DE2646223A1

DE2646223A1 - Neue verbesserte organische verbindungen

Info

Publication number: DE2646223A1
Application number: DE19762646223
Authority: DE
Inventors: Vernon Cecil Prof Stevens
Original assignee: Ohio State University
Current assignee: Ohio State University
Priority date: 1975-10-14
Filing date: 1976-10-13
Publication date: 1977-04-28
Also published as: GB1567764A; FR2327797B2; AU513558B2; HK10883A; SG63582G; IE44541B1; ZA766143B; JPS5251017A; BE847243R; NZ182272A; AU1858476A; FR2327797A2; IE44541L; DE2646223C2; MY8500808A; NL7611212A

Description

Neue verbesserte organische Verbindungen

Unsere frühere Anmeldung P 24 21 9 43.0 beschreibt u.a. die chemische Modifizierung von natürlichen endogenen Polypeptiden, wobei modifizierte Polypeptide erhalten werden, die als Antigene den normalen Fortpflanzungsprozess durch die Bildung von Antikörpern beeinflussen. Diese Antikörper neutralisieren nicht nur die als Antigene wirksamen modifizierten Polypeptide, sondern auch deren unmodifizierte endogenen Analoga und stellen dadurch ein Mittel für die immunogene Empfängnisverhütung dar.Die modifizierten Polypeptide werden aus natürlichen endogenen Polypeptiden der gleichen oder einer immunologisch äquivalenten Spezies hergestellt. In Praxis entstammen die modifizierten Polypeptide der betroffenen oder einer nahe verwandten Spezies.

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Insbesondere beschreibt unsere frühere Anmeldung die chemische Modifizierung von proteinartigen Fortpflanzungshormonen und deren Fragmenten, wobei Antigene erhalten werden, die zur immunologischen Empfängnisverhütung verwendet werden können. Die Fragmente der Proteinhormone müssen gross genug und genügend unterscheidungsfähig hinsichtlich ihres chemischen und physikalischen Charakters sein, damit sie als spezifischer Teil des gesamten Proteins erkannt werden können und sie müssen die notwendige chemische Natur, d.i. die Aminosäure-Struktur, besitzen, die es gestattet, die Fragmente in der gewünschten Weise chemisch zu modifizieren.

Die Bezeichnung "proteinartige Fortpflanzungshormone", die hier verwendet wird, umfasst Hormone, die wesent- '"_ lieh sind für den normalen Ablauf des Fortpflanzungsprozesses.

Die Bezeichnung "Fragmente" bezieht sich in der vorliegenden Erfindung auf proteinartige Fortpflanzungshormone, die sowohl Aminosäureketten, die einen Teil der Struktur der Hormone bilden, als auch Aminosäureketten, die - obzwar nicht identisch mit den Ketten, die die Struktur der Hormone bilden - ihnen jedoch genügend ähnlich sind, um immunologisch äquivalent zu sein, d.h. die im wesentlichen die gleichen Antikörper nach Verabreichung bilden umfassen.

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-η-

Unsere frühere Anmeldung beschreibt spezifisch die chemische Modifizierung von proteinartigen Fortpflanzungshormonen, wie Follikel stimulierenden Hormonen (FSH), luteinisierenden Hormonen (LH), menschlichem planzentalem Lactogen (HPL), menschlichem Prolactin und menschlichem ehorion-Gonadotropin (HCG) und deren Fragmenten.

Spez-ifische Fragmente, die entsprechend unserer früheren Anmeldung modifiziert werden können, umfassen die ß-Untereinheit von FSH und spezifische Einzelfragmente des natürlichen HPL oder menschlichen Prolactins, wobei diese Fragmente nur eine kleine Aehnlichkeit mit analogen Teilen anderer Proteine besitzen müssen. Bevorzugte Fragmente umfassen die ß-Untereinheit von HCG, welche entweder die Struktur I oder II, wie nachfolgend beschrieben, besitzen (* zeigt den Ort der Carbohydratgruppen an):

10

Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn-Ala-Thr-

20

Leu-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Gys-Ile-Thr-Yal-Asn-

40

Thr-Thr-Ile-Cys-Ala-Gly-Try-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val-Leu-

50 '

Gln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Gln-Val-Val-Cys-Asn-Try-Arg-

70

Asp-Val-Arg-Phe-Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro-Gly-Cys-Pro-Arg-

80
Gly-Val-Asn-Pro-Val-Val-Ser-Tyr-Ala-Val-Ala-Leu-Ser-Cys-

90 100

Gln-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-Arg-Ser-Thr-Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-

110
Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Äsp-Pro-Arg-Phe-Gln-

120 * * 130

Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-

I⁴⁰ Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln

(Struktur I)

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-Jr- 118-3329/A

10 *
Ser-Lys-Gln-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn-Ala-

20

Thr-Leu-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys-Ile-Thr-

29 * " 40

Val-Asn-Thr-Thr-Ile-Cys-Ala-Gly-Tyr-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-

50
Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Gin-Leu-VaI-

60 70

Cys-Asn-Tyr-Arg-Asp-Val-Arg-Phe-Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro-

80
Gly-Cys-Pro-Arg-Gly-Val-Asn-Pro-Val-Val-Ser-Tyr-Ala-Val-

90 Ala-Leu-Ser-Cys-Gln-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-(Arg)-Ser-Thr-

100 HO

Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-

* ¹²⁰

Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-

* ¹³⁰ * ¹⁴°

Leu~Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Asx-Thr~Pro-Ile-

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Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro

(Struktur II)

Wie in unserer früheren Anmeldung beschrieben ist es für
die Spezifität der Antikörper-Wirkung v/ünschenswert, dass Polypeptide modifiziert werden, wobei Molekularstrukturen erhalten werden, die völlig oder substanziell verschieden sind von denen anderer Proteinhormone. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass die ß-Untereinheit von HCG
eine Kette oder Ketten von Aminosäuren enthält, die
stark von denen von LH verschieden sind, und solche Ketten erfindungsgemäss ebenfalls modifiziert werden können.
Diese Ketten enthalten 20 bis 30 oder 30 bis 39 Aminosäurepeptide bestehend aus den C-Terminalresten der
ß-üntereinheit von HCG. Insbesondere enthalten die Ketten Strukturen, die in den nachfolgenden Formeln III und IV

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(C-terminale Teile der Struktur I) und V und VI (C-terminale Teile der Struktur II) beschrieben sind:

Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro

Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-

Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln

(Struktur III)

Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro

Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln.

(Struktur IV)

Thr-Cys-Asp~Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-

Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly

Pro-Pro-Asx-Thr-Pro~Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu~Pro.

(Struktur V)

Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu

* *
Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro

Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro.

(Struktur VI)

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Solche Strukturen können mit Hilfe von synthetischen Verfahren· oder durch enzymatischen Abbau des entsprechen Polypeptids [Carlson et al., J. Biological Chem., 284 (19), 6810 (1973)] erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst aber auch
weitere Polypeptidketten, die chemisch modifiziert werden können, um Antigene, die bei der immunologischen Fruchtbarkeitshemmung verwendet werden können, zu bilden.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die
chemische Modifizierung von Polypeptid-Ketten der nachfolgenden Formeln VII, VIII, IX und X. Infolge ihrer
substanziellen Aehnlichkeit mit der chemischen Struktur
und Konfiguration von HCG und der immunologischen Wirkung die sie nach der Modifizierung entfalten, können diese
Fragmente als Fragmente von HCG angesehen werden.

Phe-Gln~Asp-Ser-£er-Ser-Ser~Lys-Ala-Pro-Pro-Pro~Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser--Asp-Thr~Pro-Ile~

Leu-Pro-Gln

(Struktur VII)

Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Gly

(Struktur VIII)

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Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro

(Struktur IX)

Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-

Leu-Pro

(Struktur X)

Diese Strukturen können auf an sich bekannte Weise hergestellt v/erden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls (i)a) ein Antigen zur immunologischen Kontrolle der Frucht barkeit, dafi cms einem chemisch modifizierten Polypeptid besteht, wobei das unmodifizierte Polypeptid die Strukturen VII, VIII, IX oder X wie oben angegeben, besitzt.

Wie bereits in unserer früheren Anmeldung beschrieben, werden die_Polypeptide in solchem Ausmass chemisch modifiziert, dass die erhaltenen Antigene die Bildung von Anti körpern hervorzurufen, die nicht nur die Antigene selbst, sondern zumindest einige ihrer natürlichen Gegenstücke, beispielsweise HCG, neutralisieren. Diese Modifizierung hängt jedoch von bestimmten Faktoren wie der Nrtur

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der verwendeten Polypeptide ab. Wenn eine viel zu geringe Modifizierung erfolgt, kann der Körper das modifizierte Polypeptid als einen fremden Eindringling nicht erkennen und wird deshalb dagegen auch keine Antikörper bilden. Falls andererseits, eine zu starke Modifizierung erfolgt, wird der Körper Antikörper bilden, die gegen das injizierte Antigen wirksam sind, die jedoch nicht das natürliche endogene proteinartige Gegenstück,, d.i. HCG, neutralisieren.

Im allgemeinen umfasst die chemische Modifizierung die Bindung von fremden Modifizierungsgruppen an die betreffenden Polypeptide. Die Zahl der fremden modifizierenden Gruppen, die gebunden werden sollen, hängt zwar von den Umständen ab} es ist jedoch bevorzugt, 1 bis 40, zweckmässigerweise 2 bis 40, insbesondere 5 bis 30, beispielsweise 10 bis 26, modifizierende Gruppen für jedes Molekül des Polypeptids zu verwenden. Die vorgegebenen Modifizierungsgruppen werden an bestimmten Stellen im Peptidmolekül gebunden, so dass die maximal mögliche Zahl der gegebenen Modifizierungsgruppen entsprechend ausgewählt werden kann. Es ist jedoch auch möglich, dass verschiedene Modifizierungsgruppen aneinander gebunden werden, und das Reaktionsprodukt danach an eine einzige Aminogruppe gebunden wird; für die vorliegende Erfindung wird eine solche Substitution jedoch als eine Substitution durch eine einzige Modifizierungsgruppe angesehen.

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Die chemische Modifizierung kann jedoch andererseits die Bindung von 2 und mehr Polypeptidmolekülen an eine Modifizierungsgruppe umfassen.

Falls in der vorliegenden Anmeldung von der Bindung von modifizierenden Gruppen an Polypeptide (oder vice versa) gesprochen wird, so kann die Bindung direkt oder über Verbindungsgruppen erfolgen. Das Polypeptid oder das Modifizierungsmittel können beispielsweise zweckmässigerweise mit Hilfe von Modifizierungsgruppen für die Konjugation aktiviert werden.

Die Modifizierungsgruppen können v;ie angegeben, den Umständen entsprechend chemisch verschieden sein. Wie in unserer vorhergehenden Anmeldung ausgeführt, umfassen geeignete Modifizierungsgruppen auch die Diazogruppen. Diese können zweckmässigerweise durch Umsetzung mit der geeigneten Zahl von Molen der Diazosulfani!säure eingeführt werden. Die Einführung von Diazogruppen in Proteine ist eine bekannte Methode und kann beispielsweise so durchgeführt v/erden wie von

Cinader et al., J. Am. Chem. Soc. 7j5, 746 (1955), Phillips et al., J. Biol. Chem. 24Λ, 575 (1969), Tabachnick et al., J. Biol. Chem. 234(7), 1726 (1959) oder Crampton et al., Proc. Soc. Ex. Biol. & Med. _8£, 448 (1952) beschrieben. Im allgemeinen werden die Methoden von Cinader et al. und Phillips et al. bevorzugt.

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Zusätzliche Modifizierungsgruppen umfassen diejenigen, die von Dinitrophenol, Trinitrophenole S-Acetomercaptobernsteinsäureanhydrid_f Polytyrosin oder Polyalanin (in sowohl geraden als auch verzweigten Ketten), bioabbaubarem Polydextran oder - weniger bevorzugt natürlichen Proteinen, wie Thyroglobulin, abstammen. Im .allgemeinen werden synthetische Modifizierungsgruppen gegenüber natürlichen Modifizierungsgruppen bevorzugt.

Die obigen Verfahren als auch viele andere geeignete Hapten-Kupplungsverfahren sind in der Proteinchemie gut bekannt.Die nachfolgenden Literaturstellen können beispielsweise im Zusammenhang mit diesen erwähnt werden:

1. Klotz et al., Arch. Biochem. & Biophys. 9J5, 605-612 (1966,

2. Khorana, Chenu Rev/ 53, 145 (1953),

3. SeIa et al., Biochem. J. 85^, 223 (1962),

4. Eisen et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 4583 (1953),

5. Certano et al.. Fed. Proc. (ABSTR.) 25, 729 (1966),

6. Sokolowski et al., J. Am. Chem. Soc. _86, 1212 (1964),

7. Goodfriend et al., Science 144, 1344 (1964),

8. SeIa et al., J. Am. Chem. S.oc. 7j5/ 746 (1955),

9. Bahl, J. Biol. Chern. 244, 575 (1969).

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Wie in unserer vorhergehenden Anmeldung beschrieben, kann die chemische Modifizierung alternativ oder zusätzlich aus der Entfernung von Gruppen aus den Polypeptiden bestehen. Falls deshalb beispielsweise bestimmte natürliche Proteine Kohlenwasserstoffgruppen besitzen, so können diese in üblicher Weise, beispielsweise unter Verwendung von N-Acetylneuraminidase oder N-Acetylglucosidase, d.i. Substanzen, die zum Entfernen von spezifischen Kohlenwasserstoffgruppen geeignet sind, entfernt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von zusätzlichen Modifizierungsgruppen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung (i)b) ein Antigen zur immunologischen Kontrolle der Fruchtbarkeit, das aus einem chemisch modifizierten Polypeptid besteht, wobei das unmodifizierte Polypeptid ein proteinartiges Fortpflanzungshormon oder ein Fragment hiervon ist, und die chemische Modifizierung aus der Bindung einer oder mehrerer Modifizierungsgruppen, beispielsweise polymerisierteh Zucker, Serumproteine, Keyhole-limpet-hemocyanin, Marin-Gastropod-Mollusken, Viren oder vom Rirrd stammendem Gamma-Globulin an solche unmodifizierte Polypeptide oder der Bindung von zwei oder mehr unmodifizierten Polypeptid-Molekülen an solche Modifizierungsgruppen besteht.

Geeignete polymerisierte Zucker zur Modifizierung der Polypeptide umfassen Copolymere von Saccharose mit Epichlorhydrin, wie Ficoll 70 oder Ficoll 400 [Pharmacia

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Fine Chemicals, Pharmacia Laboratories Inc., 800 Centenial Avenue, Poscataway, N.J. 08854] oder eine Polyglucose, wie Dextran T70 [mikrobiologisch synthetisiert durch die Einwirkung von Leuconostoc Mesenteroides (einem Pilzstamm in NRRL B-512) oder Saccharose. Glucan enthält ct-1,6-glucosidische Bindungen. Geeignete Serumproteine umfassen homologes Serumalbumin oder vom Rind stammendes Serumalbumin und geeignete Viren sind Influenza-Viren (Typen A> B oder C) oder Poliomyelitis-Viren in lebendem oder getötetem Zustand (Typen 1, 2 oder 3).

Jedes der proteinartigen Fortpflansungshormone oder deren Fragmente können mit Hilfe dieser zusätzlichen Modifizierungsgruppen entsprechend der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass eine solche Modifizierung die Bindung der Modifizierungsgruppen an Polypeptide über Verbindungsgruppen umfasst, und dass dies erfolgen kann durch Reaktion des Polypeptide, des Modifizierungsmittels und des Verbindungsmittels (Aktivators), gleichgültig in welcher Reihenfolge mit oder ohne Schutz und nachfolgende Abspaltung der Schutzgruppen einer oder mehrerer reaktiver Gruppen im Polypeptid oder im Modifizierungsmittel. Allgemein gesehen kann solch eine Modifizierung in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielsweise wie in der obigen Literatur beschrieben.

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Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen zur immunologischen Kontrolle der Fruchtbarkeit und ist dadurch gekennzeichnet, dass man Polypeptide, die proteinartige Fortpflanzungshormone oder deren Fragmente sind, modifiziert durch

a) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, abstammen, an unraodifizierte Polypeptide durch Aktivierung des Modifizierungsmittels bzw. des PoIypeptids, das modifiziert werden soll, durch Umsetzung mit Toluol-diisocyanat und Umsetzung des erhaltenen aktivierten Produktes mit dem Polypeptid, das modifiziert werden soll bzw. dem Modifizierungsmittel, oder

b) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von " Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, abstammen oder polymerisierte Zucker sind, an unmodifizierte Polypeptide durch Konjugation des unmodifizierten Polypeptide mit dem Modifizierungsmittel, wobei ein wasserlösliches Carbodiimid als Aktivierungs-.mittel verwendet wird, oder

c) Bindung von Modifizierungsgrüppen, die durch Umsetzung von Modifizierungsmitteln mit freien Aminogruppen mit Glutarsäuredialdehyd erhalten werden,

an unmodifizierte Polypeptide durch deren Umsetzung mit dem zu modifizierenden Polypeptid in Gegenwart von Alkalimetallborhydrid, oder

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d) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Umsetzung der polymerisierten Zucker mit einem Cyanursäure-halogenid und Reaktion des erhaltenen Dihalotriazinyl-Adduktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid, oder

e) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Behandlung der Zucker mit einem Alkalimetallperjodat und Reaktion des erhaltenen Produktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid.

Das im Abschnitt a) beschriebene Verfahren kann verwendet werden zur Modifikation mit Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, wie natürliche Proteine, beispielsweise Keyhole-limpet-hemocyanin, Serumproteine, beispielsweise homologes Serumalbumin oder von Rindern stammendes Serumalbumin, Polytyrosin oder Polyalanin, von Rindern stammendes Gamma-Globulin oder Thyroglobulin, und es kann beispielsweise so durchgeführt werden, wie dies von Singer und Schick in J. Biophys. Biochem. Cytology 9_, 519 (1961) , beschrieben wird. Insbesondere wird das Modifizierungsmittel zweckmässigerweise in einer Pufferlösung, beispielsweise einem Phosphatpuffer in Natriumchloridlösung bei einem pH-Wert von beispielsweise 6-8 aufgenommen und die Lösung anschliessend mit Toluol-diisocyanat (TDIC) versetzt. Das Toluol-diisocyanat wird zweckmässigerweise verdünnt 1:10 bis 40 in Dioxan zugesetzt

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und die Menge des verwendeten Toluol-diisocyanats kann zweckmässigerweise von 0,075 bis 1000 Mol-Aequivalente betragen. Die Umsetzung kann beispielsweise bei Temperaturen von -5 bis +10° C, vorzugsweise von 0 bis 4° C, durchgeführt werden, und die Reaktionsdauer kann beispielsweise von 1/2 bis 2 Stunden betragen. Ein Ueberschuss von Toluol-diisocyanat wird danach durch Zentrifugierung entfernt, der Niederschlag mit dem obiaen Phosphatpuffer gewaschen und die überstehenden Anteile vereinigt. Das aktivierte Modifizierungsmittel kann dann zweckmässigerweise zu einer Lösung des zu modifizierenden Polypeptids im gleichen Phosphatpuffer (5 bis 30 mg/ml) zugefügt v/erden, wobei die Mengen des Modifizierungsmittels und des Polypeptids sich in dem Molverhältnis befinden sollen, das im gebildeten modifizierten Polypeptid gewünscht wird. Die in den vereinigten Lösungen befindlichen Substanzen werden zweckmässigerweise bei 30-50° C, zweckmässigerweise 35-40° C, während vorzugsweise 3-6 Stunden miteinander zur Reaktion gebracht. Die Umsetzung kann jedoch auch so durchgeführt werden, dass die erste Stufe aus der Zugabe der Toluol-diisocyanat-Lösung zum gepufferten Polypeptid besteht und die Zugabe des gepufferten Modifizierungsmittels zum aktivierten Polypeptid sich anschliesst, wobei die Bedingungen der ersten und der zweiten Stufe oben beschrieben werden.

Die Modifizierungsmittel, die im Verfahren b) verwendet werden, das im allgemeinen von Moore und Koshland in J. Biol. ehem.. 242, 2447 (1967), beschrieben wird, umfassen natürliche Proteine, wie Keyhole-limpet-hemocyanin, Serumproteine, wie homologes oder vom Rind

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stammendes Serumalbumin, polymerisierte Zucker, wie Ficoll (70 oder 40) ,oder Dextrane (Dextran T70), und Polyalanin oder Polytyrosin. Die zu modifizierenden Polypeptide werden zweckmässigerweise anfänglich durch Acetylierung ihrer Aminogruppen geschützt und anschliessend mit dem Modifizierungsmittel konjugiert, vorzugsweise in Gegenwart von Guanidin, beispielsweise Guanidinhydrochlorid, und in Gegenwart von vorzugsweise 1-Aethy1-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid als dem wasserlöslichen Carbodiimid-Aktivierungsmittel. Falls als Modifizierungsmittel polymerisierter Zucker, wie Ficoll, verwendet wird, ist es zweckmässig, diesen zuerst mit Aethylendiamin zu behandeln, um das anschliessende Kuppeln effektiver zu gestalten. Das Kuppeln erfolgt zweckmässigerweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise einer Salzlösung und Dioxan, zweckmässigerweise bei Raumtemperatur und einem pH von 9 bis 12, vorzugsweise 10 bis 11. Die Reaktionszeit kann beispielsweise von 1/4 bis Stunden betragen. Die nachfolgende Konjugation des geschützten Polypeptides mit dem Modifizierungemittel kann zweckmässigerweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise Glycin-methylester bei einem pH von beispielsweise 4 bis 5, vorzugsweise 4,5 bis 4,8, durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur ist zweckmässigerweise die Raumtemperatur, und die Reaktionsdauer kann beispielsweise von 2 bis 8 Stunden, insbesondere 5 Stunden, betragen.

Das Verfahren c), das unter Verwendung von natürlichen proteinartigen Modifizierungsmitteln, wie beispielsweise Serumproteinen, insbesondere homologem Serumälbumin, durchgeführt

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wird, beruht auf der Theorie von Richards und Knowles [J. Mol. BiOl.' 37, 231 (1968)], wonach auf dem Markt befindliches Glutarsäure-dialdehyd kein freies Glutarsäuredialdehyd enthält, sondern eher aus einem komplexen Gemisch von Polymeren, das reich ist an α,β-ungesättigten Aldehyden, besteht. Nach Reaktion mit natürlichen Proteinmodifizierungsmitteln bilden diese Polymere eine stabile Bindung über die freien Aminogruppen, wobei die Aldehydgruppen freigesetzt werden. Das Zwischenprodukt kann dann mit dem unmodifizierten PoIypeptid in Gegenwart eines Alkalimetall-borhydrids, beispielsweise Natrium-borhydrid, umgesetzt werden. Die Zwischenverbindung wird zweckmässigerweise bei einem pH von 7 bis 10, vorzugsweise 8 bis 9, und bei Raumtemperatur gebildet. Die nachfolgende Konjugation wird zweckmässigerweise bei Raumtemperatur während einer 1/4 bis 2 Stunden durchgeführt.

Das Verfahren d), das unter Verwendung von Modifizierungsmitteln, bestehend aus polymerisierten Zuckern, wie .Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymeren, beispielsweise Ficolls, insbesondere Ficoli 70 oder 400,. oder PoIyglucosen, wie beispielsweise Dextran T70, durchgeführt wird, erfolgt durch Umsetzung des Modifizierungsmittels mit einem Cyanursäurehalogenid, beispielsweise Cyanursäurechlorid, beispielsweise bei einer Temperatur von 0 bis 20° C in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, während 1/2 bis 4 Stunden. Das erhaltene Dihalotriazinyl-Zwischen-

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produkt wird bis zur Halogenidion-Freiheit dialysiert,

danach lyophilisiert, und anschliessend mit dem PoIy-

peptid bei einem pH-Wert von 8 bis 11, vorzugsweise

9 bis 10, bei Raumtemperatur während 1/2 bis 12 Stunden

umgesetzt.

Das im Abschnitt e) beschriebene Verfahren kann ebenfalls für polymerisierte Zuckermodifizierungsmittel, beispielsweise Copolymere von Saccharose mit Epichlorhydrin., insbesondere Ficolls, wie Ficoll 70 oder 400, oder Polyglucosen, wie Dextran T70, angewendet v/erden. Die Umsetzung erfolgt zweckmässigerweise durch Behandlung des Modifizierungsmittels mit einem Alkalinetallperjodat, wie Natriumperjodat, bei einer Temperatur von 30 bis 60° C und einem pH-Wert von 3 bis 6. Das erhaltene Zwischenprodukt wird mit dem Polypeptid bei einem pH von 7 bis 11, vorzugsweise von 8 bis 10, bei Temperaturen von 15 bis 80° C, vorzugsweise von 20 bis 60° C, umgesetzt. Die Reaktionszeit kann beispielsweise von 1/2 bis 4 Stunden betragen. Das Reaktionsprodukt wird anschliessend zweckmässigerweise mit einem Alkalimetallborhydrid, beispielsweise Natriumborhydrid, reduziert.

Die erhaltenen modifizierten Polypeptide können auf an sich bekannte Weise isoliert und gereinigt werden, so wie beispielsweise durch Gelfiltration, Kolonnenchromatographie oder Dialyse und Lyophilisation, Vor der

Konjugation (Modifikation) können mit Picogrammen I markierte Polypeptide als Tracer dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Die Menge des an die modifi-

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zierenden Gruppen konjugierten Polypeptides (Molverhältnis) kann durch die Menge der Radioaktivität festgestellt werden.

Die oben unter a) bis e) beschriebenen Methoden können zur Modifizierung jedes proteinartigen Fortpflanungshormons oder dessen Fragmenten, insbesondere den oben beschriebenen angewendet werden, wobei Antigene zur Verwendung bei der immunologischen Fruchtbarkeitshemmung erhalten werden.

Wie oben beschrieben, kann die Herstellung der zur Verwendung in der Fruchtbarkeitskontrolle angewendeten Antigene entsprechend unserer vorhergehenden Anmeldung und der vorliegenden Erfindung durchgeführt v/erden durch Bindung einer oder mehrerer modifizierenden Gruppen an ausgewählte Polypeptide oder durch Bindung zweier oder mehrerer Polypeptid-Moleküle an die modifizierenden Gruppen.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Antigenen zur immunologischen Kontrolle der Fruchtbarkeit durch Verwendung von chemisch modifizierten Polypeptiden, wobei das unmodifizierte Polypeptid ein proteinartiges Fortpflanzungshormon oder Fragmente hiervon sind, und die chemische Modifizierung

(ii) die Polymerisation des unmodifizierten Polypeptids über ein geeignetes bifunktionelles Agens, oder

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(iii) die Dimerisierung des unmodifizierten Polypeptids über eine Schwefel-Schwefelbrücke erhalten aus der Thiolgruppe eines Cysteinrestes, der im unmodifizierten Polypeptid anwesend ist,oder zu dem unmodifizierten Polypeptid, sofern dieses keine Cysteinreste enthält, zugegeben wird,

umfasst.

Die Antigene des Gegenstandes (ii) können durch Polymerisation des unmodifizierten Polypeptids mit einem geeigneten bifunktionellen Reagens, beispielsweise einem bifunktionellen Imidoester, wie Dirnethyladipimidat, Dimethylsuberimidat oder Diäthylmalonimidat, in an sich bekannter Weise [beispielsweise Hartmann und WoId, Biochem. £, 2439 (1967)] erhalten werden. Die Polymerisation kann bei Raumtemperatur in einem wässerigen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 9 bis 12, vorzugsweise 10 bis 12, zweckmässigerweise während 1/4 bis 2 Stunden durchgeführt v/erden.

Die Antigene des Gegenstandes (iii) können erhalten werden durch Oxidation der Thiolgruppe eines Cysteinres.tes, beispielsweise unter Verwendung von Jodbenzoesäure in bekannter Weise, beispielsweise bei Raumtemperatur während 10 bis 40 Minuten. Falls die zu modifizierenden Polypeptide keine Cysteingruppen enthalten, müssen diese zunächst in das Polypeptid auf an sich bekannte Weise eingebaut v/erden.

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Die chemische Modifikation der Gegenstände (ii) und (iii) kann bei jedem proteinartigen Fortpflanzungshormon oder seinen Fragmenten, insbesondere denen, die oben beschrieben sind, durchgeführt und die so erhaltenen modifizierten Polypeptide bzw. deren Fragmente als Antigene in der immunologischen Fruchtbarkeitshemmung angewendet werden.

Die Antigene der vorliegenden Erfindung werden zweckmässigerweise mit pharmazeutisch verträglichen flüssigen Trägern vermischt und parenteral verabreicht. Die zu verabreichenden Dosen können abhängig von vielen Faktoren variieren, insbesondere verwendet man jedoch Einheitsdosen von 0,1 bis 50 mg, die zweckmässigerweise 1 bis 5 mal in Intervallen von 1 bis 3 Wochen verabreicht v/erden.

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Beispiel 1; Struktur X - Hemocyanin von" Keyhole-limpet

Es wird eine Hemocyanin-Lösung von Keyhole-limpet (KLH) (7 mg/ml) in einem 0,05 M Natriumphosphat-Puffer in 0,2 molarer wässeriger Natriumchlorid-Lösung bei einem pH-Wert von 7,5 bereitet. Unlösliche Teile werden durch Zentrifugieren entfernt. Zu 1 ml dieser Lösung fügt man 20 ul Toluoldiisocyanat, das auf 1/30 mit Dioxan verdünnt wurde, wobei dieser Anteil das Aequivalent der Mole der Lysyl-Reste im KLH-Molekül darstellt. Nach 40-minütigem Stehen bei 0° C wird die durch Toluol-diisocyanat aktivierte KLH-Lösung mit 0,5 mg eines synthetischen ß~HCG-Peptides, das die obige Struktur X besitzt und vorgängig in 25 μΐ eines 0,5 molaren Natriumsulfat-Puffers in einer 0_f2 molaren wässerigen Natriumchlorid-Lösung bei pH 7,5 gelöst wurde, versetzt. Das Gemisch wird bei 37° C während 4 Stunden inkubiort. Das erhaltene Produkt wird durch GeIfiltration gereinigt.

Struktur III ~ vom Rind stammendes Gamma-Globulin

Zu einer Lösung von 0,23 ml vom Rind stammendem Gamma-Globulin (10 mg/ml) in 0,05 M Phosphat-Puffer und einer normalen Kochsalz-Lösung bei pH 7,5, die in einem Eiswasserbad gekühlt und stark gerührt wird, werden 50 ul

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einer 1/10 Lösung von Toluol-diisocyanat in Dioxan zugefügt. Nach 40 Minuten wird der Ueberschuss von Toluoldiisocyanat durch Zentrifugieren (0° C, 10 Minuten, 10.000 g) entfernt, und der Niederschlag 2 mal mit jeweils 0,1 ml einer normalen Kochsalz-Lösung gewaschen. Die kombinierten Ueberstände v/erden zu 7,7 g des Peptids der Struktur III, das in 0,8 ml einer normalen Kochsalz-Lösung bei pH 7,5 gelöst ist, zugefügt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 10 Minuten gerührt und danach während 4 Stunden bei 37° C inkubiert. Das konjugierte Reaktionsprodukt wird durch Dialyse gereinigt.

Beispiel 3 : ^trjak^ja^V^^jro^^Rind^ j^,smmej^e_s^^e^umalbumj.n

Vom Rind stammendes Serumalbumin (10 mg/ml), das in 0,25 ml einer normalen Kochsalz-Lösung gelöst ist, wird mit 50 ul einer 1:10 Toluol-diisocyanat-Lösung in Dioxan behandelt und anschliessend mit 7,5 mg eines synthetischen ß-HCG-Peptides der Struktur VI, das in 0,8 ml einer normalen Kochsalz-Lösung gelöst ist (pH 7,5), wie im Beispiel 2 beschrieben, konjugiert, wobei das im Titel genante Produkt erhalten wird.

Beispiel 4: Struktur VI - Poly(D,L-Lys-Ala)

Zu 0,6 ml der Lösung eines ß-HCG-Peptids der Struktur VI (10 mg/ml) in Phosphat gepufferter wässeriger Kochsalz-Lösung bei pH 7,5, die einem Eiswasserbad gekühlt und stark gerührt wird, werden 30 μΐ einer 1:10 Toluol-diisocyanat-Lösung

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- 2,4 - 118-3329/A

in Dioxan zugesetzt. Nach 40 Minuten wird der Ueberschuss von Toluol-diisocyanat durch Zentrifugieren (10.000 g, 0° C, 10 Minuten) entfernt, und der Niederschlag 2 mal mit jeweils 0,1 ml wässeriger Kochsalz-Lösung gewaschen. Das Gemisch wird während 4 Stunden bei 37° C inkubiert. Das Reaktionsprodukt wird anschliessend dialysiert und lyophilisiert. .

Struktur III - Keyhole-limpet-hemocyanin

2 mg der Verbindung der Struktur III, die in Picogramm-

125
Anteilen I enthält, und 1,6 mg KLH werden in 1 ml

von 1 M Glycirimethy!ester in 5 M Guanidinhydrochlorid gelöst. 19,1,-mg Ae thy I-dime thy I aminopropylcarbodiimid werden zu dieser Lösung zugefügt. Der pH-Wert des Gemisches wird mit Hilfe von IN Chlorwasserstoffsäure während 5 Stunden bei Raumtempertur auf pH 4,75 eingestellt. Das KLH-Peptid-Konjugat wird an einer Biogel p-60 2,2 χ 28 cm Kolonne, die mit 0,2 molarer Natriumchlorid-Lösung äquilibriert wurde, gereinigt.

Ficoll 70 - Aethylendiamin

1 g Ficoll 70 wird in 1 ml von jeweils einer normalen Kochsalz-Lösung und einer 2 M Aethylendiamin-Lösung, die auf pH 10 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt wurden, gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur in einem Wasserbad gehalten und mit Hilfe eines Magnetrührers gerührt. Danach werden 4 g Bromcyan, die in 8 ml Dioxan

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gelöst sind, zu der Ficoll-70-Lösung zugefügt. Der pH-Wert des Gemisches wird auf 10 bis 10,5 während 8 Minuten durch Zugabe von Tropfen einer 2N wässerigen Natriumhydroxid-Lösung gehalten. Danach werden weitere 2 ml einer 2 M Aethylendiamin-Lösung (pH 10) zugesetzt und das Rühren bei Raumtemperatur während 3 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird an einer Biogel p-60 Kolonne gereinigt. Das erhaltene Material kann verwendet werden zum Kuppeln von Ficoll 70 an Polypeptide unter Verwendung des Verfahrens b).

Zu einer 20 mg/ml Lösung eines homologen Serumalfotimins in 0,1 M Borat-Puffer bei pH 8,5 wird ein 1000 M % Ueberschuss einer 25 %-igen wässerigen Lösung von Glutarsäure-dialdehyd bei Raumtemperatur zugefügt. Dar Ueberschuss von Dialdehyd wird durch Gelfiltration in Wasser unter Verwendung von Biogel p-2 entfernt. Das erhaltene Material wird lyophilisiert, und das getrocknete Produkt in einem 0,1 M Borat-Puffer bei pH 8,5 (20 mg/ml) wieder gelöst und danach mit der gewünschten Menge eines Polypeptids der Struktur IX (20 mg/ml) im gleichen Puffer bei Raumtemperatur vermischt. 20 Minuten später wird Natriumborhydrid in einem 250 Mol % ueberschuss, bezogen auf Polypeptid IX, zugefügt. Die Reaktion ist nach 1 Stunde beendet. Das konjugierte Produkt wird durch Gelfiltration an einer Biogel p-60 Kolonne gereinigt, salzfrei dialysiert und lyophilisiert.

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Beispiel 7: Struktur X -' Ficoll' 70

1 g Ficoll 70_r 500 mg Natriumbicarbonat, 3 g Cyanursäurechlorid, 20 ml Wasser und 80 ml Dimethylformamid werden während 2 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 16° C gerührt. Das erhaltene Produkt wird gegen destilliertes Wasser bis zur Chlorfreiheit dialysiert und an-

schliessend lyophilisiert. 2 mg eines Polypeptids der

12^ς Struktur X, das geringste Anteile von I ~ enthält wird mit 1 mg des vorgängig erhaltenen Produktes in 0,25 ml eines 0,2 M Natriumborat-Puffers bei pH 9,5 während 1 Stunde bei 20° C inkubiert und danach das Produkt nach Chromatographie an einer Biogsl p-60 2,2 χ 28 cm Kolonne rein erhalten.

Unter Verwendung des obigen Verfahrens, jedoch bei Ersatz von Ficoll 70 durch Dextran T70 enthält man das entsprechend modifizierte Polypeptid.

· ä1 Struktur X - Ficoll 70

1 g Ficoll 70, 1,2 g NaIO₄ und 0,42 g Kaliumchlorid werden in 1,5 ml eines 1 M Natriumacetat-Puffers bei pH 4,5 gelöst und bei 37° C während 1 Stunde

inkubiert. 2 mg (588 μΜοΙ) eines Polypeptids der Struktur

125 X wird mit geringen Mengen eines I markierten Analogs vermischt und mit 2 mg des obigen Gemisches in 0,3 ml eines 0,2 M Borat-Puffers bei pH 9,5 bei 55° C während 1 Stunde inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird anschliessend in einem Eiswasserbad abgekühlt und das

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Gemisch mit 1 ml Natriumborhydrid versetzt. Die Reduktion ist beim Durchlaufen des Produktes durch eine Biogel p-60 2,2 χ 2 8 cm Kolonne, die mit einer 0,2 M Natriumchlorid-Lösung äguilibriert und eluiert wurde, beendet.

Beispiel 9: Struktur III - Polymer

3 Mole eines festen bifunktionellen Imidoester^dihydrochlorids werden in 2 mg Portionen in 5 Minutenabständen zu einer konstant gerührten Lösung von 1 Mol eines Polypeptids der Struktur III (1-20 mg/ml) in einer 0,1 M Natriumphosphat-Lösung bei pH 10,5 bei Raumtemperatur zugefügt. 0,IN Natriumhydroxid-Lösung wird zugefügt, um den pH-Wert bei 10,5 zu halten« Eine Stunde, nachdem die Zugabe des Diimidoesters beendet wurde, erhält man ein polymerisiertes Produkt.

Beispiel 10 : _S t rukturen V oder X j^_ D ' rr:e re

Jodosobenzoesaure wird in einem geringen Ueberschuss einer IN Kaliumhydroxid"Lösung (10 %-iger molarer Ueberschuss) gelöst und die Lösung zu Peptiden der Struktur V oder X in einem Phosphat-Puffer und einer normalen Kochsalz-Lösung bei pH 7,0 zugefügt. Nach 30 minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das Polypeptid-dimere durch Gelfiltration gereinigt.

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Beispi'eT '11: · Tes'tre;su;l;täte

Zahlreiche Kaninchen werden mit verschiedenen synthetischen Peptiden, die mit verschiedenen Modifizierungsgruppen konjugiert sind, immunisiert. Nach 2 oder 3 Immunisierungen bei 3 bis 5 wöchigen Intervallen werden die Sera der Tiere nach ihrer Fähigkeit, in vitro radioaktiv markiertes HCG zu binden, beurteilt. . Die Spezifität dieser Bindung wird durch Untersuchung der Reaktion der gleichen Sera gegen ähnlich markierte Proteinhormone, insbesondere von der Schilddrüse abstammendem LH, festgestellt. Die Sera, werden überdies aufgrund ihrer Fähigkeit, die biologische Aktion von exogen zugefügtem HCG bei den Tieren zu inhibieren, beurteilt. Festgestellt wird die Zunahme des Uterusgewichtes der unreifen weiblichen Ratte als Reaktion auf die verabreichte Dosis von HCG. Die Dosis HCG wird subcutan in Kochsalzlösung in 5 Injektionen während einer 3-tägigen Periode verabreicht und das Tier zur Entfernung des Uterus am 4. Tage getötet. Das Gewicht des Uterus nimmt zu mit der Reaktion auf die verabreichten Dosen der Hormone. Bei Beurteilung der Wirkung der Antisera werden verschiedene Anteile des Testserums i.p. unabhängig von der subcutanen Verabreichung der Hormone verabreicht. Dieses Vorgehen erlaubt, dass das Antiserum rasch in die Blutzirkulation der Ratte aufgenommen wird und eine rasche Wechselwirkung mit dem Hormon stattfindet, wenn dieses in den Blutstrom eintritt.

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Falls das Aritiserum in der Lage Ist, mit dem Hormon zu reagieren, um eine Stimulierung des Uterus zu verhindern, so wird das Antiserum als wirksam für die biologische Hormonwirkung anges ehen.

Die Zahl der Tiere, die eine positive Reaktion auf die immunologische Bindung und Neutralisierung der biologischen Aktivität zeigen, ist in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Die Resultate dieser Tabelle zeugen von den: weiten Anwendungsmoglichkeiten der Erfindung, wie bereits vorhergehend angegeben. Unter Verwendung von Standardmethoden bei der Untersuchung von Kaninchen zeigen sowohl die Reaktion auf die immunologische Bindung, als auch die Neutralisierung der biologischen Wirkung die für die modifizierten Polypeptide festgestellt wurde, die nachfolgenden Resultate:

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Anzahl der positiven Ant.i.k.ö.rper.-.Re.akti.on.e.n. .auf .verschiedene. .H.C.G-Pep.t.i.d-Konjugate

	Träger	■	Anzahl der Kaninchen	1	10	8 i ft	Neutralisierung der biologischen Aktivität
Peptid	vom Rind stammendes Gamma-Globulin Keyhole-Limpet-Hemocyanin		Reaktionen auf imraunologische Verbindungen	10	I 10	6 *
35 Aminosäuren 111-145 Morgan et al	PoIy-D-L-alanin vom Rind stammendes Serum-Albumin	Immunisiert	10 5	5 6
Peptid III	Keyhole-limpet-hemocyanin	10 10	9 12	ί *
31 Aminosäuren 115-145 Morgan et al	Keyhole-1impet-hemocyanin	10 12	*
Peptid VI
44 Aminosäuren 1O5-1'48 Peptid X
Natürliches 109-145 Keutmann Peptid V

rs) co

* Zusätzliche Zeit für die Beurteilung nötig

Claims

Patentansprüche

ClJ Ein Antigen zur immunologischen Fruchtbarkeitskontrolle, das aus einem chemisch modifizierten Polypeptid besteht, wobei das unmodifizierte Polypeptid ein proteinartiges Fortpflanzungshormon oder eines seiner Fragmente ist und die chemische Modifizierung

i) "die Bindung einer oder mehrerer Modifizierungsgruppen an ein unmodifiziertes Polypeptid oder die Bindung zweier oder mehrerer unmodifizierter Polypeptidraoleküle an eine Modifizierungsgruppe umfasst mit der Massgabe, dass, falls die Modifizierungsgruppen von polymerisierten Zuckern, Seruraproteinen, Keyholelimpet-hemocyanin, Marin-gastropodmollusken, Viren oder vom Rind stammendem Gammaglobulin abstammen, das unmodifizierte Polypeptid nicht die Strukturen VII, VIII, IX oder X besitzt,

Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Prc-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Äsp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln (Struktur VII)

Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Gly (Struktur VIII)'

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118-3329/A.

Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-

Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-

■ Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-

Leu-Pro

(Struktur IX)

Asp-Kis-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-■Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-GIn-Ser-Leu-Pro

(Struktur X)

oder

ii) die Polymerisation des unmodifizierten Polypeptids mittels eines geeigneten bifunktionellen Reagens
umfasst,

oder

iii) die Dimerisierung des unmodifizi'erten Polypeptids mittels einer Schv/efel-Schwefel-Brücke, die mit Hilfe von Cystein-Resten gebildet wird, die in den unmodifizierten Polypeptiden enthalten sind oder in ummodifizierte Polypeptide, die keine Cystein-Reste enthalten, eingeführt werden, umfasst.

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- 3Λ - 118-3329/A ·
2. Ein Antigen zur immunoligischen Fruchtbarkeitskontrolle, das aus einem chemisch modifizierten Polypeptid besteht, wobei das unmodifizierte Polypeptid ein proteinartiges Fortpflanzungshromon oder eines seiner Fragmente ist, und die chemische Modifizierung die Bindung einer oder mehrerer Modifizierungsgruppen an das unmodifizierte Polypeptid oder die Bindung zweier oder mehrerer unmodifizierter Polypeptidmoleküle an Modifizierungsgruppen umfasst, mit der Massgabe, dass, falls die Modifizierungsgruppen von polymerisierten Zuckern, Serumproteinen, Keyhole limpet Hemocyanin, Marin-Gastropod-Mollusken, Viren oder vom Rind stammendem Gamiuaglobulin abstammen, das unmodifizierte Polypeptid nicht die Strukturen VII, ;il, IX oder X des Anspruchs 1 besitzt.
Antigen nach Anspruch 2, worin 1-40 modifiziepen an 1 Mol Polypeptid gebunden sind.
gen nach den Ansprüchen 2 oder 3, worin zierende Gruppen an 1 Mol Polypeptid gebunden
5. Ein Antigen nach einem der Ansprüche 2-4, worin 5-30 modifizierende Gruppen an 1 Mol Polypeptid gebunden sind.
6. Ein Antigen nach Anspruch 2, worin 2 oder mehr Polypeptidmoleküle an die modifizierende Gruppe gebunden sind.

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7. Ein Antigen nach einem der Ansprüche 2-6, worin das unmodifizierte Polypeptid die Strukturen VII, VIII, IX oder X, wie im Anspruch 1 angegeben besitzt.
8« Ein Antigen nach Anspruch 7, worin die modifizierenden Gruppen Diazogruppen sind.
9. Ein Antigen nach Anspruch 8, worin die Diazogruppen eingeführt werden durch umsetzung mit Diazosulfanilsäure.
10. Ein Antigen nach Anspruch 7, worin die modifizierenden Gruppen Dinitrophenol, Trinitrophenol, S-Acetomercaptobe ms teins ä ure anhy dr id, ein Polytyrosin, ein Polya3.anin, bioabbaubare Polydextrane oder Thyroglobulin umfassen.
11. Ein Antigen nach einem der Ansprüche 2-6, worin die modifizierenden Gruppen polymerisierte Zucker, Serunaproteine, Keyhole-limpet-hemocyanin, Marin-Gaötropod-Mollusken, Viren oder vom Rind stammendes Gamma-Globulin umfassen.
12. Ein Antigen nach Anspruch 11, worin der polymerisierte Zucker ein Copolymer von Saccharose mit Epichlorhydrin oder eine Polyglucose, das Serumprotein, ein homologes oder vom Rind stammendes Serumalbumin und der Virus ein Influenzavirus des Typs A, B oder C, oder ein Poliomyelitisvirus, lebend oder getötet, vom Typ 1, 2 oder 3 sind.

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13. Ein Antigen nach Anspruch 12, worin das Copolymer von Saccharose und Epichlorhydrin Ficoll 70 oder 400
und die Polyglucose Dextran T 70 sind.
14. Ein Antigen nach einem der Ansprüche 11-13, worin die modifizierenden Gruppen Ficoll 70, homologes
oder vom Rind stammendes Albumin oder Keyhole-limpethemocyanin sind.
15. Ein Antigen nach einem der Ansprüche 11-14, worin die unmodifizierten Polypeptide, follikelstimulierende Hormone, luteinisierende Hormone, menschliches Placentallactogen, menschliches Prolactin, menschliches Chorionic™ Gonadotropin oder deren Fragmente umfassen.
16. Ein Antigen nach Anspruch 15, worin das unmodifizierte Polypeptid ein menschliches chorionisches Gonadotropin oder Fragmente hiervon sind.
17. Ein Antigen nach Anspruch 16, worin das unmodifizierte Polypeptid ein menschliches chorionisches Gonadotropin ist.
18. Ein Antigen nach Anspruch 16, worin das unmodifizierte Polypeptid die ß-Untereinheit des menschlichen
chorionischen Gonadotropin ist.
19. Ein Antigen nach Anspruch 16, worin das unmodifizierte Polypeptid ein 20-30 Aminosäure—C-Terminalfragment der ß-üntereinheit des menschlichen chorionischen Gonadotropins ist.

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- »β - 118-3329/Α .
20. Ein Antigen nach Anspruch 16, worin das unmodifizierte Polypeptid 30-39 aus Aminosäure-C-Terminalfragmenten der ß-Einheit des menschlichen Gonadotropins besteht,
21. Ein Antigen nach Anspruch 16, worin das unmodifizierte Polypeptid die Struktur VII, VIII, IX oder X wie im Anspruch 1 angegeben, oder die Strukturen III, IV, V oder VI

Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-

Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-

Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln

(Struktur III)

Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-

Ser-Pro~Ser-Arg-Leu-Pro-Gly~Pro-Ser-Asp~Thr~Pro~Ile-Leu-Pro-Gln;

(Struktur IV) .

Thr-Cys-7\sp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Äsp-Ser-Ser-Ser-Lys-

Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-

Pro-Pro-Asx-Thr~Pro-Ile-Leu~Pro-Gln-Ser-Leu-Pro.

( Struktur V)

Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-

Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro.

(Struktur VI) besitzt.

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22. Ein Antigen nach Anspruch 21, worin das unmodifizierte Polypeptid die Struktur IX oder X wie im Anspruch 1 angegeben oder die Struktur III oder VI wie im Anspruch 21 angegeben besitzt.
23. Ein Antigen nach Anspruch 22, worin das unmodifizierte Polypeptid die Struktur III wie im Anspruch 21 angegeben besitzt.
24. Ein Antigen für die immunologische Fruchtbarkeitskontrolle, das aus einem Polypeptid der Struktur X wie im Anspruch 1 angegeben besteht, das chemisch durch die Bindung einer oder mehrerer modifizierender Gruppen, die von Keyhole-limpet-hemocyanin stammen, modifiziert ist.
25. Ein Antigen zur immunologischen Fortpflanzungskontrolle, das aus einem Polypeptid der Struktur III wie im Anspruch 21 beschrieben besteht, das mit Keyholelimpet-hemocyanin konjugiert ist.
26. Ein Antigen zur immunologischen Fortpflanzungskontrolle, das aus einem Polypeptid der Struktur IX wie im Anspruch 1 angegeben besteht, das mit homologem Serumalbumin konjugiert ist.
27. Ein Antigen für die immunologische Fruchtbarkeitskontrolle, das aus einem Polypeptid der Struktur X wie im Anspruch 1 angegeben besteht, das mit Ficoll 70 oder Dextran T70 konjugiert ist. \

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28. Ein Antigen für die immunologische Fortpflanzungskontrolle bestehend aus einem Polypeptid der Struktur VI gemäss Anspruch 21, das mit einem vom Rind stammenden Serumalbumin konjugiert ist.
29. Verfahren zur Herstellung eines Antigens zur immunologischen Fortpflanzungskontrolle dadurch gekennzeichnet, dass man ein Polypeptid, das ein proteinartiges Fortpflanzungshormon oder sein Fragment ist, modifiziert durch

a) Bindung von modifizierenden Gruppen an das unmodifizierte Polypeptid, wobei die modifizierenden Gruppen von Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen besitzen, abstammen, durch Aktivierung des Modifizierungsmittels bzw. des Polypeptids, durch Umsetzung mit Toluoldiisocyanat und Reaktion des erhaltenen aktivierten Produktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid bzw. dem Modifizierungsmittel, oder

b) Bindung von modifizierenden Gruppen,"die freien Aminogruppen besitzen oder polymerisierte Zucker sind, an unmodifizierte Polypeptide durch Konjugierung des unmodifizierten Polypeptids mit dem Modifizierungsmittel unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids als Aktivierungsmittel, oder

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c) Bindung von modifizierenden Gruppen, die durch umsetzung von Modifizierungsmitteln mit freien Aminogruppen mit Glutarsäuredialdehyd erhalten v/erden, an unmodifizierte Polypeptide durch deren Umsetzung mit dem zu modifizierenden Polypeptid in Gegenwart von Alkalimetallborhydrid, oder

el·) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Umsetzung von polymerisierten Zuckern mit einem Cyanursäurehalogenid und Reaktion des erhaltenen Dihalotriazinyl-Adduktes mit dem zu ■ modifizierenden Polypeptid, oder

e) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Behandlung der Zucker mit einem Alkalimet allper j odat und Reaktion des erhaltenen Produktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid..
30. Therapeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Antigen gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche.

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