CN1327450A - 埃滋蛋白的调节/伸展肽 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了人埃滋蛋白(Hep受体)中的一种新型调节位点以及与该位点结合诱导免疫反应的带电分子。本发明人已测定,埃滋蛋白的可溶性构象中的Hep受体(人埃滋蛋白的跨越氨基酸308－373)由两个相邻α螺旋结构域组成,它们在铰合区(M339－M340)折叠在一起形成两个反向平行的螺旋线,该螺旋线通过初级氨基酸序列的互补侧链电荷来稳定的(参见表1和图1)。本发明人测定了在埃滋蛋白的未折叠膜相关构象中,该Hep受体被迫通过细胞膜并暴露在细胞外表面上(参见图2)。这种出人意料的发现与至今科学出版物中的膜组构模型相反,在细胞外表面上未显示埃滋蛋白α结构域的任何部分。本发明为氨基酸序列与部分Hep受体相同的肽与Hep受体的互补部分结合,这样引起药用免疫反应。本发明还在于与该位点结合的任何带电分子将诱导药用免疫反应。这些带电分子可以口服和通过其它途径施用以治疗各种传染病和癌症。

Description

埃滋蛋白的调节/伸展肽
发明背景
本发明的领域涉及通过诱导疾病斗争免疫反应来治疗传染病和癌症。耐受抗生素的病原菌的新菌株的生长问题、有效地抗慢性病毒和真菌引起的感染的化合物有限以及缺乏有效的抗癌治疗方法证实需要能够提高宿主防御这些医学问题的化合物。本发明涉及通过结合到Hep受体(为本发明人在人埃滋蛋白中发现的一种新型活性位点)上刺激免疫反应的新型带电分子。优选的带电分子为序列与人埃滋蛋白中的Hep受体相同的新型肽。
埃滋蛋白为蛋白质中ERM(埃滋蛋白-根蛋白-膜突蛋白)家族的一员，在许多细胞类型中起结构和调节作用。大量事实证明，埃滋蛋白调节皮层细胞骨架的结构，从而控制细胞表面拓扑图。埃滋蛋白采取两种主要构象：1)在细胞质中发现的可溶性折叠形式，2)伸展和伸长形式，发现它附着在细胞膜的胞质表面上，特别是与微绒毛以及其它激活相关的结构相连。该蛋白质的N端结构域附着在细胞膜的胞质表面上，同时其C端部分与肌动蛋白细胞骨架结合。埃滋蛋白为T细胞中的酪氨酸激酶底物，并且表皮生长因子(EGF)受体的EGF刺激还导致其经过酪氨酸磷酰化。埃滋蛋白在其伸展构象中的N端结构域在有PIP2的情况下与CD44的胞质尾区结合。埃滋蛋白还可以与ICAM-2的胞质尾区结合。埃滋蛋白对诸如钙蛋白酶的调节蛋白酶非常敏感，并且在细胞激活期间被快速转换。Anthony Bretscher、David Reczek和Mark Berryman(1997)的“埃滋蛋白：一种在细胞表面结构集群中需要构象激活以使微丝与质膜相连的蛋白质”《细胞科学杂志》110：3011-3018
对埃滋蛋白的二级结构的详细分析显示，有三个主要结构域：氨基酸1-300的N端结构域，氨基酸300-470的高带电的α结构域以及氨基酸470-585的C端结构域。结构模拟暗示，尽管还没有鉴定出铰合部的位置，但是α结构域以埃滋蛋白的可溶性球状形式折叠成两个反向平行的螺旋线。在其伸展的磷酰化形式的模型中，埃滋蛋白通过N端结构域附着在细胞膜的内表面上，两个埃滋蛋白分子的α结构域配对成反向平行二聚体并位于细胞表面膜的下面。在该伸展形式中，埃滋蛋白在第353位的酪氨酸上经酪氨酸磷酰化(Yp353)。Ossi Turunen、Markku Sainio、Juha Jaaskelainen、Olli Carpen和AnttiVaheri(1998)的“埃滋蛋白家族中的结构-功能关系以及在神经纤维瘤2蛋白质中肿瘤相关点突变的作用”《生物化学和生物物理学学报》1387：1-16
本发明人在US5773573中公开了与gp120的C端具有70％相同性的14氨基酸肽HEP1(氨基酸序列TEKKRRETEREKE，SEQ ID 28，与人埃滋蛋白的氨基酸324-337相同)，它能够在人体内抑制HIV复制。此时本发明人相信，观察到的肽HEP1的抗HIV作用是由于口服HEP1诱导了对gp120的C端的互补HIV序列诱导的自体反应性免疫反应的免疫耐性。
本发明人现已公开了HEP1的抗-HIV活性是由于激活了新型免疫途径，其中HEP1与Hep受体的结构域B中的其互补序列结合(HEP1与该Hep受体的结构域A部分相同)。
表1.氨基酸、三字母代码、一字母代码和侧链电荷
在生理pH下氨基酸侧链上的电荷
氨基酸 三字母代码 一字母代码 电荷 符号
甘氨酸 Gly  G 无
丙氨酸 Ala  A 无
缬氨酸 Val  V 无
异亮氨酸 Ile  I 无
亮氨酸 Leu  L 无
丝氨酸 Ser  S 无
苏氨酸 Thr  T 无
天冬氨酸 Asp  D 负电 --
谷氨酸 Glu  E 负电 --
磷酸酪氨酸 Tyr(P)  Yp 负电 --
天冬酰胺 Asn  N 弱负电 -
谷氨酰胺 Gln  Q 弱负电 -
赖氨酸 Lys  K 正电 +
精氨酸 Arg  R 正电 +
组氨酸 His  H 弱正电 +
脯氨酸 Pro  P 无
色氨酸 Trp  W 无
苯丙氨酸 Phe  F 无
酪氨酸 Tyr  Y 无
甲硫氨酸 Met  M 无
半胱氨酸 Cys  C 无
附图简述
图1为以下初级氨基酸序列的对比：
a)可溶性埃滋蛋白中Hep受体的折叠反向平行相关的螺旋线。
b)在具有肽配体的膜相关埃滋蛋白中Hep受体的伸展螺旋线。
c)在两个细胞相互作用期间形成反向平行相关的螺旋线的二聚体的两个伸展Hep受体。
图2为埃滋蛋白上的Hep受体、其配体、细胞膜、细胞表面受体和细胞骨架组分之间关系的说明。序列简述
SEQ ID 1为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 2为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 3为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 4为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 5为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 6为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 7为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 8为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 9为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 10为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 11为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 12为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 13为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 14为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 15为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 16为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 17为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 18为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 19为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 20为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 21为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 22为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 23为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 24为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 25为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 26为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 27为本发明的肽的氨基酸序列。
SEQ ID 28为本发明的肽的氨基酸序列。
发明详述
在细胞质中发现的埃滋蛋白的可溶性构象由两个相邻α螺旋结构域组成，它们在铰合区(M339-M340)折叠在一起形成两个反向平行的螺旋线，该螺旋线通过初级氨基酸序列的互补侧链电荷来稳定。本发明的主题是Hep受体结构域A的氨基酸序列的正电侧链和负电侧链与Hep受体结构域B的氨基酸序列的正电侧链和负电侧链互补。在埃滋蛋白的激活的开放构象中，两个不同埃滋蛋白分子的Hep受体的结构域A和结构域B相互作用能够形成反向平行二聚体。除了在细胞表面下面形成的埃滋蛋白的反向平行二聚体之外，本发明人已测定这些二聚体可以在暴露在一个细胞表面上的Hep受体与暴露在另一个细胞表面上的Hep受体之间形成。当两个Hep受体在两个细胞表面紧密相连期间进行接触时，在两个细胞中都引发激活信号(图2)。部分地模拟Hep受体的结构域A和结构域B的侧链电荷之间的相互作用的任何带电分子将引起药用生物反应。
Hep受体-结构域A(人埃滋蛋白的氨基酸号码308-339)，由以下32个氨基酸序列组成。(这些序列是使用每个氨基酸的单字母代码从多肽的N端至C端列出的。Yp代表体内发现的磷酸酪氨酸的形式)SEQ ID 1AREEKHQKQLERQQLETEKKRRETVEREKEQM
在US5773573中，本发明人公开了肽HEPl(SEQ ID 28)的抗-HIV活性，本发明人现已发现它具有与Hep受体-结构域A的一部分(人埃滋蛋白序列的跨越氨基酸324-337)相同的序列。在上述专利中，本发明人假设抗-HIV活性是由于对由HIV gp120的C端诱导的自身反应性免疫反应的免疫耐性的诱导所导致的。本发明人现在可以公开HEP1的抗-HIV活性是由于其与Hep受体结构域B结合并诱导新型免疫反应的结果。本发明的主题是由埃滋蛋白的Hep受体获得的活性明显优于HEP1的新型肽。
Hep受体-结构域B(人埃滋蛋白的氨基酸号码340-373)，由以下34个氨基酸序列组成(在埃滋蛋白的膜相关构象中酪氨酸353[Y]可以被磷酸化为磷酸酪氨酸[Yp])：SEQ ID 2MREKEELMLRLQDY(p)EEKTKKAERELSEQIQRALQ
本发明人已测定Hep受体的结构域B为埃滋蛋白上的在脑感染期间HIV gp120与其结合的位点。(HIV gp120使用与一部分Hep受体结构域A具有70％相同性的其带电C端氨基酸与Hep受体结构域B结合)。与Hep受体结合的新型带电分子可用于治疗HIV相关的痴呆。Claudia Hecker、Christoph Weise、Jurgen Schneider-Schaulies、HarveyHolmes、Volker ter Meulen(1997)“HIV-1包膜蛋白gp120与结构膜蛋白埃滋蛋白和膜突蛋白的特异性结合”《病毒研究》49 215-223
本发明人已证实(实施例1A)，Hep受体肽具有显著的辅助活性，并且通过在小鼠中使用HEP1、Rupe312、Rupe1014、Rupe1024和Rupe2032使对卵清蛋白的IgG抗体反应提高证实了这一点。本发明人也已证实(实施例1B)在小鼠中使用HEP1、Rupe312、Rupe15、Rupe1014、Rupe1024和Rupe2032之后Hep受体肽具有提高胸腺中对羊红细胞(SRBC)的抗体依赖性细胞毒素反应的活性。(Rupe312 SEQ ID 8：KKRRETVERE和Rupe15 SEQ ID 3：TEKKR和Rupe1014 SEQ ID16：EREKE和Rupe1024 SEQ ID 17：EREKEQMMREKEEL和Rupe2032 SEQ ID19：KEELMLRLQDYEE和HEP1 SEQ ID 28：TEKKRRETVEREKE)
本发明人已证实(实施例2)hep受体肽具有显著的抗肿瘤活性，并且通过在小鼠中使用Rupe312和Rupe414 Hep受体肽降低快速生长的移植肉瘤和生长较慢的移植宫颈癌的生长速率证实了这一点。(Rupe312 SEQ ID 8：KKRRETVERE和Rupe414 SEQ ID 13：KRRETVEREKE)
本发明人已证实(实施例3)，在21位HIV感染的患者中HEP1治疗(每天口服10mg，治疗30天或90天)诱导使治疗后6个月时间内临床好转的免疫反应，这可以通过以下来度量：CD4 T淋巴细胞群体增加和机会感染降低、HIV感染性降低和CD38、T淋巴细胞的CD8群体(一种公认的向AIDS发展的预后标记物)降低。M Levancher、F Hulstaert、S.Tallet、S Ullery、J J Pocidalo、B A Bach(1992)“CD8淋巴细胞上的激活标记物在人免疫缺陷综合征中的重要性：疾病分期和预后观察到值”《临床实验免疫学》90 376-382
CD44和MHC类别I在T淋巴细胞上持续6个月的表达水平的平均增加，显然它也与临床好转有关。通过给予HEP1未检测到毒性。MHC类别I表达和CD44表达的增加与记忆T细胞和I型限制性细胞介导的免疫性的增加有关。Stephan Oehen和Karin Brduscha-Riem(1998)“效应器的原初CTL和记忆CTL的区别：效应器功能与表型和细胞分裂的相关性”《免疫学杂志》161 5338-5346
该试验的结果证实模拟Hep受体全部或部分的肽或其它带电分子可以引起最后导致免疫系统的同源状态改变的激活信号并长期正调节细胞介导免疫性和体液免疫性。本发明人也已证实，通过由Hep受体刺激引起的免疫反应可以治疗并治愈妇女中急性和慢性念珠菌感染(实施例4)。本发明人已证实，由Hep受体获得的肽可以在小鼠体外和体内激活单核细胞和巨噬细胞，从而引起保护性免疫反应(实施例5)。本发明的肽的活性比HEP1的高得多。Hep受体刺激还导致激活人外周血单核细胞，通过测定放射性含氚胸腺嘧啶核苷掺入生长细胞的DNA中证实了这一点。由Hep受体结构域A获得的新型肽Rupe312和Rupe414的活性比HEP1的高10倍(实施例6)。(Rupe312 SEQ ID 8：KKRRETVERE和Rupe414 SEQ ID 13：KRRETVEREKE)
本发明人也发现用由Hep受体获得的肽将人白细胞(WBC)培养24小时将引起MHC类别I的细胞表面表达降低，这可能是由于细胞激活和受体内在化以及表达MHC类别I的巨噬细胞总群体增加。这与HEP1治疗之后的6个月内HIV患者中看到的表达MHC类别I的群体细胞长期增加相一致。在该试验系统中，Rupe312和Rupe414的活性明显高于HEP1的活性(实施例7)。(Rupe312 SEQ ID 8：KKRRETVERE和Rupe414 SEQ ID 13：KRRETVEREKE)
本发明人已证实(实施例8)，Hep受体肽对IL-8的表达具有明显的抑制效果。IL-8的抑制可以在Hep受体肽激活单核细胞/巨噬细胞的选择活性中起作用。(Rupe312 SEQ ID 8：KKRRETVERE)
本发明人已证实(实施例9)，非常低剂量的Hep受体肽(1-100ng/小鼠)保护小鼠免受鼠伤寒沙门氏杆菌的急性感染。(Rupe15 SEQ ID 3：TEKKR和Rupe1024 SEQ ID 17：EREKEQMMREKEEL和HEP1 SEQID 28：TEKKRRETVEREKE)
本发明人已证实(实施例10)，非常低剂量的Hep受体肽(1-1000ng/小鼠)提高了小鼠致命疱疹病毒感染模型的存活时间。(HEP1 SEQ ID28：TEKKRRETVEREKE)
本发明描述了特异性地与Hep受体结合的带电分子。本发明人已设计了三组新型带电肽，其序列与Hep受体的互补结构域的氨基酸序列相同，并且或者与Hep受体结构域B(SEQ ID 3-SEQ ID 16)结合，或者与结构域A和B(SEQ ID 17)结合，或者与结构域A(SEQ ID 18-SEQ ID 27)结合。为本发明主题的肽可能与细胞表面暴露的Hep受体结合并稳定埃滋蛋白的伸展构象、诱导免疫-调节效应。优选的肽的长度为5-13个氨基酸，并且优选序列如下。
Hep受体结构域B结合肽：SEQ ID 3Rupe 15： TEKKRSEQ ID 4Rupe 19： TEKKRRETVSEQ ID 5Rupe 111：TEKKRRETVERSEQ ID 6Rupe 37： KKRRESEQ ID 7Rupe 310：    KKRRETVESEQ ID 8Rupe 312：    KKRRETVERESEQ ID 9Rupe 313：    KKRRETVEREKSEQ ID 10Rupe 314：    KKRRETVEREKESEQ ID 11Rupe 411：    KRRETVERSEQ ID 12Rupe 413：    KRRETVEREKSEQ ID 13Rupe 414：    KRRETVEREKESEQ ID 14Rupe 59：     RRETVSEQ ID 15Rupe 614：    RETVEREKESEQ ID 16Rupe 1014：   EREKEHep受体结构域A和结构域B结合肽：SEQ ID 17Rupe 1024：   EREKEQMMREKEELHep受体结构域A结合肽：SEQ ID 18Rupe 2024：   KEELMSEQ ID 19Rupe 2032：  KEELMLRLQDYEESEQ ID 20Rupe 2032p： KEELMLRLQDYpEESEQ ID 2lRupe 2132：     EELMLRLQDYEESEQ ID 22Rupe 2132p：    EELMLRLQDYpEESEQ ID 23Rupe 2232：     ELMLRLQDYEESEQ ID 24Rupe 2232p：    ELMLRLQDYpEESEQ ID 25Rupe 2428：     MLRLQSEQ ID 26Rupe 2832：     QDYEESEQ ID 27Rupe 2832p：    QDYpEE
与结构域A或结构域B结合或者桥接Hep受体的结构域A和结构域B的其它肽或其它带电分子可能具有生物活性。这些肽或其它带电分子可以经口服或者通过用于治疗各种传染病和癌症的其它途径施用。制备方法
本发明所用的肽可以使用例如用Boc或Fmoc化学方法的固相法或者肽合成领域中技术人员已知的肽合成的任何其它实际途径来合成。
可以Merrifield方法为基础进行用Boc-氨基酸的逐步固相合成(《美国化学学会杂志》85 2149-2154)。可以使用以下化合物：(新生物化学树脂：Boc-Glu(OBzl)-PAM，氨基酸：Boc-Lys(2Cl-Z-)OH，Boc-Glu(OBzl)OH，Boc-Arg(Tos)OH，Boc-Val-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，溶剂：DMF(Rathburn)，二氯甲烷(BDH)，乙酸乙酯(BDH)，试剂：HBTU(相分离有限公司)，对甲酚(Lanchester)TFA(Halocarbon ProductsCorporation)HF(BOC)DIEA(Fluka)。Boc-氨基酸的推荐的反应性侧链保护基团有：Arg(Tos)，Asn(Xan)，Asp(OcHxl)，Glu(OcHxl)Gln(Xan)或Gln，His(DNP)，Lys(CIZ)，Ser(Bzl)Tyr(BrZ)Trp(CHO)。这些缩写的含义如下：DCC＝二环己基碳二亚胺，DIC＝二异丙基碳二亚胺，DCM＝二氯甲烷，DMF＝二甲基甲酰胺，TFA＝三氟乙酸，Boc＝叔丁氧基羰基，HOBT＝羟基苯并三唑，DIEA＝二异丙基乙胺，DCU＝二环己基脲。
例如，本发明肽的Boc合成可以按如下进行：使用0.5mmol树脂和3倍量的激活Boc氨基酸进行0.5mmol等级的HBTU激活/就地中和。Boc氨基酸和激活试剂(HBTU)应以等摩尔量使用，即在这种情况下各2mmol与3倍过量相等。使用DIEA中和用于偶联的树脂并激活Boc-氨基酸。(因此使用2.5mmol、1当量Boc-aa和1当量树脂)。试剂：0.5M在DMF中的HBTU(MW＝379，0.5M＝18.95g于100ml中，注意它对光不稳定)要求2mmol＝4ml并且2.5mmol DIEA＝0.46ml(MW＝129，d＝0.742)。氨基酸的激活：Boc-氨基酸应仅在加入树脂之前即刻被激活，特别是在Arg(Tos)的情况下。就所有Boc氨基酸而言：称重2mmol Boc氨基酸并置于20ml玻璃样品瓶中。加入4ml 0.5M HBTU溶液并摇荡至固体溶解。加入0.46ml DIEA并混合(可以观察到颜色有一定的变化)。方法：用DMF洗涤树脂，用100％TFA除去Boc-保护基团-摇荡2次，各1分钟，其间进行排水，排水，用DMF流动洗涤1分钟，排水，加入激活的氨基酸溶液，摇荡10分钟，然后取样并进行茚三酮试验，以测定偶联效率。完成合成之后用DMF流动洗涤，然后用DCM流动洗涤，干燥。使用3倍过量的于DMF中的HBTU激活的Boc-氨基酸完成第一和接下来每一水平的肽构建的合成。在所有偶联中，如定量茚三酮试验显示，偶联效率应大于99％。在100％ TFA中进行N-端去保护。在去保护之前和之后应小心地将树脂肽流动洗涤。最后偶联并除去Boc-保护之后，用二氯甲烷将肽树脂洗涤并经空气干燥。通过高HF法(2g树脂肽，2g甲酚，20ml HF，在-5℃下1.5小时)从树脂载体上除去肽，得到用乙酸乙酯(100ml)沉淀并再溶于6M胍HCL-0.1M TRIS溶液(20ml)的粗制肽。
该肽可以按如下进行提纯：在Vydac C18 5 RAC柱上使用分析HPLC分离。将HPLC级乙腈(aldrich)和水通过一膜滤器过滤并在使用前用氦流脱气。用开始在20分钟内从0％乙腈恒定增加到60％乙腈，在该浓度下保持20分钟，并在10分钟内稳定降低到0％乙腈的溶剂梯度以1.2ml/min的恒定流速进行分析分离。在TSK-GEL制备C18柱上进行肽的制备性分离。用开始在60分钟内从0％乙腈恒定增加到18％乙腈，然后在60％乙腈下持续80分钟，在该浓度下保持30分钟的溶剂梯度以8ml/min的恒定流速进行分离。可以通过两个微处理器控制的Gilson 302单活塞泵来控制该梯度。可以用Waters 486可调吸光度检测器在214nm下检测化合物，并用HP 5L激光喷墨打印机记录分析色谱仪。用于制备色谱仪的HolochromeUV-VIS检测器220nm可以用LKB 2210单道记录器记录。可以使用WatersQuanta 4000设备用磷酸盐缓冲液(75μM)pH2.5在15kV下运行，抽样时间20秒，通过流体静力注射加样到60cm柱上，运行时间12分钟，进行毛细管电泳质量控制。1g 0.46mmol树脂合成的产量应约为250mg纯肽。
也可以使用其它溶液合成法生产大量的本发明肽。使用通过肽合成领域中技术人员已知的活性酯法的分步合成可以获得得到保护的三聚体片段。然后，在除去相关C和N端保护基团之后，用DCC/HOBT组装这些片段。除去所有保护基团之后，将该粗制肽在SP-Sephadex-C25离子交换色谱柱上经部分提纯，之后进行制备性HPLC，然后经冷冻干燥。使用方法
可以将0.01-1000mg冻干肽溶于1-10ml蒸馏水中并口服或经阴道施用。可以将0.01-1000mg与丸剂或胶囊或栓剂制造领域中技术人员常用的并口服或经阴道或肛门施用的载体配制成丸剂或胶囊或栓剂。可以将蒸馏水中0.001-100mg肽的过滤灭菌溶液经皮下或静脉内或肌内注射。
以下实施例仅用于说明本发明，无论如何不应构成对本发明的限制。
实施例1A
Hep受体肽在小鼠中提高对卵清蛋白的IgG血清抗体反应的辅助活性
在小鼠中注射50μg卵清蛋白与不同浓度的不同Hep受体肽2周后测定其中的IgG反应。IgG反应是在有卵清蛋白的情况下通过1-100稀释的小鼠血清的光密度(OD)测定的。
结果以OD记录的IgG反应
  肽代码   对照            IP注射(μg/小鼠)        肽序列
   0   0.01   0.1     1     10
   HEP1   0.69   0.45   0.44    0.56    0.57     TEKKRRETVEREKE
 Rupe312   0.69   0.68   0.88    0.55    0.44     KKRRETVERE
 Rupe1014   0.127   0.232   0.231    0.477    0.508     EREKE
 Rupe1024   0.152   0.250   0.262    0.489    0.445     EREKEQMMREKEEL
 Rupe2032   0.127   0.509   0.606    0.327    0.203     KEELMLRLQDYEE
然后将以OD记录的IgG反应以每个对照相应于100经过换算。
  肽代码  对照           IP注射(μg/小鼠)        肽序列
   0   0.01   0.1     1    10
 HEP1   100    65   64    81    83     TEKKRRETVEREKE
 Rupe312   100    99   128    80    64     KKRRETVERE
 Rupe1014   100    183   182    376    400     EREKE
 Rupe1024   100    164   172    322    293     EREKEQMMREKEEL
 Rupe2032   100    401   477    257    160     KEELMLRLQDYEE
结论
除了HEP1之外的所有hep受体肽都显示了辅助活性，但都具有不同的最佳浓度。
实施例1B
Hep受体肽在小鼠中提高胸腺中对羊红细胞(SRBC)的抗体依赖性细胞毒素反应的活性
测定Hep受体肽对在小鼠(CBA-C57Bl F1杂种，2月龄，体重18-22g)中激活抗羊红细胞(SRBC)的形成抗体的细胞的影响。首先向小鼠经腹膜内注射或者作为对照的0.5ml无菌生理盐水或者在相同体积生理盐水中的Hep受体肽，注射Hep受体肽30分钟之后，向每只小鼠经腹膜内施用含有5百万SRBC的细胞悬液。免疫4天之后，通过颈脱臼杀死小鼠，并无菌地获得脾。将每只脾在2ml培养基199中均化，然后将100μl该悬液放入1ml在培养基199中的制备琼脂糖(贮藏在48℃下的水浴中)，加入SRBC悬液，获得1％琼脂糖的最终浓度。将1ml琼脂糖-细胞混合物搅拌后转移到培替氏培养皿中静置。当琼脂糖变成固体时，将该培替氏培养皿在37℃下培养1小时，然后在琼脂糖凝胶上面加入0.5ml 1∶20稀释的培养基199中的豚鼠血清作为补体源。继续培养另外1小时。然后使用8x双目显微镜对培养皿进行目测并计数噬斑数(每个噬斑相当于一个分泌抗体的小鼠脾细胞)。结果以每百万有核脾细胞中抗体分泌细胞的数量和整个脾中抗体分泌细胞的数量来表示。由于没有观察到促有丝分裂作用(施用Hep受体肽导致正常大小的小鼠脾)，因此这两个计算的结果相似。
每百万有核脾细胞中抗体形成细胞的数量的平均数据(来自每个数据点的30只小鼠)。数据为将每个对照组对应于100换算的。
  肽代码   对照     IP注射(μg/小鼠)         肽序列
    0     1     10
 HEP1   100   192     203     TEKKRRETVEREKE
 Rupe312   100   317     267     KKRRETVERE
 Rupe15   100   255     134     TEKKR
 Rupe1014   100   202     325     EREKE
 Rupe1024   100   401     397     EREKEQMMREKEEL
 Rupe2032   100   236     232     KEELMLRLRLDYEE
(Rupe312 SEQ ID 8：KKRRETVERE和Rupe15 SEQ ID 3：TEKKR和Rupe1014 SEQ ID16：EREKE和Rupe1024 SEQ ID 17：EREKEQMMREKEEL和Rupe2032 SEQ ID19：KEELMLRLQDYEE和HEP1 SEQ ID 28：TEKKRRETVEREKE)
结论
所有Hep受体肽都提高了胸腺中的抗体依赖性细胞毒素反应，但都具有不同的最佳浓度。
实施例2
使用Rupe312和Rupe414作为例子的Hep受体肽对子宫SM-322的移植肉瘤的生长和CBA小鼠中进行的子宫颈CUS-5的癌的抗癌活性
材料和方法
移植的小鼠肉瘤SM-322模型(内皮肿瘤)
使用1，2-二甲基肼在雌性小鼠中诱导子宫的初生肿瘤。将几个初生肿瘤移植到同基因小鼠中。4天后在移植点开始出现第一个可见的小瘤。带有移植肿瘤的小鼠的估计寿命为22-24天。
移植小鼠子宫颈癌模型CUC-5(上皮肿瘤)
使用甲基胆蒽在雌性小鼠中诱导初生肿瘤。然后将几个初生肿瘤自移植到子宫颈中。带有移植肿瘤的小鼠的估计寿命为43天。
CBA小鼠
CBA雌性小鼠体重21.4＝/-1.2g，2-3月龄。以0.5ml肿瘤悬液(1g肿瘤/10ml Igla培养基)引入肿瘤，每个处理组使用10只小鼠。
肽制备和施用
在使用前即刻以三个浓度将冻干肽溶于无菌生理盐水中。实验期间将0.5ml溶液以每周2次注射到小鼠的腹膜内。使用3个不同浓度的肽使每只小鼠每次注射的三个最终剂量为10、1.0和0.1μg。
结果
以三个时间点记录相对于对照组的肿瘤体积平均降低的百分数。将处理组和对照组中小鼠的寿命进行比较并比较对照和处理组之间的肿瘤历史。
移植小鼠肉瘤模型SM-322
    肽    浓度 相对于对照的肿瘤体积降低的百分数  估计寿命(天)
 μg/小鼠   第8天   第12天   第15天     估计
 Rupe312     10     63     54     27     12-27
    1     67     32     38     12-19
    0.1     61     34     59     12-22
 Rupe414     10     65     43     43     13-20
    1     68     28     43     12-20
    0.1     68     39     22     12-19
第8天的体积 第12天的体积 第15天的体积
对照    1.49    11.2    17.7     12-16
移植小鼠子宫颈癌模型CUC-5
    肽    浓度 相对于对照的肿瘤体积降低的百分数  估计寿命(天)
 μg/小鼠    第5天   第12天   第19天      估计
Rupe312     10     50     25     49     48-76
    1     50     26     49     47-76
    0.1     50     18     45     42-76
 Rupe414     10     50     16     48     36-76
    1     50     16     43     36-76
    0.1     50     18     57     47-76
第5天的体积  第12天的体积  第19天的体积
对照    0.06    0.68    1.56     47-76
(Rupe312 SEQ ID 8：KKRREVERE和Rupe414 SEQ ID 13：KRRETVEREKE)
结论
Hep受体肽Rupe312和Rupe414降低了快速生长的移植肉瘤的生长速率，使得估计寿命略有增加(3-18％)。
Hep受体肽Rupe312和Rupe414降低了生长较慢的移植子宫颈癌的生长速率，但是未检测到估计寿命的明显增加(或者降低)。
Hep受体肽Rupe312和Rupe414在一致地使肿瘤体积更小的两个模型中都诱导肿瘤中心的非出血性溃疡破坏。
实施例3
HEP1，一种Hep受体肽，经21位HIV感染的患者口服使用(10mg/天，或者持续30天或者持续90天)，使得临床好转。该研究的成功通常证实了由Hep受体获得的肽的实用性和付诸实施
用药用级HEP1，一种与Hep受体的结构域A的一部分具有相同序列的肽，进行该研究。在莫斯科免疫学院在Ravshan Ataullakhanov教授的指导下为该研究招募HIV-感染的志愿者。在开始试验之前，该药用级HEP1通过了广泛的动物(大鼠和兔)毒性和临床前试验，证实该化合物安全。(毒性的初步评价-阴性，1000x治疗剂量的作用-阴性，局部刺激-阴性，对CNS和HVS的影响-阴性，亚急性毒性-阴性，诱变作用-阴性，慢性毒性-阴性，胚胎毒性-阴性)
研究方案
在早上早餐之前一天一次让患者口服10mg在2ml无菌蒸馏水中的HEP1溶液(制备该溶液并将其分成份儿，每份10mg贮存在-20℃下)。在治疗之前，让所有患者连续30天服用编码的安慰剂蒸馏水溶液。第一组11个患者服用HEP1持续90天，15个月之后，在分析了来自第一组患者的数据后让第二组10个患者服用HEP1持续30天。治疗期间，要求患者1周看1次门诊，接受体格检查并抽取分析用的血样。还要求患者与治疗后监控合作并且1个月看1次门诊持续6个月，进行体格检查并提供血样。治疗期间，21个患者都与监控进行了合作，并且21个患者中有14个同意治疗后监控。在HEP1治疗之前1个月或治疗期间患者没有接受任何其它抗逆转录病毒治疗。
患者
患者从莫斯科周围的不同诊所招募并提供同意参与该试验的书面承诺。他们通过阳性ELISA试验被鉴定为被HIV感染，具有降低的T细胞计数并且经历着HIV相关疾病的一些临床表现。接着显示患者具有17-801的CD4细胞/μl以及从不能检测出至230000的血清HIV RNA拷贝数/ml(Roche Labs Amplicor定量PCR试验)。
试验开始时的患者特征
 ID编码 性别 年龄 估计的注射时间 CD4细胞/μl  HIV RNA拷贝数/ml 机会感染 其它
P1 男 45  8  219  500 严重
P2 男 33  2  192  10000 严重
P3 女 45  6  481  2000 严重
P4 女 16  8  237  43000 严重
P5 男 27  2  123 ＜400 中度 病重
P6 女 23  1  357  10000 中度 带状疱疹
P7 男 23  8  139  94000 非常低 带状疱疹
P8 女 38  10  320  22000 非常低 卵巢囊肿
P9 男 43  3  17  10000 严重
P10 男 19  2  155  21000 严重 依赖鸦片剂
P11 男 35  3  188 ＜400 严重 活性TB
P12 男 32  8  175  13000 严重
P17 男 25  1  478  11000 严重
P21 女 37  10  98  11000 严重
P63 男 35  1  651  4000 严重
P67 女 31  7  124  230000 严重 病重
P68 女 51  2  597 ＜400 严重 病重
P69 男 34  1  192  8000 严重 活性TB
P72 男 33  1  534  25000 严重 活性TB
P73 男 30  1  801 ＜400 严重 活性TB
P76 女 38  7  72  9000 严重
常规观察
患者汇报对HEP1没有不良反应，并且17个患者汇报他们一般感觉较好，并且在HEP1治疗时体重增加1.5Kg-4.5Kg(一个患者在安慰剂期间也感觉较好)。
不良反应
未检测出不良反应。临床测定包括超声波检查和一系列生物化学、血液学、免疫学血检和尿检。
机会感染
通过微生物学分析检测机会感染，通过HEP1治疗的患者或者稳定，没有新的感染，或者感染降低。例如，在治疗之前38％的患者有严重的咽部的白色念珠菌感染，治疗之后仅有9％的患者严重感染。治疗之前，52％的患者具有严重的咽部的绿色链球菌感染，治疗之后仅有33％的患者严重感染。治疗之前，33％的患者患有咽部金黄色葡萄球菌感染，治疗之后仅有19％的患者感染。
CD4 T淋巴细胞
11个患者组用HEP1治疗3个月，到治疗结束时平均增加9％的T细胞数，并且在治疗之后接下来的6个月内平均增加32％。10个患者组用HEP1治疗1个月，到治疗结束时平均增加3％的T细胞数，并且在治疗之后接下来的6个月内平均增加20％。这种连续改善暗示，在患者中已诱导了一定的阳性免疫学变化。
通过TCID的HIV感染性试验
通过将来自患者的HIV感染的外周血单核细胞(PBMC)与未感染的供体PBMC以样品细胞与培养细胞之比为1/16的比例混合并在37℃下培养14天，测定病毒载荷。通过Innogenetics HIVp24试验测定培养病毒载荷并且结果以每ml的HIVp24抗原的微微克数记录。
3个月治疗
患者   P1    P2  P3   P4    P5   P6    P7   P8    P9  P10  P11
试验开始时的感染性(pg/ml p24max)  1039   315  na  386    515  203   1113  369   1074   na  480
开始时基数为100  100   100  0  100    100  100   100  100    100    0  100
第0阶段(平均)  130
第1阶段(平均)   7    32    0    28   0    47    0     39
第2阶段(平均)   21   218   198    129  251    70   217     40  835
第3阶段(平均)   0    61    0    85   0    48     24
1个月治疗
患者    P12   P17   P21   P63  P67  P68    P69  P72  P73    P76
试验开始时的感染性(pg/ml p24max)    465   0.3   3.1   2.9  6642   6.5   3.2   2   1   4.5
开始时基数为100    100   100   100   100   100   100   100  100  100   100
第0阶段(平均)    288  251
第1阶段(平均)    24   0     5     29   0   73
第2阶段(平均)   1815   209  6924   659   334   993   28919  115   236   141
第3阶段(平均)    5   39   54   51   51    15   57   102
在两组患者(P1-P11和P12-P76)中，在检测感染的病毒颗粒的TCID试验中观察到感染性的一般模式。在HEP1治疗开始时，(第0阶段-第1阶段)，感染性HIV病毒的载荷急剧降到治疗的头3个星期的低水平，并且21个患者中有9个降至零持续至少1周。在感染性在第2周降至零之前，在治疗的头1周有3个患者经历感染性增加。在接下来的第2期中，大多数患者中在治疗开始后的4-8周，HIV感染性上升2-600倍。在这期间患者反应其症状没有恶化。接下来的第3阶段中，感染性降至治疗前水平以下。
在第1阶段中，在治疗前基线以下的病毒平均降低的最大水平为-80％。在第2阶段中，病毒增加的平均最大值为22倍。在第3阶段中，在治疗前基线以下的病毒平均降低的最大水平为-64％。在第3阶段中，在3个患者中病毒感染性降低至零。用HEP1治疗结束6个月后，病毒感染性通常返回到治疗前水平。
本发明人将这些结果解释成显示免疫系统被HEP1激活以在第1阶段中对抗HIV。免疫系统中激活的水平增加刺激潜在地感染了HIV的细胞储存器的激活，导致第2阶段中感染性病毒增加。最后在第3阶段中，激活的免疫系统成功地破坏新激活的病毒储存器。用HEP1治疗仅1个月的10个患者组显示出，通过第2阶段和第3阶段的过程不依赖HEP1的存在。
通过定量血浆HIV RNA PCR的HIV病毒载荷
通过Roche labs PCR试验进行病毒载荷分析：Amplicor HIV-1监测器。
患者   P1   P2   P3   P4   P5   P6   P7   P8   P9  P10  P11
HIV血浆RNA(1000拷贝数/ml)  0.5  10   2   43 ＜0.4   10   94   22   10   21 ＜0.4
开始时基数为100  100  100  100  100    0   100   100   100   100   100   0
第0阶段(平均)   108   143   101
第1阶段(平均)  38   39   28   37   68   78   90   45
第2阶段(平均)  476  197  103   64   28   223   112   110  1535   92
第3阶段(平均)  85  66   77   0   64   92   52   39
患者   P12   P17  P21  P63   P67  P68  P69   P72     P73   P76
HIV血浆RNA(1000拷贝数/ml)   13  11  11   4   230 ＜0.4   8   25    ＜0.4    9
开始时基数为100  100  100  100  100   100   0  100   100     100   100
第0阶段(平均)
第1阶段(平均)   0    78   55
第2阶段(平均)  219  177  273  206    91  142    191   139
第3阶段(平均)  135  86  98    63  138    72   72
在1个月治疗和3个月治疗的大多数患者中，观察到相似的阶段：病毒抑制(第1阶段)，接着暂时病毒激活(第2阶段)，接着抑制(第3阶段)；它们与TCID数据相似。第1阶段延续1-4周，病毒载荷平均降低-47％。第2阶段延续8-40周(比用TCID试验看到的延续时间长)，并且在血浆中的病毒RNA平均增加3倍。在此后的第3阶段，血浆中的病毒RNA降至治疗前水平以下，平均降低-19％。
通过细胞计量术的细胞表面标记物的细胞群体和表达
使用显微镜、荧光标记抗体、流动细胞计量术和相关步骤详细分析在用HEP1治疗1个月的10个患者组(P12-P76)的外周血单核细胞上的细胞表面标记物。HEP1治疗对10个患者组求平均的各细胞群体具有以下作用：
a)淋巴细胞
治疗期间淋巴细胞的绝对数平均增加7％，治疗5个月后增加25％。
b)白细胞
治疗期间平均增加10％，治疗5个月后增加约20％。
d)天然杀伤细胞
治疗期间平均增加10％，治疗5个月后增加约30％。
e)B细胞
治疗期间平均增加5％，治疗5个月后增加约80％。
f)CD3表达细胞
治疗期间平均增加15％，治疗5个月后增加约30％。
g)CD8表达细胞
治疗期间平均增加15％，治疗5个月后增加约20％。
h)CD44-CD4表达细胞
治疗期间平均增加25％，治疗5个月后增加约60％。
h)CD44-CD8表达细胞
治疗期间平均增加12％，治疗5个月后增加约30％。
i)在CD4细胞上的HLA类别I表达水平
治疗期间平均增加10％，治疗5个月后增加约70％。
j)在CD8细胞上的HLA类别I表达水平
治疗期间平均增加10％，治疗5个月后增加约70％。
k)CD25-CD8表达细胞
低水平治疗期间平均增加5％，治疗5个月后增加约100％。CD25-CD4细胞未显示出明显变化。
l)CD38-CD4表达细胞
低水平治疗期间平均增加2％，治疗5个月后降低约15％。
m)CD38-CD8表达细胞
低水平治疗期间平均增加2％，治疗5个月后降低约25％。(下一节将讨论在CD38中的明显降低)
其它标记物如CD28、HLA-DR、CD45RO、CD45RA、CD57、CD62L，显示出在患者之间的一致模式没有明显变化。
CD38-CD8细胞：向AIDS发展的预后指示剂
已知表达CD38-CD8的细胞群体大小的增加与HIV感染的患者中的AIDS发展有关。M Levancher、F Hulstaert、S.Tallet、SUllery、JJPocidalo、BA Bach(1992)“CD8淋巴细胞上的激活标记物在人免疫缺陷综合征中的重要性：疾病分期和预后值”《临床实验免疫学》90 376-382
简言之，CD38-CD8细胞占总的CD8群体的百分比与HIV疾病进展有关，在许多最近的出版物中已证实了这一观察。在健康人群中，也表达CD38的CD8细胞的百分比为30-50％，在无症状HIV感染的患者中为55-65％，在患有ARC的HIV感染的患者中为65-80％，在AIDS患者中为80-98％。在对连续1个月口服10mg HEP1的10个患者的跟踪研究中，5个患者提供了分析用的血样。在所有这些患者中，很显然，CD38-CD8细胞群体占总的CD8群体的百分数朝显示HIV疾病危险性降低且改善健康的值的方向降低。
CD38-CD8细胞占总的CD8细胞的百分比 基线 治疗1个月 2个月 3个月 4个月 5个月 6个月
患者12  92  94  79  84  73  72
患者17  66  71  69  50  55  57
患者21  83  86  66
患者69  90  94  86  79  71
患者76  78  84  77  64  54  50
血浆中的抗-HIV抗体
在10个患者(P12-P76)用HEP1治疗1个月结束时，5个患者显示抗各种HIV抗原的明显较高的抗体滴度(滴度以治疗前100为基准)
抗gp120  抗gp41  抗-p31   抗p24   抗p17
 患者17    216    93    157    97    101
 患者21    127    110    71    103    110
 患者63    110    131    387    146    154
 患者69    160    274    813    507    116
 患者72    93    111    147    245    143
机会感染的抗体反应
HEP1治疗刺激对机会感染的抗体反应(抗体滴度以治疗前100为基准)
治疗期间的最大滴度  P12  P17  P21  P63  P67  P68  P69  P72  P73   P76
曲霉属IgG  122  97  132  116  89  114  119  190  142   111
念珠菌属IgG  127  100  126  170  447  51  293  214  120   129
CMV IgG  290  81  227  186  118  91  105  112  152   88
CMV IgM  120  141  142  215  159  92  102  148  120   142
HSV1 IgM  113  129  158  134  99  89  116  101  107   106
HSV2 IgM  107  129  109  108  156  158  146  111  300   186
弓形体属IgG  105  107  98  108  125  101  104  95  105   98
曲霉属IgG的抗体滴度的平均增加为+23％，念珠菌属IgG的为+78％，CMV IgG的为+50％，CMV IgM的为+38％，HSV1 IgM的为+15％，HSV2 IgM的为+51，弓形体属IgG的为+5％。
结论
上面数据同序列与一部分Hep受体相同的肽在HIV患者的人临床试验中导致免疫激活和临床益处的本发明一致。
实施例4妇女中严重急性和慢性念珠菌感染可以通过Hep受体刺激所致的免疫反
应治愈
临床研究：复发性中度念珠菌感染
刚突发念珠菌感染且未经治疗的妇女(27岁)自愿加入该研究。她汇报已预先经阴道内涂敷1％克霉唑治疗的复发性中度阴道念珠菌感染(在前面12个月发作6次)。她自己连续两天用一5ml注射器经阴道内施用5ml的1mg/ml HEP1溶液。3天之后念珠菌感染的所有临床症状都消失了并且她汇报在后面的12个月内还没有复发念珠菌感染。
临床研究：严重的持续性念珠菌感染
3个参加莫斯科Nearmedic和STD临床研究的女性患者自愿加入该研究，她们患有严重的阴道念珠菌感染，之前她们已用用于各种泌尿生殖器感染的抗生素治疗过。这些患者连续3天用5ml的2mg/ml HEP1溶液治疗(没有使用其它的抗真菌治疗)。比较治疗前和治疗3周后的微生物分析(尿道、子宫颈管和阴道棉拭培养)和临床分析，证实感染或者明显改善或者消除。
  患者   年龄  时间  临床分析  尿道棉拭  子宫颈管棉拭 阴道棉拭
   LLA    34  之前  严重感染   强生长     低生长   低生长
   KEM    28  之前  严重感染   强生长     强生长   强生长
   ALN    35  之前  严重感染   强生长     强生长   强生长
   LLA    34  之后  无症状    没有      没有    没有
   KEM    28  之后  轻微症状   低生长      很少    没有
   ALN    35  之后  无症状    没有      没有    没有
实施例5Rupe312、Rupe414、Rupe111和Rupe411在小鼠中诱导强的巨噬细胞激活
反应
在小鼠中研究由Hep受体结构域A获得的包括HEP1的许多肽。
诱导激活的巨噬细胞
将体重为22-24g的3只小鼠(CDAxC57B1)F1组经腹部注射1.0μg肽溶于0.5ml生理盐水的每种肽溶液。24小时之后使用颈椎骨脱臼法将动物杀死，并将5ml Hahks溶液注入腹部。将腹部按摩30秒钟，然后收集腹膜液。将收集的液体使用尼龙滤器过滤到含有1.5mg/ml EDTA的硅化管中。
然后使用Nihon血细胞计数器在显微镜检查下测定1μg滤液中含核细胞的数目。细胞在880g下离心5分钟沉淀，将该沉淀再悬浮于胎牛血清中，将该细胞悬液滴到显微镜载玻片上，并干燥，然后在甲醇中固定，用Romanovski氏着色剂染色。使用一Opton光学显微镜在1600放大倍数下进行腹膜渗出液中的细胞形态分析。测定淋巴细胞、静止巨噬细胞、激活的巨噬细胞、粒细胞和其它类型的细胞的数量。结果是：所有肽都使激活的巨噬细胞的数目增加，但是Rupe111、Rupe312、Rupe411和Rupe414明显比HEP1跃性强。
  1.0μg肽/小鼠  生理盐水    HEP1   Rupe111   Rupe312    Rupe411   Rupe414
 激活的巨噬细胞占细胞总数的百分比    1.9    2.2    4.3    13.9      5.5     8.5
HEP1       SEQ ID 28  TEKKRRETVEREKERupe111    SEQ ID 5： TEKKRRETVERRupe312    SEQ ID 8： KKRRETVERERupe411    SEQ ID 11：KRRETVERRupe414    SEQ ID 13：KRRETVEREKE
实施例6通过测定放射性含氚胸腺嘧啶核苷掺入生长细胞的DNA中证实Hep受体肽
         在体外激活人外周血单核细胞
使用分级分离标准方法以菲克梯度从健康供体的外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。将该PBMC悬浮于含RPMI1640培养基+10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺和抗生素(BM)的培养基中。将该细胞悬液置于96孔微孔平皿的孔中培养细胞(每个孔中有100μl悬液，含100,000个细胞)。然后将100μlBM加入含肽孔中(最终浓度为0.001-10μg/ml)。阴性对照孔含BM，但不含肽。将该平皿在37℃下培养3天，然后加入放射性3H胸腺嘧啶核苷，使其最终浓度为1微居里/ml。使用β计数器用标准步骤测定3H胸腺嘧啶核苷掺入细胞DNA。将该实验重复2次，结果用两个实验中的放射性计数/分钟的平均值来表示。结果显示，所有肽都激活单核细胞增殖，但是Rupe312和Rupe414明显比HEP1活性强，峰活性约3ng/ml。
肽μg/ml  对照  HEP1  Rupe19  Rupe312  Rupe414  Rupe411  Rupe111  Rupe614
  0.0001  370  410  426  563  493  385  483  464
  0.0003  370  500  602  742  580  510  483  503
  0.001  370  989  718  976  684  702  710  550
  0.003  370  700  756  3222  2087  598  665  752
  0.01  370  628  545  656  650  532  537  607
  0.03  370  517  586  539  596  500  642  538
  0.1  370  456  537  533  485  499  633  596
  0.3  370  399  563  611  492  486  668  635
  1  370  400  509  472  449  468  529  600
  3  370  412  502  455  437  420  486  499
  10  370  501  517  405  394  390  470  412
HEP1    SEQ ID 28  TEKKRRETVEREKERupe19  SEQ ID 4： TEKKRRETVRupe312 SEQ ID 8： KKRRETVERERupe414 SEQ ID 13：KRRETVEREKE
Rupe411 SEQ ID 11：KRRETVER
Rupe111 SEQ ID 5： TEKKRRETVER
Rupe614 SEQ ID 18：RETVEREKE
实施例7
Hep受体肽对MHC类别I在不同免疫细胞上的表达的作用
在37℃下用人白细胞(WBC)将Hep受体衍生的肽(0.003μg/ml)培养24小时，结果HLA在所有WBC细胞表面上的表达强度降低(由于细胞激活和受体内在化)。Rupe312比Rupe414活性强，而Rupe414比HEP1活性强。在没有肽的情况下以对照值为100得出的数据
                         HLA类别I的细胞表面表达的密度
  单核细胞/巨噬细胞 CD8淋巴细胞 CD4淋巴细胞  B和NK细胞  粒细胞
   对照     100     100     100     100    100
   HEP1     83     83     80     84    89
 Rupe414     83     76     77     77    85
 Rupe312     71     72     70     73    81
这种激活的细胞特异性作用是表达MHC类别I的单核细胞群体增加并且表达MHC类别I的CD8淋巴细胞群体减少。在没有肽的情况下以对照值为100得出的数据
                        表达HLA类别I的细胞集落的百分数
 单核细胞/巨噬细胞 CD8淋巴细胞 CD4淋巴细胞 B和NK细胞  粒细胞
   对照     100     100     100     100    100
   HEP1     108     91     105     102    100
 Rupe414     109     89     105     101    98
 Rupe312     119     85     104     105    98
(Rupe312 SEQ ID 8：KKRRETVERE和Rupe414 SEQ ID 13：KRRETVEREKE)
实施例8
Hep受体肽抑制IL-8在WBC中产生
在37℃下培养48小时后检测增加浓度的Rupe312(一种Hep受体肽)对IL-8被人WBC表达的抑制作用。IL-8为一种响应吸引并激活T细胞、嗜中性白细胞、嗜碱细胞、粒细胞，但不吸引并激活单核细胞/巨噬细胞的炎症刺激所产生的趋化因子。IL-8的抑制可以起到Rupe312在激活单核细胞和巨噬细胞的选择活性的作用。IL-8的测定提供了一种测定各种Hep受体衍生的肽的活性的试验。
   Rupe312浓度(μg/ml)   培养物中IL-8的浓度(pg/ml)
          0          18900
        0.001          13900
        0.003          10700
        0.01          8984
        0.03          7869
        0.1          6426
(由比利时的Innogenetics设计的IL-8 EIA试验)(Rupe312 SEQ ID 3：KKRRETVERE)
实施例9非常低剂量的Hep受体肽(1-100ng/小鼠)保护小鼠免受鼠伤寒沙门氏杆菌
                    的急性感染
将实验室小鼠(CBAxC57B1 Fl杂种)分成5个或者接受0.5ml生理盐水或者接受0.5ml生理盐水＋不同浓度的不同Hep受体肽(1、10或100ng)的组。24小时后小鼠用鼠伤寒沙门氏杆菌急性感染(每只小鼠经腹膜内注射10,000或100,000个细菌)。记录20天后每组小鼠的存活百分数(致死性感染的对照动物在感染3天内就死亡了)。
注射20天之后小鼠组存活的百分数
 肽代码  1000个细菌/小鼠   对照      Hep受体肽(ng/小鼠)       肽序列
   0    1    10    100
 HEP1     10   0％  20％   20％    40％     TEKKRRETVEREKE
    100   0％  0％   0％    0％
 Rupe15     10   0％  20％   40％    40％     TEKKR
    100   0％  20％   20％    0％
 Rupe124     10   0％  40％   40％    40％     EREKEQMMREKEEL
    100   0％  0％   20％    40％
(Rupe15 SEQ ID 3：TEKKR和Rupe1024 SEQ ID 17：EREKEQMMREKEEL和HEP1 SEQID 28：TEKKRRETVEREKE)
结论
Hep受体肽保护动物免受致死性细菌感染。
实施例10非常低剂量的Hep受体肽(1-1000ng/小鼠)提高小鼠致死性疱疹病毒感染
模型的存活时间
在以0.2ml培养基中3.5 LD50的滴度致死性注射疱疹病毒(VPG-1毒株L2)之前48小时和24小时，对实验室白色B/P小鼠(每组5只)腹膜内注射Hep受体肽(1-1000ng/小鼠)。
记录每组小鼠的平均存活时间(天)。
 肽代码   对照       Hep受体肽(ng/小鼠)       肽序列
   0   1    10   100   1000
 HEP1    10  18    19    27    28     TEKKRRETVEREKE
(HEP1 SEQ ID 28：TEKKRRETVEREKE)
结论
Hep受体肽明显提高遭受致死性病毒感染的存活时间。
优先权文件UK patent application GB9921881.0，Holms R.，17thSeptember 1999专利文件United States Patent 5,773,573Rupert Holms 30th June 1998其它出版物Ossi Turunen，Markku Sainio，Juha Jaaskelainen，Olli Carpen，Antti Vaheri(1998)“Structure-Function relationships in the ezrin family and the effect of tumor-associated pointmutations in neurofibromatosis 2 protein”Biochimica et Biophysica Acta 1387：1-16Anthony Bretscher，David Reczek and Mark Berryman(1997)“Ezrin：a protein requiring conformational activation to link microfilaments to the plasma membrane inthe assembly of cell surface structures”Journal of Cell Science 110：3011-3018Claudia Hecker，Christoph Weise，Jurgen Schneider-Schaulies，Harvey Holmes，Volker ter Meulen(1997)“Specific binding of HIV-1 envelope protein gp120 to the structural membrane proteins ezrinand moesin.”Virus Research 49：215-223M Levancher，F Hulstaert，S.Tallet S Ullery，J J Pocid1alo,B A Bach(1992)“The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome：staging and prognostic value”Clinical Experimental Immunology 90 376-382Stephan Oehen and Karin Brduscha-Riem(1998)“Differentiation of Naive CTL to Effector and Memory CTL：Correlation of Effector Function withPhenotype and Cell Division”The Journal of Immunology 161 5338-5346序列表一般信息序列数：28SEQ ID 1的信息序列特征：长度：32氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 1Hep受体的结构域AAREEKHQKQLERQQLETEKKRRETVEREKEQM1   5    10   15   20   25   30SEQ ID 2的信息序列特征：长度：34氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 2Hep受体的结构域BMREKEELMLRLQDY(p)EEKTKKAERELSEQIQRALQ1   5    10      15   20   25   30SEQ ID 3的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 3Rupe15：TEKKR
    1   5SEQ ID 4的信息序列特征：长度：9氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 4Rupe19：TEKKRRETV
    1   5SEQ ID 5的信息序列特征：长度：11氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 5Rupe111：TEKKRREVER
     1   5   10SEQ ID 6的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 6Rupe37：    KKRRE
        1   5SEQ ID 7的信息序列特征：长度：8氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 7Rupe310：    KKRRETVE
         1   5SEQ ID 8的信息序列特征：长度：10氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 8Rupe31 2：    KKRRETVERE
          1   5    10SEQ ID 9的信息序列特征：长度：11氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 9Rupe313：    KKRRETVEREK
         1   5    10SEQ ID 10的信息序列特征：长度：12氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 10Rupe314：    KKRRETVEREKE
         1   5    10SEQ ID 11的信息序列特征：长度：8氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 11Rupe411：    KRRETVER
         1   5SEQ ID 12的信息序列特征：长度：10氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 12Rupe413：    KRRETVEREK
         1   5   10SEQ ID 13的信息序列特征：长度：11氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 13Rupe414：    KRRETVEREKE
         1   5    10SEQ ID 14的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 14Rupe59：    RRETV
        1   5SEQ ID 15的信息序列特征：长度：9氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 15Rupe614：    RETVEREKE
         1   5SEQ ID 16的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 16Rupe1014：    EREKE
          1   5SEQ ID 17的信息序列特征：长度：14氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 17Rupe1024    EREKEQMMREKEEL
        1   5    10SEQ ID 18的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 18Rupe2024：    KEELM
          1   5SEQ ID 19的信息序列特征：长度：13氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 19Rupe2032：    KEELMLRLQDYEE
          1   5    10SEQ ID 20的信息序列特征：长度：13氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 20Rupe2032p：    KEELMLRLQDYpEE
           1   5    10SEQ ID 21的信息序列特征：长度：12氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 21Rupe2132：     EELMLRLQDYEE
           1   5    10SEQ ID 22的信息序列特征：长度：12氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 22Rupe2132p：     EELMLRLQDYpEE
            1   5    10SEQ ID 23的信息序列特征：长度：11氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 23Rupe2232：    ELMLRLQDYEE
          1   5    10SEQ ID 24的信息序列特征：长度：11氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 24Rupe2232p：    ELMLRLQDYpEE
           1   5     10SEQ ID 25的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 25Rupe2428：    MLRLQ
          1   5SEQ ID 26的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 26Rupe2832：    QDYEE
          1   5SEQ ID 27的信息序列特征：长度：5氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 27Rupe2832p：    QDYpEESEQ ID 28的信息序列特征：长度：14氨基酸类型：氨基酸链数：单链拓扑学：线性分子类型：肽序列说明SEQ ID 28HEP1：TEKKRRETVEREKE
  1   5    10

Claims (30)

1.一种与Hep受体结合的带电分子。
2.一种序列与一部分Hep受体相同的肽。
3.如权利要求2的肽，长度为5-13个氨基酸，其序列与一部分Hep受体相同。
4.一种含有氨基酸序列AREEKHQKQLERQQLETEKKRRETVEREKEQM的肽。
5.一种含有氨基酸序列MREKEELMLRLQDY(p)EEKTKKAERELSEQIQRALQ的肽。
6.一种含有氨基酸序列TEKKR的肽。
7.一种含有氨基酸序列TEKKRRETV的肽。
8.一种含有氨基酸序列TEKKRRETVER的肽。
9.一种含有氨基酸序列KKRRE的肽。
10.一种含有氨基酸序列KKRRETVE的肽。
11.一种含有氨基酸序列KKRRETVERE的肽。
12.一种含有氨基酸序列KKRRETVEREK的肽。
13.一种含有氨基酸序列KKRRETVEREKE的肽。
14.一种含有氨基酸序列KRRETVER的肽。
15.一种含有氨基酸序列KRRETVEREK的肽。
16.一种含有氨基酸序列KRRETVEREKE的肽。
17.一种含有氨基酸序列RRETV的肽。
18.一种含有氨基酸序列RETVEREKE的肽。
19.一种含有氨基酸序列EREKE的肽。
20.一种含有氨基酸序列EREKEQMMREKEEL的肽。
21.一种含有氨基酸序列KEELM的肽。
22.一种含有氨基酸序列KEELMLRLQDYEE的肽。
23.一种含有氨基酸序列KEELMLRLQDYpEE的肽。
24.一种含有氨基酸序列EELMLRLQDYEE的肽。
25.一种含有氨基酸序列EELMLRLQDYpEE的肽。
26.一种含有氨基酸序列ELMLRLQDYEE的肽。
27.一种含有氨基酸序列ELMLRLQDYpEE的肽。
28.一种含有氨基酸序列MLRLQ的肽。
29.一种含有氨基酸序列QDYEE的肽。
30.一种含有氨基酸序列QDYpEE的肽。
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