DE2703844A1

DE2703844A1 - Peptide und ihre herstellung

Info

Publication number: DE2703844A1
Application number: DE19772703844
Authority: DE
Inventors: Charles D Bossinger; Robert L Colescott; Emil Kaiser
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1976-02-13
Filing date: 1977-01-31
Publication date: 1977-08-18
Also published as: CA1090784A; FR2362120B1; FR2362120A1; GB1570762A; US4242238A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Peptidsynthese, insbesondere auf trägergebundene Peptide mit biologischer Aktivität bzw. trägergebundene Peptide, die zur Herstellung biologisch aktiver Peptide verwendbar sind. Die Erfindung umfaßt dabei sowohl die Peptide als neue Verbindungen als auch ihr Herstellungsverfahren.

Seit langem werden bestimmte natürliche biologisch aktive Substanzen aus dem Material tierischer Drüsen gewonnen, die zur Behandlung von Mangelerscheinungen in der Humanmedizin Verwendung finden. Eine derartige Substanz ist das sog. adrenocorticotrope Hormon, üblicherweise kurz als ACTH bezeichnet, das aus tierischen Hypophysen gewonnen werden kann.

-(Case 6OCY)-FSBk

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Die große Mühe, die mit der Gewinnung der relativ kleinen Hypophysen von Tieren verbunden ist,sowie die zu ihrer Gewinnung erforderlichen aufwendigen Verfahrensschritte, die nur zu geringen Mengen an aktivem Material führen, machen es außerordentlich wünschenswert, praktikable Verfahren zur Synthese derartiger biologisch aktiver Substanzen zu entwickeln.

Zur Synthese bestimmter Peptide mit relativ kurzer Aminosäurekettenlänge sind einige Laboratoriumsverfahren vorgeschlagen worden; hierzu sind zu nennen: R. B. Merrifield: 'Solid Phase Peptide Synthesis I. The Synthesis of a Tetrapeptide', J. Am. Chem. Soc. Vol. 85 (1963) 2149 - 54, sowie J. W. Stewart, J. D. Young: 'Solid Phase Peptide Synthesis', W. H. Freemann Company, San Francisco, California.

In der US-PS 3 915 949 sind praktische Verfahren angegeben, nach denen das Hormon ACTH synthetisiert werden kann. ACTH weist eine Kette aus 39 Aminosäuren in bestimmter Sequenz auf. Nach dem angegebenen Verfahren zur Synthese der biologisch aktiven Verbindung muß jeder Aminosäurerest jeweils einzeln und in einer bestimmten Sequenz an eine molekulare Struktur angeknüpft werden, wobei Jede dieser Reaktionen mit dem Risiko der Erzeugung fehlerhafter Sequenzen verknüpft ist und die Summierung dieser Risiken zu einem fehlerhaft aufgebauten Produkt oder gravierend verschlechterter Wirksamkeit führt.

Hiervon ausgehend wurde erfindungsgemäß angestrebt, neue Substanzen mit kürzerer Aminosäurekettenlänge zu synthetisieren, die gleiche oder sogar höhere biologische Aktivität als bisher bekannte Substanzen aufweisen, wobei

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,8.

Synthesewege für derartige Verbindungen aufgesucht wurden. Im Zusammenhang damit wurden neue Verfahren und neue Zwischenprodukte entwickelt, die die Herstellung neuer biologisch aktiver Substanzen erleichtern.

Der Erfindung liegt die Auffindung einer Verbindung mit einer Kette aus 28 Aminosäuren zugrunde, die biologische Wirkung als andrenocorticotropes Hormon aufweist, wobei ferner Zwischenprodukte mit kürzerer Aminosäurekettenlänge aufgefunden wurden, die sich günstig zur Herstellung dieser Substanz eignen und auch bei der Herstellung anderer Verbindungen mit biologischer Aktivität vorteilhaft einsetzbar sind. Hierzu werden ebenfalls neu entwickelte praktische Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und der entsprechenden Zwischenprodukte angegeben.

Die erfindungsgemäße Synthese verläuft allgemein in bzw. an fester Phase, wobei ein unlösliches, durch katalytische Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhaltenes, vernetztes Harz zunächst chlormethyliert wird.

An das chlormethylierte Harz wird zunächst Glutaminsäure angekuppelt, worauf Alanin und anschließend die übrigen Aminosäuren der Kette in vorgeschriebener Sequenz unter Verwendung eines Systems der Bildung und Wiederabspaltung von Schutzgruppen der aktiven Amino- und Carboxylgruppen ansynthetisiert werden. Anschließend an das Ankuppeln der letzten Aminosäure der Kette werden die Peptidketten vom Trägerharz abgespalten und die verbliebenen Schutzgruppen entfernt.

Wenn nichts anderes angegeben liegen alle eingesetzten

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Aminosäuren in Form ihrer natürlich vorkommenden L-Isomeren vor.

Bei der erfindungsgemäßen Synthese werden die funktioneilen Gruppen der Aminosäuren durch Schutzgruppen geschützt. Die OC-Aminogruppen der Aminosäuren werden dabei durch tert-Butyloxycarbonylgruppen oder ihnen gleichwertige Gruppen geschützt; die tert-Butyloxycarbonylgruppe wird kurz als BOC bezeichnet.

Die Hydroxylfunktion des Serins wird mit einer Benzylgruppe oder einer Gruppe aus einem Benzylderivat wie etwa 4-Methoxybenzyl, 4-Methylbenzyl, 3.4-Dlmethylbenzyl, 4-Nitrobenzyl, Benzhydryl oder einer ihnen gleichwertigen Gruppe geschützt. Diese Gruppen werden mit der Abkürzung Bz bezeichnet.

Die Hydroxylfunktion des Tyrosins kann ungeschützt bleiben oder mit einer Bz Gruppe wie oben beschrieben geschützt werden, ferner mit einer Benzyloxycarbonylgruppe oder einem Benzyloxycarbonylderivat wie etwa einer 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe oder einer 2-Brombenzyloxycarbonylgruppe oder ihnen gleichwertigen Gruppen geschützt werden. Die Abkürzung Y bedeutet entweder keine Schutzgruppe oder Bz, Benzyloxycarbonyl oder ein Benzyloxycarbonylderivat.

Die Guanidinofunktion des Arginine kann durch eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe oder eine ihnen gleichwertige Gruppe geschützt werden. Zur Bezeichnung einer Nitrogruppe, einer Tosylgruppe oder einer ihnen gleichwertigen Gruppe wird die Abkürzung T verwendet.

Zur Verknüpfung von Lysin wird zum Schutz seiner £.-Aminofunktion die Trifluoracetylgruppe (TPA) verwendet, jedoch sind such Carbobenzyloxy (CBZ), 2-Chlorcarbobenzyloxy (Cl-CBZ),

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2-Bromcarbobenzyloxy oder etwa 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy gleichermaßen verwendbar. Zur Bezeichnung dieser Gruppen wird die Abkürzung V verwendet.

Die Amidfunktion des Asparagine kann ungeschützt bleiben oder mit einer Xanthydryl-oder einer Benzhydrylgruppe geschützt werden. Zur Bezeichnung von Wasserstoff oder einer derartigen Gruppe wird die Abkürzung P¹ verwendet.

Zum Schutz des Imidazolstickstoffs des Histidins ist die Benzyloxycarbonylgruppe bevorzugt, jedoch sind auch Tosyl, Dinitrophenyl, Benzyl oder Benzylderivate gleichermaßen anwendbar, ferner kann in gleicher Weise auch keine Schutzgruppe verwendet werden. Zur Kennzeichnung des Fehlens einer Schutzgruppe oder zur Bezeichnung eines der genannten Derivate wird die Abkürzung W verwendet.

Die ut-Carbonsäuregruppe der Glutaminsäure wird mit einer Bz-Gruppe geschützt.

Bei den Kupplungsreaktionen können Kupplungsmittel wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder andere Kupplungsmittel verwendet werden, die Peptidbindungen bilden, beispielsweise Diimide, Azide oder Anhydride sowie aktive Ester. Bei der Verknüpfung von Asparagin sollte das Kupplungsmittel DCC nicht eingesetzt werden, wenn das Asparagin keine geeignete, daran gebundene Schutzgruppe wie Benzhydryl oder Xanthydryl aufweist. Ohne eine derartige Schutzgruppe führt DCC zu einer Nebenreaktion, die einen Teil des Asparagine verbraucht. Alternativ dazu kann Asparagin in ungeschütztem Zustand als aktiver Ester angekuppelt werden.

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Herstellung des Trägerharzes;

Das mit dem Symbol (R) bezeichnete Trägerharz ist ein Polymermaterial, das durch katalytische Polymerisation von Styrol und Divinylbenzol erhalten wird.

Das Harz wird unter Verwendung von Chlormethylmethyläther und Zinnchlorid als Katalysator nach folgender Reaktionsgleichung chlormethyliert:

SnCl₄
(r) + Cl-CH₂OCH₃ > (r) -CH₂₁-Cl + CH₃OH.

Glutaminsäure-Veresterung an das Trägerharz:

Nach dem erfindungsgemäßen Syntheseverfahren wird zunächst Glutaminsäure an das Trägerharz gebunden, was nach folgendem Reaktionsschema erfolgt:

H 0

- CH₂Cl + HOOC-C-CH₂-CH₂-C-OBz _BA ^

NH

OH 0

IT) - CH_o-0-c'-C-CH₉-CH₉-C - OBz + BA-HCl

NH
1
P

Dabei bedeuten

das Polystyrolharz,

BA eine geeignete Base wie Triäthylamin, Diisopropylamin oder ein Alkalimetallsalz,

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P eine Aminoschutzgruppe, vorzugsweise tert-Butoxycarbonyl (BOC), jedoch gleichermaßen auch Amyloxycarbonyl (AMOC) oder o-Nitrophenylsulfenyl (NPS) und

Bz Benzyl oder ein Benzylderivat wie p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl.

Wie aus dem obigen Schema hervorgeht, wird tert-Butoxycarbonyl- L- "Jf-benzylglutamat an das chlormethylierte Harz in Gegenwart eines Säureakzeptors gebunden.

Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation;

Die Abspaltung der Schutzgruppen von der Aminofunktion des Benzylglutamats erfolgt durch Entfernung der Schutzgruppen unter Verwendung einer geeigneten Säure wie Trifluoressigsäure oder Salzsäure. Das resultierende Atninosalz wird durch Behandlung mit einer starken organischen Base neutralisiert. Der Reaktionsverlauf wird durch nachfolgendes Reaktionsschema verdeutlicht:

0 H
Il I

NH 2· Base

R) -CH₂-O-C-C-CH₂-CH₂-C-O-Bz 1. Säure

OH 0

R) -CH₂-O-C-C-CH₂-CH₂-C-O-Bz NH₂

wobei Cr) , P und Bz dieselbe Bedeutung wie oben besitzen.

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Die Verbindung

O H

R) -CH₂-O-C-C-CH₂-CH-C-O-Bz NH₂

wird kurz als

NH₀-GLU-CH₀- ( R,

i. j Z V_-^

Bz

bezeichnet. Dabei steht GLU für den Glutamatrest, wobei und Bz die obige Bedeutung besitzen. Zur Beschreibung der nachfolgenden Einzelschritte der erfindungsgemäßen Synthese wird entsprechend die international für Peptide übliche vereinfachte Nomenklatur herangezogen, gemäß der das atninoterminale Ende der Sequenz auf der linken Seite liegt.

Zur Kupplung der Verbindung NH₂-GLU-CH₂- (jj) mit ALA

Bz -

kann BOC-L-Alanin herangezogen werden, in dem die zu verknüpfende Aminosäure mit der Schutzgruppe verbunden ist und die als solche erhältlich oder nach bekannten Verfahren herstellbar ist. Nach der Abspaltung der Schutzgruppen resultiert die Verbindung

NH₀-ALA-GLU-CH₀-ζ ι ζ

Bz

mit (r) und Bz wie oben definiert. Diese Verbindung ist neu und stellt ein bedeutendes Zwischenprodukt, bei der Synthese von Verbindungen mit hormonaler Aktivität dar.

Diese Verbindung kann anschließend unter Verwendung von BOC-Glycin weiter verknüpft werden, woraus nach Abspaltung

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* /fs*

der Schutzgruppen und Neutralisation die Verbindung

NH₂GLY-ALA-GLu-CH₂ (~r) Bz

erhalten wird, die im Anschluß daran mit einem BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester gekuppelt werden kann, wonach nach Abspaltung der Schutzgruppen die Verbindung

NH₀-ASN-GLY-ALA-GLu-CH₀-P¹ Bz

mit R , Bz und P' wie oben definiert erhalten wird. Diese Verbindung kann unter Verwendung von BOC-L-Prolin entsprechend mit Prolin verknüpft werden. Kupplung, Schutzgruppenabspaltung und Neutralisation werden für jeden Kupplungszyklus wiederholt. Auf diese Weise können die vorgeschriebenen Aminosäuren in der Sequenz, in der sie in der Aminosäurekette der natürlichen ACTH-Struktur vorkommen, bis zum letzten Zyklus aneinandergekuppelt werden, in dem Serin in Position 1 angekuppelt wird. Die bevorzugten Reaktanten zur Verwendung bei den Kupplungsreaktionen sind für die jeweiligen Positionen 27 - 1 in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.

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Tabelle 1

Posi tion Nr.	Angekuppelte Amino säure	Aminosäuregruppe mit bevorzugter Schutzgruppe
27	Alanin (ALA)	BOC-L-Alanin
26	Glycin (GLY)	BOC-Glycin
25	Asparagin (ASN)	BOC-L-Asparagin-p-nitro- phenylester
24	Prolin (PRO)	BOC-Prolin
23	Tyrosin (TYR)	BOC-L₇- Tyrosin
22	Valin (VAL)	BOC-L-Valin
21	Lysin (LYS)	BOC- ε-TFA-L-Lysin
20	Valin (VAL)	BOC-L-Valin
19	Prolin (PRO)	BOC-Prolin
18	Arginin (ARG)	BOC-L-Tosylarginin
17	Arginin (ARG)	BOC-L-Tosylarginin
16	Lysin (LYS)	BOC- ε-TFA-L-Lysin
15	Lysin (LYS)	BOC- f. -TFA-L-Lysin
14	Glycin (GLY)	BOC-Glycin
13	Valin (VAL)	BOC-L-Valin
12	Prolin (PRO)	BOC-L-Prolin
11	Lysin (LYS)	BOC- ε--TFA-L-Lysin
10	Glycin (GLY)	BOC-Glycin
9	Tryptophan (TRY)	BOC-L-Tryptophan
8	Arginin (ARG)	BOC-L-Tosylarginin
7	Phenylalanin (PHE)	BOC-L-Phenylalanin
6	Histidin (HIS)	BOC-im-Carbobenzyloxy- L-histidin
5	Glutaminsäure (GLU)	BOC-L-Benzylglutamin
4	Methionin (MET)	BOC-L-Methionin
3	Serin (SER)	BOC-0-Benzyl-L-serin
2	Tyrosin (TYR)	BOC-L-Tyrosin
1	Serin (SER)	BOC-0-Benzyl-L-serin

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-H-

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Es ist ferner von Wichtigkeit, daß jede der Kupplungsreaktionen vollständig ist; in diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß der von E. Kaiser, R. Colescott, C. D. Bossinger und P. Cook in Anal. Biochem. 34 (1970) 595 - 98 beschriebene Ninhydrintest zur Bestimmung herangezogen werden kann, wann die Kupplungsreaktion ausreichend vollständig abgelaufen ist. Wenn der Ninhydrintest negativ ist, kann zur Abspaltung der Schutzgruppen vom trägergebundenen Peptid und zu den nachfolgenden Kupplungsreaktionen übergegangen werden. Wenn der Test andererseits positiv ausfällt, wird der Kupplungsschritt wiederholt, bis der Ninhydrintest schließlich negativ ist.

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wird bei der Kupplung von Asparagin diese Aminosäure in Form eines aktiven Esters eingesetzt; beim Ankuppeln von Tyrosin, Arginin, Lysin und Tryptophan wird vorzugsweise eine Menge von etwa 10 % oder mehr Dimethylformamid (DMF) zur Verbesserung der Löslichkeit eingesetzt.

Wenn nach der vorstehend beschriebenen Sequenz Arginin in Position I7 angekuppelt, von Schutzgruppen befreit und neutralisiert ist, liegt folgende Verbindung vor:

NH₀-ARG-ARG-PRO-VAL-LYS-VAL-TYR-PRO-ASn-GLY-ALA-GLU-CH₀ ²II I I I I ²

TT VYP¹ Bz

Wenn Serin in Position 1 angekuppelt ist, die Schutzgruppen entfernt und neutralisiert ist, liegt folgende Verbindung vor:

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27038AA

NH₀- SER-TYR-SER-MET-GLU- ²III I

Bz Y Bz

Bz

I-HIS-PHE-ARG-TRP-GLY-LYS-PRO-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-Il I I I I I

WT V VVTT

-PRO-VAL-LYS-VAL-TYR-PRO-ASN-GLY-AlA-GLU-CH₉- ( R

I I I I ^V^

VYP¹ Bz

Nach Vervollständigung der Kupplung der 28 Aminosäuren sowie nach Abspaltung der Schutzgruppen und Neutralisation des Serins in Position 1 kann die resultierende Verbindung mit Fluorwasserstoff behandelt werden, wobei folgende Verbindung erhalten wird:

SER-TYR-SER-MET-GLU-HIS-PHE-ARG-TRP-GLYi

^LLYS-PRO-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-PRO-VAL-LYS-i

-VAL-TYR-PRO-ASN-GLY-ALA-GLU

Wenn TFA zum Schutz des Lysins verwendet wird, resultiert folgende Verbindung:

SER-TYR-SER-MET-GLU-HIS-PHE-ARG-TRP-GLYi

TFA

-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-PRO-VAL-LYS

I I I

TFA TFA TFA

VAL-TYR-PRO-ASN-GLY-ALA-GLU

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wenn diese Verbindung mit einer wäßrigen Base wie Piperidin oder Ammoniumhydroxid zur Entfernung der TFA-Gruppen behandelt wird, wird dadurch das freie 1-28-Peptid erhalten.

Die von Schutzgruppen befreite Verbindung kann nach bekannten Reinigungsverfahren gereinigt werden; sie weist adrenocorticotrope Aktivität auf.

Zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Synthese im Detail wird im folgenden ein vollständiges Synthesebeispiel angegeben, bei dem neue verbindungen aufgrund des erfindungsgemäßen verbesserten Verfahrens erhalten werden, wobei im letzten Schritt eine Verbindung mit 28 Aminosäuren und adrenocorticotroper Wirkung erhalten wird.

Synthesebeispiel;

Beispiel 1
Herstellung des chlormethylierten Trägerharzes

1 kg eines mit 2 % Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes von 0,035 - 0,075 nrni (200 - 400 mesh) Korngröße wurde dreimal mit je 2 1 Methylenchlorid gewaschen. Feine Partikel wurden durch jeweiliges Abziehen des Methylenchlorids vom Boden entfernt. Das Harz wurde anschließend durch Suspendieren, 10 minutiges Rühren und Filtrieren durch eine Glasfritte unter Verwendung von jeweils 2-1-Teilen folgender Lösungsmittel gewaschen: mit 2 Teilen Tetrahydrofuran, mit 2 Teilen Wasser, mit 1 Teil 1 N NaOH, mit 2 Teilen Wasser, mit 2 Teilen

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Dimethylformamid, mit 2 Teilen Dioxan sowie mit 3 Teilen Methanol. Das gewaschene Harz wurde anschließend im Vakuum bei 60 ⁰C getrocknet.

500 g des gewaschenen Polystyrolharzes wurden mit 5 1 Chlormethyl-methylather bei Raumtemperatur gerührt; die Temperatur wurde anschließend in einem Eis-Wasser-Bad auf 0 - 5 ⁰C erniedrigt. Anschließend wurden 75 g wasserfreies Zinnchlorid in 925 ml eiskaltem Chlormethyl-methyläther zugesetzt und das Gemisch 2 h im Eisbad gerührt. Das Harz wurde durch eine Glasfritte abfiltriert und mit Jeweils 2 1 der folgenden Lösungsmittel gewaschen: 25 % Wasser in Dioxan, 25 % 2 N HCl in Dioxan, Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das gewaschene Harz wurde bei 45 - 50 ⁰C im Vakuum getrocknet. Nach diesem Verfahren beträgt der übliche Chloridgehalt 0,7 -1,0 mäq/g (mäq = Milliäquivalent).

Beispiel 2 Herstellung des Glutaminsäure-Harzes

50 g des wie zuvor beschrieben hergestellten chlormethylierten Polystyrolharzes mit einem Chlorgehalt von 0,74 mäq/g (37 mäq Chlor) wurden mit 24,9 g BOC-L- ε-Benzylglutamat (74 mäq) in 150 ml absolutem Äthanol gerührt, worauf anschließend 9*77 nil Triäthylamin (72 mäq) zugesetzt wurden; das Gemisch wurde unter Rühren 24 h am Rückfluß gehalten. Das Gemisch wurde anschließend abgekühlt, durch einen Büchner-Trichter mit Glasfritte filtriert und auf der Pritte mit 500-ml-Portionen folgender Lösungsmittel gewaschen: zweimal mit denaturiertem Alkohol (mit 5 % Methanol denaturierter Alkohol), zweimal mit Dioxan, zweimal mit denaturiertem Alko-

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hol, zweimal mit Wasser sowie zweimal mit Methanol. Das Harz wurde anschließend bei ho - 45 ⁰C im Vakuum getrocknet. Die Stickstoffanalyse ergab Werte zwischen etwa 0,50 und 0,70 mäq/g. Nach der im folgenden beschriebenen Abspaltung der BOC-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure wurde der Gehalt des Harzes an freien terminalen Aminogruppen durch Titration zu etwa 0,35 mäg/g bestimmt.

Beispiel 3 £^e£tIdsyjn theise

5 g des Glutaminsäureharzes wurden in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur eingebracht. Die folgenden Schritte wurden für jeden Schritt der Schutzgruppenabspaltung und Kupplung programmiert, wobei die Aminosäuren in der in Tabelle l angegebenen Reihenfolge ansynthetisiert wurden.

Schutzgruppenabspaltung;

zweimaliges Waschen mit je 30 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

30 ml 50 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, 5 min,

(nach Reaktion Nr. 12 wird 1 % 2-Mercaptoäthanol oder Äthandithiol zu der 50 #igen Trifluoressigsäure in Methylenchlorid zugesetzt), dreimaliges Waschen mit je 30 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min,

zweimaliges Waschen mit je 30 ml Methanol, jeweils 2 min und

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270384A

dreimaliges Waschen mit je 30 ml Chloroform, jeweils 2 min.

Neutralisation:

zweimal mit je 30 ml 10 % Diisopropylamin in Chloroform, jeweils 5 min und

viermaliges Waschen mit je 30 ml Chloroform, jeweils 2 min.

Kupplung;

4 mmol der Jeweiligen BOC-Aminosäure in 20 ml Methylenchlorid (oder erforderlichenfalls EMF-Gemisch), 4 mmol Dicyclohexylcarbodiimid als Kupplungsmittel in 15 ml Methylenchlorid, Reaktionszeit 45 min, zweimaliges Waschen mit je 30 ml Chloroform, jeweils 2 min und

zweimaliges Waschen mit je 30 ml Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Nach der letzten Schutzgruppenabspaltung wurde das Harz im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 11,8 g.

Beispiel Abspaltung mit Fluorwasserstoff

2 g des geschützten trägergebundenen Peptids wurden in ein Reaktionsgefäß aus synthetischem Material (KeI-F) zusammen mit 2 ml Anisol eingebracht und 10 ml wasserfreier Fluorwasserstoff durch Destillation zugesetzt. Das Gemisch

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-15.

wurde 1 h bei O ⁰C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde anschließend durch Vakuumdestillation entfernt, der Rückstand viermal mit Äthylacetat gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Der Eisessigextrakt wurde lyophilisiert und ergab 0,86 g eines lockeren weißen Pulvers. Dieses Verfahren erlaubt eine Trennung des Peptids vom Trägerharz sowie eine Entfernung aller Schutzgruppen auf den bifunktionellen Aminosäuren außer der Trifluoracetyl-Schutzgruppe (TFA) der Lysinreste. Das entsprechende Produkt wird als TFA-Peptid bezeichnet. Das freie Peptid, das biologische Aktivität aufweist, kann daraus durch Behandlung mit einer Base freigesetzt werden. Dies erfolgt durch >-stündiges Rühren mit 1 m Piperidin oder 2 N Ammoniumhydroxid. Wenn das Lysin mit anderen funktionellen Gruppen geschützt ist, resultiert das freie Peptid bereits aufgrund der Behandlung mit Fluorwasserstoff allein.

Die Erfindung betrifft zusammengefaßt trägergebundene und freie Peptide, die zur Herstellung von Peptiden mit biologischer Aktivität vorteilhaft geeignet sind, insbesondere trägergebundene Peptide mit der Sequenz ALA-GLU-CHp - (r) an einem Ende der Aminosäurekette, wobei mit (S) das Trägerharz bezeichnet ist und ALA und GLU für die entsprechenden Aminosäurereste von Alanin bzw. Glutaminsäure stehen; die Erfindung gibt ferner Verfahren zur Herstellung dieser trägergebundenen Peptide an.

Zu den erfindungsgemäßen trägergebundenen Peptiden gehört das trägergebundene 1-28-ACTH-Peptid, das adrenocorticotrope Wirksamkeit aufweist, sowie dessen Herstellungsverfahren.

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Claims

Ansprüche

lJ Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₂-ALA-GLU-CH₂- (R) Bz

- mit Divinylbenzol vemetztes Polystyrolharz und

Bz = Benzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl oder Benzhydryl.
2. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₀-GLY-ALA-GLu-CH₀-

I ² Bz

Bz und(ß) wie in Anspruch 1.
3. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₉-ASN-GLY-ALA-GLu-CH₀ ²I I

P¹ Bz

mit (r) und Bz wie in Anspruch 1

und P¹ s= H, Xanthydryl oder Benzhydryl.

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4. Trägergebundenes Peptid der Struktur

NH₀-SER-TYR-SER-MET-GLU-HIS-PHE-ARG-TRPi

²III Il I

Bz Y Bz

Bz W

GLY-LYS-PRO-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-

I I I I I

V VVTT

PRO-VAL-LYS-VAL-TYR-PRO-ASN-GLY-ALA_n

K3LU-

Bz

CH₂- ( R]

R und Bz wie in Anspruch 1, P¹ wie in Anspruch 3
T = Tosyl oder Nitro,

V = Carbobenzyloxy, 2-Chlorcarbobenzyloxy, 2-Brom-

carbobenzyloxy, 2.4-Dichlorcarbobenzyloxy oder Trifluoracetyl,

Y = H, Benzyl oder 2-Bromcarbobenzyloxy und

W = H, Carbobenzyloxy, Tosyl, Dinitrophenyl oder Benzyl.
5. Peptid der Struktur

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.3.

SER-TYR-SER-MET-GLU-HIS-PHE-ARG-TRP-GLY-LYS·

I TFA

LpRO-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-PRO-VAL-LYS-VAL-

I I I

TFA TFA TFA

LTYR-PRO-ASN-GLY-ALA-GLU

mit TFA « Trifluoracetyl.
6. Peptid der Struktur

SER-TYR-SER-MET-GLU-HIS-PHE-ARG-TRP-GLY-LYS-j

1 — J

LpRO-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-PRO-VAL-LYS-VAL-t

¹TYR-PRO-ASn-GLY-ALA-GLU
7. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß

NH₉-GLU-CH₉- (K) Bz

mit (r) und Bz wie in Anspruch 1 mit dem Reaktanten

P-ALA
mit

P = tert-Butyl oxy carbonyl, Atnyloxycarbonyl oder o-Nitropheny1sulfeny1

oder einem aktiven Ester, AzId oder einem Anhydrid davon zum Peptid.

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P-ALA-GLU-CH₂- (r) Bz

mit (r) , Bz und P wie oben

umgesetzt wird, wobei die Kupplung, wenn der Reaktant kein aktiver Ester, kein Azid oder kein Anhydrid darstellt, in Gegenwart eines Diimids vorgenommen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende Reaktionsprodukt von Anspruch 7 zur Abspaltung von P mit einer Säure behandelt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß

NH₂-ALA-GLU-CH₂ - (R, Bz

mit (r) und Bz wie in Anspruch 1

mit P-Glycin oder einem aktiven Ester, Azid oder Anhydrid davon als Reaktant zu

P-GLY-ALA-GLU-CH₂
Bz

(r) und Bz wie oben und
P wie in Anspruch 7

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gekuppelt wird, wobei die Kupplung, wenn der Reaktant kein aktiver Ester, kein Azid oder kein Anhydrid darstellt, in Gegenwart eines Diimids vorgenommen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende Reaktionsprodukt von Anspruch 9 zur Abspaltung von P mit einer Säure behandelt wird.
11. Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid

NH₂-TYR-SER-MET-GLU-HIS-PHE-ARG-TRp-GLY-

Y Bz

Bz W

LYS-PRO-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-PRO-VAL-

I I I I I

V VVTT

LYS-VAL-TYR-PRO-ASn-GLY-ALA-GLU-CH₂- ( R]

P¹

Bz

mit P-Bz-L-Serin oder einem aktiven Ester, Azid oder Anhydrid davon zu dem Peptid

NH₂-SER-TYR-SER-MET-GLU-HIS-PHE-ARg-TRP-

I I I

Bz Y Bz

I I

Bz W

GLY-LYS-PRO-VAL-GLY-LYS-LYS-ARG-ARG-PRO

I I I I I

V VVTT

VAL-LYS-VAL-TYR-PRO-ASN-GLY-ALA-GLu-CH₀- [R

III I ²

P¹

Bz

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(r) und Bz wie in Anspruch 1,
T, V, Y und W wie in Anspruch 4 und P wie in Anspruch 7

gekuppelt wird,

wobei die Kupplung, wenn der Reaktant kein aktiver Ester, kein Azid oder kein Anhydrid darstellt, in Gegenwart eines Diimids vorgenommen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende Reaktionsprodukt von Anspruch 10 zur Abspaltung der Schutzgruppen Bz, T, Y und V/ sowie zu seiner Abspaltung vom Trägerharz Qv -CHp- mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12 mit V = Trifluoracetyl, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt von Anspruch zur Abspaltung der Trifluoracetyl-Schutzgruppen mit einer wäßrigen Base behandelt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 9 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Diimid Dicyclohexylcarbodiimid verwendet wird.

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