JP2583030B2 - インヒビンに特異な抗体の製造法および抗血清 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は哺乳動物の卵胞液からの
生物学的に活性な因子の単離とその有用な使用に関す
る。

【０００２】

【従来の技術および解決すべき課題】状況証拠と限られ
た実験から既に１９３２年に、下垂体による卵胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）の分泌を選択的に抑制する能力のある
非ステロイド因子（インヒビンと命名された）を性腺が
産生していることが示唆された（マクラフ（ＭｃＣｕｌ
ｌａｇｈ）、サイエンス第７６巻、（１９３２年）１９
頁）。それ以来ＦＳＨを測定するラジオイムノアッセイ
が開発されてインヒビンの存在を示唆する大量のデータ
が蓄積されたが、１９７０年代の初期に初めてこの物質
の単離と同定が試みられた。以後多くのグループの研究
者が、起源の異なる数種の性腺からインヒビンの精製を
試みたが、その結果は矛盾していた（デ ジョング（ｄ
ｅ Ｊｏｎｇ）、モレキュラー・アンド・セリュラー・
エンドクリノロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．）第１３巻、（１９７９年）１頁）。ある研
究者たちはヒトの精漿からインヒビンを単離し配列を決
定して、インヒビンの分子種の分子量は５，０００ダル
トンと１４，０００ダルトンであると主張している（セ
イダ（Ｓｅｉｄａｈ）ら、エフイービーエスレターズ
（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）第１６７巻、（１９８４
年）９８頁；シエス（Ｓｈｅｔｈ）ら、エフイービーエ
スレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）第１６５巻、
（１９８４年）１１頁）。さらにこれらの物質が性腺に
由来するものか否かについて真剣に疑問を持たれている
（ベクサック（Ｂｅｋｓａｃ）ら、インターナショナル
・ジャーナル・オブ・アンドロロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ａ
ｎｄｒｏｌｏｇｙ）第７巻、（１９８４年）３８９頁；
リリア（Ｌｉｌｊａ）とジェプソン（Ｊｅｐｐｐｓｓｏ
ｎ）、エフイービーエスレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ）第１８２巻、（１９８５年）１８１頁）。他の
グループの研究者たちは性腺のインヒビンを単離するた
めに、睾丸の精細管（睾丸網液）から採取した液及び卵
胞液を使用してきた。しかし１２年間の研究にもかかわ
らず精製した物質は得られていない。これらの事実は、
インヒビンと規定される物質の性質、化学的特質又はそ
の産生部位に関して一致した見解が得られていないこと
を示している。

【０００３】牛の卵胞液の性質から、特異的な機能を有
する１個又は２個以上の物質（「インヒビン」）が存在
するという仮説に結びついた。我々はインヒビンに特徴
的な全ての生物学的基準を満たす物質を性腺より単離し
た。

【０００４】

【課題を解決すべき手段】本発明はインヒビンの精製と
単離、抗体産生のための精製インヒビンの使用、定量ラ
ジオイムノアッセイにおけるインヒビンと該抗血清の使
用、及びインビトロ及びインビボのインヒビンとインヒ
ビンに対する抗体の応用に関する。

【０００５】本発明の１つの態様では下記の特徴を有す
る精製蛋白（インヒビン）が与えられる： （ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定したみかけの分子量は５
６，０００±１，０００である； （ｂ）等電点は６．９−７．３の範囲にある； （ｃ）この蛋白はコンカナバリンＡ−セファロースに特
異的に結合する； （ｄ）この蛋白は、下記の特徴を有する２個のサブユニ
ットより成る： （ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定したみかけの分子量はそ
れぞれ４４，０００±３，０００と１４，０００±２，
０００である、 （ｉｉ）分子量４４，０００のサブユニットの等電点は
６．０−７．０の範囲にある、 （ｉｉｉ）２個のサブユニットのＮ−末端アミノ酸配列
は後述する通りである： （ｅ）この蛋白はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のバ
イオアッセイ系で卵胞刺激ホルモンを抑制するが黄体化
ホルモン、甲状腺刺激ホルモン又はプロラクチンを抑制
しない； （ｆ）この蛋白は放射性ヨードで標識され得る。

【０００６】本発明の別の態様では下記の段階から成る
ことを特徴とする、哺乳動物の卵胞液からインヒビンを
単離及び精製する方法が与えられる： （ａ）１回以上のゲル浸透クロマトグラフィーの段階； （ｂ）１回以上の逆相高速液体クロマトグラフィー段
階； （ｃ）１回以上の調製ポリアクリルアミドゲル電気泳動
段階； （ｄ）精製したインヒビンの電気泳動による溶出。

【０００７】好ましくはゲル浸透クロマトグラフィー段
階はポア（孔）容積の大きいゲル浸透支持体、例えばセ
ファクリルＳ２００又はセファデックスＧ１００（セフ
ァクリル及びセファデックス共にファルマシア社の登録
商標である）を用いて行う。

【０００８】凍結乾燥又は真空乾燥により生物活性の直
接の回収を可能にするため、好適な溶出法では揮発性溶
媒（例えば酢酸アンモニウム、酢酸、又は類似化合物）
を用いる。

【０００９】逆相高速液体クロマトグラフィーは好まし
くは、粒子径分布の小さい（最も好ましくは５−１０
μ）の化学結合したＮ−アルキルシリカカラム充填剤を
用いて行う。使用する溶媒は揮発性又は非揮発性でもよ
く、メタノール、アセトニトリル、又はイソプロパノー
ル等の混和性有機溶媒を有する水の濃度勾配液中に、ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、重炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム又はリン酸ナトリウム等のイオン性改質剤
を含有していてもよい。好適な方法では０．１％のＴＦ
Ａ中の０−５０％のアセトニトリル濃度勾配を用いる。
種々の孔径と架橋度を有するポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）用ゲルを用いる種々の調製ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法がドデシル硫酸ナトリウムの
存在下で使用可能である。電気泳動用の好適な緩衝液系
はリームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（ネイチャー第２
２７巻、（１９７０年）６８０頁）に基づく。

【００１０】さらにインビトロのバイオアッセイでイン
ヒビンの活性を中和する能力と、インビボで性腺の重量
を上昇させる能力のあるインヒビンに対する特異的抗体
を作成する方法が与えられる。またさらに生体試料（例
えば血漿、血清又は尿）中のインヒビンの測定に用いる
インヒビンのラジオイムノアッセイ法が与えられる。

【００１１】下記の非限定的実施例と図を参照して例示
の目的で、本発明の１つの態様を詳細に説明する。

【００１２】ここで使用する省略語は下記の意味を有す
る： ｂＦＦ −牛卵胞液 ＲＰ−ＨＰＬＣ−逆相高速液体クロマトグラフィー ＰＡＧＥ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＦＳＨ −卵胞刺激ホルモン ＬＨ −黄体化ホルモン Ｕ −単位 ＧＦ −ゲル濾過 ｋＤ −キロダルトン ＴＦＡ −トリフルオロ酢酸 ＳＤＳ −ドデシル硫酸ナトリウム

【００１３】例１：牛卵胞液からのインヒビンの精製 この精製操作は１回以上のゲル浸透段階、１回以上の逆
相高速液体クロマトグラフィー段階及び１回以上のＰＡ
ＧＥ段階の連続的応用に基づく。卵胞液の採取（ｂＦＦ） 牛の卵巣は地方の屠殺場から得た。ｂＦＦを吸引してプ
ロテアーゼインヒビターであるトラジロール（１０Ｕ／
ｍｌ）とフッ化フエニルメチルスルフォニル（２４μｇ
／ｍｌ）の入った冷却した容器中に移した。このｂＦＦ
を−２０℃で保存した。インヒビンの精製操作は四段階
より成る。下記にこの操作の概略と詳細な精製法を示
す。精製操作の段階は以下の通りである： （Ａ）セファクリルＳ−２００によるゲル浸透クロマト
グラフィー。 （Ｂ）セファデックスＧ−１００によるゲル浸透クロマ
トグラフィー。 （Ｃ）逆相高速液体クロマトグラフィー。 （Ｄ）分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動。 （Ｅ）試料の電気泳動による溶出。 インヒビンの精製はスコットらの方法（エンドクリノロ
ジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）第１０７巻、（１
９８０年）１５３６頁）を若干改良して使用した（アウ
（Ａｕ）ら、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ）第１１２巻、（１９８３年）２３９頁）。こ
の方法はインヒビンが培養中のラットの脳下垂体前葉細
胞からのＦＳＨ（ＬＨは異なる）用量依存性の低下を引
き起こす能力に基づく。Ａ段階 セファクリルＳ２００によるゲル浸透クロマトグラフィ
ー： 溶出緩衝液０．０５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７．０ ｂＦＦ（５０−１００ｍｌ）を０．０５Ｍ酢酸アンモニ
ウムｐＨ７．０（２５−５０ｍｌ）で稀釈し、遠心分離
した（１２０００ｇ×３０分、４℃）。上澄液（７５−
１５０ｍｌ）をセファクリルＳ２００ゲル濾過カラム
（９×９０ｃｍ）を用いて一時間当り７０−１００ｍｌ
の流速で分画した。第一図に示すようにインヒビン活性
はこのカラムのボイド容積部分（分子量≧９０，０００
に局在化していた。インヒビン活性の回収率は９０％が
得られ比活性は３−４倍増加していた。Ｂ段階 セファデックスＧ１００によるゲル浸透クロマトグラフ
ィー： 溶出緩衝液４Ｍ酢酸 ボイド容積画分（第１図、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）を集め、プ
ールした画分の２５−５０％を氷酢酸（発色原を含まな
い）で酸性化して最終濃度を４Ｍ酢酸として、一時間４
℃に維持した。残りの５０−７５％は次に分画するまで
−２０℃にて凍結保存した。酸性化したプール（約１２
０ｍｌ）をセファデックスＧ１００カラム（９×９０ｃ
ｍ）にかけて４Ｍ酢酸を溶出緩衝液として一時間当り７
０−１００ｍｌの流速で溶出した。いずれのゲル濾過カ
ラムの場合も全ての操作は４℃で行った。この条件化で
インヒビン活性の大部分は低分子量画分（溶出容積１７
６０−１８８０ｍｌ、分子量の範囲２０，０００−６
０，０００、第２図）に溶出し比活性は１０−２０倍増
加しており、この部分のインヒビン活性の回収率は４５
％であった。分析カラム（例えば２．５×１００ｃｍ）
を用いて比活性の高い（１０−５０倍）同様の活性のプ
ロフィールが得られた。Ｃ段階 逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ） Ｂ段階で得られたカラムの画分（溶出容積約１７６０−
１９１０ｍｌ）をＲＰ−ＨＰＬＣカラムにかける前にプ
ールした。使用したカラムはウルトラポア（Ｕｌｔｒｐ
ｏｒｅ）ＲＰＳＣである。使用した移動相は０．１％Ｔ
ＦＡの水溶液と０．１％ＴＦＡ中５０％のアセトニトリ
ルとの直線濃度勾配であり、流速は１ｍｌ／分であり、
０．５ｍｌ画分ずつ集めた。三種類の方法を用いてカラ
ムにかけた：（ａ）試料を凍結乾燥して１ｍｇを４Ｍの
酢酸に溶解し、８−１０ｍｇ乾燥重量／ｍｌの濃度に濃
縮し、約１００μｌの４Ｍ酢酸中で遠心分離し、インジ
ェクターを用いてＨＰＬＣカラムにかけた；（ｂ）凍結
乾燥した物質（５−１０ｍｇ）を２０ｍｌの４Ｍ酢酸に
溶解し、遠心分離し、ＨＰＬＣの溶媒ポート（口）から
カラムにかけた；（ｃ）凍結乾燥していない物質（約１
００ｍｌ）を０．５μのフィルター（ＦＨ；ミリポア
社）で濾過してから溶媒ポート（口）から２ｍｌ／分の
流速でカラムにかけた。（ｂ）及び（ｃ）の一回目の実
験から得られたインヒビンの領域を再びクロマトグラフ
ィーにかけた。各画分を（必要な場合は）二回目のクロ
マトグラフィーの対応する試験管の内容物と一緒にし
て、バイオアッセイ用、アミノ酸分析用及びＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ用に分注した。Ｎ_２下で蒸発させて各画分のアセ
トニトリルを除去し、試料を凍結乾燥した。第３図に示
すようにインヒビン活性はクロマトグラムの１つの場所
（約３０％のアセトニトリルに対応する）に見出され
た。この実験における試料の添加料は１ｍｇである。後
者の２つの方法ではＨＰＬＣの性能は著しく影響を受け
たが、各添加法においてインヒビンの回収率は４０％で
あった。このＨＰＬＣ操作により比活性は１０倍増加
し、全体では比活性は１６０倍増加した。Ｄ段階 分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＲＰ−ＨＰＬＣにより得られたインヒビン含有画分を非
還元性試料用緩衝液（０．０６Ｍトリス−Ｈｃｌ ｐＨ
６．８、１２．５％グリセロール、１．２５％Ｗ／Ｖ
ＳＤＳ及び０．００６％ブロムフェノールブルー）に溶
解し、垂直ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した
（レイド（Ｒｅｉｄ）とビーレスキー（Ｂｉｅｌｅｓｋ
ｉ）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２２巻、
（１９６８年）３７４頁、の方法を変更した）。ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動溶液（リームリ（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）、ネイチャー第２２７巻、（１９７０年）
６８０頁）は充填ゲル（０．１２５Ｍトリス−Ｈｃｌ
ｐＨ６．８、０．１％Ｗ／Ｖ ＳＤＳ、５％アクリルア
ミド、０．１３％ビスアクリルアミド、０．１％過硫酸
アンモニウム）と分離用ゲル（０．３８Ｍトリス−Ｈｃ
ｌ ｐＨ８．８、０．１％Ｗ／Ｖ ＳＤＳ、７．５％ア
クリルアミド、０．２％ビスアクリルアミド、０．０３
％過硫酸アンモニウム）より構成されていた。電気泳動
緩衝液は０．０５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ含有２．５ｍＭト
リスグリシン緩衝液である。添加する蛋白（５００−７
００μｇ）を８個の試料用添加口に分けた。試料が分離
用ゲルに移動するまで（１．５ｈ）ゲルをまず２０ｍＡ
で電気泳動し、次にブロムフェノールブルーのマーカー
がゲルの底に達するまでの間（４ｈ）電流を３０ｍＡに
増加した。ゲルを酢酸：イソプロピルアルコール：水
１：３：６Ｖ／Ｖ中０．５％クマシーブルーで染色し
（１５分）、酢酸：メタノール：水５０：１６７：７８
５Ｖ／Ｖで脱色した。この方法で肉眼で見えるようにし
たインヒビン領域（分子量約５６，０００）をメスと定
規を用いて２ｍｍの大きさに切った。インヒビン領域の
上下のゲルもスライスにして切った。電気泳動で溶出す
る前にゲルのスライスを密封した試験管中で−１５から
−２０℃で保存した。第４図は調製ＰＡＧＥ精製により
得られた４個の連続の画分（Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ）の還元
及び非還元ＳＤＳ−ゲル電気泳動パターンである。イン
ヒビン活性は主にＢ画分（見かけの分子量約５６，００
０±１，０００±ＳＤ；５つの精製したインヒビン調製
液）に存在していた。還元条件化ではＢ画分は見かけの
分子量が４４，０００±３，０００と１４，０００±
２，０００（ｎ＝５）（レーンＥ）の２つのおおきなバ
ンドに別れた。ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ系を使用した。蛋白は銀染色で局在化した。使用
した蛋白標準品は：牛血清アルブミン（分子量６７，０
００）；卵白アルブミン（４３，０００）；カルボニッ
クアンヒドラーゼ（２９，０００）；アヒルのリゾチー
ム（２１，０００）；鶏卵リゾチウム（１４，５００）
である。還元剤は０．１％２−メルカプトエタノールで
ある。Ｅ段階 室温での電気泳動溶出 使用した方法はフンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅ
ｒ）らの方法（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第９１
巻、（１９８３年）２２７頁）を若干変更したものであ
る。ゲルのスライスをカミソリの刃で細切れにし、溶出
緩衝液（０．０５Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３中０．１％ＳＤ
Ｓ）で５分洗滌し、透析膜ディスク（分子量のカットオ
フ６，０００−８，０００）の付いた電気泳動溶出セル
中に入れた。ゲルのスライスを浸透用緩衝液（０．４Ｍ
ＮＨ_４ＨＣＯ_３中２％ＳＤＳ）をかけてから溶出緩衝
液（０．０５Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３中０．１％ＳＤＳ）を
かけた。溶出緩衝液に個体のチオグリコレートナトリウ
ムを最終濃度が０．５ｍＭになるように添加した。ゲル
を３−５時間浸してから５０Ｖ（直流）で電気泳動溶出
を開始した。１２−１６時間後に溶出緩衝液を透析緩衝
液（０．０１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３中０．０２％ＳＤＳ）
で交換し、クマシーブルー染色と蛋白が試料捕集用穴に
移動するまで８０Ｖ（直流）でさらに２０−２４時間電
気泳動溶出した。先の曲がった５０μｌのハミルトンシ
リンジで溶出した試料を試料捕集穴から取り、分注し、
凍結又は凍結乾燥した。精製した画分の試料をインビト
ロバイオアッセイ用、アミノ酸分析用及び銀染色による
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる分子量測定用にとっておい
た。前記の方法（ゲル浸透クロマトグラフィー、ＲＰ−
ＨＰＬＣ、及び分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥの組合わせ）を用
いて、インヒビン活性はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第４図）上
で単一の蛋白バンドとして回収され、見かけの分子量は
５６，０００±１，０００（５つの調製液）であった。
インヒビンの精製した調製はインビトロのバイオアッセ
イでＦＳＨを抑制するが、黄体化ホルモン、甲状腺刺激
ホルモン又はプロラクチンを抑制せず、精製した製品は
特異的にＦＳＨを抑制することを示している。この抑制
は非特異的毒性効果によるものではない。

【表１】

【００１４】実施例２：もう１つの精製法 ４Ｍ酢酸を用いてＡ段階のボイド容積画分をｐＨ４．７
５にし、１２，０００×ｇで４℃で３０分遠心分離して
インヒビンを沈降させた以外は実施例１のようにしてイ
ンヒビンを単離した。こうして得られたペレットを０．
０５Ｍの酢酸アンモニウムｐＨ７．０に溶解した。ペレ
ットを緩衝液中で室温で破砕及び音波処理して可溶化し
た。氷酢酸を用いて試料を４Ｍ酢酸として遠心分離して
から、二回目のゲル浸透クロマトグラフィー段階（Ｂ段
階）のカラムにかけた。溶解したペレットのｐＨ沈殿と
酸性化を含むインヒビン活性の総回収率は３４％であっ
た。この変法の利点はカラムの試料用量が７５％減少し
ているため、試料の処理能力が大幅に増加することであ
る。溶出緩衝液として４Ｍ酢酸を用いるゲル濾過により
実施例１の方法と類似の画分（溶出用量１７００−２１
００ｍｌ）にインヒビン活性が回収された。以後のＲＰ
−ＨＰＬＣ及び分取ＰＡＧＥ法でのインヒビンの挙動
は、この例の中の種々の変法に影響されなかった。

【００１５】例３：インヒビンの化学的性状の解析 最終生成物を非還元状態下で分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
うと見かけの分子量が５６，０００±１，０００（平均
値±標準偏差、調製物５個）の単一のバンドが得られ、
還元状態下では見かけの分子量が４４，０００±３，０
００と１４，０００±２，０００（調製物５個）の２個
の大きなバンドが観察された。非還元状態下の５６ｋＤ
バンドと還元状態下の４４ｋＤバンドの電気泳動による
解析によりバンドの不均一性が観察された。５６ｋＤ物
質の見かけの分子量の範囲は５４，０００−５７，００
０であり、４４ｋＤ物質は４２，０００−４６，０００
であった。１４ｋＤバンドでは単一のバンドが認められ
た。これらの事実はこの分子が糖蛋白であることと一致
する。２次元ＰＡＧＥ系（オファレル（Ｏ’Ｆａｒｒｅ
ｌｌ，Ｐ，Ｈ），ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２５０
巻、（１９７５年）、４００７−４０２１頁）を用い
て、未変性インヒビンと大きい方のサブユニットのｐＩ
値を求めた。未変性インヒビンは銀染色で検出し、見か
けの分子量が５６，０００のところに単一のバンドが得
られたが、ｐＩ値がｐＨ６．９−７．３の範囲の幾つか
の非常に密接した場所にあった。これらのデータは糖蛋
白であることを示唆している。分子量４４，０００のサ
ブユニットは見かけの分子量が４６，０００の単一のバ
ンドを示したが、ｐＩ値がｐＨ６．０−７．０の範囲の
幾つかの非常に密接した場所にあった。これらのデータ
はこのサブユニットが糖蛋白であることを示唆してい
る。インヒビンが糖蛋白であるというさらに別の理由は
以下の通りである： （ａ）放射標識インヒビンは、セファロース（ファルマ
シア社の登録商標）に固定化されたレクチンであるコン
カナバリンＡに結合できる。数回の実験からトレーサー
の１５−１７％はこのレクチンに結合しており、これは
糖であるメチル−α−グルコピラノシド（カルビオケム
社、米国サンジエゴ）による溶出で放出された。 （ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分画とニトロセルロース
への電気的移動後に、インヒビンは西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識小麦胚芽レクチンに結合。レクチンの結合
はペリオキシダーゼの発色反応により追跡した。レクチ
ンの結合は５６ｋＤの未変性蛋白と４４ｋＤＮＯサブユ
ニットと相関していた。

【００１６】例４：インヒビンの２つのサブユニットの
Ｎ−末端アミノ酸配列 インヒビンの精製調製物を還元しカルボキシメチル化し
た。見かけの分子量がそれぞれ４４，０００と１４，０
００のサブユニットをＰＡＧＥで分離し、上記実施例１
のＥ段階に記載の電気溶出法によりゲルから回収した。
インヒビンのメタノール沈殿によりＳＤＳを除去し、Ｎ
−末端アミノ酸配列を決定した。二個のサブユニットの
配列は以下の通りである：

【００１７】例５：精製インヒビンに対する抗体の作成 上記のように精製したインヒビン１９μｇを６００μｌ
のダルベッコウ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．４に溶解し油を基剤とする等量のアジュバント
（例えばマルコール（Ｍａｒｃｏｌ）５２：モンタナイ
ド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８８８の９：１の混合物。マ
ルコール（Ｍａｒｃｏｌ）５２はエッソ（Ｅｓｓｏ）社
の商標であり、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８
８８はパリのエスイーピーピーアイシー（Ｓ．Ｅ．Ｐ．
Ｐ．Ｉ．Ｃ．）社の商標である）で乳化した。２００μ
ｌをウサギの筋肉内に４箇所注射し、２００μｌを皮下
に注射した。６週後に同じ注射法を用いてウサギに１８
μｇの精製インヒビンを追加免疫した。ウサギの血清中
の抗体の抗体価は、ヨード化インヒビンに結合するか
（詳細は後述）、インビトロでインヒビンを中和する活
性により測定した。追加免疫後２週目（８週目の試料）
に最大の抗体価がえられ、１７−１８週目までに免疫前
の濃度に戻った。免疫の間ウサギの睾丸重量が３．０〜
３．５ｍｌに増加したが、これは恐らく外因性インヒビ
ンの中和によるインヒビンに対する免疫が性腺の重量を
増加させ、ＦＳＨ濃度を増加させたことを示している。

【００１８】例６：抗体の性状解析 上記のように調製したウサギの８週目の抗血清の、イン
ビトロでインヒビン活性を中和する能力について調べ
た。インビトロのバイオアッセイのインヒビン標準品と
して活性炭処理した牛の卵胞液を使用した（スコット
（Ｓｃｏｔｔ）ら、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ）第１０７巻、１９８０年、１５３６
頁）。上記アッセイにおいて最大の応答を与えることが
知られているインヒビンの投与量を中和するのに２μｌ
の抗血清で十分であった。免疫前のウサギにはこの中和
活性は存在しなかった。もう１羽のウサギを最初純度の
低いインヒビン調製液で免疫し（ＲＰ−ＨＰＬＣ精製段
階の後で得られた３４０μｇ）、２２μｇの純粋なイン
ヒビンで追加免疫した。最初の免疫注射の時はバイツカ
イテス（Ｖａｉｔｕｋａｉｔｅｓ）らの免疫法を用いて
完全フロイントアジュバント中で行い（ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボ
リズム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ）第３３巻、１９７１年、９８８頁）、追加注射は
上記の方法と同じである。このウサギの抗血清（９週
目）はインビトロで中和活性を示した。

【００１９】例７：ｂＦＦインヒビンのラジオイムノア
ッセイ 温和なクロラミン−Ｔ法又はボルトンハンター試薬（ボ
ルトンとハンター（Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅ
ｒ），バイオケミストリー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ）第１３３巻、（１９７
３年）５２９頁）を用いてインヒビンの精製調製液をヨ
ード化し、比活性０．５μＣｉ／μｇ（後述するラジオ
イムノアッセイの自己排除方法により測定）にした。ヨ
ード化物質は非ヨード化分子と同じ見かけの分子量を示
した（還元条件下及び非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で測定）。ヨード化トレーサーを用い、ラジオイムノア
ッセイ法を行いポリエチレングリコール促進二抗体沈殿
法より抗体結合及び非結合ヨード化ホルモンを分離した
（ピーターソンとシュエルドルフ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，
Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｓｗｅｒｆｌｏｆｆ，Ｒ．Ｓ．：ク
リニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）第２５巻、１９７９年）１２３９−１２４
１頁）。精製及び非精製ｂＦＦについて特徴的な排除曲
線が得られた。精製物質の用量応答曲線の感度（ＥＤ
_１０）は２ｎｇ／チューブであり、ＥＤ_５０は２５ｎｇ
／チューブであった。インヒビン−抗体相互作用の解離
定数は２０℃で４．５×１０^−１０Ｍであった。

【００２０】例８：ヒトの絨毛性ゴナドトロピンで刺激
した妊娠５日のマウスにおける排卵 の阻害 牛の卵胞液の粗抽出物が排卵を阻害することは既に示し
た。この阻害はＦＳＨで完全に反対になる（エルクミン
ズ（Ｌ．Ｃｕｍｍｉｎｓ）、博士論文、１９８３年、ニ
ューイングランド大学（アルミデール））。妊娠５−７
日のマウスに１．５μｇのインヒビンを午前９時に皮下
投与し、午後６時に１０ＩＵのＨＣＧを皮下注射した。
翌朝卵管膨大部の卵子の数を数えた。第１表に示すよう
にインヒビンの投与は排卵を有意に抑制した。

【表２】 対照に比較して精製インヒビン及び１００μｌのｂＦＦ
共に有意に排卵を阻害した（ウイルコキソン（Ｗｉｌｃ
ｏｘｏｎ）の検定ではそれぞれＰ＜０．０１及びＰ＜
０．０５）。

【００２１】例９：血漿ＦＳＨ濃度に対する免疫の影響 上記の実施例５では１羽のウサギを免疫し、精製インヒ
ビンでさらに２回追加免疫した。こうして得られた抗血
清はインビトロのバイオアッセイでインヒビンの活性を
中和した。インビボではこの抗血清が血流中のインヒビ
ンを中和して、血流中のＦＳＨを増加させると考えられ
る。ウサギの血漿ＦＳＨはウサギの血清中のインヒビン
の抗体の抗体価に一致して上昇及び下降した。その結果
を第２表に示す。

【表３】

【００２２】例１０：去勢したオスのラットへの急激な
インヒビンの投与による血流中ＦＳ Ｈの抑制 牛の卵胞液を用いた下記の実験から分かるように、精製
インヒビンの投与後４−８時間以内に血流中ＦＳＨを抑
制することが予想できる。３日前に去勢した３４週令の
オスのラットに頸静脈を通して血流中にインヒビンを投
与し、５時間後にＦＳＨラジオイムノアッセイで血漿中
のＦＳＨを測定した。牛卵胞液の投与量の増加に相関し
たＦＳＨの有意の用量応答的な減少が認められた。その
結果を第３表に示す。

【表４】

【００２３】例１１：卵胞液からのインヒビンの精製 卵胞液からのインヒビン活性は上記の精製段階Ａ，Ｂ，
Ｃを用いるｂＦＦインヒビンと同様の方法で精製できる
ことを我々は見出した。Ｄ及びＥ段階の後の特徴はｂＦ
Ｆインヒビンの特徴に似ている。従ってこれよりＡから
Ｅの精製段階は、ヒトを含む哺乳動物のインヒビンに応
用できることが予想できる。ＦＳＨは卵巣及び睾丸機能
の刺激に重要であるため、精製インヒビンの主要な用途
はＦＳＨ分泌を特異的に阻害できる能力、又はインヒビ
ンに対して免疫することにより内因性のインヒビンを中
和する抗体を誘導しその結果ＦＳＨ濃度を上昇させるこ
とができるように抗原として使用することにある。イン
ヒビンの作用や生理を研究するために性腺組織又は性腺
液の粗抽出液又は部分抽出液を用いてインビボの多くの
研究が為されてきた。これらの実験においてインヒビン
又はインヒビンの抗体に帰因すると考えられる（しかし
証明されてはいない）効果には以下のようなものがあ
る： １． 性腺機能の阻害（モウドガル（Ｍｏｕｄｇａｌ）
ら、１９８５年、「性腺蛋白とペプチド及びその生物学
的意義」（Ｇｏｎａｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（サイラム
（Ｓａｉｒａｍ）編、ワールドサイエンティフィックパ
プリッシング（Ｗｏｒｌｄ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ）、シンガポール（印刷中））。 ２． 排卵速度の上昇（ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓ
ｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー
（Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．）第１０２巻、（１９８
４年）３０５頁；クミンズ（Ｃｕｍｍｉｎｓ）ら、プロ
シーディングズ・オブ・オーストラリアン・ソサエティ
・オブ・リプロダクティブ・バイオロジー（Ｐｒｏｃ．
Ａｕｓｔ．Ｓｏｃ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．）第１５
巻（１９８３年）８１頁）。 ３． 青春期の開始の早期化（アルオバイディ（Ａｌ
Ｏｂａｉｄｉ）ら、プロシーディングズ・オブ・オース
トラリアン・ソサエティ・オブ・リプロダクティブ・バ
イオロジー（Ｐｒｏｃ．Ａｕｓｔ．Ｓｏｃ．Ｒｅｐｒｏ
ｄ．Ｂｉｏｌ．）第１５巻（１９８３年）８０頁）。イ
ンヒビン及びＦＳＨの公知の性質は、本発明の精製イン
ヒビン及びインヒビンに対する抗体の幾つかの応用の可
能性を示唆している。 （ｉ）排卵速度の上昇：ＦＳＨは哺乳動物の卵巣の卵子
の発育を刺激すること（ロス（Ｒｏｓｓ）ら。（１９８
１年）、「テキストブック・オブ・エンドクリノロジ
ー」（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅａｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ）、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）編、３
５５頁）、及びＦＳＨによる卵巣の過度の刺激は多発排
卵につながること（ゲムゼル（Ｇｅｍｚｅｌｌ）、ヒト
性腺刺激ホルモンによる排卵の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｏｖｕｌａｔｉ ｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａ
ｎ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）、リースント・プ
ログレス・イン・ホルモンリサーチ（ＲｅｃｅｎｔＰｒ
ｏｇ．Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ．）第２１巻（１９６５
年）１７９頁）は認識されている。我々はインヒビンが
インビトロ及びインビボでＦＳＨを抑制すること、及び
インヒビンはインヒビンに対する中和抗体を作成するた
めの免疫原として利用できることを証明した。インヒビ
ンの精製調製物と適当なアジュバントを用いて哺乳動物
（例えば牛や羊）を免疫すると、免疫した動物中で抗体
が増加する。この抗体は動物自身のインヒビンの酸性を
中和し、従ってＦＳＨ産生に対する抑制効果を除去す
る。こうして得られるＦＳＨの上昇は卵巣中の卵胞の発
育刺激につながり排卵速度が増加する。またインヒビン
に対して免疫した動物の血清を集めることにより他の動
物の受動免疫に使用できる抗血清が得られる。この方法
によりインヒビンの抗血清を注射することにより動物自
身のインヒビンが中和され、ＦＳＨが増加して排卵が刺
激される。排卵速度の上昇に受動免疫及び能動免疫共に
利用される。性腺の成長のための能動免疫にインヒビン
を利用できる可能性は、インヒビンに対する免疫で使用
したウサギの睾丸の大きさが増加したことにより示され
る（例５）。 （ｉｉ）卵巣及び睾丸機能の阻害：卵巣における卵胞の
発育そして睾丸における精子産生の刺激におけるＦＳＨ
の重要性が認識されていること（ロス（Ｒｏｓｓ）ら、
（１９８１年）、「テキストブック・オブ・エンドクリ
ノロジー」（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ）、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）
編、３５５頁；バルデインとポールセン（Ｂａｒｄｉｎ
ａｎｄ Ｐａｕｌｓｅｎ）、（１９８１年）、「テキ
ストブック・オブ・エンドクリノロジー」（Ｔｅｘｔｂ
ｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）中の「睾
丸」（Ｔｈｅ Ｔｅｓｔｉｓ）、ウイリアムズ（Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ）編、２９３頁）は、性腺機能の抑制におけ
るインヒビンの役割の可能性を示唆している。インヒビ
ンの投与は卵巣と睾丸機能の抑制につながり、妊娠性の
破壊が起きることが予想できる。このインヒビンの作用
はヒト、羊及び牛の雄及び雌に利用可能であり、他の種
にも利用できる可能性がある。 （ｉｉｉ）妊娠性の開始の促進：青春期の開始時に起き
る最初の変化の１つはＦＳＨ濃度の増加であり、このた
め卵巣と睾丸が刺激される（ロス（Ｒｏｓｓ）ら、（１
９８１年）、「テキストブック・オブ・エンドクリノロ
ジー」（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ）、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）編、３
５５頁；バルデインとポールセン（Ｂａｒｄｉｎ ａｎ
ｄ Ｐａｕｌｓｅｎ）、（１９８１年）、「テキストブ
ック・オブ・エンドクリノロジー」（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ
ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）中の「睾丸」
（Ｔｈｅ Ｔｅｓｔｉｓ）、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ）編、２９３頁）。能動免疫又は受動免疫により
性的に未熟な哺乳動物をインヒビンに対して免疫する
と、付随的に卵巣と睾丸機能が刺激されて青春期の開始
が早くなる可能性がある。家畜動物（例えば乳牛、羊及
びヤギ）の一生の生殖機能は、青春期の開始年齢、各妊
娠間の間隔、高令化による卵巣機能の低下の可能性に依
存する。能動免疫又は受動免疫により青春期前の若い動
物をインヒビンで免疫すると、動物自身のインヒビン産
生が中和されＦＳＨ濃度が増加する。このＦＳＨの増加
により性腺が刺激され普通より早く青春期が訪れる。こ
の方法は哺乳動物の雄又は雌の早発青春期を誘導するこ
とに利用できる。 （ｉｖ）青春期の抑制：ＦＳＨは青春期の開始における
決定的な因子と考えられているため、好ましくない状態
（例えばヒトにおける早発青春期の開始）又は青春期の
開始を抑制する方法としてインヒビンを投与することも
できる。 （ｖ）インヒビンを測定するためのラジオイムノアッセ
イ又は酵素結合免疫定量法の開発、そしてインヒビンの
精製を促進するための免疫吸着カラムを開発することに
使用できる抗血清又はモノクローナル抗体を作成するた
めの免疫原として、インヒビンは利用できる。 （ｖｉ）前記した抗血清を用いて、インヒビンを測定す
るラジオイムノアッセイ系を開発した。このラジオイム
ノアッセイにより、スコット（Ｓｃｏｔｔ）（１９８０
年）らの既知のインビトロのバイオアッセイでは不可能
であった生体試料（例えば血漿、血清又は尿）中のイン
ヒビンの測定が可能になった。血漿又は血清中のインヒ
ビン濃度は、妊娠性の診断に用いるセルトリ細胞や顆粒
膜細胞機能の指標となる。 （ｖｉｉ）多量のインヒビンの投与はＬＨの分泌を阻止
することも可能である。この事実もまたインヒビンが排
卵を抑制する能力を支持している。本発明は前記の個々
の例に限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】セファクリルＳ−２００で分画した牛の卵胞液
（ｂＦＦ）中のインヒビン活性の溶出プロフィールを示
す。

【図２】セファデックスＧ１００で分画したｂＦＦ中の
インヒビン活性の溶出プロフィールを示す。

【図３】ゲルクロマトグラフィーの後で逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で分画したｂＦＦ
中のインヒビン活性の溶出プロフィールを示す。

【図４】調製ＰＡＧＥにより得た４個の連続画分の非還
元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595052334 セント ビンセンツ インスチチュート オブ メディカル リサーチ オーストラリア国，3065，ビクトリア, フイッツロイ，ビクトリア パレード 41 (73)特許権者 595052345 バイオテクノロジー オーストラリア プロプライエタリイ リミテツド オーストラリア国 2069 ニユー サウ ス ウエールズ，イースト ローズビ ル，バークー ストリート 28 (72)発明者 ミルン―ロバートソン，デビット マー ク オーストラリア国 3150 ビクトリア, グレン ウエイバーリイ．フロリート コート ６ (72)発明者 デ クレットサー，デビッド モリツツ オーストラリア国 5127 ビクトリア, サレー ヒルズ，レウラ ストリート １ (72)発明者 ヒアーン，ミルトン トーマス ウイリ アム オーストラリア国 3103 ビクトリア, バルウイン，ユニオン ロード 263 (72)発明者 バーガー，ヘンリイ ジョージ オーストラリア国 3002 ビクトリア, イースト メルボルン，ベリー ストリ ート 36 (72)発明者 フインドレイ，ジョン カー オーストラリア国 3127 ビクトリア, モント アルバート，バーロア ロード ３ (72)発明者 フオラージ，ロバート グレゴリイ オーストラリア国 2062 ニュー サウ ス ウエールズ，キヤメレイ，カーター ストリート 24 (72)発明者 リチャード，エドワード ヒュー ウェ ッテンホール オーストラリア国 3124 ビクトリア, キャンバー ウエル，ロイヤル クレス セント 23 (72)発明者 リチヤード，エドワード ヒユー ウエ ツテンホール オーストラリア国 3124 ビクトリア, キヤンバーウエル，ロイヤル クレスセ ント 23

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２個のサブユニットからなり、１サブユ
   ニットは還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した見掛け
   の分子量は約１４，０００±２，０００を有するインヒ
   ビンの有効量およびアジュバントで哺乳動物を免疫化す
   ることを特徴とする、インヒビンに特異な抗体の製造方
   法。
2. 【請求項２】 （１）精製インヒビンをバッファーに溶
   解し、（ロ）バッファーに溶解した精製インヒビンをア
   ジュバントと共に乳化して、エマルジョンを作り、つい
   で（ハ）このエマルジョンを哺乳動物に注入する工程を
   含む、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 抗体を含有する抗血清を哺乳動物から単
   離する、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 抗血清は請求項１記載の方法により製造
   する、インヒビンに特異な抗体を含む、抗血清。
5. 【請求項５】 抗血清はインビトロでインヒビンを中和
   する、請求項４記載の抗血清。