CN100455665C - 人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件 - Google Patents
人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100455665C CN100455665C CNB200610123684XA CN200610123684A CN100455665C CN 100455665 C CN100455665 C CN 100455665C CN B200610123684X A CNB200610123684X A CN B200610123684XA CN 200610123684 A CN200610123684 A CN 200610123684A CN 100455665 C CN100455665 C CN 100455665C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ezrin
- gene
- upstream
- sequence
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因表达调控,公开了一种人食管癌细胞ezrin基因的上游转录调控区。本发明首次将ezrin基因上游序列插入含报告基因的载体构建了一系列真核表达质粒,转染哺乳动物细胞瞬时表达,确定了人ezrin基因上游序列在食管癌细胞中的重要转录调控元件,包括负调控元件和增强子序列。本发明对研究Ezrin在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Ezrin为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索食管癌的发病机制,为食管癌的防治提供新的理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及基因表达调控,具体地说,涉及人食管癌细胞ezrin基因上游的转录调控元件。
背景技术
食管癌是我国常见恶性肿瘤,其发病机制尚不明确。我们最近的研究结果显示,ezrin基因是食管癌侵袭转移相关基因之一。ezrin基因又称VIL2,定位于染色体6q25.2~q26,人类ezrin基因DNA长度约为24kb,含13个外显子,cDNA长度为1761bp,其表达产物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成员之一,主要参与细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接,具有维持细胞形态和运动、连接黏附分子及调节信号转导等功能。越来越多的证据表明Ezrin调控肿瘤发展。转移与非转移肿瘤细胞系及组织样品中基因表达的对比结果显示,来自啮齿动物乳腺、人胰腺和结肠的癌转移细胞中Ezrin的表达显著提高;同时,Ezrin在多种人类肿瘤中强烈表达,这些肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星细胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌等;进一步的研究显示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科动物横纹肌肉瘤和骨肉瘤细胞,Ezrin很可能是恶性肿瘤的关键调节分子。目前的研究主要集中在Ezrin蛋白的功能、细胞中与Ezrin蛋白相互作用的分子及其作用机制,而关于ezrin基因的上游转录表达调控机制的研究,尚未见报道。
在真核生物中,一个典型的基因,其上游是一段核心启动子的DNA序列,包括距转录起始位点约-40到+50范围内的DNA序列,核心启动子结合RNA聚合酶II(Pol II)及其辅助因子(基本转录机构),定位转录起始位点并控制转录方向,对细胞内相邻近的或远距离的激活因子和抑制因子作出应答。多数情况下,核心启动子并不直接调节转录。紧靠核心启动子的上游是一段调控性启动子,它是位于核心启动子周围、转录起始位点几百个碱基对以内的DNA区域。位于基因上游或下游或位于内含子中、距离转录起始位点较远的一段调控区域是增强子序列或负调控元件。序列特异性DNA结合蛋白与调控性启动子、增强子和负调控元件的结合控制着转录机制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控区,确定人ezrin基因的增强子和负调控元件。
本发明的另一个目的在于提供含有上述基因转录调控元件的载体。
本发明的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。
为了实现上述目的,本发明利用分子生物学软件对人食管癌细胞ezrin基因翻译起始位点(翻译起始位点ATG位于+135~+137)前的上游序列(-1759~+134)进行了分析,发现这一区域的平均GC含量为70.15%,存在CpG岛和20多个潜在的转录调控元件,提示在人食管癌中ezrin基因表达调控存在多种因素,从中找出关键的转录调控区域或调控元件,对阐明人食管癌细胞中ezrin基因的表达调控机制有重要意义。
本发明中,含有人食管癌细胞ezrin基因上游的序列命名为EZ1.759,其长度为1893bp,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,保留了ezrin基因上游-1759~+134之间的片段,为翻译起始位点前的一段序列,在SEQ ID NO:1中,+1为转录起始位点。
本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因上游负调控元件之一,其长度为212bp,核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,保留了ezrin基因上游-1102~-891之间的片段。
本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因另一负调控元件,其长度为329bp,核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,保留了ezrin基因上游-1102~-774之间的片段。
本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因上游增强子之一,其长度为117bp,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,保留了ezrin基因上游-890~-774之间的片段。
本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因另一增强子,其长度为77bp,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,保留了ezrin基因上游-773~-697之间的片段。
为了鉴别ezrin基因的转录调控元件,需要对人ezrin基因上游区域进行缺失分析。在一项缺失分析中,利用嵌套缺失技术,控制外切核酸酶III(Exo III)的消化时间,使ezrin基因上游从5’端-1759处开始逐渐截短,得到一系列以ezrin基因上游不同长度片段为启动子的真核细胞表达质粒,利用萤火虫荧光素酶报告基因,检测这些质粒在人食管癌细胞EC109中的转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差,以表达海肾荧光素酶的质粒pRL-TK作为内参照,与上述嵌套缺失质粒同时转染EC109细胞,测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性,用二者的比值,即相对荧光素酶活性表示目的序列的转录活性。结果显示:ezrin基因上游-1324~-696之间的区域是一个重要的转录活性调控区,-146~-32之间的区域是另一个重要的转录活性调控区。
为了进一步鉴别ezrin基因上游-1324~-696区域的转录调控作用,在以ezrin基因上游-1324~+134序列为启动子的真核细胞表达质粒上对-1102~-774之间329bp片段进行删除,结果质粒的相对荧光素酶活性提高,显示-1102~-774片段有抑制转录活性作用,存在转录负调控元件。另外,对-1102~-697区域进行分段PCR扩增,连接至含SV40启动子的质粒上,相对荧光素酶活性检测结果显示,ezrin基因上游-1102~-891和-1102~-774片段有转录抑制作用,-890~-774和-773~-697片段有转录增强作用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明首次鉴定了人食管癌细胞ezrin基因启动子,构建了一系列用于检测ezrin基因上游序列转录调控元件的真核表达质粒,转染哺乳动物细胞瞬时表达,确定了ezrin基因上游序列在人食管癌细胞中的重要转录调控元件。本发明对研究Ezrin在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Ezrin为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索食管癌的发病机制,为食管癌的防治提供新的理论依据。
附图说明
图1为以ezrin基因上游序列为启动子的重组质粒构建流程图;
图2为ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失质粒的构建流程图;
图3为ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失质粒的PCR鉴定结果;
图4为以ezrin基因上游序列为增强子或负调控元件的重组质粒构建流程图;
图5为以ezrin基因上游序列为增强子的重组质粒双酶切鉴定结果;
图6为ezrin基因上游5’端嵌套缺失质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析;
图7为ezrin基因上游删除部分片段的重组质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析;
图8为以ezrin基因上游序列为增强子或负调控元件的重组质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析;
其中,图3中,M1为DNA Marker DL2000;M2为DNA Marker100bp ladder;1~12为嵌套缺失质粒;13为对照质粒pGL3-Basic。
图5中,MI为DNA Marker DL2000;M2为DNA Marker 100bpladder;1为pGL3-Promoter;2为pGLP/-1102~-891;3为pGLP/-890~-774;4为pGLP/-773~-697;5为pGLP/-1102~-774。
图6中,(a)为ezrin基因上游序列(-1759~-32)系列缺失重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图;(b)为对应缺失子的相对荧光素酶活性。实验被重复3次,在此显示来自3次实验中有代表性的数据,误差线代表标准差。
图7中,(a)为删除ezrin基因上游部分序列的重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图;(b)为对应质粒的相对荧光素酶活性。实验被重复3次,在此显示来自3次实验中有代表性的数据,误差线代表标准差。
图8中,ezrin基因上游序列分段扩增片段构建在载体pGL3-Promoter上,质粒的相对荧光素酶活性测定实验被重复3次,在此显示来自3次实验中有代表性的数据,误差线代表标准差。
具体实施方式
实施例1含有ezrin基因上游序列的真核表达质粒的构建
1、人ezrin基因上游序列(-1759~+134)的克隆
文献发表的人ezrin基因序列翻译起始位点ATG位于+135~+137,据此设计并合成了用于扩增人ezrin基因翻译起始密码子上游1893bp片段的一对引物F1和R1,所述引物序列如下:
F1:
5’-CGGGGTACC -1759AGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’
(下划线为Kpn I位点)
R1:
5’-CCCAAGC +134 TTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’
(下划线为Hind III位点)
应用此对引物,从人食管癌细胞EC109基因组DNA中经PCR扩增出与预期一致的约1.9kb的DNA片段。回收所扩增的目的片段,Kpn I/Hind III双酶切后,与经Kpn I/Hind III双酶切的载体pGL3-Basic(Promega公司)连接。pGL3-Basic为萤火虫荧光素酶报告基因前不含启动子的表达载体。测序结果证明人ezrin基因上游-1759~+134之间的序列已定向克隆至萤火虫荧光素酶基因的上游,该序列命名为EZ1.759,重组质粒命名为pEZ1.759。重组质粒的构建流程如图1所示。
人食管癌细胞ezrin基因上游序列EZ1.759的测序结果见SEQ IDNO:1。与GenBank已知序列比较,核苷酸相同性为99.79%。
2、以pEZ1.759为基础的ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失载体的构建
StuI位于ezrin基因上游的-1447处,该内切酶可使DNA形成平滑末端,进一步被外切核酸酶ExoIII降解;Kpn I为载体pGL3-Basic上酶切位点,该内切酶可使DNA形成3’末端突出片段,不被ExoIII降解。将质粒pEZ1.759经StuI/Kpn I双酶切,再经ExoIII酶切。取不同反应时间的酶切后产物,用S1核酸酶切除单链DNA,Klenow补平末端,T4DNA连接酶使片段自连,连接产物转化大肠杆菌JM109,进行抗性筛选及测序,得到一系列ezrin基因上游序列从5’端逐渐截短的真核表达质粒,重组质粒的构建流程参见图2。由质粒pGL3-Basic的上、下游测序引物RVprimer3和GLprimer2组成一对引物,对重组质粒进行PCR鉴定,结果见图3。所有构建的重组质粒通过测序验证。
3、用于鉴定ezrin基因增强子或负调控元件的重组质粒的构建
限制性内切酶Pst I有两个酶切位点分别位于ezrin基因上游的-1102和-773,质粒pEZ1.324经Pst I酶切,回收大片断,T4 DNA连接酶使片段自连,即得到去除ezrin基因上游-1102~-773之间329bp片段的重组质粒pEZ1.324D。所删除的序列见SEQ ID NO:5。
设计引物对ezrin基因上游-1102~-697之间的序列进行分段扩增,将不同长度的扩增片段用BamH I/Sal I双酶切,再与经BamH I/SalI双酶切的载体pGL3-Promoter(Promega公司)连接,构建用于检测ezrin基因增强子或负调控元件的重组质粒(见表1)。pGL3-Promoter为萤火虫荧光素酶报告基因前含SV40启动子的真核表达载体。该重组质粒的整个构建流程如图4所示,重组质粒用BamH I/Sal I进行双酶切鉴定,结果见图5。所述引物序列如下:
F2:(下划线为BamH I位点)
5’-CGCGGATCC -1102 CTGCAGGCGCCGGGTGAGGCGTGC-3’
F3:(下划线为BamH I位点)
5’-CGCGGATCC -890 TCCCCTCAGGTCTCTCCCGAAGGAAACGCG-3’
F4:(下划线为BamH I位点)
5’-CGCGGATCC -773 CTGCAGCCGCGGGGCAACGGTTGCT-3’
R2:(下划线为Sal I位点)
5’-ACGCGTCGAC -891 CCCGGCGCCGAGGGGAAGGTCGC-3’
R3:(下划线为Sal I位点)
5’-ACGCGTCGAC -774 TCACAACCGTCAAGCCTTTGAGAAACTCTTTCAAAAACTGCAACCGC-3’
R4:(下划线为Sal I位点)
5’-ACGCGTCGAC -697 GCTGCCAGGAAGCCCGTGAGAAGCCGAG-3’
表1以ezrin基因上游序列为增强子或负调控元件的重组质粒的构建
实施例2细胞培养、DNA转染和人食管癌细胞ezrin基因上游序列活性分析
用QIAprep Spin Miniprep Kit提取需转染的实验质粒、对照质粒pGL3-Basic和内参照质粒pRL-TK,测定其含量和纯度。取上述表达萤火虫荧光素酶的实验质粒和对照质粒用Buffer EB(10mmol/LTris·C1,pH 8.5)稀释至100ng/μl,表达海肾荧光素酶的内参照质粒pRL-TK用Buffer EB稀释至20ng/μl。将实验质粒与内参照质粒按50:1混合,即1μg:20ng(10μl:1μl)。
人食管癌细胞EC109进行常规传代培养,接种于24孔培养板中,每孔0.5ml。24h后细胞满度达50%~60%时即可用于转染。
转染方法如下:在超净工作台中,取7ml玻璃离心管若干支,做好标记,加入70.5μl含12.5mmol/L HEPES的199基础培养液和4.5μlFugene6转染试剂(Roche公司),涡旋1sec,室温下放置5min。再加入相应的质粒混合液16.5μl,空白管中加入16.5μlBuffer EB,涡旋1sec,室温下放置15min。将24孔板做好标记,每个样品设3个平行孔,每孔加入28μl转染液,轻轻摇匀,于37℃5%CO2培养箱中继续培养48h,收获细胞,进行双荧光素酶报告基因的检测。实验被重复3次。
双荧光素酶报告基因的检测采用Promega公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System进行分析。将转染有目的DNA的贴壁细胞用1×PBS洗涤一次,去尽残液,加入100μl新鲜配制的1×PLB,室温下,摇床上剧烈振荡15min以裂解细胞。取20μl上述细胞裂解液加入含100μlLARII溶液的1.5μl离心管中,测定荧火虫荧光素酶活性,再向同一离心管中加入100μl新鲜配制的1×STOP液,测定海肾荧光素酶(内参照)活性,根据TD20/20型照度计配制的软件计算出各组相对荧光强度(萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶),以此代表相对荧光素酶活性。各组实验数据均计算平均值及标准差,用x±s。应用SPSS14.0统计软件对各组实验数据之间是否有显著性差异进行t检验。
1、ezrin基因上游序列转录调控区的鉴定
ezrin基因上游序列(-1759~-32)从5’端嵌套缺失质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图及对应缺失子的相对荧光素酶活性见图6,组间差异显著性分析见表2。
表2ezrin基因上游序列5’端嵌套缺失质粒的相对荧光素酶活性
在人食管癌细胞中,ezrin基因翻译起始密码子上游的1893bp序列具有明显的转录活性。质粒pEZ1.759和pEZ1.324组间相对荧光素酶活性差异没有显著性(P>0.05),pEZ1.324和pEZ0.696组间相对荧光素酶活性差异有高度显著性(P<0.01),pEZ0.696和pEZ0.213组间、pEZ0.696和pEZ0.146组间以及pEZ0.213和pEZ0.146组间相对荧光素酶活性差异均无显著性(P>0.05),pEZ0.146和pEZ0.032组间相对荧光素酶活性差异有高度显著性(P<0.01)。当ezrin基因上游序列从-1759截短至-1324以及从-696截短至-146时,转录活性无明显变化,说明ezrin基因上游在-1759~-1324之间和-696~-146之间的DNA序列对转录活性无明显影响,为非转录活性调控区。当ezrin基因上游序列从-1324截短至-696时,转录活性下降39.1%,但与对照质粒pGL3-Basic相比较转录活性仍然很高,显示在这一区域有影响转录活性的重要转录调控元件,很可能存在ezrin基因增强子序列。当ezrin基因上游序列从-146截短至-32时,转录活性下降94.0%,接近对照质粒pGL3-Basic,说明在这一区域有显著影响转录活性的关键转录调控元件,为ezrin基因调控性启动子区。
2、ezrin基因上游增强子或负调控元件的鉴定
删除ezrin基因上游部分序列的重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图及对应的相对荧光素酶活性见图7,组间差异显著性分析见表3。
表3.删除ezrin基因上游部分序列的重组质粒的相对荧光素酶活性
质粒pEZ1.324和pEZ0.890组间相对荧光素酶活性差异没有显著性(P>0.05)。pEZ1.324和pEZ1.324D组间的相对荧光素酶活性差异有显著性(P<0.05),在pEZ1.324基础上删除-1102~-774之间的序列反而使转录活性提高,提示在-1102~-774之间序列可能对转录有负调控作用。pEZ0.890和pEZ0.696组间的相对荧光素酶活性差异有高度显著性(P<0.01),删除-890~-697之间序列的使转录活性下降,提示-890~-697之间序列对转录活性有增强作用。
为了进一步分析ezrin基因上游片段-1102~-891、-890~-774、-773~-697和-1102~-774对转录活性的影响,利用PCR方法克隆上述片段,将目的片段连接至质粒pGL3-Promoter上构建重组质粒。重组质粒pGLP/-1102~-891为在质粒pGL3-Promoter上连接有ezrin基因上游片段-1102~-891,其它质粒命名与此类似。利用相对荧光素酶活性来分析这些DNA片段对转录活性的抑制或增强作用。实验结果见图8和表4。
表4ezrin基因上游序列对转录活性的调控作用
连接有ezrin基因上游片段的质粒(pGLP/-1102~-891,pGLP/-890~-774,pGLP/-773~-697,pGLP/-1102~-774)与对照质粒pGL3-Promoter相比较,组间的相对荧光素酶活性差异有显著性或高度显著性(P<0.05或P<0.01)。可以看出,将-1102~-697之间的DNA序列分为3个区段,-1102~-891之间的片段使相对荧光素酶活性降低33.5%,对转录活性有抑制作用;-890~-774之间的片段使相对荧光素酶活性升高13.1%,对转录活性有弱的增强作用;-773~-697之间的片段使相对荧光素酶活性升高63.9%,对转录活性有增强作用。而-1102~-774片段使相对荧光素酶活性降低14.6%,表现出对转录活性的抑制作用,这与前面的实验结果相一致,即质粒pEZ1.324在删除-1102~-774之间的序列时相对荧光素酶活性升高。
综上,可以确定ezrin基因上游-1102~-697之间长406bp的DNA序列为重要的转录活性调控区。-1102~-891之间212bp片段为ezrin基因负调控元件;-890~-774之间117bp片段为ezrin基因弱增强子序列;-773~-697之间77bp片段为ezrin基因增强子序列。
人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件序列表
SEQUENCE LISTING
<110>汕头大学医学院
<120>人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件
<130>
<160>1
<170>Patent In version 3.2
<210>1
<211>1893
<212>DNA
<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)
<400>1
-1759 AGTGAATGCT GTTGCTGCTC GTCTGGAAGC CAGACGTTGA GAACCCCTTC
-1709 TAGAGTGAGC TCTCCCGCAG CAAATTCTAC TGGCCCCCAA AGTATGTGTT
-1659 TTGTGTGTCT TAAAAATTTG TTGAGAACCA TTAGCAAAAA AACAAACAAA
-1609 AAAACTTAAT TCCTAGAATT CCAGAGAAAT CCCATGGAGC TTTTTGCCAG
-1559 TCACGTCAAG AGAGGCCACA AACGTGCCAC TTAACCAGAG CTTCGGAAAG
-1509 GCGGCGGCTG GGCCGGCCAC GTGCACCGAG ACTCGGGGCC AGGTGCAGCC
-1459 GCCCCAGGGC CGAGGCCTCG GAACTGGCCC CCGGTCCCGG CCCCAAGCGG
-1409 TCCAGCGATT CCCCCAAGCC GTCCGCCCCT CCAGATTTAT TTACGTTTTC
-1359 CTGACTTCCC CCTGCCCGCT GTGGGACAAA CAGCCTCCCC ACTTGCATCT
-1309 GCGAGGGGAG TAGCGCGCAC TTCCGCCAAG TTCCGCCCCC ACCCAGCCCG
-1259 AGGCCCGGCT GCCGCCATCT TGCGGGGGGC GCACCTCACA GGTCGGGAGC
-1209 TGGGCGGGAA GGGGCGTGGT CCCGGGACCC GCCCCGCCGG GGCTTTTGGG
-1159 AGCGCGGGCA GCGAGCGCAC TCGGCGGACG CAAGGGCGGC GGGGAGCACA
-1109 CGGAGCACTG CAGGCGCCGG GTGAGGCGTG CGGCGGCCGG GGTCGGGACG
-1059 GGGGTTCTGG GCGGGGGGTT CCTGGTGGAG GGCCCGGGCG GGCGGCGGGG
-1009 TTCGGCGGCA GGTGCGGCGG GCAGCCTAGG GGGCGCGGCG CGGGGTTCTC
-959 GCCCGGCACC CCCGGGGCAG GTGGAGCTGA GCCGGCCCGC GGCCCCGCGA
-909 CCTTCCCCTC GGCGCCGGGT CCCCTCAGGT CTCTCCCGAA GGAAACGCGG
-859 AGCCTGGGTG CCTGGGCGCC GTCCCTCGGC GGCTCCCGAG CGGTTGCAGT
-809 TTTTGAAAGA GTTTCTCAAA GGCTTGACGG TTGTGACTGC AGCCGCGGGG
-759 CAACGGTTGC TACACAAAGT GAAACTTGCC GAGTGCTCGG CTTCTCACGG
-709 GCTTCCTGGC AGCCCCGGGA AGTTCCTCGG CGGACCCCGA GCCCGCGCCC
-659 CCTCTCCACG GATCCCTCCC CAGCGAGTGC CCCCCCGCCC GCCCTGTGCC
-609 CCCTCTCCCC TGACCCCTCC CTGTCGGGTG CCCCGCGGGC TCGCGCTGGC
-559 TGTCCTGGGA CTCCTTCCTC CTAGGTGTTC CTCCTGCCCC TCGCCCTCTC
-509 TCTCCCAGGC GCGCGCTCCC TCTCCCCGGG CCTTTCCCCG CCGGGTATCC
-459 CTGGGCCCGC GCCCCGTCTT CTCCGCCTCT CTCCGCTGGG TGCACCTCGA
-409 GTGTCCCCCA GACCCCTCCC CGCCCGGCCG GCGCTCTCTC CCCTGACCCT
-359 CCTGGCCGAG TGTTCCCCGG GGCCCGCGCC CCCTCCCCCC GATCCTCCCC
-309 ACTGAGTGTT CCCCCTGCCC TCTCTCTCCC GGGCCTGCGC CCCCCACCAG
-259 CCCCTTCATG CTGGGGGTCC CCTGGGTGCG CACCCCCTCT CCTCGGACCC
-209 ACCCCCAACT GGGGGGCACC TCCAGTGCCC GCCGGCTGCC CCTTGGGCGC
-159 GCGCCCCCGC TCTCGGGCGC CTCCTCGCCG GGGGCCCGGC CCGGCCCCGC
-109 CCCGCCCGTG CCCCCTCCCC ATGCCCGCAG TGCTGGGCGG GGCGCTGACT
-59 CACCCGGGCC CGGGCTGGCC GGTTCTTAAG CGGCAGCGCG CTGCGGGCGC
-9 CGAGTGTCGG GCGCGGCAGG AGGACGAGGC AGGGCGGGCG GGCGCTCTAA
+42 GGGTTCTGCT CTGACTCCAG GTTGGGACAG CGTCTTCGCT GCTGCTGGAT
+92 AGTCGTGTTT TCGGGGATCG AGGATACTCA CCAGAAACCG AAA
<210>2
<211>212
<212>DNA
<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)
<400>2
-1102 CTGCAGGCGC CGGGTGAGGC GTGCGGCGGC CGGGGTCGGG ACGGGGGTTC
-1052 TGGGCGGGGG GTTCCTGGTG GAGGGCCCGG GCGGGCGGCG GGGTTCGGCG
-1002 GCAGGTGCGG CGGGCAGCCT AGGGGGCGCG GCGCGGGGTT CTCGCCCGGC
-952 ACCCCCGGGG CAGGTGGAGC TGAGCCGGCC CGCGGCCCCG CGACCTTCCC
-902 CTCGGCGCCG GG
<210>3
<211>117
<212>DNA
<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)
人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件序列表
<400>3
-890 TCCCCTCAGG TCTCTCCCGA AGGAAACGCG GAGCCTGGGT GCCTGGGCGC
-840 CGTCCCTCGG CGGCTCCCGA GCGGTTGCAG TTTTTGAAAG AGTTTCTCAA
-790 AGGCTTGACG GTTGTGA
<210>4
<211>77
<212>DNA
<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)
<400>4
-773 CTGCAGCCGC GGGGCAACGG TTGCTACACA AAGTGAAACT TGCCGAGTGC
-723 TCGGCTTCTC ACGGGCTTCC TGGCAGC
<210>5
<211>329
<212>DNA
<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)
<400>5
-1102 CTGCAGGCGC CGGGTGAGGC GTGCGGCGGC CGGGGTCGGG ACGGGGGTTC
-1052 TGGGCGGGGG GTTCCTGGTG GAGGGCCCGG GCGGGCGGCG GGGTTCGGCG
-1002 GCAGGTGCGG CGGGCAGCCT AGGGGGCGCG GCGCGGGGTT CTCGCCCGGC
-952 ACCCCCGGGG CAGGTGGAGC TGAGCCGGCC CGCGGCCCCG CGACCTTCCC
-902 CTCGGCGCCG GGTCCCCTCA GGTCTCTCCC GAAGGAAACG CGGAGCCTGG
-852 GTGCCTGGGC GCCGTCCCTC GGCGGCTCCC GAGCGGTTGC AGTTTTTGAA
-802 AGAGTTTCTC AAAGGCTTGA CGGTTGTGA
<210>6
<211>
<212>DNA
<213>引物
<400>6
F1:5’-CGGGGTACCAGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’
R1:5’-CCCAAGCTTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’
<210>7
<211>
<212>DNA
<213>引物
<400>7
F2:5’-CGCGGATCCCTGCAGGCGCCGGGTGAGGCGTGC-3’
F3:5’-CGCGGATCCTCCCCTCAGGTCTCTCCCGAAGGAAACGCG-3’
F4:5’-CGCGGATCCCTGCAGCCGCGGGGCAACGGTTGCT-3’
R2:5’-ACGCGTCGACCCCGGCGCCGAGGGGAAGGTCGC-3’
R3:5’-ACGCGTCGACTCACAACCGTCAAGCCTTTGAGAAACTCTTTCAAAAACTGCAACCGC-3’
R4:5’-ACGCGTCGACGCTGCCAGGAAGCCCGTGAGAAGCCGAG-3’
Claims (7)
1、一种人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件,其核苷酸序列选自下组:
(1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,
(2)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,或
(3)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
2、一种载体,它含有权利要求1所述的人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件。
3、如权利要求2所述的载体,其特征在于,它还含有所述的人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件可操作地连接的外源基因。
4、如权利要求3所述的载体,其特征在于,所述外源基因是报告基因。
5、一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求2所述的载体。
6、如权利要求5所述的宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
7、如权利要求6所述的宿主细胞,其特征在于,所述哺乳动物细胞是人的细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB200610123684XA CN100455665C (zh) | 2006-11-21 | 2006-11-21 | 人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB200610123684XA CN100455665C (zh) | 2006-11-21 | 2006-11-21 | 人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1966685A CN1966685A (zh) | 2007-05-23 |
CN100455665C true CN100455665C (zh) | 2009-01-28 |
Family
ID=38075667
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB200610123684XA Expired - Fee Related CN100455665C (zh) | 2006-11-21 | 2006-11-21 | 人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN100455665C (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106434663A (zh) * | 2016-10-12 | 2017-02-22 | 遵义医学院 | CRISPR/Cas9靶向敲除人ezrin基因增强子关键区的方法及其特异性gRNA |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1327450A (zh) * | 1999-09-17 | 2001-12-19 | 鲁珀特·唐纳德·霍姆斯 | 埃滋蛋白的调节/伸展肽 |
US20040105860A1 (en) * | 2002-08-01 | 2004-06-03 | Losordo Douglas W. | Cell modulation using a cytoskeletal protein |
US20050143357A1 (en) * | 2002-02-25 | 2005-06-30 | Ake Pousette | Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-) methods and uses thereof |
-
2006
- 2006-11-21 CN CNB200610123684XA patent/CN100455665C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1327450A (zh) * | 1999-09-17 | 2001-12-19 | 鲁珀特·唐纳德·霍姆斯 | 埃滋蛋白的调节/伸展肽 |
US20050143357A1 (en) * | 2002-02-25 | 2005-06-30 | Ake Pousette | Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-) methods and uses thereof |
US20040105860A1 (en) * | 2002-08-01 | 2004-06-03 | Losordo Douglas W. | Cell modulation using a cytoskeletal protein |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Estrogen Receptor Inducibility of the Human Na+/H+Exchanger Regulatory Factor/Ezrin-Radixin-Moesin BindingProtein 50 (NHE-RF/EBP50) Gene Involving MultipleHalf-Estrogen Response Elements. TRACY R. EDIGER et al.Molecular Endocrinology,Vol.16 No.8. 2002 |
Estrogen Receptor Inducibility of the Human Na+/H+Exchanger Regulatory Factor/Ezrin-Radixin-Moesin BindingProtein 50 (NHE-RF/EBP50) Gene Involving MultipleHalf-Estrogen Response Elements. TRACY R. EDIGER et al.Molecular Endocrinology,Vol.16 No.8. 2002 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1966685A (zh) | 2007-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pinto et al. | Regulatory sequences of the mouse villin gene that efficiently drive transgenic expression in immature and differentiated epithelial cells of small and large intestines | |
Kleinjan et al. | Aniridia-associated translocations, DNase hypersensitivity, sequence comparison and transgenic analysis redefine the functional domain of PAX6 | |
Plowman et al. | While K-ras Is Essential for MouseDevelopment, Expression of the K-ras 4A Splice VariantIsDispensable | |
Gruzdeva et al. | The Mcp element from the bithorax complex contains an insulator that is capable of pairwise interactions and can facilitate enhancer-promoter communication | |
CN101384734B (zh) | 正常和异常基因表达中的dna构象(环结构) | |
CN111019971A (zh) | 在rosa26位点条件性过表达hpv e6基因小鼠模型的构建方法 | |
CN102439174B (zh) | 基于检测slc45a3-elk4融合转录子的用于诊断前列腺癌的组合物和方法 | |
Delidakis et al. | Amplification of a chorion gene cluster in Drosophila is subject to multiple cis-regulatory elements and to long-range position effects | |
CN110117657A (zh) | 环状RNA hsa_circ_0004872在胃癌诊断中的应用 | |
Rogers et al. | Ectopic expression of Zmiz1 induces cutaneous squamous cell malignancies in a mouse model of cancer | |
Gopalkrishnan et al. | Translational infidelity and human cancer: role of the PTI-1 oncogene | |
Reddy et al. | Cancer-inducible transgene expression by the Grp94 promoter: spontaneous activation in tumors of various origins and cancer-associated macrophages | |
CN106701900A (zh) | 长链非编码rna herc2p3基因及其在胃癌中的用途 | |
Challa et al. | Novel hypomorphic alleles of the mouse tyrosinase gene induced by CRISPR-Cas9 nucleases cause non-albino pigmentation phenotypes | |
CN105624191A (zh) | 一种建立cyp2d1基因敲除大鼠模型的方法 | |
Wardrop et al. | Identification of two evolutionarily conserved and functional regulatory elements in intron 2 of the human BRCA1 gene | |
CN100455665C (zh) | 人食管癌细胞ezrin基因上游转录调控元件 | |
CN101974643B (zh) | 上皮型钙黏蛋白表达基因cdh1突变检测试剂盒及其用途 | |
WO2008073201A9 (en) | Compositions and methods for identifying agents that alter expression of survivin | |
Yang et al. | Induction of melanoma in murine macrophage inflammatory protein 2 transgenic mice heterozygous for inhibitor of kinase/alternate reading frame | |
CN100427596C (zh) | 人食管癌细胞ezrin基因启动子 | |
CN103898158B (zh) | 一种含有malat1启动子序列和报告基因的载体及其构建方法和用途 | |
Kang et al. | Efficient integration of short interspersed element-flanked foreign DNA via homologous recombination | |
Fang et al. | Development of chimeric gene regulators for cancer-specific gene therapy with both transcriptional and translational targeting | |
Safina et al. | Functional efficiency of PCR vectors in vitro and at the organism level |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090128 Termination date: 20091221 |