DE2717741C2

DE2717741C2 -

Info

Publication number: DE2717741C2
Application number: DE2717741A
Authority: DE
Inventors: Bjoern Erik Gustav Bertilsson Stockholm Se Luening
Original assignee: BONNIERFOERETAGEN STOCKHOLM SE AB
Current assignee: BONNIERFOERETAGEN STOCKHOLM SE AB
Priority date: 1976-04-29
Filing date: 1977-04-21
Publication date: 1990-10-25
Also published as: MX4699E; FR2349569A1; CA1106360A; FR2349569B1; SE436645C; BR7702737A; GB1570375A; DD130476A5; SE7604972L; SE436645B; US4107298A; DE2717741A1; CH630060A5; JPH0236906B2; JPS52156819A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide und ein Verfahren zu ihrer Herstellung gemäß den Patentansprüchen.

In der US-PS 39 60 827 ist ein krebserzeugendes Polypeptid-Antigen (CAPA), das Verfahren seiner Abtrennung und seine Verwendung bei der Krebsdiagnose und der Herstellung von Antikörpern beschrieben. Aus der US-PS läßt sich erkennen, daß die Abtrennung dieses natürlichen Antigens ein schwieriges Verfahren ist, sogar wenn dabei ein praktisch verwendbares Produkt erhalten wird, da es hohe Produktionskosten erfordert und darüber hinaus Schwierigkeiten bei der Bereitstellung des notwendigen Ausgangsmaterials, wie Tumorgewebe, macht.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand nun darin, synthetische antigenwirksame Polypeptide zu bekommen, die monospezifisch mit Antikörpern reagieren, die mit Hilfe des Polypeptid-Antigens CAPA hergestellt wurden.

Diese Aufgabe wird mit den in Anspruch 1 aufgeführten Polypeptiden gelöst.

Nachstehend sind die für die Polypeptide verwendeten Abkürzungen der Aminosäuren aufgeführt:

Alanin
Ala
Arginin	Arg
Asparagin	Asn
Asparaginsäure	Asp
Glutamin	Gln
Glutaminsäure	Glu
Glycerin	Gly
Isoleucin	Ile
Leucin	Leu
Tyrosin	Tyr
Valin	Val
Treonin	Thr
Phenylalanin	Phe
Lysin	Lys

Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide. Bei diesem Verfahren wird eine N-geschützte Aminosäure durch Veresterung an einen Träger, vorzugsweise ein Harz, angelagert, die N-schützende Gruppe entfernt, eine zweite N-geschützte Aminosäure an die trägergebundene Aminogruppe angelagert, die N-schützende Gruppe entfernt und die Kupplungsstufe so oft wiederholt, bis die erwünschte Aminosäuresequenz erreicht ist, wonach das Polypeptid dann vom Träger abgespalten wird. N-Schutzgruppen bei diesem Verfahren sind die üblichen Gruppen, wie sie nachstehend näher erläutert werden. Bevorzugt werden nach jeder Anlagerung einer N-geschützten Aminosäure an die vorausgehende alle Nebenprodukte und nicht umgesetzten löslichen Materialien ausgewaschen.

Das bei dieser Synthese verwendete Harz kann aus einem Mischpolymeren von Styrol und Divinylbenzol bestehen, wobei das Styrol den größeren Teil des Mischpolymeren darstellt, das beispielsweise aus etwa 98% Styrol und etwa 2% Divinylbenzol besteht. Um eine reaktionsfähige Gruppe zum Ankuppeln in geeigneter Weise teilweise chlormethyliert. Wenn dieses chlormethylierte Harz mit dem Triethylaminsalz einer N-geschützten Aminosäure behandelt wird, bildet sich eine Bindung vom Benzylestertyp.

Eine derartige Bindung ist bei den Bedingungen der Synthese stabil, kann jedoch mit HBr in Essigsäure oder Trifluoressigsäure gespalten werden, wobei die N-schützende Gruppe gleichzeitig entfernt und das Peptid von dem Harz abgetrennt wird.

Als Schutzgruppe wird vorzugsweise eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe verwendet, da sie durch HCl in Essigsäure gut abgespalten werden kann. Man kann zu diesem Zweck auch die Carbobenzoxygruppe verwenden, wobei jedoch zur Entfernung der Schutzgruppe dann HBr in Essigsäure verwendet werden muß. Als Schutzgruppe kann man auch die o-Nitrophenylsulfenylgruppe verwenden. Andere brauchbare Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt.

Das am häufigsten verwendete Kupplungsmittel bei dieser Synthese ist Dicyclohexylcarbodiimid. Bei Verwendung von Methylenchlorid als Lösungsmittel und etwa 50% Überschuß an tert.-Butyloxycarbonylaminosäure und Dicyclohexylcarbodiimid, wird eine quantitative Umsetzung innerhalb weniger Minuten sogar bei Verwendung von Dimethylformamid als Lösungsmittel erreicht. Bezüglich weiterer Einzelheiten der Synthese wird auf das Buch "Protein Sequence Determination", zusammengefaßt von Saul B. Needleman, Springer-Verlag, Berlin- Heidelberg-New York, 1970, insbesondere Seiten 308 bis 310 verwiesen.

Um zu untersuchen, welche Funktionen kritisch sind für die Wirksamkeit der Polypeptide nach der Erfindung, wurden bestimmte Versuche durchgeführt. Das zentral angeordnete Arginin wurde dabei mit Cyclohexandion bei einem pH-Wert von 13 blockiert, wobei ein Verlust der Wirksamkeit von 99,5% erfolgte. Wenn jedoch das Polypeptid lediglich in eine basische Umgebung gebracht wird, deren pH-Wert 13 beträgt, wird die Wirksamkeit lediglich um etwa 20% verringert. Das zeigt an, daß das Vorliegen des Arginins im Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung eine entscheidende Bedeutung für die Antigenwirksamkeit hat.

Um die Wirkung des um 5 Aminosäurereste vom Arginin in der Sequenz entfernten Tyrosins zu bestimmen, wurde das Polypeptid bei einem pH-Wert von 9,5 mit Jod behandelt. Bei Verwendung von Jod in einem Überschuß von etwa 10 000 mit Bezug auf den Tyrosingehalt des Polypeptids gehen etwa 85%, der Wirksamkeit verloren, bei 1000fachem Überschuß etwa 75%, während bei einem 100fachen Überschuß 40 bis 50% der Wirksamkeit verschwinden. Bei einem Überschuß von nur etwa der 10fachen Menge wird jedoch die Wirksamkeit des Polypeptids nicht beeinflußt.

Aus der basischen Struktur ergibt sich eindeutig, daß die Polypeptide einen sauren Charakter aufweisen und in einer neutralen Lösung negativ geladen sind, während die positive Ladung vom Argininteil gehalten wird.

Die chemische Basis für den Antigencharakter des Polypeptids läßt sich mit den vorstehenden Ausführungen erklären. Die bemerkenswerte spezifische Wirksamkeit, die bei einem synthetisch hergestellten Produkt erreicht wird und von der wegen der kleinen bestimmenden Gruppe angenommen wird, daß sie von Hapten-Natur ist, stellt einen erheblichen Vorteil für die Anwendung in der Immunologie und bei Untersuchungen, d. h. bei der Diagnose innerhalb des Krebsbereiches, dar.

Eindeutig und in Übereinstimmung mit den Kenntnissen der Immunologie steht fest, daß die Antigenwirksamkeit eine Funktion nicht nur der Struktur der haptenischen bestimmenden Gruppe ist, sondern auch der Größe des Polypeptids. Diese Größe beeinflußt jedoch die Spezifizität des Peptids nicht, sondern nur den Grad der Wirksamkeit insofern, als ein größeres Molekül dazu neigt, wirksamer zu sein als ein kleineres. Es wird daher eine verbesserte Wirksamkeit erreicht, wenn das Polypeptid auf einem geeigneten immunogen wirksamen Träger angeordnet ist, beispielsweise auf einem Protein wie einem Albumin, z. B. Eiweiß. Es hat jedoch bereits das Polypeptid in seiner Grundstrukturform, d. h. mit mindestens 7 Aminosäureeinheiten, eine Antigenwirksamkeit, die ausreichend ist, das Polypeptid in die Lage zu versetzen, mit den entsprechenden Antikörpern zu reagieren. Darüber hinaus kann das Polypeptid zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Dazu ist es jedoch erforderlich, das Polypeptid an ein geeignetes Protein zu kuppeln, das als Träger wirkt, beispielsweise Schweineserum. Die Wirksamkeit liegt also bereits bei Polypeptidketten mit wenigstens 7 und insbesondere 9 Aminosäureeinheiten vor, scheint sich bei etwa 26 Aminosäureeinheiten auf einen Maximalwert zu verstärken und liegt noch bei einem Überschuß von 30 Aminosäureeinheiten vor, die als Anteil der Polypeptidkette keine immunologisch bestimmende Gruppe im Sinne der vorstehenden Ausführungen sind, sondern sich immunologisch inert verhalten und als Träger für die immunologisch bestimmenden Gruppen dienen.

Bei der Herstellung des Polypeptids, kann als Harz jedes Material verwendet werden, das Benzolringe enthält und darüber hinaus mindestens die Fähigkeit hat, N-geschützte Aminosäure durch Veresterung zu binden. Die Esterbindung muß relativ leicht hydrolysierbar und natürlich leichter aufspaltbar sein als die Peptidbindungen im Polypeptid. Die Esterbindung muß darüber hinaus ausreichend stabil sein, um den Reaktionsbedingungen bei der Synthese zu widerstehen.

Statt des bevorzugten Kupplungsmittels Dicyclohexylcarbodiimid kann bei der Anlagerung von Glutamin- und Asparagineinheiten als Kupplungsmittel auch ein wirksamer Ester, beispielsweise Cyanmethyl-, Thiophenyl- oder Nitrophenylester verwendet werden. Als Lösungsmittel bei der Synthese können aprotische Lösungsmittel verwendet werden, insbesondere Lösungsmittel mit etwa hydrophilem oder semipolarem Charakter.

Bei der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz sind die endständigen Gruppen (nach Entfernung der Schutzgruppen und des Harzanteils) immer Aminogruppen bzw. Carbonsäurereste. Die Aminogruppe liegt am einen Ende der Kette vor, während die Carbonsäureester am entsprechenden Ende der Aminosäuresequenz vorliegen.

In den Beispielen wurde die Antigenwirksamkeit des synthetisierten Polypeptids auf folgende Weise bestimmt:

Zur quantitativen Bestimmung der Polypeptidmenge wurden 7 mg des Peptids in 1,4 ml Puffergradserum gelöst, einer physiologischen Salzlösung mit einem Gehalt von 2% inertem menschlichen Serum, die auf einen pH-Wert von etwa 7,5 mit einem Phosphatpuffer abgepuffert worden war. Durch Reihenverdünnung wurde eine Reihe von Proben dieser Lösung mit verringertem Polypeptidgehalt hergestellt und zu jeder dieser Proben eine vorbestimmte Menge Antiserum mit Antikörpern gegeben, die spezifisch für CAPA sind. Zu jeder der erhaltenen Proben wurde dann nach Inkubieren eine bestimmte Menge des auf einem besonderen Träger vorliegenden Polypeptids gegeben, wobei eine Hämagglutination in einem Ausmaß erfolgte, das der Menge der verfügbaren Antikörper entsprach. Parallel dazu wurde eine entsprechende Reihe von Kontrollproben hergestellt, die bekannte abfallende Mengen von CAPA enthielten. Die Durchmesser der Hämagglutinationsniederschläge der Kontrollproben wurden dann in ihren jeweiligen Vertiefungen in einer Reihe Verdünnungstestblättchen gemessen und die Werte der erhaltenen Durchmesser gegen die CAPA-Konzentrationen aufgetragen, wobei eine S-förmige Kurve erhalten wurde, deren Zwischenteil einen Knickpunkt als steile Neigung aufwies. Die entsprechende Kurve des Durchmessers der Niederschläge aus der Hämagglutination als Funktion der CAPA-Konzentration wird im Diagramm der Zeichnung als Kurve B gezeigt.

Im gleichen Diagramm ist die entsprechende Kurve für das synthetisierte Polypeptid des Beispiels 1 mit A bezeichnet. Bei Kenntnis der spezifischen Wirksamkeit des CAPA läßt sich die spezifische Wirksamkeit des synthetisch hergestellten Polypeptids mit 0,024 Einheiten je Milligramm Peptid bestimmen.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die spezifischen Wirksamkeiten der Polypeptide der nachfolgenden Beispiele 1 bis 25.

Spezifische Wirksamkeit der Polypeptide gemäß den Beispielen 1 bis 25
Beispiel Nr.
Spezifische Wirksamkeit

(Einheiten je mg/Peptid)
1
0,024
2	0,015
3	0,005
4	0,006
5	0,004
6	0,005
7	0,010
8	0,009
9	0,011
10	0,012
11	0,015
12	0,016
13	0,008
14	0,005
15	0,010
16	0,021
17	0,020
18	0,017
19	0,013
20	0,023
21	0,005
22	0,009
23	0,023
24	0,023
25	0,008

Beispiel 1

Nach dem in fester Phase durchgeführten Verfahren von Merrifield (vgl. die vorstehend genannte Literaturstelle) wird folgendes Produkt hergestellt:

worin R den Harzanteil, Boc einen tert.-Butyloxycarbonylrest und

bedeuten.

Die Aminosäuresequenz zwischen dem tert.-Butyloxycarbonylrest und dem Träger kann in folgender Weise unter Verwendung der vorstehend aufgeführten Abkürzungen für die Aminosäuren ausgedrückt werden:

Ala Leu Leu Asn Asp Glu Leu Ala Gln Tyr Leu Asp Leu Val Arg
Ala Leu Glu Ala Ala Asn Gly Glu Leu Glu Val

0,4 mMol Boc-Valin (Harzbenzylester) wurden in eine Cuvette einer Beckman-Peptidsynthesevorrichtung eingebracht und in Methylenchlorid (CH₂Cl₂) aufgequollen. Die schützende Boc-Gruppe wurde durch Behandlung mit überschüssiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt. Nach dem Waschen mit Methylenchlorid wurde das Harz mit Triethylamin neutralisiert und erneut mit Methylenchlorid gewaschen. Es wurde N- Boc-Glutaminsäurebenzylester (Kupplungsstufe 1) und Cyclohexylcarbodiimid, gelöst in CH₂Cl₂, zugegeben und die Mischung 30 min gerührt. Das Harz wurde gewaschen und die Kupplungsstufe wiederholt. Damit wurde die Einführung von R₂ in Stufe 1 abgeschlossen.

Stufe 2 der Synthese begann mit der Entfernung des N-Boc von der endständigen Aminosäure und Wiederholung der Kupplungsstufe unter Verwendung einer anderen N-Boc-Aminosäure. Zum Aufbau der vorstehend genannten Aminosäurefolge wurden folgende Reagenzien in den aufeinanderfolgenden Stufen verwendet:

In Stufe 2:
N-Boc-Leucin
In Stufe 3:	wie in Stufe 1
In Stufe 4:	N-Boc-Glycin
In Stufe 5:	N-Boc-Asparaginxanthydrylderivat
In Stufe 6:	B-Boc-Alanin
In Stufe 7:	wie in Stufe 6
In Stufe 8:	wie in Stufe 1
In Stufe 9:	wie in Stufe 2
In Stufe 10:	wie in Stufe 6
In Stufe 11:	N-Boc-G-Tosylarginin
In Stufe 12:	N-Boc-Valin
In Stufe 13:	wie in Stufe 2
In Stufe 14:	N-Boc-Asparaginsäurebenzylester
In Stufe 15:	wie in Stufe 2
In Stufe 16:	N-Boc-Tyrosin-3-chlorbenzylether
In Stufe 17:	N-Boc-Glutaminxanthydrylderivat
In Stufe 18:	wie in Stufe 6
In Stufe 19:	wie in Stufe 2
In Stufe 20:	wie in Stufe 1
In Stufe 21:	wie in Stufe 14
In Stufe 22:	wie in Stufe 5
In Stufe 23:	wie in Stufe 2
In Stufe 24:	wie in Stufe 2
In Stufe 25:	wie in Stufe 6

Die Schutzgruppen wurden von dem geschützten, harzgebundenen Peptid entfernt und das Harz unter Verwendung von wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0°C für 30 min abgespalten. Das Peptid wurde von dem Harz mit Hilfe einer 10%igen wäßrigen Essigsäurelösung extrahiert. Nach Eindampfen wurde der Rückstand durch Gelfiltration in 0,1 M NH₄HCO₃ gereinigt. Nach der Lyophilisierung des Peptids wurde ein Molekulargewicht von etwa 3000 ermittelt. Der theoretische Wert des Molekulargewichts beträgt 2959,71.

Das wie vorstehend hergestellte Polypeptid wurde bezüglich seiner Fähigkeit, die Hämagglutinationsreaktion zwischen mit Tannin getränkten roten Schafsblutzellen, die mit natürlichem Krebsantigen versetzt sind, und Antikörpern zu verhindern, die unter Verwendung von natürlichem Krebsantigen (CAPA) hergestellt wurde, untersucht. Bezüglich der Einzelheiten dieses Verfahrens wird auf die US-PS 39 60 827 hingewiesen. Die spezifische Wirksamkeit des Polypeptids wurde mit 0,024 Einheiten je Milligramm (U/mg) bestimmt. Diese Einheit für die spezifische Wirksamkeit wird definiert als ¹/₆ der Menge des wirksamen Polypeptids, die benötigt wird, um 10⁹ Schafsblutzellen so zu markieren, daß sie vollständig durch eine minimale Menge von Antikörpern agglutiniert wird (maximale Verdünnung von Antikörpern).

Beispiele 2 bis 25

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurden die in der nachstehenden Tabelle II beschriebenen Polypeptide hergestellt. Ihre spezifischen Wirksamkeiten ergeben sich aus der obigen Tabelle I

Tabelle II

Claims

1. Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen

2. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise durch stufenweisen Aufbau der Aminosäuresequenz jeweils die N-geschützte Aminosäure durch Veresterung der endständigen Stellung an einen Träger kuppelt, die N-Schutzgruppe entfernt, die nächste N-geschützte Aminosäure der Sequenz an die Aminogruppe der trägergebundenen Aminosäure kuppelt, die N-Schutzgruppe abspaltet und die Kupplungsstufe so oft wiederholt, bis die gewünschte Aminosäuresequenz erreicht ist, und schließlich das erhaltene Polypeptid von dem Träger abspaltet und die schützenden Gruppen davon entfernt.