids vom Trägerharz sowie die Abspaltung der meisten oder aller verbleibenden Schutzgruppen durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff vorgenommen werden.

Wenn V Carbobenzyloxy (CBZ), 2-Bromcarbobenzyloxy,

2.4-Dichlorcarbobenzyloxy oder 2-Chlorcarbobenzyloxy hl

(Cl-CBZ) bedeutet, kann diese Reaktion L^Sgg£i£Jgi^t. J folgendermaßen erläutert werden:

Reaktion 26
NHo-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-

² r ί r ■ ι ι ι ι

Bz Y Bz Bz W T V

Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-

IiII I I

VVTT V Y

Pro-Asp-CH - (T) + HF >

Bz

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp

(Verbindung 26)

Wenn V TFA ist, liegt nach Reaktion 26 eine Verbindung folgender Struktur vor:

809846/0606

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-

TFA

VaI- Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Ly s-Val -■ Tyr-Pro-Asp TFA TFA TFA ^:/

(Verbindung 26a)

Beispiel 8 . "

Das Beispiel erläutert die Abspaltungsreaktion, wenn die Schutzgruppe V Carbobenzyloxy, 2-Bromcarbobenzyloxy, 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy oder Chlorcarbobenzyloxy ist. 0,4 g der Verbindung 25 wurden in ein Reaktionsgefäß aus synthetischem Material (KeI-P) zusammen mit 1 ml Anisol eingebracht und 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff hinzudestilliert. Das Gemisch wurde 1 h bei 0 ⁰C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde anschließend durch Vakuumdestillation entfernt, der Rückstand viermal mit Äthylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Eisessigextrakt wurde lyophilisiert und ergab 99 mg eines lockeren weißen Pulvers. Dieses Verfahren erlaubt eine Trennung des Peptide vom Trägerharz sowie eine Entfernung aller Schutzgruppen auf den Aminosäuren. Das als Verbindung 26 bezeichnete Produkt besitzt aufgrund des Aktivitätstests/ -B^rS-rP^—afrB«#4- ACTH-Aktivität. ' fnaohträo'ikTjTl Π kick i.S. P., IkikdSkUs fUrin+copo**,) Ljgeänc·^^ J

Beispiel 9

Das Beispiel erläutert die Abspaltungsreaktion, wenn V Trifluoracetyl (TFA) darstellt. 0,4 g der Ver-

809846/0605

bindung 25 wurden in ein Reaktionsgefäß aus synthetischem Material (KeI-P) zusammen mit 1 ml Anisol eingebracht, worauf 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff hinzudestilliert wurden. Das Gemisch wurde 1 h bei 0 ⁰C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde anschließend durch Vakuumdestillation entfernt, der Rückstand viermal mit Äthylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Essigsäureextrakt wurde lyophilisiert und ergab ein lockeres weißes Pulver. Dieses Verfahren erlaubt eine Abspaltung des Peptids vom Trägerharz und entfernt alle Schutzgruppen auf den bifunktionellen Aminosäuren außer der Trifluoracetylgruppe (TFA) der Lysinreste. Das entsprechende Produkt wird als TFA-Peptid (Verbindung 26a) bezeichnet.

0,3 g des TFA-Peptids wurden 3 h in 5 ml 0,2 m Piperidin gerührt. Die Lösung wurde anschließend filtriert und lyophilisiert. Die erhaltene Verbindung entsprach Verbindung 26, Beispiel 8, und besaß beim Aktivitätstest (U.S.P. assay) ACTH-Aktivität.

In der vorstehenden Beschreibung wurde in Reaktion 1, Position 25, Asparaginsäure mit dem Trägerharz verknüpft. Anstelle der Asparaginsäure kann in dieser Position auch Asparagin (Asn) eingesetzt werden, wobei BOC-L-asparagin als Reaktant eingesetzt wird; dabei können die gleichen Reaktionsbedingungen und dieselbe Reihenfolge der Aminosäuren wie oben beschrieben angewandt werden. In diesem Falle besitzen die Verbindungen nach den einzelnen unten genannten Reaktionsschritten folgende Struktur:

809846/060E

Reaktion 1

NH₂-Asn-CH₂- ( R

Reaktion 2

NH₂-PrO-ASn-CH₂- (R

Reaktion 4

NH^-Val-Tyr-Pro-Asn-CHo-(R ζ ι Z V__^

Reaktion 5

NH_O-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-CH_O- (R

Zi ι Ζ ν >

Reaktion 8 NH^-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-CH,,- { R

²I Il

T VY

Reaktion 20 NH^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-

Xi T V " V V

Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-CH^- (r)

Il Il ^{2 w}

TT VY

809846/0608

Reaktion 25

NHo-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-

²IlI Il I

Bz Y Bz Bz W T

Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-

.1 I I I I I

V VVTT V

VaI-TYr-PrO-AStI-CH₂-

Wenn V TFA bedeutet, besitzt die nach Abspaltung vom Harz mit HF erhaltene Verbindung, bei der in Position 25 Asparagin verknüpft wurde, folgende Struktur:

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-

TFA Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-

I I I

TFA TFA TFA

Tyr-Pro-Asn

Beispiel 10

Entsprechend Beispiel 2 wurde ein von Schutzgruppen befreites ß-Benzylaspartat ~ Harz

NH₂-ASp-CH₂- (RJ Bz

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hergestellt. 1 g dieses Harzes mit einem Aminogehalt von 0,38 mäq/g wurde, zur Synthese eines 1-25-ACTH-Peptids herangezogen. Die folgenden BOC-Aminosäuren wurden in der entsprechenden Sequenz angekuppelt:

Reaktion 2 . ·

BOC-Aminosäure: 0,17 g BOC-prolin.

Kupplung: 20 ml Methylenchlorid + 0,2 g DCC, Reaktionsdauer lh.

Waschen: 3 x mit je 20 ml Methylenchlorid, 3 x mit je 20 ml Methanol und 3 x mit je 20 ml Trichloräthylen.

Schutzgruppenabspaltung: 10 ml HCl-gesättigtes Dioxan + 10 ml Trichloräthylen, Reaktionszeit 20 min. Waschen: 3 x mit je 20 ml Chloroform,, 3 x mit je 20 ml Methanol und ~ 3 x mit je 20 ml Chloroform.

Entfernung der Säure: 10 ml Chloroform mit 10 % Triäthylamin, Reaktionszeit 10 min. Waschen: 2 χ mit je 20 ml Chloroform und 3 x mit je 20 ml Methylenchlorid.

Reaktion 3

BOC-Aminosäure: 0,3 g BOC-0-benzyltyrosin. Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion 1 Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

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Reaktion 4

BOC-Aminosäure: 0,17 g BOC-valin Kupplung: Wie in Reaktion Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion

Reaktion 5

BOC-Aminosäure: 0,3 g BOC-S-CBZ-lysin Kupplung: Wie in Reaktion Schut zgruppenab spaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie¹ in Reaktion

Reaktion 6

Reaktion 7

BOC-Aminosäure: 0,17 g BOC-prolin Kupplung: Wie in Reaktion

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Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 8

BOC-Aminosäure: 0,26 g BOC-nitroarginin

Kupplung: 5 ml Dimethylformamid + 15 ml Methylenchlorid, Reaktionsdauer 1 h. Waschen: 3 x mit je 20 ml Methylenchlorid, 3 x mit je 20 ml Methanol und 3 x mit je 20 ml Trichloräthylen.

Reaktion 9

BOC-Aminosäure: 0,25 g BOC-nitroarginin Kupplung: Wie in Reaktion 8 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 10

BOC-Aminosäure: 0,3 g BOC-£-CBZ-lysin Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

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Reaktion 11 BOC-Aminosäure: 0,3 g BOC-£ -CBZ-lysin Kupplung; Wie in Reaktion Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion

Reaktion 12 BOC-Aminosäure: 0,14 g BOC-glycin Kupplung: Wie in Reaktion Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion

Reaktion 13 BOC-Aminosäure: 0,17 g BOC-valin Kupplung: Wie in Reaktion Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion

Reaktion 14 BOC-Aminosäure: 0,17 g BOC-prolin Kupplung: Wie in Reaktion Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion

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Reaktion 15

BQC-Aminosäure: 0,3 g BOC-£-CBZ-lysin Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 16

BOC-Aminosäure: 0,14 g BOC-glycin Kupplung: Wie in Reaktion 1 S chut zgruppenab spaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 17

BOC-Aminosäure: 0,24 g BOC-tryptophan Kupplung: Wie in Reaktion 8 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion 1 + 0,5 %

2-Mercaptoäthanol

Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 18

BOC-Aminosäure: 0,26 g BOC-nitroarginin Kupplung: Wie in Reaktion 8 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

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Reaktion 19

BOC-Aminosäure: 0,21 g BOC-phenylalanin Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure; Wie in Reaktion 1.

Reaktion 20

BOC-Aminosäure: 0,28 g BOC-im-CBZ-histidin Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 21

BOC-Aminosäure: 0,28 g BOC- 'jf-benzylglutamat Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 22

BOC-Aminosäure: 0,2 g BOC-methionin Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schut zgruppenab spaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 23

BOC-Aminosäure: 0,2*1 g BOC-0-benzylserin Kupplung: Wie in Reaktion 1

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Reaktion 24

BOC-Aminosäure: 0,30 g BOC-0-benzyltyrosin Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung; Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Reaktion 25

BOC-Aminosäure: 0,24 g BOC-0-benzylserin Kupplung: Wie in Reaktion 1 Schutzgruppenabspaltung: Wie in Reaktion Entfernung der Säure: Wie in Reaktion 1.

Das schließlich erhaltene trägergebundene Peptid (1,5 g) wurde wie in Beispiel 8 mit HF behandelt, worauf ein biologisch aktives 1-25-ACTH-Peptid erhalten wurde. Die Aktivität des Rohprodukts betrug 5 U/mg.

Beispiel 11

5 g chlormethyliertes Polystyrol-Trägerharz wurden in derselben Weise wie in Beispiel 2 für die Veresterung mit BOC-ß-benzylaspartat beschrieben mit 7,4 mäq BOC-asparagin verestert.

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Sämtliche übrigen Reaktionen waren mit denen von Beispiel 10 identisch, wonach ein 1-25-Asparagin-Peptid mit biologischer Aktivität erhalten wurde.

Die Erfindung betrifft zusammengefaßt trägergebundene Peptide und ihre Herstellung, die sich zur Herstellung von Peptiden mit biologischer Aktivität günstig einsetzen lassen, insbesondere trägergebundene Peptide, die die Struktur Pro-Asp-CHp- (r) oder PrO-ASn-CH₂- (r) an einem Ende der Aminosäurekette enthalten, wobei Qy das Trägerharz und Pro, Asp und Asn die Aminosäuren Prolin, Asparaginsäure und Asparagin bedeuten; ferner werden entsprechende Herstellungsverfahren angegeben.

Aus den vorstehenden Angaben geht hervor, daß sich erfindungsgemäß trägergebundene sowie freie Peptide herstellen lassen, die in unerwarteter Weise biologische Aktivität aufweisen.

Die in den Beispielen angegebenen Daten sind lediglich beispielhaft und nicht einschränkend zu verstehen, da im Rahmen des üblichen Fachwissens liegende Modifizierungen ebenfalls von der Erfindung umfaßt werden.

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Claims

BEETZ-LAMPRECHT-BEETZ München 22 - Steinsdorfstr. 1O TELEFON (O89) 22 72 01 - 22 72 44 - 29 5910 Telex 5 22048 -Telegramm Allpatent München !807220

542-27.895p

PATENTANWÄLTE

Dipl.-Ing. R. BEETZ sen. DIpI.-Ing. K. LAMPRECHT Dr.-Ing. R. BEETZ Jr. Dlpl.-Phys. U. HEIDRICH auch Rechtsanwalt Dr.-Ing. W. TIMPE Dipl.-Ing. J. SIEGFRIED

2o. Febr. 1978

X.j

Ansprüche

Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₂-PrO-ASp-CH₂-Bz

mit

= vernetztes Polystyrolharz und

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl.

2.

Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH_O-Tyr-Pro-Asp-CH„- (R)

^d I I

Y Bz

mit

und Bz wie in Anspruch 1, und Y = H oder Bz.

3.

Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₀-LyS -Val-Tyr-Pro-Asp-CH,,· ²I I I

V Y Bz

mit

5M2-(Case 5224)-PSE

41/

und Bz wie in Anspruch 1, - Y wie in Anspruch 2 und

V = Carbobenzyloxy, 2-Chlorcarbobenzyloxy, 2-Bromcarbobenzyloxy, Dichlorcarbobenzyloxy oder Trifluoracetyl.

4. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NHo-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Pho-Arg-Trp-Gly-

²IIi I ! I

Bz Y Bz Bz W T

Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-

I I I I I I

V VVTT V

Val-Tyr-Pro-Asp.-CH^- (T) Y Bz

mit

und Bz wie in Anspruch 1,

Y wie in Anspruch 2,

V wie in Anspruch 3,

T = Tosyl oder Nitro und

W = Carbobenzyloxyj Tosyl, Dinitrophenyl, Bz oder H.

5. Peptid der Struktur

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Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-

TFA

Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val

TFA TFA TFA

Tyr-Pro-Asp

mit

TFA = Trifluoracetyl.

6„ Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptide, dadurch gekennzeichnet_s daß L-Pro-P mit

P = tert.-Butyloxycarbonyl, Amyloxycarbonyl oder

o-Nitrophenylsulfenyl mit dem Reaktanten

NH₂-AsP-CH₂- (r) Bz

mit

und Bz wie in Anspruch 1,

oder einem aktiven Ester oder Azid davon zu dem trägergebundenen Peptid

P-Pro-Asp-CH₂-

Bz mit

HU und Bz wie in Anspruch 1 und P wie oben umgesetzt wird, wobei die Kupplung, wenn der Reaktant keinen

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aktiven Ester, kein Azid oder kein Anhydrid darstellt, in Gegenwart eines Diimids vorgenommen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6,

dadurch gekennzeichnet, ; .-:■

daß das Reaktionsprodukt von Anspruch 6 zur Abspaltung von P mit einer Säure behandelt wird. . -

8. Verfahren nach Anspruch 7»
dadurch gekennzeichnet,

daß P-L-tyrosin mit dem Reaktionsprodukt'von Anspruch 7 oder einem aktiven Ester oder Azid davon zu einem trägergebundenen Peptid der Struktur:

P-Tyr-Pro-Asp-CH,,-

ι I ²

y Bz

mit

und Bz wie in Anspruch 1, Y wie in Anspruch 2 und
P wie in Anspruch 6

gekuppelt wird, wobei die Kupplung, wenn der Reaktant keinen aktiven Ester oder kein Azid darstellt, in Gegenwart eines Diimids vorgenommen wird.

9. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids,

dadurch gekennzeichnet,

daß L-Ser-P mit dem Reaktanten

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28Ö7220

s-

NH^-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Ly

²II Il I ί

Y Bz Bz. W T V

Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-

I I I I I

VVTT V

Tyr-Pro-Asp-CH₂~ U*)
Y Bz

mit

und Bz wie in Anspruch 1,

Y wie in Anspruch 2_S

V wie in Anspruch 3 und
W und T wie in Anspruch 4

gekuppelt wird, wobei die Kupplung, wenn der Reaktant keinen aktiven Ester oder kein Azid darstellt, in Gegenwart eines Diimids vorgenommen w?rd.

10. Trägergebundenes Peptid der Struktur NH₂-Pro-Asn-CH₂-

mit

wie in Anspruch 1.

11. Trägergebundenes Peptid der Struktur

ΝΗ,,-Tyr-Pro-Asn-CH,,- (R
Y

mit

09848/0

Cr) wie in Anspruch 1 und
- Y wie in Anspruch 2.

12. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NHo-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-

²IlI Il I

Bz Y Bz Bz W T

Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-V VVTT V

Val-Tyr-Pro-Asn-CH₂-

mit

und Bz wie in Anspruch 1,

Y wie in Anspruch 2,

V wie in Anspruch 3 und

T und W wie in Anspruch 4.

13. Peptid der Struktur

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-

TFA Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-

I I I

TFA TFA TFA

Tyr-Pro-Asn

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mit

TFA = Trifluoracetyl.

14. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß L-Pro-P

mit

P wie in Anspruch mit dem Reaktanten

NH₂-ASn-CH₂- (R

mit

wie in Anspruch

oder einem aktiven Ester oder einem Azid davon gekuppelt wird, wobei die Kupplung, wenn der Reaktant keinen aktiven Ester oder kein Azid darstellt, in Gegenwart eines Diimids vorgenommen wird.

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