DK171711B1

DK171711B1 - Inhibin isoleret fra mammal ovariefollikelvæske, monoklonalt eller polyklonalt antistofpræparat, immunoassay for inhibin, og rensning af inhibin, og radio- eller enzymbundet immunoassay for inhibin

Info

Publication number: DK171711B1
Application number: DK060586A
Authority: DK
Inventors: David Moritz De Kretser; Milton Thomas William Hearn; Henry George Burger; John Kerr Findlay; Francis Joseph Morgan; David Mark Robertson; Robert Gregory Forage; Richard Esward Hugh Wettenhall
Original assignee: Biotech Australia Pty Ltd; Univ Monash; St Vincents Inst Med Res; Monash Medical Centre
Priority date: 1984-06-08
Filing date: 1986-02-07
Publication date: 1997-04-01
Also published as: ATE95194T1; EP0185034A1; JPS61502399A; EP0185034A4; DE3587603T2; NO176570C; DK60586D0; NZ212248A; JPH0848636A; NO860427L; EP0185034B1; WO1986000078A1; JP2521707B2; NO176570B; JP2583030B2; US5364837A; DE3587603D1; CA1341617C; DK60586A; US5102807A

Description

DK 171711 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår proteinet inhibin, der er isoleret fra marrmal ovariefollikelvæske. Endvidere angår opfindelsen et rnono-klonalt eller polyklonalt antistofpræparat, imnunoassay for inhibin og radio- eller enzymbundet imnunoassay for inhibin.

På basis af indirekte bevis og begrænset eksperimentering 5 blev det foreslået så tidligt som i 1932, at kønskirtlerne producerede en ikke-steroid faktor, kaldt inhibin, som var i stand til selektivt at undertrykke hypofysesekretionen af follikelstimulerende hormon (FSH) (McCullagh, Scien-ce 76, (1932) 19). Siden den gang har udviklingen af radio-10 immunoprøver til måling af FSH ført til akkumuleringen af en væsentlig sandsynlighed for at foreslå, at inhibin eksisterer, men det var ikke før først i 1970'erne, at der har været gjort noget forsøg på at isolere og identificere dette stof. Siden da har en række grupper af forskere for-15 søgt at rense inhibin fra adskillige kønskirtelkilder med modstridende resultater (de Jong, Mol. Cell. Endocrinol.

13. (1979) 1). Nogle forskere har erklæret at have isoleret og kortlagt inhibin fra human seminal plasma med molekylvægtene for disse arter inhibin på 5000 og 14000 dalton 20 (Seidah et al., FEBS Letters 167, (1984) 98; Sheth et al., FEBS Letters, 165. (1984) 11). Endvidere er kønskirtelqprin-delsen af disse materialer alvorligt betvivlet (Beksac et al., Int. J. Andrology 2» (1984) 389; Lilja og Jeppsson, FEBS Letters 182, (1985) 181). Andre grupper forskere har 25 anvendt væske samlet fra de sædførende rør i testis (rete-testisvæske) og også ovariefollikelvæske i forsøg på at i-solere kønskirtelinhibin. Hidtil har disse forsøg skønt forsøgt udført over en periode på 12 år ikke ført til opnåelse af renset materiale. Denne baggrund indikerer, at der ikke 30 er nogen almen overensstemmelse i henseende til natur, kemiske træk eller produktionssted for det stof, der er defineret som inhibin.

Egenskaberne for bovine follikelvæske ekstrakter har ført til det postulat, at der er et stof eller stoffer, "inhibin”, 35 med specifikke virkninger. Det er nu i forbindelse med op- findelsen lykkedes at isolere et materiale fra en kønskir telkilde, som tilfredsstiller alle de biologiske kriterier, som er karakteristiske for inhibin.

2 DK 171711 B1

Den foreliggende opfindelse angår et i således isoleret og ren-5 set inhibin samt anvendelsen af det rensede materiale til dannelse af antistoffer, anvendelsen af inhibin og antisera i en kvantitativ radioimmunoprøve og anvendelser in vitro og in vivo af inhibin og antistof mod inhibin.

Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes et renset 10 protein, inhibin, der er karakteriseret ved, at (a) den tilsyneladende molekylvægt som bestemt ved SDS-PAGE er 56000 - 1000, (b) det isoelektriske punkt ligger i området 6,9-7,3, (c) proteinet kan bindes specifikt til Concanavalin A-Se- 15 pharose, (d) proteinet består af to underenheder, der kan adskilles efter reduktion som bestemt ved SDS-PAGE, karakteriseret ved, at (i) deres tilsyneladende molekylvægte er henholdsvis 20 44000 - 3000 og 14000 - 2000, (ii) det isoelektriske punkt for underenheden med molekylvægten 44000 ligger i området 6,0-7,0, (iii) de N-terminale aminosyre sekvenser for de to underenheder er som heri beskrevet, 25 (e) proteinet kan undertrykke follikel stimulerende hormon, men ikke luteiniseringshormon, thyroidstimulerende hormon eller prolactin i et in vitro bioprøvesystem, 3 DK 171711 B1 (f) proteinet kan mærkes med radioaktivt iod.

Det omhandlede inhibin er isoleret fra materialer af pattedyrsoprindelse, ved en proces, hvorved man underkaster udgangsmaterialet følgende trin: 5 (a) et eller flere gelpermeationschromatografitrin, (b) et eller flere HPLC-chromatografitrin med omvendt fase, (c) et eller flere præparative polyacrylamidgelelektrofore-setrin, 10 (d) elektroforet!sk eluering af det rensede inhibin.

Gelpermeationschromatografitrinnet udføres fortrinsvis under anvendelse af en gelpermeationsbærer med stort porevolumen, f.eks. Sephacryl S200 eller Sephadex G100 (både Se-phacryl og Sephadex er varemærker tilhørende Pharmacia).

15 Foretrukne elueringsmetoder gør brug af flygtige opløsningsmidler indeholdende f.eks. ammoniumacetat, eddikesyre eller lignende forbindelser for at tillade direkte udvinding af biologisk aktivitet ved lyofilisering eller vakuumtørring.

HPLC-chromatografien med omvendt fase udføres fortrinsvis 20 under anvendelse af kemisk bundne N-alkylsilica-kolonnepak-ninger med snæver partikelstørrelsesfordeling, mest hensigtsmæssigt 5-10 p. De anvendte elueringsmidler kan være flygtige eller ikke-flygtige og indeholde ionmodificeringsmidler, såsom trifluoreddikesyre (TFA), ammoniumbicarbonat, 25 ammoniumacetat eller natriumphosphat, i en gradient af vand med et blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom methanol, acetonitril eller isopropanol. En foretrukken procedure gør brug af en gradient af 0-509( acetonitril i 0,1% TFA. Forskellige præparative polyacrylamidelektrofc>rese-(PAGE)-me-30 toder kan anvendes i nærværelse af natriumdodecylsulfat DK 171711 B1

It (SDS) under anvendelse af PAGE-geler med forskellige porøsiteter og indhold af tværbinding. Et foretrukkent puffer-system til elektroforese er baseret på metoden af Laemmli som beskrevet i Nature 227. (1970) 680.

5 Der tilvejebringes yderligere et antistof mod inhibin, hvilket antistof har evnen til at neutralisere aktiviteten af inhibin i in vitro bioprøven og at forårsage en forøgelse af gonadalvægten in vivo.

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen er tilvejebragt 10 en radioimmunoassay for inhibin, som kan anvendes til målingen af inhibin i biologiske prøver, såsom plasma, serum eller urin.

Opfindelsen vil blive beskrevet detaljeret ved hjælp af de efterfølgende eksempler og den medfølgende tegning, 15 hvorpå fig. 1 viser elueringsprofilen for inhibinaktivitet i bovin ovariefollikelvæske (bFF) fraktioneret på Sephacryl S-200, fig. 2 viser elueringsprofilen for inhibinaktivitet i bFF· fraktioneret på Sephadex G100, 20 fig. 3 viser elueringsprofilen for inhibinaktivitet i bFF fraktioneret ved HPLC-chromatografi med omvendt fase (RP-HPLC) efter forudgående gelchromatografi, og fig. 4 viser reducerede og ikke-reducerede SDS-polyacryl-amidgelelektroforesemønstre for fire sekvensfraktioner op-25 nået ved præparativ PAGE.

Forkortelser anvendt heri er som følger: bFF - bovin ovariefollikelvæske RP-HPLC - højtryksvæskechromatografi med omvendt DK 171711 Bl 5 fase PAGE - polyacrylamidgelelektroforese FSH - follikelstimulerende hormon LH - luteiniseringshormon 5 U - enheder GF - gelfiltrering kD - kilo Dalton TFA - trifluoreddikesyre SDS - natriumdodecylsulfat 10 EKSEMPEL 1

Rensning af inhibin fra bovin ovariefollikelvæske

Rensningsproceduren er baseret på sekvensanvendelsen af et eller flere gelpermeationstrin, et eller flere chromatogra-fitrin med omvendt fase og høj adskillelse og et eller fle-15 re PAGE-trin.

Samling af bovin follikelvæske (bFF)

Bovin-ovarier blev opnået fra lokale slagterier og bFF luftet i en afkølet beholder indeholdende proteaseinhibitorerne Trasylol (10 U/ml) og phenylmethylsulfonylfluorid (24 μg/m^-).

20 bFF blev opbevaret i frosset tilstand ved -20°C.

Proceduren til rensning af inhibin bestod af fire trin. I de efterfølgende afsnit er der beskrevet en skitse af proceduren og angivet detaljer ved rensningsproceduren.

Trinnene i rensningsproceduren er som følger: 25 (A) Gelpermeationschromatografi på Sephacryl S-200.

(B) Gelpermeationschromatografi på Sephadex G-100.

(C) HPLC-chromatografi med omvendt fase.

6 DK 171711 B1 (D) Præparativ polyacrylamidgelelektroforese.

(E) Elektroforetisk eluering af prøver.

Rensningen af inhibin blev vist ved bioprøvemetoden af Scott et al. (Endocrinology 107» (1980) 1536), anvendt med mindre 5 modifikationer (Au et al., Endocrinology 112, (1983) 239). Fremgangsmåden er baseret på inhibins evne til at forårsage dosisafhængig reduktion af FSH-, men ikke LH-celleindhold, for rottehypofyseforkantceller i kultur.

Trin A: 10 Gelpermeationschromatografi på Sephacryl S-200i

Elueringspuffer 0.05 M ammoniumacetat til pH 7.0 bFF (50-100 ml) blev fortyndet med 0,05 M ammoniumacetat pH 7,0 (25-50 ml) og centrifugeret (12000 g x 30 min. ved 4°C). Supernatanten (75-150 ml) blev fraktioneret på en Se-15 phacryl S-200 gelfiltreringskolonne (9 x 90 cm) ved en strømningshastighed på 70-100 ml pr. time. Som det fremgår af fig.

1 blev inhibinaktivitet lokaliseret i et mellemrumsområde (molvægt > 90000) på denne kolonne. 90%’s udvindinger af inhibinaktivitet blev opnået med en 3-4 fold forøgelse i speci-20 ficitetsaktivitet.

Trin B:

Gelpermeationschromatografi på Sephadex G-100:

Elueringspuffer 4 M eddikesyre_

Mellemrumsvolumenfraktioner (A, B, C og D, fig. 1) blev 25 forenet, og 25-509é af de samlede fraktioner blev syrnet med iseddikesyre (chromogenfri) til en slutkoncentratiori på 4 M eddikesyre og holdt ved 4°C i 1 time. De resterende 50-759^ blev opbevaret frosset ved -20°C før senere fraktionering. Den syrnede portion (ca. 120 ml) blev påført en Se- 7 DK 171711 B1 phadex G-100 gel filtreringskolonne (9 x 90 cm) med 4 M eddikesyre som elueringspuffer ved en strømningshastighed på 70-100 ml pr. time. Alle operationer med begge gelfiltreringskolonner blev foretaget ved 4°C. Under disse betingel-5 ser blev størstedelen af inhibinaktivitetén elueret i et område med lavere molekylvægt (elueringsvolumen 1760-1880 ml, molvægtsinterval 20000-60000, fig. 2) med en 10-20 gange forøgelse i specifik aktivitet og 4596's udvinding af inhi-binaktivitet i dette område. Under anvendelse af analytis-10 ke kolonner (f.eks. 2,5 x 100 cm) er der blevet iagttaget lignende aktivitetsprofiler med højere specifikke aktiviteter (10-50 gange).

Trin C i HPLC-chromatografi med omvendt fase 15 Kolonnefraktionerne (elueringsvolumen ca. 1760-1910 ml) fra trin B blev samlet før påføring på RP-HPLC-kolonnen. Den anvendte kolonne var en Ultrapore RPSC (Beckman, Berkeley, California). Den anvendte mobile fase var en lineær gradient mellem 0,1% TFA i vand og 50% acetonitril i 0,1% TFA; 20 strømningshastigheden var 1 ml pr. minut, og der blev samlet fraktioner på 0,5 ml. Tre påføringsprocedurer blev anvendt: (a) prøven blev lyofiliseret og 1 mg opløst i 4 M eddikesyre til en koncentration på 8-10 mg tørvægt/ml, centrifugeret i ca. 100 μϋΐβΓ 4 M eddikesyre og påført HPLC-25 kolonnen med en sprøjte; (b) det lyofiliserede materiale (5-10 mg) blev opløst i 20 ml 4 M eddikesyre, centrifugeret og påført kolonnen via en opløsningsmiddelport på HPLC; (c) det ulyofiliserede materiale (ca. 100 ml) blev filtreret. gennem et 0,5 Jim filter (FH; Millipore Corp.) før på-30 føring via en opløsningsmiddelport på kolonnen ved en strømningshastighed på 2 ml/min.

Inhibinområdeme fra masseforløbene (b) og (c) blev rechro-matograferet. Hver fraktion blev kombineret med indholdet 8 DK 171711 B1 af de tilsvarende rør fra gentagelsesforløbene (om nødvendigt) og aliquoter blev taget til bioprøve, aminosyreanalyse og SDS-PAGE. Acetonitrilet fra hver fraktion blev derpå fjernet ved afdampning under Ng, og prøven blev lyofilise-5 ret. Som det fremgår af fig. 3 blev inhibinaktivitet fundet i et område af chr omat ogrammet svarende til ca. 30% acetonitril. Prøvebelastningen i dette forsøg var 1 mg.

Der blev opnået inhibinudbytter på 40% ved de forskellige belastningsprocedurer, skønt HPLC-kolonneudbyttet var 10 mærkbart influeret af de to sidste procedurer. Der blev opnået en tidobbelt forøgelse i specifik aktivitet med dette HPLC-trin med en total forøgelse i specifik aktivitet på 160 gange.

Trin D: 15 Præparativ polvacrvlamidgelelektroforese

De inhibin-holdige fraktioner opnået ved RP-HPLC blev opløst i ikke-reducerende prøvepuffer (0,06 M Tris-HCl, pH

6.8, 12,5% glycerol, 1,25% efter vægt/vol. SDS og 0,006% bromphenol blåt) og fraktioneret på et lodret polyacrylamid- 20 gelelektroforeseapparat (Reid og Bieleski, Analytical Bio chemistry, 22, (1968) 374) med modifikationer. SDS-polyacryl-amidgelelektroforeseopløsningeme (Laemmli, Nature 227,

(1970) 680) bestod af en stablegel (0,125 M Tris-HCl, pH

6.8, 0,1% efter vægt/vol. SDS, 5% acrylamid, 0,13% Bis-25 acrylamid, 0,1% ammoniumper sulfat) og en adskillende gel (0,38 M Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% efter vægt/vol. SDS, 7,5% acrylamid, 0,2% Bis-acrylamid, 0,03% ammoniumper sulf at). Elektrof ore sepufferen var 2,5 mM Tris-glycinpuffer indeholdende 0,05% (vægt/vol.) SDS. Proteinbelastningen (500-700 μg) 30 blev delt mellem de otte prøveslidser.

Gelerne blev elektroforeseret til at begynde med ved 20 mA, indtil prøven var vandret over i den adskillende gel (1,5 9 DK 171711 B1 timer), hvorpå strømmen blev forøget til 30 mA i forsøgets varighed (4 timer), indtil bromphenol blåt-markøren nåede bunden af gelen. Gelen blev farvet med 0,59é Coomassie-blåt i eddike syre: i sopropylalkohol: vand 1:3:6 vol./vol. (15 min.) 5 og affarvet med eddikesyre:methanol:vand, 50:165:785 vol./-vol., og inhibinområdet (molekylvægt ca. 56000), som blev gjort synligt ved denne procedure, blev delt i 2 mm skiver under anvendelse af en skalpel og lineal. Gelskiver over og under inhibinområdet blev også udtaget. Gelskiverne blev 10 opbevaret i lukkede rør ved -15 til -20°C før elektroforetisk eluering.

Fig. 4 viser reducerede og ikke-reducerede SDS-gelelektro-foretiske mønstre for 4 sekvensfraktioner (A, B, C og D) opnået ved præparativ PAGE-rensning. Inhibinaktivitet blev 15 lokaliseret primært i fraktion B (tilsyneladende molvægt 56000 - 1000 middelværdi - SD; 5 rensede inhibinpræparater). Under reducerende betingelser blev fraktion B reduceret til to hovedbånd med tilsyneladende molekylvægte på 44000 - 3000 og 14000 - 2000 (n = 5) (bane E). Laemmli (1970) SDS-PAGE-20 systemet blev anvendt. Proteiner blev lokaliseret ved sølvfarvning. Anvendte proteinstandarder var: bovin serumalbumin (molekylvægt 67000); ovalbumin (43000); carboanhydrase (29000); gåselysozym (21000); hønseæglysozym (14500). Re-duktanten var 0,1% 2-mercaptoethanol.

25 Trin E:

Elektroforetisk eluering ved stuetemperatur

Den anvendte metode var modificeret fra metoden af Hunkapil-ler et al. (Methods in Enzymology, (1983) 227). Gelskiver blev skåret i terninger i destilleret vand med et bar-30 berblad, vasket i elueringspuffer (0,1% SDS i 0,05 M

NH^HCO^) i 5 minutter og anbragt i en elektroforetisk elu-eringscelle udstyret med dialysemembranskiver (6000-8000 molekylvægtsafskæring). Gelskiverne blev dækket med udblø- 10 DK 171711 B1 dende puffer (2% SDS i 0,4 M NH^HCO^) og overlagt med elu-eringspuffer (0,19é SDS i 0,05 M NH^HCO^)· Fast natriumthio-glycolat til en slutkoncentration på 0,5 mM blev sat til elueringspufferen. Gelstykker fik lov at opbløde i 3-5 ti-5 mer før initiering af den elektroforetiske elueringsproces ved 50 V (jævnstrøm). Efter 12-16 timers forløb blev elueringspuf feren erstattet med dialysepuffer (0,0296 SDS i 0,01 M NH^HCO^) efterfulgt af yderligere elektroforetisk elue-ring ved 80 V (jævnstrøm) i 20-24 timer, indtil Coomassie-10 blåfarvningen og proteinet var vandret ind i prøveopsamlingsbrønden. Den eluerede prøve blev fjernet fra opsamlingsbrønden ved hjælp af en 50 pliter Hamilton-sprøjte med bøjet spids, indstillet og enten frosset eller lyofiliseret. Prøver af de rensede fraktioner blev sat til side til in vitro 15 bioprøven, aminosyreanalyse og molekylvægtsbestemmelse under anvendelse af SDS-PAGE som anvendt med sølvfarvningsteknikken.

Under anvendelse af rensningsprocedurer baseret på ovennævnte metoder, dvs. en kombination af gelpermeeringschromatogra-20 fi, RP-HPLC og præparativ PAGE, blev inhibinaktivitet .udvundet som et enkelt proteinbånd på SDS-PAGE (fig. 4) med en tilsyneladende molekylvægt på 56000 ί 1000 (5 præparationer).

De rensede præparationer af inhibin undertrykker FSH, men ikke luteiniserende hormon, thyroidstimulerende hormon el-25 ler prolactin i in vitro bioprøven, hvilket indikerer., at det rensede produkt er specifikt til at undertrykke FSH. Undertrykkelsen skyldes ikke ikke-specifikke toksiske virkninger.

EKSEMPEL 2 30 Alternative rensningsprocedurer

Inhibin blev isoleret som i eksempel 1 med den ændring, at inhibin blev udfældet ved indstilling af pH for mellem- 11 DK 171711 B1 rumvolumenfraktionen fra trin A til pH 4,75 med 4 M eddikesyre og centrifugeret ved 12000 x g i 30 minutter ved 4°C.

Den resulterende pellet blev opløst i 0,05 M ammoniumacetat pH 7,0. Solubiliseringen af pellet blev hjulpet ved homoge-5 nisering og lydbehandling i puffer ved stuetemperatur. Prøven blev indstillet til 4 M eddikesyre med iseddikesyre og centrifugeret før påføring på kolonnen til det andet gel-permeeringstrin (trin B). De totale udbytter af inhibinakti-vitet, herunder pH-udfældning og syrning af den opløste pel-10 let, var 34%. Modifikationen har den fordel, at kolonneprø-vevolumenet er reduceret med 75%, hvilket tillader større gennemstrømning af materiale. Inhibinaktivitet blev udvundet i lignende kolonnefraktioner (elueringsvolumina 1700-2100 ml) som de i proceduren fra eksempel 1 efter fraktio-15 nering ved gelfiltrering med 4 M eddikesyre som eluerings-puffer. Den efterfølgende opførsel af inhibin på RP-HPLC og PREP-PAGE blev ikke påvirket af de forskellige modifikationer undersøgt i dette eksempel.

EKSEMPEL 3 20 Yderligere kemisk karakterisering af inhibin

Analytisk SDS-PAGE af slutproduktet under ikke-reducerende betingelser gav et enkelt bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 56000 - 1000 (middelværdi - SD, 5 præparationer), mens der under reducerende betingelser blev iagttaget to 25 hovedbånd med tilsyneladende molekylvægte på 44000 i 3000 og 14000 ί 2000 (5 præparationer). Sandsynlighed for homo-genisitet blev iagttaget som bestemt ud fra elektroforese af 56 kD-båndet under ikke-reducerende betingelser og 44 kD-båndet under reducerende betingelser. Det tilsyneladende 30 molekylvægtsområde for 56 kD-materialet var mellem 54000 og 57000, mens det for 44 kD-materialet var mellem 42000 og 46000. Et enkelt bånd blev iagttaget med 14 kD-båndet.

Disse resultater er i overensstemmelse med dette molekyles glycoproteinnatur.

12 DK 171711 B1 pi-værdierne for intakt inhibin og den større underenhed blev bestemt under anvendelse af det todimensionale PAGE-system ifølge O’Farrell, P.H., J. Biol. Chem., 250 (1975)» 4007-4021. Intakt inhibin blev detekteret ved sølvfarvning 5 og viste et enkelt bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 56000, men med flere nært tilknyttede pletter med pl-værdier i pH-området 6,9-7,3. Disse data antyder et glyco-proteinpræparat. Underenheden med en molekylvægt på 44000 viste et enkelt bånd med en tilsyneladende molekylvægt på 10 46000 med nært tilknyttede pletter med pi-værdier i pH-om- rådet 6,0-7,0, hvilket antyder, at denne underenhed er et glycoprotein.

Yderligere sandsynlighed for, at inhibin er et glycoprotein, blev opnået ved: 15 (a) Evnen for radiomærket inhibin til at binde til lec- tinet Concanavalin A immobiliseret på Sepharose (varemærke tilhørende Pharmacia, Uppsala, Sverige).

Ud fra forskellige forsøg bandt 15-17% af sporstoffet til lectin og blev frigjort efter eluering med 20 sukkerarten methyl-α-D-glucopyranosid (Calbiochem,

San Diego, USA).

(b) Binding af peberrodperoxidase-mærket hvedekimlectin til inhibin efterfulgt af fraktionering af inhibin på SDS-PAGE og elektrooverførsel af proteinet til 25 nitrocellulose. Bindingen af lectinet blev vist ved intensiteten af peroxidasefarvereaktionen. Lectin-binding var forbundet med det 56 kD intakte protein og med 44 kD underenheden.

EKSEMPEL 4 30 Den N-terminale aminosvresekvens for inhibins to underenheder Et renset inhibinpræparat blev reduceret og carboxymethyle- 13 DK 171711 B1 ret, og de to underenheder med tilsyneladende molekylvægte på 44000 og henholdsvis 14000 blev adskilt ved PAGE og udvundet fra gelen ved en elektroelueringsproces som beskrevet i trin E, eksempel 1 i det foregående. SDS blev fjernet 5 ved methanoludfældning af inhibin og den N-terminale aminosyre sekvens bestemt.

Sekvenserne for de to underenheder er:

Rest 44 kD underenhed 14 kD underenhed 1 xxx Tyr 10 2 Ala Leu 3 Val Glu 4 Gly yyy 5 Gly Asp 6 Phe Gly 15 7 Met Lys 8 Arg Val 9 Arg Asx 10 Gly Ile 11 Ser Gin 20 12 Glu yyy 13 Pro Lys 14 Glu Lys 15 Asp 16 Gin 25 xxx = uklar yyy = ubestemmelig - utilstrækkeligt materiale i disse forsøg

Asx = Asn eller Asp.

14 DK 171711 B1 EKSEMPEL 5

Dannelse af antistoffer mod renset inhibin 19 ug inhibin renset som beskrevet i det foregående blev opløst i 600 filter Dulbecco's phosphatpuffer pH 7,4 og e-5 mulgeret med et lige så stort volumen oliebaseret adjuvans (f.eks. Marcol 52:Montanide 888 i forholdet 9:1. Marcol 52 er et varemærke tilhørende Esso, og Montanide 888 er et varemærke tilhørende S.E.P.P.I.C., Paris). 200 piliter blev injiceret i hver af fire intramuskulære steder og 200 μΐϊ-10 ter injiceret subkutant i en kanin. Dyret blev efterinjice-ret 6 uger senere med 800 UE renset inhibin under anvendelse af samme injektionsprocedure som i det foregående. Antistof-titeren i kaninserum blev bestemt ved dets evne til at binde til ioderet inhibin (for detaljer se i det følgende) el-15 ler ved dets evne til at neutralisere inhibinaktivitet in vitro. Den højeste titer blev observeret 2 uger efter efter-injektion (uge 8 prøve), og vendte tilbage til præimmuniseringskoncentrationer ved uge 17-18.

Under immunisering forøgede kaninen sit testikelvolumen 20 fra 3,0 til 3,5 ml, hvilket indikerede, at immunisering mod inhibin kan forøge gonadalvægt, antagelig ved neutralisering af endogen inhibin, hvilket således bevirker forøgelse af FSH-mængder.

EKSEMPEL 6 25 Anti serum-karakterisering

Uge 8 antiserum fra kaninen, fremstillet som beskrevet i det foregående, blev undersøgt for dets evne til at neutralisere inhibinaktivitet in vitro. Et kulbehandlet bovint follikelvæskepræparat blev anvendt som inhibinstandard i 30 en in vitro inhibin bioprøve (Scott et al., Endocrinology, 107, 1980, 1536). Det viste sig, at 2 eliter antiserum var 15 DK 171711 B1 tilstrækkeligt til at neutralisere en dosis inhibin (2 enheder), der var kendt f,or at give et maksimalt respons i prøven. Denne neutraliseringsaktivitet var ikke til stede i præimmuniseringsserum. En anden kanin blev immuniseret til 5 at begynde med med et mindre rent inhibinpræparat (340 pg opnået efter RP-HPLC-rensningstrinnet) og efter-immuniseret med 22 μζ rent inhibin. Den initiale immuniseringsinjektion var i complete Freund’s adjuvant, under anvendelse af immuniseringsmetoden af Vaitukaitas et al. (Journal of Cli-10 nical Endocrinology and Metabolism, 3^, 1971, 988), mens efterinjektionsproceduren var den samme som anført i det foregående. Antiserum (uge 9) fra dette dyr udviste også neutraliserende evner in vitro.

EKSEMPEL 7 15 Radioimmunoprøve for bFF-inhibin

Rensede præparater af inhibin blev ioderet enten ved en mild chloramin-T-procedure eller ved anvendelse af Bolton-Hunter- reagenset (Bolton and Hunter, Biochem J. 133 (1973) 529) til en specifik aktivitet på 0,5 μCi./μg som bestemt ved en 20 selverstatningsprocedure i den i det foregående beskrevne radioimmunoprøvemetode. Det ioderede materiale viste samme tilsyneladende molekylvægt som det ikke-ioderede molekyle som afprøvet ved SDS-PAGE under reducerende og ikke-reduce- rende betingelser. Under anvendelse af det ioderede sporstof 25 blev en radioimmunoprøveprocedure afledt under anvendelse af et polyethylenglycol-lettet andet antistofudfældningstrin for at skille antistof-bundet fra -ubundet ioderet hormon (Peterson, M.A. og Swerdloff, R.S.: Clin. Chem. 2£ (1979) 1239-1241). Karakteristiske erstatningskurver blev opnået 30 for rensede og ufraktionerede bFF-præparater. Dosis/respons- kurven for det rensede materiale udviste en følsomhed (ED^q) på 10 ng/rør med ED,-n på 25 ng/rør. Dissociationskonstanten

3" —TO

for inhibin/antistof-interaktionen var 4,5 x 10 M ved 20°C.

16 DK 171711 B1 EKSEMPEL 8

Inhibering af ovulation i med human chorionisk gonadotrophin- stimulerede 5-dages gravide mus_ Rå ekstrakter af bovin follikelvæske er tidligere blevet 5 vist at udvise ovulation. Inhiberingen kan fuldstændig vendes med FSH (L. Cummins, Ph.D. Thesis, 1983, University of New England (Armidale)).

5-7 dage gravide mus blev indgivet 1,5 pg inhibin subkutant kl. 9 a.m. efterfulgt af subkutan injektion af 10 IU HCG 10 kl. 6 p.m. Den følgende morgen blev antallet af æg i æggelederens ampulla talt. Inhibinadmirtistrering inhiberede signifikant ovulation som det fremgår af tabel 1.

TABEL 1

Prøve Antal dyr Antal æg i ampulla 15 Kontrol (opløs- .

ningsmiddel alene) 11 4,91-2,66

Renset inhibin* 7 2,43-2,22 bFF** (50 pliter) 8 3,38 ± 1,80 bFF (100 pliter) 4 2,0 - 0,0 20 - Inhibinpræparat 75% rent baseret på intensitet af sølv farvning på SDS-PAGE. Forureningerne består af materiale med højere molekylvægt (molvægt 65-70 kD), som er biologisk inaktivt i in vitro inhibin-bioprøven. Dosis ca. 1,5 pg protein/dyr.

25 - Indeholdende 20 pg/ml inhibin baseret på in vitro inhi- bin-bioprøve.

Renset inhibin og 100 pliter bFF-bouillon resulterede i 17 DK 171711 B1 signifikant inhibering af ovulation sammenlignet med kontrollen (p<0,01 og p<.0,05 henholdsvis ved Wilcoxon's test).

EKSEMPEL 9

Virkning af immunisering -på plasma FSH-koncentrationer 5 I eksempel 5 i det foregående blev en kanin immuniseret og efter-immuniseret ved to yderligere lejligheder med renset inhibin. Således opnået antiserum neutraliserede inhibinak-tivitet i in vitro bioprøven. Det skulle forventes, at in vivo ville antiserum neutralisere cirkulerende inhibin fø-10 rende til forøgelse af cirkulerende FSH. Kaninens plasma FSH udviste en forøgelse og et fald i overensstemmelse med titeren for inhibinantistoffet i kaninserum. Resultaterne er som vist i tabel 2.

TABEL 2 15 Antal uger

efter efter- Antal se- . Plasma FSH

injektion rumprøver Antistoftiter* ng/ml 3-6, 17, 21 6 <10,25 4,87 - 0,76a 11-14 3 0,67 - 0,19 5,44 - 0,24b 20 7-10 3 2,13-0,45 6,15 - 0,44c * - Reciprok af antiserumvolumen (filter) krævet for at neutralisere 1,5 U inhibin i in vitro inhibin-bioprøven.

a mod c; a mod b og c; p<0,05.

EKSEMPEL 10 25 Undertrykkelse af cirkulerende FSH efter akut administre- ring af inhibin til kastrerede hanrotter_

Det forventes, at renset inhibin, som det ses i det følgende 18 DK 171711 B1 forsøg med bovin follikelvæske, ville undertrykke cirkulerende FSH inden for 4-8 timer efter administrering. Inhibin (bovin follikelvæske) blev administreret via halsblodåren til kredsløbet på 34 dage gamle hanrotter, som var blevet 5 kastreret 3 dage tidligere, og mængderne af plasma-FSH 5 timer senere blev bestemt ved FSH-radioimmunoassay.

Der var en signifikant dosisafhængig nedgang i FSH forbundet med forøgede doser bovin follikelvæske. Resultater er vist i tabel 3.

10 TABEL 3

Plasma udtrykt som % af

Prøve Antal dyr præin.iektio nsmængder

Kontrol (opløs- ningsmiddel alene) 5 99,3 - 12,8a 15 bFF1 (62,5 pliter) 5 80,8 - 5,5b bFF (125 eliter) 5 66,6 - 10,3° bFF (250 pliter) 5 51,9 - 7,0d - Indeholdende 20 pg/ml inhibin baseret på in vitro inhi- bin-bioprøve.

20 a mod b; b mod c; c mod d p < 0,05 EKSEMPEL 11

Rensning af inhibin fra ovin follikelvæske

Det har vist sig, at inhibinaktivitet fra ovin follikelvæske renses på lignende måde som bFF-inhibin under anven-25 delse af rensningstrin A, B og C i det foregående. Dets e- genskaber efter trin D og E er svarende til egenskaberne for bFF-inhibin. Ved forlængelse forventes det, at rensnings-trin A til E ville være anvendelige for andre patte dyr- irihi-biner, herunder inhibin fra mennesket.

19 DK 171711 B1

Da FSH er vigtig i stimuleringen af ovarie- og testikelfunktion, ligger de væsentlige potentielle anvendelser for renset inhibin i dets evne til specifikt at inhibere FSH-sekre-tion eller i dets anvendelse som et antigen, så at immuni-5 sering mod inhibin vil give antistoffer, der er i stand til at neutralisere endogen-forekommende inhibin, hvorved FSH-koncentrationerne stiger. Der har været foretaget mange studier in vivo under anvendelse af rå eller delvis rensede ekstrakter fra gonadalvæv eller -væsker i forsøg på at studere 10 virkningen og fysiologien af inhibin. I disse eksperimenter omfatter virkninger tilskrevet, men ikke vist at skyldes inhibin eller antistoffer mod inhibin: 1. Inhibering af gonadal funktion (Moudgal et al., 1985 i Gonadal Proteins and Peptides and their Biological Sig- 15 nificance (ed. Sairam), World Scientific Publishing,

Singapore (under trykning)).

2. En forøgelse i ovulationsgrad (Henderson et al., J. Endocrinol. 102, (1984) 305; Cummins et al., Proc. Aust.

Soc. Reprod. Biol. 15 (1983) 81).

20 3. En forbedring af igangsætningen af pubertet (Al Obaidi et al., Proc. Aust. Soc. Reprod. Biol., 1£ (1983) 80).

De kendte egenskaber for inhibin og FSH antyder en række mulige anvendelser for det rensede inhibin og antistof mod inhibin ifølge den foreliggende opfindelse:

25 (i) Forøgelse af ovulationsgrad; det er anerkendt, at FSH

stimulerer udviklingen af æg i pattedyrovarier (Ross et al., (1981) i Textbook of Endocrinology, udg. Williams, p. 355), og at for megen stimulation af ovarierne med FSH vil føre til multiovulationer (Gemzell, Induc-30 tion of ovulation with human gonadotrophins, Recent

Prog. Hormone Res. 21 (1965) 179). Eet har nu vist sig, at inhibin vil undertrykke FSH såvel in vitro som in vi- 20 DK 171711 B1 vo, og at inhibin kan anvendes som et immunogen til at danne neutraliserende antistoffer mod inhibin. Immuniseringen af pattedyr, f.eks. kvæg og får, med det rensede inhibinpræparat og et egnet adjuvans fører til 5 udviklingen af antistoffer i injicerede dyr. Disse an tistoffer neutraliserer dyrets egen inhibinproduktion, hvorved man fjerner den undertrykkende virkning på FSH-sekretion. Den resulterende forøgelse af FSH fører til forøget stimulering af follikeludvikling i 10 ovariet med en forøgelse i ovulationsgraden til følge.

Samling af serum fra dyr immuniseret mod inhibin giver også et antiserum, som kan anvendes til passiv immunisering af andre dyr. Ved denne metode neutraliserer injektionen af inhibinantiserum dyrets eget inhibin 15 og fører derfor til en forøgelse af FSH og den efter følgende virkning ved stimulering af ovulation. Både den passive og den aktive metode til immunisering kan anvendes til at forøge ovulationsgraden.

Styrken ved anvendelse af inhibin til aktiv immunise-20 ring til opnåelse af gonadal vækst er vist ved forøgel sen i testikelstørrelse for den kanin, der er afprøvet under immunisering mod inhibin (eksempel 5)· (ii) Inhibering af ovarie- og testikelfunktion: den iagttagne betydning af FSH ved stimuleringen af follikel-25 udvikling i ovariet og spermaproduktion i testis (Ross et al., (1981), i Textbook of Endocrinology, udg. Williams, p. 355» Bardin og Paulsen, (.1981), The Testes, i Textbook of Endocrinology, udg. Williams, p. 293) understøtter en kraftig rolle for inhibin ved 30 undertrykkelsen af gonadalfunktion. Det forventes, at administreringen af inhibin vil føre til en undertrykkelse af ovarie- og testikelfunktion og en afbrydelse af fertiliteten. Denne virkning for inhibin kan anvendes i handyr og hundyr, mennesker, fåre- og kvæg- 21 DK 171711 B1 arter og kan sandsynligvis anvendes på andre arter.

(iii) Fremme af igangsætningen af fertilitet: det blev iagttaget, at en af de tidligste begivenheder i igangsætningen af pubertet er forøgelsen af FSH-mængder, som 5 fører til ovarie- og testikelstimulering (Ross et al., (1981) i Textbook of Endocrinology, udg. Williams, p. 355; Bardin og Paulsen, (1981), The Testes, i Textbook of Endocrinology, udg. Williams, p. 293). Det er muligt, at immunisering af seksuelt umodne pattedyr 10 mod inhibin, ved aktiv eller passiv teknik, vil føre til en for tidlig igangsætning af pubertet med deraf følgende stimulering af ovarie- og testikelfunktion.

Den reproduktive formåen i levetiden for husdyr, såsom køer, får og svin, afhænger af alderen ved igang-15 sætning af pubertet, intervallerne mellem hver koncep tion og muligheden for efterfølgende ovariesvigt med fremadskridende alder. Immunisering af unge dyr før pubertet med inhibin, enten ved aktiv eller passiv immunisering, neutraliserer dyrets egen inhibinproduk-20 tion og fører til en forøgelse af FSH. Denne forøgel se i FSH-mængder inducerer pubertetsudvikling ved en tidligere alder end normalt ved stimulering af kønskirtlerne. Denne metode kan anvendes til at indføre tidlig pubertet i han- eller hundyr.

25 (iv) Undertrykning af pubertet: da FSH anerkendes som en afgørende faktor ved igangsætningen af pubertet, kan administrering af inhibin anvendes som middel til at undertrykke pubertet i uønskede situationer, f.eks. for tidlig pubertetsudvikling hos mennesker, eller 30 til at forsinke igangsætningen af pubertet.

(v) Inhibin kan anvendes som et immunogen til at danne antisera eller monoklonale antistoffer, som kan anvendes til at udvikle radioimmunoprøver eller enzymbundne 22 DK 171711 B1 immunoprøver til måling af inhibin og til at udvikle immunoadsorptionskolonner til hjælp ved rensningen af inhibin.

(vi) Under anvendelse af ovennævnte antisera er der blevet 5 udviklet et radioimmunoprøvesystem til måling af in hibin, som muliggør målingen af inhibin i biologiske prøver (f.eks. plasma, serum eller? .urin), som ikke er mulig under anvendelse af det hidtil kendte in vitro bioprøvesystem af Scott et al. (1980). Inhibin-10 mængder i plasma eller serum vil give et Sertoli-cel- leindeks og granulosa-cellefunktion for anvendelse i diagnosen af den fertile status.

(vii) Det er muligt, at administrering af høje doser inhibin kan inhibere. sekretionen af LH. Dette ville yder- 15 ligere understøtte inhibins evne til at undertrykke ovulation.

Claims

23 DK 171711 B1

1. Inhibin, der er isoleret fra mammal ovariefollikelvæs-ke, kendetegnet ved, at 5 (a) inhibinets tilsyneladende molekylvægt, bestemt ved SDS-PAGE, er 56000 + 1000, (b) inhibinets isoelektriske punkt ligger i området 6,9- 7,3, (c) inhibinet kan bindes specifikt til Concanavalin

10 A-Sepharose, (d) inhibinet består af to underenheder, der kan adskilles efter reduktion som bestemt ved SDS-PAGE, karakteriseret ved, at (i) deres tilsyneladende molekylvægte er henholds- 15 vis 44000 ± 3000 og 14000 ± 2000, (ii) det isoelektriske punkt for underenheden med molekylvægten 44000 ligger i området 6,0-7,0, (iii) de N-terminale aminosyresekvenser for de to underenheder er: 24 DK 171711 B1 Rest 44 kD underenhed 14 kD underenhed 1 xxx Tyr

2. Monoklonalt eller polyklonalt antistofpræparat rettet mod inhibin ifølge krav 1.

2 Ala Leu

3. Immunoassay for inhibin, kendetegnet ved anvendelse af inhibin ifølge krav 1 som et antistof.

3 Val Glu

4. Antistof, kendetegnet ved, at det består af mærket inhibin ifølge krav 1. 25 DK 171711 B1

4 Gly yyy

5. Diagnostiseringsmetode for inhibin, kendetegnet ved anvendelsen af mærket antistof ifølge krav 4.

5 Gly Asp

6. Protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at proteinet er mærket.

6 Phe Gly

7. Radioimmunoassay for inhibin, kendetegnet ved, at et radiomærket protein ifølge krav 6 omsættes med et antistof for inhibin.

7 Met Lys

8. Radioimmunoassay ifølge krav 7, kendeteg-10 net ved, at det yderligere omfatter et udfældningstrin, hvorved der anvendes endnu et antistof og polyethy-lenglycol.

8 Arg Val

9. Enzymbundet immunoassay, der er karakteriseret ved anvendelse af et protein ifølge krav 1, koblet til et en- 15 zym.

9 Arg Asx

10 Gly Ile

11 Ser Gin

12 Glu yyy

13 Pro Lys

14 Glu Lys

15 Asp

16 Gin (e) inhibinet kan undertrykke follikelstimulerende hormon, men ikke luteiniseringshormon, thyroidstimule- 5 rende hormon eller prolactin i et in vitro bioprøve system, (f) inhibinet kan mærkes med radioaktivt iod.

10. Enzymbundet immunoassay, der er karakteriseret ved anvendelse af et antistof for inhibin ifølge krav 1, koblet til et enzym.