KR20010101017A

KR20010101017A - 에즈린의 조절/펼침 펩티드들

Info

Publication number: KR20010101017A
Application number: KR1020017006187A
Authority: KR
Inventors: 루퍼트 도날드 홈스
Original assignee: 홈스, 루퍼트, 도날드
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2001-11-14
Also published as: DE60033783D1; EP1131348B1; DK1131348T3; PT1131348E; AU7433300A; NZ511747A; GB9921881D0; ES2283317T3; ATE356144T1; WO2001025275A9; CN1327450A; NO20012417L; BR0007158A; EP1131348A1; PL348635A1; WO2001025275A1; DE60033783T2; CA2348780A1; HUP0104254A3; GB2354241A

Abstract

본 발명은 본 발명자가 인간 에즈린에서 발견한 조절 부위인, 헤프리셉터에 특이적으로 결합하는 신규한 하전된 분자들을 기술한다. 본 발명은 펩티드들 및 다른 하전된 분자들이 헤프리셉터에 결합할 때, 의약적으로 유용한 면역 반응들이 유도된다는 것이다. 이 하전된 분자들은 다양한 감염성 잘환들 및 암의 치료를 위하여 경구적으로 그리고 다른 경로들로 투여될 수 있다. 본 발명자는 에즈린의 용해성 형태에서 헤프리셉터 (인간 에즈린 아미노산 308-373)는 1차 아미노산 서열의 보충적 측쇄 전하들에 의해 안정화되고 그리고 힌지 영역 (M339-M340)에서 서로 접혀지는 두개의 인접한 알파 나선 도메인들로 이루어진다는 것을 알아내었다. 본 발명자는 에즈린의 펼쳐진 막 관련 형태에서, 헤프리셉터는 세포 막을 통하여 밀쳐지고 그리고 세포의 외부 표면상에 노출된다는 것을 알아냈다. 헤프리셉터-도메인 A (인간 에즈린의 아미노산 번호 308-339)는 다음의 32 아미노산 서열로 이루어진다: SEQ ID 1 AREEKHQKQLERQQLETEKKRRETVEREKEQM. 헤프리셉터-도메인 B (인간 에즈린의 아미노산 번호 340-373)는 다음의 34 아미노산 서열로 이루어져있다 (티로신 353 [Y]은 에즈린의 막 관련 형태에서 포스포티로신 [Y_P]로 인산화 될 것이다): SEQ ID 2 MREKEELMLRLQDY_(p)EEKTKKAERELSEQIQRALQ.

Description

에즈린의 조절/펼침 펩티드들{Regulatory/Unfolding Peptides of Ezrin}

항생제들에 내성인 병원성 세균의 신규한 균주들의 성장 문제, 만성 바이러스 및 진균 감염에 대해 효과적인 화합물의 제한된 범위 및 효과적인 항-암 치료의 부족은 이들 의학적 문제들에 대한 숙주 방어를 증진시킬 수 있는 화합물들의 필요성을 증명한다. 본 발명은 본 발명자가 발견한 인간 에즈린(ezrin)에 신규한 활성 부위인 헤프리셉터(Hepreceptor)에 결합함에 의해 면역 반응을 자극하는 신규한 하전된(charged) 분자들에 관한 것이다. 바람직한 하전된 분자들은 인간 에즈린의 헤프리셉터와 동일한 서열들을 갖는 신규한 펩티드들이다.

에즈린은 광범위한 세포 타입들에서 구조적 및 조절적 역활들을 하는 ERM (ezrin-radixin-moesin) 패밀리의 단백질들중 하나의 구성원이다. 에즈린이 세포 표면 토포그래피 (topography)를 제어하는 피질 세포골격의 구조를 조절한다는 것을 가르키는 유력한 증거가 있다. 에즈린은 두가지의 주요 형태를 채용하고 있다: 1) 세포질에서 발견되는 수용성의 접힌 형태 및, 2) 미소섬모 및 다른 활성화 관련 구조들에 특히 연관된 세포 막의 세포질 표면에 부착되어 발견되는 접힌 및 연장된(elongated) 형태. 단백질의 N 말단 도메인은 막의 세포질 표면에 부착되어 있는 반면에, C 말단부는 액틴 세포골격에 결합한다. 에즈린은 T 세포들에서 티로신 키나제 기질이고 그리고 또한 EGF 리셉터의 상피세포 성장인자 (EGF) 자극의 결과로서 티로신 인산화된다. 그것의 확장된 형태에서 에즈린의 N-말단 도메인은 PIP₂의 존재하에서 CD44의 세포질 꼬리에 또한 결합할 수 있다. 에즈린은 또한 ICAM-2의 세포질 꼬리에 결합할 수 있다. 에즈린은 칼페인(calpain)과 같은 조절 프로테아제에 매우 민감하고 그리고 세포 활성화 동안 신속히 대사회전 (turn over)된다.

Anthony Bretscher, David Reczek and Mark Berryman (1997)

"에즈린: 세포 표면 구조들의 조립에서 원형질막에 미세섬유를 연결하기 위해 요구되는 형태 활성화에 요구되는 단백질"Journal of Cell Science110: 3011-3018

에즈린의 이차 구조의 상세한 분석은 세개의 주 구조적 도메인이 있음을 보여준다: 아미노산 1 내지 300의 N 말단 도메인, 아미노산 300 내지 470의 매우 하전된 알파 도메인 및 아미노산 470 내지 585의 C 말단 도메인. 구조적 모델링은 알파 도메인이 비록 힌지 (hinge)의 위치가 확인되지 않았을지라도 에즈린의 용해성 구형의 두개의 역평행 나선들로 접혀진다는 것을 제시한다. 확장된 인산화된 형태의 모델에서, 에즈린은 N 말단 도메인에 의해 세포 막의 내부 표면으로 부착되고, 두개의 에즈린 분자들의 알파 도메인들은 역평행 이량체로 쌍을 이루고 그리고 세포 표면 막 아래에 위치된다. 이 확장된 형태에서, 에즈린은 티로신 353에 인산화된 티로신이다 (Yp353).

Ossi Turunen, Markku Sainio, Juha Jaaskelainen, Olli Carpen, Antti Vaheri (1998) "Structure-Function relationships in the ezrin family and the effect of tumor-associated point mutations in neurofibromatosis 2 protein"Biochimica et Biophysica Acta1387: 1-16

본 발명자는 미국특허 제5,773,573호에 gp120의 C 말단과 70% 동일성을 갖는 14 아미노산 펩티드 HEP1 (인간 에즈린의 아미노산 324-337과 동일한 TEKKRRETEREKE, SEQ ID 28의 아미노산)은 인간에서 생체내에서 HIV 복제를 저해할 수 있음을 개시했다. 그 때, 본 발명자는 관찰된 펩티드 HEP1의 항-HIV 효과는 gp120의 C 말단의 상보적 HIV 서열에 의해 유도된 자동-반응성 면역 반응에 대한 면역학적 내성을 유도하는 경구적으로 투여된 HEP1에 기인했다고 믿었다.

본 발명자는 HEP1의 항-HIV 활성은 HEP1이 헤프리셉터의 도메인 B에서 그것의 상보적인 서열에 결합하는 신규한 면역학적 경로의 활성화에 기인한다는 것을 이제 밝혀냈다 (HEP1은 헤프리셉터의 도메인 A의 부분과 일치한다).

본 발명의 분야는 면역 반응과 싸우는(fighting) 질환의 유도에 의한 감염성 질환 및 암의 치료에 관한 것이다.

도 1은

a) 용해성 에즈린에서 헤프리셉터의 접힌 역평행 관련된 나선들,

b) 펩티드 리간드의 한 실시예를 갖는 막 관련된 에즈린에서 헤프리셉터의 펼쳐진 나선,

c) 두 세포들 간의 상호작용 동안에 역평행 관련된 나선의 이량체를 형성하는 두개의 펼쳐진 헤프리셉터들의 일차 아미노산 서열들의 배열의 다이어그램이다.

도 2는 에즈린 상의 헤프리셉터, 그것의 리간드들, 세포 막들, 세포 표면 수용체들 및 세포골격 성분들 간의 관계의 예시이다.

서열의 간단한 설명

SEQ ID 1은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 2은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 3은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 4는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 5는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 6은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 7은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 8은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 9는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 10은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 11은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 12는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 13은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 14는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 15는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 16은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 17은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 18은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 19는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 20은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 21은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 22는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 23은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 24는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 25는 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 26은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 27은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

SEQ ID 28은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열이다.

발명의 요약

본 발명은 인간 에즈린 (헤프리셉터)에 신규한 조절 부위 및 면역 반응을 유도하는 이 부위에 결합하는 하전된 분자들을 기술한다. 본 발명자는 에즈린의 용해성 형태에서 헤프리셉터 (인간 에즈린의 걸쳐있는 아미노산 308-373)는 1차 아미노산 서열의 보충적인(complimentary) 측쇄 전하들에 의해 안정화된 두개의 역평행나선들로 힌지 영역 (M339-M340)에서 서로 접혀지는 두개의 인접한 알파 나선 도메인들로 이루어진다는 것을 알아내었다 (표 1 및 도 1 참조). 본 발명자는 에즈린의 펼쳐진 막 관련 형태에서, 헤프리셉터는 세포 막을 통하여 밀쳐지고 그리고 세포의 외부 표면상에 노출된다는 것을 알아냈다 (도 2 참조). 이 예측되지 않았던 발견은 외부 세포 표면 상의 에즈린의 알파 도메인의 어떤 부분도 나타내지 않은, 지금까지의 과학적 문헌에서의 막 조직화의 모델과는 현저히 다른 것이다. 본 발명은 헤프리셉터의 부분들과 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드들은 의학적으로 유용한 면역학적 반응들을 도출하는 헤프리셉터의 상보적인 부분들에 결합하는 것에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 부위에 결합하는 어떤 하전된 분자도 의약적으로 유용한 면역학적 반응들을 유도할 것이라는 것에 관한 것이다. 이 하전된 분자들은 다양한 감염성 잘환들 및 암의 치료를 위하여 경구적으로 그리고 다른 경로들로 투여될 수 있다.

아미노산, 세자 코드, 한자 코드 및 측쇄 전하

세포질에서 발견된 에즈린의 용해성 형태는 힌지 영역(M339-M340)에서 일차아미노산 서열의 보충적 측쇄 전하들에 의해 안정된 두개의 역평행 나선들로 서로 접혀진 두개의 인접한 알파 나선 도메인들로 이루어진다. 본 발명의 대상은 헤프리셉터 도메인 A의 아미노산 서열의 양성으로 및 음성으로 하전된 측쇄들은 헤프리셉터 도메인 B의 아미노산 서열의 양성으로 및 음성으로 하전된 측쇄들에 상보적이라는 것이다. 에즈린의 활성화된 개방 형태에서, 두개의 상이한 에즈린 분자들의 헤프리셉터들의 도메인 A 및 도메인 B의 상호작용은 역평행 이량체들의 형성을 하게 한다. 세포 표면 아래에 형성하는 에즈린의 역평행 이량체들에 더하여, 본 발명자는 이들 이량체들이 하나의 세포 표면상에 노출된 헤프리셉터와 또 다른 세포 표면상에 노출된 헤프리셉터 사이에 형성할 수 있음을 결정하였다. 두개의 헤프리셉터들이 두개의 세포 표면의 근접 연관동안 접촉할때, 활성화 신호는 두 세포들 모두에서 개시된다 (도 2). 헤프리셉터들의 도메인 A 및 도메인 B의 측쇄 전하들 간의 상호작용을 부분적으로 의태(mimic)하는 모든 하전된 분자는 의약적으로 유용한 생물학적 반응을 생기게 할 것이다.

헤프리셉터-도메인 A (인간 에즈린의 아미노산 번호 308-339)는 하기의 32 아미노산 서열로 이루어져 있다 (이 서열은 폴리펩티드의 N 말단에서 C 말단으로 쓰여진 각각의 아미노산에 대해 단일 문자 코드를 사용하여 나열되어 있다).

SEQ ID 1

A R E E K H Q K Q L E R Q Q L E T E K K R R E T V E R E K E Q M

미국특허 제5,773,573호에서, 본 발명자는 발견한 펩티드 HEP1 (SEQ ID 28)의 항-HIV 활성은 헤프리셉터-도메인 A의 부분 (인간 에즈린 서열의걸쳐있는(spanning) 아미노산 324-337)과 동일한 서열을 갖는다는 것을 이제야 밝혀냈다. 상기 특허에서, 본 발명자는 항-HIV 활성은 HIV gp120의 C 말단에 의해 유도된 자동반응성 면역 반응에 대한 면역학적 내성의 유도에 기인한다는 추측했었다. 본 발명자는 이제 HEP1의 항-HIV 활성은 헤프리셉터 도메인 B에 그것의 결합 및 신규한 면역 반응의 유도에 기인한다는 것을 밝혀낼 수 있다. 본 발명의 대상은 에즈린의 헤프리셉터로부터 유래된, 현저히 우수한 HEP1에 대한 활성을 갖는 신규한 펩티드들이 있다는 것이다.

헤프리셉터-도메인 B (인간 에즈린의 아미노산 번호 340-373)은 하기의 34 아미노산 서열로 이루어져 있다 (티로신 353[Y]는 에즈린의 막 연관된 형태에서 포스포티로신 [Yp]으로 인산화될 수 있다):

SEQ ID 2

M R E K E E L M L R L Q D Y_(P)E E K T K K A E R E L S E Q I Q R A L Q

본 발명자는 헤프리셉터의 도메인 B는 HIV gp120이 뇌 감염시에 결합하는 에즈린 상의 부위이다 (HIV gp120은 헤프리셉터 도메인 A의 부분과 70% 동일성을 갖는 그것의 하전된 C 말단 아미노산들을 사용하여 헤프리셉터 도메인 B에 결합한다). 헤프리셉터에 결합하는 신규한 하전된 분자들은 HIV 관련된 치매의 치료에 유용할 것이다.

Claudia Hecker, Christoph Weise, Jurgen Schneider-Schaulies, Harvey Holmes, Volker ter Meulen (1997) "Specific binding of HIV-1 envelope proteingp120 to the structural membrane proteins ezrin and moesin." Virus Research 49 215-223

본 발명자는 헤프리셉터 펩티드들이 분명한 아주반트 (adjuvant) 활성을 갖음을 증명했고 (실시예 1A) 그리고 이것은 HEP1, Rupe312, Rupe1014, Rupe1024 및 Rupe2032를 이용하여 마우스들에서 난알부민에 대한 IgG 항체 반응을 증진함에 의해 증명된다. 본 발명자는 또한 (실시예 1B) HEP1, Rupe312, Rupe15, Rupe1014, Rupe1024 및 Rupe2032를 사용하여 마우스들에서 양의 적혈구 세포들 (SRBC)에 대한 흉선에서 항체-의존 세포독성 반응을 증진하는 데 헤프리셉터 펩티드들의 활성을 증명하였다. (Rupe312 SEQ ID 8: KKRRETVERE 및 Rupe15 SEQ ID 3: TEKKR 및 Rupe 1014 SEQ ID 16: EREKE 및 Rupe1024 SEQ ID 17: EREKEQMMREKEEL 및 Rupe2032 SEQ ID 19: KEELMLRLQDYEE 및 HEP1 SEQ ID 28: TEKKRRETVEREKE)

본 발명자는 (실시예 2) 헤프리셉터 펩티드들이 분명한 항-종양 활성을 갖는다는 것을 증명하였고 그리고 이것은 Rupe312 및 Rupe414를 이용하여 마우스들에서 급속하게 성장하는 이식된 육종 및 서서히 성장하는 이식된 자궁경부 암의 성장 속도를 줄이는 헤프리셉터 펩티드들에 의해 증명된다. (Rupe312 SEQ ID 8: KKRRETVERE 및 Rupe414 SEQ ID 13: KRRETVEREKE)

본 발명자는 (실시예 3) 21 HIV 감염된 환자들에서 HEP1 치료법 (30일 또는 90일 동안 하루당 10mg 경구투여)은 CD4 T 림프구 집단 (population)의 증가 및 기회 감염의 하락, HIV 감염성의 하락 및 T 림프구들의 CD38,CD8 집단의 하락 (AIDS의 진전의 성립된 예후 마커)로 측정될 때, 치료후 6개월에 걸쳐 임상적 향상을 가져오는 면역 반응들을 유도함을 증명하였다.

M Levancher, F Hulstaert, S. Tallet, S Ullery, J J Pocidalo, B A Bach (1992) "The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value"Clinical Experimental Immunology90 376-382

임상적 향상과 또한 서로 관련하는 것으로 보이는, 6개월에 걸친 T 림프구들에서 CD44 및 MHC 클래스 I의 발현 수준에서 평균 증가가 관찰되었다. HEP1의 투여로는 어떠한 독성도 검출되지 않았다. MHC 클래스 I 발현 및 CD44 발현의 증가는 기억 T 세포들 및 클래스 I 제한된 세포 중재 면역의 증가와 관련된다.

Stephan Oehen and Karin Brduscha-Riem (1998)

"Differentiation of Naive CTL to Effector and Memory CTL: Correlation of Effector Function with Phenotype and cell Division"The Journal of Immunology161 5338-5346

이 시도의 결과는 헵프리셉터 모두 또는 일부를 의태하는 펩티드 또는 다른 하전된 분자가 궁극적으로 면역계의 항상성 및 세포 중재된 그리고 체액성 면역의 장기 상향 조절(up regulation)에서 변화를 이끌어 내는 활성화 신호를 생기게 할 수 있음을 증명한다. 본 발명자는 또한 여성의 급성 및 만성 캔디다 감염은 헤프리셉터 자극으로부터 생기는 면역 반응에 의해 처리되고 그리고 치료될 수 있음을 증명하였다 (실시예 4). 본 발명자는 헤프리셉터 유래의 펩티드들은, 보호 면역 반응을 이끌어 내는, 생체외 및 생체내 둘 다의 마우스에서 단핵구 및 대식세포를활성화할 수 있음을 증명하였다 (실시예 5). 본 발명의 펩티드들은 HEP1 보다 상당히 더 높은 활성을 갖는다. 헤프리셉터 자극은 또한 성장 세포들의 DNA로 방사성 삼중수소화된 티미딘의 혼입을 측정함에 의해 증명된 인간 말초혈 단핵 세포의 활성화를 이끌어 낸다. 신규한 펩티드들, 헤프리셉터 도메인 A로부터 유래된 Rupe312 및 Rupe414는 HEP1 보다 10배 더 높은 활성을 갖는다 (실시예 6). (Rupe312 SEQ ID 8: KKRRETVERE 및 Rupe414 SEQ ID 13: KRRETVEREKE)

본 발명자는 또한 헤프리셉터로부터 유래되는 펩티드들을 갖는 인간 백혈구 (WBC)의 24 시간 접종은 아마도 세포 활성화 및 리셉터 내부화(internalisation)에 기인하는 MHC 클래스 I 세포 표면 발현에서의 하락, 및 MHC 클래스 I을 발현하는 대식세포의 총 집단에서의 증가를 초래함을 밝혀냈다. 이것은 HEP1 치료법에 이어서 6개월 동안 HIV 환자들에서 보여진 MHC 클래스 I을 발현하는 집단 세포들에서의 장기간 증가와 일치한다. 이 분석 시스템에서 Rupe312 및 Rupe414는 HEP1 보다 현저히 더 높은 활성을 가졌다 (실시예 7). (Rupe312 SEQ ID 8: KKRRETVERE 및 Rupe414 SEQ ID 13: KRRETVEREKE)

본 발명자는 (실시예 8) 헤프리셉터 펩티드들은 IL-8의 발현에 현저한 억제 효과를 갖는다는 것을 증명했다. IL-8의 억제는 단핵구/대식세포의 활성화에 헤프리셉터 펩티드들의 선택적인 활성의 역활을 할 것이다. (Rupe312 SEQ ID 8: KKRRETVERE)

본 발명자는 (실시예 9) 매우 적은 용량의 헤프리셉터 펩티드 (1-100 나노그람/마우스)가Salmonella tryphimurium에 의한 급성 감염으로부터 마우스들을 보호함을 증명하였다. (Rupe15 SEQ ID 3: TEKKR 및 Rupe 1024 SEQ ID 17: EREKEQMMREKEEL 및 HEP1 SEQ ID 28: TEKKRRETVEREKE)

본 발명자는 (실시예 10) 매우 적은 용량의 헤프리셉터 펩티드 (1-1000 나노그람/마우스)가 마우스 치사 헤르페스 바이러스 감염 모델에서 생존 시간을 증진시킨다는 것을 증명했다. (HEP1 SEQ ID 28: TEKKRRETVEREKE)

본 발명은 헤프리셉터에 특이적으로 결합하는 하전된 분자를 기재한다. 본 발명자는 헤프리셉터의 상보적 도메인들의 아미노산 서열과 동일한 서열을 갖고 그리고 헤프리셉터 도메인 B (SEQ ID 3 - SEQ ID 16)에 결합하거나, 또는 도메인 A 및 B 둘다 (SEQ ID 17)에 결합하거나, 또는 도메인 A (SEQ ID 18 - SEQ ID 27)에 결합하는 세 그룹의 신규한 하전된 펩티드들을 설계하였다. 본 발명의 대상인 펩티드들은 아마도 세포 표면에 노출된 헤프리셉터들에 결합할 것이고 그리고 에즈린의 펼쳐진 형태를 안정화하고 그리고 면역-조절 효과들을 유도할 것이다. 바람직한 펩티드들은 길이가 5 내지 13 아미노산이고 그리고 바람직한 서열들은 다음과 같다.

헤프리셉터 도메인 B 결합 펩티드들:

SEQ ID 3

Rupe15: TEKKR

SEQ ID 4

Rupe19: TEKKRRETV

SEQ ID 5

Rupe111: TEKKRRETVER

SEQ ID 6

Rupe37: KKRRE

SEQ ID 7

Rupe310: KKRRETVE

SEQ ID 8

Rupe312: KKRRETVERE

SEQ ID 9

Rupe313: KKRRETVEREK

SEQ ID 10

Rupe314: KKRRETVEREKE

SEQ ID 11

Rupe411: KRRETVER

SEQ ID 12

Rupe413: KRRETVEREK

SEQ ID 13

Rupe414: KRRETVEREKE

SEQ ID 14

Rupe59: RRETV

SEQ ID 15

Rupe614: RETVEREKE

SEQ ID 16

Rupe1014: EREKE

헤프리셉터 도메인 A 및 도메인 B 결합 펩티드:

SEQ ID 17

Rupe1024: EREKEQMMREKEEL

헤프리셉터 도메인 A 결합 펩티드:

SEQ ID 18

Rupe2024: KEELM

SEQ ID 19

Rupe2032: KEELMLRLQDYEE

SEQ ID 20

Rupe2032p: KEELMLRLQDYpEE

SEQ ID 21

Rupe2132: EELMLRLQDYEE

SEQ ID 22

Rupe2132p: EELMLRLQDYpEE

SEQ ID 23

Rupe2232: ELMLRLQDYEE

SEQ ID 24

Rupe2232p: ELMLRLQDYpEE

SEQ ID 25

Rupe2428: MLRLQ

SEQ ID 26

Rupe2832: QDYEE

SEQ ID 27

Rupe2832p: QDYpEE

도메인 A 또는 도메인 B에 결합하거나 또는 헤프리셉터의 도메인 A와 도메인 B를 가교하는 다른 펩티드들 또는 다른 하전된 분자들은 생물학적으로 활성일 것 같다. 이 펩티드들 또는 다른 하전된 분자들은 경구적으로 그리고 다양한 감염성 질환들 및 암의 치료를 위한 다른 경로에 의해 투여될 수 있다.

제조 방법

본 발명에서 사용된 펩티드들은 예를들면 Boc 또는 Fmoc 화학을 이용하는 고체상 방법을 사용하거나 또는 펩티드 생합성의 기술에서 당업자에게 알려진 펩티드 생합성을 위한 다른 모든 실용 경로을 사용하여 합성될 수 있다.

Boc-아미노산으로 순차적인 고체상 합성은 메리필드의 방법을 기초로 하여 수행될 수 있다; (Jounal of American Chemical Society 85 2149-2154). 하기 화합물들이 사용될 수 있다. 노바비오켐 수지: Boc-Glu(OBzl)-PAM, 아미노산: Boc-Lys (2Cl-Z-)OH, Boc-Glu(OBzl)OH, Boc-Arg(Tos)OH, Boc-Val-OH, Boc-Thr (Bzl)-OH, 용매: DMF (Rathburn), 디클로로메탄 (BDH), 에틸아세테이트 (BDH), 시약:HBTU (Phase Separations Ltd), p-Cresol (Lanchester), TFA (Halocarbon Products Corporation) HF (BOC) DIEA (Fluka). Boc-아미노산들의 추천되는 반응성 측쇄 보호기들은 다음과 같다: Arg(Tos), Asn(Xan), Asp(OcHxl), Glu(OcHxl) Gln(Xan) 또는 Gln, His(DNP), Lys(CIZ), 세린(Bzl) Tyr(BrZ) Trp(CHO). 약자들은 다음과 같은 의미를 갖는다: DCC=디시클로헥실카르보디이미드, DIC=디이소프로필카르보디이미드, DCM=디클로로메탄, DMF=디메틸포름아미드, TFA=트리플로르아세트산, Boc=t-부틸옥시카르보닐, HOBT=히드록시벤조트리아졸, DIEA=디이소프로필에틸아민, DCU=디시클로헥실우레아.

예를들면, 본 발명의 펩티드의 boc 합성은 하기와 같이 수행될 수 있었다: 0.5 mmol 규모로 HBTU 활성화/인시츄 중성화는 0.5mmol의 수지 및 3배 이상의 활성화된 Boc 아미노산을 사용한다. Boc 아미노산 및 활성화 시약 (HBTU)은 같은 몰 양으로 사용된다 즉, 이 경우 각각 2mmol은 3배 초과와 같다. DIEA는 커플링을 위한 수지를 중성화하고 그리고 Boc-아미노산을 활성화하기 위해 사용된다 (이런 연유로 2.5mmol이 사용되고, 1 당량 Boc-aa 및 1 당량 수지). 시약: DMF중의 0.5M HBTU (MW=379, 0.5M=100ml중의 18.95g, 빛에 안정하지 않음을 주의)은 2mmol=4ml 및 2.5mmol DIEA=0.46ml (MW=129, d=0.742)를 요구한다. 아미노산의 활성화: Boc-아미노산은 특히 Arg(Tos)의 경우에, 수지에 첨가하기 전에 즉시 활성화되어야 한다. 모든 Boc 아미노산들 위해서: 2mmol Boc 아미노산을 20ml 글래스 시료 병으로 무게를 달아 넣는다. 4ml 0.5M HBTU 용액을 첨가하고 그리고 고체를 녹이기 위해 흔든다. 0.46ml DIEA를 첨가하고 그리고 혼합한다 (일부 색상의 변화가 관찰될 수있다). 방법: DMF로 수지를 세척하고, 1분 배출(drain) 동안 100% TFA-Shake로 Boc-보호기를 제거하고, 배출하소, 1 분간 DMF로 흘러내려 세척하고 (flow wash), 배출하고, 활성화된 아미노산 용액을 첨가하고, 그리고 나서 시료를 취하고 그리고 커플링 효율을 결정하기 위한 닌히드린 테스트를 수행한다. 합성이 완료될쯤 DMF 그리고 나서 DCM으로 흘러내려 세척하고, 건조한다. 펩티드 축조의 첫번째 및 모든 연이은 수준의 합성은 세배 이상의 DMF 중의 HBTU 활성화된 Boc-아미노산을 사용하여 달성된다. 모든 커플링에서, 커플링 효율은 양적 닌히드린 테스트에 의해 나타내진 바와 같이 99% 이상이어야 한다. N-말단의 탈보호화는 100% TFA에서 수행된다. 수지 펩티드는 탈보호 전 및 후에 주의깊게 흘러내려 세척된다. 마지막 커플링 및 Boc-보호의 제거 후에, 펩티드 수지는 디클로로메탄으로 세척되고 그리고 공기로 건조된다. 펩티드는 수지 지지체로부터 고 HF 방법 (2g 수지 펩티드, 2g 크레졸, 20ml HF, -5℃에서 1.5 시간)에 의해 제거하여 에틸아세테이트 (100ml)로 침전되고 그리고 6M 구아니딘 HCL-0.1M TRIS 용액 (20ml)에 재용해된 조(crude) 펩티드를 산출한다.

펩티드는 Vydac C₁₈5 RAC 컬럼 상의 분석적인 HPLC 분리를 사용하여 하기와 같이 정제될 수 있다. HPLC 등급(grade) 아세토니트릴 (aldrich) 및 물은 막 필터를 통하여 여과되고 그리고 사용전에 헬륨 기류로 가스가 제거된다. 분석적 분리는 0% 아세토니트릴로 시작하여 20분에 60% 아세토니트릴로 일정하게 증가하고, 20분 동안 이 농도에서 유지하게 하고 그리고 분당 1.2ml의 일정 흐름에서 10분동안0% 아세토니트릴로 꾸준히 감소하는 용매 글래디언트로 달성했다. 펩티드의 예비 분리는 TSK-GEL 예비 C₁₈컬럼 상에서 달성했다. 분리는 0% 아세토니트릴로 시작하여 60분에 18% 아세토니트릴로 일정하게 증가하고, 그리고 나서 80분 동안 60% 아세토니트릴, 분당 8ml의 일정 흐름에서 30분동안 이 농도에서 유지하게 하는 용매 글래디언트로 달성했다. 글래디언트는 두개의 마이크로프로세서 제어된 길슨 302 단일 피스톤 펌프에 의해 제어될 수 있다. 화합물들은 214nm에서 Waters 486 Tunable Absorbance Detector 및 HP 레이저젯 5L로 기록된 분석학적 크로마토그래피로 검출될 수 있다. 예비 크로마토그래피를 위한 Holochrome UV-VIS Detector 220nm는 LKB2210 단일 채널 기록기로 기록될 수 있다. 모세관 전기영동 질 제어는 15kV에서 가동되고 (시료 시간 20초), 60cm 컬럼 상에 정수의(hydrostatic) 주입에 의해 로드된 (가동 시간 12분) 인산염 완충액 (75μM) pH2.5를 이용하는 Waters Quanta 4000 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 1g 0.46mmol 수지 합성에 대한 수율은 약 250mg 순수 펩티드이어야 한다.

또 다른 용액 합성 방법은 본 발명의 더 많은 양의 펩티드들을 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 보호된 삼량체 단편들은 펩티드 합성의 기술에서 당업자에게 알려진 활성 에스테르들에 의해 단계적 합성을 이용하여 얻어질 수 있다. 그리고 나서 단편들은 관련된 C 및 N 말단 보호기들의 제거 후에 DCC/HOBT를 사용하여 조립된다. 모든 보호기들의 제거 후에, 조 펩티드는 SP-Sephadex-C25 이온 교환 크로마토그래피와 연이은 예비 HPLC 상에서 부분적으로 정제하고 그리고 나서 냉동건조한다.

사용 방법

냉동건조된 펩티드의 0.01 내지 1000mg을 1-10ml 증류된 물에 녹이고 그리고 경구로 또는 질로 투여된다. 0.01 내지 1000mg은 정제 또는 캡슐 또는 좌약 제조의 기술 분야에서 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 담체를 갖는 정제나 캡슐 또는 좌약으로 제형화될 수 있고 그리고 경구로 또는 질로 또는 항문으로 투여될 수 있다. 증류된 물에서 0.001 내지 100mg의 펩티드의 여과 살균된 용액은 피하로 또는 정맥으로 또는 근육으로 주입될 수 있다.

하기 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 것이며, 어떤 방식으로도 제한할 의도는 아니다.

실시예 1A

마우스에서 난알부민에 대한 IgG 혈청 항체 반응을 향상시키는 헤프리셉터 펩티드들의 아쥬반트 활성

50㎍의 난알부민 + 다양한 농도의 상이한 헤프리셉터 펩티드들의 주입 2주 후 마우스에서 IgG 반응을 결정하였다. IgG 반응은 난알부민의 존재하에서 마우스 혈청의 1 내지 100 희석의 광학 밀도 (OD)로 측정되었다.

결과

OD로서 기록된 IgG 반응

각각의 대조구의 100에 비하여 재기준된 OD로서 기록된 IgG 반응 데이터

결론

HEP1의 예외를 갖는 모든 헤프리셉터들은 상이한 최적 농도를 갖는 것을 제외하고는 아쥬반트 활성을 보인다.

실시예 1B

마우스에서 양의 적혈구 세포들 (SRBC)에 대한 흉선에서 항체-의존 세포독성 반응을 향상시키는 헤프리셉터 펩티드들의 활성

마우스들 (CBA - C57B1 Fi 하이브리드들, 2월령, 18-22g 중량)에서 양 적혈구 (SRBC)에 대한 항체 형성 세포들의 활성에 대한 헤프리셉터 펩티드들의 영향을결정하였다. 마우스들을 첫번째로 대조구로서의 0.5ml 멸균 염수 또는 동일 용량의 염수중의 헤프리셉터 펩티드들을 사용하여 복강내로 주입하였다. 헤프리셉터 펩티드들의 주입 30분 후, 5백만 SRBC를 함유하는 세포 현탁액을 각각의 마우스에게 복강내로 투여하였다. 예방 접종 4일 후, 마우스들을 자궁 경부의 탈구로 사살하고 그리고 비장을 무균적으로 얻었다. 각각의 비장을 2ml의 배지 199에서 균질화하고, 그리고 나서 이 현탁액의 100㎕를 1ml의 배지 199 (48℃ 워터 배스에서 저장된) 중의 제조된 아가로스에 넣었고, SRBC 현탁액을 첨가하여 최종 농도 1% 아가로스가 되게 하였다. 1ml의 아가로스-세포 혼합물을 젓고 그리고 나서 세트하기 위해 페트리 디쉬로 이송하였다. 아가로스가 고체로 되었을때, 페트리 디쉬를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트하고 그리고 나서 0.5ml의 배지 199 중의 20에 1로 희석된 기니아 돼지 혈청을 보체(complement) 원으로서 아가로스 겔의 상부에 첨가하였다. 인큐베이션은 또 다른 1시간 동안 계속되었다. 그리고 나서 페트리 디쉬들을 8배 쌍안 현미경을 이용하여 명시화하고 그리고 플라크의 수를 세었다 (각각의 플라크는 하나의 항체 분비 마우스 비장 세포에 상당한다). 그 결과는 1백만 핵을 지닌 비장 세포들 당 항체 분비 세포들의 수로서 그리고 전체 비장 당 항체 분비 세포들의 수로서 표현되었다. 분열촉진 효과는 관찰되지 않았기 때문에 (헤프리셉터 펩티드 투여는 정상 크기 마우스 비장을 초래했다), 이들 두 계산은 유사한 결과들을 주었다.

1백만 핵을 지닌 비장 세포들 당 항체 형성 세포들의 수의 평균 데이터 (데이터 포인트 당 30 마우스로부터). 그 데이터는 각각의 대조구의 100에 대하여재-기준화 되었다.

결론

모든 헤프리셉터들은 상이한 최적 농도를 갖는 것을 제외하고는 흉선에서 항체-의존 세포독성 반응을 향상시킨다.

실시예 2

예로서 Rupe312 및 Rupe414를 사용하여 CBA 마우스에서 수행된 이식된 자궁 육종 SM-322의 성장에 대한 그리고 자궁 경관 암 CUS-5에 대한 헤프리셉터 펩티드들의 항암 활성

재료 및 방법

이식된 마우스 육종 SM-322 모델 (내피 세포층 종양)

초기 자궁 종양은 1,2 디메틸히드라진을 사용하는 암컷 마우스에 유도하였다. 소수의 초기 종양들을 동계 마우스로 이식하였다. 최초 가시적 결절들은 이식 4일후 시점부터 보이기 시작했다. 이식된 종양을 갖는 마우스의 생존 예측량(expextancy)은 22-24일이었다.

이식된 마우스 자궁 경관 암 모델 CUC-5 (내피 세포층 종양)

초기 종양들은 메틸콜란트렌을 사용하여 암컷 마우스들에서 유도하였다. 그리고 나서 몇몇 초기 종양들을 자궁 경부로 자동-이식하였다. 이식된 종양들을 갖는 마우스들의 생존 기대치는 43일이었다.

CBA 마우스들

CBA 암컷 마우스들은 21.4=/-1.2g 무게이고 2-3 월령이었다. 종양들을 0.5ml의 종양 현탁액으로서 도입하고 (Igla 배지의 10ml당 1g 종양) 그리고 10 마리의 마우스들을 각각의 치료 그룹에서 사용하였다.

펩티드 제조 및 투여

동결건조된 펩티드들을 사용전에 즉시 살균된 생리학적 염수에 세가지 농도로 녹였다. 용액 0.5ml를 실험 지속기간 동안에 마우스들의 복막에 주당 2회 주입하였다. 펩티드의 세가지 상이한 농도는 마우스 주입 당 최종 용량이 10, 1.0 및 0.1mg이 되게 사용하였다.

결과

대조구 그룹에 비교하여 종양 용적의 평균 % 감소를 3 시점에서 기록하였다. 치료 그룹 및 대조구 그룹에서 마우스들의 수명을 비교하였고 그리고 대조구 및 치료 그룹 간의 종양들의 조직 구조를 비교하였다.

이식된 마우스 육종 모델 SM-322

이식된 마우스 자궁 경관 암 모델 CUC-5

결론

헤프리셉터 펩티드 Rupe312 및 Rupe414는 빠르게 성장하는 이식된 육종의 성장 속도를 감소시켜서 생존 예측량에서 약간의 (3-18%) 증가를 가져온다. 헤프리셉터 펩티드 Rupe312 및 Rupe414는 더 느리게 성장하는 이식된 자궁 경관 암의 성장 속도를 줄이나 생존 에측량에서는 뚜렷한 증가 (또는 감소)가 관찰되지 않았다.

헤프리셉터 펩티드 Rupe312 및 Rupe414는 일관되게 더 적은 종양 용적이 되게 하는 두 모델에서 종양 중심의 비 출혈 궤양성 파괴를 유도하였다.

실시예 3

21 HIV 감염된 환자들에 경구로 투여된 (30일 또는 90일 동안 하루에 10mg), HEP1, 헤프리셉터 펩티드는 임상적 향상을 가져왔다. 이 연구의 성공은 일반적으로 헤프리셉터 유래의 펩티드들의 실용에 대한 유용성 및 감소를 증명한다.

이 연구는 헤프리셉터의 도메인 A의 부분과 동일한 서열을 갖는 펩티드인, 약제학적 등급 HEP1으로 수행하였다. HIV-감염된 지원자들은 Ravshan Ataullakhanov 교수의 지도 아래 모스코바에 있는 Institute of Immunology에서 연구를 위해 모집되었다. 약제학적 등급 HEP1은 시험 개시 전에, 광범위한 동물 (랫트 및 토끼) 독물학 및 예비 임상적 테스트를 통과하였고 이는 화합물의 안전성을 증명한다. (독성의 예비적 평가 - 음성, 1000×치료학적 용량의 효과 - 음성, 국소 자극 - 음성, CNS 및 HIV에 대한 영향 - 음성, 하위(sub)-급성 독성 - 음성, 돌연변이 효과 - 음성, 만성 독성 - 음성, 태아독성 - 음성)

연구 계획

환자들은 아침 식사전 하루에 한번 2ml 멸균된 증류수 중의 HEP1 10mg의 용액을 경구적으로 투여하였다 (용액을 제조하고 그리고 -20℃에서 10mg씩 따로따로 저장하였다). 모든 환자들에게 치료전 30일동안 코드된 위약(僞藥)을 투여했다. 첫번째 그룹의 11 환자들에게 90일 동안 HEP1을 투여했고 그리고 첫번째 그룹의 환자들로부터의 데이터를 분석한 후에 15개월 후에 두번째 그룹의 10 환자들에게 30일동안 HEP1을 투여했다. 이 치료 기간 동안에, 환자들은 일주일에 한번 클리닉에 오게 하여, 의학적 시험을 받고 그리고 분석을 위해 혈액 샘플을 채취했다. 환자들은 또한 치료후 모니터링에 협조가 요청되었고 그리고 추가의 의학적 심사를 위해 6개월 동안 한달에 한번 클리닉에 방문하여 혈액 샘플을 공여하였다. 21명의 환자들중 21명이 치료 기간동안 모니터링에 협조했고 그리고 21명의 환자중 14명은 치료후 모니터링에 동의했다. 환자들은 HEP1 치료동안 및 치료전 한달간 어떤 다른 항-레트로바이러스 치료법도 받지 않았다.

환자들

환자들은 모스코바 주위의 다양한 클리닉으로부터 모집했고 그리고 시험에 참여에 대한 서면 동의를 하였다. 그들은 ELISA 분석에 의해 HIV 감염으로 확인되었고, T 세포 계수가 감소했고 그리고 HIV 관련된 질환의 몇몇 임상적 표시를 경험했다. 그 후 환자들은 μl당 17 내지 801 CD4 세포의 범위를 갖고 그리고 ml당 검출되지 않는 것부터 230,000 복사체 혈청 HIV RNA (Roche Labs Amplicor 양적 PCR 분석)의 범위를 갖는 것으로 보여졌다.

일반적인 관찰들

환자들은 HEP1에 대한 부작용은 없었고, 그리고 17명의 환자들은 더 나아졌다고 느꼈고 HEP1 치료동안 체중이 1.5Kg 내지 4.5Kg 늘었다고 보고되었다 (한 환자는 또한 위약 기간동안 더 나아졌다고 느꼈다).

부작용

부작용은 검출되지 않았다. 초음파 조사 및 광범위한 일련의 생화학적, 조직학, 면역학적 혈액 테스트 및 소변 테스트를 포함하는 임상적 평가를 수행하였다.

기회 감염

기회 감염은 미생물학적 분석에 의해 검출되었고 그리고 HEP1에 의해 치료된 환자들은 새로운 감염 없이 안정하거나 감염이 줄었다. 예를들면, 치료전, 환자의 38%가 인두의 심한Candida Albicans감염을 가졌고, 치료 후는 단지 9%만이 심하게 감염되었다. 치료전, 환자의 52%가 인두의 심한S viridans감염을 가졌고, 치료 후에는 단지 33%가 심하게 감염되었다. 치료전에, 환자의 33%가 인두의 S aureus 감염을 가졌고, 치료 후에는 단지 19% 만이 감염되었다.

CD4 림프구

HEP1으로 3개월 동안 치료된 그룹 11명의 환자들은 치료 종료시 9%의 T 세포 수의 평균 증가를 그리고 치료후 연이은 6개월 동안에 걸쳐 32% 평균 증가를 경험했다. 한달 동안 HEP1으로 치료된 그룹 10명의 환자들은 치료 종료시 3%의 T 세포 수의 평균 증가를 그리고 치료후 연이은 6개월 동안에 걸쳐 20% 평균 증가를 경험했다. 계속된 향상은 몇몇 양성 면역학적 변화가 환자들에서 유도되었음을 제시한다.

TCID에 의한 HIV 감염성 분석

바이러스성 로드(load)가 환자로부터의 HIV 감염된 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC)을 감염되지 않은 공여자 PBMC와 시료 세포들 대 배양 세포 간의 비율을 1/16으로 혼합하고 그리고 14일 동안 37℃에서 배양함에 의해 측정되었다. 배양 바이러스성 로드가 Innogenetics HIVp24 분석에 의해 측정되었고 그리고 결과들은ml당 HIVp24 항원의 피코그람으로 기록되었다.

두 그룹의 환자들 모두에서 (P1-P11 및 P12-P76), 감염성의 일반적인 패턴은 감염성 바이러스 입자들을 검출하기 위한 TCID 분석으로 관찰되었다. HEP1 치료법의 개시시에, (0 기 1기), 감염성 HIV 바이러스의 로드는 치료의 첫째 3주 내에 낮은 수준으로 급격히 줄어들고 그리고 21명의 환자중 9명에서 적어도 1주 동안 0으로 떨어졌다. 감염성이 두째주에 0으로 떨어지기 전에 3명의 환자들은 치료 첫째주 동안 감염성에서 증가를 경험했다. 뒤따르는 두번째 기에서 (2기), 대다수의 환자들에서 HIV 감염성은 치료 시작후 4 내지 8주 사이에 2배 내지 600배 증가하였다. 환자들이 이 기간동안 그들의 상태가 악화되지는 않았다. 뒤이은 3기에서는 감염성이 전-처리(pre-treatment) 수준 이하로 줄어들었다.

1기에서, 전-처리 기준선 아래의 바이러스 수준의 평균 최대 하락은 -80%이었다. 2기에서, 바이러스의 평균 최대 증가는 22배였다. 3기에서, 전-처리 기준선 아래의 바이러스 수준의 평균 최대 하락은 -64%이었다. 3기 동안에, 바이러스성 감염성은 3명의 환자에서 0으로 하락했다. HEP1으로 치료 종료 6개월 후, 바이러스성 감염성은 일반적으로 전-처리 수준으로 환원되었다.

본 발명자는 이 결과들은 면역계가 HEP1에 의해 활성화되어 1기에서 HIV와 싸운다는 것을 나타내는 것으로 해석한다. 면역계에서 활성의 증가된 수준은 HIV로 잠재적으로 감염된 세포들의 저장소 (reservoir)의 활성을 자극하여 2기에서 감염성 바이러스에서 증가를 가져왔다. 마지막으로 3기에서, 활성화된 면역계는 성공적으로 새롭게 활성화된 바이러스 저장소를 파괴하였다. HEP1으로 단지 한달 동안 치료된 10명의 환자들의 그룹은 2기 및 3기를 통한 진행이 HEP1의 존재에 의존하지 않았음을 보였다.

양적인 플라즈마 HIV RNA PCR에 의한 HIV 바이러스성 로드

바이러스성 로드의 분석은 Roche labs PCR 분석: Amplicor HIV-1 모니터에 의해 수행되었다.

1개월 및 3개월 치료한 양자 모두의 대다수 환자들에서, 바이러스 억제 (1기), 이어서 일시적인 바이러스 활성화 (2기), 이어서 억제 (3기)의 유사한 기들이 관찰되었는데, 이는 TCID 데이터에 유사하였다. 1기는 1 내지 4주간 지속되었고 그리고 바이러스 로드는 평균 -47%까지 하락했다. 2기는 8 내지 40주 동안 지속되었고 (TCID 분석으로 보여진 것 보다 더 지속된 기간) 그리고 혈장에서 바이러스성 RNA는 평균 3배까지 증가했다. 혈장에서 바이러스 RNA가 -19%의 평균 감소로 전-처리 수준 이하로 떨어진 3기가 뒤이었다.

세포계수에 의한 세포 집단 및 세포 표면 마커의 발현

HEP1으로 한달동안 치료된 10명의 환자들 (P12-P76)의 그룹의 말초 혈액 단핵세포 상의 세포 표면 마커들은 현미경, 형광 표지된 항체들, 유동 세포계수 및 관련된 절차들을 사용하여 상세히 분석되었다. HEP1 치료는 10명의 환자 그룹에 대해 평균된 각각 세포 집단들에 대해 하기의 효과를 가졌다:

a) 림프구

치료 동안 림프구의 절대 수에서 평균 7% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 25% 증가.

b) 백혈구

치료 동안 평균 10% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 20% 증가.

d) 자연 살세포(NK cell)

치료 동안 평균 10% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 30% 증가.

e) B 세포

치료 동안 평균 5% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 80% 증가.

f) CD3 발현 세포

치료 동안 평균 15% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 30% 증가.

g) CD8 발현 세포

치료 동안 평균 15% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 20% 증가.

h) CD44-CD4 발현 세포

치료 동안 평균 12% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 30% 증가.

i) CD4 세포들 상의 HLA 클래스 I 발현 수준

치료 동안 평균 10% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 70% 증가.

j) CD8 세포들 상의 HLA 클래스 I 발현 수준

k) CD25-CD8 발현 세포들

낮은 수준으로부터 치료 동안 평균 10% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 100% 증가. CD25-CD4 세포들은 두드러진 변화는 보이지 않았다.

l) CD38-CD4 발현 세포들

낮은 수준으로부터 치료 동안 평균 2% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약15%감소.

m) CD38-CD8 발현 세포들

낮은 수준으로부터 치료 동안 평균 2% 증가 및 5개월 뒤따른 치료동안 약 25%감소. (CD38에서의 두드러진 감소가 다은 섹션에서 다루어진다)

CD28, HLA-DR, CD45RO, CD45RA, CD57, CD62L과 같은 다른 마커들은 환자들간에 변화가 없었거나 일전한 패턴을 보였다.

CD38-CD8 세포들: AIDS로 진행에 대한 예후(prognostic) 지시제

CD38-CD8을 발현하는 세포 집단들의 증가하는 크기는 HIV 감염된 환자들에서 AIDS의 발달과 일치한다는 것이 잘 인식된다.

M Leavancher, F Hulstaert, S. Tallet, S Ullery, J J Pocidalo, B A Bach (1992) "The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficienty syndrome: staging and prognostic value"Clinical Experimental Immunology90 376-382

간략하게, 총 CD8 집단의 퍼센트로서 CD38-CD8 세포들은 HIV 질환 진행, 즉 수 많은 더 최근 집단들에서 증명된 관찰과 일치한다. 건강한 사람들에서, 또한 CD38을 발현하는 CD8의 퍼센트는 30 내지 50%이고, 자각증상이 없는 HIV 감염된 환자들에서는 50 내지 65%이고, ARC로 HIV 감염된 환자들에서는 65 내지 80%이고, 그리고, AIDS 환자들에서는 80 내지 98%이다. 한달 동안 경구로 10mg HEP1을 섭취한 10명 환자의 연구에 게속하여, 5명의 환자들은 분석을 위하여 혈액을 제공하였다. 이 환자들 모두에서, 총 CD8 집단의 퍼센트로서 CD38-CD8 세포들의 집단은 HIV 질환의 더 낮은 위험 및 향상된 건강을 나타내는 값들을 향하여 기울었다는 것이 분명했다.

혈장에서 항-HIV 항체들

10명 환자들의 HEP1으로 한달 치료 종료시에 (P12-P76), 5명의 환자들은 다양한 HIV 항원들에 대한 현저히 더 높은 역가 (치료전에 100에 재-기준된 역가)를 보였다.

기회 감염에 대한 항원 반응

기회 감염에 대한 HEP1 치료 자극된 항체 반응들 (치료전 100에 재-기준된 항체 역가)

항체 역가에서 평균 증가는 아스퍼길러스 IgG에 대해 +23%였고, 칸디다 IgG에 대해 +78%였고, CMV IgG에 대해 +50%였고, CMV IgM에 대해 +38%였고, HSV1 IgM에 대해 +15%였고, HSV2 IgM에 대해 +51%였고 그리고 토포플라즈마 IgG에 대해 +5%였다.

결론

상기 데이터는 헤프리셉터의 부분과 동일한 서열을 갖는 펩티드는 HIV 환자들의 인간 임상 시험에서 면역 활성화 및 임상적 이익을 가져오는 본 발명과 일치한다.

실시예 4

여성들에서 심한 급성 및 만성 칸디다 감염은 헤프리셉터 자극으로부터 도출하는 면역 반응에 의해 치유될 수 있다.

임상 연구: 재발성 순한 칸디다 감염

치료되지 않은 새로운 칸디다 감염의 발병을 갖는 여성 (27세)이 연구에 자원하였다. 그녀는 1% 클로트리마졸의 질내 적용으로 이전에 치료되었던 순한 질칸디다 감염 (이전 12개월에서 6회 증상 발현)이 보고되었다. 그녀는 이틀 연속 5ml 주입기로 질내로 HEP1 1mg/ml 용액 5ml를 스스로 투여하였다. 3일후, 칸디다 감염의 모든 임상 증후가 사라졌고 그리고 그녀는 계속되는 12개월에는 칸디다 감염의 더 이상의 재발은 보고되지 않았다.

임상 연구: 심한 지속하는 칸디다 감염

모스코바에 있는 Nearmedic Plus STD 클리닉에 다니는, 다양한 요 생식기 감염을 위해 항생제들로 치료 받은 후에 심한 질의 칸디다 감염을 앓고 있는 3명의 여성 환자들이 연구에 자원했다. 환자들을 연속되는 사흘동안 HEP1의 2mg/ml 용액 5ml로 치료되었다 (다른 항진균 치료는 사용되지 않았다). 치료 전과 치료 후의 미생물학적 분석 (요도, 자궁 경관 및 질 스왑의 배양) 및 임상적 분석의 비교는 감염의 분명한 향상이나 제거를 증명했다.

실시예 5

Rupe312, Rupe414, Rupe111 및 Rupe411는 마우스들에서 강한 마크로파지 활성화 반응을 유도한다.

HEP1을 포함하여 헤프리셉터 도메인 A로부터 수 많은 펩티드들이 마우스들에서 연구되었다.

활성화된 마크로파지들의 유도

22-24g 체중의 세마리 마우스 (CDA×C57B1) 그룹에 0.5ml의 생리학적 염수에 녹인 펩티드 1.0mg의 각각의 펩티드 용액을 복강으로 주입했다. 24시간 후에 마우스들을 목 척추 탈구로 사살하고 그리고 Hanks 용액 5ml를 복부로 주입하였다. 복부를 30초간 마사지했고 그리고 나서 복막액을 모았다. 모아진 용액을 나일론 필터로 1.5mg/ml EDTA을 함유하는 실리콘 튜브로 여과했다.

그리고 나서 1mg의 여과물에 핵 함유 세포들의 수를 Nihon 혈구계수기를 사용하여 현미경 검사하에 평가하였다. 세포들을 800g에서 5분간 원심분리하여 펠렛화했고, 펠렛을 태아 소 혈청에 재현탁했고, 세포 현탁액을 글래스 현미경 슬라이드로 적가했고 그리고 건조하였고 그리고 나서 메탄올로 고정하였고 그리고 Romanovski의 착색제로 염색하였다. 복막 압출물의 세포들의 형태학적 분석은 1600배 확대로 Opton 광학 현미경을 사용하여 수행하였다. 림프구, 휴식 마크로파지, 활성화된 마크로파지, 과립 백혈구 및 다른 세포 유형들의 수를 평가하였다. 그 결과는 펩티드 모두는 활성화된 마크로파지의 수가 증가하였으나, Rupe111, Ripe312, Rupe411 및 Rupe414는 HEP1 보다 현저히 더 활성적이다.

실시예 6

헤프리셉터에 의한 인간 말초혈액 단핵구의 생체외 활성과는 성장하는 세포들의 DNA로의 방사성 삼중수소화된 티미딘의 혼입을 측정함에 의해 증명되었다.

말초 혈액 단핵세포 (PBMC)를 피콜(ficoll) 그래디언트에서 분획화의 표준 방법을 사용하여 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 분리하였다. PBMC를 RPMI1640 배지 + 10% 태아 소 혈청, 1mM L-글루타민 및 항생제 (BM)를 함유하는 배양 배지에 현탁하였다. 세포 현탁액을 세포 배양을 위한 96 홀 마이크로웰의 웰들에 위치시켰다 (웰당 100,000 세포들을 함유하는 100㎕의 현탁액). 그리고 나서 100㎕의 BM을 펩티드들 함유하는 것에 첨가했다 (최종 농도 0.001-10㎍/㎖). 음성 대조구 웰은 BM을 함유했으나 펩티드는 없었다. 플레이트를 3일동안 37℃에서 인큐베이트했고 그리고 나서 방사성³H 티미딘을 ml당 1 마이크로퀴리의 최종 농도로 첨가하였다. 세포들의 DNA로³H 티미딘의 혼입은 표준 절차를 이용하는 베타카운터를 사용하여 측정하였다. 실험은 두번 반복되었고 그리고 그 결과는 분당 방사성 계수에서 두 실험들의 평균으로 나타냈다. 결과는 모든 펩티드들은 단핵 세포 증식은 활성화하나 Rupe312 및 Rupe414는 약 3ng/ml 피크 활성을 갖는 HEP1 보다 훨씬 더 활성적이였음을 나타냈다.

실시예 7

다양한 면역학적 세포들상의 MHC 클래스 I의 발현에 대한 헤프리셉터 펩티드들의 효과

헤프리셉터 유래 펩티드들 (0.003㎍/ml)를 인간 백혈구 세포 (WBC)와 함께 37℃에서 24시간 동안의 인큐베이션하는 것은 모든 WBC의 세포 표면상에 HLA 발현의 강도를 하락시켰다 (세포 활성화 및 리셉터 내면화에 기인). Rupe312는 HEP1 보다 더 활성적이었던 Rupe414 보다 더 활성적이었다.

펩티드가 없는 대조구 값에 대해 100으로 재기준된 데이터

이 활성화의 세포 특이적 효과는 MHC 클래스 I을 발현하는 단핵구 집단에서의 증가였고 그리고 MHC 클래스 I을 발현하는 CD8 림프구 집단에서의 감소였다.

펩티드가 없는 대조구 값에 대해 100으로 재기준된 데이터

실시예 8

헤프리셉터 페티드는 WBC에서 IL-8 생성을 억제한다

37℃에서 48시간 인큐베이션 후에 인간 WBC에 의한 IL-8의 발현에 대한 헤프리셉터 펩티드인 Rupe312의 농도가 증가함에 따른 억제 효과를 측정하였다. IL-8은 염증 자극에 반응하여 생성되는 주화성 인자로 T 세포들, 호중구, 호염구, 과립성 백혈구를 흡인하나 단핵구/마크로파지는 그러하지 않다. IL-8의 저해는 단핵구 마크로파지의 활성화에 Rupe312의 선택적 활성에 역할을 할 것이다. IL-8의 측정은 다양한 헤프리셉터 유래된 펩티드들의 활성을 결정하기 위한 분석(assay)을 제공한다.

(벨기에의 Innogenetics에 의해 제조된 IL-8 EIA 분석)

(Rupe312 SEQ ID 8: KKRRETVERE)

실시예 9

매우 저 용량의 헤프리셉터 펩티드 (1-100ng/마우스)는 Salmonella tryphimurium 에 의한 급성 감염으로부터 마우스들을 보호한다

실험실 마우스들 (CBA×C57B1 F1 하이브리드들)을 0.5ml 염수 또는 상이한 농도의 헤프리셉터 펩티드들 (1, 10 또는 100ng) + 0.5ml 염수를 투여받은 그룹들로 나누었다. 24시간 후, 마우스들을Salmonella tryphimurium으로 급성 감염시켰다 (마우스당 10,000 또는 100,000 세균을 복막내로 주입하였다). 20일 후 생존하는 각각 그룹의 마우스들의 퍼센트를 기록하였다 (치사적으로 감염된 대조구 동물들은 감염 3일 내에 죽었다).

20일 감염 후 생존하는 마우스 그룹의 퍼센트

결론

헤프리셉터 펩티드들은 치사 세균 감염으로부터 동물들을 보호한다

실시예 10

매우 저 농도의 헤프리셉터 펩티드들 (1-1000ng/마우스)은 마우스 치사 헤르페스 바이러스 감염 모델에서 생존 시간을 향상시킨다

실험실 흰 B/P 마우스들 (그룹당 5마리)에게 0.2ml 배지에 3.5 LD50의 역가로 헤르페스 바이러스 (VPG-1 균주 L2)의 치사 주입 전 48시간 및 24시간에 헤프리셉터 펩티드 (1-1000ng/마우스)를 복막내로 주입하였다.

평균 생존 시간을 일수로 마우스 그룹당 기록하였다.

결론

헤프리셉터 펩티드들은 치사 바이러스 감염으로부터 생존 시간을 현저히 향상시킨다.

우선권 서류

영국 특허 출원 GB9921881.0, Holms R., 1999. 9. 17

특허 서류

미국특허 제5,773,573호, Rupert Holms, 1998. 6. 30

다른 문헌들

Claims

헤프리셉터에 결합하는 하전된 분자.
헤프리셉터의 부분과 일치하는 서열을 갖는 펩티드.
제 2항에 있어서, 헤프리셉터의 부분과 일치하는 서열을 갖는 5 내지 13 아미노산 길이인 것을 특징으로 하는 펩티드.
하기의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드:

A R E E K H Q K Q L E R Q Q L E T E K K R R E T V E R E K E Q M.
하기의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드:

M R E K E E L M L R L Q D Y_(P)E E K T K K A E R E L S E Q I Q R A L Q.
하기의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드:

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하기의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드:

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