DE2646223C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebenen Antigene zur immunologischen Fruchtbarkeitskontrolle, das im Anspruch 10 angegebene Verfahren zu deren Herstellung und gemäß Anspruch 11 eine therapeutische Zusammensetzung enthaltend obige Antigene. Die Ansprüche 2 bis 9 betreffen Ausgestaltungen des Anspruchs 1.

Die GB-PS 10 58 828 betrifft ein Verfahren zur Herstellung künstlicher Antigene, bei dem ein serologisch determinantes Peptid eines Proteins (z. B. eines Virus- oder Bakterien-Proteins oder eines Hormon-Proteins) über eine organische Brückengruppe (z. B. von einem Diisocyanat abgeleitet) an ein Trägerprotein (z. B. Albumine, γ-Globulin, Gelatine) gebunden sind.

Die DE-OS 24 21 943 beschreibt u. a. die chemische Modifizierung von natürlichen endogenen Polypeptiden, wobei modifizierte Polypeptide erhalten werden, die als Antigene den normalen Fortpflanzungsprozeß durch die Bildung von Antikörpern beeinflussen. Diese Antikörper neutralisieren nicht nur die als Antigene wirksamen modifizierten Polypeptide, sondern auch deren unmodifizierte endogenen Analoga und stellen dadurch ein Mittel für die immunogene Empfängnisverhütung dar. Die modifizierten Polypeptide werden aus natürlichen endogenen Polypeptiden der gleichen oder einer immunologisch äquivalenten Spezies hergestellt. In der Praxis entstammen die modifizierten Polypeptide der betroffenen oder einer nahe verwandten Spezies.

Insbesondere bescheibt die obige DE-OS die chemische Modifizierung von proteinartigen Fortpflanzungshormonen und deren Fragmenten, wobei Antigene erhalten werden, die zur immunologischen Empfängnisverhütung verwendet werden können. Die Fragmente der Proteinhormone müssen groß genug und genügend unterscheidungsfähig hinsichtlich ihres chemischen und physikalischen Charakters sein, damit sie als spezifischer Teil des gesamten Proteins erkannt werden können und sie müssen die notwendige chemische Natur, d. h. die Aminosäure-Struktur, besitzen, die es gestattet, die Fragmente in der gewünschten Weise chemisch zu modifizieren.

Die Bezeichnung "proteinartige Fortpflanzungshormone", die hier verwendet wird, umfaßt Hormone, die wesentlich sind für den normalen Ablauf des Fortpflanzungsprozesses.

Die Bezeichnung "Fragmente" bezieht sich in der vorliegenden Erfindung auf proteinartige Fortpflanzungshormone, die sowohl Aminosäureketten, die einen Teil der Struktur der Hormone bilden, als auch Aminosäureketten, die - obzwar nicht identisch mit den Ketten, die die Struktur der Hormone bilden - ihnen jedoch genügend ähnlich sind, um immunologisch äquivalent zu sein, d. h. die nach Verabreichung im wesentlichen die gleichen Antikörper bilden, umfassen.

Die obige DE-OS beschreibt spezifisch die chemische Modifizierung von proteinartigen Fortpflanzungshormonen, wie Follikel-stimulierenden Hormonen (FSH), luteinisierenden Hormonen (LH), menschlichem plazentalem Lactogen (HPL), menschlichem Prolactin und menschlichem chorionischem Gonadotropin (HCG) und deren Fragmenten.

Spezifische Fragmente, die entsprechend der obigen DE-OS modifiziert werden können, umfassen die β-Untereinheit von FSH und spezifische Einzelfragmente des natürlichen HPL oder menschlichen Prolactins, wobei diese Fragmente nur eine kleine Ähnlichkeit mit analogen Teilen anderer Proteine besitzen müssen. Bevorzugte Fragmente umfassen die β-Untereinheit von HCG, welche entweder die Struktur I oder II, wie nachfolgend beschrieben, besitzt (* zeigt den Ort der Carbohydratgruppen an):

Wie in der obigen DE-OS beschrieben, ist es für die Spezifität der Antikörper-Wirkung wünschenswert, daß Polypeptide modifiziert werden, wobei Molekularstrukturen erhalten werden, die völlig oder substanziell verschieden sind von denen anderer Proteinhormone. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, daß die β-Untereinheit von HCG eine Kette oder Ketten von Aminosäuren enthält, die stark von denen von LH verschieden sind, und solche Ketten erfindungsgemäß ebenfalls modifiziert werden können. Diese Ketten enthalten 20 bis 30 oder 30 bis 39 Aminosäurepeptide, bestehend aus den C-Terminalresten der β-Untereinheit von HCG. Insbesondere enthalten die Ketten Strukturen, die in den nachfolgenden Formeln III und IV (C-terminale Teile der Struktur I) und V und VI (C-terminale Teile der Struktur II) beschrieben sind:

Solche Strukturen können mit Hilfe von synthetischen Verfahren oder durch enzymatischen Abbau des entsprechenden Polypeptids [Carlson et al., J. Biological Chem., 284 (19), 6810 (1973)] erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung umfaßt aber auch weitere Polypeptidketten, die chemisch modifiziert werden können, um Antigene, die bei der immunologischen Fruchtbarkeitshemmung verwendet werden können, zu bilden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die chemische Modifizierung von Polypeptid-Ketten der nachfolgenden Formeln VII, VIII, IX und X. Infolge ihrer substanziellen Ähnlichkeit mit der chemischen Struktur und Konfiguration von HCG und der immunologischen Wirkung die sie nach der Modifizierung entfalten, können diese Fragmente als Fragmente von HCG angesehen werden.

Diese Strukturen können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.

Wie bereits in der eingangs erwähnten DE-OS beschrieben, werden die Polypeptide in solchem Ausmaß chemisch modifiziert, daß die erhaltenen Antigene die Bildung von Antikörpern hervorzurufen, die nicht nur die Antigene selbst, sondern zumindest einige ihrer natürlichen Gegenstücke, beispielsweise HCG, neutralisieren. Diese Modifizierung hängt jedoch von bestimmten Faktoren, wie z. B. der Natur der verwendeten Polypeptide ab. Wenn eine zu geringe Modifizierung erfolgt, kann der Körper das modifizierte Polypeptid als einen fremden Eindringling nicht erkennen und wird deshalb dagegen auch keine Antikörper bilden. Falls andererseits eine zu starke Modifizierung erfolgt, wird der Körper Antikörper bilden, die gegen das injizierte Antigen wirksam sind, die jedoch nicht das natürliche endogene proteinartige Gegenstück, d. i. HCG, neutralisieren.

Im allgemeinen umfaßt die chemische Modifizierung die Bindung von fremden Modifizierungsgruppen an die betreffenden Polypeptide. Die Zahl der fremden modifizierenden Gruppen, die gebunden werden sollen, hängt zwar von den Umständen ab; es ist jedoch bevorzugt, 1 bis 40, zweckmäßigerweise 2 bis 40, insbesondere 5 bis 30, beispielsweise 10 bis 26, modifizierende Gruppen für jedes Molekül des Polypeptids zu verwenden. Die vorgegebenen Modifizierungsgruppen werden an bestimmten Stellen im Peptidmolekül gebunden, so daß die maximal mögliche Zahl der gegebenen Modifizierungsgruppen entsprechend ausgewählt werden kann. Es ist jedoch auch möglich, daß verschiedene Modifizierungsgruppen aneinander gebunden werden, und das Reaktionsprodukt danach an eine einzige Aminogruppe gebunden wird; für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine solche Substitution jedoch als eine Substitution durch eine einzige Modifizierungsgruppe angesehen.

Die chemische Modifizierung kann jedoch andererseits die Bindung von 2 und mehr Polypeptidmolekülen an eine Modifizierungsgruppe umfassen.

Falls in der vorliegenden Anmeldung von der Bindung von modifizierenden Gruppen an Polypeptide (oder vice versa) gesprochen wird, so kann die Bindung direkt oder über Verbindungsgruppen erfolgen. Das Polypeptid oder das Modifizierungsmittel können beispielsweise zweckmäßigerweise mit Hilfe von Modifizierungsgruppen für die Konjugation aktiviert werden.

Die Modifizierungsgruppen können wie angegeben, den Umständen entsprechend chemisch verschieden sein. Wie in der eingangs erwähnten DE-OS ausgeführt, umfassen geeignete Modifizierungsgruppen auch die Diazogruppen. Diese können zweckmäßigerweise durch Umsetzung mit der geeigneten Zahl von Molen der Diazosulfanilsäure eingeführt werden. Die Einführung von Diazogruppen in Proteine ist eine bekannte Methode und kann beispielsweise so durchgeführt werden wie von Cinader et al., J. Am. Chem. Soc. 78, 746 (1955), Phillips et al., J. Biol. Chem. 244, 575 (1969), Tabachnik et al., J. Biol. Chem. 234(7), 1726 (1959) oder Crampton et al., Proc. Soc. Ex. Biol. & Med. 80, 448 (1952) beschrieben. Im allgemeinen werden die Methoden von Cinader et al. und Phillips et al. bevorzugt.

Zusätzliche Modifizierungsgruppen für die Polypeptide mit den obigen Strukturen VII bis X umfassen diejenigen, die von Dinitrophenol, Trinitrophenol, S-Acetomercaptobernsteinsäureanhydrid, Polytyrosin oder Polyalanin (in sowohl geraden als auch verzweigten Ketten), bioabbaubarem Polydextran oder - weniger bevorzugt - natürlichen Proteinen, wie Thyroglobulin, abstammen. Im allgemeinen werden synthetische Modifizierungsgruppen gegenüber natürlichen Modifizierungsgruppen bevorzugt.

Die obigen Verfahren als auch viele andere geeignete Hapten-Kupplungsverfahren sind in der Proteinchemie gut bekannt. Die nachfolgenden Literaturstellen können beispielsweise im Zusammenhang mit diesen erwähnt werden:

• 1. Klotz et al., Arch. Biochem. & Biophys. 96, 605-612 (1966),
• 2. Khorana, Chem. Rev. 53, 145 (1953),
• 3. Sela et al., Biochem. J. 85, 223 (1962),
• 4. Eisen et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 4583 (1953),
• 5. Certano et al., Fed. Proc. (ABSTR.) 25, 729 (1966),
• 6. Sokolowski et al., J. Am. Chem. Soc. 86, 1212 (1964),
• 7. Goodfriend et al., Science 144, 1344 (1964),
• 8. Sela et al., J. Am. Chem. Soc. 78, 746 (1955),
• 9. Bahl, J. Biol. Chem. 244, 575 (1969).

Wie in der eingangs erwähnten DE-OS beschrieben, kann die chemische Modifizierung zusätzlich aus der Entfernung von Gruppen aus den Polypeptiden bestehen. Falls deshalb beispielsweise bestimmte natürliche Proteine Kohlenwasserstoffgruppen besitzen, so können diese in üblicher Weise, beispielsweise unter Verwendung von N-Acetylneuraminidase oder N-Acetylglucosidase, d. h. Substanzen, die zum Entfernen von spezifischen Kohlenwasserstoffgruppen geeignet sind, entfernt werden.

Im Falle der Polypeptide mit den obigen Strukturen VII bis X betrifft die vorliegende Erfindung ferner die Verwendung von zusätzlichen Modifizierungsgruppen, beispielsweise von polymerisierten Zuckern, Serumproteinen, Keyhole-limpet-hemocyanin, Marin- Gastropod-Mollusken, Viren oder von Rinder- γ-Globulin zur Bindung an solche unmodifizierte Polypeptide. Zwei oder mehr der obigen unmodifizierten Polypeptid- Moleküle können auch an jeweils eine derartige Modifizierungsgruppe gebunden werden.

Geeignete polymerisierte Zucker zur Modifizierung der Polypeptide umfassen Copolymere von Saccharose mit Epichlorhydrin, wie Ficoll®70 oder Ficoll®400 oder für die Polypeptide der Strukturen VII bis X zusätzlich eine Polyglucose, wie Dextran T70 [mikrobiologisch synthetisiert durch die Einwirkung von Leuconostoc Mesenteroides (einem Pilzstamm in NRRL B-512) oder Saccharose. Glucan enthält α-1,6- glucosidische Bindungen. Geeignete Serumproteine zur Modifizierung der Polypeptide der Strukturen VII bis X umfassen homologes Serumalbumin oder vom Rind stammendes Serumalbumin und geeignete Viren und Influenza-Viren (Typen A, B oder C) oder Poliomyelitis-Viren in lebendem oder getötem Zustand (Typen 1, 2 oder 3).

Jedes der obigen proteinartigen Fortpflanzungshormone oder deren Fragmente können mit Hilfe dieser zusätzlichen Modifizierungsgruppen entsprechend der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Es sei darauf hingewiesen, daß eine solche Modifizierung die Bindung der Modifizierungsgruppen an Polypeptide über Verbindungsgruppen umfaßt, und daß dies erfolgen kann durch Reaktion des Polypeptids, des Modifizierungsmittels und des Verbindungsmittels (Aktivators), gleichgültig in welcher Reihenfolge mit oder ohne Schutz und nachfolgende Abspaltung der Schutzgruppen einer oder mehrerer reaktiver Gruppen im Polypetpid oder im Modifizierungsmittel. Allgemein gesehen kann solch eine Modifizierung in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielsweise wie in der obigen Literatur beschrieben.

Die vorliegende Erfindung berifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der obigen Antigene zur immunologischen Fortpflanzungskontrolle, dadurch gekennzeichnet, daß man Polypeptide, die proteinartige Fortpflanzungshormone oder deren Fragmente sind, modifiziert durch

• 1a) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, abstammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Aktivierung des Modifizierungsmittels bzw. des Polypeptids, das modifiziert werden soll, durch Umsetzung mit Toluol-diisocyanat und Umsetzung des erhaltenen aktivierten Produktes mit dem Polypeptid, das modifiziert werden soll bzw. dem Modifizierungsmittel, oder
• b) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, abstammen oder polymerisierte Zucker sind, an unmodifizierte Polypeptide durch Konjugation des unmodifizierten Polypeptids mit dem Modifizierungsmittel, wobei ein wasserlösliches Carbodiimid als Aktivierungsmittel verwendet wird, oder
• c) Bindung von Modifizierungsgruppen, die durch Umsetzung von Modifizierungsmitteln mit freien Aminogruppen mit Glutarsäuredialdehyd erhalten werden, an unmodifizierte Polypeptide durch deren Umsetzung mit dem zu modifizierenden Polypeptid in Gegenwart von Alkalimetallborhydrid, oder
• d) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Umsetzung der polymerisierten Zucker mit einem Cyanursäure-halogenid und Reaktion des erhaltenen Dihalotriazinyl-Adduktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid, oder
• e) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Behandlung der Zucker mit einem Alkalimetallperjodat und Reaktion des erhaltenen Produktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid.

Das im Abschnitt a) beschriebene Verfahren kann verwendet werden zur Modifikation mit Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, wie natürliche Proteine, beispielsweise Keyhole-limpet-hemocyanin, Serumproteine, beispielsweise homologes Serumalbumin oder von Rindern stammendes Serumalbumin, Polytyrosin oder Polyalanin, von Rindern stammendes Gamma-Globulin oder Thyroglobulin, (wobei die genannten Modifizierungsmittel mit Ausnahme von Kehyde-limpet-hemocyanin nur zur Modifizierung der Polypeptide mit den Strukturen VII bis X herangezogen werden) und es kann beispielsweise so durchgeführt werden, wie dies von Singer und Schick in J. Biophys. Biochem. Cytology 9, 519 (1961), beschrieben wird. Insbesondere wird das Modifizierungsmittel zweckmäßigerweise in einer Pufferlösung, beispielsweise einem Phosphatpuffer in Natriumchloridlösung bei einem pH-Wert von beispielsweise 6-8 aufgenommen und die Lösung anschließend mit Toluol-diisocyanat (TDIC) versetzt. Das Toluol-diisocyanat wird zweckmäßigerweise verdünnt 1 : 10 bis 40 in Dioxan zugesetzt und die Menge des verwendeten Toluol-diisocyanats kann zweckmäßigerweise von 0,075 bis 100 Mol-Äquivalente betragen. Die Umsetzung kann beispielsweise bei Temperaturen von -5 bis +10°C, vorzugsweise von 0 bis 4°C, durchgeführt werden, und die Reaktionsdauer kann beispielsweise von ½ bis 2 Stunden betragen. Ein Überschuß von Toluol-diisocyanat wird danach durch Zentrifugierung entfernt, der Niederschlag mit dem obigen Phosphatpuffer gewaschen und die überstehenden Anteile vereinigt. Das aktivierte Modifizierungsmittel kann dann zweckmäßigerweise zu einer Lösung des zu modifizierenden Polypeptids im gleichen Phosphatpuffer (5 bis 30 mg/ml) zugefügt werden, wobei die Mengen des Modifizierungsmittels und des Polypeptids sich in dem Molverhältnis befinden sollen, das im gebildeten modifizierten Polypeptid gewünscht wird. Die in den vereinigten Lösungen befindlichen Substanzen werden zweckmäßigerweise bei 30-50°C, zweckmäßigerweise 35-40°C, während vorzugsweise 3-6 Stunden miteinander zur Reaktion gebracht. Die Umsetzung kann jedoch auch so durchgeführt werden, daß die erste Stufe aus der Zugabe der Toluol-diisocyanat-Lösung zum gepufferten Polypeptid besteht und die Zugabe des gepufferten Modifizierungsmittels zum aktivierten Polypeptid sich anschließt, wobei die Bedingungen der ersten und der zweiten Stufe oben beschrieben werden.

Die Modifizierungsmittel, die insbesondere zur Modifizierung der Polypeptide mit den obigen Strukturen VII bis X verwendet werden, gemäß einem Verfahren, das allgemein von Moore und Koshland in J. Biol. Chem. 242, 2447 (1967) beschrieben wird, umfassen natürliche Proteine, wie Keyhole-limpet-hemocyanin, Serumproteine, wie homologes oder vom Rind stammendes Serumalbumin, polymerisierte Zucker, wie Ficoll®(70 oder 40) oder Dextrane (Dextran T70), und Polyalanin oder Polytyrosin. Die zu modifizierenden Polypeptide werden zweckmäßigerweise anfänglich durch Acetylierung ihrer Aminogruppen geschützt und anschließend mit dem Modifizierungsmittel konjugiert, vorzugsweise in Gegenwart von Guanidin, beispielsweise Guanidinhydrochlorid, und in Gegenwart von vorzugsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid als dem wasserlöslichen Carbodiimid-Aktivierungsmittel. Falls als Modifizierungsmittel polymerisierte Zucker, wie Ficoll®, verwendet wird, ist es zweckmäßig, diesen zuerst mit Ethylendiamin zu behandeln, um das anschließende Kuppeln effektiver zu gestalten. Das Kuppeln erfolgt zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise einer Salzlösung und Dioxan, zweckmäßigerweise bei Raumtemperatur und einem pH von 9 bis 12, vorzugsweise 10 bis 11. Die Reaktionszeit kann beispielsweise von ¼ bis 2 Stunden betragen. Die nachfolgende Konjugation des geschützten Polypeptides mit dem Modifizierungsmittel kann zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise Glycin-methylester bei einem pH von beispielsweise 4 bis 5, vorzugsweise 4,5 bis 4,8, durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur ist zweckmäßigerweise die Raumtemperatur, und die Reaktionsdauer kann beispielsweise von 2 bis 8 Stunden, insbesondere 5 Stunden, betragen.

Das Verfahren c), das im Falle der Polypeptide, mit den Strukturen VII bis X, unter Verwendung von natürlichen proteinartigen Modifizierungsmittel, wie beispielsweise Serumproteinen, insbesondere homologem Serumalbumin, durchgeführt wird, beruht auf der Theorie von Richards und Knowles [J. Mol. Biol. 37, 231 (1968)], wonach auf dem Markt befindlicher Glutarsäure-dialdehyd keinen freien Glutarsäuredialdehyd enthält, sondern vielmehr aus einem komplexen Gemisch von Polymeren, das reich ist an α,β-ungesättigten Aldehyden, besteht. Nach Reaktion mit natürlichen Proteinmodifizierungsmitteln bilden diese Polymere eine stabile Bindung über die freien Aminogruppen, wobei die Aldehydgruppen freigesetzt werden. Das Zwischenprodukt kann dann mit dem unmodifizierten Polypeptid in Gegenwart eines Alkalimetallborhydrids, beispielsweise Natriumborhydrid, umgesetzt werden. Die Zwischenverbindung wird zweckmäßigerweise bei einem pH von 7 bis 10, vorzugsweise 8 bis 9, und bei Raumtemperatur gebildet. Die nachfolgende Konjugation wird zweckmäßigerweise bei Raumtemperatur während ¼ bis 2 Stunden durchgeführt.

Das Verfahren d), das unter Verwendung von Modifizierungsmitteln, bestehend aus polymerisierten Zuckern, wie Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymeren, beispielsweise Ficolls, insbesondere Ficoll®70 oder 400, oder im Falle der Polypeptide mit den Strukturen VII bis X auch mit Polyglucosen, wie beispielsweise Dextran T70, durchgeführt wird, erfolgt durch Umsetzung des Modifizierungsmittels mit einem Cyanursäurehalogenid, beispielsweise Cyanursäurechlorid, beispielsweise bei einer Temperatur von 0 bis 20°C in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, während ½ bis 4 Stunden. Das erhaltene Dihalotriazinyl-Zwischenprodukt wird bis zur Halogenidion-Freiheit dialysiert, danach lyophilisiert, und anschließend mit dem Polypeptid bei einem pH-Wert von 8 bis 11, vorzugsweise 9 bis 10, bei Raumtemperatur während ½ bis 12 Stunden umgesetzt.

Das im Abschnitt e) beschriebene Verfahren kann ebenfalls für polymerisierte Zuckermodifizierungsmittel, beispielsweise Copolymere von Saccharose mit Epichlorhydrin; insbesondere Ficolls, wie Ficoll®70 oder 400, oder im Falle der Polypeptide mit den Strukturen VII bis X auch mit Polyglucosen, wie Dextran T70, angewendet werden. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßigerweise durch Behandlung des Modifizierungsmittels mit einem Alkalimetallperjodat, wie Natriumperjodat, bei einer Temperatur von 30 bis 60°C und einem pH-Wert von 3 bis 6. Das erhaltene Zwischenprodukt wird mit Polypeptid bei einem pH von 7 bis 11, vorzugsweise von 8 bis 10, bei Temperaturen von 15 bis 80°C, vorzugsweise von 20 bis 60°C, umgesetzt. Die Reaktionszeit kann beispielsweise von ½ bis 4 Stunden betragen. Das Reaktionsprodukt wird anschließend zweckmäßigerweise mit einem Alkalimetallborhydrid, beispielsweise Natriumborhydrid, reduziert.

Die erhaltenen modifizierten Polypeptide können auf an sich bekannte Weise isoliert und gereinigt werden, so wie beispielsweise durch Gelfiltration, Säulenchromatographie oder Dialyse und Lyophilisatoren. Vor der Konjugation (Modifikation) können mit Picogramm-Mengen I¹²⁵ markierte Polypeptide als Tracer dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Die Menge des an die modifizierenden Gruppen konjugierten Polypeptides (Molverhältnis) kann durch die Menge der Radioaktivität festgestellt werden.

Die oben unter a) bis e) beschriebenen Methoden können zur Modifizierung jedes proteinartigen Fortpflanzungshormons oder dessen Fragmenten, insbesondere den oben beschriebenen, angewendet werden, wobei Antigene zur Verwendung bei der immunologischen Fruchtbarkeitshemmung erhalten werden.

Wie oben beschrieben, kann die Herstellung der zur Verwendung in der Fruchtbarkeitskontrolle angewendeten Antigene entsprechend der eingangs erwähnten DE-OS und der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden durch Bindung einer oder mehrerer modifizierender Gruppen an ausgewählte Polypeptide oder durch Bindung zweier oder mehrerer Polypeptid-Moleküle an die modifizierenden Gruppen.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Antigenen zur immunologischen Kontrolle der Fruchtbarkeit durch Verwendung von chemisch modifizierten Polypeptiden, wobei das unmodifizierte Polypeptid ein proteinartiges Fortpflanzungshormon oder ein Fragment hiervon ist, und die chemische Modifizierung

• (ii) die Polymerisation des unmodifizierten Polypeptids über ein geeignetes bifunktionelles Agens, oder
• (iii) die Dimerisierung des unmodifizierten Polypeptids über eine Schwefel-Schwefelbrücke, erhalten aus Thiolgruppen, von Cysteinresten, die im unmodifizierten Polypeptid anwesend sind, oder zu dem unmodifizierten Polypeptid, sofern dieses keine Cysteinreste enthält, zugegeben werden,

umfaßt.

Die Antigene des Gegenstandes (ii) können durch Polymerisation des unmodifizierten Polypeptids mit einem geeigneten bifunktionellen Reagens, beispielsweise einem bifunktionellen Imidoester, wie Dimethyladipimidat, Dimethylsuberimidat oder Diethylmalonimidat, in an sich bekannter Weise [beispielsweise Hartmann und Wold, Biochem. 6, 2439 (1967)] erhalten werden. Die Polymerisation kann bei Raumtemperatur in einem wässerigen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 9 bis 12, vorzugsweise 10 bis 12, zweckmäßigerweise während ¼ bis 2 Stunden durchgeführt werden.

Die Antigene des Gegenstandes (iii) können erhalten werden durch Oxidation der Thiolgruppe eines Cysteinrestes, beispielsweise unter Verwendung von Jodbenzoesäure in bekannter Weise, beispielsweise bei Raumtemperatur während 10 bis 40 Minuten. Falls die zu modifizierenden Polypeptide keine Cysteingruppen enthalten, müssen diese zunächst in das Polypeptid auf an sich bekannte Weise eingebaut werden.

Die chemische Modifikation der Gegenstände (ii) und (iii) kann bei jedem proteinartigen Fortpflanzungshormon oder seinen Fragmenten, insbesondere denen, die oben beschrieben sind, durchgeführt und die so erhaltenen modifizierten Polypeptide bzw. deren Fragmente als Antigene in der immunologischen Fruchtbarkeitshemmung angewendet werden.

Die Antigene der vorliegenden Erfindung werden zweckmäßigerweise mit pharmazeutisch verträglichen flüssigen Trägern vermischt und parenteral verabreicht. Die zu verabreichenden Dosen können abhängig von vielen Faktoren variieren, insbesondere verwendet man jedoch Einheitsdosen von 0,1 bis 50 mg, die zweckmäßigerweise 1 bis 5 mal in Intervallen von 1 bis 3 Wochen verabreicht werden.

Beispiel 1 Struktur X - Hemocyanin von Keyhole-limpet

Es wird eine Hemocyanin-Lösung von Keyhole-limpet (KLH) (7 mg/ml) in einem 0,05 M Natriumphosphat-Puffer in 0,2 molarer wäßriger Natriumchlorid-Lösung bei einem pH-Wert von 7,5 bereitet. Unlösliche Teile werden durch Zentrifugieren entfernt. Zu 1 ml dieser Lösung fügt man 20 µl Toluoldiisocyanat, das auf ¹/₃₀ mit Dioxan verdünnt wurde, wobei dieser Anteil das Äquivalent der Mole der Lysyl-Reste im KLH-Molekül darstellt. Nach 40minütigem Stehen bei 0°C wird die durch Toluol-diisocyanat aktivierte KLH-Lösung mit 0,5 mg eines synthetischen β-HCG-Peptides, das die obige Struktur X besitzt und vorgängig in 25 µl eines 0,5 molaren Natriumsulfat-Puffers in einer 0,2 molaren wäßrigen Natriumchlorid-Lösung bei pH 7,5 gelöst wurde, versetzt. Das Gemisch wird bei 37°C während 4 Stunden inkubiert. Das erhaltene Produkt wird durch Gelfiltration gereinigt.

Beispiel 2 Struktur III - Keyhole-Limpet-hemocyanin

2 mg der Verbindung der Struktur III, die in Picogramm- Anteilen I¹²⁵ enthält, und 1,6 mg KLH werden in 1 ml 1 M Glycinmethylester in 5 M Guanidinhydrochlorid gelöst. 19,1 mg Ethyl-dimethylaminopropylcarbodiimid werden zu dieser Lösung zugefügt. Der pH-Wert des Gemisches wird mit Hilfe von 1N Chlorwasserstoffsäure während 5 Stunden bei Raumtemperatur auf pH 4,75 eingestellt. Das KLH-Peptid-Konjugat wird an einer Biogel®p-60 2,2 × 28 cm Kolonne, die mit 0,2 molarer Natriumchlorid-Lösung äquilibriert wurde, gereinigt.

Ficoll®70 - Ethylendiamin

1 g Ficoll®70 wird in jeweils 1 ml einer normalen Kochsalz-Lösung und einer 2 M Ethylendiamin-Lösung, die mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 10 eingestellt wurden, gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur in einem Wasserbad gehalten und mit Hilfe eines Magnetrührers gerührt. Danach werden 4 g Bromcyan, die in 8 ml Dioxan gelöst sind, zu der Ficoll®-70-Lösung zugefügt. Der pH- Wert des Gemisches wird auf 10 bis 10,5 während 8 Minuten durch Zugabe von Tropfen einer 2N wässerigen Natriumhydroxid- Lösung gehalten. Danach werden weitere 2 ml einer 2 M Ethylendiamin-Lösung (ph 10) zugesetzt und das Rühren bei Raumtemperatur während 3 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird an einer Biogel®- p-60-Kolonne gereinigt. Das erhaltene Material kann verwendet werden zum Kuppeln von Ficoll®70 an Polypeptide unter Verwendung des Verfahrens b).

Beispiel 3 Struktur IX - homologes Serumalbumin

Zu einer 20 mg/ml Lösung eines homologen Serumalbumins in 0,1 M Borat-Puffer bei pH 8,5 wird ein 1000 M-% Überschuß einer 25%igen wäßrigen Lösung von Glutarsäure-dialdehyd bei Raumtemperatur zugefügt. Der Überschuß von Dialdehyd wird durch Gelfiltration in Wasser unter Verwendung von Biogel®p-2 entfernt. Das erhaltene Material wird lyophilisiert, und das getrocknete Produkt in einem 0,1 M Borat- Puffer bei pH 8,5 (20 mg/ml) wieder gelöst und danach mit der gewünschten Menge eines Polypeptids der Struktur IX (20 mg/ml) im gleichen Puffer bei Raumtemperatur vermischt. 20 Minuten später wird Natriumborhydrid in einem 250 Mol-% Überschuß, bezogen auf Polypeptid IX, zugefügt. Die Reaktion ist nach 1 Stunde beendet. Das konjugierte Produkt wird durch Gelfiltration an einer Biogel®p-60 Kolonne gereinigt, salzfrei dialysiert und lyophilisiert.

Beispiel 4 Struktur X - Ficoll®70

1 g Ficoll® 70, 500 mg Natriumbicarbonat, 3 g Cyanursäurechlorid, 20 ml Wasser und 80 ml Dimethylformamid werden während 2 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 16°C gerührt. Das erhaltene Produkt wird gegen destilliertes Wasser bis zur Chlorfreiheit dialysiert und anschließend lyophilisiert. 2 mg eines Polypeptids der Struktur X, das geringste Anteile von I¹²⁵ enthält, wird mit 1 mg des vorgängig erhaltenen Produktes in 0,25 ml eines 0,2 M Natriumborat-Puffers bei pH 9,5 während 1 Stunde bei 20°C inkubiert und danach das Produkt nach Chromatographie an einer Biogel®p-60 2,2 × 28 cm Kolonne rein erhalten.

Unter Verwendung des obigen Verfahrens, jedoch bei Ersatz von Ficoll®70 durch Dextran T70 enthält man das entsprechend modifizierte Polypeptid.

Beispiel 5 Struktur X - Ficoll®70

1 g Ficoll®70, 1,2 g NaIO₄ und 0,42 g Kaliumchlorid werden in 1,5 ml eines 1 M Natriumacetat- Puffers bei pH 4,5 gelöst und bei 37°C während 1 Stunde inkubiert. 2 mg (588 µMol) eines Polypeptids der Struktur X wird mit geringen Mengen eines mit I¹²⁵ markierten Analogons vermischt und mit 2 mg des obigen Gemisches in 0,3 ml eines 0,2 M Borat-Puffers bei pH 9,5 bei 55°C während 1 Stunde inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird anschließend in einem Eiswasserbad abgekühlt und das Gemisch mit 1 ml Natriumborhydrid versetzt. Die Reduktion ist beim Durchlaufen des Produktes durch eine Biogel®- p-60 2,2 × 28 cm Kolonne, die mit einer 0,2 M Natriumchlorid- Lösung äquilibriert und eluiert wurde, beendet.

Beispiel 6 Struktur III - Polymer

3 Mole eines festen bifunktionellen Imidoester-dihydrochlorids werden in 2 mg Portionen in 5-Minuten-Abständen zu einer konstant gerührten Lösung von 1 Mol eines Polypeptids der Struktur III (1-20 mg/ml) in einer 0,1 M Natriumphosphat-Lösung bei pH 10,5 bei Raumtemperatur zugefügt. 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung wird zugefügt, um den pH-Wert bei 10,5 zu halten. Eine Stunde nachdem die Zugabe des Diimidoesters beendet wurde, erhält man ein polymerisiertes Produkt.

Beispiel 7 Strukturen V oder X - Dimere

Jodosobenzoesäure wird in einem geringen Überschuß einer 1N Kaliumhydroxid-Lösung (10%iger-molarer Überschuß) gelöst und die Lösung zu Peptiden der Struktur V oder X in einem Phosphat-Puffer und einer normalen Kochsalz- Lösung bei pH 7,0 zugefügt. Nach 30minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das Polypeptid-dimere durch Gelfiltration gereinigt.

Beispiel 8 Testresultate

Zahlreiche Kaninchen werden mit verschiedenen synthetischen Peptiden, die mit Keyhole-Limpet-Hemocyanin konjugiert sind, immunisiert. Nach 2 oder 3 Immunisierungen in 3- bis 5wöchigen Intervallen werden die Sera der Tiere nach ihrer Fähigkeit, in vitro radioaktiv markiertes HCG zu binden, beurteilt. Die Spezifität dieser Bindung wird durch Untersuchung der Reaktion der gleichen Sera gegen ähnlich markierte Proteinhormone, insbesondere von der Schilddrüse abstammendem LH, festgestellt. Die Sera werden überdies aufgrund ihrer Fähigkeit, die biologische Wirkung von exogen zugefügtem HCG bei den Tieren zu inhibieren, beurteilt. Festgestellt wird die Zunahme des Uterusgewichtes der unreifen weiblichen Ratte als Reaktion auf die verabreichte Dosis von HCG. Die Dosis HCG wird subcutan in Kochsalzlösung in 5 Injektionen während einer 3tägigen Periode verabreicht und das Tier zur Entfernung des Uterus am 4. Tage getötet. Das Gewicht des Uterus nimmt zu mit der Reaktion auf die verabreichten Dosen der Hormone. Bei Beurteilung der Wirkung der Antisera werden verschiedene Anteile des Testserums i. p. unabhängig von der subcutanen Verabreichung der Hormone verabreicht. Dieses Vorgehen erlaubt, daß das Antiserum rasch in die Blutzirkulation der Ratte aufgenommen wird und eine rasche Wechselwirkung mit dem Hormon stattfindet, wenn dieses in den Blutstrom eintritt.

Falls das Antiserum in der Lage ist, mit dem Hormon zu reagieren, um eine Stimulierung des Uterus zu verhindern, so wird das Antiserum als wirksam für die biologische Hormonwirkung angesehen.

Die Zahl der Tiere, die eine positive Reaktion auf die immunologische Bindung und Neutralisierung der biologischen Aktivität zeigt, ist in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Die Resultate dieser Tabelle zeugen von den weiten Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung, wie bereits angegeben. Unter Verwendung von Standardmethoden bei der Untersuchung von Kaninchen zeigt sowohl die Reaktion auf die immunologische Bindung als auch die Neutralisierung der biologischen Wirkung, die für die modifizierten Polypeptide festgestellt wurde, die nachfolgenden Resultate:

Anzahl der positiven Antikörper-Reaktionen auf verschiedene HCG-Peptid-Konjugate

Claims (11)

1. Antigen zur immunologischen Fruchtbarkeitskontrolle, das aus einem chemisch modifizierten Polypeptid besteht, wobei das unmodifizierte Polypeptid ein proteinartiges Fortpflanzungshormon oder eines seiner Fragmente ist und die chemische Modifizierung

• i) aus der Bindung einer oder mehrerer Modifizierungsgruppen an das unmodifizierte Polypeptid oder der Bindung zweier oder mehrerer unmodifizierter Polypeptidmoleküle an eine Modifizierungsgruppe besteht mit der Maßgabe, daß die Modifizierungsgruppen von Copolymeren von Saccharose mit Epichlorhydrin, Keyhole- limpet-hemocyanin, Marin-gastropodmollusken oder Viren abstammen, falls das unmodifizierte Polypeptid eine andere Struktur als die folgenden Strukturen VII, VIII, IX oder X besitzt, oder
• ii) aus der Polymerisation des unmodifizierten Polypeptids mittels eines bifunktionellen Reagenz besteht, oder
• iii) aus der Dimerisierung des unmodifizierten Polypeptids über einer Schwefel-Schwefel-Brücke, die aus Thiolgruppen von Cystein-Resten gebildet wird, die in den unmodifizierten Polypeptiden enthalten sind oder in unmodifizierte Polypeptide, die keine Cystein-Reste enthalten, eingeführt werden, besteht.

2. Antigen nach Anspruch 1, worin 1-40 modifizierende Gruppen an 1 Molekül Polypeptid gebunden sind.

3. Antigen nach Anspruch 1, worin das Virus ein Influenzavirus des Typs A, B oder C, oder ein Poliomyelitisvirus, lebend oder getötet, vom Typ 1, 2 oder 3 ist.

4. Antigen nach Anspruch 1, worin das Copolymer von Saccharose und Epichlorhydrin Ficoll®70 oder 400 ist.

5. Antigen nach einem der Ansprüche 1-4, worin die unmodifizierten Polypeptide follikelstimulierende Hormone, luteinisierende Hormone, menschliches Placentallactogen, menschliches Prolactin, menschliches chorionisches Gonadotropin oder deren Fragmente umfassen.

6. Antigen nach Anspruch 5, worin das unmodifizierte Polypeptid die β-Untereinheit des menschlichen chorionischen Gonadotropins ist.

7. Antigen nach Anspruch 5, worin das unmodifizierte Polypeptid ein 20-30 Aminosäure-C-Terminalfragment der β-Untereinheit des menschlichen chorionischen Gonadotropins ist.

8. Antigen nach Anspruch 5, worin das unmodifizierte Polypeptid aus 30-39 Aminosäure-C-Terminalfragmenten der β-Einheit des menschlichen Gonadotropins besteht.

9. Antigen nach Anspruch 5, worin das unmodifizierte Polypeptid die Strukturen III, IV, V oder VI besitzt.

10. Verfahren zur Herstellung eines Antigens zur immunologischen Fortpflanzungskontrolle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polypeptid, das ein proteinartiges Fortpflanzungshormon oder sein Fragment ist, modifiziert durch

• a) Bindung von modifizierenden Gruppen an das unmodifizierte Polypeptid, wobei die modifizierenden Gruppen von Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen besitzen, abstammen, durch Aktivierung des Modifizierungsmittels bzw. des Polypeptids, durch Umsetzung mit Toluoldiisocyanat und Reaktion des erhaltenen aktivierten Produktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid bzw. dem Modifizierungsmittel, oder
• b) Bindung von modifizierenden Gruppen, die freie Aminogruppen besitzen oder polymerisierte Zucker sind, an unmodifizierte Polypeptide durch Konjugierung des unmodifizierten Polypeptids mit dem Modifizierungsmittel unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids als Aktivierungsmittel, oder
• c) Bindung von modifizierenden Gruppen, die durch Umsetzung von Modifizierungsmitteln mit freien Aminogruppen mit Glutarsäuredialdehyd erhalten werden, an unmodifizierte Polypeptide durch deren Umsetzung mit dem zu modifizierenden Polypeptid in Gegenwart von Alkalimetallborhydrid, oder
• d) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Umsetzung von polymerisierten Zuckern mit einem Cyanursäurehalogenid und Reaktion des erhaltenen Dihalotriazinyl-Adduktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid, oder
• e) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an unmodifizierte Polypeptide durch Behandlung der Zucker mit einem Alkalimetallperjodat und Reaktion des erhaltenen Produktes mit dem zu modifizierenden Polypeptid.

11. Therapeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Antigen gemäß einem der Ansprüche 1-9.