DE2421943A1

DE2421943A1 - Modifizierte polypeptide

Info

Publication number: DE2421943A1
Application number: DE2421943A
Authority: DE
Inventors: Vernon Cecil Prof Stevens
Original assignee: Ohio State University
Current assignee: Ohio State University
Priority date: 1973-05-07
Filing date: 1974-05-07
Publication date: 1974-11-28
Also published as: JPS623128B2; IL44779A; MY8100128A; GB1473601A; CA1057742A; CH622426A5; NL7406098A; FR2228477A1; HK41280A; DE2421943C2; FR2228477B1; NZ174192A; ATA377074A; AU524925B2; IE42002B1; DD113919A5; JPS5069221A; PL97318B1; AU6869574A; SE7406096L

Description

Patentanwälte Case 118-3329

Dipl.-l.-.g. P. Wir*

Dr. V. S-.! •.•.Vi.-.il-Kowarztk

Dip', l'ifj. G. Danncnbsrg

Dr. P. Wdiiholci, Or. D. Gudel

6 Frankfurt /W., Gr. Eschenheimer. Str. 33

The Ohio State University 190 North Oval Drive Columbus, Ohio 43 210 /USA

. Modifizierte. Polypeptide

, Die Erfindung betrifft modifizierte Polypeptide, die als Antigene zur aktiven Immunisierung zwecks Kontrolle oder Behandlung verschiedener physiologischer Prozesse, insbesondere der Fortpflanzung, verwendet werden können.

Es ist bekannt, dass Polypeptide,insbesondere Proteine, für viele physiologische Prozesse verantwortlich sind, bzw. su diesen beitragen oder sie beeinflussen.. Beispielsweise ist es bekannt, dass bestimmte Proteinhormone und auch nicht hormonale Proteine wesentlich sind für den normalen Fortpfianzungsprozess. Ueberdies ist bekannt, dass ein unüblicher Ueberschuss bestimmter Polypeptide, wie Gastrin, Angiotension II oder Somatomedian, verschiedene Krankheiten oder Krankheitszustände hervorruft bzw. beeinflusst.

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Die vorliegende Erfindung betrifft die Kontrolle bzw. die Behandlung solcher physiologischer Prozesse durch aktive Immunisierung (d.i„ durch Verabreichung von Antigenen). Durch die Verabreichung von Antigenen werden Antikörper gebildet, die diejenigen endogenen Polypeptide neutralisieren bzw. biologisch inaktivieren, die verantwortlich sind für solche physiologische Prozesse bzw. zu diesen beitragen oder sie beeinflussen.

Die Immunologie als ein Mittel zur Kontrolle der Fortpflanzung war bereits Gegenstand zahlreicher Untersuchungen, R.G. Edwards gibt in seiner Arbeit "Immunology of Conception and Pregnancy" (British Medical Journal, _2£, 72-78 [19 70 3) eine Uebersicht über die auf diesem Gebiet erschienene Literatur, die sich mit der Bildung und der Verwendung von Antikörpern gegen Testike1 und Sperraian befasst. Hormonale Antikörper wurden auch während vieler Jahre untersucht, und die Wirkungen spezifischer Antisera registriert. Die meisten Untersuchungen der Empfängnis-Verhütung auf immunologischem Gebiet bezogen sich jedoch auf eine passive Xreinunisatiori, d. i. auf eine Injektion von Antikörpern, die anderswo gebildet wurden. Die passive Immunisation hat jedoch in der Menschenbehandlung Grenzen _e nachdem eine wiederholte Injektion von tierischen Antikörpern beim Menschen unerwünschte Nebenreaktionen hervorrufen kann.

Es wurde nunmehr gefunden, dass man durch chemische Modifizierung natürlicher, endogener Polypeptide, die eine Rolle in physiologischen Prozessen spielen, Antigene er-

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hält, die in der Lage sind, Antikörper zu bilden, wobei die Antikörper nicht nur die antigenisch modifizierten Polypeptide, sondern auch ihre unmodifizierten endogenen Gegenstücke (d.i. die gleichen, jedoch unmodifizierten Polypeptide) neutralisieren. Es kann angenommen v/erden, dass die Immunisation auf der Unfähigkeit der Antikörper beruht, zwischen den antigenisch modifizierten Polypeptiden und ihren unmodifizierten endogenen Gegenstücken zu unterscheiden. Die. modifizierten Polypeptide werden aus den natürlichen endogenen Polypeptiden der betreffenden Spezies erhalten, oder sind immunologisch äquivalent zu den so erhaltenen modifizierten Polypeptiden, Die zu modifizierenden Polypeptide stammen praktisch aus den betreffenden Spezies oder aus nahe verwandten Spezies.

In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen, besieht sich die Angabe "modifizierte Polypeptide" auf Polypeptide, die

a) Proteinhormone

b) nicht hormonale Proteine oder

c) Fragmente von a) oder b) sind*

Solche Polypeptide können natürlich sein oder synthetisch hergestellt* Die unter c) angegebenen Fragmente müssen gross genug und genügend unterscheidungskräftig in chemischer und physikalischer Weise sein, um als ein spezifischer Teil des ganzen Proteins erkannt zu werden. Sie müssen selhstver stänälich auch eine chemische Natur besitzen, d,i_e einen entsprechenden Aminosäureaufbau, damit die Möglichkeit besteht, sie in gewünschter Weise chemisch zu modifizieren.

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Die Erfindung betrifft ein. Antigen zur Verwendung als aktives Immunisationsmittel zur Kontrolle oder Behandlung von physiologischen Prozessen in bestimmten Spezies, enthaltend ein. chemisch modifiziertes Polypeptid, wobei das chemisch modifizierte Polypeptid einem endogenen Polypeptid entstammt, das solche physiologische Prozesse in dieser Spezies beeinflusst bzw« immunologisch äquivalent ist zu dem so erhaltenen chemisch modifizierten Polypeptid, wobei die chemische Modifikation derart ist, dass sie dem chemisch modifizierten Polypeptid erlaubt, in der Spezies Antikörper zu bilden, die die endogenen Polypeptide als auch die chemisch modifizierten Polypeptide biologisch neutralisieren können.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Antigens, das darin besteht, dass man ein geeignetes Polypeptid im notwendigen Ausinass chemisch modifiziert.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Antikörper, die in der Spezies als Reaktion auf die Einwirkung solcher erfindungsgemäss hergestellter Antigene gebildet werden, sowie Antisera, die solche Antikörper enthalten.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode zur Kontrolle bzw. zur Beeinflussung eines physiologischen Vorganges in einer Spezies, die dadurch gekennzeichnet ist, dass man in die Spezies eine immunologisch wirksame Menge des Antigens oder der erfindungsgemässen Antikörper injiziert» Die Erfindung betrifft insbesondere eine entsprechende Methode zur Empfängnis-" verhütung«

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Die Polypeptide, die zwecks Bildung der erfindungsgemässen Antigene chemisch modifiziert v/erden können, sind insbesondere protein-reproduktive Hormone, wie das Follikel stimulierende Hormon (FSH), das luteinisierende Hormon (LK), menschliche Plazenta-Lactogen (HPL), das menschliche Prolactin und das menschliche Chorionic-Gonadotropin, sowie deren spezifische Fragmente.

Spezifische Fragmente der Protein reproduktiven Hormone, die erfindungsgemäss modifiziert werden können, enthalten die ß-ünte-reinheit von FSH und spezifische Fragmenteioheiten des natürlichen. HPL oder menschlichen Proiactins, vrofoei die Fragmente nur eine geringe Aehnliehkeit mit ähnlichen Anteilen anderer Proteinhormone besitzen. Bevorzugte Fragmente sind die 0-Untereinheiten von HCG, die entweder die Struktur I oder II besitzen.

(* bedeutet den Ort der Kohlehydratgruppen)

10

Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-lie- -Asn-Ala-Thr-

20 " *

Lau-AIa-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys-Ile-Thr-Val-Aen-

Thr-Thr-Ile-Cys-Ala-Gly-Try-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val-Leu-

50 60

Gin-GIy-VaI-Leu-Pro-AIa-Leu-Pro-Gin-VaI-VaI-Cys-Äsn-Try-Arg-

70 Asp- VaI- Arg- Phe-Glu-Ser-Tle-Arg-Leu-Pro-Gly-Cys-Pro-J.rg- GIy-

80 - 90

VaI- Asn-Pro- VaI- Val-Ser-Tyr- Ala- VaI- Ala-Leu-Ser-Cys-Gln-Cys-

100 Ala-Leu-Cys-Arg-Arg-Ser-Thr-Thr-Äsp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-

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110 120

His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-

* * 130 *

Ser-Lys-Äla-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro- * 140

Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln

(Struktur I)

10 * Ser-Lys-Gln-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn-Ala-Thr-

20 29 · *

Leu-AIa-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys-Ile-Thr-Val-Asn-

40 Th r- Thr-1 Ie-Cy s-Äl a- GIy- Ty r-Cy s- Pr o-Thr- Me t-Th r-Arg- VaI- Leu- GIn-

50 60

GIy-VaI-Leu-Pro- AIa- Leu- P ro- GIx-Leu- Val-Cys-Asn-Tyr-Arg-Asp-VaI-

70
Arg-Phe~Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro-Gly-Cys-Pro-Arg-GIy-VaI-Asn~

80 90

Pro-VaI-Val-Ser-Tyr-Ala-VaI-Ala-Leu-Ser-Cys-Gln-Cys-Ala-Leu-

100

Cys-Arg-(Argi-Ser-Thr-Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-

110 * 120

Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ber-Ser-Öer-Lys-Ala-

* 130 *

Pro-Pro-Pro-Ser—Lau-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Prc-GIy-Pro-Pro-

140 147

Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro

(Struktur U)

Für die Spezifität der Antikörperwirkung ist es viünschenöwert, dass Polypeptide modifiziert v/erden, die hinsichtlich ihrer Molekularetruktür völlig oder subs banzie11 verschieden sind von anderen. Proteinhormonen« Beispielsweise enthält die ß~Untoreinheit von HCG eine oder mehrere Arninosäureketten, die sich stark von denen vcn LH

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unterscheiden, wobei diese Ketten ebenfalls entsprechend der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können. Solche Ketten beeinhalten 20-30 oder 30-39·Aminosäurepeptide, die aus C-Terminalresten der ß-Untergruppe von HCG bestehen. Insbesondere sind hierfür die in den nachfolgenden Formeln III und IV (C-terminale Anteile der Struktur I) und V und VI (C-terminale Anteile der Struktur II) beschriebenen Ketten geeignet:

Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-

Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-

*
Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln

(Struktur III)

Glri"Äsp~Ser~Ser~Ser-Ser~Lys~A.la"Pro-Pro~Pro~Ser--Leu-Pro-

Se r-Pro-Ser~Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Iie-

Leu-Pro-GIn

(Struktur IV)

Th r- Cy s - As p- äs p- P r o-Ar g- Phe - G In- As p~ S e r - S e r~ S e r ·- Ly s -

AIa-Pro-Pro-Pro--Ser- Leu-Pro- Ser-Pro-Ser-- Arg- Leu~Prc- GIy-

P iro-Pro~ As x—Th r~Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser- Leu-Pro

(Struktur V)

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Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-

* *
Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx—Thr-Pro-

He-Le u-Pro-Gln-Ser- Leu-Pro

(Struktur VI)

Solche Strukturen können mit Hilfe von rein synthetischen Methoden oder mit Hilfe des enzymatischen Abbaus entsprechender Polypeptide [Carlson et al., J. Biological Chemistry, 2j84 (19), 6810 (1973)] erhalten werden. Eine Polytyrosinkette kann ebenfalls zu den Strukturen III bis VI hinzugefügt werden und das erhaltene Polypeptid erfindimgsgeio.äss modifiziert v/erden.

Eine anders Gruppe von Polypeptiden, die erfindungsgemäss modifiziert werden können, sind spezifische nicht hormonella Proteinantigene, die aus dem Placentagewebe isoliert v/erden können.

Andere Proteine, die erfindungsgemäss modifiziert werden können und zuraktiven Immunisation bsi der Behandlung verschiedener Krankheitsstadien und Krenkheiten verwendet werden können, beeinhalten Gastrin. ein hormonales Polypeptid, das als Angiotension II bekannt ist, Wachstumshormone _t Soir.atomedian, Parathyroidhornicne, Insulin, Glucagon, Thyroid stimulierende Horr.icne (TSH) und Sekretin.

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Das Ausmass der chemischen Modifizierung der Polypeptide soll erfindungsgeraäss so sein, dass die erhaltenen Antigene die Bildung von Antikörpern induzieren, die nicht nur die Antigene, sondern zumindest auch einige ihrer natürlichen endogenen Gegenstücke neutralisieren, wobei die Art der Modifikation von dem spezifischen Problem als auch von der Natur des betreffenden Polypeptides abhängt. Falls die Modifikation zu geringfügig ist, kann der Körper das modifizierte Pclypeptid nicht als fremden Eindringling erkennen und deshalb dagegen auch nicht Antikörper bilden* Falls jedoch die Modifikation zu weitgehend ist, wird der Körper spezifische Antikörper zv. dem injizierten Antigen bilden, die das natürliche endogene Protein nicht zu neutralisieren vermögen.

Im allgemeinen erfolgt die chemische Modifikation durch Hinzufügen von fremden modifizierenden Gruppen zu den in Frage kommenden Polypeptiden (Bapten-Kupplung). Die Zahl der fremden modifizierenden Gruppen, die zugegeben werden kann, hängt von den Umständen ab, beispielsweise verwendet man 1-40, vorzugsweise 2-40, insbesondere 5-30, zweckmässigerweise jedoch 10-26 modifizierende Gruppen für jedes Peptidmolekül. Die modifizierenden Gruppen werden an bestimmten Stellen der Aminosäure-Gruppen des Peptidmoleküis gebunden, so dass die maximale Zahl einer bestimmten modifizierenden Gruppe, die an ein bestimmtes Polypeptid gebunden v/erden kann, berechenbar ist. Die Art der modifizie-

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renden Gruppen kann dementsprechend ausgewählt werden. Es ist auch möglich, dass verschiedene modifizierende Gruppen aneinander gebunden und dann in eine bestimmte Aminosäuregruppe eingeführt werden, doch wird dies gemäss der vorliegenden Erfindung als eine Substitution durch eine einzige modifizierende Gruppe betrachtet.

Die modifizierenden Gruppen können abhängig von den Umständen unterschiedlich sein, Geeignete modifizierende Gruppen sind beispielsweise Diazogruppen. Diese können durch Umsetzung mit einer geeigneten Anzahl von Molen der Diazosulfaniiinsäure eingeführt werden. Die Einführung von Diazogruppen in Proteine ist eine bekannte Technik und kann beispielsweise durchgeführt v/erden, wie beschrieben,bei cinader et al. , J. Am. Chem. Soc. 78./ ⁷⁴⁶ (1955) _f Phillips 'et al. , J. Biol. Chem. 2J1> ⁵⁷⁵ (1969), Tabachnick et al., J. Biol. Chem 234(7) , 1726 (1959) oder Crampton-et al., Proc. Soc. Ex. Biol. & Medo _80, 448 (1952). Im allgemeinen werden die Verfahren von Cinader et al. und Phillips et al. bevorzugt,

Zusätzliche modifizierende Gruppen sind diejenigen, die bei der Umsetzung der Polypeptide mit Dinitrophenol, Tri- nitrophenol, S-Acetoraercaptobernsteinsäureanhydrid, PoIytyrosin oder Polyalaninen (sowohl geradekettige als verzweigte Gruppen), bioabbaubarem Polydextran oder, weniger bevorzugt, natürlichem Protein, wie Thyroglobulin, erhalten werden. Im allgemeinen sind synthetische Modifizierungsmittel den natürlichen Modifizierungsmitteln vorzuziehen.

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Sowohl die obigen Umsetzungen als auch viele andere Hapten-Kupplungsreaktionen sind in der Proteinchernie bekannt. Im Zusammenhang damit sei auf folgende Literaturstellen hingewiesen:

1. Klotz et al. , Arch. Biochem. & Biophys. 9j6, 605-612 (1966),

2« Khorana, Chem. Rev. 5J3, 145 (195 3) ,

3. SeIa et al., Biochem. J. 85_, 223 (1962),

4. Eisen et al., J. Am. Chem. Soc. 75.» 4533 (1953),

5. Certano et al., Fed. Proc, (ABSTR₅) _25/ 729 · (1966) ,

6. Sokolowski et al., J. Am. Chem. Soc, j86_ 121.2 (1964),

7. Goodfriend et al. Science 144, 1344 (1964),

8. SeIa et al., J. Am. Chem, Soc. 2Jl· ^74β (19S5), 9ν Bahl, J. Biol. Chem, Z44, 575 (1969).

Die chemische Modifizierung kann andererseits oder zusätzlich auch aus der Entfernung vor. Gruppen aus den Polypeptiden bestehen. Falls beispielsweise bestimmte natürliche Proteine Kohlenhydrate besitzen, so können diese auf an sich bekannte Weise unter Verwendung von beispielsv?eise H-Acetyineurairdni·- dase oder N-Acetylglucosidase, d. i. Verbindungen, die bekannt sind zur Entfernung spezifischer Kohlehydratreste, ent fe rnt werden,

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Wie oben angegeben, werden die modifizierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung als Antigene bei der aktiven Immunisation zum Zweck der Kontrolle oder Behandlung verschiedener physiologischer Prozesse verwendet. Insbesondere werden die modifizierten proteinartigen Fortpflanzungshormone oder deren Fragmente der vorliegenden Erfindung als Antigene in der aktiven Immunisierung zum Zwecke der Fruchtbarkeitskontrolle verwendet. Durch Verabreichung dieser Verbindungen v/erden Zintikörper gebildet, die nicht nur die Antigene, sondern auch die natürlichen endogenen Proteine der Fortpflanzungshormone , die wesentlich sind für den normalen Ablauf des Fortpflanzungsprozesses, neutralisieren, wodurch der natürliche Prozess der Empfängnis und/oder der öcnvrangerschaft unterbrochen wird. Diese Antigene können deshalb in der Empfängnisverhütung und zur Beendigung dar Schwangerschaft kurz nach der Empfängnis verwendet werden. Die spezifischen nicht hormonalen Proteinantigene, der aus dem Plazentagewebe isolierten und entsprechend der vorliegenden Erfindung modifizierten Proteine, sind für die vorliegende Verwendung ebenfalls angezeigt. Es hat sich, gezeigt, dass die Inhibierung der Substanzen, die plazentagevebespezifisch sind, und keine ähnliche antigene Wirkung haben, wie Antigene anderer Organe, zu einer Beendigung einer Schwangerschaft durch passive Immunisation führen kann. Solche spezifischen Plazentagswebesubstanzen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung modifiziert sind, können in den Körper der gleichen Spezies als ein

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Mittel der Empfängnisverhütung durch aktive Immunisation injiziert werden. Der Vorteil dieser Substanzen besteht darin, dass die Plazentaantigene den nicht schwangeren Frauen fremd sind, und es ist deshalb nicht zu erwarten, dass dadurch eine Kreuzreaktion oder eine Störung der normalen Körperfunktion der nicht schwangeren Frauen stattfindet. Es versteht sich von selbst, dass, obzwar die Methoden zur Fruchtbarkeitskontrolle meistens bei Frauen angewendet werden, bestimmte Antigene, insbesondere FSH, deren ß-Untergruppen und. deren Fragmente, soferne sie geinäss der vorliegenden Erfindung modifiziert sind, auch bei Männern angewendet werden können,

Gastrin, das gemäss der vorliegenden Erfindung modifiziert wurde, kann in der Behandlung von Verdauungsstörungen, die unter dem Namen "Zollinger-Ellison Syndrom" bekannt sind, als Mittel zur aktiven Immunisation verwendet v/erden= Dieses Syndrom wird allgemein als ein Zustand beschrieben, der eine Hypersekretion des Polypeptidgastrins hervorruft, Das Polypeptidgastrin wird in der Pankreas erzeugt und bewirkt bei Hypersekretion im Magen einen Zustand der Uebersäuerung·, der zu chronischen Verdauungsstörungen führt. Eine Injektion des modifzierten Gastrins steigert die Eildung von Antikörpern gegen die Hypersekretion von Gastrin, wodurch der Krankheitszustand gebessert wird, ohne dass die Notwendigkeit eines chirurgischen Eingriffes, der bisher das einzig wirksame Mittel der Heilung darstellte, auftritt»

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Angiotension II kann, falls es gemäss der vorliegenden Erfindung modifiziert wird, als Antigen zur Behandlung der Hypertension verwendet werden« Allgemein gesehen, werden als Hypertension ein abnormal hoher Blutspiegel oder Schwankungen des Blutdruckes bezeichnet, Der Blutdruck eines Individuums wird durch zahlreiche physiologische Prozesse im Körper kontrolliert. Die Hauptsubstanz dieses Reguliermechanismus ist ein hormonales Polypeptide das als.Angiotensicn II bekannt ist. In bestimmten Zuständen des hohen Blutdruckes (Hypertension) ist es schwierig, die Sekretion und dementsprechend den Anteil von Antiotension II im Kreislauf durch Medikamente zu kontrollieren. Durch entsprechende Modifikation dieses Hormons und nachfolgende Immunisierung mittels des gebildeten Antigens ist es möglich, die Sekretion von Angiotönsion II in Patienten mit chronisch erhöhtem Hormonspiegel zu reduzieren. Die voraussehbare und kontrollierte Reduktion des Anteils dieser Substanz wirkt sich günstig auf bestimmte Patienten mit chronischem Bluthochdruck aus*

Wachstumshormone und Somatorrteälnn sind, falls gemäss der vorliegenden Erfindung modifiziert, geeignet, als Antigene bei der immunoligischen Behandlung von Diabetes und damit im Zusammenhang stehenden UnregeIraässigkeiten des Kikro- und Makrogsfäss-Systems verwendet zu werden«.. Ueb lieh erweise ist die Behandlung von Diabetes beschränkt auf Diät und/oder eine Medikamentierung, die den Blutglukosespiegcai regulieren. In letzter Zeit erhaltene wissenschaftliche Resultate unterstützen die Auffassung, dass Wachstumshormone und SamatoKiedian (beide Polypeptide) einen Einfluss auf den Symptonkomplex dieser Krankheit besitzen.

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Die Antigene der vorliegenden Erfindung werden zweckmässigerweise zusammen mit pharmazeutisch geeigneten flüssigen Trägerstoffen parenteral verabreicht. Die zu verabreichende Dosis hängt von verschiedenen Faktoren ab, wobei die zu behandelnden Zustände und deren Schwere zu berücksichtigen sind. Im allgemeinen sind Einheitsdosen von 0,1 bis 50 mg angezeigt, die zweckmässigerweise 1-5 mal in Intervallen von 1-3 Wochen verabreicht werden sollen.

Wie angegeben, beruht die vorliegende Erfindung auf der Theorie, dass die chemische Modifikation von Proteinen, die wichtig sind für die Fortpflanzung oder Beeinflussung eines bestimmten Krankheitszustandes, diesen eine antigene Eigenschaft verleiht, so dass sie die Bildung von Antikörpern hervorrufen, die sumindest teilweise das endogene Protein zusätzlich zum Antigen neutralisieren, unter Berücksichtigung dessen wurden- Fortpflansungshormone verschiedener Spezies modifiziert und im Pavian, wie im Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Resultate zeigen, dass modifizierte Hormone nicht verwandter Spezies die erwünschten Resultate nicht liefern, während modifizierte Hormone der gleichen Spezies oder naher verwandter Spezies dies tun. Die Beispiele 2-9 beschreiben ebenfalls diese Erfindung.

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Beispiel 1:

Bei erwachsenen weiblichen Pavianen wurde während zumindest einem Menstruationszyklus die Art der im Urin enthaltenen Gestrcgene, Plasma und Progestine und in einigen Fällen das im Urin enthaltene LH untersucht. Nur diejenigen Tiere, die den normalen Typ dieser Hormone, zeigten wurden immunisiert. Die Kriterien für die Normalität dieser Hormone die Methoden der Tierhaltung sind bekannt und werden deshalb nicht beschrieben,

Gonadotropische__Prä]garate

Menschliches luteinisierend.es Hormon (HLH) - teilweise gereinigte Zubereitung aus menschlicher Hypophyse mit einer biologischen Potenz von 2,5 Einheiten/rag (NIH-LE-SIj.

Menschliches follikelstimulierendes Hormon (HFSH) - eine teilweise gereinigte Zubereitung aus menschlicher Hypophyse mit einer biologischen Potenz von 86 Einheiten/mg (NIH-FSH-SI).

Menschliches Chorion Gonadotropin (HCG) - eine höchst gereinigte Zubereitung aus menschlichem Schwangerenurin mit einer biologischen Potenz von 13 200 I.E./mg (2,- IPP-HCG) .

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Luteinisierendes Hormon des Affen (MLH) - eine rohe Zubereitung aus der Hypophyse von Resusaffen mit einer biologischen Potenz von 0,75 Einheiten/mg (NIH-LH-SI),

Luteinisierendes Hormon des Ochsen (OLH) (NIH-LH-S5).

Luteinisierendes Hormon des Pavians (BLH) - teilweise gereinigte Zubereitung aus der Hypophyse des Pavians mit einer biologischen Potenz von 1,1 Einheiten/mg (KIH-LH-SI).

Alle Zubereitungen mit Ausnahme der Zubereitung von OLH wurden im Laboratorium des Erfinders hergestellt. Die biologische Aktivität von LH und HCG wurde mit Hilfe des Eiers tock-As corbinsäure-Ent zugt.es tes gemessen, und die FSH-Zubereitung mit Hilfe des Eierstock-Vergrösserungstests untersucht.

Die Hormone wurden durch Kuppein mit Hapten in verschiedenen Verhältnissen von Hapten zu .Hormonen, wie von Cinader et al, (siehe oben) beschrieben, in Antigene verändert, Bas Cinader-Verfahren wird hier aus Gründen der Zweckmässigkeit besprochen f obzwar das von Phillips (siehe oben) beschriebene Verfahren unter bestimmten Bedingungen stabilere Bindungen ergeben kann. In diesem Verfahren wirken die Proteinhorgane als Träger und das Hapten wird daran mittels Biazobincung angekuppelt« Obzwar eine grosse Zahl von Haptengruppen an bestimmte Hormone angekuppelt wurde, verwendete man das gleiche Basisverfahren für jede Kombination. Es wurde gefunden, dass 15-35 Haptengruppen für jedes Hormonmolekül

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am zweckmässigsten sind für die Herstellung des Immunisierungsantigens. Die Basisreaktion bestand darin, dass mein das Hapten (Sulfanilsäure) in eine Lösung einer O_fll N Chlorwasserstoffsäure eintrug und das erhaltene Gemisch langsam tropfenweise einer l %igen Natriumnitrit-Lösung bei 4° C unter konstantern Rühren zufügte und damit diazotierte. Der Nachweis von freier salpetriger Säure im Reaktionsgemisch zeigte an, dass die Diasotierung vollständig war. Obzwar diese Reaktion bei 4° C durchgeführt wurde, beträgt der günstigste Texuperaturbereich für diese Reaktion normalerweise 0-6° C, hierbei wird die Temperatur von 4° C bevorzugt»

Die Kapten-Protein-Kupplung wurde durch Auflösen des Proteirihorruons in einsjn Alkali puffer bei pH 8,0 durchgeführt. Hierbei wird das diazotierte Hapten langsam zur Hormonlösung unter beständigem Rühren bei 4° C zugefügt. Der pH-Wert des Reakticnsgemisches wurde konstant überwacht und bei ca. 8,0 gehalten. Nachdem alles Hapten zugegeben war, wurde der pH-tfert schliesGlich auf 8,0 eingestellt und das Ge:nisch während 1-2 Stunden gerührt. Danach wurde es bei 4° C über Kacht stehen gelassen« Das Gemisch wurde arisch lies send während 6-8 Tagen gegen destilliertes Wasser diaiysiert, wobei nicht umgesetztes Hapten entfernst wurde.

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Obzwar die Zahl der Diazogruppen per Hormonmoiekül durch die Zahl der zugegebenen Mole von Hapten" und des umgesetzten Hormons gesteuert v/erden konnte, wurde eine parallele Kontrolle mit S~ markierter Sulfanilsäure durchgeführt, mit der Absicht, die genaue Zusammensetzung der Hapten-Protein-Muster nach jeder Diazotierung aufzufinden_t Die gleiche Hermonzusammensetzung, die für die Immunisierung verwendet-wurde, wurde für die Kontrolle herangezogen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde eine Probe dem Reaktionsgemisch entnommen und der verbleibende Teil dialysiert. Gleiche Anteile der dialysierten und der nicht dialysierten Lösungen wurden mit Hilfe der Flüssigkeitszintillation untersucht. Durch Vergleich der Resultate der dialysierten und nicht dialysierten Muster konnte man die Mole Hapten, die rait jedem Mol des Hormons gekuppelt haben, berechnen, da nicht umgesetztes Hapten durch Dialyse entfernt wurde. Bei dieser Berechnung wurde ein Molekulargewicht, von 30,. 000 für alle Gonadotropins us ammensetzungen angenommen.

Im Anschinass an die Dialyse wurden die Haptenhormone lyophilisiert und bei 4° C aufbewahrt. Diazo-HCG (35 Gruppen/ Molekül) und HLH (2.6 Gruppen/Molekül) wurden einer Untersuchung im Eierstock-ascorbinsäure-Entzungstest unterworfen, und es wurde gefunden, dass diese 62 bzw«. 85 % der Aktivität der unveränderten Hormone, aus denen sie entstanden waren, besitzen. Kein anderes Hormon wurde auf biologische Aktivität untersucht.

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Immuni s ierun gs\^re r fahren

Weibliche Paviane erhielten ihre Ausgangsiiranunisierung am dritten bis fünften Tag ihres Menstruationszyklus und die und 3. Injektion jeweils eine Woche voneinander getrennt. Die 4. Injektion wurde 2-3 Wochen nach der 3. gegeben. Einige Tiere erhielten auch eine 5. Injektion ca. 70-80 Tage nach der ersten Injektion. Alle Antigene wurden subcutan in einer Mannid-manoleat oder einer Erdnussclsuspension verabreicht. Die Antigendosen variierten bei jeder Injektion zwischen 3 und 5 mg. Die Injektionsorte wurden täglich während 5 Tagen nach jeder Immunisierung untersucht, um aufzufinden, ob lokale Reaktionen auftraten.

Registrierung der Wirkung der Immunisation

Täglich wurden 24 Stunden Urinproben, und öfters Serumproben während zumindest eines Menstruationszyklus vor der Immunisierung und im Anschluss an die Immunisierung gesammelt, um die Wirkung der Behandlung abschäbzen zu können. Die

(LH) des Urins, Oestrogene des Urins und

Plasmaprogestine wurden gemessen. Hierbei wurden in Serumproben f die nach der Immunisation entnommen wurden, durch Reaktion von 0,2 ml einer 1:1000 Serumverdünnung in einem Phosphat-Kochsalze-Puffer (pH 7,4) eines 0,5 %igen normalen Pavianserums mit 250 pg eines ü "" markierten Hormons_r Antikörper aufgefunden. Die Sera wurden sowohl mit unverändertem Immunisierungshormon und unverändertem Pavian LH zur Auffindung der Antikörper reagieren gelassen. Eine gereinigte Pavian LK-Zusammensetzung (1,9 χ NIH-LH-Sl) wurde als

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Antigenanzeiger verwendet. Antigen-Antikörperkomplexe wurden mit vom Ochsen stammenden Anti-Pavian-gamma-Globulin nach 24-stündiger Inkubation bei 4° C ausgefällt. Der Anteil der Antikörper wurde bezeichnet als pg der markierten Hormonbindungen. Als signifikante Antikörperanteile wurden diejenigen angesehen, die in der Lage sind 5 pg oder mehr des J markierten Antigens zu binden.

Die Antisera wurden durch Gelfiltration auf Sephadex G-200 unter Verwendung des Verfahrens von Fahey und Terry (Seite 36/ Experimental Immunology, F.A. Davies Co«_f Philadelphia, Pa₁ , 1967) fraktioniert, um den Anteil von IgM und IgG Antikörpern im Pavianserum festzustellen. Nachdem der IgG Anteil in diesem Verfahren Anteile von IgA und IgD Antikörpern enthielt, wurden nur die IgM Anteile und der Gesamttiter bestimmt. Die IgM Fraktion der Kolonne wurde J" Hormonen zur Umsetzung gebracht und die Bindungskapazität bestimmt. Die Volumina der fraktionierten Sera wurden einander angepasst, so dass die Anteile der Antikörper mit denen des ganzen Serums vergleichbar wurden.

Antikörper-Produktion

An den Injektionsstellen wurden im Anschluss an die Immunisierung keine signifikanten Reaktionen beobachtet. Bei 4 Gelegenheiten machte sich eine leichte Verhärtung (2-3 cm im Durchmesser) bemerkbar, insbesondere, wenn Mannid-manoleat als Vehikel verwendet wurde, die Rötung und Schwellung verschwand jedoch innerhalb von 4-5 Tagen.

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Antikörper gegen das immunisierende Antigen wurden innerhalb von 3-5 Wochen in allen Tieren festgestellt, Das Ausmass, die Bauer und die Kreuzreaktionsfähigkeit dieser Antikörper wurden festgehalten. Im allgemeinen wurde festgestellt, dass höhere Anteile an Antikörpern bei einer heterogenen Gonantropin-Immunisierung auftraten als bei einer homogenen Immunisierung.

Die Kre\izreaktionsfähigkeit der induzierten Antikörper mit Pavian LH wurde bei jedem Tier untersucht« Die Kreusreaktionsfähigkeit der Antisera bei hohen Anteilen wurde registriert. Obwohl eine relativ hohe Antikörper-Aktivität gegen menschliches LH und HCG gefunden wurde, sind relativ wenig Reaktionen mit Pavian LK aufgetreten» Eine intermediäre Kreuzreaktion, mit Anti-LH-Hormon des Ochsen und ein hoher Grad von Kreuzreaktionsfähigkeit mit Anti-LH-Serum des Affen wurden festgestellt« Menschliches Diazo-FSH-Serum war beim Pavian schwach antigenisch. Die Dauer der Antikörper-Produktion war im allgemeinen grosser bei der menschlichen und vom Schaf stammenden Gonadotropin-Immunisierung als bei solcher vom Affen oder Pavian stammenden *

Sehr hohe Antikörper-Anteile wurden bei der Gelegenheit erhalten, wenn die Antikörper hauptsächlich zum IgG-Typus überwechselten. Frühe Antikörper hatten grössere Anteile des IgM-Typus und waren im allgemeinen stärker kreuzreaktiν

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mit LH-Serum des Pavians. Die Aenderung in der Zusammensetzung der gesamten Antikörper-Population, insbesondere des IgM-Musters wurde aufgezeichnet von dem Zeitpunkt an, an dem Antikörper zum ersten Mal aufgefunden wurden. Merkliche Kreuzreaktivität zum Pavian-LH fiel auf in menschlichem Anti-Gonadotropin, wenn IgM in grossem Anteil vorhanden war, jedoch scharf zurückgedrängt wurde, als das Antiserum beinahe gänzlich zum IgG-Typus überwechselte. Dieses Zurückdrängen in der Kreuzreaktionsfähigkeit erfolgte nicht bei der Affen- und Pavianimmunisierung. Die Immunisierung des LH-Serums des Ochsen führte zu einem vorübergehenden Wechsel in der Reaktivität durch die Aenderung von IgM zu IgG.

Wirkung^ J3^yLi^££LJS2£H^

Die Wirkung der Immunisierung auf den Menstruationszyklus wurde bestimmt durch Beobachtung der Veränderung der Geschlechsthautanschwellung und der Anteile der Hypophysen und/oder Eileiterhormone. Unter Bezugnahme auf diese Parameter wurde die Verzögerung der Ovulation von der vorausberechneten Zeit,, bezogen auf den Kontroilzyklus, berechnet. Ein Tier, das mit HCG immunisiert wurde, hatte keinen ünterbruch in der Ovulation und ein anderes, das mit HFSH immunisiert wurde, hatte eine Verzögerung während eines Zykltas.. Zwei Tiere, denen HLH injiziert wurde, und zwei Tiere, die HCG injiziert bekammen hatten Ovulationsversögerungen, die zwei Menstruationszyklen äquivalent waren. Ein drittes Tier, das mit HLH immunisiert wurde, war um 86 berechnete Tage verzögert. Das LH-Serum vom Ochsen führte zu einer Immunisierung, die eine 88-tägige Verzögerung der Ovulation zvir Folge hatte,

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Die Immunisierung mit Diazoserum des Affen oder LH-Serum des Pavians führte zu längeren Verzögerungen des Menstruationszyklus. Die berechnete Verzögerung der Ovulation dieser beiden Tiere, die LH-Serum des Affen erhielten, betrug 146 und 122 Tage* die Tiere, die ein modifiziertes LH-Serurn des Pavians erhielten, zeigten eine Ovulationsverzögerung von 224 und 210 Tagen.

Die Wirkung auf spezifische Hormonschemen im Anschluss an die Immunisierung mit HLH in einem Tier wurde festgehalten. Der Intervall zwischen den Menstruationen wurde als ein Zyklus festgesetzt. Die im Urin enthaltenen Oestrogene und im Plasma enthaltenen Progestine zeigten an, dass während der Dauer der Immunisierung, die 85 Tage betrug, keine Ovulation stattgefunden hatte. Im Urin enthaltene Oestrogenanteile waren während der Behandlung erhöht, zeigten jedoch nicht ein typisches Muster. Plasmaprogestine wurden nicht erhöht, bis ungefähr zum 19.- Tag des ersten Zyklus nach der Behandlung. Sowohl die Oestrogen- als auch die Progestintypen wurden normal innerhalb der Grenzen während des zweiten Zyklus nach Behandlung« Der Anteil der Antikörper stieg von 35. Tag der Behandlung bis zum 2 89. Tag von der ersten Auffindung der Antikörper. Eine LH-Messung war,während der Zeit das Tier unter Beobachtung stand, nicht verfügbar, und keine Daten über die Plasma- oder Urinanteile dieser Hormone konnten erhalten werden.

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Hormonmuster, die nach einer Immunisierung mit Diazo-LH-Serum aufgetreten sind, wurden registriert. In diesem Tier waren die Antikörper-Anteile geringer und im allgemeinem weniger dauerhaft, als nach Immunisierung mit menschlichen Gonadotropinen» Während des Behandlungszyklus folgten die Anteile der Urinöstrogene und Plasmaprogestine dem normalen Muster, sie waren jedoch mengenmassig geringer als normal„ Die Muster des dem Urin entstammenden LH veränderten sich merklich infolge der Injektion von Diazo-LK während dieser Periode. Es wurde deshalb kein endgültiger Nachweis der Ovulation für den Beharidlungszyklus erbracht. Der erste Zyklus nach Behandlung dauerte 246 Tage₀ Während dieses Zyklus war das dem Urin entstammende LH und die Oestrogens erhöht am 35. bis 41«, Tag^ aber es fand anschliessend, keine Erhöhung der Plasmaprogestine statt, die. darauf hinweisen würden _f dass eine Ovulation stattgefunden hat. Im Anschluss an den 42, Tag dieses Zyklus fand keine signifikante Erhöhung in einem dieser drei Hormonanteile statt, bis sum 231, Tag, als signifikante Erhöhungen der urinöstrogene und des LK stattfanden,, Diesen Erhöhungen folgte drei Tage später eine Erhöhung im Plasmaprogestin, die auf die Gegenwart eines funktionierenden Gslbkcrperhormons hinwies. Ein zweiter Menstruationszyklus nach der Behandlung war von normaler Dauer und die endoctrinalen Muster waren normal.

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Die Anteile der Antikörper des unveränderten Pavian-LH-Serums erzielten die Maximalv/erte am 70. Tag des Zyklus nach Behandlung und blieben relativ konstant bis zum 190. Tag, als ein stätiger Abfall beobachtet wurde. Am 215. Tag dieses Zyklus konnten Antikörper kaum mehr entdeckt werden. Ungefähr 16 Tage später wurde ein LH-Serum-Anteil beobachtet, der einer normalen erhöhten Menge in der Mitte des Zyklus entsprach. So gesehen, schien das Tier die normale Funktion einer Hypophysen-Eierstockachse zu besitzen« Hormonale Muster der Tiere irit anderen heterogenen Gonadotropin- Immuni sat ionen waren ähnlich denen, die HLH erhielten, und die hormonalen Muster von Tieren, die LH von Testaffen oder Pavianen erhielten, 3n-";sprachen den Mustern von Tieren die LH des Pavians erhielte/: *

Diese Resultate bei Pavianen zeigten auf, dass die Modifizierung eines Fortpflanzungshormons nach der besprochenen Methode dieses antigenisch macht und die so erhaltenen Antikörper neutrale endogene Hormone neutralisierten, falls die natürlichen Hormone aus den Spezies erhalten wurden,, die pit Kodifizierten Hormonen immunisiert wurden»

ECG ist ein natürliches Hormon, das nur in schwangeren Frauen anzutreffen ist. HCG kann käuflich erworben werden. LH-Ro nacn ist immunologisch und biologisch identisch mit KCG-Hormon_f obwohl dieses chemisch verschieden ist*

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Nachdem diese biologisch identisch sind und HCG bereits im Handel gekauft werden kann, wurde angenommen/ dass die Wirksamkeit dieses Immunisierungsverfahrens durch Injektion modifizierter HCG in nicht schwangere Frauen und Registrierung der Blutanteile von LH, die die gebildeten Antikörper, sowohl LH als auch das modifizierte HCG^ neutralisieren würden, festgestellt werden könnte.

Frauen haben einen bestimmten LH-Anteile j der Anteil ist substanziell konstant bis zu der mittleren Periode zwischen den Menstruationszyklen bis knapp vor ,der Ovulation. An diesem Punkt steigt der LH-Anteil stark an und hilft die Ovulation auszulösen. Durch Messung des LH-Anteils und des AntikörperanteiIs kann man feststeilen, ob das Verfahren die Produktion von Antikörpern, die fähig sind, endogene Fortpflanzungshormone wie LH zu neutralisieren, bewirkte oder nicht*

Für die obige Studie wurde eine 27-jährige Frau ausgewählt. Die Hormone wurden erhalten, gereinigt und modifiziert. Menschliches modifiziertes Hormon (HCG) wurde injiziert« Es ist bekannt, dass Antikörper gegen HCG, auch gegen LH und auch gegen HCG v/irden. Der Immunisierungseffekt war erhöht, hauptsächlich durch Registrierung des Blutspiegels des LH-Hormons. Schliesslich wurden die Resultate bestimmt*

ORSGKiAL INSPECTED

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Bereitung der Hormone

Klinisches HCG, das man aus dem Urin Schwangerer erhalten hat, wurden von der Vitamerican Corp., Little Falls, New Jersey, geliefert. Dieses Material hatte eine immunologische Potenz von 2600 ΙΕ/mg. In diesem Präparat wurden Verunreinigungen entdeckt. Die Reinigung erfolgte mit Hilfe der Chromatographie und Eluierung. Die Fraktionen wurden dialysiert und lyophylisiert. Die am stärksten potente Fraktion enthielt ungefähr 7600 ΙΕ/mg, war jedoch heterogen, wie den Resultaten der Polyacrylamid-gel-electrophorese zu entnehmen· war.

Die Fraktion wurde anschiiesserid durch Gelfiltration weiter gereinigt. Die Eluierung zeigte zwei starke Proteinanteile. Das am stärksten wirksame HCG wurde im ersten Anteil gefunden und hatte eine immunologische Potenz von 13 670 ΙΕ/mg. Diese Fraktion wurde einer Polyacrylamid-gel-eiectrophorese unterworfen. Eine v/eitere Reinigung durch Gelfiltration zeigte keine Heterogenität des HCG mehr an» Dementsprechend wurden die für die Studie benötigten Materialien nach dem obigen Verfahren hergestellt«

Die Verunreinigung des gereinigten HCG wurde mit J getestet und für die Identifizierung verwendet« Ein Muster wurde mit Antisera gegen verschiedene Proteine zur Reaktion gebracht, nachdem diese als Verunreinigung auftreten könnten. Diese Proteine waren follikelstimulierende

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Hormone, manschliche Wachstumshormone, ganzes menschliches Serum, menschliches Albumin, Transferin, Alpha-1-globulin, Alpha-2-globulin und Orsomucoid« Keine feststellbare Bindung des gereinigten HCG wurde mit irgend einem Antiserum bei einer Verdünnung von 1:50 festgestellt. Diese negativen Resultate wurden gegen Bindungen entsprechender Proteins berechnet, wobei gezeigt werden konnte, dass die Verunreinigung, falls überhaupt vorhanden, geringer war als 0,005

Veränderung der Hormone

Hormone wurden verändert durch Kupplung mit Hapten (SuIfanilazo). Diese Methode kuppelt Haptenmoleküle an Proteine über die Aminogruppe des aliphatischen oder aromatischen Teils von Hapten. Die Zahl der Haptenmoleküle, die an das HCG-Molekül (Ha-HCG) gekuppelt wurden, konnte für diese Untersuchung reguliert werden, 40 Haptengruppen für jedes HCG-Molekül wurden verwendet, zur Herstellung des immunisierenden Antigens. Im Anschluss an die Haptenkupplung wurde das Ha-HCG sterilisiert und getestet.

Subjekt

Das Subjekt war vielgebärend und hatte ihre Fortpflanzungsfähigkeit durch vorhergehende beidseitige Tubenextirpation beendet. Sie war bei guter Gesundheit und hatte einen regelmässigen Menstruations.zyklus, Sie wurde einer kompletterärztlichen Untersuchung und einer Laboratoriumsbestimmurig einschliesslich Blutmessung, Urinmessung, Latexfixierung und Feststellung des Papanicolau-Abstrichs unterworfen. Sie zeigte keine Allergiem

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Zum Nachweis des normalen Funktionierens der Hypophysen-Eierstock-Achse vor der Immunisierung wurden Blutproben jeden Tag vom ersten Tag der Menstruation während 10 Tagen entnommen, dann täglich während 10 Tagen und schliess· lieh jeden Tag bis zur nächsten Menstruation, Es wurden Serumbestimmungen von FSH, LH, Oestron, Oestradiol und Progesteron durchgeführt. Diese Studien zeigten ein Ovulationsmuster.

Imraunis ie rungsprozeduren

10 mg des Ha-HCG-Antigens wurden in 1 ml Kochsalzlösung gelöst und mit dem gleichen Volums anteil OeI ernulgiert. Vor der Injektion wurden Kratztests auf Antigen und Vehikel durchgeführt« Die Immunusierung wurde in der Lutea!phase des Behandlungszyklus begonnen, um eine Superovulation durch verabreichtes HCG zu vermeiden. Vier Injektionen in einem 2-wöchigen Intervall wurden dem Subjekt verabreicht« Die ersten beiden wurden in OeI sübcutan (1 ml tu jeden Oberarm) verabreicht, die zwei letzten wurden in Salzlösung nur über intracutanen Weg gegeben. Nach jeder Injektion wurden Blutdruckmessungen durchgeführt und das Subjekt auf allergische Reaktionen beobachtet.

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Registrierung des Immunlsierungsef'fsktes

Blutproben wurden in einem wöchtenlichen Intervall entnommen, wobei 2'Wochen nach der ersten Injektion begonnen wurde, um die Gegenwart von humoralen und zellularen Antikörpern festzustellen. Nach Vervollständigung des Immunisationsplanes wurden Blutmuster gesammelt in der gleichen Art wie im Kontrollzyklus, um den Effekt der Immunisation auf die Hormonmuster des Menstruationszyklus abzuschätzen. Nachdem die Antikörper gegen HCG in gleicher Weise gegen LH und HCG reagieren, wurde LH festgesetzt als Index der Wirksamkeit des Verfahrens. Ein dritter Zyklus wurde in gleicher Weise 6 Monate nach der ersten Immunisierung untersucht» Nach Vervollständigung der Studie wurden Untersuchungen des Körpers und Beckens und Laboratoriuinsrr.essungeri wiederholt. Serumrruister der Kontrolle und des Zyklus nach Behandlung wurden für FSH, LH, Oes'cron, Oestradiol und Progesteron untersuchte Das Subjekt wurde auf eine verzögerte Hypertension vor der Immunisation und in 2·" Wochen-Intervallen, bis der Injektionsplan vollständig war, in einem in vitro Lymphocyten-Transformationstest untersucht*

Resultate

Es wurden vorübergehende Beziehungen der Serurnhypophysen und der gonadalen Hormone in den Kontrollzyklen des Subjektes festgestellt. Antikörpertiter gegen RCG wurden in Subjekt nach 2 Injektionen gefunden. Die Menstruation trat in regelnlässigen Intervallen während der Immunisierung auf.

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Im Anschluss an die erste Injektion in Mannid-manoleat trat ein Jucken und eine Schwellung des Injektionsortes auf. Nachfolgende intradermale Injektionen in Kochsalzlösung zeigten keine Reaktion, und es wurde deshalb angenommen, dass die lokalen Reaktionen durch Mannidmanoleat hervorgerufen wurden. Die Lymphocyt-Transformationstests in Plasmamustern waren negativ.

Im Zyklus nach Behandlung waren die grundlegenden follikularen und lutealen Phasen-LH-Anteile nicht merklich verändert. Sehr geringe Erhöhungen des LH-Anteiles in der Zwischenzyklusperiode wurden beobachtet im Vergleich zu den normalen starken Erhöhungen. Die FSH-Muster im Zyklus nach der Behandlung waren normal. Dies zeigte, dass die Antikörper die Aktion des endogenen LH neutralisierten. Das Subjekt zeigte ein Progesteronmuster einer Ovulation, jedoch erreichte relativ hohe Antikörpertiter gegen LH und HCG nach nur 2 Injektionen von Ha-KCG.

Das Subjekt wurde während eines weiteren Zyklus ungefähr 6 Monate nach der ersten Immunisierung untersucht. Es wurden signifikante Antikörpertiter gefunden. LH-Muster zeigten eine leichte Erhöhung bei Zyklusmitte. FSH-Muster waren normal. Dementsprechend wurde die Spezifitat der Anti-HCG-Antikörper gegen LH gezeigt, jedoch nicht gegen FSH.

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Beispiel 3

Es wurde eine weitere Frau von 29 Jahren für die Untersuchungen ausgewählt. Es wurden Hormone erhalten, gereinigt und modifiziert, wie im Beispiel 2 beschrieben. Diese modifizierten Hormone wurden dem Subjekt in der gleichen Art wie im Beispiel 2 beschrieben, verabreicht. Das Subjekt wurde registriert und getestet wie im Beispiel 2. .

Die erhaltenen Resultate waren ähnlich den im Beispiel 2 gefundenen Resultaten, mit der Ausnahme, dass

(1) der Anteil von Oestron und Oestradiol ziemlich normal war,

(2) das Subjekt merkliche Antikörper-AnteiIe spät im Nachimmunisationszyklus aufwies und

(3) in dem Zyklus, der 6 Monate später untersucht wurde, das Subjekt keine signifikante auf die Zyklusmitte hinweisende Erhöhung der LH-Werte zeigte.

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Beispiel 4:

Es wurde eine weitere 29-jährige Frau für die Untersuchungen ausgewählt. Die Hormone wurden erhalten und gereinigt und modifiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Das modifizierte Hormon wurde diesem Subjekt in der gleichen Art, wie im Beispiel 2 beschrieben, injiziert. Das Subjekt wurde gemessen und untersucht wie im Beispiel 2.

Die erhaltenen Resultate waren ähnlich den Resultaten, die im Beispiel 2 gefunden wurden mit der Ausnahme, dass

(1) die Grundlinien der LH-Anteile in der follikularen und lutealen Phase merklich erniedrigt waren im Zyklus nach Behandlung,

(2) keine Erhöhung des LH-Wertes in der Zyklusmitte erfolgte,

(3) Oestronanteile während der Follikularphase des Nach-Immunisationszyklus erhöht waren und

(4) während der 6 Monate dauernden Studie keine merkliche Erhöhung der LH-Anteile in der Zyklusmitte auftrat.

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Beispiel 5;

Eine andere Frau von 35 Jahren wurde für weitere Studien ausgewählt.

Die Hormone wurden erhalten, untersucht und modifiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Das modifizierte Hormon wurde injiziert in der gleichen Art, wie im Beispiel 2 beschrieben. Das Subjekt wurde gemessen und getestet wie im Beispiel 2.

Die Resultate waren ähnlich'den Resultaten,die im Beispiel 2 gefunden wurden mit der Ausnahme, dass

(1) die Grundlinien der LH-Anteile in der follikularen und lutealen Phase erniedrigt waren im Zyklus nach der Behandlung,

(2) sehr kleine Erhöhungen des LH-Wertes in der Mitte des Zyklus auftraten,

(3) die Anteile der FSH-Muster im Zyklus nach der Behandlung erniedrigt waren und

(4) die Anteile von Oestron und Oestradiol reduziert waren während der follikularen Phase der Postimmunisation.

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Beispiel 6 :

Eine Frau von 28 Jahren wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die Hormone wurden erhalten gereinigt und modifiziert wie im Beispiel 2 beschriebene Das modifizierte Hormon wurde injiziert, wie im Beispiel 2 beschrieben. Das Subjekt wurde gemessen und untersucht wie im Beispiel 2.

(1) die Anteile von LH in der lutealen und follikularen Phase im Zyklus nach der Behandlung niedriger waren,

(2) keine erhöhten Werte von LE-Serum in der Mitte des Zyklus beobachtet wurden,

(3) Oestronanteile in der follikularen Phase des Zyklus nach der Immunisation erhöht schienen und

(4) LH-Muster keine signifikante Erhöhung in der Mitte des Zyklus im 6-monatigen Zyklus nach der Immunisierung zeigten.

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Beispiel 7;

Eine 28-jährige Frau wurde für v/eitere Untersuchungen ausgewählt, Di.e Hormone wurden erhalten, gereinigt und modifiziert wie im Beispiel 2, Das modifizierte Hormon wurde injiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Das Subjekt wurde registriert und untersucht wie im Beispiel 2.

Die Resultate waren ähnlich den im Beispiel 2 erhaltenen Resultaten mit der Ausnahme, dass

(1) Antikörper-Titer gegen HCG bis nach 3 Injektionen nicht gefunden werden konnten,

(2) die'LR-Werte der follikularen und lutealen Phase im Zyklus nach der Behandlung erniedrigt waren,

(3) keine erhöhten Werte und auch keine Erhöhung der Werte von LH in der.Mitte des Zyklus beobachtet wurden,

(4) Gestronwerte während der follikularen Phase erhöht waren und

(5) keine merklichen Antikörper-Titer im 6-Monatszyklus gefunden wurden,

Die obigen Beispiele zeigen die Möglichkeit, dass durch Injektion von modifizierten Hormonen endogene Fort-

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pflanzungshormone neutralisiert werden, wobei hierbei eine Möglichkeit zur Verhinderung der Empfängnis oder der Beendigung einer Schwangerschaft geboten v/ird.

Beispiel 8;

Daten, die in früheren Experimenten erhalten und in den Beispielen 1 bis 7 diskutiert wurden, zeigen, dass ein modifiziertes natürliches Fortpflanzungshormon, sobald es einem Tier der Spezies, der es entstammt, injiziert wird, Antikörper bildet, die die Wirkung von unmodifizierten endogenen Hormonen im Körper des Tieren neutralisieren. Die in den Untersuchungen der Beispiele 1-7 ver wendeten Hormone varan FSH, LH und HCG. Neue Experimente wurden durchgeführt, beruhend auf dieser Kenntnis, um andere Fortpflanζungshormone (plazentales Lactogen), das in der gleichen Art verwendet werden könnte, zu identifizieren.

Eine gereinigte Zubereitung des plazentalen Lactogens wurde aus dar Plazenta von Pcivianen erhalten. Es bestand die Absicht, modifiziertes Placenta.-Lactogen zur Immunisierung von Pavianen zu verwenden. Die Plazenta wurde extrahiert und das Extrakt mit Hilfe der KolonneηChromatographie gereinigt unter Verwendung von bekannten Verfahren. Die Reinheit wurde mit Hilfe von Polyacrylamidgei, Elektrophorese und radioimmunologischen Versuchen getestet* Das Material zeigte einen hohen Reinheitsgrad bei der Elektrophorese und im radioimraunologischen Versuch sowie keine weitere Verunreinigung mit anderen plazeritaien Hormonen.

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Hormonrrtodifizierung und Immunisierung

Das Plazenta-Lactogen (BPL) des Pavians wurde durch Kupplung mit dem Diazoniumsalz der Sulphanilsäure verändert, wie bereits für andere Hormone im Beispiel 1 beschrieben. Die Zahl der Diasornoleküle für jedes BPL-Molekül war 15. Die Immunisierungsverfahren entsprachen denjenigen des Beispiels 1 für andere Hormone.

Resultate

Innerhalb von 4-6 Wochen nach der ersten Injektion von Diazo-BPL wurden Antikörper-Anteile gegen natürliches unmodifiziert.es BPL in vitro bei 6 weiblichen Pavianen aufgefunden. Die /enteile wuchsen zu einem Plateau innerhalb von 8-10 Wochen und verblieben hier während rr.ehrer Monate. Hormonmessungen zeigten, dass hierdurch kein Einfluss auf den Menstruationszykius aufgrund dieser Immunisierung stattgefunden hat. Nachdem BPL normalerweise nur in der Schwangerschaft abgesondert wird, war dies keine überraschende Beobachtung.

Alle 6 weiblichen Paviane wurden mit männlichen Pavianen von nachgewiesener Fruchtbarkeit 3 mal zusammengebracht (jeweils 1 mal in 3 verschiedenen Zyklen während der Fruchtbarkeitsperiode) . Nach jeder Begattung wurde eine Schwangerschaftsuntersuchung durch Hormonmessung durchgeführt«

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Von 18 Begattungen führten 13 zur Empfängnis, wie mit Hilfe der Schwangerschaftsuntersuchungen festgestellt wurde. Die trächtig gewordenen Tiere bekamen Menstruationsblutungen 7-12 Tage später als für ihren normalen Menstruationszyklus zu erwarten war. Nachfolgende hormonale Untersuchungen zeigten, dass diese 13 Schwangerschaften durch Aborte ungefähr 1 Woche nach der zu erwarteten Menstruation beendet wurden.

Diese Resultate zeigen, dass die in den Tieren nach der Immunisierung gebildeten Antikörper keinen Einfluss hatten auf den Menstruationszyklus der nicht trächtigen Tieren, doch, sobald die Tiere trächtig wurden, diese das plazentale Lactogen der Paviane in der Plazenta neutralisierten und zu einem Abort bald nach der Empfängnis führten.

Falls in den obigen Beispielen 1-8 die Strukturen 1-7 durch Verwendung -/on Diazosulfonsäure, Dinitriphenol oder S-Ace-to-mercaptobernsteinsäure-anhydrid oder Strukturen iii-vi modifiziert werden, oder die Modifizierung durch Polytyrosin oder Polyalanin stattfand, erhielt man die gleichen Resultate.

In der gleichen Weise, führten FSH, Somatomedian, wachs-cuiushormone oder Antiotension II, die durch die Verwendung von Diazosulfani!säure oder Trinitriphenol modifiziert wurden, η ach des: Verabreichung des gereinigten modifizierten Polypeptids an einen männlichen oder weiblichen Menschen oder an ein männliches oder weibliches Tier zu einer

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24219Λ3

Stimulierung der Eildung von Antikörpern, die alle oder einige der modifizierten Polypeptide als auch die entsprechenden endogenen Polypeptide neutralisieren.

Beispiel 9t

Die Subjekte, die in diesem Beispiel untersucht wurden, waren weibliche Paviane. Alle Paviane waren erwachsen und im fortpflanzungsfähigen Alter. Eine Beschreibung der Subjekte und der Untersuchungsbedingungen enthält das Beispiel 1* Die Tiere wurden untersucht unter Verwendung von hochgereinigten ß-Untergruppen von HCG unter Verwendung einer Zubereitung mit einer biologischen Aktivität von weniger als 1 ΙΕ/mg. Dia Tiere wurden immunisiert mit 14-26 Mol/ Mo1-Sulfonsäure-Polypeptid-Untereinheiten in Mannidmanoleat,

Antikörperanteile wurden geschätzt durch Festeilung der

1°5 Bindung von Serumverdümrangen mit J " markierten Antigenen. Die Kreuzreaktionsfähigkeit der Antisera wurde durch direkte Bindung markierter Antigene und durch radio*- immunologische Untersuchungen gemessen. Eine Fruchtbarkeitshemmende wirkung bei aktiv-immunisierten Tieren wurde festgestellt nach Begattung der Weibchen durch Männchen roit nachgewiesener Fruchtbarkeit. Die Effekte in trächtigen Pavianen, die entweder mit Schaf- oder Pavian-anti-ß-HCG passiv immunisiert wurden, wurden festgestellt durch Registrierung der Serumanteile von Gonadotropinen und Geschlechtshormcnen vor und nach der Immunisierung.

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8 v/eibliche Paviane wurden mit modifizierten ß-Subgruppen von HCG immunisiert. Merkbare Anteile an Antikörpern wurden in allen Tieren erreicht.

Eine P avi aniinmuni s ie rung mit modifizierten ß-Subgruppen von HCG führten zu hohen Antikörper-Anteilen gegen HCG _f menschliches LH und CG des Pavians, jedoch nicht gegen LH des Pavians. Alle Tiere blieben ovulationsfähig, jedoch keine Schwangerschaften ergaben sich aus zahlreichen Begattungen mit männlichen Tieren nachgewiesener Fruchtbarkeit. Eine passive Immunisierung von nicht iirjnunisierten trächtigen Pavianen mit Schaf-anti~ß-HCG führte zu Aborten innerhalb von 36-44 Stunden.

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Claims

- 43 - 118-3329 · Patentansprüche

1. Antigen zur Verwendung in der aktiven Immunisierung zur Kontrolle und Behandlung von physiologischen Prozessen in bestimmten Spezies, das aus einem chemisch modifizierten Polypeptid besteht, wobei das chemisch modifizierte PoIypeptid von einem endogenen Polypeptid abgeleitet ist, das solche physiologischen Prozesse in dieser Spezies beeinflusst bzw. das" immunologisch äquivalent ist einem so erhaltenen eheEdseh. modifizierten Polypsptid, v/obei die chemische Modifizierung derart ist, dass sie den·, chemisch modifizierten Polypeptid erlaubt, in dieser Spezies die Bildung von Antikörpern su verursachen _t die sowohl das endogene Polypeptid als auch das chemisch modifizierte Polypeptid biologisch neutralisieren.

2. Antikörper gebildet in der Spezies als Reaktion auf die Anwesenheit eines Antigens gemass Anspruch 1«

3o Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Antigen gemäss Anspruch 1.

4. Verfahren zur Herstellung eines Antigens zur Verwendung in der aktiven Immunisierung -zur Kontrolle oder Behandlung von physiologischen Prozessen in bestimmten Spezies dadurch gekennzeichnet, dass man endogene Polypeptide, die solche physiologischen Prozesse beeinflussen, oder Polypeptide,

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die, sobald sie modifiziert sind, solchen modifizierten endogenen Polypeptiden äquivalent sind, in solch einem Ausmass modifiziert, dass es den modifizierten Polypeptiden möglich ist, in dieser Spezies die Bildung von Antikörpern zu verursachen, die sowohl das endogene PoIypeptid als auch das modifizierte Polypeptid zu neutralisieren vermögen.

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