JP2521707B2 - 卵胞液から単離したインヒビン - Google Patents

卵胞液から単離したインヒビン

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳動物の卵胞液からの生物学的に活性な因
子の単離とその有用な使用に関する。
状況証拠と限られた実験から既に1932年に、下垂体に
よる卵胞刺激ホルモン（FSH）の分泌を選択的に抑制す
る能力のある非ステロイド因子（インヒビンと命名され
た）を性腺が産生していることが示唆された（マクラフ
（McCullagh）、サイエンス第76巻、（1932年）19
頁）。それ以来FSHを測定するラジオイムノアツセイが
開発されてインヒビンの存在を示唆する大量のデータが
蓄積されたが、1970年代の初期に初めてこの物質の単離
と同定が試みられた。以後多くのグループの研究者が、
起源の異なる数種の性腺からインヒビンの精製を試みた
が、その結果は矛盾していた（デ ジヨング（de Jon
g）、モレキユラー・アンド・セリユラー・エンドクリ
ノロジー（Mol.Cell.Endocrinol.）第13巻、（1979年）
１頁）。ある研究者たちはヒトの精漿からインヒビンを
単離し配列を決定して、インヒビンの分子種の分子量は
5,000ダルトンと14,000ダルトンであると主張している
（セイダ（Seidah）ら、エフイービーエスレターズ（FE
BS Letters）第167巻、（1984年）98頁；シエス（Shet
h）ら、エフイービーエスレターズ（FEBS Letters）第1
65巻、（1984年）11頁）。さらにこれらの物質が性腺に
由来するものか否かについて真剣に疑問を持たれている
（ベクサツク（Beksac）ら、インターナシヨナル・ジヤ
ーナル・オブ・アンドロロジー（Int.J.Andrology）第
７巻、（1984年）389頁；リリア（Lilja）とジエプソン
（Jepppsson）、エフイービーエスレターズ（FEBS Lett
ers）第182巻、（1985年）181頁）。他のグループの研
究者たちは性腺のインヒビンを単離するために、睾丸の
精細管（睾丸網液）から採取した液及び卵胞液を使用し
てきた。しかし12年間の研究にもかかわらず精製した物
質は得られていない。これらの事実は、インヒビンと規
定される物質の性質、化学的特質又はその産生部位に関
して一致した見解が得られていないことを示している。
牛の卵胞液の性質から、特異的な機能を有する１個又
は２個以上の物質（「インヒビン」）が存在するという
仮説に結びついた。我々はインヒビンに特徴的な全ての
生物学的基準を満たす物質を性腺より単離した。
本発明はインヒビンの精製と単離、抗体産生のための
精製インヒビンの使用、定量ラジオイムノアツセイにお
けるインヒビンと該抗血清の使用、及びインビトロ及び
インビボでのインヒビンとインヒビンに対する抗体の応
用に関する。
本発明の１つの態様では下記の特徴を有する精製蛋白
（インヒビン）が与えられる： （ａ）SDS-PAGEで決定したみかけの分子量は56,000±1,
000である； （ｂ）等電点は6.9-7.3の範囲にある； （ｃ）この蛋白はコンカナバリンＡ−セフアロースに特
異的に結合する； （ｄ）この蛋白は、下記の特徴を有する２個のサブユニ
ツトより成る： （ｉ）SDS-PAGEで決定したみかけの分子量はそれぞれ4
4,000±3,000と14,000±2,000である、 （ii）分子量44,000のサブユニツトの等電点は6.0-7.0
の範囲にある、 （iii）２個のサブユニツトのＮ−末端アミノ酸配列は
後述する通りである： （ｅ）この蛋白はインビトロ（in vitro）のバイオアツ
セイ系で卵胞刺激ホルモンを抑制するが黄体化ホルモ
ン、甲状腺刺激ホルモン又はプロラクチンを抑制しな
い； （ｆ）この蛋白は放射性ヨードで標識され得る。
本発明の別の態様では下記の段階から成ることを特徴
とする、哺乳動物の卵胞液からインヒビンを単離及び精
製する方法が与えられる： （ａ）１回以上のゲル浸透クロマトグラフイーの段階； （ｂ）１回以上の逆相高速液体クロマトグラフイー段
階； （ｃ）１回以上の調製ポリアクリルアミドゲル電気泳動
段階； （ｄ）精製したインヒビンの電気泳動による溶出。
好ましくはゲル浸透クロマトグラフイー段階はポア
（孔）容積の大きいゲル浸透支持体、例えばセフアクリ
ルS200又はセフアデツクスG100（セフアクリル及びセフ
アデツクス共にフアルマシア社の登録商標である）を用
いて行う。
凍結乾燥又は真空乾燥により生物活性の直接の回収を
可能にするため、好適な溶出法では揮発性溶媒（例えば
酢酸アンモニウム、酢酸、又は類似化合物）を用いる。
逆相高速液体クロマトグラフイーは好ましくは、粒子
径分布の小さい（最も好ましくは5-10μ）の化学結合し
たＮ−アルキルシリカカラム充填剤を用いて行う。使用
する溶媒は揮発性又は非揮発性でもよく、メタノール、
アセトニトリル、又はイソプロパノール等の混和性有機
溶媒を有する水の濃度勾配液中に、トリフルオロ酢酸
（TFA）、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又は
リン酸ナトリウム等のイオン性改質剤を含有していても
よい。好適な方法では0.1％のTFA中の0-50％のアセトニ
トリル濃度勾配を用いる。種々の孔径と架橋度を有する
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）用ゲルを用い
る種々の調製ポリアクリルアミドゲル電気泳動法がドデ
シル硫酸ナトリウムの存在下で使用可能である。電気泳
動用の好適な緩衝液系はリームリ（Laemmli）の方法
（ネイチヤー第227巻、（1970年）680頁）に基づく。
さらにインビトロのバイオアツセイでインヒビンの活
性を中和する能力と、インビボで性腺の重量を上昇させ
る能力のあるインヒビンに対する特異的抗体を作成する
方法が与えられる。
またさらに生体試料（例えば血漿、血清又は尿）中の
インヒビンの測定に用いるインヒビンのラジオイムノア
ツセイ法が与えられる。
下記の非限定的実施例と図を参照して例示の目的で、
本発明の１つの態様を詳細に説明する。
第１図はセフアクリルS-200で分画した牛の卵胞液（b
FF）中のインヒビン活性の溶出プロフイールを示す。
第２図はセフアデツクスG100で分画したbFF中のイン
ヒビン活性の溶出プロフイールを示す。
第３図はゲルクロマトグラフイーの後で逆相高速液体
クロマトグラフイー（RP-HPLC）で分画したbFF中のイン
ヒビン活性の溶出プロフイールを示す。
第４図は調製PAGEにより得た４個の連続画分の非還元
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示
す。
ここで使用する省略語は下記の意味を有する： bFF −牛卵胞液 RP-HPLC −逆相高速液体クロマトグラフイー PAGE −ポリアクリルアミドゲル電気泳動 FSH −卵胞刺激ホルモン LH −黄体化ホルモン Ｕ −単位 GF −ゲル濾過 kD −キロダルトン TFA −トリフルオロ酢酸 SDS −ドデシル硫酸ナトリウム 実施例1:牛卵胞液からのインヒビンの精製 この精製操作は１回以上のゲル浸透段階、１回以上の
逆相高速液体クロマトグラフイー段階及び１回以上のPA
GE段階の連続的応用に基づく。
卵胞液の採取（bFF） 牛の卵巣は地方の屠殺場から得た。bFFを吸引してプ
ロテアーゼインヒビターであるトラジロール（10u/ml）
とフツ化フエニルメチルスルフオニル（24μg/ml）の入
つた冷却した容器中に移した。このbFFを−20℃で保存
した。
インヒビンの精製操作は四段階より成る。下記にこの
操作の概略と詳細な精製法を示す。
精製操作の段階は以下の通りである： （Ａ）セフアクリルS-200によるゲル浸透クロマトグラ
フイー。
（Ｂ）セフアデツクスG-100によるゲル浸透クロマトグ
ラフイー。
（Ｃ）逆相高速液体クロマトグラフイー。
（Ｄ）調製ポリアクリルアミドゲル電気泳動。
（Ｅ）試料の電気泳動による溶出。
インヒビンの精製はストツトらの方法（エンドクリノ
ロジー（Endocrinology）第107巻、（1980年）1536頁）
を若干改良して使用した（アウ（Au）ら、エンドクリノ
ロジー（Endocrinology）第112巻、（1983年）239
頁）。この方法はインヒビンが培養中のラツトの脳下垂
体前葉細胞からのFSH（LHは異なる）用量依存性の低下
を引き起こす能力に基づく。
Ａ段階 セフアクリルS200によるゲル浸透クロマトグラフイー： 溶出緩衝液0.05M酢酸アンモニウムpH7.0 bFF（50-100ml）を0.05M酢酸アンモニウムpH7.0（25-
50ml）で稀釈し、遠心分離した（12000g×30分、４
℃）。上澄液（75-150ml）をセフアクリルS200ゲル濾過
カラム（９×90cm）を用いて一時間当り70-100mlの流速
で分画した。第一図に示すようにインヒビン活性はこの
カラムのボイド容積部分（分子量≧90,000）に局在化し
ていた。インヒビン活性の回収率は90％が得られ比活性
は3-4倍増加していた。
Ｂ段階 セフアデツクスG100によるゲル浸透クロマトグラフイ
ー： 溶出緩衝液4M酢酸 ボイド容積画分（第１図、A,B,C,D）を集め、プール
した画分の25-50％を氷酢酸（発色原を含まない）で酸
性化して最終濃度を4M酢酸として、一時間４℃に維持し
た。残りの50-75％は次に分画するまで−20℃にて凍結
保存した。酸性化したプール（約120ml）をセフアデツ
クスG100カラム（９×90cm）にかけて4M酢酸を溶出緩衝
液として一時間当り70-100mlの流速で溶出した。いずれ
のゲル濾過カラムの場合も全ての操作は４℃で行つた。
この条件化でインヒビン活性の大部分は低分子量画分
（溶出容積1760-1880ml、分子量の範囲20,000-60,000、
第２図）に溶出し比活性は10-20倍増加しており、この
部分のインヒビン活性の回収率は45％であつた。分析カ
ラム（例えば2.5×100cm）を用いて比活性の高い（10-5
0倍）同様の活性のプロフイールが得られた。
Ｂ段階 逆相高速液体クロマトグラフイー（RP-HPLC） Ｂ段階で得られたカラムの画分（溶出容積 約1760-1
910ml）をRP-HPLCカラムにかける前にプールした。使用
したカラムはウルトラポア（Ultrapore）RPSCである。
使用した移動相は0.1％TFAの水溶液と0.1％TFA中50％の
アセトニトリルとの直線濃度勾配であり、流速は1ml/分
であり、0.5ml画分ずつ集めた。三種類の方法を用いて
カラムにかけた：（ａ）試料を凍結乾燥して1mgを4Mの
酢酸に溶解し、8-10mg乾燥重量/mlの濃度に濃縮し、約1
00μｌの4M酢酸中で遠心分離し、インジエクターを用い
てHPLCカラムにかけた；（ｂ）凍結乾燥した物質（5-10
mg）を20mlの4M酢酸に溶解し、遠心分離し、HPLCの溶媒
ポート（口）からカラムにかけた；（ｃ）凍結乾燥して
いない物質（約100ml）を0.5μのフイルター（FH;ミリ
ポア社）で濾過してから溶媒ポート（口）から2ml/分の
流速でカラムにかけた。
（ｂ）及び（ｃ）の一回目の実験から得られたインヒ
ビンの領域を再びクロマトグラフイーにかけた。各画分
を（必要な場合は）二回目のクロマトグラフイーの対応
する試験管の内容物と一緒にして、バイオアツセイ用、
アミノ酸分析用及びSDS-PAGE用に分注した。N2下で蒸発
させて各画分のアセトニトリルを除去し、試料を凍結乾
燥した。第３図に示すようにインヒビン活性はクロマト
グラムの１つの場所（約30％のアセトニトリルに対応す
る）に見出された。この実験における試料の添加料は1m
gである。
後者の２つの方法ではHPLCの性能は著しく影響を受け
たが、各添加法においてインヒビンの回収率は40％であ
つた。このHPLC操作により比活性は10倍増加し、全体で
は比活性は160倍増加した。
Ｄ段階 調製ポリアクリルアミドゲル電気泳動 RP-HPLCにより得られたインヒビン含有画分を非還元
性試料用緩衝液（0.06Mトリス−Hcl pH6.8、12.5％グリ
セロール、1.25％W/V SDS及び0.006％ブロムフエノール
ブルー）に溶解し、垂直ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分画した（レイド（Reid）とビーレスキー（Bieles
ki）、アナリテイカル・バイオケミストリー（Analytic
al Biochemistry）第22巻、（1968年）374頁、の方法を
変更した）。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動溶液
（リーム（Laemmli）、ネイチヤー第227巻、（1970年）
680頁）は充填ゲル（0.125Mトリス−Hcl pH6.8、0.1％W
/V SDS、５％アクリルアミド、0.13％ビスアクリルアミ
ド、0.1％過硫酸アンモニウム）と分離用ゲル（0.38Mト
リス−Hcl pH8.8、0.1％W/V SDS、7.5％アクリルアミ
ド、0.2％ビスアクリルアミド、0.03％過硫酸アンモニ
ウム）より構成されていた。電気泳動緩衝液は0.05％
（W/V）SDS含有2.5mMトリスグリシン緩衝液である。添
加する蛋白（500-700μｇ）を８個の試料用添加口に分
けた。
試料が分離用ゲルに移動するまで（1.5h）ゲルをまず
20mAで電気泳動し、次にブロムフエノールブルーのマー
カーがゲルの底に達するまでの間（4h）電流を30mAに増
加した。ゲルを酢酸：イソプロピルアルコール：水 1:
3:6V/V中0.5％クマシーブルーで染色し（15分）、酢
酸：メタノール：水 50:167:785V/Vで脱色した。この
方法で肉眼で見えるようにしたインヒビン領域（分子量
約56,000）をメスと定規を用いて2mmの大きさに切つ
た。インヒビン領域の上下のゲルもスライスにして切つ
た。電気泳動で溶出する前にゲルのスライスを密封した
試験管中で−15から−20℃で保存した。
第４図は調製PAGE精製により得られた４個の連続の画
分（A,B,C及びＤ）の還元及び非還元SDS−ゲル電気泳動
パターンである。インヒビン活性は主にＢ画分（見かけ
の分子量 約56,000±1,000±SD;5つの精製したインヒ
ビン調製液）に存在していた。還元条件化ではＢ画分は
見かけの分子量が44,000±3,000と14,000±2,000（ｎ＝
５）（レーンＥ）の２つのおおきなバンドに別れた。ラ
ムリ（Laemmli）のSDS-PAGE系を使用した。蛋白は銀染
色で局在化した。使用した蛋白標準品は：牛血清アルブ
ミン（分子量67,000）；卵白アルブミン（43,000）；カ
ルボニツクアンヒドラーゼ（29,000）；アヒルのリゾチ
ーム（21,000）；鶏卵リゾチウム（14,500）である。還
元剤は0.1％２−メルカプトエタノールである。
Ｅ段階 室温での電気泳動溶出 使用した方法はフンカピラー（Hunkapiller）らの方
法（メソツズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymology）第91巻、（1983年）227頁）を若干変更した
ものである。ゲルのスライスをカミソリの刃で細切れに
し、溶出緩衝液（0.05M NH4HCO3中0.1％SDS）で５分洗
滌し、透析膜デイスク（分子量のカツトオフ6,000-8,00
0）の付いた電気泳動溶出セル中に入れた。ゲルのスラ
イスを浸透用緩衝液（0.4M NH4HCO3中２％SDS）をかけ
てから溶出緩衝液（0.05M NH4HCO3中0.1％SDS）をかけ
た。溶出緩衝液に個体のチオグリコレートナトリウムを
最終濃度が0.5mMになるように添加した。ゲルを3-5時間
浸してから50V（直流）で電気泳動溶出を開始した。12-
16時間後に溶出緩衝液を透析緩衝液（0.01M NH4HCO3中
0.02％SDS）で交換し、クマシーブルー染色と蛋白が試
料捕集用穴に移動するまで80V（直流）でさらに20-24時
間電気泳動溶出した。先の曲がつた50μｌのハミルトン
シリンジで溶出した試料を試料捕集穴から取り、分注
し、凍結又は凍結乾燥した。精製した画分の試料をイン
ビトロバイオアツセイ用、アミノ酸分析用及び銀染色に
よるSDS-PAGEを用いる分子量測定用にとつておいた。
前記の方法（ゲル浸透クロマトグラフイー、RP-HPL
C、及び調製SDS-PAGEの組合わせ）を用いて、インヒビ
ン活性はSDS-PAGE（第４図）上で単一の蛋白バンドとし
て回収され、見かけの分子量は56,000±1,000（５つの
調製液）であつた。
インヒビンの精製した調製液はインビトロのバイオア
ツセイでFSHを抑制するが、黄体化ホルモン、甲状腺刺
激ホルモン又はプロラクチンを抑制せず、精製した製品
は特異的にFSHを抑制することを示している。この抑制
は非特異的毒性効果によるものではない。
実施例2:もう１つの精製法 4M酢酸を用いてＡ段階のボイド容積画分をpH4.75に
し、12,000×ｇで４℃で30分遠心分離してインヒビンを
沈降させた以外は実施例１のようにしてインヒビンを単
離した。こうして得られたペレツトを0.05Mの酢酸アン
モニウムpH7.0に溶解した。ペレツトを緩衝液中で室温
で破砕及び音波処理して可溶化した。氷酢酸を用いて試
料を4M酢酸として遠心分離してから、二回目のゲル浸透
クロマトグラフイー段階（Ｂ段階）のカラムにかけた。
溶解したペレツトのpH沈澱と酸性化を含むインヒビン活
性の総回収率は34％であつた。この変法の利点はカラム
の試料用量が75％減少しているため、試料の処理能力が
大幅に増加することである。溶出緩衝液として4M酢酸を
用いるゲル濾過により実施例１の方法と類似の画分（溶
出用量1700-2100ml）にインヒビン活性が回収された。
以後のRP-HPLC及び調製PAGE法でのインヒビンの挙動
は、この例の中の種々の変法に影響されなかつた。
実施例3:インヒビンの化学的性状の解析 最終生成物を非還元状態下で分析SDS-PAGEを行うと見
かけの分子量が56,000±1,000（平均値±標準偏差、調
製物５個）の単一のバンドが得られ、還元状態下では見
かけの分子量が44,000±3,000と14,000±2,000（調製物
５個）の２個の大きなバンドが観察された。非還元状態
下の56kDバンドと還元状態下の44kDバンドの電気泳動に
よる解析によりバンドの不均一性が観察された。56kD物
質の見かけの分子量の範囲は54,000−57,000であり、44
kD物質は42,000−46,000であつた。14kDバンドでは単一
のバンドが認められた。これらの事実はこの分子が糖蛋
白であることと一致する。
２次元PAGE系（オフアレル（Ｏ′Farrell,P,H），ジ
ヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）第250巻、（1975年）、4007-4021頁）を用い
て、未変性インヒビンと大きい方のサブユニツトのpI値
を求めた。未変性インヒビンは銀染色で検出し、見かけ
の分子量が56,000のところに単一のバンドが得られた
が、pI値がpH6.9-7.3の範囲の幾つかの非常に密接した
場所にあつた。これらのデータは糖蛋白であることを示
唆している。分子量44,000のサブユニツトは見かけの分
子量が46,000の単一のバンドを示したが、pI値がpH6.0-
7.0の範囲の幾つかの非常に密接した場所にあつた。こ
れらのデータはこのサブユニツトが糖蛋白であることを
示唆している。
インヒビンが糖蛋白であるというさらに別の理由は以
下の通りである： （ａ）放射標識インヒビンは、セフアロース（フアルマ
シア社の登録商標）に固定化されたレクチンであるコン
カナバリンＡに結合できる。数回の実験からトレーサー
の15-17％はこのレクチンに結合しており、これは糖で
あるメチル−α−グルコピラノシド（カルビオケム社、
米国サンジエゴ）による溶出で放出された。
（ｂ）SDS-PAGEによる分画とニトロセルロースへの電気
的移動後に、インヒビンは西洋ワサビペルオキシダーゼ
標識小麦胚芽レクチンに結合。レクチンの結合はペルオ
キシダーゼの発色反応により追跡した。レクチンの結合
は56kDの未変性蛋白と44kDNOサブユニツトと相関してい
た。
実施例4:インヒビンの２つのサブユニツトのＮ−未端ア
ミノ酸配列 インヒビンの精製調製物を還元しカルボキシメチル化
した。見かけの分子量がそれぞれ44,000と14,000のサブ
ユニツトをPAGEで分離し、上記実施例１のＥ段階に記載
の電気溶出法によりゲルから回収した。インヒビンのメ
タノール沈澱によりSDSを除去し、Ｎ−末端アミノ酸配
列を決定した。
二個のサブユニツトの配列は以下の通りである：残基 44kDサブユニツト 14kDサブユニツト 1 xxx Tyr 2 Ala Leu 3 Val Glu 4 Gly yyy 5 Gly Asp 6 Phe Gly 7 Met Lys 8 Arg Val 9 Arg Asx 10 Gly Ile 11 Ser Gln 12 Glu yyy 13 Pro Lys 14 Glu Lys 15 Asp 16 Gln xxx＝不明確 yyy＝測定不可能（これらの実験で試料が不十分であつ
た。） Asx＝Asn又はAsp 実施例5:精製インヒビンに対する抗体の作成 上記のように精製したインヒビン19μｇを600μｌの
ダルベツコウ（Dulbecco）のリン酸緩衝液pH7.4に溶解
し油を基剤とする等量のアジユバント（例えばマルコー
ル（Marcol）52:モンタナイド（Montanide）888の9:1の
混合物。マルコール（Marcol）52はエツソ（Esso）社の
商標であり、モンタナイド（Montanide）888はパリのエ
スイーピーピーアイシー（S.E.P.P.I.C.）社の商標であ
る）で乳化した。200μｌをウサギの筋肉内に４箇所注
射し、200μｌを皮下に注射した。６週後に同じ注射法
を用いてウサギに18μｇの精製インヒビンを追加免疫し
た。ウサギの血清中の抗体の抗体価は、ヨード化インヒ
ビンに結合するか（詳細は後述）、インビトロでインヒ
ビンを中和する活性により測定した。追加免疫後２週目
（８週目の試料）に最大の抗体価がえられ、17-18週目
までに免疫前の濃度に戻つた。免疫の間ウサギの睾丸重
量が3.0〜3.5mlに増加したが、これは恐らく外因性イン
ヒビンの中和によるインヒビンに対する免疫が性腺の重
量を増加させ、FSH濃度を増加させたことを示してい
る。
実施例6:抗体の性状解析 上記のように調製したウサギの８週目の抗血清の、イ
ンビトロでインヒビン活性を中和する能力について調べ
た。インビトロのバイオアツセイのインヒビン標準品と
して活性炭処理した牛の卵胞液を使用した（スコツト
（Scott）ら、エンドクリノロジー（Endocrinology）第
107巻、1980年、1536頁）。上記アツセイにおいて最大
の応答を与えることが知られているインヒビンの投与量
を中和するのに２μｌの抗血清で十分であつた。免疫前
のウサギにはこの中和活性は存在しなかつた。もう１羽
のウサギを最初純度の低いインヒビン調製液で免疫し
（RP-HPLC精製段階の後で得られた340μｇ）、22μｇの
純粋なインヒビンで追加免疫した。最初の免疫注射の時
はバイツカイテス（Vaitukaites）らの免疫法を用いて
完全フロイントアジユバント中で行い（ジヤーナル・オ
ブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボ
リズム（Journal of Clinical Endocrinology and Meta
bolism）第33巻、1971年、988頁）、追加注射は上記の
方法と同じである。このウサギの抗血清（９週目）はイ
ンビトロで中和活性を示した。
実施例7:bFFインヒビンのラジオイムノアツセイ 温和なクロラミン−Ｔ法又はボルトンハンター試薬
（ボルトンとハンター（Bolton and Hunter），バイオ
ケミストリー・ジヤーナル（Biochemistry Journal）第
133巻、（1973年）529頁）を用いてインヒビンの精製調
製液をヨード化し、比活性0.5μCi/μｇ（後述するラジ
オイムノアツセイの自己排除方法により測定）にした。
ヨード化物質は非ヨード化分子と同じ見かけの分子量を
示した（還元条件下及び非還元条件下のSDS-PAGEで測
定）。ヨード化トレーサーを用い、ラジオイムノアツセ
イ法を行いポリエチレングリコール促進二抗体沈澱法よ
り抗体結合及び非結合ヨード化ホルモンを分離した（ピ
ーターソンとシユエルドルフ（Peterson,M.A.and Swerf
loff,R.S.:クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemi
stry）第25巻、1979年）1239-1241頁）。精製及び非精
製bFFについて特徴的な排除曲線が得られた。精製物質
の用量応答曲線の感度（ED10）は2ng/チユーブであり、
ED50は25ng/チユーブであつた。インヒビン−抗体相互
作用の解離定数は20℃で4.5×10-10Mであつた。
実施例8:ヒトの絨毛性ゴナドトロピンで刺激した妊娠５
日のマウスにおける排卵の阻害 牛の卵胞液の粗抽出物が排卵を阻害することは既に示
した。この阻害はFSHで完全に反対になる（エルクミン
ズ（L.Cummins）、博士論文、1983年、ニユーイングラ
ンド大学（アルミデール））。
妊娠5-7日のマウスに1.5μｇのインヒビンを午前９時
に皮下投与し、午後６時に10IUのHCGを皮下注射した。
翌朝卵管膨大部の卵子の数を数えた。第１表に示すよう
にインヒビンの投与は排卵を有意に抑制した。
第1表 試料 動物の数 膨大部の卵子の数 対照（溶媒のみ） 11 4.91±2.66 精製インヒビン* ７ 2.43±2.22 bFF**（50μｌ） ８ 3.38±1.80 bFF（100μｌ） ４ 2.0±0.0 インヒビン調製物のSDS-PAGEの銀染色に基づく純度は
75％である。混入しているものは、インヒビンのインビ
トロバイオアツセイにおいて生物学的に不活性な高分子
量（分子量65-70kD）物質である。投与量約1.5μｇ蛋白
／動物。
**−20μg/mlのインヒビンを含有する（インヒビンの
インビトロのバイオアツセイに基づく）。
対照に比較して精製インヒビン及び100μｌのbFF共に
有意に排卵を阻害した（ウイルコキソン（Wilcoxon）の
検定ではそれぞれＰ＜0.01及びＰ＜0.05）。
実施例9:血漿FSH濃度に対する免疫の影響 上記の実施例５では１羽のウサギを免疫し、精製イン
ヒビンでさらに２回追加免疫した。こうして得られた抗
血清はインビトロのバイオアツセイでインヒビンの活性
を中和した。インビボではこの抗血清が血流中のインヒ
ビンを中和して、血流中のFSHを増加させると考えられ
る。ウサギの血漿FSHはウサギの血清中のインヒビンの
抗体の抗体価に一致して上昇及び下降した。その結果を
第２表に示す。
実施例10:去勢したオスのラツトへの急激なインヒビン
の投与による血流中FSHの抑制 牛の卵胞液を用いた下記の実験から分かるように、精
製インヒビンの投与後4-8時間以内に血流中FSHを抑制す
ることが予想できる。３日前に去勢した34週令のオスの
ラツトに頚静脈を通して血流中にインヒビンを投与し、
５時間後にFSHラジオイムノアツセイで血漿中のFSHを測
定した。牛卵胞液の投与量の増加に相関したFSHの有意
の用量応答的な減少が認められた。その結果を第３表に
示す。
実施例11:卵胞液からのインヒビンの精製 卵胞液からのインヒビン活性は上記の精製段階A,B,C
を用いるbFFインヒビンと同様の方法で精製できること
を我々は見出した。Ｄ及びＥ段階の後の特徴はbFFイン
ヒビンの特徴に似ている。従つてこれよりＡからＥの精
製段階は、ヒトを含む哺乳動物のインヒビンに応用でき
ることが予想できる。
FSHは卵巣及び睾丸機能の刺激に重要であるため、精
製インヒビンの主要な用途はFSH分泌を特異的に阻害で
きる能力、又はインヒビンに対して免疫することにより
内因性のインヒビンを中和する抗体を誘導しその結果FS
H濃度を上昇させることができるように抗原として使用
することにある。インヒビンの作用や生理を研究するた
めに性腺組織又は性腺液の粗抽出液又は部分抽出液を用
いてインビボの多くの研究が為されてきた。これらの実
験においてインヒビン又はインヒビンの抗体に帰因する
と考えられる（しかし証明されてはいない）効果は以下
のようなものがある： 1.性腺機能の阻害（モウドガル（Moudgal）ら、1985
年、「性腺蛋白とペプチド及びその生物学的意義」（Go
nadal Proteins and Peptides and their Biological S
ignificance）（サイラム（Sairam）編、ワールドサイ
エンテイフイツクパブリツシング（World Scientific P
ublishing）、シンガポール（印刷中））。
2.排卵速度の上昇（ヘンダーソン（Henderson）ら、ジ
ヤーナル・オブ・エンドクリノロジー（J.Endocrino
l.）第102巻、（1984年）305頁；クミンズ（Cummins）
ら、プロシーデイングズ・オブ・オーストラリアン・ソ
サエテイ・オブ・リプロダクテイブ・バイオロジー（Pr
oc.Aust.Soc.Reprod.Biol.）第15巻（1983年）81頁）。
3.青春期の開始の早期化（アルオバイデイ（Al Obaid
i）ら、プロシーデイングズ・オブ・オーストラリアン
・ソサエテイ・オブ・リプロダクテイブ・バイオロジー
（Proc.Aust.Soc.Reprod.Biol.）第15巻（1983年）80
頁）。
インヒビン及びFSHの公知の性質は、本発明の精製イ
ンヒビン及びインヒビンに対する抗体の幾つかの応用の
可能性を示唆している。
（ｉ）排卵速度の上昇:FSHは哺乳動物の卵巣の卵子の発
育を刺激すること（ロス（Ross）ら。（1981年）、「テ
キストブツク・オブ・エンドクリノロジー」（Textbook
of Eandocrinology）、ウイリアムズ（Williams）編、
355頁）、及びFSHによる卵巣の過度の刺激は多発排卵に
つながること（ゲムゼル（Gemzell）、ヒト性腺刺激ホ
ルモンによる排卵の誘導（Induction of ovulati on wi
th humangonadotrophins）、リースント・プログレス・
イン・ホルモンリサーチ（Recent Prog.Hormone Res.）
第21巻（1965年）179頁）は認識されている。我々はイ
ンヒビンがインビトロ及びインビボでFSHを抑制するこ
と、及びインヒビンはインヒビンに対する中和抗体を作
成するための免疫原として利用できることを証明した。
インヒビンの精製調製物と適当なアジユバントを用いて
哺乳動物（例えば牛や羊）を免疫すると、免疫した動物
中で抗体が増加する。この抗体は動物自身のインヒビン
の酸性を中和し、従つてFSH産生に対する抑制効果を除
去する。こうして得られるFSHの上昇は卵巣中の卵胞の
発育刺激につながり排卵速度が増加する。
またインヒビンに対して免疫した動物の血清を集める
ことにより他の動物の受動免疫に使用できる抗血清が得
られる。この方法によりインヒビンの抗血清を注射する
ことにより動物自身のインヒビンが中和され、FSHが増
加して排卵が刺激される。排卵速度の上昇に受動免疫及
び能動免疫共に利用される。
性腺の成長のための能動免疫にインヒビンを利用でき
る可能性は、インヒビンに対する免疫で使用したウサギ
の睾丸の大きさが増加したことにより示される（実施例
５）。
（ii）卵巣及び睾丸機能の阻害：卵巣における卵胞の発
育そして睾丸における精子産生の刺激におけるFSHの重
要性が認識されていること（ロス（Ross）ら、（1981
年）、「テキストブツク・オブ・エンドクリノロジー」
（Textbook of Endocrinology）、ウイリアムズ（Willi
ams）編、355頁；バルデインとポールセン（Bardin and
Paulsen）、（1981年）、「テキストブツク・オブ・エ
ンドクリノロジー」（Textbook of Endocrinology）中
の「睾丸」（The Testis）、ウイリアムズ（Williams）
編、293頁）は、性腺機能の抑制におけるインヒビンの
役割の可能性を示唆している。インヒビンの投与は卵巣
と睾丸機能の抑制につながり、妊娠性の破壊が起きるこ
とが予想できる。このインヒビンの作用はヒト、羊及び
牛の雄及び雌に利用可能であり、他の種にも利用できる
可能性がある。
（iii）妊娠性の開始の促進：青春期の開始時に起きる
最初の変化の１つはFSH濃度の増加であり、このため卵
巣と睾丸が刺激される（ロス（Ross）ら、（1981年）、
「テキストブツク・オブ・エンドクリノロジー」（Text
book of Endocrinology）ウイリアムズ（Williams）
編、355頁；バルデインとポールセン（Bardin and Paul
sen）、（1981年）、「テキストブツク・オブ・エンド
クリノロジー」（Textbook of Endocrinology）中の
「睾丸」（The Testis）、ウイリアムズ（Williams）
編、293頁）。能動免疫又は受動免疫により性的に未熟
な哺乳動物をインヒビンに対して免疫すると、付随的に
卵巣と睾丸機能が刺激されて青春期の開始が早くなる可
能性がある。
家畜動物（例えば乳牛、羊及びヤギ）の一生の生殖機
能は、青春期の開始年齢、各妊娠間の間隔、高令化によ
る卵巣機能の低下の可能性に依存する。能動免疫又は受
動免疫により青春期前の若い動物をインヒビンで免疫す
ると、動物自身のインヒビン産生が中和されFSH濃度が
増加する。このFSHの増加により性腺が刺激され普通よ
り早く青春期が訪れる。この方法は哺乳動物の雄又は雌
の早発青春期を誘導することに利用できる。
（iv）青春期の抑制:FSHは青春期の開始における決定的
な因子と考えられているため、好ましくない状態（例え
ばヒトにおける早発青春期の開始）又は青春期の開始を
抑制する方法としてインヒビンを投与することもでき
る。
（ｖ）インヒビンを測定するためのラジオイムノアツセ
イ又は酵素結合免疫定量法の開発、そしてインヒビンの
精製を促進するための免疫吸着カラムを開発することに
使用できる抗血清又はモノクローナル抗体を作成するた
めの免疫原として、インヒビンは利用できる。
（vi）前記した抗血清を用いて、インヒビンを測定する
ラジオイムノアツセイ系を開発した。このラジオイムノ
アツセイにより、スコツト（Scott）（1980年）らの既
知のインビトロのバイオアツセイでは不可能であつた生
体試料（例えば血漿、血清又は尿）中のインヒビンの測
定が可能になつた。血漿又は血清中のインヒビン濃度
は、妊娠性の診断に用いるセルトリ細胞や顆粒膜細胞機
能の指標となる。
（vii）多量のインヒビンの投与はLHの分泌を阻止する
ことも可能である。この事実もまたインヒビンが排卵を
抑制する能力を支持している。
本発明は前記の個々の例に限定されるものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/26 Ｃ０７Ｋ 16/26 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＦＢ (73)特許権者 999999999 セント ビンセンツ インスチチユート オブ メデイカル リサーチ オ−ストラリア国 3065 ビクトリア, フイツツロイ，ビクトリア パレード 41 (73)特許権者 999999999 バイオテクノロジー オーストラリア プロプライエタリイ リミテツド オ−ストラリア国 2069 ニユー サウ ス ウエールズ，イースト ローズビ ル，バークー ストリート 28 (72)発明者 ミルン―ロバートソン，デビツト マー ク オーストラリア国 3150 ビクトリア, グレン ウエイバリー．フロリート (72)発明者 デ クレツトサー，デビツド モリツツ オーストラリア国 5127 ビクトリア, サレー ヒルズ，レウラ ストリート１ (72)発明者 ヒアーン，ミルトン トーマス ウイリ アム オーストラリア国 3103 ビクトリア, バルウイン，ユニオン ロード 263 (72)発明者 バーガー，ヘンリイ ジヨージ オーストラリア国 3002 ビクトリア, イースト メルボルン，ベリー ストリ ート 36 (72)発明者 フインドレイ，ジヨン カー オーストラリア国 3127 ビクトリア, モント アルバート，バーロア ロード ３ (72)発明者 フオラージユ，ロバート グレゴリイ オーストラリア国 2062 ニュー サウ ス ウェールズ，キャメレイ，カーター ストリート 24 (72)発明者 リチャード，エドワード ヒユー ウエ ツテンホール オーストラリア国 3124 ビクトリア, キヤンバー ウエル，ロイヤル クレス セント 23

Claims (39)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】非還元性SDS-PAGEにより単一の主バンドを
    得るのに十分な純度をもつ本質的に精製したインヒビン
    からなる蛋白性物質であって、この精製したインヒビン
    は２個のサブユニットからなり、１サブユニットは還元
    性SDS-PAGEにより測定して見掛けの分子量約14,000±2,
    000を有し、インヒビンは黄体形成ホルモンの生成を抑
    制せずに卵胞刺激ホルモンの生成を抑制しうるものであ
    る、上記蛋白性物質。
  2. 【請求項２】グリコシル化されている、請求項１記載の
    蛋白性物質。
  3. 【請求項３】上記サブユニットは少なくとも１つのジス
    ルフィド結合により結ばれている、請求項１記載の蛋白
    性物質。
  4. 【請求項４】蛋白性物質は、卵胞刺激ホルモンの投与依
    存性減少をおこすが、培養においてラット下垂体前葉細
    胞の黄体形成ホルモン細胞含量を減少させないインヒビ
    ンの活性により測定して、約10,260から約212,000U/mg
    の比活性を有する、請求項１から３のいずれか１項記載
    の蛋白性物質。
  5. 【請求項５】インヒビンは、卵胞刺激ホルモンの投与依
    存性減少をおこすが、培養においてラット下垂体前葉細
    胞の黄体形成ホルモン細胞含量を減少させないインヒビ
    ンの活性により測定して、約212,000U/mgの比活性を有
    する、請求項４記載の蛋白性物質。
  6. 【請求項６】蛋白性物質は少なくとも75％の純度を有す
    る、請求項１から３のいずれか１項記載の蛋白性物質。
  7. 【請求項７】蛋白性物質は非還元性SDS-PAGEにより56,0
    00±1,000の見掛けの分子量を有する、請求項１から３
    のいずれか１項記載の蛋白性物質。
  8. 【請求項８】約56,000の見掛けの分子量を有する、請求
    項７記載の蛋白性物質。
  9. 【請求項９】蛋白性物質はインビトロのバイオアッセイ
    系で甲状腺刺激ホルモン又はプロラクチンを抑制しな
    い、請求項１から３のいずれか１項記載の蛋白性物質。
  10. 【請求項１０】蛋白性物質はホルモン生成の非特異的、
    毒性的抑制を示さない、請求項９記載の蛋白性物質。
  11. 【請求項１１】（イ）SDS-PAGEにより測定して見掛けの
    分子量が56,000±1,000、 （ロ）等電点は6.9〜7.3である、 （ハ）アガロースから調製したゲル形成ビーズを含むゲ
    ル透過マトリックスに接合したコンカナバリンＡに特異
    的に結合しうる、 （ニ）SDS-PAGEにより測定して、還元により分離可能
    な、下記の特徴を有する２個のサブユニットからなる： （ｉ）見掛けの分子量はそれぞれ44,000±3,000および1
    4,000±2,000であり、 （ii）分子量44,000のサブユニットの等電点は6.0〜7.0
    であり、 （iii）２個のサブユニットのＮ−末端アミノ酸配列は
    下記のとおりである：アミノ酸の位置 44kDサブユニット 14kDサブユニット ２ Ala Leu ３ Val Glu ４ Gly ５ Gly Asp ６ Phe Gly ７ Met Lys ８ Arg Val ９ Arg Asp又はAsn 10 Gly Ile 11 Ser 12 Glu 13 Pro Lys 14 Glu Lys 15 Asp 16 Gln （ホ）この蛋白性物質は卵胞刺激ホルモンを抑制しうる
    が、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン又はプロラ
    クチンをインビトロのバイオアッセイ系で抑制しない、
    および （ヘ）放射性ヨードで標識しうる、 であることを特徴とする、請求項１記載の非還元性SDS-
    PAGEにより単一の主バンドを生ずるに十分な純度の蛋白
    性物質。
  12. 【請求項１２】蛋白性物質と医薬的に許容可能なキャリ
    アーとの調製物を哺乳動物に供与して、その動物の外因
    性インヒビンに対し抗体を産生させる、請求項１から３
    のいずれか１項記載の蛋白性物質。
  13. 【請求項１３】約6.9〜7.3のpIを有する、請求項１から
    ３のいずれか１項記載の蛋白性物質。
  14. 【請求項１４】アガロースゲルより形成したビーズを含
    むゲル透過マトリックスに接合したコンカナバリンＡに
    特異的に結合しうる、請求項１から３のいずれか１項記
    載の蛋白性物質。
  15. 【請求項１５】蛋白性物質をSDS-PAGEによりフラクショ
    ンに分画しかつそのフラクションをニトロセルロースで
    電気移動させて、西洋ワサビペルオキシダーゼ−標識し
    た小麦胚芽レクチンと結合しうる、請求項１から３のい
    ずれか１項記載の蛋白性物質。
  16. 【請求項１６】卵胞液から得る、請求項１から３または
    11のいずれか１項記載の蛋白性物質。
  17. 【請求項１７】哺乳動物の卵胞液から得る、請求項16記
    載の蛋白性物質。
  18. 【請求項１８】ウシ、ヒツジ又はヒトから得る、請求項
    １から３または11記載の蛋白性物質。
  19. 【請求項１９】標識する、請求項１から３のいずれか１
    項記載の蛋白性物質。
  20. 【請求項２０】放射性ヨードにより標識する、請求項19
    記載の蛋白性物質。
  21. 【請求項２１】サブユニットは、還元性SDS-PAGEにより
    測定して、約14,000±2,000の見掛けの分子量を有す
    る、請求項１記載の蛋白性物質。
  22. 【請求項２２】グリコシル化されている、請求項21記載
    の蛋白性物質。
  23. 【請求項２３】サブユニットは還元性SDS-PAGEにより測
    定して44,000±3,000の見掛けの分子量を有する、請求
    項21記載の蛋白性物質。
  24. 【請求項２４】サブユニットは、還元性SDS-PAGEにより
    測定して、約44,000の見掛けの分子量を有する、請求項
    １記載の蛋白性物質。
  25. 【請求項２５】約6.0〜7.0の等電点を有する、請求項24
    記載の蛋白性物質。
  26. 【請求項２６】サブユニットの２から16番目のＮ−末端
    アミノ酸はアミノ酸の位置 アミノ酸 ２ Ala ３ Val ４ Gly ５ Gly ６ Phe ７ Met ８ Arg ９ Arg 10 Gly 11 Ser 12 Glu 13 Pro 14 Glu 15 Asp 16 Gln である、請求項23記載の蛋白性物質。
  27. 【請求項２７】サブユニットは還元性SDS-PAGEにより測
    定して見掛けの分子量は14,000±2,000である、請求項2
    1記載の蛋白性物質。
  28. 【請求項２８】サブユニットは還元性SDS-PAGEにより測
    定して見掛けの分子量は14,000である、請求項27記載の
    蛋白性物質。
  29. 【請求項２９】サブユニットの第２、３、５、６、７、
    ８、９、10、13および14番目のＮ−末端アミノ酸はアミノ酸の位置 アミノ酸 ２ Leu ３ Glu ５ Asp ６ Gly ７ Lys ８ Val ９ Asp又はAsn 10 Ile 13 Lys 14 Lys である、請求項27記載の蛋白性物質。
  30. 【請求項３０】インヒビンを含有する出発物質から、２
    個のサブユニットからなり、１サブユニットは還元性SD
    S-PAGEにより測定した見掛けの分子量は約14,000±2,00
    0を有するインヒビンを精製する方法において、 イ）出発物質を第１ゲル透過クロマトグラフィに供し
    て、第１透過液を得、 ロ）この第１透過液を第２ゲル透過クロマトグラフィに
    供して、第２透過液を得、 ハ）第２透過液を逆相HPLCに供して、第３の透過液を
    得、 ニ）第３透過液を分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動
    に供して、単一の主バンドを得、ついで ホ）ラット下垂体前葉細胞により黄体形成ホルモンの産
    生を抑制せずに、培養にこの細胞による卵胞刺激ホルモ
    ンの産生の抑制能について、この単一の主バンドの物質
    を試験することを特徴とする、上記精製方法。
  31. 【請求項３１】出発物質は卵胞液である、請求項30記載
    の方法。
  32. 【請求項３２】出発物質は哺乳動物の卵胞液である、請
    求項30記載の方法。
  33. 【請求項３３】出発物質はウシ、ヒツジまたはヒトの卵
    胞液である、請求項30記載の方法。
  34. 【請求項３４】インヒビンを含む分取ポリアクリルアミ
    ドゲルからゲル部を単離しそしてゲル部に含まれるイン
    ヒビンを電気泳動溶離に付する、請求項30記載の方法。
  35. 【請求項３５】電気泳動の溶離液は、 （イ）ゲル部を溶離バッファーにて洗い、 （ロ）溶離バッファー液で覆われた浸漬用バッファーに
    ゲル部を浸漬し、 （ハ）ゲル部の電気泳動による溶離を開始し、 （ニ）溶離バッファーを透析バッファーと置換し、 （ホ）インヒビンがゲル部から移動するまで、ゲル部の
    電気泳動溶離を続け、ついで （ヘ）インヒビンを採取する、請求項34記載の方法。
  36. 【請求項３６】非還元SDS-PAGEにより単一の主バンドを
    得るのに十分な純度の精製インヒビンを得る、請求項30
    記載の方法。
  37. 【請求項３７】医薬的に許容しうる担体とともに、非還
    元性SDS-PAGEについて単一の主バンドを得るのに十分な
    純度の精製インヒビンから本質的になる蛋白性物質の有
    効量を含み、この精製インヒビンは２つのサブユニット
    からなり、１つのサブユニットは還元性SDS-PAGEにより
    測定して約14,000±2,000の見掛けの分子量を有する、
    避妊剤。
  38. 【請求項３８】インヒビンは黄体形成ホルモンの産生を
    抑制せずに卵胞刺激ホルモンの産生を抑制する、請求項
    37記載の避妊剤。
  39. 【請求項３９】医薬的に許容しうる担体は放出遅延組成
    物である、請求項37又は38記載の避妊剤。
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