DE69723055T2

DE69723055T2 - Biologisch aktive stoffe insbesondere peptide, die einen verstärkenden effekt auf die biologische aktivität des wachstumshormons haben

Info

Publication number: DE69723055T2
Application number: DE69723055T
Authority: DE
Inventors: Daniel Portetelle; Robert Renaville
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-22
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2017-01-23
Also published as: AU1449297A; EP0877807B1; CN1209841A; AU722064B2; CA2243845A1; CN1130459C; ZA97614B; EP0877807A1; BR9707067A; WO1997027298A1; DE69723055D1; AR005559A1; JP2000509964A; CA2243845C; FR2744123B1; FR2744123A1; NZ326401A; ES2202571T3; ATE243749T1; US6455049B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein biologisch aktives Molekül vom Typ eines Peptids, das, wenn es kovalent an bestimmte Trägerpeptide und/oder bestimmte Adjuvantien gebunden ist, in vivo einen verstärkenden Effekt der biologischen Aktivität des Wachstumshormons GH hervorrufen kann.
Die Verstärkung der biologischen Aktivität des GH durch Antikörper, genauer der somatogenischen Aktivität, wurde zuerst von Holder et al. (1980) beobachtet, die ihre Studien auf der Messung des Einbaus von radioaktivem Sulfat in Rippenknorpel, sowie auf der Gewichtszunahme, die durch das GH bei Zwergmäusen vom Typ Snell hervorgerufen wird, basierten.
Drei Studien, basierend auf den gleichen Parametern, durchgeführt von Holder et al. (1985) und Aston et al. (1986 und 1987), zeigten, dass die Mehrheit der untersuchten Antikörper einen verstärkenden Effekt auf die biologische Wirkung des GH besaßen. Die Arbeiten von Wallis et al. (1987) bestätigten das Verstärkungsphänomen der somatogenischen Aktivität des Rinderwachstumshormons durch Anti-GH-Antikörper. Sie basierten ihre Studien auf der Messung des Plasmagehalts an IGF-1 (Insulinwachstumsfaktor) und der Gewichtszunahme von Ratten, deren Hypophyse ausgeschaltet wurde, der Rasse Wistar.
Insbesondere beschreibt die Europäische Patentanmeldung EP 284 406 (COOPERS ANIMAL HEALTH LTD) ein Peptid, das eine Homologie der Primärstruktur mit einer fortlaufenden Sequenz der Aminosäurereste des Wachstumshormons im Bereich, der sich zwischen den Positionen 35 bis 53 verteilt, oder von Peptiden mit Kreuzreaktivität besitzt, wobei das Peptid in einer antigenischen Zusammensetzung verwendet werden kann, um die Effekte des Wachstumshormons bei einem Wirbeltier zu verstärken. Die von Aston et al. beschriebenen Experimente entsprechen einer Verabreichung in vivo von Antikörpern, entweder als Seren, wenn sie aus dem Schaf gewonnen werden, oder als monoclonale Antikörper, und diese passive Verabreichung von Antikörpern gegen das Peptid oder gegen das natürliche Hormon, natives GH, komplexiert an das Hormon, erhöht seine biologische Aktivität. Es wurde nicht bewiesen, dass das Peptid 35–53 des Wachstumshormons im Rahmen einer aktiven Immunisierung verwendet werden kann.
Jüngste Arbeiten mit verstärkenden Antikörpern scheinen anzudeuten, dass, wenn das GH sich allein auf Hepatocyten fixiert, sich der Komplex GH-MAb oder der Komplex, gebildet aus dem Hormon gemäß der Erfindung und einem verstärkenden monoclonalen Antikörper, bevorzugt auf sinusoidalen Zellen (Kupffer-Zellen) fixiert (Tans et al. (1994)). Folglich kann man seitdem annehmen, dass die Synthese von IGF-1 und IGF BP3 durch Hepatocyten (Massart et al. (1993)) ebenso durch die Wirkung der Komplexe auf diese sinusoidalen Zellen erhöht werden könnte.
Es ist in der Europäischen Patentanmeldung EP 137 234 (THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED) beschrieben, dass bestimmte Antikörper des Wachstumshormons seine Aktivität verstärken können, während man weiss, dass im allgemeinen solche Antikörper, zumindest in vivo, die Tendenz hatten, seiner Wirkung entgegenzuwirken. Solche Antikörper können unter anderem in situ durch „Impfung" des Wirtstieres mit einem spezifischen Fragment des Wachstumshormons hergestellt werden, so dass eine Klasse polyclonaler Antikörper mit eingeschränkter Spezifität erzeugt wird, die die Aktivität des endogenen Hormons verstärken könnte.
In der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass bestimmte Sequenzen des Wachstumshormons, assoziiert an ein Trägermolekül und/oder ein Adjuvans, die Aktivität des Hormons bei einem Wirbeltier verstärken können. Die Entdeckung des Peptidfragments der vorliegenden Endung ist das Ergebnis einer Suche, die zuerst auf der Auswahl monoclonaler Antikörper (MAb) der IgG-Klasse basierte, deren Reaktivitäten gegen das Wachstumshormon, insbesondere des Rinderwachstumshormons, am meisten erhöht zu sein schienen. Nach Reinigung der MAb wurden vier Typen erhalten. Der Effekt letzterer auf die plasmatische IGF-1-Antwort, induziert durch eine einzelne Injektion an bGH bei der unreifen hypophysektomierten Ratte, wurde von Massart et al. (1993) getestet. Man konnte schließlich ein Epitop identifizieren, das von einem verstärkenden Antikörper erkannt wird, genannt 2H4, wobei dieser Antikörper eine Peptidsequenz in der Helix Nr. 3 des nativen Wachstumshormons spezifisch erkennen kann.
Die ganze Referenz der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur des GH bezieht sich auf die in Scanes C. G. et al. (1995) beschriebene.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Mittel zu liefern, das die Verstärkung des Wachstumshormons GH auf effiziente Art und länger andauernd als die Mittel des früheren Fachgebiets erlaubt. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung ein Peptid, oder Hapten, das, wenn es kovalent an ein Trägerpeptid und/oder Adjuvans gebunden ist, in vivo einen verstärkenden Effekt der biologischen Aktivität dieses Hormons hervorrufen kann.
Ein solcher Effekt kann das Ergebnis einer aktiven Immunisierung vom Typ Impfung sein, oder die Verabreichung des Haptens, das vor allem die Produktion spezifischer Antikörper in vivo induziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft also eine Peptidkonstruktion, die einen verstärkenden Effekt auf die biologische Aktivität des Wachstumshormons GH hat, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer der folgenden Strukturen besteht:

a) mindestens einem Hapten, bestehend aus den gesamten oder einem Teil der Sequenzen, die sich von Position 104 bis 113 des Wachstumshormons erstrecken, kovalent an ein Trägerpeptid gebunden,
b) der Struktur aus a), kovalent oder nicht kovalent mit einem Adjuvans assoziiert,
c) mindestens einem Hapten, bestehend aus den gesamten oder einem Teil der Sequenzen, die sich von Position 104 bis 113 des Wachstumshormons erstrecken, kovalent oder nicht kovalent mit einem Adjuvans assoziiert.

Die genaue Identifikation dieser Sequenz des GH oder „Peptid-GH" ist Gegenstand der Analyse einer bestimmten Zahl von monoclonalen Anti-GH-Antikörpern, die für einen verstärkenden Effekt bei Verabreichung des Komplexes Antikörper-GH verantwortlich sind. Dieses Peptidfragment, dessen Peptidsequenz ausgehend vom GH unter anderem als ein Molekül vom Typ Hapten betrachtet werden kann, wird durch den Antikörper 2H4 erkannt. Andererseits kann man unter den Antikörpern mit den besten Verstärkungseffekten bemerken, dass die Affinität von 2H4 für GH im Vergleich zu denen anderer Antikörper schwach ist.
Gemäß einer bevorzugten Peptidkonstruktion der Erfindung ist die Sequenz des Wachstumshormons GH in der folgenden Sequenz enthalten:
GTSDRVYEKL
Noch bevorzugter ist die Sequenz des Hormons GH aus den folgenden Sequenzen ausgewählt:
TSDRVYEKL
GTSDRVYEK
SDRVYEKL
TSDRVYEK
GTSDRVYE
Diese fünf Peptide entsprechen jeweils den Bereichen 105–113, 104–112, 106–113, 105–112, 104–111, des Wachstumshormons GH, wie in Scanes et al. (1995) veröffentlicht, und können mittels klassischer Verfahren der Peptidsynthese erhalten werden.
Da ein Hapten per Definition nicht immunogen ist, wird das Peptid der Endung kovalent an einen Träger gebunden. Beispielsweise können solche Träger vorteilhafterweise Peptidsequenzen, die von Ovalbumin, KLH (Pfeilschwanzkrebshämocyanin) oder Albumin stammen, oder vor allem die folgenden Peptide sein:
323–339 von Ovalbumin,
378–398 oder 379–398 oder 378–397 oder 378–396 oder 378–395 von Peptid CS.T3, beschrieben von Sinigaglia et al.,
45–60 von Protein 1A des Respiratory-Syncytial-Virus,
120–140 des die genomische DNA des Hepatitis-B-Virus umhüllenden Proteins.
Diese Sequenzen sind kovalent an das Carboxyl- oder Aminoende des „Peptids GH" gekoppelt.
Das Peptidfragment der Erfindung kann außerdem kovalent an nachstehende Trägermoleküle, ein Adjuvans vom Typ N-Acetyl-muramyl (MAP), assoziiert an ein Peptid, wie das MDP oder seine Derivate, gebunden sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Peptidfragments gemäß der Endung ist das Adjuvans das Muramyldipeptid (MDP) oder eines der Derivate, wie MDP-Lysin Lys(NH₂)-D-isoGlu-L-Ala-NMc-Nur.
Das Derivat von MDP ist also kovalent an das Carboxylende des Peptids, bestehend aus „Peptid GH" und dem Träger, auf klar ähnliche Weise wie die, die in EP 89290 beschrieben ist, gekoppelt.
Das Peptidfragment gemäß der Erfindung kann außerdem an eine Sequenz gebunden sein, von der bekannt ist oder angenommen wird, dass sie T-abhängig mit oder ohne MDP, oder seine Derivate, ist, oder alternativ an Liposomen gebunden oder in Liposomen eingeschlossen sein kann. Es kann folglich in wässrigem oder öligem Milieu oral, als subkutane, intramuskuläre oder transmucosale Injektion, als „Pellets" (bioabbaubare Polymere, die das Produkt enthalten) und als Implantation von Systemen wiederholter Abgabe durch Mikropumpen verabreicht werden. Andere Adjuvantien, wie das PAO, allein oder in Verbindung mit Lecithin ( EP 445710 ), Zn (OH)₂ oder HBW 538 (DRUGS. EXP. CLIN. RES. 17(9) 1991 445–450) assoziiert an Al(OH)₃, können kovalent oder nicht kovalent mit dem GH-Träger verbunden sein.
Schließlich können selbstverständlich auf einem gleichen Trägermolekül mehrere Peptidfragmente gemäß der Endung fixiert sein, ohne dass dadurch der verstärkende Effekt beeinträchtigt wird.
Die „Peptide GH" oder Peptide GH, gekoppelt an Trägerpeptide, können auf chemischem Weg synthetisiert werden, mittels dem Fachmann bekannter Verfahren, wie zum Beispiel dem Verfahren von Merrifield.
Eine solche Vorgehensweise, die eine aktive Immunisierung vorschlägt, ist ein Verfahren, das zahlreiche Vorteile im Vergleich zur Verabreichung von Antikörpern besitzt. Tatsächlich bewirkt eine aktive Immunisierung nach Art der Impfung einen fortbestehende Wirkung, während die Verabreichung von Antikörpern nur eine Übergangswirkung besitzt; außerdem ist die Herstellung von Peptiden deutlich weniger kostspielig als die von Antikörpern oder des nativen GH.
Ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Hapten codiert, das aus den gesamten oder einem Teil der Sequenzen besteht, die sich von Position 104 bis Position 113 des Wachstumshormons GH erstrecken, und gegebenenfalls ein Trägerpeptid, wobei die rekombinante Nucleinsäure für die Produktion von Peptidkonstruktionen gemäß der Erfindung in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen geeignet ist. Eine solche rekombinante Nucleinsäure kann verwendet werden:

– entweder, um prokaryontische oder eukaryontische Zellen zu transfizieren und zu bewirken, dass sie in vitro die Peptide herstellen;
– oder als aktiver Wirkstoff eines verstärkenden Arzneimittels des GH; die Peptide werden dann in vivo durch einen ähnlichen Mechanismus, wie der von Wang B. et al. (1993) beschriebene, hergestellt.

Die vorliegende Endung zielt ebenso auf eine immunogene Zusammensetzung, umfassend ein Peptidfragment, oder eine rekombinante Nucleinsäure, wie vorstehend beschrieben.
In einer solchen Zusammensetzung kann ein Adjuvans hinzugefügt werden, das an das Peptid, wie vorstehend beschrieben, gekoppelt sein kann oder nicht. Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann vorteilhafterweise als Lebensmittelzusatz verwendet werden, um das Wachstum und/oder die Milcherzeugung von Tieren, insbesondere Rindern, Schafen, Schweinen oder anderen Wirbeltieren (Fischen, Beuteltieren, Menschen...) anzuregen. Sie kann zur oralen Verabreichung bestimmt sein, zum Beispiel als Lebensmittelzusatz, oder als rektale, subkutane, intramuskuläre oder transmucosale Verabreichung, als „Pellets" und Mikropumpsysteme; insbesondere Liposomen können als Vektor in einer Zusammensetzung, die das Peptid GH umfasst, gekoppelt oder nicht mit einem Träger und einem Adjuvans, verwendet werden.
Für eine das Wachstum oder die Milcherzeugung bei Tieren fördernde Wirkung wird die Zusammensetzung so formuliert, dass das Peptid der Erfindung in Mengen von 0,01 μg bis 10 μg pro kg verabreicht wird.
Die Peptide und die Zusammensetzungen der Endung können auch beim Menschen zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Wachstumsprobleme verwendet werden, wenn diese aus einem Mangel an endogenem Wachstumshormon oder einer Störung des Metabolismus von letzterem resultieren. Die Formulierungen dieser Zusammensetzungen sind ebenso die wie vorstehend definierten.
Ohne einschränkend zu sein, zeigen die nachstehenden Beispiele und Figuren den Effekt, vor allem den vorteilhaften, der Peptidkonstruktionen der Erfindung, und insbesondere im Vergleich mit anderen wachstumsfördernden Stoffen.
Genaue Beschreibung
1) Bestimmung der Sequenz des „Peptid GH"
In einem einleitenden Schritt war es notwendig, unter den verschiedenen monoclonalen Antikörpern gegen das bGH die auszuwählen, die eine bestimmte Affinität dafür zeigen. Diese schienen tatsächlich solche zu sein, die die geeignetsten waren, positiv oder negativ mit der biologischen Aktivität des Hormons zu interferieren.
Zum Erhalt dieser Antikörper verwendete man ein schnelles Verfahren der Immunisierung, das es erlaubt, spezifische monoclonale Antikörper zu erhalten, beschrieben von Holmdahl et al. (1985) und Mirza et al. (1987). Das bGH wurde als Antigen verwendet.
Die erhaltenen Antikörper wurden auf folgende Eigenschaften charakterisiert:

– den Isotyp
– die Reaktivität im RIA mit 125I-markiertem bGH
– die Reaktivität im ELISA (additive Titration, Einfangen)
– die Reaktivitäten im WESTERN-BLOT.

Die Antikörper wurden anschließend ausgehend von Aszites mittels des von Bruck et al. (1982) beschriebenen Verfahrens gereinigt, und wenn die Reinigung einmal beendet ist, wurden die erhaltenen Antikörperlösungen einer Minielektrophorese auf einem denaturierenden SDS-Gel (PHAST SYSTEM) unterzogen. Dieser Arbeitsvorgang hat zum Ziel, die Isolierung der Immunglobuline zu kontrollieren.
Die Fähigkeit der gereinigten MAb, Immunkomplexe mit dem bGH in Lösung in wichtigen Konzentrationen zu bilden, wurde mittels eines schnellen Verfahrens bestimmt, mittels eines vor allem von Massart beschriebenen Verfahrens. Diese Reaktivität wird anhand der Fähigkeit der Antikörper gemessen, einen Komplex mit dem mit ¹²⁵I markierten bGH unter der Präzipitationsbedingung in Gegenwart von PEG (Polyethylenglycol) zu bilden.
Das erlaubte, einen Antikörper auszuwählen, der die gewünschte Reaktivität zeigt und 2H4 genannt wird, der auf seine Affinität mit dem bGH hin untersucht wurde. Die Ergebnisse der physikochemischen Eigenschaften dieses Antikörpers sind in der Dissertation von S. Massart und der nachstehenden Tabelle 1 dargelegt. Tabelle 1
ELISA Einfangen: Einfangen des biotinylierten bGH mit Hilfe auf Plastik adsorbierter Antikörper (stellt die Zahl der Verdünnungen der Antikörper dar, die den maximalen beobachteten DO zeigen)
2) Kariographie des vom Antikörper 2H4 erkannten Epitops
Die vorstehend beschriebenen Arbeiten erlaubten also die Bestimmung des Epitops von MAb 2H4 mittels Studien der Epitopkartographie, die insbesondere nach Beattle und Holder (1994) durchgeführt wurden.
Eine Reihe von Peptiden mit 8 Aminosäuren wurde synthetisiert und mit den monoclonalen Antikörpern zur Reaktion gebracht. Die Peptide, die die Antikörper binden, wurden mittels Spektrometrie identifiziert. Das Molekulargewicht der Antikörper-Peptid-Komplexe ist klar höher als das der Peptide allein.
Es wurde auch gezeigt, dass die Anheftungsstelle an den Antikörper das Peptid 104-113 der Struktur des GH war.
Dieser Bereich 104–113 befindet sich auf der Ebene der α-Helix Nr. 3 des GH, ein wenig untersuchter Bereich des Hormons GH, aufgrund der Tatsache, dass die Peptide dieser Helix eine schwache Radiorezeptoraktivität besitzen (Scanes et al., Ausgabe 1995). Man weiß jedoch, dass die Peptide dieses Bereichs eine wesentliche wachstumsfördernde Aktivität zeigen, wobei die Helix α3 darüber hinaus der Bereich der zweiten Bindungsstelle des Bindungsproteins GH (GHBP) ist. Tatsächlich ist es zur Bindung von GH an seinen Rezeptor in der Leber notwendig, dass es ein Dimer mit zwei GH BP bildet, um den wachstumsfördernden Effekt nach dem Modell von Fuh (1992) auszulösen (Science, 256, 1677–1678). In Abwesenheit dieser Dimerisierung des GH oder GHBP erfolgt kein Antagonismus der Wirkung und kein wachstumsfördernder Effekt wird folglich erhalten. Man kann demnach annehmen, dass der verstärkende Antikörper diese Bindung des GHBP an die Bindungsstelle erleichtert oder verändert, was den vorteilhaften Effekt dieses „Peptid GH" erklären könnte.
Beispiele
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente in vivo erfolgten in 19 Ansätzen, 5 Ratten pro Ansatz, weibliche hypophysektomierte Ratten der Rasse Wistar. Diesen Tieren wurde im Alter von 4 Wochen die Hypophyse ausgeschaltet und anschließend wurden sie während einer Woche beobachtet. Während einer Woche der ergänzenden Beobachtung wiegt man sie, und die Tiere, die nach sieben Wochen mehr als 5 Gramm gewonnen haben, werden getötet. Man zieht tatsächlich in Erwägung, dass das Ausschalten der Hypophyse dieser Tiere unvollständig ist. Sie sind daher nicht geeignet, im Rahmen der vorliegenden Arbeiten verwendet zu werden.
Jedes ausgewählte Tier erhält eine ergänzende Behandlung mit Schilddrüsenhormon T4 und Cortison. Diese Hormone werden täglich subkutan in einer Dosis von 50 μg/100 g Körpergewicht für das Cortison und 1 μg/100 g Körpergewicht für T4 verabreicht. Man beobachtet allgemein eine leichte Gewichtszunahme der Tiere nach der Injektion dieser Hormone. Diese ergänzende Hormonbehandlung wird während einer Woche durchgeführt, während der man immer täglich das Gewicht bestimmt. Diese Tiere sind daher geeignet, für eine vergleichende Beurteilung der somatogenischen Aktivität des bGH verwendet zu werden, inkubiert oder nicht mit verschiedenen Peptidkonstruktionen, die als Peptid GH die Sequenz 104–113 oder die Sequenz 35–53, beschrieben in EP 284406 , enthalten.
Im Laufe dieser Beurteilung, die für 50 Tage durchgeführt wurde, versuchte man, die Zunahme der hormonalen Aktivität des Schweine-GH, verabreicht als Komplex mit Antikörpern gegen das Peptid 104–113, verglichen mit dem Peptid 35–53 des GH, mittels der Gewichtszunahme und des Gehalts an IGF-1 zu messen.
Das Peptid 104–113 wurde durch Kopplung an verschiedene Trägermoleküle peptidischen Ursprungs immunogen gemacht, um nachstehend beschriebene Peptidkonstruktionen zu bilden, und die anschließend in Individuuen injiziert wurden, gekoppelt oder nicht an Adjuvantien verschiedenen Ursprungs, insbesondere von MDP abgeleitete Peptide, Mineralöle, Produkte bakteriellen Ursprungs oder verschiedene Hydroxyde. Diese Injektion wurde in Form einer Zusammensetzung durchgeführt, die die Peptidkonstruktionen in einer Dosis von 0,01 μg bis 10 μg Zusammensetzung pro kg (Masse der Ratte) umfasst.
Parallel dazu erhalten Kontrollratten, ebenso hypophysektomiert, Injektionen an Schweine-GH in einer Dosis von 0,01 μg bis 10 μg pro kg, entweder in Anwesenheit von normalen Immunglobulinen (Negativkontrollen) oder in Anwesenheit von Antikörpern gegen Peptid 35–53 des GH (angenommene Positivkontrolle).
Die zwei Immunogene (35-53-OVA und 35-53-SRIF) wurden in der Europäischen Patentanmeldung EP284406 als wirksam zum Erhalt von Antikörpern, die die Aktivität des GH bei hypophysektomierten Wistar-Ratten erhöhen können, beschrieben. In den vorliegenden Experimenten wurde das Peptid 35–53 des GH außerdem durch die gleiche kovalente Kupplungsart wie das Peptid 104–113 immunogen gemacht.
Die Immunogene 104-113-OVA, 104-113-LysMDP, 104-113-SRIF, 104-113-SRIF-LysMDP wurden also mit Immunogenen verglichen, die die gleiche Konjugationsart (Trägermoleküle oder Adjuvantien) enthielten, aber in denen das Peptid 104–113 durch das Peptid 35–53 ersetzt wurde.
Die zur Konjugation des OVA und von SRIF verwendeten Verfahren können die sein, die in der Patentanmeldung EP284406 beschrieben wurden. Außerdem kann die Kopplung an LysMDP gemäß des von Carelli et al. in der Europäischen Patentanmeldung EP 89290 beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.
Der Nachweis von Anti-Peptid- und Anti-GH-Antikörpern wurde auch gemäß des in der Europäischen Patentanmeldung EP284406 beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Die subkutane Injektion wurde an den Tagen T-1, T-15 und T-40 appliziert, und die Blutungen wurden an den Tagen T-1, T-7, T-21, T-45 und eine Endblutung an T-50 durchgeführt. Beschreibung der Ansätze:

wurden also in den verschiedenen Ansätzen verglichen:

– Erzeugung von verstärkenden Antikörpern gemäß des in Massart (1989), Seiten 27 und 34, beschriebenen Verfahrens.
– Gewichtsentwicklung
– Gehalt an plasmatischem IGF

Am Ende der Behandlung nach Wiegen der Individuen in der Gesamtheit der Ansätze wurden die Tiere durch Enthauptung ohne Anästhesie zur Bestimmung des Gehalts an IGF-1 getötet, und die Gewichtsentwicklung und die Antworten an IGF-1 der verschiedenen Versuchsgruppen wurden in den verschiedenen Ansätzen verglichen.
Zur Bestimmung des Gehalts an IGF-1 wurde das Blut des Rumpfes in Glasröhrchen gesammelt. Nach Entfernen der Blutklümpchen (2 Stunden bei 4°C) werden die Proben zentrifugiert, und die Seren werden bei –20°C aufbewahrt.
Man fährt anschließend mit der Extraktion von IGF-1 gemäß des von Renaville et al. (1993), Seite 444, beschriebenen Verfahrens fort. Der Prozentsatz der Gewinnung von IGF-1 durch dieses Verfahren ist 93%; mehr als 99% der Bindungsproteine wurden entfernt. So extrahiertes IGF-1 wird dann mittels Radioimmuntest unter Verwendung des Antiserums Rab2 quantifiziert (Renaville et al. (1993)).
Man kann sofort die Ähnlichkeit bemerken, die zwischen den zwei Typen von Ergebnissen existiert, da tatsächlich eine wichtige Korrelation zwischen den Gewichtszunahmen und den IGF-1-Antworten existiert.
Tatsächlich induziert in einer Dosis von 100 μg/Ratte das bGH einen mittleren Gehalt von 60 ng/ml IGF. Dieser Wert ist achtmal höher als der Grundgehalt bei kontrollierten hypophysektomierten Tieren.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die Peptidkonstruktionen mit dem Peptid GH eine Erhöhung der Aktivität des Hormons induzieren. Diese Erhöhung spiegelt sich in der erhaltenen Konzentration an IGF-1 wider, die höher als die der mit bGH allein injizierten Tiere ist.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen auch, dass eine Korrelation zwischen dem Gehalt zirkulierender Antikörper, die das native Hormon (GH) erkennen, und der Gewichtszunahme der immunisierten Ratten existiert. Insbesondere unterscheiden sich die Ansätze, die Peptide erhalten, sowohl an OVA konjugiert als auch in Anwesenheit von ACF injiziert, sowie die, die direkt an MDPLys gekoppelt und in PBS injiziert sind, klar von den anderen Ansätzen. OVA ist also ein besserer Träger als SRIF, auch wenn letzteres seinerseits an MDPLys gekoppelt ist.
Die direkte Kopplung der Peptide an MDPLys ergibt gute Ergebnisse, wenn sie in PBS eher als in AIF durchgeführt wird. Es muss auch bemerkt werden, dass in den Ansätzen, die das Peptid 35–53 erhalten, der Ansatz 7 ein besseres Ergebnis als die Ansätze 13 und 17 ergibt, aber dennoch schlechter als die Ansätze 5 und 12.
LITERATURVERZEICHNIS

(1) Aston et al. « Potention of the somatogenic and lactogenic activity of human GH with Mab ≫ (1986) J. Endocrinol. 110 381–388.
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(5) Fuh et al. Science (1994), 256, 1677–1678.
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(18) Wang et al. (1993) PNAS 90 4156–4160.

Claims

Peptidkonstruktion, die einen verstärkenden Effekt auf die biologische Aktivität des Wachstumshormons GH hat, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer der folgenden Strukturen besteht: a) mindestens einem Hapten, bestehend aus den gesamten oder einem Teil der Sequenzen, die sich von Position 104 bis 113 des Wachstumshormons erstrecken, kovalent an ein Trägerpeptid gebunden, b) der Struktur aus a), kovalent oder nicht kovalent mit einem Adjuvans assoziiert, c) mindestens einem Hapten, bestehend aus den gesamten oder einem Teil der Sequenzen, die sich von Position 104 bis 113 des Wachstumshormons erstrecken, kovalent oder nicht kovalent mit einem Adjuvans assoziiert.
Peptidkonstruktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Haptensequenz ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen: TSDRVYEKL GTSDRVYEKL SDRVYEKL TSDRVYEK GTSDRVYE.
Peptidkonstruktion nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpeptid ausgewählt ist aus den Peptiden mit den folgenden Sequenzen: 323–339 von Ovalbumin, 378–398 oder 379–398 oder 378–397 oder 378–396 oder 378–395 von Peptid CS.T3, 45–60 von Protein 1A des Respiratory-Syncytial-Virus, 120–140 des die genomische DNA des Hepatitis-B-Virus umhüllenden Proteins.
Peptidkonstruktion nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Adjuvans Muramyldipeptid (MDP) oder eines seiner Derivate, wie das MDP-Lysin, ist, gegebenenfalls kovalent gebunden an das Carboxylende des Haptens.
Rekombinante Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Hapten codiert, das aus den gesamten oder einem Teil der Sequenzen besteht, die sich von Position 104 bis Position 113 des Wachstumshormons GH erstrecken, und gegebenenfalls ein Trägerpeptid, wobei die rekombinante Nucleinsäure für die Produktion von Peptidkonstruktionen nach einem der Ansprüchen 1 bis 3 in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen geeignet ist.
Zusammensetzung, enthaltend eine Peptidkonstruktion nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Peptidkonstruktion nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein Adjuvans enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 oder 7 bei der Herstellung von Lebensmittelzusätzen.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in Liposomen formuliert ist.
Verwendung von Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 6 oder 7 bei der Herstellung von Lebensmittelzusätzen, mit denen das Wachstum und die Milcherzeugung der Wirbeltiere, die sie zu sich nehmen, angeregt werden kann.
Verwendung der rekombinanten Nucleinsäure nach Anspruch 5 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur aktiven Immunisierung von Wirbeltieren.