NO176570B - Proteinmateriale, inhibin, fremgangsmåte for renfremstilling av dette, antistoff mot inhibin, ikke-terapeutiske blandinger inneholdende inhibin/antistoff samt anvendelse for diagnostiske og analytiske formål - Google Patents
Proteinmateriale, inhibin, fremgangsmåte for renfremstilling av dette, antistoff mot inhibin, ikke-terapeutiske blandinger inneholdende inhibin/antistoff samt anvendelse for diagnostiske og analytiske formål Download PDFInfo
- Publication number
- NO176570B NO176570B NO860427A NO860427A NO176570B NO 176570 B NO176570 B NO 176570B NO 860427 A NO860427 A NO 860427A NO 860427 A NO860427 A NO 860427A NO 176570 B NO176570 B NO 176570B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- inhibin
- protein
- antibody
- protein material
- sds
- Prior art date
Links
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 title claims abstract description 154
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 title claims abstract description 151
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 15
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims abstract description 40
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims abstract description 13
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 claims abstract description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 claims description 142
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 claims description 142
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 29
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 21
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 16
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims description 11
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 11
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 11
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 239000011800 void material Substances 0.000 claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 claims 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 abstract description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000013014 purified material Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 5
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 231100000546 inhibition of ovulation Toxicity 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000008141 pubertal development Effects 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010033165 Ovarian failure Diseases 0.000 description 1
- RQTDRJMAUKHGHV-UHFFFAOYSA-N P.P.I Chemical compound P.P.I RQTDRJMAUKHGHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010021083 hen egg lysozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N methyl alpha-D-glucopyranoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 201000004535 ovarian dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 231100000539 ovarian failure Toxicity 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 208000006155 precocious puberty Diseases 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000002311 subsequent effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/817—Steroids or hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/85—Reproductive organs or embryos
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Centrifugal Separators (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår et proteinmateriale, inhibin, en fremgangsmåte for rensing derav, antistoff spesifikt overfor inhibin, samt anvendelse av proteinmaterialet for analytiske og diagnostiske formål og til fremstilling av blandinger for ikke-terapeutiske formål
På grunnlag av indirekte bevis og begrenset eksperi-mentering ble det foreslått så tidlig som i 1932 at kjønns-kjertlene produserer en ikke-steroidal faktor kalt inhibin som selektivt kunne undertrykke sekresjonen av follikkelstimulerende hormon (FSH) fra hypofysen (McCullagh, Science 76, (1932) 19). Siden den tid har utviklingen av radioimmunologiske prøver for å måle FSH ført til oppsamling av en stor mengde bevis som antyder at inhibin eksisterer, men det var ikke før tidlig i 1970-årene at det ble gjort noe forsøk på å isolere og identifisere dette stoffet. Siden den tid har en rekke grupper av forskere forsøkt å rense inhibin fra flere gonadale kilder med motstridende resultater (de Jong, Mol. Cell. Endocrinol. 13, (1979) 1). Noen forskere har påstått å ha isolert og sekvensbestemt inhibin ut fra human seminal plasma, idet molekylvektene til de forskjellige artene inhibin har vært 5.000 og 14.000 dalton (Seidah et al., FEBS Letters 167,
(1984) 98, Sheth et al., FEBS Letters, 165, (1984) 11). Videre har det i betenkelig grad blitt stilt spørsmål ved den aonadale opprinnelse av dette materiale (Beksac et al., Int. J. Andrology 7, (1984) 389, Lilja and Jeppsson, FEBS Letters 182, (1985) 181). Andre forskergrupper har benyttet væske samlet opp fra de sædproduserende kanaler i testiklene (rete testikkelvæske) og også ovarial follikkelvæske for å forsøke å isolere gonadal inhibin. Hittil har disse forsøkene, til tross for at de har vært utført over en periode på 12 år, vært mis-lykket når det gjelder å oppnå et renset materiale. Denne bak-grunn indikerer at det ikke er noen generell overensstemmelse med hensyn til naturen av, de kjemiske trekkene til eller produksjonsstedet for stoffet som er definert som inhibin.
Egenskapene til bovine follikkelvæskeekstrakter har ført til det postulat at det finnes et stoff eller stoffer, "inhibin", med bestemte funksjoner. Vi har nå isolert et materiale fra en gonadal kilde som tilfredsstiller alle de biologiske kriterier som er karakteristiske for inhibin.
Foreliggende oppfinnelse vedrører rensingen og karakteriseringen av inhibin, samt anvendelsen av det rensede materiale for å produsere antistoffer, anvendelsen av inhibin og antiseraene i en kvantitativ radioimmunanalyse, og anvendelser in vitro og in vivo av inhibin og antistoff mot inhibin.
Ifølge et aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et proteinmateriale, inhibin, med en tilstrekkelig renhet til å gi et enkelt hovedbånd på ikke-reduserende SDS-PAGE, kjennetegnet ved at: (a) molekylvekten bestemt ved SDS-PAGE er 56000 ± 1000; (b) det isoelektriske punkt er i området 6,9-7,3; (c) proteinet kan bindes spesifikt til Concanavalin A-Sepharose; (d) proteinet består av to underenheter som lar seg atskille ved reduksjon, bestemt ved hjelp av SDS-PAGE, kjennetegnet ved at: (i) molekylvektene er henholdsvis 44000 ± 3000 og 14000 ± 2000, (ii) det isoelektriske punkt til underenheten med molekylvekt 44000 er i området 6,0 til 7,0, (iii) De N-terminale aminosyresekvenser av de to underenheter er:
(e) proteinmaterialet kan undertrykke follikkelstimulerende hormon, men ikke luteiniserende hormon, tyroidstimuler-ende hormon eller prolaktin i et in vitro biologisk
prøvesystem,
(f) proteinet kan merkes med radioaktiv jod.
Ifølge et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for rensing av inhibin fra et mammalsk utgangsmateriale inneholdende inhibinet, kjennetegnet ved at: (a) utgangsmaterialet underkastes en første gelgjennomtrengningskromatografi på Sephacryl S200 eller Sephadex G100 for å gi et første eluat; (b) det første eluat underkastes en andre gelgjennomtrengningskromatografi på Sephacryl S200 eller Sephadex G100 for å gi et andre eluat; (c) det andre eluat underkastes omvendt fase væskekromatografi med høy yteevne for å gi et tredje eluat; (d) det tredje eluat underkastes preparativ polyakrylamidgel-elektroforese for å erholde et enkelt hovedbånd; og (e) det enkle hovedbånd analyseres med hensyn til evne til å
undertrykke produksjon av follikkelstimulerende hormon fra rotte-hypofyseforlappceller i kultur uten å inhibere produksjon av luteiniserende hormon fra cellene.
Fortrinnsvis utføres kromatografitrinnet med gel-gjennomtrengning under anvendelse av en bærer for gelgjennom-trengningen med stort porevolum, f.eks. Sephacryl<®> S200 eller Sephadex<®> G100 (både Sephacryl<®> og Sephadex<®> er Pharmacias varemerker). Foretrukkede elueringsmetoder utnytter flyktige oppløsningsmidler som inneholder f.eks. ammoniumacetat, eddiksyre eller lignende forbindelser, for å muliggjøre direkte utvinning av biologisk aktivt materiale ved frysetørking eller vakuumtørking.
Fortrinnsvis utføres omvendt fase væskekromatografien med høy yteevne under anvendelse av kjemisk bundne N-alkyl-siliciumdioksid-kolonnepakninger med en snever fordeling av partikkelstørrelse, mest egnet 5-10 pm. De anvendte eluerings-midler kan være flyktige eller ikke-flyktige, og inneholde ionemodifikasjonsmidler som f.eks. trifluoreddiksyre (TFA), ammoniumbicarbonat, ammoniumacetat eller natriumfosfat, i en gradient mellom vann og et blandbart organisk oppløsnings-middel som f.eks. methanol, acetonitril eller isopropanol. Ved en foretrukket fremgangsmåte benyttes en gradient av 0-50 % acetonitril i 0,1 % TFA. Forskjellige preparative fremgangsmåter for polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) kan anvendes i nærvær av natrium-dodecylsulfat (SDS) ved å bruke PAGE-geler av forskjellige porøsiteter og kryssbindingsinnhold. Et foretrukket buffersystem for elektroforese er basert på fremgangsmåten til Laemmli, som beskrevet i Nature 227, (1970) 680.
Videre tilveiebringes en fremgangsmåte for å produsere spesifikke antistoffer mot inhibinet, idet antistoffene har evne til å nøytralisere aktiviteten av inhibin i den in vitro biologiske prøve, og til å gi en økning i gonadal vekt in vivo.
Videre tilveiebringes også en fremgangsmåte for radioimmunanalyse for inhibin som kan brukes til måling av inhibin i biologiske prøver som f.eks. plasma, serum eller urin.
Som et eksempel vil nå en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse bli nærmere beskrevet under henvisning til eksemplene nedenunder, og de ledsagende tegninger hvor: Figur 1 viser elueringsprofilen for inhibinaktivitet i bovin ovarial follikkelvæske (bFF) fraksjonert på Sephacryl<® >S-200. Figur 2 viser elueringsprofilen for inhibinaktivitet i bFF fraksjonert på Sephadex<®> G100. Figur 3 viser elueringsprofilen for inhibinaktivitet i bFF fraksjonert ved hjelp av omvendt fase væskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) etter forutgående gelkromatografi. Figur 4 viser reduserte og ikke-reduserte elektroforetiske mønstre ved SDS-polyacrylamidgel for fire sekvens-fraksjoner erholdt ved hjelp av preparativ PAGE.
Følgende forkortninger er her brukt:
bFF - bovin ovarial follikkelvæske RP-HPLC - omvendt fase væskekromatografi med høy
yteevne
PAGE - polyacrylamidgelelektroforese
FSH - follikkelstimulerende hormon
LH - luteiniserende hormon
U - enheter
GF - gelfiltrering
kD - kilodalton
TFA - trifluoreddiksyre
SDS - natriumdodecylsulfat
Eksempel 1
Rensing av inhibin fra bovin ovarial follikkelvæske.
Rensingsfremgangsmåten er basert på den fortløpende anvendelse av ett eller flere gelgjennomtrengningstrinn, ett eller flere trinn med omvendt fase kromatografi med høy opp-løsning, og ett eller flere PAGE-trinn.
Oppsamling av bovin follikkelvæske ( bFF).
Bovine eggstokker ble erholdt fra lokale slakterier og bFF sugt inn i en avkjølt beholder som inneholdt protease-inhibitorene Trasylol (10 U/ml) og fenylmethylsulfonylfluorid (24 pg/ml). Den bovine ovariale follikkelvæske ble lagret nedfryst ved -20 °C.
Fremgangsmåten for rensing av inhibin besto av fire faser eller trinn. I avsnittene nedenunder er hovedtrekkene ved fremgangsmåten beskrevet, og detaljer vedrørende rensingsfremgangsmåten er angitt.
Trinnene i rensingsfremgangsmåten er som følger:
(A) Gelgjennomtrengningskromatografi på Sephacryl<® >S-200. (B) Gelgjennomtrengningskromatografi på Sephadex<® >G-100. (C) Omvendt fase væskekromatografi med høy yteevne.
(D) Preparativ polyacrylamidgelelektroforese.
(E) Elektroforetisk eluering av prøver.
Rensingen av inhibin ble overvåket ved hjelp av den
biologiske prøvemetode til Scott et al. (Endocrinology 107,
(1980) 1536), brukt med mindre endringer (Au et al., Endocrinology 112, (1983) 239). Metoden er basert pa inhibins evne til a forårsake mengdeavhengig reduksjon av cellulært FSH-innhold, men ikke av cellulært LH-innhold, i celler i kultur fra for-kant av rottehypofyse.
Trinn A:
Gelgjennomtrengningskromatografi på Sephacryl<®> S200: Eluerinqsbuffer 0, 05M ammoniumacetat. pH 7, 0
bFF (50-100 ml) ble fortynnet med 0,05M ammoniumacetat pH 7,0 (25-50 ml) og sentrifugert (12000 g x 30 min. ved 4 °C. Supernatanten (75-150 ml) ble fraksjonert på en Sephacryl<®> S200 gelfiltreringskolonne (9 x 90 cm) ved en strømningshastighet på 70-100 ml pr. time. Som det fremgår av fig. 1, ble inhibinaktivitet lokalisert i et "void volume"-område (molekylvekt > 90.000) i denne kolonnen. 90 % utvin-ninger av inhibinaktivitet ble erholdt med en 3-4 ganger økning i spesifikk aktivitet.
Trinn B:
Gelgjennomtrengningskromatografi på Sephadex<®> G100: Eluerinqsbuffer 4M eddiksyre
"Void volume"-fraksjoner (A, B, C og D, fig. 1) ble blandet og 25-50 % av de sammenslåtte fraksjoner ble surgjort med iseddik (kromogenfri) til en sluttkonsentrasjon på 4M eddiksyre og holdt ved 4 °C i 1 time. De gjenværende 50-75 % ble lagret nedfryst ved -20 °C før den etterfølgende frak-sjonering. Den surgjorte blanding (omtrent 120 ml) ble tilført en Sephadex<®> G100 gelfiltreringskolonne (9 x 90 cm) med 4M eddiksyre som elueringsbuffer ved en strømningshastighet på 70-100 ml pr. time. Alle arbeidsoperasjoner med gelfiltrer-ingskolonnene ble utført ved 4 °C. Under disse betingelser eluerte mesteparten av inhibinaktiviteten i et lavere molekyl-vektsområde (elueringsvolum 1760 til 1880 ml, molekylvekt-
område 20.000 til 60.000, fig. 2) med en 10-20 ganger økning i spesifikk aktivitet og 45 % utvinning av inhibinaktivitet i dette område. Ved å bruke analytiske kolonner (f.eks. 2,5 x 100 cm) er det blitt iakttatt lignende aktivitetsprofiler med høyere spesifikke aktiviteter (10-50 ganger).
Trinn C:
Omvendt fase- væskekromatoqrafi med høy yteevne ( RP- HPLC)
Kolonnefraksjonene (elueringsvolum omtrent 1760 til 1910 ml) fra trinn B ble slått sammen før fylling på RP-HPLC-kolonnen. Den anvendte kolonne var en "Ultrapore RPSC"
(Beckman, Berkeley, California). Den anvendte mobile fase var en lineær gradient mellom 0,1 % TFA i vann og 50 % acetonitril i 0,1 % TFA, strømningshastigheten var 1 ml/minutt og 0,5 ml fraksjoner ble samlet opp. Det ble anvendt tre påfyllingsfrem-gangsmåten (a) prøven ble frysetørket og 1 mg oppløst i 4M eddiksyre til en konsentrasjon på 8-10 ml tørrvekt/ml, sentrifugert i omtrent 100 pl 4M eddiksyre og tilført HPLC-kolonnen via injektoren, (b) det frysetørkede materiale (5-10 mg) ble oppløst i 20 ml 4M eddiksyre, sentrifugert og påfylt kolonnen via en oppløsningsmiddelventil på HPLC-en, (c) det ikke-fryse-tørkede materiale (omtrent 100 ml) ble filtrert gjennom et 0,5 pm filter (FH, Millipore Corp) før påfylling via en opp-løsningsmiddelventil til kolonnen ved en strømningshastighet på 2 ml/minutt.
Inhibinområdene fra fremgangsmåtene (b) og (c) ble rekromatografert. Hver fraksjon ble blandet med innholdene i de tilsvarende rør fra de gjentatte kromatograferinger (om påkrevet) og aliquoter ble tatt ut for biologisk prøve, amino-syreanalyse og SDS-PAGE. Acetonitrilet fra hver fraksjon ble deretter fjernet ved avdamping under N2 og prøven ble fryse-tørket. Som det fremgår av fig. 3, ble inhibinaktivitet funnet i et område av kromatogrammet, tilsvarende omtrent 30 % acetonitril. Prøvepåfyllingen i dette forsøket var 1 mg.
Det ble oppnådd gjenvinninger av inhibin på 40 % ved de forskjellige påfyllingsfremgangsmåter, selv om HPLC-kolonneyteevnen i merkbar grad ble påvirket av de to sist-nevnte fremgangsmåter. En 10 ganger økning i spesifikk aktivitet ble oppnådd med dette HPLC-trinnet, med en total
160 ganger økning i spesifikk aktivitet.
Trinn D:
Preparativ polyacrylamidqelelektroforese
De inhibinholdige fraksjoner erholdt ved hjelp av RPHPLC ble oppløst i ikke-reduserende prøvebuffer (0,06 M Tris-HCL pH 6,8, 12,5 % glycerol, 1,25 % vekt/volum SDS og 0,006 % bromfenolblått) og fraksjonert på et elektroforese-apparat med vertikalstilt polyacrylamidgel (Reid and Bieleski, Analytical Biochemistry, 22 (1968) 374) med endringer. Oppløs-ningene for SDS-polyacrylamidgelelektroforese (Laemmli, Nature 227 (1970) 680) besto av en samlende gel (0,125 M Tris-HCl pH 6,8, 0,1 % vekt/volum SDS, 5 % acrylamid, 0,13 % bis-acrylamid, 0,1 % ammoniumpersulfat) og en separerende gel (0,38 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1 % vekt/volum SDS, 7,5 % acrylamid, 0,2 % bis-acrylamid, 0,03 % ammoniumpersulfat). Elektroforese-bufferen var 2,5 mM Tris-glycin-buffer med 0,05 % (vekt/volum) SDS. Proteintilførselen (500-700 ug) ble fordelt mellom de 8 prøveåpningene.
Gelene ble utsatt for elektroforese først ved 20mA inntil prøven hadde forflyttet seg inn i den separerende gel (1,5 time), deretter ble strømmen økt til 30mA for resten av den tiden elektroforesen pågikk (4 timer) inntil bromfenolblått-markøren nådde bunnen av gelen. Gelen ble farget med 0,5 % Coomassie-blått i eddiksyre: isopropylalkohol:vann 1:3:6 volum/volum (15 minutter) og avfarget med eddiksyre: methanol: vann, 50:165:785 volum/volum, og inhibinområdet (molekylvekt omtrent 56.000) som ble visualisert ved hjelp av denne fremgangsmåte, ble delt opp i 2 mm stykker ved å bruke en skalpell og lineal. Gelstykker over og under inhibinområdet ble også tatt ut. Gelstykkene ble oppbevart i lukkede rør ved -15 til
-20 °C før elektroforetisk eluering.
Fig. 4 viser reduserte og ikke-reduserte, SDS-gel-elektroforetiske mønstre for 4 på hverandre følgende fraksjoner (A, B, C og D) erholdt ved preparativ PAGE-rensing. Inhibinaktivitet ble lokalisert primært i fraksjon B (tilsynelatende molekylvekt 65.000 ± 1000, gjennomsnitt ± standardavvik, 5 rensede inhibinpreparater). Under reduserende beting-eiser ble fraksjon B redusert til to hovedbånd med tilsynelatende molekylvekter på 44.000 ± 3000 og 14.000 ± 2000 (n = 5)
(Felt E). SDS-PAGE-systemet til Laemmli (1970) ble anvendt. Proteiner ble lokalisert ved hjelp av sølvfarging. Anvendte proteinstandarder var: bovint serumalbumin (molekylvekt 67.000), ovalbumin (43.000), kullsyreanhydrase (29.000), gås-lysozym (21.000 ), høneegglysozym (14.500). Reduksj onsmidlet var 0,1 % 2-mercaptoethanol.
Trinn E:
Elektroforetisk eluerinq ved værelsetemperatur
Den anvendte fremgangsmåte var modifisert fra fremgangsmåten til Hunkapiller et al (Methods in Enzymology, 91
(1983) 227). Gelstykker ble skåret i terninger i destillert vann med et barberblad, vasket i elueringsbuffer (0,1 % SDS i 0,05M NH4HC03) i 5 minutter og plassert i en celle for elektroforetisk eluering forsynt med dialysemembranplater (som stanser forbindelser med molekylvekt over 6000-8000). Gelstykkene ble belagt med oppbløtingsbuffer (2 % SDS i 0,4M NH4HC03) og tildekket med elueringsbuffer (0,1 % SDS i 0,05M NH4HC03). Fast natriumthioglycolat ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 0,5mM i elueringsbufferen. Gelstykker ble oppbløtt i 3-5 timer før oppstartingen av den elektroforetiske elueringsfremgangsmåte ved 50 volt (likestrøm). Etter 12-16 timer ble elueringsbufferen erstattet med dialysebuffer (0,02 % SDS i 0,01M NH4HC03) etterfulgt av ytterligere elektroforetisk eluering ved 80 volt (likestrøm) i 20-24 timer inntil Coomassieblåfargen og proteinet hadde forflyttet seg inn i oppsamlingsbrønnen for prøven. Den eluerte prøve ble fjernet fra oppsamlingsbrønnen ved hjelp av en 5 pl Hamilton-sprøyte med bøyd spiss, delt opp i like store mengder og enten nedfryst eller frysetørket. Prøver av de rensede fraksjoner ble satt til side for in vitro biologisk prøve, aminosyre-analyse og molekylvektbestemmelse ved å bruke SDS-PAGE som anvendt med sølvfargingsteknikken.
Ved å bruke rensingsfremgangsmåter basert på de ovenfor angitte metoder, dvs. en kombinasjon av gelgjennomtrengningskromatografi, RP-HPLC og preparativ PAGE, ble inhibinaktivitet gjenvunnet som et enkelt proteinbånd på SDS-PAGE (fig. 4) med en tilsynelatende molekylvekt på 56.000 ± 1000
(5 preparater).
De rensede preparater av inhibin undertrykker FSH-hormon men ikke luteiniserende hormon, thyroidstimulerende hormon eller prolactin i den in vitro biologiske prøve. Dette indikerer at det rensede produkt er spesifikt når det gjelder å undertrykke FSH. Undertrykkingen skyldes ikke ikke-spesifikke toksiske virkninger.
Eksempel 2 Alternative rensingsfremqanqsmåter
Inhibin ble isolert som i eksempel 1 med unntak av at inhibin ble utfelt ved å regulere pH i "void volume"-frak-sjonen fra trinn A til pH 4,75 med 4M eddiksyre og sentrifugert ved 12.000 x g i 30 minutter ved 10 °C. Den resulterende pellet ble oppløst i 0,05M ammoniumacetat pH 7,0. Opp-løseliggjøringen av pelleten ble hjulpet ved homogenisering og lydbølgebehandling i buffer ved værelsetemperatur. Prøven ble regulert til 4M eddiksyre med iseddik og sentrifugert før påfylling på kolonnen for det andre gelgjennomtrengningstrinn (trinn B). Den totale utvinning av inhibinaktivitet inkludert pH-utfelling og surgjøring av den oppløste pellet, var 34 %. Denne modifikasjon har den fordel at kolonnens prøvevolum reduseres med 75%, noe som muliggjør et høyere gjennomløp av materiale. Inhibinaktivitet ble utvunnet i lignende kolonne-fraksjoner (elueringsvolumer 1700 til 2100 ml) som i fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ved å la fraksjoneringen etter-følges av gelfiltrering med 4M eddiksyre som elueringsbuffer. Den derpå følgende oppførsel av inhibin ved RP-HPLC- og PREP-PAGE-fremgangsmåten ble ikke påvirket av de forskjellige endringer som ble undersøkt i dette eksempel.
Eksempel 3: Ytterligere kjemisk karakterisering av inhibin Analytisk SDS-PAGE på sluttproduktet under ikke-reduserende betingelser ga et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 56.000 ± 1000 (gjennomsnitt ± standardavvik, 5 preparater), mens det under reduserende betingelser ble iakttatt to hovedbånd med tilsynelatende molekylvekter på 44.000 ± 3000 og 14.000 ± 2000 (5 preparater). Tegn på uensartethet ble iakttatt bedømt ut fra elektroforese av 56kD båndet under ikke-reduserende betingelser og 44kD båndet under reduserende betingelser. Det tilsynelatende molekylvektområde for 56kD materialet var mellom 54.000 og 57.000, mens 44kD materialet varierte fra 42.000 til 46.000. Et enkelt bånd ble iakttatt med 14kD. Disse funn er i overensstemmelse med glycoprotein-naturen til dette molekylet.
pl-verdiene for intakt inhibin og for den største underenheten ble bestemt ved å bruke det 2-dimensjonale PAGE-systemet til 0'Farrell, P.H., J. Biol. Chem., 250 (1975), 4007-4021. Intakt inhibin ble påvist ved hjelp av sølvfarging og oppviste et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 56.000, men med flere nært tilknyttede flekker med pl-verdier i pH-området 6,9 til 7,3. Disse data tyder på et glycoproteinpreparat. Underenheten med molekylvekt 44.000 oppviste et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 46.000 med flere tett tilknyttede flekker med pl-verdier i pH-området 6,0 til 7,0, hvilket tyder på at denne underenheten er et glycoprotein.
Ytterligere bevis for at inhibin er et glycoprotein ble fastslått ved hjelp av: (a) Radioaktivt merket inhibins evne til å binde seg til lectinet Concanavalin A immobilisert på Sepharose<®> (varemerke til Pharmacia, Uppsala, Sverige). I flere forsøk ble 15-17 % av sporingsisotopen bundet til lectinet og ble frigjort etter eluering med sukkeret methyl-a-D-glucopyranosid (Calbiochem, San Diego, USA). (b) Binding av pepperrot-peroxydase-merket hvete-spirelectin til inhibin etterfulgt av fraksjo-nering av inhibin på SDS-PAGE og elektroover-føring av proteinet til nitrocellulose. Bind-ingen av lectinet ble overvåket ved hjelp av styrken på peroxydasefargereaksjonen. Binding av lectin ble forbundet med det 56kD intakte protein og med 44kD underenheten.
Eksempel 4:
Aminosyresekvensen i N- enden til de to underenheter av inhibin
Et renset preparat av inhibin ble redusert og carboxymethylert og de to underenheter med tilsynelatende molekylvekt henholdsvis 44.000 og 14.000 ble atskilt ved hjelp av PAGE og utvunnet fra gelen ved hjelp av en elektroeluer-ingsfremgangsmåte beskrevet i trinn E, eksempel 1 ovenfor. SDS ble fjernet ved methanolutfelling av inhibin og N-ende-aminosyresekvensen bestemt.
Sekvensene til de to underenhetene er:
Eksempel 5: Produksjon av antistoffer mot renset inhibin
19 ug inhibin renset som beskrevet ovenfor ble opp-løst i 600 ul Dulbecco's fosfatbuffer pH 7,4 og emulgert med et like stort volum av et oljebasert hjelpestoff (f.eks. "Marcol 52":"Montanide 888" i forholdet 9:1. "Marcol 52" er et varemerke som tilhører Esso, og "Montanide 888" er et varemerke som tilhører S.E.P.P.I.C., Paris). 200 ul ble injisert i hvert av fire intramuskulære steder og 200 pl injisert subkutant, i en kanin. Dyret ble injisert på nytt 6 uker senere med 18 ug renset inhibin for å forsterke immuniseringen, idet den samme injeksjonsfremgangsmåte som ovenfor ble brukt. Antistoff titeren i kaninserumet ble fastslått ved hjelp av dets evne til å binde seg til iodert inhibin (se nedenunder med hensyn til detaljer), eller ved hjelp av dets evne til å nøy-tralisere inhibinaktivitet in vitro. Den største titer ble iakttatt 2 uker etter den nye injeksjon (prøve fra uke 8), med tilbakevending til førimmuniseringsnivåer etter 17 til 18 uker.
Under immunisering økte kaninens testikkelvolum fra 3,0 til 3,5 ml, noe som indikerer at immunisering mot inhibin kan øke kjønnskjertelvekt, antagelig ved nøytralisering av endogen inhibin, og således muliggjøre økning i FSH-nivåer.
Eksempel 6: Karakterisering av antiserum
Antiserum fra uke 8, fremstilt som beskrevet ovenfor, fra kaninen ble undersøkt med hensyn på dets evne til å nøy-tralisere inhibinaktivitet in vitro. Et preparat av bovin follikkelvæske behandlet med trekull ble brukt som inhibin-standard i en in vitro biologisk inhibinprøve (Scott et al, Endocrinology, 101, 1980, 1536). Det ble funnet at 2 yl antiserum var tilstrekkelig til å nøytralisere en mengde inhibin (2 enheter) som er kjent for gi en maksimal respons i prøven. Denne nøytraliserende aktivitet var ikke tilstede i serum fra før immunisering. En annen kanin ble immunisert først med et mindre rent inhibinpreparat (340 ug erholdt etter RP-HPLC-rensingstrinnet) og immuniseringen forsterket med 25 ug rent inhibin. Den første immuniseringsinjeksjon skjedde i full-stendig Freund's hjelpestoff under anvendelse av immuniser-ingsmetoden til Vaitukaitas et al, (Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 33, 1971, 988), mens fremgangsmåten ved den immuniseringsforsterkende injeksjon var den samme som angitt ovenfor. Antiserum (uke 9) fra dette dyret oppviste også nøytraliserende egenskaper iri vitro.
Eksempel 7: Radioimmunanalvse for bFF- inhibin
Rensede preparater av inhibin ble iodert enten ved hjelp av en mild kloramin-T-fremgangsmåte eller ved å bruke Bolton-Hunter-reagenset (Bolton and Hunter, Biochem. J. 133
(1973) 529) til en spesifikk aktivitet på 0,5 uCi/ug bestemt ved hjelp av en fremgangsmåte med selvforskyvning i radio-immunanalysemetoden beskrevet nedenunder. Det ioderte materiale oppviste den samme tilsynelatende molekylvekt som det ikke-ioderte molekyl fastslått ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Ved å bruke den ioderte sporingsisotop ble det oppnådd en radioimmunanalyse som anvender polyethylenglycol i et andre antistoff-utfel-lingstrinn for å atskille antistoffbundet og ikke antistoffbundet, iodert hormon (Peterson, M.A. and Swerdloff, R.S., Clin. Chem. 25 (1979) 1239-124). Det ble oppnådd karakteristiske forskyvningskurver for rensede og for ikke-fraksjonerte bFF-preparater. Mengderesponskurven for det rensede materiale oppviste en sensitivitet (ED10) på 2 ng/rør med ED50 på 25 ng/rør. Dissosiasjonskonstanten for reaksjonen mellom inhibin og antistoff var 4,5 x 10"<10> M ved 20 °C.
Eksempel 8:
Inhibering av eggløsning hos mus med 5 dager fremskredet drektighet og stimulert med human korionqonadotropin
Råekstrakter av bovin follikkelvæske er tidligere blitt påvist å inhibere eggløsning. Inhiberingen kan kompeti-tivt reverseres med FSH (L. Cummins, Ph.D. Thesis, 1983, University of New England (Armidale)).
Mus med 5-7 dager fremskredet drektighet ble gitt 1,5 ug inhibin subkutant kl. 9 etterfulgt av subkutan injeksjon av 10 IU HCG kl. 18.00. Den påfølgende morgen ble antallet egg i den flaskeformede utvidelse av Fallopian-gangen tellet. Inhibinadministrasjon inhiberte eggløsning signifikant, som vist i tabell 1.
Renset inhibin og 100 pl bFF resulterte begge i signifikant inhibering av eggløsning sammenlignet med kon-trollen (henholdsvis p mindre enn 0,01 og p mindre enn 0,05 ved Wilcoxon's test).
Eksempel 9: Virkning av immunisering på plasmanivåer av FSH
I eksempel 5 ovenfor ble en kanin immunisert og immuniseringen forsterket ved to ytterligere anledninger med renset inhibin. Det således erholdte antiserum nøytraliserte inhibinaktivitet i den in vitro biologiske prøve. Det ville være forventet at antiserumet in vivo ville nøytralisere inhibin i blodomløpet, og føre til en økning i FSH i blodom-løpet. Kaninens plasma-FSH oppviste en stigning og et fall sammen med titeren til inhibin-antistoffet i kaninserumet. Resultatene er vist i tabell 2.
Eksempel 10:
Undertrykkelse av FSH i blodomløpet etter akutt administrasjon av inhibin til kastrerte hannrotter.
Det er forventet at renset inhibin, som det vil sees i forsøket nedenunder med bovin follikkelvæske, bør undertrykke FSH i blodomløpet i løpet av 4 til 8 timer etter administrasjon. Inhibin (bovin follikkelvæske) ble admini-strert via halsvenen til blodomløpet hos 34 dager gamle hannrotter som var blitt kastrert 3 dager tidligere, og plasma-nivåene av FSH 5 timer senere ble bestemt ved hjelp av FSH radioimmunologisk prøve.
Det var en signifikant doseavhengig reduksjon i FSH forbundet med økende menoder bovin follikkelvæske. Resultater er vist i tabell 3.
Eksempel 11: Rensing av inhibin fra follikkelvæske fra sau
Vi har funnet at inhibinaktivitet fra follikkelvæske fra sau kan renses på en lignende måte som bFF-inhibin ved å bruke de ovenfor angitte rensingstrinn A, B og C. Dets karak-teristika etter trinnene D og E er lik med karakteristikaene til bFF-inhibin. I utvidet forstand vil rensingstrinnene A-E være anvendbare på andre pattedyrinhibiner, deriblant inhibin fra menne ske.
Ettersom FSH er viktig ved stimuleringen av eggstokk- og testikkelfunksjon, ligger de viktigste potensielle anvendelser av renset inhibin i dets evne til spesifikt å inhibere FSH-sekresjon, eller i dets anvendelse som et antigen slik at immunisering mot inhibin vil utløse antistoffer som er i stand til å nøytralisere endogent forekommende inhibin, og derved gi FSH-nivåer. Det har vært utført mange undersøkelser in vlvo ved å bruke rå eller delvis rensede ekstrakter av gonadale vev eller væsker i forsøk på å undersøke virkningen av og fysiologien til inhibin. I disse forsøkene omfatter virkninger som er tilskrevet, men ikke vist, å skyldes inhibin eller antistoffer mot inhibin: 1. Inhibering av gonadal funksjon (Moudgal et al., 1985 i "Gonadal Proteins and Peptides and Their Biological Significance" (ed. Sairam), World Scientific Publish-ing, Singapore (under trykking). 2. En økning i eggløsningshyppighet (Henderson et al., J. Endocrinol. 102, (1984) 305, Cummins et al., Proe.
Aust. Soc. Reprod. Biol. 15 (1983) 81).
3. En påskyndelse av pubertetsstart (Al Obaidi et al., Proe. Aust. Soc. Reprod. Biol., 15 (1983) 80).
De kjente egenskapene til inhibin og FSH tyder på en rekke mulige anvendelser for det rensede inhibin og antistoff mot inhibin ifølge foreliggende oppfinnelse: (i) Økning av eggløsningshyppigheten: Det er anerkjent at FSH stimulerer utviklingen av egg i eggstokker hos pattedyr (Ross et al., (1981) i Textbook of Endocrinology, ed. Williams, s. 355) og at for mye stimulering av eggstokkene med FSH vil føre til flere egg-løsninger (Gemzell, Induction of ovulation with human gonadotrophines, Recent Prog. Hormone Res. 21 (1965) 179). Vi har vist at inhibin vil undertrykke FSH både in vitro og in vivo og at inhibin kan brukes som et immunogen for å produsere nøytraliserende antistoffer mot inhibin. Immuniseringen av pattedyr, f.eks. kveg og får, med det rensede preparat av inhibin og et egnet hjelpestoff fører til utviklingen av antistoffer i immuniserte dyr. Disse antistoffene nøytraliserer dyrets egen inhibinproduksjon og fjerner derved den undertrykkende virkning på ESH-sekresjon. Den resulterende økning i FSH fører til økt stimulering av follikkelutvikling i eggstokken med en økning i eggløsningshyppighet.
Oppsamling av serum fra dyr immunisert mot inhibin gir også et antiserum som kan brukes til passiv immunisering av andre dyr. Ved hjelp av denne fremgangsmåten nøytraliserer injeksjonen av antiserumet mot inhibin dyrets egen inhibin og fører følgelig til en økning av FSH og de derpå følgende virkninger på stimulering av eggløsning. Både den passive og den aktive metode for immunisering kan brukes til å øke eggløsningshyppighet.
Eventualiteten å bruke inhibin til aktiv immunisering for å få gonadal vekst er illustrert ved økningen i testikkelstørrelse hos kaninen testet under immunisering mot inhibin (eksempel 5). (ii) Inhibering av eggstokk- og testikkelfunksjon: Den anerkjente viktighet av FSH ved stimuleringen av follikkelutvikling i eggstokkene og sædcelleproduk-sjon i testiklene (Ross et al., (1981) i Testbook of Endocrinology, ed. Williams, s. 355, Bardin and Paulsen, (1981), The Testes, i Textbook of Endocrinology, ed. Williams, s. 293) tyder på en potensiell rolle for inhibin i undertrykkelsen av gonadal funksjon. Det er forventet at administrasjonen av inhibin vil føre til en undertrykkelse av eggstokk-og testikkelfunksjon og et fruktbarhetsavbrudd. Denne virkningen av inhibin kan brukes på individer av hannkjønn og hunnkjønn av den humane, ovine og bovine art, og vil sannsynligvis være anvendbar på andre arter. (iii) Fremskyndelse av fruktbarhetsinntreden: Det er anerkjent at en av de tidligste hendelser ved pubertetsstart er økningen i FSH-nivåer som fører til eggstokk- og testikkelstimulering (Ross et al., (1981) i Textbook of Endocrinology, ed. Williams, 3. 355, Bardin and Paulsen, (1981), The Testes, i Textbook of Endocrinology, ed. Williams, s. 293). Den mulighet foreligger at immunisering av seksuelt umodne pattedyr mot inhibin ved hjelp av aktive eller passive teknikker vil føre til en alt for tidlig pubertetsstart med ledsagende stimulering av eggstokk- og testikkelfunksj on.
Yteevnen med hensyn til formering i løpet av levetiden hos husdyr som f.eks. kyr, får og svin, avhenger av alderen ved pubertetens begynnelse, tids-rommene mellom hver befruktning og muligheten for derpå følgende eggstokksvikt med økende alder. Immunisering av unge dyr før pubertet med inhibin, enten ved hjelp av aktiv eller passiv immunisering, nøytraliserer dyrets egen inhibinproduksjon og fører til en Økning av FSH. Denne økning i FSH-nivåer induserer pubertal utvikling ved en tidligere alder enn normalt ved stimulering av kjønnskjertiene. Denne metoden kan brukes til å indusere tidlig utviklet pubertet i pattedyr av hann- eller hunnkjønn.
(iv) Undertrykkelse av pubertet: Ettersom FSH er anerkjent som en avgjørende faktor ved pubertetsstart, kan administrasjon av inhibin brukes som et middel for å undertrykke pubertet i uønskede situasjoner, f.eks. for tidlig pubertal utvikling hos mennesker, eller for å forsinke pubertetsstarten. (v) Inhibin kan brukes som et immunogen for å produsere antisera eller monoklonale antistoffer som kan brukes til å utvikle radioimmunologiske analyser eller enzymbundne immunologiske analyser for å måle inhibin, og for å utvikle immunologisk adsorberende kolonner for å hjelpe til ved rensingen av inhibin. (vi) Ved å bruke de ovenfor beskrevne antisera er et radioimmunologisk analysesystem for måling av inhibin blitt utviklet som muliggjør målingen av inhibin i biologiske prøver (f.eks. plasma, serum eller urin), noe som ikke er mulig ved bruk av det tidligere kjente in vitro biologiske prøvesystem til Scott et al (1980). Inhibinnivåer i plasma eller serum vil gi et uttrykk for Sertoli-celle- og granulosacelle-funksjon for anvendelse ved diagnosen av fruktbar-
hetsstatus. (vii) Det er mulig at administrasjon av store mengder inhibin kan inhibere sekresjonen av LH. Dette vil ytterligere understøtte inhibins evne til å undertrykke eggløsning.
Claims (31)
1. Proteinmateriale, inhibin, med en tilstrekkelig renhet til å gi et enkelt hovedbånd på ikke-reduserende SDS-PAGE, karakterisert ved at: (a) molekylvekten bestemt ved SDS-PAGE er 56000 ± 1000; (b) det isoelektriske punkt er i området 6,9-7,3; (c) proteinet kan bindes spesifikt til Concanavalin A-Sepharose; (d) proteinet består av to underenheter som lar seg atskille ved reduksjon, bestemt ved hjelp av SDS-PAGE, kjennetegnet ved at: (i) molekylvektene er henholdsvis 44000 ± 3000 og 14000 ± 2000, (ii) det isoelektriske punkt til underenheten med molekylvekt 44000 er i området 6,0 til 7,0, (iii) De N-terminale aminosyresekvenser av de to underenheter er: (e) proteinmaterialet kan undertrykke follikkelstimulerende hormon, men ikke luteiniserende hormon, tyroidstimuler-ende hormon eller prolaktin i et in vitro biologisk prøvesystem, (f) proteinet kan merkes med radioaktiv jod.
2. Proteinmateriale ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en renhet på minst 75 %.
3. Proteinmateriale ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det er erholdt fra mammalsk ovariefollikkelvæske.
4. Proteinmateriale,
karakterisert ved at det er en underenhet av inhibin med følgende egenskaper: a) en molekylvekt bestemt ved SDS-PAGE på 14000 2000; b) en N-terminal aminosyresekvens:
5. Proteinmateriale,
karakterisert ved at det er en underenhet av inhibin med følgende egenskaper: a) en molekylvekt bestemt ved SDS-PAGE på 44000 ± 3000; b) et isoelektrisk punkt i området pH 6,0 til 7,0; c) en N-terminal aminosyresekvens
6. Proteinmateriale,
karakterisert ved at det er et derivat av proteinet inhibin hvori proteinmaterialet omfatter hele, eller en del av, minst én av underenhetene definert i krav 1.
7. Proteinmateriale ifølge krav 6, karakterisert ved at det er en del av underenheten med molekylvekt 44000 ± 2000.
8. Proteinmateriale ifølge krav 6,
karakterisert ved at det er et glycoprotein som kan undertrykke produksjon av follikkelstimulerende hormon uten å undertrykke produksjon av luteiniserende hormon.
9. Proteinmateriale ifølge krav 6,
karakterisert ved at det kan administreres som et antigen i pattedyr for å produserer antistoffer mot proteinet inhibin og derved øke nivåene av follikkelstimulerende hormon i pattedyr.
10. Fremgangsmåte for rensing av inhibin fra et mammalsk utgangsmateriale inneholdende inhibinet,
karakterisert ved at: (a) utgangsmaterialet underkastes en første gelgjennomtrengningskromatografi på Sephacryl S200 eller Sephadex G100 for å gi et første eluat; (b) det første eluat underkastes en andre gelgjennomtrengningskromatografi på Sephacryl S200 eller Sephadex G100 for å gi et andre eluat; (c) det andre eluat underkastes omvendt fase væskekromato-graf i med høy yteevne for å gi et tredje eluat; (d) det tredje eluat underkastes preparativ polyakrylamidgel-elektroforese for å erholde et enkelt hovedbånd; og (e) det enkle hovedbånd analyseres med hensyn til evne til å undertrykke produksjon av follikkelstimulerende hormon fra rotte-hypofyseforlappceller i kultur uten å inhibere produksjon av luteiniserende hormon fra cellene.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det anvendes follikkelvæske som utgangsmateriale.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det anvendes bovin, ovin eller human follikkelvæske som utgangsmaterialet.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det anvendes Sephacryl S-200 for å utføre den første gelgjennomtrengningskromatografi, trinn (a).
14. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det anvendes et første eluat omfattende en void-volumfraksjon fra gelgjennomtreg-ningskromatografien.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det anvendes Sephadex G-100 i nærvær av syre, fortrinnsvis 4M eddiksyre, for å ut-føre den andre gelgjennomtrengningskromatografi, trinn (b).
16. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den andre gelgjennomtrengningskromatografi utføres på en analytisk kolonne.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den omvendte fase væskekromatografi med høy yteevne utføres ved anvendelse av et kjemisk bundet N-alkyl-silisiumoksid kolonnemateriale.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det fra trinn (d) iso-leres en gelporsjon fra den inhibininneholdende preparative polyakrylamidgel etterfulgt av at inhibinet inneholdt i gelporsjonen underkastes elektroforetisk eluering.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den omfatter at det første eluat underkastes en pH-justering til pH 4,75 før det andre gelgj ennomtrengningskromatograferingstrinn.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den elektroforetiske eluering omfatter: (a) vask av gelporsjonen i en elueringsbuffer; (b) bløtlegging av gelporsjonen i en bløtleggingsbuffer over-lagt med en elueringsbuffer; (c) innledning av elektroforetisk eluering av gelporsjonen; (d) erstatning av elueringsbufferen med en dialysebuffer; (e) kontinuerlig elektroforetisk eluering av gelporsjonen inntil inhibinet har vandret ut fra gelporsjonen; og (f) innsamling av inhibinet.
21. Antistoff spesifikt overfor inhibin ifølge krav 1 og som nøytraliserer inhibinaktivitet ln vitro,
karakterisert ved at det fremstilles ved: (i) immunisering med en effektiv mengde av et preparat av et proteinmateriale ifølge krav 1 ved: (a) oppløsning av det rensede inhibin i buffer; (b) emulgering av det rensede inhibin oppløst i bufferen med adjuvans for å gi en emulsjon; og (c) injeksjon av emulsjonen i pattedyret;
etterfulgt av (ii) isolering av det antistoffinneholdende antiserum fra pattedyret.
22. Antistoff mot inhibin ifølge krav 21, karakterisert ved at det er merket.
23. Blanding effektiv som et prevensjonsmiddel for pattedyr,
karakterisert ved at den omfatter en effektiv mengde av proteinet inhibin ifølge ethvert av kravene 1 til 3 sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel, eller sammen med et farmasøytisk akseptabelt preparat med forsinket frigivelse.
24. Fruktbarhetsøkende eller diagnostisk blanding til ikke-terapeutisk anvendelse,
karakterisert ved at den omfatter et antistoff ifølge krav 21 sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel.
25. Fruktbarhetsøkende blanding til ikke-terapeutisk anvendelse,
karakterisert ved at den omfatter et antistoff ifølge krav 21 sammen med et farmasøytisk akseptabelt preparat med forsinket frigivelse.
26. Anvendelse av proteinmateriale ifølge ethvert av kravene 1 til 3 i radiomerket form, og et antistoff mot inhibin ifølge krav 21 som er i stand til å binde radiomerket inhibin og nøytralisere inhibinaktivitet in vitro, i en radioimmunanalyse for analysering av forekomsten av inhibin i en prøve.
27. Anvendelse av radioimmunanalyseprosedyren ifølge krav 26 for å påvise og diagnostisere ufruktbarhet hos et pattedyr.
28. Anvendelse av et merket antistoff ifølge krav 22 som er radiomerket i en radioimmunanalyse for inhibin.
29. Anvendelse av et polyetylenglykol-lettet andre antistoff -utfellingstrinn i radioimmunanalysen ifølge krav 28.
30. Anvendelse av inhibin ifølge ethvert av kravene 1-3 koblet til et enzym i en enzymbundet immunanalyse.
31. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 21 eller 22 koblet til et enzym, i en enzymbundet immunanalyse
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPG542784 | 1984-06-08 | ||
AUPH003185 | 1985-04-04 | ||
PCT/AU1985/000119 WO1986000078A1 (en) | 1984-06-08 | 1985-06-03 | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO860427L NO860427L (no) | 1986-02-06 |
NO176570B true NO176570B (no) | 1995-01-16 |
NO176570C NO176570C (no) | 1995-04-26 |
Family
ID=25642809
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO860427A NO176570C (no) | 1984-06-08 | 1986-02-06 | Proteinmateriale, inhibin, fremgangsmåte for renfremstilling av dette, antistoff mot inhibin, ikke-terapeutiske blandinger inneholdende inhibin/antistoff samt anvendelse for diagnostiske og analytiske formål |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5102807A (no) |
EP (1) | EP0185034B1 (no) |
JP (2) | JP2521707B2 (no) |
AT (1) | ATE95194T1 (no) |
CA (1) | CA1341617C (no) |
DE (1) | DE3587603T2 (no) |
DK (1) | DK171711B1 (no) |
NO (1) | NO176570C (no) |
NZ (1) | NZ212248A (no) |
WO (1) | WO1986000078A1 (no) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1341617C (en) * | 1984-06-08 | 2011-06-28 | Henry George Burger | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid |
WO1986006076A1 (en) * | 1985-04-18 | 1986-10-23 | Biotechnology Australia Pty. Ltd. | Recombinant inhibin |
US4798885A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-17 | Genentech, Inc. | Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain |
NZ231899A (en) * | 1985-10-03 | 1991-07-26 | Genentech Inc | Human or porcine inhibin peptide compositions and dna encoding them |
US5089396A (en) * | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5215893A (en) * | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4864019A (en) * | 1985-11-08 | 1989-09-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Antibodies to inhibin and conjugates produced therefrom |
ZA871844B (en) * | 1986-03-13 | 1988-05-25 | Biotechnology Pty Ltd | Method of assay of inhibin |
US5015729A (en) * | 1986-06-24 | 1991-05-14 | The Salk Institute For Biological Studies | Ovine inhibin |
US6150328A (en) * | 1986-07-01 | 2000-11-21 | Genetics Institute, Inc. | BMP products |
DE3853383T2 (de) * | 1987-01-29 | 1995-07-27 | Biotech Australia Pty Ltd | Isolierung von einkettigen proteinen mit fsh unter- drückender aktivität aus follikularflüssigkeit. |
US5032507A (en) * | 1987-11-13 | 1991-07-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Potentiation of erythropoiesis |
WO1989011862A1 (en) * | 1988-05-31 | 1989-12-14 | Biotechnology Australia Pty. Ltd. | Actions of hormones |
WO1991010445A1 (en) * | 1990-01-08 | 1991-07-25 | Genentech, Inc. | Method for increasing fertility in females |
DE4000327A1 (de) * | 1990-01-08 | 1991-07-11 | Stefan Heiden | Arzneimittel zur verbesserung der ovarreaktion und der eizell- und embryonen- produktion bei haussaeugetieren |
US5942220A (en) * | 1990-03-16 | 1999-08-24 | Chiron Corporation | Inhibitor of cytokine activity and applications thereof |
ATE238417T1 (de) * | 1991-11-04 | 2003-05-15 | Inst Genetics Llc | Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung |
US20080070842A1 (en) * | 1991-11-04 | 2008-03-20 | David Israel | Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use |
US5428011A (en) * | 1992-06-16 | 1995-06-27 | Procyon Biopharma, Inc. | Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma |
ES2213745T3 (es) * | 1993-05-12 | 2004-09-01 | Genetics Institute, Llc | Composiciones de bmp-11. |
US6291206B1 (en) * | 1993-09-17 | 2001-09-18 | Genetics Institute, Inc. | BMP receptor proteins |
ATE319823T1 (de) | 1993-12-07 | 2006-03-15 | Inst Genetics Llc | Bmp-12, bmp-13 und diese enthaltende sehne- induzierende zusammensetzungen |
US5786179A (en) * | 1994-02-28 | 1998-07-28 | Agritech Technologies Ltd. | Heterologous protein comprising avian alpha-subunit inhibin protein and methods of producing same |
US20030171283A1 (en) * | 1994-02-28 | 2003-09-11 | Satterlee Daniel G. | Inhibin compositions and methods of enhancing production performance |
US5725858A (en) * | 1994-02-28 | 1998-03-10 | Agritech Technologies, Ltd. | Methods of enhancing production performance of birds comprising administration of heterologous protein comprising avian alpha-subunit inhibin protein |
AU780982B2 (en) * | 1997-04-23 | 2005-04-28 | Monash University | Inhibin modulation of cell growth |
AUPO638897A0 (en) * | 1997-04-23 | 1997-05-22 | Monash University | Modulation of cell growth and methods relating thereto |
TW586934B (en) * | 1997-05-19 | 2004-05-11 | Sumitomo Pharma | Immunopotentiating composition |
US6727224B1 (en) * | 1999-02-01 | 2004-04-27 | Genetics Institute, Llc. | Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage |
JP4703926B2 (ja) | 1999-10-15 | 2011-06-15 | ジェネティクス インスティテュート,エルエルシー | 骨形成蛋白をデリバリーするためのヒアルロン酸の処方 |
CA2355334A1 (en) * | 2000-10-16 | 2002-04-16 | Procyon Biopharma Inc. | Pharmaceutical preparations and methods for inhibiting tumors |
US20030082233A1 (en) * | 2000-12-01 | 2003-05-01 | Lyons Karen M. | Method and composition for modulating bone growth |
TW200526779A (en) | 2001-02-08 | 2005-08-16 | Wyeth Corp | Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof |
JP2005500280A (ja) * | 2001-06-01 | 2005-01-06 | ワイエス | 骨形成タンパク質(bmp)をコードする配列の全身投与のための組成物および方法 |
TWI267378B (en) * | 2001-06-08 | 2006-12-01 | Wyeth Corp | Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins |
US20050026833A1 (en) * | 2001-11-08 | 2005-02-03 | Rabbani Shafaat Ahmed | PSP-94: use for treatment of hypercalcemia and bone metastasis |
EA008354B1 (ru) * | 2002-05-17 | 2007-04-27 | Уайз | Инъецируемые твердые переносчики гиалуроновой кислоты для доставки остеогенных протеинов |
WO2004043287A2 (en) * | 2002-11-07 | 2004-05-27 | Agritech Technology, Ltd | Novel compositions that enhance production performance in avians |
CN1878565B (zh) * | 2003-09-12 | 2011-01-12 | 惠氏公司 | 用于递送成骨蛋白的注射型磷酸钙固体小棒剂和糊剂 |
ES2667013T3 (es) | 2010-11-29 | 2018-05-09 | Mote Marine Laboratory, Inc. | Determinación de las características sexuales de peces usando hormonas peptídicas |
BR102014005376A2 (pt) * | 2014-03-07 | 2016-02-10 | Ouro Fino Saúde Animal Ltda | antígeno de inibina alfa, gene codificante de inibina alfa, gene codificante de proteína de fusão, processo de obtenção do antígeno de inibina alfa, composição antigênica, uso do antígeno de inibina alfa e uso da composição antigênica |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1007568A (en) * | 1973-12-13 | 1977-03-29 | Michael C. Attwell | Bovine immunoglobulin isolation process |
FR2361912A1 (fr) * | 1976-08-19 | 1978-03-17 | Merck & Co Inc | Vaccin anti-fecondite a base de membrane pellucide solubilisee |
US4409139A (en) * | 1981-08-10 | 1983-10-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Gonadostatin |
US4423037A (en) * | 1982-05-13 | 1983-12-27 | The General Hospital Corporation | Inhibitors of peptide hormone action |
CA1341617C (en) * | 1984-06-08 | 2011-06-28 | Henry George Burger | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid |
WO1986006076A1 (en) * | 1985-04-18 | 1986-10-23 | Biotechnology Australia Pty. Ltd. | Recombinant inhibin |
US4624944A (en) * | 1985-06-14 | 1986-11-25 | The Regents Of The University Of California | Human seminal alpha-inhibins |
US4740587A (en) * | 1985-07-18 | 1988-04-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Inhibin and method of purifying same |
US4798885A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-17 | Genentech, Inc. | Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain |
US4864019A (en) * | 1985-11-08 | 1989-09-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Antibodies to inhibin and conjugates produced therefrom |
US4737578A (en) * | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
WO1989011862A1 (en) * | 1988-05-31 | 1989-12-14 | Biotechnology Australia Pty. Ltd. | Actions of hormones |
-
1985
- 1985-05-27 CA CA482470A patent/CA1341617C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-30 NZ NZ212248A patent/NZ212248A/en unknown
- 1985-06-03 DE DE85902422T patent/DE3587603T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-03 WO PCT/AU1985/000119 patent/WO1986000078A1/en active IP Right Grant
- 1985-06-03 JP JP60502564A patent/JP2521707B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-03 AT AT85902422T patent/ATE95194T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-03 EP EP85902422A patent/EP0185034B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-02-06 NO NO860427A patent/NO176570C/no unknown
- 1986-02-07 DK DK060586A patent/DK171711B1/da not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-04-11 US US07/336,053 patent/US5102807A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-03 US US07/389,328 patent/US5364837A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-06 JP JP7084463A patent/JP2583030B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO176570C (no) | 1995-04-26 |
WO1986000078A1 (en) | 1986-01-03 |
NZ212248A (en) | 1991-05-28 |
EP0185034A1 (no) | 1986-06-25 |
JP2521707B2 (ja) | 1996-08-07 |
EP0185034A4 (no) | 1988-01-28 |
ATE95194T1 (de) | 1993-10-15 |
DK171711B1 (da) | 1997-04-01 |
US5364837A (en) | 1994-11-15 |
JPS61502399A (ja) | 1986-10-23 |
US5102807A (en) | 1992-04-07 |
DE3587603D1 (de) | 1993-11-04 |
CA1341617C (en) | 2011-06-28 |
DE3587603T2 (de) | 1994-02-10 |
NO860427L (no) | 1986-02-06 |
DK60586D0 (da) | 1986-02-07 |
JPH0848636A (ja) | 1996-02-20 |
DK60586A (da) | 1986-02-07 |
JP2583030B2 (ja) | 1997-02-19 |
EP0185034B1 (en) | 1993-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5364837A (en) | Method of modifying serum hormone levels using purified inhibin materials | |
McLachlan et al. | The radioimmunoassay of bovine and human follicular fluid and serum inhibin | |
Midgley Jr et al. | Use of antibodies for characterization of gonadotropins and steroids | |
CA1307736C (en) | Method of assay of inhibin | |
Shome et al. | Human and porcine thyrotropins: a comparison of electrophoretic and immunological properties with the bovine hormone | |
LOLAIT et al. | Ovarian immunoreactive β-endorphin and estrous cycle in the rat | |
BRADDON | Relaxin-dependent adenosine 3′, 5′-monophosphate concentration changes in the mouse pubic symphysis | |
Conlon et al. | Properties of endogenous somatostatin-like immunoreactivity and synthetic somatostatin in dog plasma. | |
US4966888A (en) | hCG-hLH receptor and hCG-hLH receptor-hCG complex as antigens, antibodies thereto and contraceptive vaccine | |
US4764502A (en) | Intragonadal regulatory protein | |
IE63385B1 (en) | A method for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (Type III) and procollagen (Type III) in body fluids and means for carrying it out | |
AU636318B2 (en) | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid | |
Lunenfeld et al. | Immunology of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone | |
Rao et al. | The role of FSH and LH in the initiation of ovulation in rats and hamsters: a study using rabbit antisera to ovine FSH and LH | |
Weiss et al. | Partial purification of relaxin from human seminal plasma | |
ELY et al. | A study of the immunological and biological properties of a follicle-stimulating hormone | |
CA1268417A (en) | Intragonadal regulatory protein | |
Hellema | The chameleonic behaviour of gonadotrophins: A review of recent results on their physicochemical properties and molecular structure | |
Maruo et al. | Large molecular species of chorionic gonadotrophin from human placental tissues: biosynthesis and physico-chemical properties | |
US4271069A (en) | Beta-hCG preparation and method | |
NAKAZAWA et al. | Immunohistochemical study on oxytocin-like substance in the human placenta | |
SUNDARAM et al. | Immunochemical studies of human growth hormone, ovine prolactin, bovine growth hormone and a tryptic digest of bovine growth hormone | |
Reddy et al. | Immunohistochemical demonstration of somatostatin in the pancreas of fetal and adult sheep | |
Kragt et al. | Radioimmunoassay of ovine FSH | |
Desplan et al. | Isolation of circulating immunoreactive human parathyroid hormone: comparison with a 1-34 N-terminal synthetic fragment |