DE60125959T2

DE60125959T2 - Unterscheidung zwischen gnrh-i und gnrh-ii

Info

Publication number: DE60125959T2
Application number: DE60125959T
Authority: DE
Inventors: Hans Robert MELOEN; Berendina Hendrica OONK; Anne Jouwert TURKSTRA
Original assignee: Pepscan Systems BV
Current assignee: Pepscan Systems BV
Priority date: 2000-09-12
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2021-09-12
Also published as: NZ524540A; DE60125959D1; JP2004509135A; ES2280402T3; WO2002022659A2; DK1317478T3; PT1317478E; CN100522994C; EP1317478B1; EP1317478A2; CA2421580C; IL154821A; CA2421580A1; CN1455781A; RU2003110420A; IL154821A0; JP4820047B2; RU2348648C2; AU9439501A; AU2001294395B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf GnRH Isoformen.
GnRH-I (in der Literatur üblicherweise als GnRH beschrieben) ist ein kleines, 10 Aminosäuren langes Peptid (Dekapeptid) aus dem Hypothalamus. Die Aminosäurensequenz von GnRH-I (SEQ ID NO: 1) kann durch den folgenden Dreibuchstaben-Code dargestellt werden:
pGlu-His-TRP-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂
oder den entsprechenden Einbuchstaben-Code, wobei pE Pyroglutaminsäure ist, und # Amid:
pE H W S Y G L R P G#
GnRH-I wirkt an der Hypophyse, um einen Anstieg der Ausschüttung von Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und luteinisierendem Hormon (LH) in das Blut zu verursachen, welche im Gegenzug beim heranwachsenden männlichen Tier die Entwicklung der Hoden und die Synthese männlicher Steroide anregen. Im heranwachsenden weiblichen Tier wird die Entwicklung der Eierstöcke angeregt, wie die Entwicklung der Follikel innerhalb der Eierstöcke, die Synthese der weiblichen Steroide und der Eissprung.
Es ist bekannt, dass GnRH-I, wenn es an ein Trägerprotein gekoppelt ist, verwendet werden kann um Tiere zu impfen. Eine solche Impfung kann aus verschiedenen Gründen durchgeführt werden, von denen alle mit der natürlichen Funktion von GnRH- I in Verbindung stehen. Wie bekannt ist, hemmt eine drastische Reduktion von LH und/oder FSH im Blut die Produktion männlicher Steroide oder Androgene und von Sperma in den Hoden des Männchens und die Bildung weiblicher Steroide oder Progestagene und Östrogene im Blut und der Follikelreifung im Eierstock des Weibchens. Eine solche Reduktion der Mengen an Androgenen, Progestagenen und Östrogenen im Blut, auf ein Niveau, das zu demjenigen vergleichbar ist, das erreicht werden kann durch die Entfernung der Hoden oder Eierstöcke mittels Kastration, kann erreicht werden durch eine effektive Immunisierung des Tieres gegen GnRH-I. Bei männlichen Tieren tritt es in vielen Fällen ein, dass die Hoden sich langsam oder überhaupt nicht entwickeln, wobei keine Synthese von Androgenen (männlichen Steroidhormonen) und keine Bildung von Spermatozoen auftritt. Bei weiblichen Tieren tritt es auf, dass die Aktivität der Eierstöcke abnimmt, mit keiner Synthese von Östrogenen und Progestagenen (weiblichen Steroidhormonen) und Unterdrückung der Follikelreifung und des Eisprungs.
Unlängst wurde berichtet, dass eine zweite Form von GnRH (GnRH-II) im Primatengehirn vorhanden ist (Lescheid et al. Endocrinol. 138 (1997) 5618-5629) und ein Gen für dieses zweite GnRH Molekül aus einer menschlichen Genbibliothek geklont wurde (GnRH-II, (SEQ ID NO: 2) (White et al. PNAS USA 95 (1998) 305-309). Säugetier GnRH-I (SEQ ID NO 1) ist außerhalb des Gehirn kaum vorhanden. Wenige Ausnahmen sind in dieser Hinsicht bekannt. GnRH-I ist vorhanden im Endometrium von Frauen mit einem Menstruationszyklus (Casan et al. Fertil. Steril. 1998, 70, 102-106) und während der Schwangerschaft in der menschlichen Plazenta (Kelly et al. cell Biol. 1991, 10, 411-421). GnRH mRNA wurde gefunden im Eierstock, im Hoden, im Thymus, in der Plazenta und im Hypothalamus der Ratte (Oikawa et al., Endocrinology, 1990, 127, 2350-2356). Das Expression von GnRH wurde im Immungewebe (Milz, Thymus und Lymphozyten) von Schweinen entdeckt (Weesner et al., life Sci, 1997, 61, 1643-1649).
GnRH-II wird in vielen Geweben außerhalb des Gehirns exprimiert, und wird in besonders hoher Konzentration in den Nieren, im Knochenmark und der Prostata gefunden. Die Gegenwart von GnRH-II in verschiedenen Geweben neben dem Gehirn deutet darauf hin, dass GnRH-II verschiedene Funktionen haben kann. Zusätzlich legt die über verschiedene Wirbeltiergattungen streng konservierte Struktur von GnRH-II-Peptid nahe, dass dieses Neuropetid eine vitale Bioaktivität besitzt. Bis jetzt aber waren die Funktionen von GnRH-II praktisch unbekannt. Verschiedene Arten von differenzierten Lymphozyten, wie T- und B-Lymphozyten und Mastzellen, produzieren GnRH und GnRH-ähnliche Peptide. Signifikante Anzahlen des letzteren Zelltyps sind vorhanden in der Niere, im Knochenmark und in der Prostata und tragen vielleicht zu der hohen Ausschüttung von GnRH-II in diesen Geweben bei. GnRH-II scheint im Vergleich zu GnRH-I bei der Fortpflanzung weniger beteiligt zu sein. In der hypogonodalen Maus, einer Maus, welcher es am GnRH-I Gen mangelt, sind die GnRH-II produzierenden Zellen in der gleichen Verteilung vorhanden wie bei der normalen Maus, aber dies ist nicht ausreichend um bei jenen Mäusen eine normale Entwicklung der Keimdrüsen zu bewirken (Chen et al. FEBS Letters 435 (1998) 199-203). Aber Makaken in der Lutealphase des Menstruationszyklus zeigten einen merklichen Anstieg der Plasmakonzentration von luteinisierendem Hormon nach der intravenösen Gabe von GnRH-II, aber dieser Ansteig konnte nicht während der mittleren follikularen Phase bewirkt werden (Leescheid et al. Endocrinol. 138 (1997) 5618-5629).
Die Erfindung stellt ein Peptid zur Verfügung, das zumindest zwei gekoppelte GnRH Dekapeptid Sequenzen umfasst, die aus der Gruppe gewählt wird, die
*AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#, pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#, pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# und pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#
umfassen, wobei # Amid und * Acetyl ist, und zur Auslösung einer Immunreaktion auf Formen von gonadotropinem Ausschüttungshormon (Gonadotropine Releasing Hormone – GnRH), auch bezeichnet als luteinisierendes Hormon Ausschüttungshormon (Luteinizing Hormone Releasing Hormone – LHRH) geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe zur Verfügung sowie Arzneistoffe und andere medizinische Präparate, die auf einem solchen Peptid basieren. Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines solchen Impfstoffes oder medizinischen Präparats zur Verfügung in einer Methode zur Immunisierung eines Säugetiers gegen GnRH zur Beeinflussung der Fortpflanzungs- oder Verhaltenscharakteristiken dieses Säugetiers und in einer Methode zur Verbesserung der Schlachtqualität von Schweinen. Die Erfindung stellt ferner ein Peptid zur Verfügung, das geeignet ist eine selektive immunogene Reaktion gegen GnRH-I oder GnRH-II auszulösen. Weiterhin stellt die Erfindung Antikörper gegen GnRH-I und/oder GnRH-II, Zusammensetzungen umfassend diese Antikörper und die Verwendung der Peptide in pharmazeutischen Zusammensetzungen oder im Präparat für ein Medikament zur Behandlung von Prostatakrebs zur Verfügung.
Die Erfindung stellt jetzt die Erkenntnis bereit, dass durch die Verfügbarkeit von Peptidsequenzen, die eine Unterscheidung zwischen den verschiedenen Typen von GnRH erlauben, von der Veränderung oder vom Unterschied der Immunreaktionen auf die verschiedenen Typen von GnRH, angemessener und effizienterer Gebrauch gemacht werden kann.
Im Besonderen stellt die Erfindung den Einblick bereit, dass Verbesserungen in der Effizienz und der Selektivität von Impfstoffen gegen GnRH-I erreicht werden können. Die Immunisierung gegen GnRH ist wirksam in der Neutralisierung von GnRH-I und resultiert in reduzierten Gonadotropinspiegeln und der Blockade der Synthese gonodaler Steroide. Nichts ist aber bekannt über physiologische Effekte der Antikörper, die gebildet gegen GnRH-I werden, auf die Funktion von GnRH-II. Da GnRH-II hauptsächlich in den Nieren gebildet und ausgeschüttet wird, könnten gegen GNRH-I gebildete Antikörper, die eine Kreuzreaktion mit GnRH-II haben, die Nierenfunktion beeinflussen. Um mögliche Nebeneffekte einer GnRH-I Immunisierung auf die Nierenfunktion auszuschließen wäre es wünschenswert, die Antigen-Reaktion auf einen Immunkastrations-Impfstoff spezifisch gegen GnRH-I zu richten, und so mögliche schädliche Seiteneffekte aufgrund der Neutralisation nicht-gonodaler GnRH-II zu vermeiden
Wenn allein die Reproduktionsfähigkeit einer Spezies, häufig zusammen mit dem begleitenden Sexualverhalten, aufgehoben werden soll, wäre es wünschenswert, einen Immunkastrationsimpfstoff anzustreben, der spezifisch GnRH-I neutralisiert. Daher der Wunsch zu einer selektiven Immunisierung gegen gonadotropine(s) Ausschüttungshormon(e) zu kommen, die vorzugsweise gegen GnRH-I selektiv sind.
In der Tiermedizin könnte eine 100%-wirksame Immunisierung gegen GnRH-I zur Sterilisation von z.B. kleinen Haustieren wie männlichen und weiblichen Katzen und Hunden verwendet werden oder zur Behandlung der Aggressivität männlicher Hunde und Stiere, einfach durch eine Impfung statt durch drastische Chirurgie wie Kastration oder Entfernung der Eierstöcke. Andere vorstellbare Gründe für eine Immunisierung gegen GnRH-I sind die Verhinderung der Läufigkeit bei weiblichen Tieren, wie Hunden, Katzen und Kühen, und der Ruhelosigkeit bei männlichen Tieren, die für die Schlachtung gemästet werden.
In der medizinischen Versorgung des Menschen kann eine Immunisierung gegen GnRH-I und/oder GnRH-I zur Behandlung von Prostatakrebs und Brustkrebs verwendet werden und, falls gewünscht, zur Behandlung einiger Formen von Krebsgeschwulsten der Hypophyse. Im Falle von Prostatakrebs könnte es wünschenswerter sein GnRH-I und GnRH-II zu neutralisieren, da die letztere Isoform im Prostatagewebe in großem Masse ausgeschüttet wird.
Eine andere Verwendung eines Impfstoffes gegen GnRH-I liegt im Bereich der Viehzucht, vorzugsweise der Mästung von Schweinen für die Schlachtung. Das Fleisch männlicher, geschlechtsreifer Schweine (Eber) hat einen typischen Geruch, den sogenannten Ebermakel oder Ebergeruch. In den Hoden des geschlechtsreifen Schweins werden viele C19-delta-16 Steroide gebildet, die im Fettgewebe des Tieres gespeichert werden (Patterson, J. Sci. Food Agric. 19, 31-38 (1968); Brooks en Pearson, J. Anim. Sci. 62, 632-645 (1986); Claus, Zeitschrift. Tierzüchtg. Züchtungsbiol. 93, 38-47 (1976); Claus, Acta Endocrinol. (Copenh.) 91, Suppl. 225, 432-433 (1979)). Diese Steroide sind hauptsächlich verantwortlich für die Bildung des widerlichen, urinartigen Geruchs, wenn das Fleisch erhitzt wird (Fuchs, Swedish J. Agric. Res. 1, 233-237 (1971); Bonneau, Livest. Prod. Sci. 9, 687-705 (1982)). Aufgrund dieses unangenehmen Geruchs ist das Fleisch männlicher, geschlechtsreifer Schweine generell ungeeignet für den Verzehr und unbrauchbar für den Export. Da ungefähr 10% der männlichen Schlachtschweine vor der Schlachtzeit bereits geschlechtsreif sind, hat dies potentiell einen großen Verlust für die Schweinezuchtindustrie zur Folge.
Um diese Verluste zu steuern und zu vermeiden, werden nahezu alle männlichen Ferkel, wenn sie jung sind, kastriert mit einer chirurgischen Prozedur, die allgemein ohne jegliche Form von Betäubung ausgeführt wird. Abgesehen von dem tierunfreundlichen Aspekt einer solchen Kastration, führt die Kastration auch zu Infektionen, einer Unterdrückung des Wachstums und zu einer letztendlichen Schlachtqualität, die schlechter ist, als bei einem intakten Tier, zumindest so lange wie das intakte Tier den Eberekel noch nicht entwickelt hat (Walstra; Livest. Prod. Sci. 1, 187-96 (1974)).
Eine tierfreundliche Alternative besteht in der Reduktion der GnRH-I Konzentration in der Hypophyse des Schweins mittels einer Immunisierung gegen GnRH-I, die sogenannte Immunkastration. Diese Reduktion der GnRH-I Spiegel führt zu einer Reduktion der biologisch aktiven FSH und LH, welche im Gegenzug die Entwicklung der Hoden in den heranwachsenden Tieren und die Synthese testikularer Steroide, einschließlich Androstenon, Testosteron und Östrogene, verhindert wird. Diese Methode verhindert das Auftreten des Eberekels bei männlichen Schweinen zur Schlachtzeit und macht eine chirurgische Kastration unnötig, da die Androstenon Spiegel auf Niveaus herabgesetzt werden, die niedrig oder nicht nachweisbar sind (Oonk et al., 1995, Livestock production Science 42, 63-71).
Eine strikte Anforderung an einen annehmbaren Impfstoff gegen Eberekel ist, dass bei nahezu allen Schweinen die Entwicklung der Hoden in einem solchen Ausmass verlangsamt wird, dass Eberekel zur Schlachtzeit nicht auftritt, und dass falls der Impfstoff die Hodenentwicklung bei einem Tier nicht reduziert, dies aufgrund einer im Vergleich zu erfolgreich immunkastrierten Schweinen zu hohen Hodengröße leicht festgestellt werden kann.
In der bestehenden Literatur und früheren Patentanmeldungen bezüglich der Antifruchtbarkeitseigenschaften von Impfstoffen gegen GnRH-I erscheinen die Ergebnisse der Impfungen häufig variabel. In den meisten der beschriebenen Studien, reagiert entweder ein kleiner Prozentsatz der geimpften Tiere nicht auf die Impfung, oder es werden hohe Dosen des Impfstoff, mehrfache Impfungen oder kommerziell unakzeptable Zusätze benötigt, um den gewünschten Effekt zu produzieren (Hoskinson et al., 1990, Austr. J. Biotech. 4, 166-170; Falvo et al., (1986) J. Anim. Sci. 63; 986-994; Clarke et al., 1998, Endocrinology 139, 2007-2014; Adams T.E. and B.M. Adams, Feedlot performance of steers ans bulls active immunized against Gonadotropine-Releasing Hormone, J. Anim. Sci. 1992, 70: 1691-1698; Browne et al., immunization of sheep against GnRH-I early in life: effects of reproductive function and hormons in rams, Journal of reproduction and Fertility (1994) 101, 15-21; Ferro et al., Immunological castration using a Gonadotropine-releasing Hormone analogue conjugated tp PPD, Food and agricultural immunology. 1995, 7, 259-272; U.S.patent 4,608,251: Int. Patent appl. WO 88/05308).
Einige Studien legen eine 100%ige Wirksamkeit eines Impfstoffs gegen GnRH-I nahe, aber der Impfstoff war nicht an einer großen Zahl von Tieren getestet worden (Ladd et al. (1994), Development of an antifertility vaccine for pets based on active immunization against Luteinizing Hormone releasing hormone, Biology of reproduction 51, 1076-1083; J.G. Manns and S.R. Robbins (1997). Prevention of boar taint with a recombinant based GnRH vaccine, In: Boar taint in entire male pigs, Proceedings of a meeting of the EAAP working group "Production and Utilissation of Meat from Entire Male Pigs", EAAP Publication No. 92, 137-140;); andere Studien geben die Wirksamkeit als den Durchschnittswert der behandelten Tiere an, da individuelle Werte keinen klaren Unterschied zwischen immunisierten und nicht behandelten Kontrolltieren zeigten (Bonneau et al., J. Anim. Sci. 72, 14-20 (1994); Hennessy et al., 1997. Elimination of boar taint: a commercial boar taint vaccine for male pigs. In: Bonneau, M., Lundström, K. and Malmfors, B. (Eds.), Boar taint in entire male pigs. Wageningen Pers, Wageningen, EAAP Publication No. 92., 141-145).
Die Schwierigkeit bei der Herstellung dieses Typs von Impfstoffen wird vielleicht durch das Phänomen der Toleranz verursacht. Körpereigene Substanzen wie Hormone werden nicht als fremd erkannt sondern eher vom Immunsystem toleriert. Normalerweise werden keine Antikörper gegen körpereigene Substanzen hervorgerufen. Damit ein Impfstoff aber erfolgreich ist, muss er ausreichend fremd sein. Nur wenn der Impfstoff genügend fremd ist, wird das Immunsystem den Impfstoff nicht tolerieren und die Produktion von Antikörpern wird angestoßen. Umgekehrt aber müssen die Antikörper noch in der Lage sein das Hormon zu erkennen, und daher darf der Impfstoff nicht "zu fremd" sein.
Da diese Eigenschaften sich wechselseitig auszuschließen scheinen, war es bis vor kurzem nicht sicher, ob derartige Substanzen überhaupt hergestellt werden könnten. Ein Ansatz zur Herstellung von GnRH-artigen Peptid Impfstofffen bestand im Ersetzen von Gly an position 6 des GnRH-I Dekapeptid durch eine rechtsdrehende Aminosäure (D-tryp; Chaffauy et al., Recueil de Medicine Veterinaire 161 82), 133-145, 1985). Es wurde aber gezeigt, das ein Impfstoffpräparat, das dieses modifizierte GnRH-Peptid enthielt, sogar weniger gut wirkte als das normale GnRH-I Dekapeptid (Europäische Patentanmeldung – 464, 124 A).
Kürzlich haben wir definitiv gezeigt, dass es möglich ist eine effektive Antikörperantwort bei allen Individuen hervorzurufen, die gegen GnRH-I geimpft wurden (Meloen et al., Vaccine 12, 741-746 (1994)). Bei diesen Experimenten wurden Schweine zweimal mit einem GnRH-I Impfstoff geimpft, der vom klassischen Typ des GnRH-I Impfstoffs abweicht (GnRH-I gekoppelt an ein Trägerprotein, in Freund's Adjuvans (Hilfsstoff), namentlich der Tandem-GnRH-I Impfstoff (Europäisches Patent Nr. 0464124). In dieser Veröffentlichung wird ein Peptid beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, das es zumindest zwei GnRH-I Sequenzen in Tandemform umfasst, gemäß der allgemeinen Formel
Z¹-Glx-His-Trp¹-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-[Gly-X-Gln-His-Trp²-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]_n-Gly-Z²,
in welcher die Aminosäuren gemäß dem Dreibuchstaben-Code bezeichnet werden, Trp¹ und Trp² sind Tryptophan bzw. formyliertes Tryptophan (N_(indole)-formyl-tryptophan), n ist eine Zahl mit einem Wert von mindestens 1, X ist entweder eine direkte Bindung oder eine Zwischengruppe zwischen den Aminosäuren Gly und Gln, Z¹-Glx ist entweder pGlu (Pyroglutaminsäure) oder Gln mit einem angesetzten Endstück, welches eine oder mehrere Aminosäuren umfasst. In dieser allgemeinen Formel kann X eine direkte Bindung zwischen den Aminosäuren Glycin und Glutamin sein, d.h. diese Aminosäuren sind untereinander über die normale Peptidbindung direkt verbunden ohne eine Zwischenverbindung. Die Erfindung des Tandem-GnRH-I Impfstoffs umfasst auch Peptide, in denen die GnRH-I Sequenzen über Zwischengruppen verbunden sind. Die Beschaffenheit der Zwischengruppen kann stark variieren, von einer oder mehreren Aminosäuren zu einer kürzeren oder längeren Kohlenwasserstoffkette und anderen Verbindungsgruppen oder Molekülen. In der obigen allgemeinen Formel steht Z¹-Glx vorzugsweise für pGlu (Pyroglutaminsäure), kann aber auch stehen für Gln, woran ein Endstück befestigt ist, welches eine oder mehrere Aminosäuren umfasst, z.B. zur Nutzung für die Kopplung des Peptids an ein Trägerprotein. In der obigen allgemeinen Formel steht Gly-Z² für z.B. Gly-NH₂ oder Gly, woran ein Endstück befestigt ist, welches eine oder mehrere Aminosäuren umfasst, z.B. zur Nutzung für die Kopplung an ein Trägerprotein. Vorzugsweise steht Gly-Z² für Gly-Cys-NH, das C-terminale Cystein wird im Zusammenhang mit der möglichen Kopplung des Peptids an ein Trägerprotein addiert.
Aus der WO 96/40755 und Oonk et al., Vaccine 16 (11-12), 1074-1082, 1998 ist es bekannt, dass die Anwendung des Tandem-Dimer-Prinzips auf eine Variante des GnRH-I Moleküls einen Impfstoff ergab, der in verschiedenen milden Adjuvantien (Hilfsstoffen), nämlich Specol und einer Doppelölemulsion, hoch effektiv war, als auch in niedrigen Dosen effektiv war. In diesem Fall wurde die Variante des GnRH-I Moleküls durch die Substitution der sechsten Aminosäure Gly des Dekapeptids durch eine rechtsdrehende (D-)Aminosäure, D-Lys gebildet, wonach das sich ergebende Peptid dimerisiert und an einen gemeinsamen Trägerverbund, Ovalbumine, gekoppelt wurde. Folglich: Sofern ein Impfstoff, der D-Aminosäuren Substitution von Gly an Position 6 der Originalsequenz und ein einzelnes GnRH-I Dekapeptid mit einer D-Aminosäure nutzt, die immunogene Aktivität im Vergleich zur Original GnRH-I Sequenz absenkt (Chaffaux et al., Recueil de Medicine Veterinaire 161 (2), 133-145, 1985), so waren derartige Substitutionen mit einer D-Aminosäure angewendet auf einen Tandem-Dimer GnRH-I Impfstoff in der Lage, GnRH-I Impfstoff Präparate mit einer noch höheren Immunogenität zu erzeugen. Nichtsdestoweniger erforderte die Impfmethode eine Wiederholungsdosierung des Impfstoffs um vollständig effektiv zu sein. Die Notwendigkeit einer zusätzlichen Dosis zur Erreichung einer wirklich 100%ig wirksamen Impfung von Säugetieren gegen GnRH-I ist ein Nachteil der bekannten. Peptide. Wir fanden auch heraus, dass in bestimmten Fällen der Gebrauch des (D-Lys⁶)GnRH-I Tandem-Dimers (d.h. das GnRH-I Tandem-Dimer, mit und ohne der D-Lys⁶ Ersetzung) in sehr geringen, aber noch messbaren Testosteron-Spiegeln resultierte, was unerwünscht ist und einen Nachteil des (D-Lys⁶)GnRH-I Tandem-Dimers darstellt.
Die jetzige Erfindung stellt Peptidsequenzen zur Verfügung, die zumindest zwei gekoppelte GnRH Dekapeptid Sequenzen umfassen, die aus der Gruppe gewählt wird, die aus
*AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#, pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#, pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# und pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#
besteht, wobei # Amid und * Acetyl ist, und die Alternativen zum Tandem D-Lys⁶ GNRH-I bei Anwendung in Impfstoffen darstellen, was Impfstoffe ergibt, die für die Immunkastration effektiv sind.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung des Ausmaßes, bis zu dem die Aminosäuren in der Tandem GnRH-I Sequenz variiert werden können, wobei das resultierende substituierte Tandem GnRH-I noch in der Lage ist, eine für die Immunkastration ausreichende Immunreaktion gegen GnRH-I zu erzeugen. Somit umfasst die Erfindung die Erzeugung einer Peptidsequenz, die die Produktion von Antikörpern gegen GnRH-I induzieren können, die weiterhin sowohl in der Menge als auch in der Aktivität ausreichend kompetitiv sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, eine Peptidsequenz zur Verfügung zu stellen, die die Produktion von Antikörpern gegen GnRH-I selektiv veranlasst, während gegen GnRH-II eine geringe oder keine Immunreaktion ausgelöst wird. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Peptidsequenz, die nicht nur selektiv die Produktion von Antikörpern gegen GnRH-I bewirkt, sondern auch bei der Immunkastration effektiv ist, während eine Immunreaktion auf GnRH-II verringert oder nicht vorhanden ist.
Die jetzigen Erfinder haben heraus gefunden, dass in der Tandem GnRH-I Peptidssequenz der Erfindung verschiedene Aminosäuren ersetzt werden können, mit dem Ergebnis einer abnehmenden Ähnlichkeit mit dem körpereigenen Hormon, während gleichzeitig die Fähigkeit des Peptids GnRH-I bindende Antikörper hervorzurufen erhalten bleibt oder sogar ansteigt. Auch resultieren bestimmte Ersetzungen von Aminosäuren in der GnRH-I Peptidsequenz in einer selektiven Immunantwort auf GnRH-I und in einer verringerten oder nicht vorhandenen Immunantwort auf GnRH-II.
Bei einem Aspekt der Erfindung berücksichtigen bestimmte modifizierte Tandem GnRH-I Peptidsequenzen Impfstoffe, die nicht nur die Fähigkeit aufweisen bei männlichen Tieren das Wachstum der Hoden zu verringern, sondern auch die Fähigkeit aufweisen, die Testosteron-Spiegel wirksam zu auf ein Maß zu reduzieren, das mittels konventioneller Methoden nicht nachgewiesen werden kann.
Ferner haben Impfstoffe, die aus diesen Peptidsequenzen hergestellt wurden, eine Aktivität, die in den meisten Fällen die zweite zusätzliche Immunisierung, wie bei der konventionellen D-Lys⁶ Tandem GnRH-I, unnötig machten, um eine im wesentlichen 100%ige Aktivität zu erreichen. Eine Aktivität oder Wirksamkeit von 100% in den Begriffen der vorliegenden Erfindung ist definiert als ein Testosteronspiegel, der im wesentlichen nach einer einzelnen Impfung mit konventionellen Methoden nicht nachweisbar ist. Eine der bemerkenswertesten Eigenschaften der Erfindung ist es, dass Antikörper, die aufgrund dieser alternativen GnRH Impfstoffe produziert werden, zwischen GnRH-I und GnRH-II unterscheiden. Somit zeigen erfindungsgemäße Peptide eine erhöhte oder gleichbleibende Aktivität gegen GnRH-I, während gleichzeitig eine eine reduzierte oder nicht vorhandene Immunantwort auf GnRH-II gefunden wird. Dies erlaubt die Entwicklung von Peptiden, die einen umgekehrten Effekt erzielen, d.h. sie weisen eine erhöhte oder gleich bleibende Aktivität gegen GnRH-II auf, während sie gleichzeitig eine reduzierte oder nicht vorhandene Immunantwort gegen GnRH-I aufweisen. Eine derartige GnRH-II-spezifische Antwort könnte genutzt werden, um zu helfen bei die Einnistung des Embryos bei Säugetieren zu unterdrücken, sofern eine Schwangerschaft nicht oder nur in geringem Masse gewünscht ist. Weiterhin können durch die Nutzung einer derartigen GnRH-II spezifischen Antwort FSH Spiegel herunter reguliert werden, was zu einer reduzierten Gesamtfruchtbarkeit führt.
Die Erfindung bezieht sich in einem Aspekt auf ein Peptid, das eine modifizierte Tandem GnRH-I Dekapeptidsequenz aufweist, wobei eine Impfung mit dem Peptid in einer geeigneten Dosis einen Testosteronspiegel erlaubt, der im wesentlichen nicht nachweisbar ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Peptid, das mindestens zwei gekoppelte GnRH-I Dekapeptidsequenzen umfasst, optional gekoppelt über ein Zwischengruppe, welches eine Immunantwort ermöglicht, die eine wirksame Unterscheidung zwischen GnRH-I und GnRH-II möglich macht.
Die erfindungsgemäßen Peptide entsprechen in ausreichendem Maße dem Hormon, sind aber gleichzeitig in ausreichendem Maße "fremd" für das Immunsystem und haben eine erhöhte Fähigkeit die Produktion von gegen das Hormon gerichteten Antikörpern zu bewirken.
Eine Eigenschaft der Erfindung ist es, dass individuelle Tandemeinheiten dimerisiert werden können um ihre Immunogenität weiter zu erhöhen, ohne die Möglichkeit zu verlieren, das Peptid oder die Peptidzusammensetzung an ein Trägerprotein zu koppeln.
Die Techniken zur Dimerisierung und zur Kopplung des Tandems an einen Träger können genutzt werden, sind gleichartig zu denen, die in der WO 96/40755 beschrieben sind. Es ist auch vorgesehen, dass Peptide, die nur einen Teil der GnRH-I oder GnRH-II Peptidsequenzen enthalten, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Beispiele hierzu sind Nonapeptide und Undekapeptide.
Die Verbindungsgruppen, die in den erfindungsgemäßen Peptiden genutzt werden, können aus den Verbindungsgruppen gewählt werden, die in dieser Anmeldung an anderer Stelle beschrieben werden oder von Verbindungsgruppen wie SMCC-Verbindungsgruppen oder anderen Verbindungsgruppen nach dem Stand der Technik.
Verbindungsgruppen werden zur Kopplung von zwei oder mehr dimerisierten Peptidsequenzen genutzt. Die Aminosäure, die zur Substitution der Aminosäure in den Tandempeptidsequenzen Verwendung findet ist vorzugsweise eine vergleichsweise einfache Aminosäure, wie etwa Alanin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ersetzende Aminosäure daher Alanin. Andere Aminosäuren können auch verwendet werden, um die Aminosäure in der Tandem-Dekapeptidsequenz zu ersetzen. Vorzugsweise werden nur konservative Ersetzungen vorgenommen. Konservative Ersetzungen sind Aminosäuresubstitutionen, bei welchen voluminöse Aminosäuren durch voluminöse Aminosäuren ersetzt werden, aromatische Aminosäuren durch aromatische Aminosäuren, etc. Diese Konzepte sind dem Fachmann wohlbekannt.
Zwischengruppen können erfindungsgemäß zwischen den Peptiden plaziert werden. Dieses ermöglicht die Bildung von Multimeren. Geeignete Zwischengruppen sind in der Technik bekannt.
Beschreibung der Zeichnungen
1: Kompetition um die Bindung von jodiertem GnRH mit Antiserum mit GnRH (leere Kreise), GnRH-II (ausgefüllte Kreise), Kontrollpeptide (ausgefüllte Quadrate), und ohne Peptide (Sterne). Das Serum 1/10.000 ist verdünnt und steigende Peptidkonzentrationen (0,25; 2,5; 25 pmol) wurden pro Kavität zugegeben. In den Graphen A-C werden Seren mit steigender Bindungskapazität für GnRH-II gezeigt. Horizontale Achse: Peptidmenge (pmol pro Kavität); vertikale Achse: Bindungskapazität (Zerfälle pro Minute)
2: Prozentualer Anteil von jodiertem GnRH-I, das von GnRH-I (2A) und von GnRH-II (2B) verdrängt wurde für Seren individueller Tiere (jeder Balken steht für ein Tier) nach der Immunisierung mit G6k-GnRH-Tandem-Dimer Peptiden mit Alanin-Ersetzungen wie unter jeder Balkengruppe angegeben. Das Antiserum, das drei Wochen nach der zusätzlichen Immunisierung (10wpv) gewonnen wurde, wurde 1:100 bis 1:10.000 verdünnt. GnRH-I und GnRH-II wurde in einer Konzentration von 250 pmol pro ml für die Verdrängung zugegeben.
2A: Horizontale Achse: Zur Immunisierung genutzte Peptide Vertikale Achse: Prozentsatz des von GnRH-I verdrängten jodierten GnRH-I
2B: Horizontale Achse: Zur Immunisierung genutzte Peptide Vertikale Achse: Prozentsatz des von GnRH-I verdrängten jodierten GnRH-II
3: Prozentualer Anteil von jodiertem GnRH-I, das von GnRH-I (3A) und von GnRH-II (3B) verdrängt wurde für Seren individueller Tiere (jeder Balken steht für ein Tier) nach Immunisierung mit G6k-GnRH-Tandem-Dimer Peptiden mit Alanin-Ersetzungen wie unter jeder Balkengruppe angegeben. Das Antiserum wurde zur Zeit der zusätzlichen Immunisierung (7wpv) gewonnen und wurde im Verhältnis 1:100 bis 1:10.000 verdünnt. GnRH-I und GnRH-II wurden in einer Konzentration von 250 pmol pro ml für die Verdrängung zugegeben. Daten der H2A und W3A Seren sind nicht beingefügt, da die Antikörpertiter zu gering waren, um eine Verdrängung zu messen.
3A: Horizontale Achse: Zur Immunisierung genutzte Peptide Vertikale Achse: Prozentsatz des von GnRH-I verdrängten jodierten GnRH-I
3B: Horizontale Achse: Zur Immunisierung genutzte Peptide Vertikale Achse: Prozentsatz des von GnRH-I verdrängten jodierten GnRH-II
4: Auswertung der Immunkastrationswirkung bei verschiedenen Gruppen von Schweinen, die mit GnRH-Tandem-Dimer Peptiden (62 μg), konjugiert an Ovalbumin und mit Specol als Adjuvans (Hilfsstoff), immunisiert werden. Das Anfangspeptid war ein GnRH Tandem (Cys-OH) Dimer (abgekürzt Cys-OH). Von diesem Peptid wurden alle Alaninscan-Peptide für die Immunisierung genutzt. Die Immunkastrationswirkung wurde auf einer Skala von 1 bis 4 eingestuft (1 = Immunkastration trat nicht auf, 2 = eine Minderheit der Schweine war immunkastriert, 3 = eine Mehrheit der Schweine war immunkastriert, 4 = alle Schweine waren immunkastriert).
5: Prozentualer Anteil von jodiertem GnRH-I, das von GnRH-I (5A) und von GnRH-II (5B) verdrängt wurde für Seren individueller Tiere (jeder Balken steht für ein Tier) nach der Immunisierung mit GnRH-Tandem-Dimer Peptiden mit Alanin-Ersetzungen wie unter jeder Balkengruppe angegeben. Das Antiserum wurde drei Wochen nach der zusätzlichen Immunisierung (10wpv) gewonnen und wurde von 1:100 bis 1:10.000 verdünnt. GnRH-I und GnRH-II wurden in einer Konzentration von 250 pmol pro ml für die Verdrängung zugegeben.
5A: Horizontale Achse: Zur Immunisierung genutzte Peptide Vertikale Achse: Prozentsatz des von GnRH-I verdrängten jodierten GnRH-I
5B: Horizontale Achse: Zur Immunisierung genutzte Peptide Vertikale Achse: Prozentsatz des von GnRH-I verdrängten jodierten GnRH-II
Detaillierte Beschreibung
Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen zumindest zwei gekoppelte GnRH Dekapeptidsequenzen, die aus der Gruppe bestehend aus
*AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#, pEHWRYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#, pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# und pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#
Ausgewählt werden, wobei # Amid und * Acetyl ist. Die erfindungsgemäßen Peptide beziehen sich auf die allgemeine Formel, die durch (SEQ ID NO: 4) gegeben ist, oder durch den folgenden Einbuchstaben-Code:
pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#.
In dieser allgemeinen Formel steht Q für Gln und kann einen Vorgänger X haben, wobei X für ein Zwischengruppe steht. Einige dieser Aminosäuren werden durch andere Aminosäuren ersetzt. In den Formeln ist die Stelle der Substitution fett und unterstrichen dargestellt. Großbuchstaben stehen für linksdrehende Aminosäuren, Kleinbuchstabens stehen für rechtsdrehende Aminosäuren, z.B. K: L-Lys; k: D-Lys. Ihre Immunreaktion wurde anschließend bestimmt nachdem sie an einen Träger, im allgemeinen Ovalbumin, gekoppelt wurden, aber auch andere Träger wie KLH, BSA können verwendet werden.
Es sollte klar sein, dass die Sequenz des GnRH-II Peptids (SEQ ID NO: 2) festlegt, welche der Aminosäuren derart ersetzt werden kann, dass eine auf der Immunreaktion basierende, wirksame Unterscheidung zwischen den Sequenzen GnRH-I und GnRH-II noch möglich ist.
Um zu bestimmen, ob von den erfindungsgemäßen GnRH Impfstoffen hervorgerufene Antikörper zwischen gnRH-I und GnRH-II unterschieden haben, wurde ein Bindungsassay für GnRH Antikörper durchgeführt, also um nachzuweisen, ob Antikörper, die gegen das GnRH-I Tandem-Dimer oder sein Alanin Ersetzungsanalogon hervorgerufen wurden, an GnRH-II binden oder die Bindung an GnRH-II verloren haben. Serumverdünnungen wurden entweder mit GnRH-I, GnRH-II, einem Kontrollpeptid oder keinem Peptid vorinkubiert. Dann wurde jodiertes GnRH-I hinzugegeben, um mit den vorinkubierten Peptide um die Bindung an die Antikörper zu konkurrieren.
Dieses Vorgehen wurde für Serum durchgeführt, das vor und nach der zusätzlichen Immunisierung gewonnen wurde, da die Spezifität der Antikörper nach der zusätzlichen Immunisierung ansteigen kann.
Sofern die erfindungsgemäßen Peptide als Ovalbumin-Konjugate(OVA-Konjugat) genutzt wurden und mit Kontrolleinheiten verglichen wurden, zeigten alle eine Wirksamkeit in der Immunkastration junger männlicher Schweine. Ein Vergleich mit dem bekannten G6k-GnRH Tandem-Dimer OVA Konjugat (siehe Tabelle 1) zeigte, dass die erfindungsgemäßen Peptide vergleichbare oder ähnliche Wirksamkeit zeigten, auch wenn ihre Ähnlichkeit zum körpereigenen Hormon GnRH-I abgenommen hatte. Die erfindungsgemäßen Peptide ergeben eine Immunreaktion, die eine wirksame Unterscheidung zwischen GnRH-I und GnRH-II erlaubt. Diese Peptide ergaben kleine Hoden und niedrige Testosteronspiegel. Im Einzelnen sind die Peptide, die ein niedriges Hodengewicht und einen niedrigen Testosteronspiegel verursachten, R8A, G10A und S4A. Die bevorzugten Peptide, basierend auf der immunologischen Selektivität zwischen GnRH-I und GnRH-II sind S4A und pE1A.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Peptid aus der Gruppe bestehend aus
pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC# (SEQ ID NO: 5),
pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC# (SEQ ID NO: 6) und
pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# (SEQ ID NO: 7) ausgewählt Das Peptid wird stärker bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus
pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC# (SEQ ID NO: 6); und
pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# (SEQ ID NO: 7) ausgewählt.
In den erfindungsgemäßen Peptiden kann die Dimerisierung zum Beispiel über den Carboxylterminus oder den Aminoterminus geschehen. Zwei Tandemeinheiten können zum Beispiel mittels einer Disulfid- oder einer Thioether-Brücke dimerisiert werden. Um die Tandemsequenzen zu dimerisieren, kann das Cys an Position 21 verwendet werden, oder Cys kann synthetisch vor der Glutaminsäure an Position 1 eingeführt werden. Andere Verfahren zur Dimerisierung oder Multimerisierung der GnRH-Tandemeinheiten können auch im Stand der Technik gefunden werden. Wenn Cys an Position 21 an der Dimerisierung beteiligt ist und dementsprechend nicht für die Kopplung verfügbar ist, ist es ebenso möglich eine andere Aminosäure des Tandems für die Kopplung zu verwenden. Wenn die Dimerisierung oder Multimerisierung zu einem Verlust von zugänglichen Stellen führt, an die eine Trägerverbindung konjugiert werden kann, ist es ausreichend, die Auswahl der Austausch-Aminosäuren auf solche Aminosäure mit einer geeigneten Seitenkette einzuschränken. Solch eine Austausch-Aminosäure kann z.B. L oder D-Lys, L oder D-Glu oder eine andere Aminosäure sein, die eine Seitenkette enthält, die die Anbindung an eine Trägerverbindung erlaubt. Sowohl die L- als auch die D-Substitution sind getestet worden und zeigen den gleichen Effekt.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung bereit, die ein Peptid umfasst, das in eine immunogene Form gebracht wurde. Dem Fachmann sind verschieden Verfahren bekannt, mit denen die immunogene Form einer Substanz hergestellt werden kann die selbst nicht immunogen ist. Eine Möglichkeit besteht darin, ein erfindungsgemäßes Peptid an ein geeignetes Trägerprotein zu koppeln. Ein geeignetes Protein ist Ovalbumin, KLH oder BSA. In einem Tandempeptid kann ein Cysten am N- oder C-Terminus für eine chemische Kopplung geeignet sein. In dem Tandemdimer-Peptid kann die Kopplung ebenfalls über die einfache oder modifizierte Seitenkette von D-Lysin oder D-Glutamin erfolgen oder aber jeder modifizerter Aminosäure, die eine Aminosäure in der Peptidsequenz ersetzt. Geeignete Kopplungsmethoden und Trägerproteine sind den Personen mit gewöhnlicher Fachkunde in diesem Gebiet wohl bekannt.
Entsprechend der Erfindung gibt es eine bevorzugte Zusammensetzung, die dadurch charakterisiert ist, dass sie ein immunogenes Konjugat eines Proteins, wie z.B. Ovalbumin, mit einem Peptid oder einer Peptidzusammensetzung umfasst.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in der Form eines Impfstoffes genutzt werden. Zu diesem Zweck kann die Zusammensetzung in einer Form hergestellt werden, die zur Verabreichung geeignet ist. Durch die Gabe eines erfindungsgemäßen Impfstoffes wird eine Immunreaktion auf GnRH hervorgerufen, vorzugsweise eine Immunreaktion auf GnRH-I.
Daher stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Immunisierung eines Säugetiers gegen GnRH-I, durch die Impfung des Säugetiers mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung mittels eines erfindungsgemäßen Impfstoffes ein Verfahren zur selektiven Immunisierung eines Säugetiers gegen GnRH-I zur Verfügung.
Natürlich kann das erfindungsgemäße Impfpräparat mit mindestens einem Adjuvans (Hilfsstoff) kombiniert werden. Geeignete Adjuvantien sind dem Fachmann bekannt. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Adjuvans (Hilfsstoff) kann Specol sein oder eine doppelte Ölemulsion, aber andere Adjuvantien (Hilfsstoffe), die keine oder nur milde Nebenwirkungen hervorrufen, können genauso gut verwendet werden. Die Erfindung kann in Verfahren zur Immunisierung von Individuen gegen GnRH-I verwendet werden, wobei die Individuen aus einer großen Vielfalt von Wirbeltieren, und vorzugsweise Säugetieren, ausgewählt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Impfstoff in einer Einzeldosis verabreicht werden, was die gleiche Wirkung hat wie die derzeit bekannten Impfstoffe, welche in der Form von zwei Dosen verabreicht werden müssen. Immunisierung gegen GnRH-I, vorzugsweise selektiv, könnte z.B. zur Sterilisierung von beispielsweise kleinen Haustieren, wie männlichen und weiblichen Katzen und Hunden verwendet werden, oder für die Behandlung von Aggressivität bei männlichen Hunden und Stieren. Andere vorstellbare Gründe zur Immunisierung gegen GnRH-I mit der vorliegenden Erfindung sind die Verhinderung von Läufigkeit bei weiblichen Tieren, wie Hunden, Katzen und Kühen, sowie die Verhinderung oder Behandlung von Ruhelosigkeit bei Tieren, die für die Schlachtung gemästet werden. In der medizinischen Versorgung des Menschen kann die Immunisierung gegen GnRH, vorzugsweise selektiv entweder gegen GnRH-I oder GnRH-II, genutzt werden zur Behandlung von Prostatakrebs und Brustkrebs und, wenn gefordert, bei der Behandlung einiger Formen von Hypophysenkarzinomen.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Verbesserung der Schlachtqualität von Schweinen, wobei die Schweine mit einem solchen erfindungsgemäßen Impfstoffpräparat geimpft werden. Die Erfindung wird im folgenden experimentellen Teil erläutert.
I. Immunkastration von Schweinen
Materialien und Methoden
Materialien
Acetonitril war von Gradientenqualität für HPLC-S, N-Methylpyrrolidon (NMP), Diisopropylethylamin (DIEA), Dimethylformamid (DMF), Trifluoressigsäure (TFA) und Piperidin waren von Peptidsytnese-Qualität und wurden alle von Biosolve (Valkenswaard, NL) bezogen. N- Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-Tetramethyluronium Hexafluorphosphat (HBTU) wurde von Richelieu Biotechnologies Inc. (Hamon, Kanada) bezogen. O-(Benzotriazol-1-yl)tris-pyrrolidinophosphonium-hexafluorphosphat (PyBOP) wurde von Novabiochem (Laufelfingen, Schweiz) bezogen. Thioanisol (TA), Ethandithiol (EDT), Dimethylsulfoxid (DMSO), Pentan und Dimethylaminopyridin (DMAP) waren von pro-analysis Qualität und wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Diethylether wurde vor dem Gebrauch über eine Säule mit aktiviertem, basischem Aluminiumoxid gereinigt. Aminosäurenderivate und Harze wurden von Bachem Feinchemicalien AG (Bubendorf, Schweiz) bezogen.
Multiple Peptidsynthese (Multiple peptide synthesys (MPS) Ein Hamilton Microlab 2200 wurde programmiert, um Waschlösemittel und Reagenzien an ein Rack mit 40 einzelnen 4 ml Filtersäulen zu liefern, die 30 ml Harz für die Peptidsynthese enthielten. Die Flüssigkeit wurde nach jedem Syntheseschritt mittels Vakuum aus den Filtersäulen abgezogen. Der Kopplungszyklus basierte auf Fmoc-Chemie unter Nutzung von Doppelkopplungsschritten:

1. NMP Waschung (1ml)
2. 30% (v/v) Piperidin/NMP (3 min, 0,5 ml)
3. 30% (v/v) Piperidin/NMP (17 min, 0,5 ml)
4. NMP Waschung (5 × 1 ml)
5. Doppelte Kopplung (2 × 30 min)
6. NMP Waschung (2 × 1 ml)

Kopplungsschritt: Fmoc-Aminosäure in NMP (0,4 M, 0,25 ml) HBTU/HOBt (0,45 M, 0,22 ml) in DMP, und DIEA (2 M, 0,2 ml) in NMP wurden in das Reaktionsgefäß überführt und konnten für 30-50 min reagieren. Die Reaktionsmischung wurde abgezogen und der Kopplungsvorgang wurde einmal wiederholt.
Nach der Kopplung der letzten Aminosäure wurde die Fmoc-Gruppe mit 30% Piperidin/NMP abgespaltet, die Peptide wurden gewaschen, mittels NMP/Essigsäureanhydrid/DIEA 10/1/0,2 acetyliert, wiederum gewaschen und getrocknet. Die Spaltung der Schutzgruppen sowie die Abspaltung der Peptide erfolgte in einer Mischung von 1,5 ml TFA/Phenol/TA/Wasser/EDT 10/0,75/0,5/0,5/0,25 (Reagenz K). Die Abspaltungsmischung wurde filtriert, das Harz wurde mit 0,5 ml TFA gewaschen und das Peptid wurde durch den Zusatz von 13 ml Pentan/Diethylether 1/1 ausgefällt. Nach Zentrifugation wurde das Fällungsprodukt wiederum mit Pentan/Diethylether extrahiert. Das Fällungsprodukt wurde getrocknet, in ACN/Wasser 1/1 aufgelöst und gefriergetrocknet. Dieses Vorgehen ergibt, abhängig vom Molekulargewicht, 25 bis 70 mg des Peptids.
Die synthetisierten Peptidsequenzen werden im Einbuchstaben-Aminosäurencode in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Aminosäuresequenzen der synthetisierten Peptide im Einbuchstaben-Code

pE=Pyroglutaminsäure; *=Acetyl; #=Amid; k=d-Lysin; G6k=Gly an Position 6 der ursprünglichen GnRH-Sequenz ersetzt durch d-Lysin
¹ nur zu Erläuterungszwecken

Analytische HPLC
Zur Analyse der Peptide nutzten wir ein LC-MS (Elektrospray) System, das aus zwei Waters-Pumpen Modell 510, einer Waters-Gradientensteuerung Modell 680, einem Waters WISP 712 Autoinjektor und einem Waters 991 Photodiodenarraydetektor bestand. Das Massenspektrometer war ein Micromass Quattro II sq, das im positiven Ionenmodus verwendet wurde. Die Produkte wurden analysiert in einem linearen Gradienten von 10% ACN/Wasser mit 0,05% TFA zu 70% ACN/Wasser mit 0,05% TFA in 30 min auf einer Waters Delta Pak C18-100Å (3,9 × 150 mm, 5 mm) Säule bei 1 ml/min bei 215 nm. Alle Produkte waren 40-70% rein in Bezug auf die Peakfläche.
Dimerisierung
Die Rohprodukte wurden durch Auflösung der Produkte in 20% DMSO in Wasser dimerisiert. Der pH-Wert wurde mit 1% NH₄HCO₃ auf 5-6 eingestellt, wobei eine klare Lösung erhalten wurde. Die Korrektur des pH-Werts wurde mit 1% Essigsäure durchgeführt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für mindestens 5 h, wurden die Produkte bei –20°C bis zur Reinigung gelagert.
Präparative HPLC
Die Peptidreinigungen wurden mit einem Waters Prep 4000 flüssigkeitschromatographen durchgeführt, der mit mit einem Waters RCM Modul ausgerüstet war, sowie mit zwei PrepPak Cartridges plus einer Guard Cartridge (40 × 210mm oder 25 × 210mm), die mit delta-Pak C18-100Å (15 mm) Material gefüllt waren. Im Allgemeinen wurden die Reinigungen mit Hilfe der gleichen Eluenten wie bei der analytischen HPLC durchgeführt, aber bei einer Gradientengeschwindigkeit von 0,5% ACN/min und einer Flussrate von 40 oder 100 ml/min. Peptide wurden bei 215-230 nm über einen Waters 486 Spektrophotometers mit einer preparativen Meßzelle nachgewiesen. Die Peptide wurden gefriergetrocknet und die Reinheitsbestimmung ergab einen Wert von mehr als 90%.
Konjugat Herstellung
Zur Konjugation mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid ("EDC") an Hühnereialbumin ("OVA") wurde eine gleiche Einwaage des Peptids und des Trägerproteins getrennt in milliQ-Wasser aufgelöst und beide Lösungen wurden gut gemischt. Dann wurde ein zehnfacher Überschuss, auf Basis von Gewichtsäquivalenten, von EDC in milliQ-Wasser gelöst. Daraufhin wurde diese Lösung langsam zu der Peptid/OVA Lösung unter dauerndem Rühren hinzu gegeben. Der pH-Wert der sich ergebenden Lösung ist 5. Nach 6 Stunden langsamen Schüttelns wurde das Produkt für zwei Tage gegen einen 300-fachen Überschuss von milliQ-Wasser dialysiert (Molekulargewichtsausschlußgrenze 10.000 Da). Das Wasser wurde zweimal am Tag erneuert. Die Beladung wurde durch eine vergleichende Aminosäurenanalyse von Konjugat und Trägerprotein berechnet. Nach Hydrolyse in einer Pico-Tag Workstation unter Verwendung von 6N HCl bei 150 °C für eine 1h, und Derivatisierung mit Phenylisothiocyanat wurde die Aminosäurenanalyse mit einem Waters Pico-Tag System durchgeführt.
Gemäß der Aminosäurenanalyse enthielten die Konjugate zwischen 0,3 und 0,5 mg des Peptids pro mg des Trägerproteins, mit Ausnahme des P9A-G6k-GnRH-tandem-Dimer-Konjugats, das nur 0,16 mg Peptid pro mg Ovalbumin enthielt.
Das G6k-GnRH-Tandem-Dimer OVA Konjugat wird abgekürzt mit G6k-TD. Die Konjugate mit Alaninsubstitutionen werden abgekürzt durch die Aminosäure in der ursprünglichen GnRH-Sequenz, die ersetzt wurde, ihre Position und einem A für die Alanin-Ersetzung. Das pE1A-G6k-GnRH-Tandem-Dimer OVA-Konjugat ist zum Beispiel pE1A.
Emulsionsherstellung
Specol (Spezielle Ölphase, ID-DLO, Lelystad, Niederlande), bestehend aus zwei Detergentien in einem leichten Mineralöl, wurde als Ölphase genutzt (Bokhout et al., 1981). Die Wasser in Öl (WIO) Emulsionen wurden in einem Ultra Turrax (Janke und Kunkel, Staufen, Deutschland) mit einem Rührstab hergestellt. Die Ölphase Specol (5 Teile v/v) wurde in einem 25 ml Glasgefäß vorgelegt, und die Wasserphase (4 Teile v/v) mit dem Konjugat in milliQ-Wasser wurde langsam hinzu gegeben, während die Emulsion gerührt wurde. Nach der Zugabe der Wasserphase wurde die Emulsion für eine halbe Minute bei derselben Rotationsgeschwindigkeit (15.000 rpm) gerührt. Die Emulsionen wurden zur Überprüfung der Stabilität über Nacht bei 4 °C gelagert und den Tieren am nächsten Tag verabreicht.
Tiere
Männliche Schweine, ungefähr im Alter von 10 Wochen, wurden in diesem Experiment verwendet. Die durch Kreuzung erzeugten Ferkel wurden in Koben untergebracht, die zur Hälfte mit einem Lattenrost ausgestattet waren, und ihnen wurde freier Zugang zu Futter und Wasser gewährt.
Immunisierung
Die Ferkel wurden der Behandlung zufällig zugeteilt, 6 oder 7 Ferkel pro Behandlung. Allen Tieren wurden 2 ml Emulsion mit dem dimerisierten Tandem GnRH Konjugat (d.h. 62 μg Peptide) oder eine Emulsion ohne Antigen injiziert. Die Injektionen wurden zu Beginn des Experiments (Tag 0) und 7 Wochen später (7wpv) intramuskulär in den Nacken verabreicht. Dreizehn Wochen nach der anfänglichen Immunisierung (13wpv) wurden alle Tiere geschlachtet.
Messungen und Blutproben
Die Tiere wurden an den Tagen 0 und 7 und 13 wpv gewogen. Die Hodengröße wurde durch die Messung der Hodenlänge mit einer Schublehre an Tagen 0 und 7 und nach 10 und 13 Wochen gemessen. Die Hodengröße wurde als Durchschnitt beider Testikel festgehalten.
Blutproben wurden durch Punktierung der Vena jugularis an den gleichen Tagen entnommen, an denen die Hodengröße gemessen wurde, sowie 4 Wochen nach der Anfangsimmunisierung. Die Blutproben wurde über Nacht bei 4°C gelagert und am nächsten Tag wurde das Serum mittels Zentrifugation (1500 × g, 15 min) gewonnen. Die Serumproben wurden bis zur Analyse bei –20°C gelagert.
Evaluation nach der Schlachtung
Nach der Schlachtung wurden die Hoden entfernt, und nach der Entfernung der Nebenhoden gewogen. Das Hodengewicht wurde als Durchschnitt beider Testikel festgehalten.
Peptid Antikörper
Die Antikörper gegen die Peptide und zur Immunisierung wurden über einen ELISA nachgewiesen. Die Peptide wurden in den Kavitäten Mikrotitrierplatte mit Glutardialdehyd (GDA) immobilisiert. GDA wurde auf die Oberflächen der Kavitäten durch Inkubation mit 0,2% GDA in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 5) für vier Stunden bei Zimmertemperatur aufgetragen. Die Platten wurden dreimal für 10 Minuten mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8) ausgewaschen. Ein Mikrogramm Peptid in 100 ml Phosphatpuffer (0,1 M; pH 8) wurden pro ausgewaschener Kavität durch Inkubation für 3 Stunden bei 37°C immobilisiert. Die Platten wurden bis zum Gebrauch bei –20°C gelagert. Die aufgetauten Platten wurden dreimal für 10 Minuten mit milli-Q Wasser gewaschen, welches 8,2 g NaCl, 1,15 g Na₂PO₄·2H₂O, 0,20 g NaH₂PO₄·2H₂O und 5 ml einer 10%-igen Tween 80 Lösung in Wasser pro Liter Wasser enthielt.
Serielle Serumverdünnungen der Antipetidseren wurden mit den immobilisierten Peptiden für eine Stunde bei 25°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für 10 Minuten wurde Goat-Anti-Pig IgG, gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase (Dako, Glastrup, Dänemark) als zweiter Antikörper für eine Stunde zugegeben und ABTS (Boehringer, Mannheim, Deutschland) ((250 ml (2 g/100 ml) in 10 ml Substratpuffer, zu welchem 20 ml H₂O₂ (3%ige Lösung)) wurde als Substrat benutzt. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.
GnRH Antikörper
Die Antikörper gegen GnRH wurden nachgewiesen, wie von Meloen et al. beschreiben (Vaccine 12, 741-746 (1994). Serielle Verdünnungen der Schweineantiseren wurde die Möglichkeit gegeben an ¹²⁵J-GnRH zu binden.
Testosteron
Die Testosteronspiegel wurden mit einem Coat-a-Count Kit bestimmt, der von DPC Laboratorien, Los Angeles, Kalifornien, bezogen wurde.
Ergebnisse
Hodengröße und Hodengewicht
Sieben Wochen nach der ersten Immunisierung konnten bereits durch die Messung der Hodengröße erste Immunkastrationseffekte nachgewiesen werden. Drei Behandlungen (R8A, G10A und G6k-TD) zeigten kaum irgendeine Steigerung (< 10 mm) der durchschnittlichen Hodengröße zur Zeit der zusätzlichen Immunisierung. Diese Behandlungen waren erfolgreich bei einem Schlachtgewicht der Hoden von 70 g oder weniger. Andere Behandlungen, die in Bezug auf niedriges Hodengewicht wirksam waren, waren pE1A und S4A, während in der Gruppe Y5A, L7A und P9A, 2, 1 bzw. 1 Tier nicht auf die Immunisierung (Tabelle 2) reagierten. Das individuelle Hodengewicht der immunkastrierten Tiere überstieg nicht 70 Gramm, was in einem klaren Unterschied zwischen immunkastrierten und nicht immunkastrierten Tieren resultierte.
Tabelle 2: Wirksamkeit der verschiedenen Behandlungen gemäß Hodengewicht (g)
Antikörperreaktion
Durschnittliche Antikörpertiter gegen die für die Immunisierung verwendeten Peptide werden in Tabelle 3 angegeben. Durchschnittliche Antikörpertiter von Schweinen, die mit H2A und P9A behandelt wurden, sind niedriger als die Peptidantikörpertiter bei anderen Behandlungen.
Die Antikörpertiter einzelner Tiere gegen die verschiedenen Peptide reichten von 2 bis 4. Innerhalb einer Behandlung zeigten Tiere, die nicht immunkastriert waren, den geringsten Antikörpertiter. Mit H2A und W3A behandelte Tiere waren nicht immunkastriert, aber signifikante Antipetidetiter waren vorhanden.
Prozentsätze der GnRH Antikörper Bindung waren bei einer Serumverdünnung von 1/2000 nicht nachweisbar oder gering bei den H2A und W3A Gruppen. Allerdings waren bei einer Serumverdünnung von 1/200 Antikörper in den Seren aller Tiere der Gruppe H2A nachweisbar sowie bei drei Tieren aus der Gruppe W3A. Tiere mit einem niedrigen durchschnittlichen Antikörpertiter waren nicht immunkastriert. Hohe Antikörpertiter ergaben immer erfolgreich kastrierte Tiere. Das Testikelgewicht der Tiere mit mittleren Antikörpertitern reichte von 15 bis 300 Gramm.
Durchschnittliche GnRH Antikörpertiter pro Behandlung zeigten eine klare Relation zum Hodengewicht (Median) pro Behandlung (Tabelle 3).
Testosteron
Die Testosteronspiegel aller erfolgreich behandelten Tiere waren niedrig und sanken nach der zweiten Immunisierung. Allerdings zeigte eine Mehrheit (n=31) der Tiere einen Kastrationseffekt bereits vier Wochen nach der ersten Immunisierung, indem sie einen nicht nachweisbaren Testosteronspiegel aufwiesen. Das Hodengewicht dieser Tieere variierte von 8-36 Gramm.
Die Mehrheit der Tiere war also wirksam nach der Verabreichung einer einzelnen Dosis immunisiert.
Obwohl im Zeitpunkt der Schlachtung die Testosteronspiegel bei allen immunkastierten Tieren niedrig waren, hatten zwei Tiere mit Hodengewichten von 65 und 70 Gramm signifikante Serum Testosteronspiegel von 3,8 bzw. 1,18 pmol/ml.
Die Peptide, die ein niedriges Hodengewicht in Verbindung mit nicht nachweisbaren Testosteronspiegeln ergaben, werden als die wirksamsten Peptide für die Immunkastration von Schweinen angesehen. Diese Peptide waren S4A, R8A und G10A.
Die Testosteronspiegel im Zeitpunkt der Schlachtung schwankten bei den Tieren, die nicht immunkastriert worden waren, zwischen 0,46 und 48,91 pmol/ml. Tabelle 3: Ergebnis verschiedener Behandlungen auf das durchschnittliche Hodengewicht, Peptidantikörpertiter, Prozentsatz der GnRH Antikörperbindung und LH sowie Testosteronspiegel im Serum

wpv = weeks post vaccination (= Wochen nach der Impfung)
n.d. = not detectable (= nicht nachweisbar)

II. Ersatz von D-Aminosäuren durch L-Aminosäuren
D-Lysin (k) an den Positionen 6, 16, 27 und 37 in einem Tandem-Dimer wird durch L-Lysine (K) ersetzt und das entstehende Peptid wird getestet (Tabelle 4).
G6k-GnRH-Tandem: pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC# (SEQ ID NO: 9)
G6K-GnRH-Tandem: pEHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC# (SEQ ID NO: 14) Tabelle 4

n.d. = not detectable (= nicht nachweisbar)

Das Ersetzen von D-Lysine durch L-Lysine ändert die Wirksamkeit des Impfstoffantigens nicht.
III. Unterscheidung zwischen GnRH-I und GnRH-II
Ein kompetitiver Radioimmunassay zur Analyse der GnRH Antikörperbindung wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die gegen das G6k-GnRH-Tandem (SEQ ID NO:9)-Dimerpeptid oder Gegen dessen Alaninersetzungsanaloga entstandenen Antikörpersich an GnRH-II binden oder keine Bindung an GnRH-II zeigen. Serumverdünnungen wurden vorab mit entweder GnRH-I, GnRH-II, einem Kontrollpeptid oder keinem Peptid inkubiert. Dann wurde jodiertes GnRH-I zugegeben, um mit den vorab zugegebenen Peptiden um die Bindung an die Antikörper zu konkurrieren.
Diese Prozedur wurde für Serum durchgeführt, das vor und nach der Booster-Immunisierung gesammelt wurde, da die Spezifizität der Antikörper nach der Booster-Immunisierung aufgrund der Antikörpermaturierung steigen könnte.
Materialien und Methoden
Serumproben der 7 wpv und der 10 wpv Entnahme (3 Wochen nach der Booster-Immunisierung) wurden 1/100-1/10.000 in PBS mit 0,4% BSA (Verdünnungspuffer) verdünnt. 50 μl der Serumverdünnung wurden in Mikrotiterplatten gegeben und 25 μl Peptidlösung (0; 0,25; 2,5 sowie 25 mol Peptid im Verdünnungspuffer pro Kavität) wurden hinzu gegeben. Diese Mischung wurde für 24 h bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 25 μl jodiertes GnRH (ungefähr 13.000 cpm) hinzu gegeben und nach einer Übernachtlagerung (4 °C) wurde das ungebundene Peptid mit Holzkohle vom gebundenen Peptid separiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen, gezählt und der Prozentsatz des an die Antikörper gebundenen jodierten GnRH berechnet.
Ergebnisse
Die Bindung von Antikörpern an jodiertes GnRH-I wurde für alle Seren aller Behandlungen gezeigt außer für H2A und W3A Seren, die 7 wpv gewonnen wurden. Die Kompetition mit GnRH-I resultierte in einer dramatischen Abnahme der Bindung von jodiertem GnRH-I (siehe 1), wobei die Verdrängung von GnRH-I durch GnRH-II hoch variabel war. Wie erwartet band sich keines der Antiseren an die Kontrollpeptide.
Für die 10 wpv Seren: In den Seren nahezu aller Behandlungen, wurde das jodierte GnRH-I von GnRH-I zu mehr als 80% verdrängt (2A). Die Kompetition von GnRH-II zu jodiertem GnRH-I um die Bindung an Antikörper resultierte in vollständiger oder teilweiser Verdrängung des jodierten GnRH-I in nahezu allen Seren der R8A, P9A, G10A und G6k-TD Behandlungen und in der Hälfte der Seren von der Behandlungen mit Y5A und L7A (2B). Allerdings ließen die Antikörper im Grunde aller Tiere der pE1A, H2A, W3A und S4A Gruppen eine Bindung an GnRH-II vollständig vermissen und waren somit spezifisch für GnRH-I.
Die Ergebnisse der Verdrängungsstudien der Seren vor der Booster-Immunisierung (7 wpv) waren verschieden von denen der 10 wpv Seren. Wiederum erkannten die Seren aller Behandlungen (bis auf H2A und W3A, aufgrund der niedrigen Antikörpertiter) GnRH-I, wie es durch die Verdrängung von jodiertem GnRH-I durch GnRH-I (3A) gezeigt wurde. Im Gegensatz aber zu den 10 wpv Seren (2) erkannte eine Mehrheit der Seren aus allen Behandlungen, einschließlich pE1A und S4A, GnRH-II (3B). Daher sind 7 wpv Seren der Gruppen pE1A und S4A nicht spezifisch für GnRh-I, aber die Spezifizität für GnRH-I und nicht GnRH-II ist drei Wochen nach der zusätzlichen Immunisierung (10 wpv) voll ausgeprägt.
Die Ergebnisse zur Antikörperbindung, die man von den Seren vor der Booster-Immunisierung erhielt, waren verschieden von denen der 10 wpv Seren. Die Antiseren der pE1A und S4A Behandlungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet GnRH-I oder GnRH-II zu erkennen (siehe 3). Für beide Peptide banden die 10 wpv Seren von 6 aus 7 Tieren nicht an GnRH-II. Von den pE1A Seren, die vor der Booster-Immunisierung gewonnen wurden, zeigten 4 von 7 Tieren eine Bindung an GnRH-II. Zwei Seren erkannten GnRH-II nicht und ein Serum zeigte keine Bindung an jodiertes GnRH. Die Ergebnisse der S4A Seren, die vor der Booster-Immunisierung gewonnen wurden, stehen im Widerspruch zu den Ergebnissen der 10 wpv Seren. Die vor der Booster-Immunisierung gewonnenen Seren aller Tiere der S4A Gruppe erkannten GnRH-II, wobei die Hemmung der Bindungskapazität für jodiertes GnRH sowohl für GnRH-I als auch für GnRH-II ähnlich war.
IV. Immunkastration von Schweinen mit GnRH-Tandem-Dimer Paaren
In Ähnlichkeit zum Alanin-Scan, wie er im Beispiel beschrieben wurde, wurden Peptide des GnRH-Tandem Peptid mit Alanin Ersetzungen synthetisiert (Tabelle 5). Die Peptide wurden dimerisiert, gereinigt und an OVA konjugiert wie früher beschrieben. Tabelle 5: Aminosäurensequenz der Peptide

pE = Pyroglutaminsäure
* = Acetyl
# = Amid
– = die Aminosäure an dieser Position unterscheidet sich nicht von der Aminosäure an der gleichen Position im GnRH-Tandem
1: nur zu Erläuterungszwecken

Vier oder fünf Schweine pro Gruppe wurden mit 62 μg Peptidäquivalent der Konjugate im Specol-Adjuvans (Hilfsstoff) immunisiert.
Die Immunkastrationswirkung der Konjugate ist in 4 dargestellt.
Die gegen die für die Immunisierung verwendeten Peptide gerichteten Antikörpertiter waren niedrig für diemit pE1A, H2A und R8A behandelten Schweine, während viel Antipeptid-Antikörper für die W3A, S4A, Y5A und G10A Gruppen festgestellt wurde. Die Antikörpertiter gegen GnRH-I waren in Übereinstimmung mit den Antipeptid-Antikörpertitern, mit Ausnahme der Antikörpertiter der Schweine, die mit W3A behandelt wurden: In diesen Tieren wurden viel Antipeptid-Antikörper festgellt, die Bindungskapazität an jodiertes GnRH aber wurde als niedrig gemessen.
V. Unterscheidung zwischen GnRH-I und GnRH-II bei GnRH-Tandem-Dimer Antiseren
Die Antikörperbindung von jodiertem GnRH in einem Radioimmunassay wurde für das 10 wpv Serum (verdünnt 1/100-1/10.000) von allen Tieren beobachtet, die mit den GnRH Tandem-Dimer Peptiden mit Alanin-Ersetzungen behandelt wurden. Die Kompetition mit GnRH-I resultierte in einer dramatischen Abnahme der Bindung von jodiertem GnRH-I. In den Seren nahezu aller Behandlunge wurde jodiertes GnRH-I durch GnRH-I zu mehr als 80% verdrängt (5A).
Die Verdrängung von jodiertem GnRH-I durch GnRH-II war stark variabel zwischen den Gruppen. Es ergab sich eine vollständige oder teilweise Verdrängung des jodierten GnRH-I in nahezu allen Seren von Y5A, L7A, R8A, P9A und TD Behandlungen (5B, wobei für die meisten Seren der übrigen Behandlungen nur teilweise Verdrängung von jodiertem GnRH-I durch GnRH-II festgestellt wurde oder auch überhaupt keine Verdrängung.
Sequenzliste

Claims

Peptid, das mindestens zwei miteinander gekoppelte GnRH-Dekapeptid-Sequenzen umfasst, die ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus *AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#, pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#, pEHWSYkLRPGQHWSYkARPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# und pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# besteht, wobei # ein Amid ist und * ein Acetylrest.
Peptid nach Anspruch 1, welches eine vom Immunsystem ausgelöste Immunantwort ermöglicht, die es erlaubt, zwischen verschiedenen Arten von GnRH zu unterscheiden, vorzugsweise zwischen GnRH-I und GnRH-II.
Peptid nach Anspruch 1, welches einen Testosteronspiegel gewährleistet, der nach einer Impfung mit einer geeigneten Dosierung des Peptids im Wesentlichen nicht nachweisbar ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid ausgewählt wurde aus einer Gruppe, die aus pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC# und pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# und besteht, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC# und pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# besteht, wobei # ein Amid ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das dimerisiert oder multimerisiert ist.
Peptid nach Anspruch 5, welches konjugiert mit einer Trägerverbindung ist.
Peptid nach Anspruch 6, wobei die Trägerverbindung ein Protein ist.
Impfstoff, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Impfstoff nach Anspruch 8, welcher zusätzlich einen Hilfsstoff umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 9, wobei der Hilfsstoff eine Ölphase einer Wasser-in-Öl-Emulsion oder eine doppelte Ölemulsion ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 8 bis 10, der bei Gabe einer einzelnen Dosis ausreichend aktiv ist für die wesentliche Immuno-Kastration von Schweinen.
Antikörper gegen GnRH-II, erhältlich durch ein Verfahren, das einen Schritt umfasst, in dem eine Immunreaktion ausgelöst wird auf ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Impfstoff gegen GnRH-II, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Zusammensetzung für die Behandlung von Prostatakrebs, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Nutzung als Medikament.
Verwendung eines Peptids, wie es in den Ansprüchen 1 bis 7 definiert wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Prostatakrebs.