JPS61502399A - 卵胞液から単離したインヒビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 卵胞液から単離したインヒビン 本発明は哺乳動物の卵胞液からの生物学的に活性な因子の単離とその有用な使用 に関する。

状況証拠と限られた実験から既に１９３２年Ｋ、下垂体による卵胞刺激ホルモン （ＦＳＨ）の分泌を選択的に抑制する能力のある非ステロイド因子（インヒピン と命名された）を性腺が産生じていることが示唆された（マクラフ　（１ｉｌｅ ｃｕ１．１ａｇｈ　）、サイエンス第７６巻、（１９３２年）１９１ｉＩ）。そ れ以来ＦＳＨを測定するラジオイムノアッセイが開発されてインヒピンの存在を 示唆する大量のデータが蓄積されたが、１９７０年代の初期に初めてこの物質の 単離と同定が試みられた。

以後多くのグループの研究者が、起源の異なる数種の性腺からインヒピンの精製 を試みたが、その結果は矛盾していた（デ　ゾヨング（ｄｅ　Ｊｏｎｇ　）　、 モレキュラー・アンｒ・セリュラー・工／ドクリノロゾー（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　ｍｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　）第１３巻、（１９７９年）１頁）。

ある研究者たちはヒトの精漿からインヒピンを単離し配列を決定して、インヒビ ンの分子種の分子量は５．０００ダルトンと１４，０００ダルトンであると主張 している（セイダ（５ｅｉｄａｈ　）ら、エフイービーニス年）９８頁；シエス （５ｈｅｔｈ　）ら、エフイービーエスレターズ（ＦＥＢＳ　Ｉ、ｅｔｔｅｒｓ 　）第１６５巻、（１９８４年）１１頁）。さらにこれらの物質が性腺に由来す るものか否かについて真剣に疑問を持たれている（ベクサツク（Ｂｅｋｓａｃ　 ）ら、インターナショナル・ジャーナル・オデ・アンｒロロジー（Ｉｎｔ、　Ｊ 、Ａｎｄｒｏｌｏｇｖ　）第７巻、（１９８４年）３８９頁：リリア（Ｌｉ１ｊ ａ　）とゾエプソン（Ｊｅｐｐｐｓｓｏｎ　）　、エフイービーエスレターズ（ ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）第１８２巻、（１９８５年）１８１頁）。他のグ ループの研究者たちは性腺のインヒげンを単離するだめに、畢丸の精細管（畢丸 網液）から採取した液及び卵胞液を使用してきた。しかし１２年間の研究にもか かわらず精製した物質は得られていない。これらの事実は、インヒピンと規定さ れる物質の性質、化学的特質又はその産生部位に関して一致した見解が得られて いないことを示している。

牛の卵胞液の性質から、特異的な機能を有する１個又は２個以上の物質（「イン ヒピン」）が存在するという仮説に結びついた。我々はインヒビ／に特徴的な全 ての生物学的基準を満たす物質を性腺より単離した。

本発明はインヒビンの精製と単離、抗体産生のための精製インヒピンの使用、定 量ラジオイムノアッセイにおけるインヒビンと該抗血清の使用、及びインぎトロ 及びインピ〆でのインヒビンとインヒビンに対スる抗体の応用に関する。

本発明の１つの態様では下記の特徴を有する精製蛋白（インヒビン）が与えられ る： （ａ）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　テ決定シｆｃミカケｆ）４千ｉｉ　）’！　５６， ０００±１．０００である： （ｂ）等電点は６．９−７．３の範囲にある；（Ｃ）この蛋白はコンカナバリン Ａ−セファロースに特異的圧結合する； （ｄ）この蛋白は、下記の特徴を有する２個のサブユニットより筬る： （１）　５ＤＳ−ＰａＧＥで決定したみかけの分子量はそれぞれ４４．０００± ３．０００と１４．０００±２．０００である、 （１１）分子量４４０００のサブユニットの等電点は６．０−７．０の範囲にあ る、 Ｑｉｉ）　２個のサブユニットのＮ−末端アミノ酸配列は後述する通りである： （ｅ）この蛋白はインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）のバイオアッセイ系で卵胞 刺激ホルモンを抑制するが黄体化ホルモン、甲状腺刺激ホルモン又はプロラクチ ンを抑制しない： （ｆ）この蛋白は放射性ヨードで標識され得る。

本発明の別の態様では下記の段階から成ることを特徴とする、哺乳動物の卵胞液 からインヒビンを単離及び精製する方法が与えられる。

（ａ）１回以上のグル浸透クロマトグラフィーの段階；（ｂ２１回以上の逆相高 速液体クロマトグラフィ一段階： （ｃ）１回以上の調製ポリアクリルアミドデル電気泳動段階； （ｄ）精製したインヒピンの電気泳動による溶出。

好ましくはｒル浸透クロマトグラフィ一段階はボア（孔］容積の大きいデル浸透 支持体、例えばセファクリル５２００又はセファデックスＧ１００（セファクリ ル及びセファデックス共にファルマシア社の登録商標である）を用いて行う。

凍結乾燥又は真空乾燥により生物活性の直接の回収を可能にするため、好適な溶 出法では揮発性溶媒（例えば酢酸アンモニウム、酢酸、又は類似化合物）を用い る。

逆相高速液体クロマトグラフィーは好ましくをま、粒子径分布の小さい（最も好 ましくは５−１０μ）の化学結合し九Ｎ−アルキルシリカカラム充填剤を用いて 行う。使用する溶媒は揮発性又は非揮発性でもよく、メタノール、アセトニトリ ル、又はインプロパツール等の混和性有機溶媒を有する水の濃度勾配液中に、ト リフルオロ酢酸（ＴＦＡ　）　、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリ ン酸ナトリウム等のイオン性改質剤を含有していてもよい。好適な方法では０． １％のＴＦＡ中の０−５０％のアセトニトリル濃度勾配を用いる。種々の孔径と 架橋度を有するポリアクリルアミドデル電気泳動（ＰＡＧＩＩＣ）用デルを用い る種々の調ｖＪポリアクリルアミｒデル電気泳動法がドデシル硫酸ナトリウムの 存在下で使用可能である。電気泳動用の好適な緩衝液系はリームリ（Ｌａｅｍｍ ｌｌ）の方法（ネイチャー第２２７巻、（１９７０年）６８０頁）に基づく。

さらにインビトロのバイオアッセイでインヒビンの活性を中和する能力と、イン ビボで性腺の重量を上昇させる能力のあるインヒビンに対する特異的抗体を作成 する方法が与えられる。

またさらに生体試料（例えば血漿、血清又は尿）中のインヒビンの測定に用いる インヒビンのラジオイムノアッセイ法が与えられる。

下記の非限定的実施例と図を参照ｌ−て例示の目的で、本発明の１つの態様を詳 細に説明する。

第１図はセファクリルＳ　−２００で分画した牛の卵胞液（ｂＦＦ）中のインヒ ビ／活性の溶出プロフィールを示す。

第２図はセファデックスＧ１００で分画した１）ＦＦ中のインヒビ／活性の溶出 プロフィールを示す。

第３図はデルクロマトグラフィーの後で逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ −ＨＰＬＣ）で分画したｂＦＦ中のインヒビ／活性の溶出プロフィールを示す。

第４図は調製ＦＡＧ　Ｆｉにより得た４個の連続画分の非還元８Ｄ８−ポリアク リルアミドデル電気泳動パターンを示す。

ここで使用する省略語は下記の意味を有するｂＦＦ　−牛卵胞液 ＲＰ−ＨＰＬＣ−逆相高速液体クロマトグラフイーＰＡＧＥ　−ポリアクリルア ミＰＰｆａル電気泳動ＦＳＨ−卵胞刺激ホルモン ＬＨ−黄体化ホルモン Ｕ　一単位 ＧＦ　−デル濾過 １（Ｄ　−キロダルトン ＴＦＡ　−）リフルオロ酢酸 ＳＤＳ　−ドデシル硫酸ナトリウム この精製操作は１回以上のデル浸透段階、１回以上の逆相高速液体クロマトグラ フィ一段階及び１回以上のＰＡＧＥ段階の連続的応用に基づく。

卵胞液の採取（ｂＦＦ　） 牛の卵巣は地方の屠殺場から得た。ｂＦＥＦを吸引してプロテアーゼインヒビタ ーであるトラゾロール（１０Ｕ／Ｍｌ）トフツ化フェニルメチルスルフォニル（ ２４μｇ／　ｍｌ　）の入った冷却した容器中に移した。この１）ＩＦＦを一２ ０℃で保存した。

インヒピンの精製操作は四段階より成る。下記にこの操作の概略と詳細な精製法 を示す。

精製操作の段階は以下の通りである： （Ａ）セファクリルＳ−２００によるゲルー浸透クロマトグラフィー。

（Ｂ）セファデックスＧ−１００によるデル浸透クロマトグラフィー。

（Ｃ）逆相高速液体クロマトグラフィー。

（Ｄ）調製ポリアクリルアミｒデル電気泳動。

（ｍ）試料の電気泳動による溶出。

インヒビンの精製はスフットらの方法（エンドクリ１０シー（Ｋｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌｏｇｙ　）第１０７巻、（１９８０年）１５３６頁）を若干改良して使用し た（アラ（Ａｕ　）ら、エンドクリノロシー（Ｋｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　） 第１１２巻、（１９８３年）２３９頁〕。こ、の方法はイ／ヒビンが培養中のラ ットの脳下垂体前葉細胞からのＦ’ＳＨ（ＬＨは異なる）用爪依存性の低下を引 き起こす能力に基づく。

ｂＦＦ　（５０−１００ｍｌ　）を０．０５　Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７，０（ ２５−５０厘ｌ）で稀釈し、遠心分離した（１２０００Ｆｘ３０分、４°Ｃ）。

上澄液（７５−１５０ｍ＋／）を七フアクリル５２００デル濾過カラム流速で分 画した。第一図に示すようにインヒビ／活性はこのカラムのボイド容積部分（分 子量≧９０．０００）に局在化していた。インヒビ／活性の回収率は９０％が得 られ比活性は６−４倍増加していた。

ボイド容積画分（第１５図、Ａ、Ｂ、Ｏ，Ｄ）を集め、プールした両分の２５− ５０チを氷酢酸（全色原を含まない）で酸性化して最終濃度を４Ｍ酢酸として、 一時間４°Ｃに維持した。残りの５０−７５％は次に分画するま−Ｑ−２０℃に て凍結保存した。酸性化したプール（約１２０ｍ／）をセファデックス０１００ カラム（９×９０ｃＩｒＬ）にかけて４Ｍ酢酸を溶出緩衝液として一時間当り７ ０−１００ｍ／の流速で溶出した。いずれのデル濾過カラムの場合も全ての操作 は４°Ｃで行った。

この条件化でインヒビ／活性の大部分は低分子量画分（溶出容積１７６０−１８ ８０ｍ／、分子量の範［）１１２０．０００−６０．０００、第２図）に溶出し 比活性は１０−２０倍増加しており、この部分のインヒビ／活性の回収率は４５ チであった。分析カラム（例えば２．５）１００ｃＴＩＬ）を用いて比活性の高 い（１０−５０倍）同様の活性のプロフィールが得られた。

Ｂ段階で得られたカラムの両分（溶出容積約１７６０−１９１０ｍｌ　）　ヲＲ Ｐ−ＨＰＬＣｈ　ラＡＫカＧ’ｔル前に７’　ｋした。使用したカラムはウルト ラボア（Ｕｌｔｒａｐｏｒｅ　）ＲＰＳＣである。使用した移動相はＱ、１％　 ＴＦａの水溶液とＱ、１％　ＴＦＡ中５０％のアセトニトリルとの直線濃度勾配 であり、流速は１ｄｇ／分であり、０．５Ｊ！／画分ずつ集めた。三種類の方法 を用いてカラムＫかけた：　（ａ）試料を凍結乾燥してｌ　ｍ９を４Ｍの酢酸に 溶解し、８−１０■乾燥重ｉ／腹ｌの濃度に濃縮し、約１００μｌの４Ｍ酢酸中 で遠心分離し、インジェクターを用いてＨＰＬＣカラムにかけた：（ｂ）凍結乾 燥した物質（５−１０ｒｎ９）を２０ｍ１０４Ｍ酢酸に溶解し、遠心分離し、Ｈ ＰＬＣ！の溶媒ボート（ロ）からカラムにかけた：（Ｃ）凍結乾燥していない物 質（約１００ｍ／）を０．５μのフィルター（ＦＨ；　ミリボア社）で濾過して から溶媒ボート（ロ）から２ｔｔｔ１分の流速でカラムにかけた。

（ｂ）及び（ｃ）の−回目の実験から得られたインヒビンの領域を再びクロマト グラフィーにかけた。各画分を（必要な場合は）二回目のクロマトグラフィーの 対応する試験管の内容物と一緒にして、バイオアッセイ用、アミノ酸分析用及び ５Ｄ８−ＰＡＧＥ用に分注した。Ｎ２下で蒸発させて各画分のアセトニトリルを 除去し、試料を凍結乾燥した。第６図に示すようにインヒビン活性はクロマトグ ラムの１つの場所（約３０チのアセトニトリルに対応す°る）に見出された。こ の実験における試後者の２つの方法ではＨＰＬ（！の性能は著しく影響を受けた が、各添加法においてインヒビンの回収率は４０チであった。このＨＰＬＣ操作 により比活性は１０倍増加し、全体では比活性は１６０倍増加した。

ＲＰ−ＨＰＬＣにより得られたインヒビン含有画分を非還元性試料用緩衝液（０ ，０６Ｍ　）リス−ＨｅｌｐＨ６，８，１２，５％グリセロール、１．２５％Ｗ ／Ｖ　ＳＤＳ及び０．００６％デロムフェノールプルー）に溶解シ、垂７６ポリ アクリルアミドデル電気泳動で分画した（レイド（Ｒｅ１ｄ　）とビーレスキー （Ｂｉｅｌｅｓｋｉ　）、アナリテイカ、Ｑ／−バイオケミストリー（Ａｎａｌ ｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ　）第２２巻、（１９６８年）３７ ４頁、の方法を変更した）。ＥＩＤＳポリアクリルアミドデル電気泳動溶液（リ ームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）、ネイチャー第２２７巻、（１９７０年）６８０頁 ）は充填デル（０，１２５Ｍトリス−Ｈｅｌ　ｐ）１６−８、Ｑ、１％Ｗ／ＶＳ ＤＥＩ、５％アクリルアミ）’、０．１３　％ビスアクリルアミ）’、０．１％ 過硫醗アンモニウムンと分離用デル（０，３８Ｍ　トリス−ＨｃｌｐＨ８，８， ０，１％ｗ／ｖ　ＳＤＳ、７．５　％　７りＩＪ　ルア　ミド、０．２チビスア クリルアミ１−”、０．０３％過硫酸アンモニウム）より構成されていた。電気 泳動緩衝液は０．０５％（Ｗ／Ｖ　）　５Ｄ１３含有２．５　ｍＭ　）リスグリ シン緩衝液である。添加する蛋白（５００−７００μｇ）を８個の試料用添加口 ｒ分けた。

試料が分離用ケ９ルに移動するまで（１，５ｈ）ゲルをまず２０７７１Ａで電気 泳動し、次にブロムフェノールブルーのマーカーがゲルの底に達するまでの間〔 ４ｈ〕電流を３３７７！Ａ　Ｖ増加した。ゲルを酢酸二インプロぎシアルコール 。水　１：３：６Ｖ／Ｖ中０．５チクマシーブルーで染色しく１５分）、酢酸： メタノール：水５０：１６７：７８５Ｖ／’／で脱色した。この方法で肉眼で見 えるようにｌ−たインヒピン領域（分子量　約５６．０００）をメスと定規を用 いて２寵の大きさに切った。インヒビン領域の上下のゲルもスライスにして切っ た。［気泳動で溶出する前にデルのスライスを密封した試験管中で−１５から一 ２０℃で保存した。

第４図は調製ＰＡＧＥ精製により得られた４個の連続の画分（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ ）の還元及び非還元５ＤＳ−デル電気泳動パターンである。インヒビン活性は主 ＫＢＷＪ分（見かけの分子量　約５６，０００±１．０００±ＳＤ；５つの精製 したインヒビン調製液）に存在していた。

還元条件化ではＢ画分は見かけの分子量が４４．０００±３．０００と１４［］ ００±２，０００　（ｎ＝５）（レーンＥ）の２つのおおきなパンげに別れた。

ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ系を使用した。蛋白ハ銀染色で 局在化した。使用した蛋白標準品は：牛血清アルブミン（分子ｆｆ１６７．００ ０）；卵白アルブミン（４３，０００）；カルボニックアンヒドラーゼ（２９， ０００）ニアヒルのリゾチーム（２１，［］ＯＯ）：鶏卵リリチウム（１４，５ ００）である。還元剤は０．１％２−メルカプトエタノールである。

使用した方法はフン力ビラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　）らの方法（メソツズ ・イン・エンずイモロゾ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）第 ９１巻、（１９８３年）２２７頁）を若干変更したものである。デルのスライス をカミソリの刃で細切れにし、溶出緩衝液（Ｑ、３５　Ｍ　ＮＨ，Ｈ（！０３中 ０．１１　ＳＤＳ　）で５分洗滌し、透析膜ディスク（分子量のカットオフ６． ０００−８．０００）の付いた電気泳動溶出セル中に入れた。ゲルのスライスを 浸透用緩衝液（０，４Ｍ　ＮＩ（、Ｉ（ｃｏ３中２％ＳＤＳ　）をかけてから溶 出緩衝液（Ｑ、Ｑ　５　Ｍ　ＮＨ，ＨＣＯ３ＣＯ２Ｏ３ＳＤＳ　）をかけた。溶 出緩衝液に個体のチオグリフレートナトリウムを最終濃度が０．５ｍＭになるよ ５に添加した。デルを６−５時間浸してから５０ｖ（直流）で電気泳動溶出を開 始した。１２−１６時間後に溶出緩衝液を透析緩衝液（Ｑ、Ｑ　ｉ　Ｍ　ＮＨ， ＨＣＯ３ＣＯ２Ｏ３％ＳＤＳ　）で交換し、クマシープルー染色と蛋白が試料捕 集用穴に移動するまで８０ｖ（直流）でさらに２０−２４時間電気泳動溶出した 。先の曲がった５０μｅのハミルトンシリンジで溶出した試料を試料捕集穴から 取り、分注し、凍結又は凍結乾燥した。精製した画分の試料をインビトロバイオ アツセイ用、アミノ酸分析用及び銀染色による＋３ＤＢ−ＰＡＧＦを用いる分子 量測定用にとっておいた。

前記の方法（ケ１ル浸透クロマトグラフィー、ＲＰ−ＩｒＰＬＣ，及び、９３１ １！Ｊ　５ＤＳ−ＰＡＧＥの組合わせ）を用いて、インヒビン活性は５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ　（第４図）上で単一の蛋白バンドとして回収され、見かけの分子量は５ ６．０００土１，０００（５つの調製液）であった。

インヒビンの精製した調製液はインビトロのバイオアッセイでＦＳＨを抑制する が、黄体化ホルモン、甲状腺刺激ホルモン又はプロラクチンを抑制せず、精製し た製品は特異的にＦＳＨを抑制することを示している。

この抑制は非特異的毒性効果によるものではない。

実施例２．もう１つの精製法 ４Ｍ酢酸を用いてＡ段階のボイド溶積画分をｐ）１４．７５にし、１２，０００ Ｘ、９で４°Ｃで６０分遠心分離してインヒビンを沈降させた以外は実施例１の ようにしてインヒビンを単離した。こうして得られたペレットを０．０５Ｍの酢 酸アンモニウムｐｉ−１７，０に溶解した。ペレットを緩衝液中で室温で破砕及 び音波処理して可溶化した。氷酢酸を用いて試料を４Ｍ酢酸として遠心分離して から、二回目のデル浸透クロマトグラフィ一段階（Ｂ段＠）のカラムにかけた。

溶解したペレットの一沈殿と酸性化を含むインヒビン活性の総回収率は′５４チ であった。この変法の利点は力２ムの試料用量が７５チ減少しているため、試料 の処理能力が大幅に増加することである。溶出緩衝液として４Ｍ酢酸を用いるデ ル濾過により実施例１の方法と類似の国分（溶出用量１７００−２１００ａ／り にインヒビン活性が回収された。以後のＲＰ−ＨＰＬＣ及び調製ｐｐ、ａｚ法で のインヒビンの挙動は、この例の中の種々の変法に影響されなかった。

実施例６．インヒビンの化学的性状の解析最終生成物を非還元状態下で分析５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥを行うと見かけの分子量が５６．　ＯＤ　Ｏ±１，０００（平均信 士標準偏差、調製物５個）の単一のパンｒが得られ、還元状態下では見かけの分 子量が４４．０００±３．ＯＤＤと１４０００±２，０００（調製物５個）の２ 個の大きなパンｒが観察された。非還元状態下の５６ｋＤバンドと還元状態下の ４４　ｋＤバンドの電気泳動による解析によりバンドの不均一性が観察された。

５６ｋＤ物質の見かけの分子量の範囲は５４０００−５７，０００であり、４４ ｋＤ物質は４２．０００−４６．０００であった。１４ｋＤパンｒでは単一のパ ンＶが認められた。

これらの事実はこの分子が糖蛋白であることと一致する。

２次元ＰＡＧＩ！Ｘ系（オファレル（０’Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ、　Ｈ）　。

ジャーナル・オデ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、、　Ｉ：ｊ ｈｅｍ、　）第２５０巻、（１９７５年）、４００７−４０２１頁）を用いて、 未変性インヒビンと大きい方のサブユニットのｐＩ値をめた。未変性インヒビン は銀染色で検出し、見かけの分子量が５６、０００のところに単一のバンドが得 られたが、ゎ１値がＦＪ−１６，９−７，，３の範囲の幾っがの非常に密接した 場所にあった。これらのデータは糖蛋白であることを示唆している。分子ｆ２ｔ ４４０００のサブユニットは見かけの分子量が４６．　ＯＯＯの単一のバンドを 示したが、ｐＩ値がｐｌ−１６，０−７，［］の範囲の幾つかの非常に密接した 場所にあった。これらのデータはこのサブユニットが糖蛋白であることを示唆し ている。

インヒビンが糖蛋白であるというさらに別の理由は以下の通りである： α）　ｉ　射ｓ　識インヒビンは、セファロース（ファルマシア社の登録商標） に固定化されたレクチンであるフンカナバリンＡＭ結合できる。数回の実験から トレーサーの１５−１７％はこのレクチンに結合しており、これは糖であるメチ ル−α−グルフぎラノシド（カルビオケム社、米国サンジエゴ）による溶出で放 出された。

（ｂ）　５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分画とニトロセルロースへの電気的移動後圧、 インヒビンは西洋ワサビペルオキシダーゼ標識小麦胚芽レクチンに結合。レクチ ンの結合はペルオキシダーゼの発色反応により追跡した。レクチンの結合は５６ に、Ｄの未変性蛋白と４４　ｋＤＮｏサブユニットと相関していた。

実施例４．インヒビンの２つのサブユニットのＮ−末端アミノ酸配列 イ／ヒビンの精製調製物を還元しカルざキシメチル化した。見かけの分子量がそ れぞれ４４，０００と１４０００のサブユニットをＰＡＧＥで分離し、上記実施 例１のＥ段階に記載の電気溶出法によりデルから回収した。インヒピンのメタノ ール沈殿によりＳＤＳを除去し、Ｎ−末端アミノ酸配列を決定した。

二個のサブユニットの配列は以下の通りである：残基４４　ｋＤサプユニツＩ− １４ｋＤサブユニツト７　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ ｌ　１　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ １５　Ａｓｐ １　６　Ｇ］、ｎ ｘｘｘ−不明確 ｙｙｙ　”測定不可能（これらの実験で試料が不十分であった。） Ａｓｘ　＝　Ａｓｎ又はＡＳＤ 実施例５．精製インヒビンに対する抗体の作成上記のように精製したインヒビン １９μｇを６００μｌのダルベラツウ（ＤｕｌｂｅＣｍＯ）のリン酸緩衝液−４ ７，４に溶解し油を基剤とする等量のアジュバント（例えばマルフール（Ｍａｒ ｃｏｌ　）　５２　：モンタナイド（ｕｏｎｌ；ａｎｉａｅ　）　８８８の９１ の混合物。マルフール（Ｍａｒｃｏｌ　）　５２はニップ（Ｋｓｓｏ　）社の商 標であり、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　）　８８８はパリのエスイーー ービーアイシー（ｓ、　ｇ、ｐ、ｐ、ｘ、ｃ、　）社の商標である）で乳化した 。２００μｌをウサギの筋肉内に４箇所注射し、２００μｌを皮下に注射した。

６週後に同じ注射法を用いてウサギに１８μｇの精製インヒビンを追加免疫した 。ウサギの血清中の抗体の抗体価は、ヨード化インヒビンに結合するか（詳細は 後述）、インビトロでインヒビンを中和する活性により測定した。追加免疫後２ 週目（８週目の試料）Ｋ最大の抗体価がえく外因性インヒビンの中和によるイン ヒビンに対する免疫が性腺の重置を増加させ、ＦＳＨｆｉ度を増加させたことを 示している。

実施例６　抗体の性状解析 上記のように調製したクサイ０８週目の抗血清の、インビトロでインヒビン活性 を中和する能力について調べた。インビトロのバイオアッセイのインヒビン標準 品として活性炭処理し、た牛の卵胞液を使用した（スコツト（５ｃｏｔ、ｔ　） ら、エンドクリノロジー（Ｋｎｄｏｃｒ−ｉｎｏｌｏｇｖ　）第１０７巻、１９ ８０年、１５３６頁）。

上記アッセイにおいて最大の応答を与えることが知られているインヒビンの投与 量を中和するのに２μｌの抗血清でｆ分であった。免疫前のウサギにはこの中和 活性は存在しなかった。もう１羽のウサギを最初純度の低いインヒビン調製液で 免疫しく　ＲＰ−ＨＰＬＣ！精製段階の後で得られた３４０μ＃Ｌ２２μｇの純 粋なインヒビンで追加免疫した。最初の免疫注射の時はパイッカイテス（Ｖａｉ ｔｕｋａｉｔｅｓ　）らの免疫法を用いて完全フロインドアシュパント中で行い （ジャーナル・オプ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズＡ 　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　 ａｎｄ　Ｍｅｔａ　−ｂｏｌｉｓｍ　）第３６巻、１９７１年、９８８頁）、追 加注射は上記の方法と同じである。このウサギの抗血清（９週目）はインビトロ で中和活性を示した。

実施例７：ｂｌ’？インヒビンのラジオイムノアッセイ温和なりロラミンーＴ法 又はポルトンハンター試薬（ポルトンとハ、７ター（Ｂｏｌｔｏｎ　ａｎｄ　Ｈ ｕｎｔｅｒ　）　、バイオケミストリー・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ）第１３３巻、（１９７３年）５２９頁）を用いてインヒビ ンの精製調製液をヨード化し、比活性０．５μＣｉ　／μｇ（後述するラジオイ ムノアッセイの自己排除方法により測定）にした。ヨード化物質は非ヨーＰ化分 子と同じ見かけの分子量を示した（還元条件下及び非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで測定）。ヨーｒ化トレーサーを用い、ラジオイムノアッセイ法を行いポリ エチレングリフール促進二抗体沈殿法より抗体結合及び非結合ヨード化ホルモン を分離した（ビーダーリンとシュエルドルフ（Ｐｅｔｐｒｓｏｎ　、Ｍ、Ａ、ａ ｎｄ　Ｓｗｅｒｆｌｏｆｆ　、Ｒ，８，：クリ２カル・ケミストリー（Ｃ１１ｎ ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第２５巻、１９７９年）１２３９−１２４１ 頁）。精製及び非精製１）ＦＦについて特徴的な排除曲線が得られた。精製物質 の用量応答曲線の感度（ＥＤ工。）は２　ｎｇ／チューブであり、ＥＤ５ｏは２ ５μｇ／チューブであった。インヒビンー抗体相互作用の解離定数は２０°Ｃで ４．５　Ｘ　１０−１０Ｍであった。

牛の卵胞液の粗抽出物が排卵を阻害することは既に示した。この阻害はＦＳＨで 完全に反対になる（エルクミンズ（Ｌｌｕｍｍｉｎｓ　）、博士論文、１９８６ 年、ニューイングランド大学（アルミゾール））。

妊娠５−７日のマウスに１．５μｇのインヒビンを午前９時に皮下投与し、午後 ６時に１３ＩＵのＨＯＧを皮下注射した。翌朝卵管膨大部の卵子の数を数えた。

第１表に示すようにインヒビンの投与は排卵を有意に抑対照（溶媒のみ）　１１ 　４．９１±２．６６精製インヒビン＊７　２．４６±２．２２ｂ７Ｆ＊＊（５ ０μｌ）　８　３．３８±１．８０ｂＦ’Ｆ　（１００μｌ）　４　２．０±０ ．０インヒビン調製物の！３Ｄｓ−ＰＡＧＥの銀染色に基づく純度は７５チであ る。混入しているものは、インヒビンのインビトロバイオアッセイにおいて生物 学的に不活性な高分子Ｎ（分子量６５−７０　ｋＤ　）物質である。

投与量的１．５μｌ蛋白／動物。

＊＊−２０μｇ／　ｒｕｇのインヒビンを含有する（インヒビンのインビトロの バイオアッセイに基づく）。

対照に比較して精製インヒビン及び１００μｌの１）ＦＦ共に有意に排卵を阻害 した（ウイルコキソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ　）の検定ではそれぞれＰ　＜　０． ０１及びＰ上記の実施例５では１羽のウサギを免疫し、精製インヒビンでさらに ２回追加免疫した。こうして得られた抗血清はインビトロのバイオアッセイでイ ンヒぎンの活性を中和した。インビボではこの抗血清が血流中のインヒビンを中 和して、血流中のＦＳＨを増加させると考えられる。ウサギの血漿ＦＳＨはウサ ギの血清中のインヒビンの抗体の抗体価に一致して上昇及び下降した。その結果 を第２表に示す。

３−６．１７．２１　６　≦０゜２５４．８７±０．７６ａ１１−１４　３　０ ．６７±０．１９５．４４±０．２４ｂ７−１０　５　２．１３±０．４５６． １５±０．４４ｃ＊−インヒビンのインビトロのバイオアッセイで１．５０のイ ンヒビンの中和に要した抗血清の量（μｌ）の逆数 ａ対Ｃ；δ対すとＣ：Ｄ＜０．０５ 実施例１０．去勢したオスのラットへの急激なインヒビンの投与による血流中Ｆ ＳＨの抑制 中の卵胞液を用いた下記の実験から分かるように、精製インヒビンの投与後４− ８時間以内に血流中ＦＳＨを抑制することが予想できる。６日前に大勢した５４ 週令のオスのラットに頴静脈を通して血流中にインヒピンを投与し、５時間後に ＦＳＨラジオイムノアッセイで血漿中のＦＳＨを測定した。牛卵胞液の投与量の 増加に相関したＦＳＨの有意の用量応答的な減少が認められた。その結果を第３ 表に示す。

対照（溶媒のみ）　５　９９．３±１２．８ａｂＦＦ＊（６２，５μｌ）　５　 ８０．８±　５，５ｂｂＦＦ（１２５μｌ）　５　６６．６±１０．５ＣｂＦＦ 　（２５０μｌ）　５　５１．９±　７．０ｄ＊−２０μｌ　／　ｄのインヒピ ンを含有（インヒビンのインビトロバイオアッセイｆ基ツくン ａ対ｂ；　ｂ対Ｃ：　Ｃ対ｄＰ０．０５実施例１１：卵胞液からのインヒビンの 精製卵胞液からのインヒビン活性は上記の精製段階Ａ。

Ｂ、Ｃを用いるｌ）Ｆ？インヒビンと同様の方法で精製できることを我々は見出 した。Ｄ及びＥ段階の後の特徴はｂＦ？インヒビンの特徴に似ている。従ってこ れよりＡからＥの精製段階は、ヒトを含む哺乳動物のインヒピンに応用できるこ とが予想できる。

ＦＳＨは卵巣及び畢丸機能の刺激に重要であるため、精製インヒビンの主要な用 途はＦＳ１′（分泌を特異的に阻害できる能力、又はインヒビンに対して免疫す ることにより内因性のインヒビンを中和する抗体を誘導しその結果Ｆ’ＳＨ濃度 を上昇させることができるように抗原として使用することにある。インヒビンの 作用や生理を研究するために性腺組織又は性腺液の粗抽出液又は部分抽出液を用 いてインビボの多くの研究が為されてきた。これらの実験においてインヒビン又 はインヒピンの抗体に帰因すると考えられる（しかし証明されてはいない）効果 には以下のようなものがある。

１、　性腺機能の阻害（モウｒガル（Ｍｏｕｄｇａｌ　）ら、１９８５年、「性 腺蛋白とペプチド及びその生物学的意義Ｊ　（Ｇｏｎａｄａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄｔｈｅｉｒ　Ｂｉ、ｏｌｏｇｉｃａｌ　 ５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｃｅ　）　（サイラム（Ｓａｉｒａｍ　）　ｍ−、ワール ドサイエンティフィックパブリッシング（Ｗｏｒｌｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、シンカポール（印刷中））。

２、　排卵速度の上昇（ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ　）ら、ジャーナル ・オプ・エン−クリノロシー（Ｊ。

Ｉ！：ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　）第１０２巻、（１９８４年）６０５頁；クミン ズ（ａｕｍｍｉｎｓ　）ら、プロシーデイングズ・オプ・オーストラリアン・ソ サエティ・オプ・リゾロダクテイプ・バイオロジー（Ｐｒｏｃ、　Ａｕ５ｔ、　 Ｓｏｃ。

Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｂｉｏｌ、　）第１５巻（１９８３年）８１頁）。

６、　青春期の開始の早期化（アルオバイデイ（Ａ１０ｂａｉｄｉ　）ら、ゾロ シーデイングズ・オブ・オーストラリアン、ソサエティ・オプ・リフ０ロダクテ イプ・バイオロジー（Ｐｒｏｃ、　Ａｕ５ｔ、　Ｓｏｃ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｂ ｉｏｌ、　）第１５巻（１９８３年）８０頁）。

インヒピン及びＦＳＨの公知の性質は、本発明の精製イ／ヒビン及びインヒビン に対する抗体の幾つかの応用の可能性を示唆している。

（１）　排卵速度の上昇：　ＦＳＨは哺乳動物の卵巣の卵子の発育を刺激するこ と（ロス（Ｒｏｓｓ　）ら。（１９８１年）、［テキストブック・オデ・エンＰ クリノロジー　Ｊ　（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｋａｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 　）、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　）　Ｈａ、５５５頁）、及びＦＳＨに よる卵巣の過度の刺激は多発排卵につながること（デＡ　（！’　／ｌ／　（Ｇ ｅｍｚｅｌｌ　）　、ヒト性腺刺激ホルモンπよる排卵の誘導（工ｎｄｕｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ｏｖｕｌａｔｉ　ｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎｇｏｎａｄｏｔｒｏ ｎｈｉｎｓ　）　、リースント・プログレス・イン・ホルモンリサーチ（Ｒｅｃ ｅｎｔＦｒｏｇ、ＨｏｒｍｏｎｅＲｅｓ、）第２１巻（１９６５年）１７９頁） は認識されている。我々はインヒビンがインビトロ及びインビボでＦＳＨを抑制 すること、及びインヒビンはインヒビンに対する中和抗体を作成するだめの免疫 原として利用できることを証明した。インヒピンの精製調製物と適当なアジュバ ントを用いて哺乳動物（例えば牛や羊）を免疫すると、免疫した動物中で抗体が 増加する。この抗体は動物自身のインヒビンの酸性を中和し、従ってＦＳＨ産生 に対する抑制効果を除去する。こうして得られるＦＳＨの上昇は卵巣中の卵胞の 発育刺激につながり排卵速度が増加する。

またインヒビンに対して免疫した動物の血清を集めることにより他の動物の受動 免疫に使用できる抗血清が得られる。この方法によりインヒビンの抗血清を注射 することにより動物自身のインヒビンが中和され、ＦＳＨが増加して排卵が刺激 される。排卵速１ｙの上昇に受動免疫及び能動免疫共に利用される。

性腺の成長のだめの能動免疫にインヒビンを利用できる可能性は、インヒビンに 対する免疫で使用したウサギの畢丸の大きさが増加したことにより示される（実 施例５）。

（１１）　卵巣及び塁丸機能の阻害：卵巣における卵胞の発育そして畢丸におけ る精子産生の刺激におけるＦＳＨの重要性が認識されていること（ロス（Ｒｏｓ ｓ　）　Ｃ）、（１９８１年）、「テキストブック・オデ・エンドクリノロシー Ｊ　（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｋｎｄｏｃｒｉｎｎｌｏｇｙ　）、ウィリアム ス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　）綱、３５５頁：パルディンとボールセン（Ｂａｒｄｉ ｎ　ａｎｄ　Ｐａｕｌｓｅｎ　）　Ｘ（１９８１年）、「テキストブック・オプ ・エンドクリノロジーＪ　（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ ｇｙ　）中の［畢丸Ｊ　（Ｔｈｅ　Ｔｅ５ｔｉｓ　）、ウィリアムス（Ｗｉｌｌ ｉａｍｓ　）編、２９６頁）は、性腺機能の抑制圧おけるインヒビンの役割の可 能性を示唆している。

インヒビンの投与は卵巣と畢丸機能の抑制圧つながり、妊娠性の破壊が起きるこ とが予想できる。このインヒビンの作用はヒト、羊及び牛の雄及び雌に利用可能 であり、他の種にも利用できる可能性がある。

（Ｉｌ＋）　妊娠性の開始の促進：青春期の開始時に起きる最初の変化の１つは ＦＳＨ濃度の増加であり、このため卵巣と畢九が刺激される（ロス（Ｒｏｓｓ　 ）　Ｇ）、（１９８１年ン、［テキストブック・オプ・エンドクリノロシーＪ　 （ＴｅＸｔｂＯｏｋ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｖ　）　。

ウィリアムス（Ｗｊ、１１ｉａｍｓ　）　＠、　３５５頁：パルディンとボール セン（Ｂａｒｄｉｎ　ａｎｄ　Ｐａｕｌｓｅｎ　）、（１９８１年〕、［テキス トブック・オプ・エンドクリノロシーＪ　（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｋｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　）中の「畢丸Ｊ　（Ｔｂｅ　Ｔｅ５ｔｉｓ　）、ウィリア ムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　）編、２９６頁）。能動免疫又は受動免疫により性的 に未熟な哺乳動物をインヒビンに対して免疫すると、付随的に卵巣と畢丸機能が 刺激されて青春期の開始が早くなる可能性がある。

家畜動物（例えば乳牛、羊及びヤギ）の−生の生殖機能は、青春期の開始年齢、 各妊娠間の間隔、高置化による卵巣機能の低下の可能性に依存する。能動免疫又 は受動免疫により青春期前の若い動物をインヒビンで免疫すると、動物自身のイ ンヒビン産生が中和されＦＳＨ濃度が増加する。このＦＳＨの増加により性腺が 刺激され普通より早く青春期が訪れる。

この方法は哺乳動物の雄又は雌の早発青春期を誘導することに利用できる。

Ｏｖ）　青春期の抑制：　ＦＳＨは青春期の開始における決定的な因子と考えら れているため、好ましくない状態（例えばヒトにおける早発青春期の開始）又は 青春期の開始を抑制する方法としてインヒビンを投与することもできる。

（ｖ）　インヒビンを測定するだめのラジオイムノアッセイ又は酵素結合免疫定 量法の開発、そしてインヒビンの精製を促進するための免疫吸着カラムを開発す ることに使用できる抗血清又はモノクローナル抗体を作成するだめの免疫原とし て、インヒピンは利用できる。

（ｖＯ前記した抗血清を用いて、インヒビンを測定するラジオイムノアッセイ系 を開発した。このラジオイムノアッセイにより、スフット（５ｃｏｔｔ　）　（ １９８０年）らの既知のインビトロのバイオアッセイでは不可能であった生体試 料（例えば血漿、血清又は尿）中のインヒビンの測定が可能になった。血漿又は 血清中のインヒビン濃度は、妊娠性の診断に用いるセル）　ＩＪ細胞や顆粒膜細 胞機能の指標となる。

←１−　多量のインヒビンの投与はＬＨの分泌を阻止することも可能である。こ の事実もまたインヒビンが排卵を抑制する能力を支持している。

本発明は前記の個々の例に限定されるものではない。

口９、’　ｆ’Ｅ　ｚ８ｏ　ｒＬＩ＋％咀旭ル　２８ｏＡへ 染色Ｃ組成 二乙Ｅｌ　４　］Ｉ［Ａ　’ＩＷ医 ５ＡＢＣＤ　Ｓ　ε ケ゛）しの長こ（ｃｚン 国際調査報告

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の特徴を有する蛋白インヒビン：（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したみ かけの分子量は５６，０００±１，０００である： （ｂ）等電点は６．９−７．３の範囲にある；（ｃ）この蛋白はコンカナバリン Ａ−セフアロースに特異的に結合する； （ｄ）この蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して還元により分離可能な、下記の特 徴を有する２個のサブユニツトより成る： （ｉ）みかけの分子量はそれぞれ４４，０００±３，０００と１４，０００±２ ，０００である、 （ｉｉ）分子量４４，０００のサブユニツトの等電点は６．０−７．０の範囲に ある、 （ｉｉｉ）２個のサブユニツトのＮ−末端アミノ酸配列は下記の如くである： 残基【配列があります】 （ｅ）この蛋白はインビトロのバイオアツセイ系で卵胞刺激ホルモンを抑制する が黄体化ホルモン、甲状腺刺激ホルモン又はプロラクチンを抑制しない；（ｆ） この蛋白は放射性ヨードで標識され得る。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の蛋白の同族体、誘導体、断片、及びサブユニツト 。
3. ３．請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛋白の免疫原性量を動物に投与するこ とを特徴とする、インヒビンに対する抗体を誘導する方法。
4. ４．請求の範囲第１項又は第２項の蛋白を免疫原として使用することを特徴とす る、インビトロ又はインビボにおいてモノクローナル抗体を産生する方法。
5. ５．請求の範囲第３項又は第４項に記載の方法により作成したインヒビンに対す る抗体を使用することを特徴とする、インヒビンの定量方法。
6. ６．請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛋白のサブユニツトのアミノ酸配列を 使用することを特徴とする、組み換えＤＮＡを用いるインヒビン遺伝子の以後の クローニング及び発現のためのオリゴヌクレオチドの作成方法。
7. ７．外来的に与えた請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛋白を使用することを 特徴とする、哺乳動物においてＦＳＨ濃度を抑制する方法。
8. ８．請求の範囲第３項又は第４項に記載の方法により作成したインヒビンに対す る抗体を哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物においてＦＳＨ濃度を 上昇させる方法。
9. ９．請求の範囲第３項、第４項又は第８項のいずれか１項に記載の外来性蛋白を 哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の雌の排卵速度を上昇させる方 法。
10. １０．請求の範囲第３項、第４項又は第８項のいずれか１項に記載の外来性蛋白 を投与することを特徴とする、哺乳動物の雄の精子形成を増加させる方法。
11. １１．請求の範囲第１項又は第２項に記載の外来性の蛋白を投与することを特徴 とする、哺乳動物の雄又は雌の繁殖力を低下させる方法。
12. １２．請求の範囲第３項、第４項又は第８項のいずれか１項に記載の方法に従い 、インヒビンで動物を免疫することを特徴とする、性的に未熟な哺乳動物の雄又 は雌の青春期の開始を早める方法。
13. １３．請求の範囲第１項又は第２項に記載の外来性の蛋白を投与することを特徴 とする、哺乳動物の雄又は雌の青春期の開始を遅らせるか又は抑制する方法。
14. １４．早発青春期の治療のための請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．インヒビンに対する抗体を誘導する方法において、請求の範囲第１項に記 載の蛋白、又は請求の範囲第２項に記載の同族体、誘導体、断片又はそれらのサ ブユニツトの免疫原性量を１回以上の投与で別々に又は一緒に動物に投与するこ とを特徴とする、上記方法。
16. １６．筋肉内注射及び／又は皮下注射により免疫原性量を与える、請求の範囲第 １５項に記載の方法。
17. １７．アジユバントと共に少なくとも１回分の免疫原性量を与える、請求の範囲 第１６項に記載の方法。
18. １８．アジユバントの基剤は油である、請求の範囲第１７項に記載の方法。
19. １９．少なくとも１回の注射分のアジユバントはマルコール（Ｍａｒｃｏｌ）５ ２とモンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８８８の混合物である、請求の範囲第 １７項に記載の方法。
20. ２０．少なくとも１回の注射分のアジユバントは完全フロインドアジユバントで ある、請求の範囲第１７項に記載の方法。
21. ２１．請求の範囲第３項、第４項、又は第１５−１９項までのいずれか１項に記 載の方法により調製されるインヒビンに対する抗体。
22. ２２．出発物質を下記の段階の操作にかけることを特徴とする、哺乳動物由来の 物質からインヒビンを単離及び精製する方法： （ａ）１回以上のゲル浸透クロマトグラフイーの段階；（ｂ）１回以上の逆相高 速液体クロマトグラフイー段階；（ｃ）１回以上の調製ポリアクリルアミドゲル 電気泳動段階； （ｄ）精製したインヒビンの電気泳動による溶出。
23. ２３．最初のゲル浸透クロマトグラフイー段階のボイドボリユーム（ｖｏｉｄ　 ｖｏｌｕｍｅ）画分を２回目のゲル浸透クロマトグラフイーにかける前にｐＨ沈 殿させることを特徴とする、請求の範囲第２２項に記載の方法。
24. ２４．酢酸を用いてｐＨ沈殿をすることを特徴とする、請求の範囲第２３項に記 載の方法。
25. ２５．ポア（孔）容積の大きいゲル浸透支持体を用いてゲル浸透クロマトグラフ イーを行う、請求の範囲第２２項に記載の方法。
26. ２６．溶出液が完全に揮発性である、請求の範囲第２２−２５項までのいずれか １項に記載の方法。
27. ２７．ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行 う、請求の範囲第２２−２６項までのいずれか１項に記載の方法。
28. ２８．粒度が５−１００μの範囲の化学結合したＮ−アルキルシリカカラム充填 剤を用いて逆相高速液体クロマトグラフイーを行う、請求の範囲第２２−２７項 までのいずれか１項に記載の方法。
29. ２９．粒度が３０−９０μの範囲である、請求の範囲第２８項に記載の方法。
30. ３０．粒度が１０−３０μの範囲である、請求の範囲第２８項に記載の方法。
31. ３１．粒度が５−１０μの範囲である、請求の範囲第２８項に記載の方法。
32. ３２．請求の範囲第２２−３１項までのいずれか１項に記載の方法において、逆 相高速液体クロマトグラフイー段階に用いられる溶出液は揮発性であり、メタノ ール、アセトニトリル及びイソプロパノールより成る群から選ばれる混和性の有 機溶媒を含有する水の濃度勾配中にパーフルオロアルカノン酸、重炭酸アンモニ ウム及び酢酸アンモニウムより成る群から選ばれるイオン性改質剤を含有するこ とを特徴とする、上記方法。
33. ３３．請求の範囲第２２−３１項までのいずれか１項に記載の方法において、逆 相高速液体クロマトグラフイー段階に用いられる溶出液は非揮発性であり、メタ ノール、アセトニトリル及びイソプロパノールより成る群から選ばれる混和性の 有機溶媒を含有する水の濃度勾配中にアルカリ金属リン酸塩及びアルカリ土類リ ン酸塩より成る群から選ばれるイオン性改質剤を含有することを特徴とする、上 記方法。
34. ３４．揮発性及び非揮発性の溶出液を用いる、請求の範囲第２２−３１項までの いずれか１項に記載の方法。
35. ３５．薬理学的に許容できる任意の希釈物と共に請求の範囲第１項又は第２項に 記載のインヒビンを含有する治療用組成物。
36. ３６．薬理学的に許容できる任意の遅延型放出性組成物と共に請求の範囲第１項 又は第２項に記載のインヒビンを含有する治療用組成物。
37. ３７．実質的に上記のインヒビンを含有する治療用又は診断用組成物。
38. ３８．薬理学的に許容できる任意の希釈物と共に、請求の範囲第３項、第４項又 は第２１項のいずれか１項に記載のインヒビンに対する抗体を含有する治療用又 は診断用組成物。
39. ３９．薬理学的に許容できる任意の放出遅延型組成物と共に、請求の範囲第３項 、第４項又は第２１項のいずれか１項に記載のインヒビンに対する抗体を含有す る治療用組成物。
40. ４０．実質的に上記のインヒビンに対する抗体を含有する治療用又は診断用組成 物。
41. ４１．動物の生体液中のインヒビン濃度を測定することを特徴とする、動物の妊 娠状態を測定する方法。
42. ４２．ＬＨ分泌を抑制するために十分に多量の請求の範囲第１項又は第２項に記 載のインヒビンを動物に投与することを特徴とする、動物の排卵を抑制する方法 。
43. ４３．請求の範囲第３項、第４項又は第２１項のいずれか１項に記載のインヒビ ンに対する抗体は、免疫学的に不活性な個体吸着物質に結合していることを特徴 とする、インヒビン精製用の免疫吸着カラムのための物質。
44. ４４．請求の範囲第３項、第４項又は第２１項のいずれか１項に記載の抗体を使 用することを特徴とする、組み換えＤＮＡ技術を用いて産生したインヒビン遺伝 子の全て又は一部を発現するクローンの単離方法。
45. ４５．請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛋白のサブユニツトのアミノ酸配列 を用いることを特徴とする、生体試料中のインヒビンｍＲＮＡの検出方法。
46. ４６．任意の公知の方法により標識される、請求の範囲第３項、第４項又は第２ １項のいずれか１項に記載のインヒビンに対する抗体。
47. ４７．請求の範囲第４６項に記載の標識抗体を用いることを特徴とする診断法。
48. ４８．任意の公知の方法により標識される請求の範囲第１項又は第２項に記載の 蛋白。
49. ４９．請求の範囲第４８項に記載の放射性標識蛋白をインヒビンに対する抗体と 反応させることを特徴とする、インヒビンのラジオイムノアツセイ。
50. ５０．請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛋白を請求の範囲第４６項に記載の 放射性標識抗体と反応させることを特徴とする、インヒビンのラジオイムノアツ セイ。
51. ５１．ポリエチレングリコール促進第２抗体沈殿法を用いることを特徴とする、 請求の範囲第４９項又は第５０項に記載のラジオイムノアツセイ。
52. ５２．任意の公知の方法により酵素に結合させた請求の範囲第１項又は第２項に 記載の蛋白を用いることを特徴とする、酵素結合免疫定量法。
53. ５３．任意の公知の方法により酵素に結合させた請求の範囲第３項、第４項又は 第２１項のいずれか１項に記載の抗体を用いることを特徴とする、酵素結合免疫 定量法。
54. ５４．請求の範囲第４９−５１項までのいずれか１項に記載のラジオイムノアツ セイ、又は請求の範囲第５２項又は第５３項に記載の酵素結合免疫定量法を用い ることを特徴とする、性腺機能の評価方法。
55. ５５．請求の範囲第４９−５１項までのいずれか１項に記載のラジオイムノアツ セイを用いることを特徴とする、生体試料中のインヒビンの定量法。
56. ５６．請求の範囲第５２項又は第５３項に記載の酵素結合免疫定量法を用いるこ とを特徴とする、生体試料中のインヒビンの定量法。
57. ５７．請求の範囲第４６項に記載のインヒビンに対する標識抗体を、組織中のイ ンヒビンのマーカーとして用いることを特徴とする、インヒビンの免疫局在化法 。
58. ５８．請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛋白を投与することを特徴とする、 腫瘍によるＦＳＨ分泌を抑制する方法。
59. ５９．請求の範囲第３項、第４項、第２１項、第３８項又は第３９項のいずれか １項に記載の抗体を投与することを特徴とする、腫瘍によるインヒビン分泌を抑 制する方法。
60. ６０．請求の範囲第３項又は第４項に記載の方法により外来性の蛋白を投与する ことを特徴とする、哺乳動物中のＦＳＨ濃度を上昇させる方法。