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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Peptide, die sich bei der Behandlung von Infektionskrankheiten,
Krebs und Zuständen
des Immunsystems eignen.
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Hintergrund
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Ezrin
ist ein Mitglied der ERM-Familie (Ezrin-Radixin-Moesin) von Proteinen,
die in einem großen
Bereich von Zelltypen strukturelle und regulatorische Rollen spielen.
Es gibt erhebliche Anzeichen dafür,
dass Ezrin die Struktur des kortikalen Zytoskeletts reguliert, um
die Zelloberflächentopographie
zu steuern.
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Eine
ausführliche
Analyse der Sekundärstruktur
von Ezrin zeigt, dass drei Hauptstrukturdomänen vorliegen: eine N-terminate
Domäne
von den Aminosäuren
1 bis 300, eine hochgradig geladene α-Domäne von den Aminosäuren 300
bis 470 und eine C-terminate Domäne
von den Aminosäuren
470 bis 585.
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WO-95/33768
beschreibt, dass ein als HEP1 identifiziertes Peptid mit 14 Aminosäuren, d.
h. TEKKRRETEREKE (identisch mit den Aminosäuren 324-337 von humanem Ezrin),
das eine 70%ige Identität
mit dem C-Terminus von gp120 aufweist, in vivo die HIV-Replikation
beim Menschen hemmen kann. Zu diesem Zeitpunkt nahm ich an, dass
die beobachtete anti-HIV-Wirkung auf die Induktion einer immunologischen
Toleranz gegen autoreaktive Immunreaktionen, die durch den C-Terminus
von HIV-gp120 induziert werden, zurückzuführen ist.
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Gould
et al., EMBO J., Bd. 8(13) (1989), 4133-42 beschreibt Peptide, die
mit Teilen des HEP-Rezeptors identisch sind.
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Zusammenfassende Darstellung
der Erfindung
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Die
lösliche
Konformation von Ezrin, die im Zytoplasma auftritt, umfasst zwei
benachbarte helikale α-Domänen, die
an einer Gelenkregion (M339-M340) zu zwei antiparallelen Helices
zusammengefaltet sind, die durch komplementäre Seitenkettenladungen der
primären
Aminosäuresequenz
stabilisiert werden. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass
die positiv und negativ geladenen Seitenketten der Aminosäuresequenz
der HEP-Rezeptordomäne
A komplementär
zu den positiv und negativ geladenen Seitenketten der Aminosäuresequenz
der HEP-Rezeptordomäne
B sind.
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In
der aktivierten offenen Konformation von Ezrin ermöglicht die
Wechselwirkung der Domäne
A und der Domäne
B der HEP-Rezeptoren von zwei verschiedenen Ezrin-Molekülen die
Bildung von antiparallelen Dimeren. Zusätzlich zu den antiparallelen
Dimeren von Ezrin, die unter der Zelloberfläche entstehen, habe ich festgestellt,
dass diese Dimeren zwischen einem HEP-Rezeptor, der an der Oberfläche an einer
Zelle exponiert ist, mit einem HEP-Rezeptor, der an der Oberfläche einer
anderen Zelle exponiert ist, entstehen können. Wenn die beiden HEP-Rezeptoren
während
einer engen Assoziation von zwei Zelloberflächen in Kontakt gelangen, wird
in beiden Zellen ein Aktivierungssignal initiiert. Beliebige geladene
Moleküle,
die partiell die Wechselwirkung zwischen den Seitenkettenladungen
der Domäne
A und der Domäne
B des HEP-Rezeptors nachahmen, veranlassen die Entstehung einer
medizinisch wertvollen biologischen Reaktion.
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Die
Erfindung beruht auch auf der Erkenntnis, dass die anti-HIV-Aktivität von HEP1
auf dessen Bindung an die HEP-Rezeptordomäne B und die Induktion einer
neuen Immunreaktion zurückzuführen ist.
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Erfindungsgemäß umfasst
ein Peptid zur Behandlung von infektiösen Erkrankungen, Krebs oder
einem Zustand des Immunsystems mindestens 5 aufeinanderfolgende
Aminosäuren
der folgenden Sequenz mit 34 Aminosäuren:
MREKEELMLRLQDY(p)EEKTKKAERELSEQIQRALQ.
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Bei
der Sequenz mit 34 Aminosäuren
handelt es sich um die HEP-Rezeptordomäne B (Aminosäuren 340-373
von humanem Ezrin), wobei in der membranassoziierten Konformation
von Ezrin Tyrosin 353 [Y] zu Phosphotyrosin [Yp] phosphoryliert
sein kann. Ich habe festgestellt, dass die Domäne B des HEP-Rezeptors die Stelle
von Ezrin ist, an die HIV-gp120 während einer Hirninfektion bindet
(HIV gp120 bindet an die HEP-Rezeptordomäne B unter Heranziehung seiner
geladenen C-terminalen Aminosäuren,
die eine 70%ige Identität mit
einem Teil der HEP-Rezeptordomäne
A aufweisen). Neue geladene Moleküle, die an den HEP-Rezeptor binden,
können
sich zur Behandlung von HIV-bedingter Demenz eignen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein erfindungsgemäßes Peptid
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von infektiöser Erkrankung,
Krebs oder einem Zustand des Immunsystems verwendet.
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Beschreibung
der Erfindung
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
weisen vorzugsweise 5 bis 13 Aminosäuren auf. Beispielhafte erfindungsgemäße Peptide
sind die folgenden, die HEP-Rezeptordomäne A bindenden
Peptide:
- Rupe2024: KEELM
- Rupe2032: KEELMLRLQDYEE
- Rupe2032p: KEELMLRLQDYpEE
- Rupe2132: EELMLRLQDYEE
- Rupe2132p: EELMLRLQDYpEE
- Rupe2232: ELMLRLQDYEE
- Rupe2232p: ELMLRLQDYpEE
- Rupe2428: MLRLQ
- Rupe2832: QDYEE
- Rupe2832p: QDYpEE
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Weitere
Peptide oder andere geladene Moleküle, die die Domäne A des
HEP-Rezeptors binden, sind vermutlich biologisch aktiv. Diese Peptide
oder andere geladene Moleküle
können
oral oder auf anderen Wegen verabreicht werden, um verschiedene
infektiöse
Krankheiten und Krebs zu behandeln.
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Herstellung
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Erfindungsgemäß verwendete
Peptide lassen sich beispielsweise unter Anwendung eines Festphasenverfahrens
herstellen, wobei man sich der Boc- oder Fmoc-Chemie oder einer
anderen praxisgerechten Möglichkeit
der Peptidsynthese, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese
bekannt sind, bedient.
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Eine
stufenweise Festphasensynthese mit Boc-Aminosäuren lässt sich auf der Grundlage
des Verfahrens von Merrifield durchführen (Journal of American Chemical
Society, Bd. 85, S. 2149-2154). Die folgenden Verbindungen können verwendet
werden: Novabiochem-Harz: Boc-Glu(OBzl)-PAM, Aminosäuren: Boc-Lys (2Cl-Z-)OH, Boc-Glu(OBzl)OH,
Boc-Arg(Tos)OH, Boc-Val-OH, Boc-Thr (Bzl)-OH, Lösungsmittel: DMF (Rathburn),
Dichlormethan (BDH), Ethylacetat (BDH), Reagenzien: HBTU (Phase
Separations Ltd.), p-Cresol (Lanchester), TFA (Halocarbon Products
Corporation), HF (BOC), DIEA (Fluka). Empfohlene reaktive Seitenketten-Schutzgruppen
für Boc-Aminosäuren sind:
Arg (Tos), Asn (Xan), Asp (OcHxl), Glu (OcHxl), Gln (Xan) oder Gln,
His (DNP), Lys (CIZ), Serin (Bzl), Tyr (BrZ), Trp (CHO). Die Abkürzungen
haben die folgenden Bedeutungen: DCC = Dicyclohexylcarbodiimid,
DIC = Diisopropylcarbodiimid, DCM = Dichlormethan, DMF = Dimethylformamid,
TFA = Trifluoressigsäure,
Boc = tert.-Butyloxycarbonyl, HOBT = Hydroxybenzotriazol, DIEA =
Diisopropylethylamin, DCU = Dicyclohexylharnstoff.
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Beispielsweise
kann die Boc-Synthese eines erfindungsgemäßen Peptids folgendermaßen durchgeführt werden.
Für eine
HBTU-Aktivierung/in situ-Neutralisation
im 0,5 mmol-Maßstab
verwendet man 0,5 mmol Harz und einen 3-fachen Überschuss einer aktivierten
Boc-Aminosäure.
Die Boc-Aminosäure
und das Aktivierungsreagenz (HBTU) sollen in äquimolaren Mengen verwendet
werden, d. h. jeweils 2 mmol entsprechen in diesem Fall einem 3-fachen Überschuss.
DIEA wird sowohl zur Neutralisation des Harzes für die Kupplung als auch zur
Aktivierung der Boc-Aminosäure
verwendet (somit werden 2,5 mmol verwendet, 1 Äquivalent Boc-Aminosäure und
1 Äquivalent
Harz). Reagenzien: 0,5 M HBTU in DMF (MG = 379, 0,5 M = 18,95 g
in 100 ml; gegenüber
Licht nicht stabil) erfordern 2 mmol = 4 ml und 2,5 mmol DIEA =
0,46 ml (MG = 129, d = 0,742). Aktivierung von Aminosäuren: die
Boc-Aminosäure
soll erst unmittelbar vor der Zugabe zum Harz aktiviert werden,
insbesondere im Fall von Arg (Tos). Für sämtliche Boc-Aminosäuren: 2
mmol Boc-Aminosäure
werden in ein 20 ml fassendes Probenfläschchen aus Glas eingewogen.
4 ml 0,5 M HBTU-Lösung
werden zugegeben und zur Auflösung
des Feststoffes geschüttelt.
0,46 ml DIEA werden zugegeben und vermischt (es kann eine gewisse
Farbänderung
auftreten). Verfahren: Das Harz wird mit DMF gewaschen. Die Boc-Schutzgruppe
wird mit 100 % TFA entfernt. Sodann wird 2-mal 1 Minute geschüttelt, wobei
man dazwischen die Flüssigkeit
ablaufen lässt.
Nach Ablaufen der Flüssigkeit,
1-minütigem Waschen
mit fließendem
DMF, Ablaufen, Zugeben von aktivierter Aminosäure und 10-minütigem Schütteln wird
die Probe aufgenommen und einem Ninhydrintest unterzogen, um den
Kupplungswirkungsgrad festzustellen. Nach Beendigung der Synthese
wird ein Waschvorgang mit fließendem
DMF und anschließend
mit DCM durchgeführt.
Sodann wird das Produkt getrocknet. Die Synthese bei der ersten
und allen anschließenden
Stufen der Peptidkonstruktion wird unter Verwendung eines 3-fachen Überschusses
an HBTU-aktivierter Boc-Aminosäure in DMF
erreicht. Bei sämtlichen
Kupplungsvorgängen
soll der Kupplungsgrad mehr als 99 % betragen, wie durch quantitativen
Ninhydrintest festgestellt wird. Eine Schutzgruppenentfernung an
den N-Termini wird in 100 % TFA vorgenommen. Das Harzpeptid wird
vor und nach der Schutzgruppenentfernung sorgfältig gewaschen. Nach der letzten
Kupplung und Entfernen der Boc-Schutzgruppe wird das Peptidharz
mit Dichlormethan gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Peptid
wird vom Harzträger
durch das Verfahren mit hoher HF-Konzentration entfernt (2 g Harzpeptid,
2 g Cresol, 20 ml HF, 1,5 Stunden bei –5 °C), wodurch man das rohe Peptid
erhält,
das mit Ethylacetat (100 ml) gefällt und
in 6 M Guanidin-HCl-0,1 M TRIS-Lösung
(20 ml) wieder in Lösung
gebracht wird.
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Das
Peptid lässt
sich auf folgende Weise unter Anwendung einer analytischen HPLC-Trennung
an einer Vydac-C18-5-RAC-Säule reinigen.
Acetonitril von HPLC-Qualität
(Aldrich) und Wasser werden durch einen Membranfilter filtriert
und vor der Verwendung mit einem Heliumstrom entgast. Eine analytische
Trennung wird mit einem Lösungsmittelgradienten
erreicht, wobei man mit 0 % Acetonitril beginnt, dessen Konzentration
konstant innerhalb von 20 Minuten auf 60 % erhöht, diese Konzentration 20
Minuten beibehält
und sodann stetig 10 Minuten lang auf 0 % Acetonitril absenkt, wobei
eine konstante Strömungsgeschwindigkeit
von 1,2 ml pro Minute eingehalten wird. Eine präparative Trennung des Peptids
wird an einer präparativen
TSK-Gel-C18-Säule erreicht. Die Trennung
wird mit einem Lösungsmittelgradienten
erreicht, der mit 0 °C
Acetonitril beginnt, wonach eine konstante Zunahme innerhalb von
60 Minuten auf 18 % Acetonitril folgt, anschließend die Konzentration innerhalb
von 80 Minuten auf 60 % erhöht
wird und diese Konzentration 30 Minuten aufrechterhalten wird, wobei
eine konstante Strömung
von 8 ml pro Minute eingehalten wird. Der Gradient kann durch zwei
mikroprozessorgesteuerte Gilson 302-Einzelkolbenpumpen gesteuert
werden. Die Verbindungen lassen sich mit einem Waters 486 Tunable
Absorbance Detector bei 214 nm und analytische Chromatographen bei
Aufzeichnung mit einem HP-Laserjet 5L nachweisen. Ein Holochrome
UV-VIS-Detektor mit 220 nm für
präparative Chromatographen
kann unter Verwendung eines LKB 2210-Einzelkanal-Rekorders verwendet
werden. Eine Qualitätskontrolle
durch Kapillarelektrophorese kann unter Verwendung einer Waters
Quanta 4000-Einrichtung unter Einsatz von Phosphatpuffer (75 μM), pH-Wert 2,5, durchgeführt werden:
15 kV, Probenzeit 20 Sekunden, Aufsetzen durch hydrostatische Injektion
auf eine 60 cm-Säule,
Laufzeit 12 Minuten. Die Syntheseausbeute für 1 g (0,46 mmol Harz) soll
etwa 250 mg reines Peptid betragen.
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Alternative
Syntheseverfahren in Lösung
können
ebenfalls zur Herstellung größerer Mengen
der erfindungsgemäßen Peptide
verwendet werden. Geschützte
Trimerfragmente lassen sich durch stufenweise Synthese nach dem
Aktivesterverfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese
geläufig
ist, erhalten. Die Fragmente werden sodann unter Verwendung von
DCC/HOBT nach Entfernung der entsprechenden C- und N-terminalen
Schutzgruppen zusammengesetzt. Nach Entfernung sämtlicher Schutzgruppen wird das
rohe Peptid partiell durch SP-Sephadex-C25-Ionenaustauschchromatographie gereinigt,
wonach sich eine präparative
HPLC und eine Lyophilisation anschließen.
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Anwendung
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0,01
bis 1 000 mg lyophilisiertes Peptid können in 1-10 ml destilliertem
Wasser gelöst
und oral oder vaginal verabreicht werden. 0,01 bis 1 000 mg können zu
einer Pille, einer Kapsel oder einem Suppositorium zusammen mit
Trägern,
die vom Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung von Pillen, Kapseln
oder Suppositorien verwendet werden, zubereitet und oral, vaginal
oder anal verabreicht werden. Eine steril filtrierte Lösung von
0,001 bis 100 mg Peptid in destilliertem Wasser kann subkutan, intravenös oder intramuskulär injiziert
werden.
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Die
nachstehenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sind in keiner
Weise als Beschränkung
anzusehen.
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Beispiel 1A
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Ich
habe nachgewiesen, dass HEP-Rezeptorpeptide eine signifikante Adjuvanswirkung
besitzen. Dies wird durch Verstärkung
der IgG-Antikörperreaktion
auf Ovalbumin bei Mäusen
und durch Verstärkung
der antikörperabhängigen,
zytotoxischen Reaktion im Thymus gegen rote Blutkörperchen
des Schafes (SRBC) bei Mäusen
unter Verwendung von Rupe2032 nachgewiesen.
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Die
IgG-Reaktion bei Mäusen
2 Wochen nach Injektion von 50 μg
Ovalbumin und verschiedenen Konzentrationen an Rupe2032 wurde bestimmt.
Die IgG-Reaktion
wurde durch die optische Dichte (OD) bei einer 1:100-Verdünnung von
Mäuseserum
in Gegenwart von Ovalbumin gemessen. In der nachstehenden Tabelle ist
die als OD aufgezeichnete IgG-Reaktion angegeben:
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In
der nachstehenden Tabelle ist die IgG-Reaktion bei Aufzeichnung
als OD als relativer Wert bezogen auf 100 für die einzelnen Kontrollen
angegeben
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Beispiel 1B
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Der
Einfluss von HEP-Rezeptorpeptiden auf die Aktivierung von Antikörper gegen
Schaferythrozyten bildenden Zellen (SRBC) bei Mäusen (CBA-C57B1-Fi-Hybride, Alter 2
Monate, Gewicht 18-22 g) wurde bestimmt. Die Mäuse erhielten zunächst eine
intraperitoneale Injektion unter Verwendung von entweder 0,5 ml steriler
Kochsalzlösung
als Kontrolle oder Rupe2032 im gleichen Volumen wie die Kochsalzlösung. 30
Minuten nach der Injektion von Peptiden wurde jeder Maus eine Zellsuspension
mit einem Gehalt an 5 Millionen SRBC intraperitoneal verabreicht.
4 Tage nach der Immunisierung wurden die Tiere durch Gehirndislokation
getötet. Die
Milzorgane wurden aseptisch gewonnen. Jede Milz wurde in 2 ml Medium
199 homogenisiert. Anschließend
wurden 100 ml dieser Suspension in 1 ml in Medium 199 vorbereiteter
Agarose (aufbewahrt in einem Wasserbad bei 48 °C) gegeben und die SRBC-Suspension
wurde zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 1 % Agarose
ergab. Das 1 ml-Agarose-Zell- Gemisch
wurde bewegt und sodann auf eine Petri-Schale übertragen und zum Absetzen
gebracht. Nachdem die Agarose einen festen Zustand erreicht hatte,
wurde die Petri-Schale 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden
0,5 ml eines 1 + 20 verdünnten
Meerschweinchenserums in Medium 199 oben auf das Agarosegel als
Komplementquelle aufgesetzt. Die Inkubation wurde eine weitere Stunde
fortgesetzt. Sodann wurden die Schalen unter Verwendung eines 8x
Binokularmikroskops betrachtet und die Anzahl an Plaques wurde gezählt (jede
Plaque entspricht einer Antikörper
sezernierenden Mäuse-Milzzelle).
Die Ergebnisse wurden sowohl als die Anzahl der Antikörper sezernierenden
Zellen pro 1 Million nukleierten Milzzellen als auch als Anzahl
von Antikörper
sezernierenden Zellen pro vollständige
Milz angegeben. Da keine mitogene Wirkung beobachtet wurde (die
Verabreichung von HEP-Rezeptorpeptid führte zu Mäuse-Milzorganen von normaler
Größe), ergaben
diese beiden Berechnungen ähnliche
Ergebnisse.
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In
der nachstehenden Tabelle sind die Mittelwerte (30 Mäuse pro
Datenpunkt) der Anzahl von Antikörper
bildenden Zellen pro 1 Million nukleierten Milzzellen angegeben.
Die Daten wurden auf den Wert 100 für jede Kontrollgruppe bezogen.
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