CH645880A5 - Synthetisches antigenaktives polypeptid, verfahren zu dessen herstellung und das polypeptid enthaltendes antigenes mittel sowie arzneimittel. - Google Patents

Synthetisches antigenaktives polypeptid, verfahren zu dessen herstellung und das polypeptid enthaltendes antigenes mittel sowie arzneimittel. Download PDF

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CH645880A5
CH645880A5 CH300480A CH300480A CH645880A5 CH 645880 A5 CH645880 A5 CH 645880A5 CH 300480 A CH300480 A CH 300480A CH 300480 A CH300480 A CH 300480A CH 645880 A5 CH645880 A5 CH 645880A5
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Description

Die Erfindung betrifft ein synthetisches antigenaktives Polypeptid, das bestimmte Aminosäuresequenzen enthält, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Polypeptids.
In der veröffentlichten schwedischen Patentanmeldung Nr. 73-08917-9 und in der US-PS 3 960 827 ist ein mit Cancer verbundenes Polypeptidantigen (CAPA), die Methode zur seiner Isolierung und seine Verwendung bei der Cancer-diagnose und bei der Herstellung von Antikörpern beschrieben. Das CAPA ist jetzt unter der Bezeichnung TPA im Handel, was «Gewebepolypeptidantigen» bedeutet. Wie aus der Beschreibung der oben genannten schwedischen Patentanmeldung und der genannten US-Patentschrift klar ersichtlich ist, ist die Isolierung des natürlichen Antigens ein kom- • pliziertes Verfahren, das selbst dann, wenn es zu einem praktisch brauchbaren Produkt führt, hohe Produktionskosten erfordert und ausserdem Schwierigkeiten bezüglich der Bereitstellung erforderlicher Ausgangsmaterialien, wie von Tumorgewebe usw., ergeben kann. Vor diesem Hintergrund wäre natürlich ein synthetisch hergestelltes Antigen äusserst wünschenswert im Hinblick auf die Möglichkeit, dadurch ein Produkt zu erhalten, das hinsichtlich seiner Zusammensetzung genau definiert ist, wobei dieses Produkt auch noch zu einem günstigeren Preis hergestellt werden kann.
Hauptaufgabe der Erfindung ist es somit, ein synthetisches antigenaktives Polypeptid zu bekommen, das monospezifisch mit Antikörpern reagiert, welche mit Hilfe des in den oben genannten Patentveröffentlichungen beschriebenen Polypeptidantigens hergestellt wurden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäss mit einem synthetischen antigenaktiven Polypeptid mit der Aminosäuresequenz H-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala--Asn-Ala-Arg-Leu-Ser-Glu-Leu-OH gelöst.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bekommt man ein synthetisches antigenaktives Polypeptid, das als aktiven Bestandteil oder immunologisch entscheidende Gruppe die Aminosäuresequenz (I) H-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg--Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Leu-Ser--Glu-Leu-Glu-Ala-Ala-Leu-Gln-Arg-Ala-Lys-Gln-Asp-OH enthält.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Polyeptid die Aminosäuresequenz (II) H-Ala-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala-Ile-Ala-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg--Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Leu-Ser--Glu-Leu-OH.
Die folgenden Abkürzungen werden hier für die fraglichen Aminosäuren verwendet:
Alanin
Ala
Serin
Ser
Arginin
Arg
Leucin
Leu
Asparagin
Asn
Tyrosin
Tyr
Asparaginsäure
Asp
Valin
Val
Glutamin
Gin
Thr eonin
Thr
Glutaminsäure
Glu
Phenylalanin
Phe
Glycin
Gly
Lysin
Lys
Isoleucin
Ile
Auch betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des antigenaktiven Polypeptids, und in diesem Verfahren wird eine N-geschützte Aminosäure durch Veresterung an ein Harz gebunden, die N-schützende Gruppe wird entfernt, und eine zweite N-geschützte Aminogruppe wird an die Aminogruppe der harzgebundenen Aminosäure gebunden, die N-schützende Gruppe wird entfernt und die Kupp-lungs- oder Bindungsstufe mit einer dritten N-geschützten Aminosäure wiederholt. Schutzgruppen in dem Verfahren sind die üblichen Gruppen und werden nachfolgend im einzelnen noch weiter erläutert. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis die erwünschte Aminosäuresequenz erreicht ist, worauf dann das Polypeptid von dem Harz abgespalten wird, Es ist bevorzugt, nach jeder Bindung einer N-geschützten Aminosäure an die harzgebundene Aminosäure alle Nebenprodukte und unumgesetzten löslichen Materialien wegzu-waschen.
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Das in der Synthese verwendete Harz kann aus einem Copolymeren von Styrol und Divinylbenzol bestehen, wobei das Styrol den Hauptteil des Copolymeren ausmacht, indem das Copolymere beispielsweise aus etwa 98 Gewichts-%
Styrol und etwa 2 Gewichts-% Divinylbenzol besteht.
Um eine reaktive Gruppe an dem Harz für die Bindung an die erste Aminosäure zu bekommen, werden die Benzolringe zweckmässig teilweise chlormethyliert. Wenn dieses chlormethylierte Harz mit dem Triäthylaminsalz einer N-geschützten Aminosäure behandelt wird, bildet sich eine Bindung vom Benzylestertyp. Eine solche Bindung ist unter den Synthesestufen beständig, kann aber mit HBr in Essigsäure oder Trifluoressigsäure gespalten werden, wobei die N-schützende Gruppe gleichzeitig entfernt und das Peptid von dem Harz getrennt wird.
Um das N-Ende einer Aminosäure zu schützen, kann zweckmässig die Tertiärbutyloxycarbonylgruppe verwendet werden, da sie mit Hilfe von HCl in Essigsäure bequem abgespalten werden kann. Es ist auch möglich, die Carbo-benzoxygruppe für diesen Zweck zu benutzen, doch in diesem Fall muss HBr in Essigsäure zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet werden. Als Schutzgruppe kann auch die o-NitrophenylsuIfenylgruppe benutzt werden. Andere Schutzgruppen können auch verwendet werden und liegen für den Fachmann auf der Hand.
Das Kupplungs- oder Bindungsmittel, das in der Synthese am häufigsten verwendet wird, ist Dicyclohexylcarbodi-5 imid. Wenn Methylenchlorid als Lösungsmittel verwendet wird und ein etwa 50%iger Überschuss an Tertiärbutylory-carbonylaminosäure und Dicycdohexylcarbodimid benutzt wird, bekommt man eine quantitative Umsetzung innerhalb weniger Minuten. Auch Dimethylformamid kann als Lö-lo sungsmitel verwendet werden. Weitere Einzelheiten bezüglich des Syntheseverfahrens finden sich in «Protein Sequence Determination», herausgegeben von Saul B. Needleman, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1970, besonders auf den Seiten 308 bis 310. Andere Kupplungs- oder i5 Bindungsmittel sind auch geeignet und liegen für den Fachmann auf der Hand.
Beispiele
Die Erfindung wird nun durch Beispiele weiter erläutert.
20
Beispiel 1
Nach dem Verfahren in fester Phase gemäss Merrifield (siehe die obige Literaturstelle) wurde das folgende Produkt hergestellt:
R-30 R29-R28'
I I Boc-NH-CH-CONH-CH
■R4-R3 R2 Ri
III' CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COO-CH2
worin R ein Harz bedeutet, Boc eine Tertiärbutyloxycarbonylgruppe ist, Rj R19 R3q = CH2-COO-CH2 —/
R2 = R27 = CH2-CH2-CONH
R3 = CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C0-0-CH2—
R-i = Ra = Rg = R 6 ^-18 ^22 ^29 = CH3
R5 = R15 = R20 = R26 = CH2-CH2-CH2-NH-C;
NH
"nh-scv
-CH,
^6 ^2 — ^27
R7 = Rn = R14 = R23 = -CH2-CH:
CH3
CH,
Rio - Rio — R?a ~ R?n —CH,-CH,-COO-CH, —
R13 = -CH2-0-CH2 -
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4
Rai = -CH-CH2-CH3
I
CHS R* = H
Die Aminosäuresequenz zwischen der Tertiärbutyloxycarbonylgruppe und dem Harzteil kann in der folgenden Weise unter Verwendung der obigen Abkürzungen bezüglich der Aminosäuren ausgedrückt werden: (I) -Asp-AIa-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala--Asn-Ala-Arg-Leu-Ser-Blu-Leu-Glu-Ala-Ala-Leu-Gln-Arg--Ala-Lys-Gln-Asp.
0,4 mMol Boc-Asparaginsäure-ß-benzylester [a-(Harz-benzylester)] wurde auf die Küvette in einer Beckmann-Pep-tidsynheseeinrichtung übertragen und in Methylenchlorid (CH2C12) gequollen. Die schützende Boc-Gruppe wurde durch Behandlung mit Trifluoressigsäure im Überschuss in Methylenchlorid entfernt. Nach dem Waschen mit Methylenchlorid wurde das Harz mit Triäthylamin neutralisiert und wiederum mit Methylenchlorid gewaschen. N-Boc-Glutamin-säurebenzylester (Kupplungsstufe 1) und Cyclohexylcarbo-diimid wurden in CH2C12 gelöst zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Das Harz wurde gewaschen und die Kupplungsstufe wiederholt. Dies beendet die Einführung von R2 in der Stufe 1 nach den obigen Ausführungen.
Die Stufe 2 der Synthese beginnt mit der Entfernung von N-Boc von der Aminosäure mit N-Endgruppe und einer Wiederholung der Kupplungsstufe während eine andere N-Boc--Aminosäure verwendet wird. Um die obige Aminosäuresequenz aufzubauen, wurden die folgenden Reagentien in den aufeinanderfolgenden Stufen verwendet:
In Stufe 2: N-Boc-Glutaminxanthydrylderivat In Stufe 3: aN-Boc-e-(o-Chlorcarbobenzoxy)-lysin In Stufe 4: N-Boc-Alanin In Stufe 5: N-Boc-G-Tosylarginin In Stufe 6: Wie in Stufe 2 In Stufe 7: N-Boc-Leucin In Stufe 8: Wie in Sufe 4 In Stufe 9: Wie in Stufe 4 In Stufe 10: N-Boc-Glutaminsäure-y-benzylester In Stufe 11: Wie in Stufe 7 In Stufe 12: Wie in Stufe 10 In Stufe 13: N-Boc-Serinbenzyläther In Stufe 14: Wie in Stufe 7 In Stufe 15: Wie in Stufe 5 In Stufe 16: Wie in Stufe 4 In Stufe 17: N-Boc-Asparaginxanthydrylderivat In Stufe 18: Wie in Stufe 4 In Stufe 19: N-Boc-Asparaginsäure-ß-benzylester In Stufe 20: Wie in Stufe 5 In Stufe 21: N-Boc-Isoleucin In Stufe 22: Wie in Stufe 4 In Stufe 23: Wie in Stufe 7 In Stufe 24: Wie in Stufe 10 In Stufe 25: N-Boc-Glycin In Stufe 26: Wie in Stufe 5 In Stufe 27: Wie in Stufe 2 In Stufe 28: Wie in Stufe 10
In Stufe 29: Wie in Stufe 4 In Stufe 30: Wie in Stufe 19.
Die Schutzgruppen: wurden von dem geschützten harzgebundenen Peptid entfernt, das Harz wurde unter Verwendung von wasserfreier Fluorwasserstoffsäure bei 0°C während 30 Minuten abgespalten, und das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung einer lOgewichtsprozentigen wäss-rigen Lösung von Essigsäure extrahiert. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand durch Gelfiltraion auf Se-phadex G 25 Fine in 0,2 M NH4HC03 gereinigt. Nach der Lyophilisierung des Peptids wurde eine zufriedenstellende Aminosäureanalyse erhalten, zusammen mit einem Molekulargewicht von etwa 3300, bestimmt durch Gelfiltration. Der theoretische Molekulargewichtswert liegt bei 3320,80.
Das nach den obigen Ausführungen hergestellte Polypeptid kann bezüglich seiner Fähigkeit, die Hämagglutina-tionsreaktion zwischen gegerbten roten Blutkörperchen vom Schaf, markiert mit natürlichem Cancerantigen, und Antikörpern, die unter Verwendung von natürlichem Cancerantigen (CAPA oder TPA) hergestellt wurden, zu hemmen, untersucht werden. Was diese Methode betrifft, so kann auf die oben genannte schwedische Patentanmeldung Nummer 73-08917-9 und die US-PS 3 960 827 hingewiesen werden. Die spezifische Aktivität des Polypeptids lag bei etwa 0,2 Einheiten je Milligramm (E/mg). Diese Einheit für die spezifische Aktivität ist definiert als ein Sechstel der Menge von aktivem Polypeptid, die erforderlich ist, um 109 Blutkörperchen vom Schaf so zu markieren, dass sie vollständig mit der Mindestanzahl oder Mindestmenge an Antikörpern (maximale Verdünnung der Antikörper) agglutiniert sind.
Zum Zwecke der Untersuchung, welche Funktionen für die Aktivität des Polypeptids, dessen Grundstruktur oben angegeben ist, kritisch sind, wurden bestimmte Experimente durchgeführt. Die Arginine wurden dabei mit Cyclohexan-dion bei pH 13 blockiert, was zu einem fast vollständigen Aktivitätsverlust führte. Wenn jedoch das Polypeptid nur einer basischen Umgebung, deren pH-Wert 13 war, während der gleichen Zeit ausgesetzt wurde, ging nur ein kleinerer Teil der Aktivität verloren. Dies zeigt die Tatsache, dass die Anwesenheit von Arginin in dem Polypeptid nach der Erfindung von entscheidender Bedeutung für die Antigenaktivität ist. Aufgrund des Charakters der Struktur ist es klar, dass das Polypeptid einen sauren Charakter besitzt und somit in einer neutralen Lösung negativ geladen ist, während die positive Ladung des Argininteils des Polypeptids jedoch beibehalten wird.
Klar und gemäss dem, was in der Immunologie bekannt ist, ist die Antigenaktivität eine Funktion nicht nur der Struktur der bestimmten Haptengruppe, sondern auch der Grösse des Polypeptids. Diese Grösse bewirkt jedoch nicht die Spezifität des Peptids, sondern nur seinen Aktivitätsgrad insofern, als ein grösseres Molekül dazu neigt, aktiver als ein kleineres zu sein. Daher bekommt man eine verbesserte Aktivität, wenn das Polypeptid auf einem geeigneten immuno-gen aktiven Träger, wie beispielsweise einem Protein, wie Albumin, beispielsweise Eiweiss, angeordnet ist. Bereits das Polypeptid in seiner Grundstrukturform, d.h. mit wenigstens 20 Aminosäureeinheiten, zeigt jedoch eine Antigenaktivität, die ausreicht, dass Polypeptid in die Lage zu versetzen, mit entsprechenden Antikörpern zu reagieren. Ausserdem kann das Polypeptid für die Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Dies spricht jedoch für eine Bindung des Polypeptids an ein geeignetes Protein, welches als ein Träger fungiert, oder ein sogenanntes «Schlepperantigen», wie beispielsweise Schweineserum.
In dem obigen Beispiel 1 wird die antigene Aktivität des synthetisierten Polypeptids in folgender Weise bestimmt:
Für quantitative Bestimmung der Polypeptidmenge wer-
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den 7 mg des Peptids in 1,4 ml Pufferserum gelöst, d'.h. in einer physiologischen Kochsalzlösung, die 2% inertes menschliches Serum enthält u. mit einem Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von etwa 7,5 gepuffert is. Unter Reihenverdünnung wird eine Reihe von Proben dieser Lösung mit 5 einer abnehmenden Polypeptidkonzentration hergestellt, und jeder dieser Proben wird eine vorbestimmte Menge Anti-serum zugesetzt, das gegen TPA spezifische Antikörper enthält. Jeder der resultierenden Proben wird dann nach der Inkubation eine vorbestimmte Menge des auf einem fein- 10 teiligen Träger gebundenen Polypeptids zugesetzt, wobei Hämagglutination bis zu einem Grad entsprechend der Menge der verfügbaren Antikörper stattfindet. Parallel hierzu wird eine entsprechende Reihe von Kontrollproben hergestellt, die bekannte abnehmende Mengen an TPA enthalten. 15 Die Durchmesser der Hämagglutinationsablagerungen der Testproben werden visuell mit denen der Kontrollproben verglichen, um die Aktivität zu bestimmen.
Beispiel 2 20
Auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurde das folgende Polypeptid hergestellt und erwies sich als immunologisch etwa gleich aktiv wie das Polypeptid des Beispiels 1:
R28 R26-R25 R4-R3 R2 R:
I ! III /^\
Boc-NH-CH-CONH-CH CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COO-CH2 / ~ R
worin R das Harz bedeutet, Boc eine Tertiärbutyloxycarbonylgruppe bedeutet,
CH3
Ri = -CH2-CHC ; R2 = -CH2-CH,-COO-CH,~
CHS
R3 = -CH2-0-CH2 - ; R4 = Ri,
NH
R5 = -CH2-CH2-CH2-NH-C^
NH-S02- —CH3; R6 = CH3;
R, = -CH2-CONH-( y ; Ra = R6; R9 = -CH2-COO-CH?-
R10 R5! Ru -CH-CH2-CH3; R12 Rg! CH3
RJ3 RJ! RJ4 R2; Ris H; R16 R5;
R„ = -CH2-CH2CONH-< o ; Ria = R2; R19 = Re;
R20 Ra! R21 Rß' R22 Ru; R23 R24 Re; R25 R2> R26 Ri> R27 R,;^ R28 RG-
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Die Aminosäuresequenz zwischen der Tertiärbutyloxycarbonylgruppe und dem Harzteil kann in der folgenden Weise unter Verwendung der obigen Abkürzungen bezüglich der Aminosäuren ausgedrückt werden: (II) -Ala-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala-Ile-Ala-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly--Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Leu-Ser-Glu--Leu.
0,4 mMol Boc-Leucin (Harzbenzylester) wurden auf die Küvette einer Beckmann-Peptilsynthetisiervorrichtung überführt und in Methylenchlorid (CH2C12) gequollen. Die schützende Boc-Gruppe wurde durch Behandlung mit Tri-fluoressigsäure in einem Überschuss in Methylenchlorid entfernt. Nach d'em Waschen mit Methylenchlorid wurde das Harz mit Triäthylamin neutralisiert und wiederum mit Methylenchlorid gewaschen. N-Boc-Glutaminsäurebenzylester (Kupplungsstufe 1) und Cyclohexylcarbodiimid wurden in CH2C12 gelöst zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Das Harz wurde gewaschen und die Kupplungsstufe wiederholt. Dies beendete die Einführung von R2 in Stufe 1 gemäss den obigen Ausführungen.
Stufe 2 d'er Synthese beginnt mit der Entfernung von N-Boc von der Aminosäure mit N-Endgruppe und der Wiederholung der Kupplungstufe, während eine andere N-Boc--Aminosäure verwendet wurde. Um die obige Aminosäuresequenz aufzubauen, wurden in nacheinanderfolgenden Stufen die folgenden Reagentien verwendet:
In Stufe 2: N-Boc-Glutaminsäure-y-benzylester
In Stufe 3: N-Boc-Serinbenzyläther
In Stufe 4: N-Boc-Leucin
In Stufe 5: N-Boc-G-Tosylarginin
In Stufe 6: N-Boc-Alanin
In Stufe 7: N-Boc-Asparaginxanthydrylderivat In Stufe 8: Wie in Stufe 6 In Stufe 9: N-Boc-Asparaginsäure-ß-benzylester In Stufe 10: Wie in Stufe 5 5 In Stufe 11: N-Boc-Isoleucin In Stufe 12: Wie in Stufe 6 In Stufe 13: Wie in Stufe 4 In Stufe 14: Wie in Stufe 2 In Stufe 15: N-Boc-Glycin 10 In Stufe 16: Wie in Stufe 5 In Stufe 17: N-Boc-Glutaminxanthydrylderivat In Stufe 18: Wie in Stufe 2 In Stufe 19: Wie in Stufe 6 In Stufe 20: Wie in Stufe 9 15 In Stufe 21: Wie in Stufe 6 In Stufe 22: Wie in Stufe 11 In Stufe 23: Wie in Stufe 6 In Stufe 24: Wie in Stufe 6 In Stufe 25: Wie in Stufe 2 20 In Stufe 26: Wie in Stufe 4 In Stufe 27: Wie in Stufe 3 In Stufe 28: Wie in Stufe 6.
Das resultierende geschützte harzgebundene Peptid wurde dann gemäss dem Verfahren des Beispiels 1 behandelt 25 und analysiert.
Das Molekulargewicht war gemäss Bestimmung durch Gelfiltration etwa 3000,-während das theoretische Molekulargewicht bei 2936,38 liegt.
Die Ergebnisse der Aminosäureanalysen bei den Poly-30 peptiden d'er obigen Beispiele 1 und 2 sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Die darin angegebenen Werte bezeichnen die Molprozente einer jeden Aminosäure, d.h. die Zahl betreffenden Aminosäuren je 100 Aminosäuren des Peptids. Die Werte in der Tabelle entsprechen in zu-35 friedenstellender Weise den theoretischen Werten.
TABELLE
Beispiel
Nr.
Asp
Ser
Glu
Gly
Ala
Ile
Leu
Lys
Arg
1
6,99
4,11
20,94
2, £3
26,61
3,28
16,87
5,39
13,27
2
10,45
7,03
17,09
2,75
30,43
6,74
15,48
—
10,02
Die Erfindung ist in keiner Weise auf die obigen speziellen Ausführungsformen beschränkt. So kann bei der Herstellung des Polypeptids das Harz irgendein Material sein, das Benzolringe und ausserdem wenigstens eine Gruppe mit der so Fähigkeit, N-geschützte Aminosäuren durch Veresterung zu binden, enthält. Die Esterbindung muss relativ leicht zu hy-drolysieren sein und muss natürlich leichter spaltbar als die Peptidbindungen in dem Polypeptid sein. Die Esterbindung muss aber ausreichend beständig sein, um den Reaktions-55 bedingungen der Synthese widerstehen zu können.
Als Alternative zu dem oben erwähnten Kupplungs- oder Bindungsreagenz Dicyclohexylcarbodiimid kann man beim Binden von Glutamin- und Asparagineinheiten die Bindung oder Kupplung mit sogenannten aktiven Estern durchführen, 60 wie beispielsweise Cyanomethyl-, Thiophenyl- oder Nitro-phenylestern. Als ein Lösungsmittel in der Synthese sind sogenannte aprotische Lösungsmittel geeignet, besonders Lösungsmittel, die etwas hydrophil od'er «semipolar» sind.
Bezüglich brauchbarer Gruppen zum Schutz der N-Ami-65 nosäuren sei festgestellt, dass mit Vorteil auch Tertiärbutyl-oxycarbonylgruppen verwendet werden können, worin eine oder zwei Methylgruppen durch Phenylreste ersetzt sind. In diesem Zusammenhang kann erwähnt werden, dass das in
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der Synthese erhaltene Produkt mit N-schützenden Gruppen versehen und durch Veresterung an ein Harz gebunden ist und dass es mit Vorteil lange Zeit ohne zerstört zu werden gelagert werden kann. Im Zusammenhang mit der Verwendung des Polypeptids können dann die Schutzgruppen und 5 der Harzteil entfernt werden.
In den in dem vorliegenden Präparat angegebenen Aminosäuresequenzen sind die Endgruppen (nach Entfernung der Schutzgruppen und des Harzteils) immer eine Aminogruppe bzw. Carboxylgruppe. Die Aminogruppe findet sich an dem linken Ende der Kette, während die Carboxylgruppe sich an dem entgegengesetzten Ende der Aminosäuresequenz findet.
v

Claims (14)

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1. Synthetisches antigenaktives Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz H-Asp-Ala--Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala--Arg-Leu-Ser-Glu-Leu-OH enthält.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz H-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly--Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp-Ala-Asn-Ala-Arg-Leu-Ser-Glu--Leu-Glu-Ala-Ala-Leu-Gln-Arg-Ala-Lys-Gln-Asp-OH enthält.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz H-Ala-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala--Ile-Ala-Asp-Ala-Glu-Gln-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ile-Arg-Asp--Ala-Asn-Ala-Arg-Leu-Ser-Glu-Leu-OH enthält.
4. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 durch aufeinanderfolgenden Aufbau der Aminosäuresquenz, dadurch gekennzeichnet, dass man eine N-geschützte Aminosäure durch Veresterung an der C-Endposition an einen Träger bindet, die N-schützende Gruppe entfernt und eine zweite N-geschützte Aminosäure der Sequenz an die Aminogruppe der trägergebundenen Aminosäure bindet, die N-Schutzgruppe entfernt und diese Stufe, wenn erforderlich, wiederholt und so ein Polypeptid mit der gewünschten Aminosäuresequenz aufbaut, das so erhaltene Polypeptid von dem Träger abspaltet und die Schutzgruppen von ihm entfernt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Nebenprodukte und unumgesetzte lösliche Materialien nach jeder Bindung einer N-geschützten Aminosäure an die trägergebundene Aminosäure oder Aminosäurese-quenz auswäscht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kupplungsmittel oder Verbindungsmittel Dicyclohexylcarbodiimid verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lösungsmittel Methylenchlorid oder Dimethylformamid verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als N-schützende Gruppe eine
Tertiärbutyloxycarbonylgruppe verwendet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Träger ein Harz verwendet.
10. Antigenes Mittel bestehend aus einem immunogen aktiven Träger mit einem kovalent daran gebundenen Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
11. Antigenes Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sein Träger ein Protein ist.
12. Antigenes Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sein Träger ein Albumin ist.
13. Arzneimittel, bestehend aus einem Polypeptid nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial od'er Verdünnungsmittel.
14. Polypeptide, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentansprüchen 4 bis 9.
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