CH622426A5 - Contraceptive composition - Google Patents
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Description
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PATENTANSPRUCH Empfängnisverhütungsmittel zur aktiven Immunisierung gegen die Fortpflanzung bei Mensch und Säugetier, das als Wirkstoffkomponente ein biologisch déterminantes Peptid eines biologisch aktiven Proteins enthält, welches Peptid chemisch zu einem künstlichen Antigen modifiziert ist, das in Menschen und Säugetieren die Bildung von Antikörpern verursacht, die sowohl das biologisch aktive Protein als auch das modifizierte Peptid biologisch neutralisieren, dadurch gekennzeichnet, dass in der Wirkstoffkomponente das biologisch determinante Peptid ein solches der protein-reproduzierenden Hormone follikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Plazenta-Lactogen (HPL), menschliches Prolactin oder menschliches Chorionic-Gonado-tropin (HCG) ist.
Die Erfindung betrifft ein Empfängnisverhütungsmittel zur aktiven Immunisierung gegen die Fortpflanzung bei Mensch und Säugetier, das als Wirkstoffkomponente ein biologisch déterminantes Peptid eines biologisch aktiven Proteins enthält, welches Peptid chemisch zu einem künstlichen Antigen modifiziert ist, das in Menschen oder Säugetieren die Bildung von Antikörpern verursacht, die sowohl das biologisch aktive Protein als auch das modifizierte Peptid biologisch neutralisieren.
Die künstlichen Antigene sind in der Lage, Antikörper zu bilden, indem die Antikörper nicht nur die antigenisch modifizierten, biologisch determinanten Peptide, sondern auch die unmodifizierten Peptide neutralisieren. Es kann angenommen werden, dass die Immunisation auf der Unfähigkeit der Antikörper beruht, zwischen den antigenisch modifizierten, biologisch determinanten Peptiden und den unmodifizierten Peptiden zu unterscheiden. Unter biologisch determinanten Peptiden werden sowohl die natürlichen, biologisch aktiven Proteine der betreffenden Spezies als auch solche Peptide verstanden, die strukturell den gleichen oder nahezu gleichen Aufbau besitzen wie in den natürlichen Proteinen vorhanden ist und die biologisch eine gleichartige Aktivität aufweisen. Die zu modifizierenden Peptide können synthetischen Ursprungs sein, stammen jedoch praktisch aus den betreffenden Spezies oder aus nahe verwandten Spezies. Solche Peptide sind in chemischer und physikalischer Hinsicht genügend gross und unterscheidungskräftig, um als biologisch déterminant erkannt zu werden.
Immunisierungsmittel wie die vorher erwähnten sind bekannt aus der britischen Patentschrift 1 058 828. Gemäss dieser Patentschrift werden biologisch determinante Peptide von biologisch aktiven Proteinen durch chemische Kupplung modifiziert, wodurch Antigene erhalten werden. Die Antigene werden bei Tieren injiziert und die Antikörper der aus den Tieren gewonnenen Antisera werden bei Menschen zu ihrer passiven Immunisation eingesetzt.
Bisher sind jedoch keine solchen Mittel bekannt, die zur Empfängnisverhütung bei Menschen und Säugetieren dienen und dabei zur aktiven Immunisierung eingesetzt werden können.
Es ist bekannt, dass Polypeptide, insbesondere Proteine, für viele physiologische Prozesse verantwortlich sind bzw. zu diesen beitragen oder sie beeinflussen. Beispielsweise ist es bekannt, dass bestimmte Proteinhormone wesentlich sind für den normalen Fortpfianzungsprozess.
Die Regulierung solcher Fortpflanzungsprozesse durch Immunisierung, d.h. durch Verabreichung von Antigenen, ist nun Anwendungszweck der vorliegenden Erfindung. Durch Verabreichung von künstlichen Antigenen werden Antikörper gebildet, die diejenigen Proteine neutralisieren bzw. biologisch inaktivieren, die verantwortlich sind für solche Prozesse bzw. zu diesen beitragen oder sie beeinflussen.
Die Immunologie als ein Mittel zur Kontrolle der Fort-s pflanzung war bereits Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. R. G. Edwards gibt in seiner Arbeit «Immunology of Conception and Pregnancy» (British Medicai Bulletin, 26, 72-78 [1970]) eine Übersicht über die auf diesem Gebiet erschienen Literatur, die sich mit der Bildung und der Verwen-lo dung von Antikörpern gegen Testikel und Spermien befasst. Hormonale Antikörper wurden auch während vieler Jahre untersucht, und die Wirkungen spezifischer Antisera registriert. Die meisten Untersuchungen der Empfängnisverhütung auf immunologischem Gebiet bezogen sich jedoch auf eine 15 passive Immunisation, d. h. auf eine Injektion von Antikörpern, die in natürlicher Weise anderswo gebildet wurden. Die passive Immunisation hat jedoch in der Menschenbehandlung Grenzen, nachdem eine wiederholte Injektion von tierischen Antikörpern beim Menschen unerwünschte Nebenreaktionen 20 hervorrufen kann.
Gegenstand der Erfindung sind nun Mittel, in denen die Wirkstoffkomponente das biologisch determinante Peptid ein solches der protein-reproduzierenden Hormone follikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), 25 menschliches Plazenta-Lactogen (HPL), menschliches Prolactin oder menschliches Chorionic-Gonatropin (HCG) ist.
Spezifische biologisch determinante Peptide, die modifiziert werden, enthalten die ß-Untereinheit von FSH und spezifische Peptideinheiten des natürlichen HPL oder menschlichen 30 Prolactins, wobei die Einheiten solche Proteinhormonteile sind, die nur eine geringe Ähnlichkeit mit Peptiden anderer Proteinhormone besitzen. Bevorzugte biologisch determinante Peptide sind die /3-Untereinheiten von HCG, die entweder die Struktur I oder II besitzen.
35
* bedeutet den Ort der Kohlehydratgruppen
10
Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-40 * 20
Asn-Ala-Thr-Lau-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys-IIe-Thr-Val-Asn-Thr-Thr-Ile-Cys-Ala-Gly-Try-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val-Leu-50 60
45 Pro-Ala-Leu—Pro-Gin—Val-Val-Cys-Asn-Try-Arg-Asp-
70
Val-Arg—Phe-Glu-Ser—Ile—Arg-Leu-Pro-Gly-Cys—Pro-
80
Arg-Gly—Val-Asn—Pro-Val-Val-Ser—Tyr—Ala—Val—Ala-50 90
Leu-Ser-Cys-Gln-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-Arg-Ser-Thr-100
Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr-110 120 «
ssCys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-* 130 *
Lys-Ala—Pro-Pro-Pro-Ser—Leu—Pro-Ser-Pro-Ser—Arg-* 140
Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln
60
(Struktur I)
10
Ser-Lys-Gln-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-65 « 20
Asn-Ala-Thr—Leu—Ala-Val-Glu-Lys-Glu-GIy-Cys-Pro-29 «
V al-Cy s-Ile-Thr-V al-Asn-Thr-Thr-Il e-Cy s-A la-G ly-Ty r-
3
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40
Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val-Leu-50 60
Pro-Ala-Leu-Pro-Glx-Leu-Val-Cys-Asn-Tyr-Arg-Asp-
70
Val-Arg-Phe-Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro-Gly-Cys-Pro-
80
Arg-Gly-Val-Asn-Pro-Val-Val-Ser-Tyr-AIa-Val-Ala-90
Leu-Ser-Cys-Gln-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-(Arg)-Ser-Thr-100
Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr-110 * 120
Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-
* 130 *
Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-
140
Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-
147 Leu-Pro
(Struktur II)
Für die Spezifität der Antikörperwirkung ist es wünschenswert, dass Peptide modifiziert werden, die hinsichtlich ihrer Molekularstruktur völlig oder substanziell verschieden sind von anderen Proteinhormonen. Beispielsweise enthält die /^-Untereinheit von HCG eine oder mehrere Aminosäureketten, die sich stark von denen von LH unterscheiden, wobei diese Ketten ebenfalls modifiziert werden können. Solche Ketten beeinhalten 20 bis 30 oder 30 bis 39 Aminosäurepepti-de, die aus C-Terminalresten der -Untergruppe von HCG bestehen. Vorteilhaft sind hierfür die in den nachfolgenden Formeln III und IV (C-terminale Anteile der Struktur I) und V und VI (C-terminale Anteile der Struktur II) beschriebenen Ketten geeignet:
*
Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-* *
Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-%
Gly-Pro-Ser-Asp—Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln
(Struktur III)
* *
Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-AIa-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-
Pro-Ser-Pro-Ser—Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln
(Struktur IV)
Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-
* *
Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro
(Struktur V)
Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-
* $
Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro
(Struktur VI)
Insbesondere sind die chemisch modifizierten Peptiden der nachfolgenden Formeln VII, Vili, IX und X als Wirkstoffkomponente brauchbar. Infolge ihrer substantiellen Ähnlichkeit mit der chemischen Struktur und Konfiguration von HCG 5 und der immunologischen Wirkung, die sie nach der Modifizierung entfalten, können diese Peptide als biologisch determinante Peptide von HCG angesehen werden.
Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-io Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser—Asp— Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln
(Struktur VII)
15
Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Gly
(Struktur VIII)
20
Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-25 Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro
(Struktur IX)
30 Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-GIy-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro.
35 (Struktur X)
Solche Peptide können mit Hilfe von rein synthetischen Methoden oder mit Hilfe des enzymatischen Abbaus entsprechender Polypeptide [Carlson et al., J. Biological Chemistry, 40 248 (19), 6810 (1973)] erhalten werden. Eine Polytyrosinkette kann ebenfalls hinzugefügt werden und das erhaltene Polypeptid modifiziert werden.
Die Art und Weise der Modifizierung ist in der Immunbiologie bekannt.
45 Das Ausmass der Modifizierung der biologisch determinanten Peptide wird in der Immunbiologie gewöhnlich so weit fortgesetzt, bis die modifizierten Peptide die Bildung von Antikörpern induzieren, die nicht nur die modifizierten Peptide, sondern zumindest auch die natürlichen unmodifizierten 50 Proteine neutralisieren, wobei die Art der Modifikation von dem spezifischen Problem als auch von der Natur des betreffenden Proteins abhängt. Wenn eine viel zu geringe Modifizierung erfolgt, kann der Körper das modifizierte Peptid als einen fremden Eindringling nicht erkennen und wird deshalb dage-55 gen auch keine Antikörper bilden. Falls anderseits eine zu starke Modifizierung erfolgt, wird der Körper Antikörper bilden, die gegen das injizierte Antigen wirksam sind, die jedoch nicht mehr das natürliche Protein, d.h. HCG, neutralisieren.
Die chemische Modifikation erfolgt z. B. durch Hinzufügen 60 von fremden modifizierenden Gruppen zu den in Frage kommenden polyfunktionellen Peptiden (Hapten-Kupplung). Die Zahl der fremden modifizierenden Gruppen, die zugegeben werden können, hängt von den Umständen ab, beispielsweise verwendet man 1 bis 40, vorzugsweise 2 bis 40, insbe-65 sondere 5 bis 30, zweckmässigerweise jedoch 10 bis 26 modifizierende Gruppen für jedes Peptidmolekül. Die modifizierenden Gruppen werden an bestimmten Stellen der Aminosäuregruppen des Peptidmoleküls gebunden, so dass die maximale
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4
Zahl einer bestimmten modifizierenden Gruppe, die an ein bestimmtes Peptid gebunden werden kann, berechenbar ist. Die Art der modifizierenden Gruppen kann dementsprechend ausgewählt werden. Es ist auch möglich, dass verschiedene modifizierende Gruppen aneinander gebunden und dann als monofunktionelle Gruppe in eine bestimmte Aminosäuregruppe eingeführt werden, doch wird dies als eine Substitution durch eine einzige modifizierende Gruppe betrachtet.
Die chemische Modifizierung kann jedoch anderseits auch durch Bindung von 2 und mehr Polypeptidmolekülen an eine polyfunktionelle Modifizierungsgruppe erfolgen.
Sofern in der vorliegenden Patentschrift von der Bindung von modifizierenden Gruppen mit Peptiden gesprochen wird, so kann die Bindung direkt über ihre funktionellen Gruppen oder über einzuführende Verbindungsgruppen erfolgen.
Die modifizierenden Gruppen können, abhängig von den Umständen, unterschiedlich sein. Als geeignete modifizierende Gruppe sind beispielsweise substituierte Diazogruppen bekannt. Diese können durch Umsetzung mit einer geeigneten Anzahl von Molen der Diazosulfanilinsäure eingeführt werden. Die Einführung von Diazogruppen in Proteine ist ebenfalls eine bekannte Technik und kann beispielsweise durchgeführt werden, wie beschrieben, bei Cinader et al., J. Am. Chem. Soc. 78, 746 (1955), Phillips et al., J. Biol. Chem. 244, 575 (1969), Tabachnick et al., J. Biol. Chem. 234 (7), 1726 (1959) oder Crampton et al., Proc. Soc. Ex. Biol. & Med. 80,448 (1952). Im allgemeinen werden die Verfahren von Cinader et al. und Phillips et al. bevorzugt.
Andere ebenfalls bekannte modifizierende Gruppen sind diejenigen, die bei der Umsetzung der Peptide mit Dinitro-phenol, Trinitrophenol, S-Acetomercaptobernsteinsäureanhy-drid, Polytyrosin oder Polyalaninen (sowohl geradkettige als verzweigte Gruppen), bioabbaubarem Polydextran oder -weniger bevorzugt - natürlichem Protein, wie Thyroglobulin, erhalten werden.
Sowohl die obigen Modifizierungen als auch viele andere sind in der Proteinchemie bekannt. Im Zusammenhang damit sei auf folgende Literaturstellen hingewiesen:
1. Klotz et al., Arch. Biochem. & Biophys. 96, 605-612 (1966),
2. Khorana, Chem. Rev. 53,145 (1953),
3. Sek et al., Biochem. J. 85, 223 (1962),
4. Eisen et al., J. Am. Chem. Soc. 75,4583 (1953),
5. Centeno et al., Fed. Proc. (ABSTR.) 25, 729 (1966),
6. Sokolowski et al., J. Am. Chem. Soc. 86,1212 (1964),
7. Goodfriend et al. Science 144,1344 (1964),
8. Sela et al., J. Am. Chem. Soc. 78, 746 (1955),
9. Bahl, J. Biol. Chem. 244, 575 (1969).
Noch andere geeignete Modifizierungsgruppen sind solche aus polymerisiertem Zucker, Serumproteinen, Keyhole-lim-pet-hemocyanin, Marin-Gastropod Mollusken, Viren oder vom Rind stammendem Gamma-Globulin. Von diesen Gruppen können eine oder mehrere mit dem protein-reproduktiv determinanten Peptid gekoppelt werden. Da sie polyfunktionell sind, können umgekehrt auch zwei oder mehr Peptid-Mo-leküle mit einer solchen Modifizierungsgruppe gebunden werden.
Geeignete polymerisierte Zucker zur Modifizierung der Peptide umfassen Copolymere von Saccharose mit Epichlor-hydrin, wie Ficoll 70 oder Ficoll 400 [Pharmacia Fine Chemicals, Pharmacia Laboratories Inc., 800 Centenial Avenue, Poscataway, N.J. 08854] oder eine Polyglucose, wie Dextran T70 [mikrobiologisch synthetisiert durch die Einwirkung von Leuconostoc Mesenteroides (einem Pilzstamm in NRRL B-512)] oder Saccharose. Glucan enthält a-l,6-glucosidische Bindungen. Geeignete Serumproteine umfassen homologes Serumalbumin oder vom Rind stammendes Serumalbumin, und geeignete Viren sind Influenza-Viren (Typen A, B oder C)
oder Poliomyelitis-Viren in lebendem oder getötetem Zustand (Typen 1, 2 oder 3).
Es sei darauf hingewiesen, dass die Modifizierung die Bindung der Modifizierungsgruppen an Peptide meistens über s Verbindungsgruppen umfasst, und dass dies erfolgen kann durch Reaktion des Peptids, des Modifizierungsmittels und des Verbindungsmittels (Aktivators), gleichgültig in welcher Reihenfolge mit oder ohne Schutz und nachfolgende Abspaltung der Schutzgruppen einer oder mehrerer reaktiver Gruppen im io Peptid oder im Modifizierungsmittel. Allgemein gesehen kann solch eine Kupplung in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielsweise wie in der obigen Literatur beschrieben.
Kupplungen, die mit den protein-reproduktiv determinanten Peptiden ausgeführt werden können, bestehen neben der 15 bereits erweiteten Diazokupplung aus der a) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, abstammen, an die protein-reproduktiv determinanten Peptide durch Aktivierung des Modifizierungsmittels bzw. des Peptids, das
20 modifiziert werden soll, durch Umsetzung mit Toluol-diisocy-anat und Umsetzung des erhaltenen aktivierten Produktes mit dem Peptid, das modifiziert werden soll, bzw. dem Modifizierungsmittel, oder b) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von Modifi-25 zierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, abstammen oder polymerisierte Zucker sind, an die protein-reproduktiv determinanten Peptide durch Konjugation des unmodifizierten Peptids mit dem Modifizierungsmittel, wobei ein wasserlösliches Carbodiimid als Aktivierungsmittel verwendet
30 wird, oder c) Bindung von Modifizierungsgruppen, die durch Umsetzung von Modifizierungsmitteln mit freien Aminogruppen mit Glutarsäuredialdehyd erhalten werden, an die protein-reproduktiv determinanten Peptide durch deren Umsetzung mit
35 dem zu modifizierenden Peptid in Gegenwart von Alkalimetallborhydrid, oder d) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polyme-risierten Zuckern stammen, an protein-reproduktive Peptide durch Umsetzung der polymerisierten Zucker mit einem
40 Cyanursäurehalogenid und Reaktion des erhaltenen Dihalo-triazinyl-Adduktes mit dem zu modifizierenden Peptid, oder e) Bindung von modifizierenden Gruppen, die von polymerisierten Zuckern stammen, an protein-reproduktiv determinante Peptide durch Behandlung der Zucker mit einem Alka-
45 limetallperjodat und Reaktion des erhaltenen Produktes mit dem zu modifizierenden Peptid.
Das im Abschnitt a) beschriebene Verfahren kann mit den Modifizierungsmitteln, die freie Aminogruppen enthalten, sowie mit Polytyrosin oder Polyalanin beispielsweise so durch-50 geführt werden, wie dies von Singer und Schick in J. Biophys. Biochem. Cytology 9, 519 (1961), beschrieben wird. Insbesondere wird das Modifizierungsmittel zweckmässigerweise in einer Pufferlösung, beispielsweise einem Phosphatpuffer in Natriumchloridlösung bei einem pH-Wert von beispielsweise 55 6-8 aufgenommen und die Lösung anschliessend mit Toluol-diisocyanat (TDIC) versetzt. Das Toluol-diisocyanat wird zweckmässigerweise verdünnt 1:10 bis 40 in Dioxan zugesetzt und die Menge des verwendeten Toluol-diisocyanats kann zweckmässigerweise von 0,075 bis 1000 Mol-Äquivalente 60 betragen. Die Umsetzung kann beispielsweise bei Temperaturen von -5 bis +10° C, vorzugsweise von 0 bis 4° C, durchgeführt werden, und die Reaktionsdauer kann beispielsweise von V2 bis 2 Stunden betragen. Ein Uberschuss von Toluol-diisocyanat wird danach durch Zentrifugierung entfernt, der Nie-65 derschlag mit dem obigen Phosphatpuffer gewaschen und die überstehenden Anteile vereinigt. Das aktivierte Modifizie-rungsmittel kann dann zweckmässigerweise zu einer Lösung des zu modifizierenden Peptids im gleichen Phosphatpuffer (5
5
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bis 30 mg/ml) zugefügt werden, wobei die Mengen des Modifizierungsmittels und des Peptids sich in dem Molverhältnis befinden sollen, das im gebildeten modifizierten Peptid gewünscht wird. Die in den vereinigten Lösungen befindlichen Substanzen werden zweckmässigerweise bei 30 bis 50° C, zweckmässigerweise 35 bis 40° C, während vorzugsweise 3 bis 6 Stunden miteinander zur Reaktion gebracht. Die Umsetzung kann jedoch auch so durchgeführt werden, dass die erste Stufe aus der Zugabe der Toluol-diisocyanat-Lösung zum gepufferten Peptid besteht und die Zugabe des gepufferten Modifizierungsmittels zum aktivierten Peptid sich anschliesst, wobei die Bedingungen der ersten und der zweiten Stufe oben beschrieben werden.
Die Modifizierungsmittel, die im Verfahren b) verwendet werden, das im allgemeinen von Moore und Koshland in J. Biol. Chem. 242, 2447 (1967), beschrieben wird, umfassen natürliche Proteine, wie Keyhole-limpet-hemocyanin, Serumproteine, wie homologes oder vom Rind stammendes Serumalbumin, polymerisierte Zucker, wie Ficoll (70 oder 40) oder Dextrane (Dextran T70), und Polyalanin oder Polytyrosin. Die zu modifizierenden Peptide werden zweckmässigerweise anfänglich durch Acetylierung ihrer Aminogruppen geschützt und anschliessend mit dem Modifizierungsmittel konjugiert, vorzugsweise in Gegenwart von Guanidin, beispielsweise Guanidinhydrochlorid, und in Gegenwart von vorzugsweise l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid als dem wasserlöslichen Carbodiimid-Aktivierungsmittel. Falls als Modifizierungsmittel polymerisierter Zucker, wie Ficoll, verwendet wird, ist es zweckmässig, diesen zuerst mit Äthylendiamin zu behandeln, um das anschliessende Kuppeln effektiver zu gestalten. Das Kuppeln erfolgt zweckmässigerweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise einer Salzlösung und Dioxan, zweckmässigerweise bei Raumtemperatur und einem pH von 9 bis 12, vorzugsweise 10 bis 11. Die Reaktionszeit kann beispielsweise von V4 bis 2 Stunden betragen. Die nachfolgende Konjugation des geschützten Peptides mit dem Modifizierungsmittel kann zweckmässigerweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise Glycin-methylester bei einem pH von beispielsweise 4 bis 5, vorzugsweise 4,5 bis 4,8, durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur ist zweckmässigerweise die Raumtemperatur, und die Reaktionsdauer kann beispielsweise von 2 bis 8 Stunden, insbesondere 5 Stunden, betragen.
Das Verfahren c), das unter Verwendung von natürlichen proteinartigen Modifizierungsmitteln, wie beispielsweise Serumproteinen, insbesondere homologem Serumalbumin, durchgeführt wird, beruht auf der Theorie von Richards und Knowles [J. Mol. Biol. 37, 231 (1968)], wonach auf dem Markt befindliches Glutarsäuredialdehyd kein freies Glutar-säuredialdehyd enthält, sondern eher aus einem komplexen Gemisch von Polymeren, das reich ist an a ,0-ungesättigten Aldehyden, besteht. Nach Reaktion mit natürlichen Proteinmodifizierungsmitteln bilden diese Polymere eine stabile Bindung über die freien Aminogruppen, wobei die Aldehydgruppen freigesetzt werden. Das Zwischenprodukt kann dann mit dem unmodifizierten Peptid in Gegenwart eines Alkalimetallborhydrids, beispielsweise Natrium-borhydrid, umgesetzt werden. Die Zwischenverbindung wird zweckmässigerweise bei einem pH von 7 bis 10, vorzugsweise 8 bis 9, und bei Raumtemperatur gebildet. Die nachfolgende Konjugation wird zweckmässigerweise bei Raumtemperatur während einer x/4 bis 2 Stunden durchgeführt.
Das Verfahren d), das unter Verwendung von Modifizierungsmitteln, bestehend aus polymerisierten Zuckern, wie Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymeren, beispielsweise Fi-colls, insbesondere Ficoll 70 oder 400, oder Polyglucosen, wie beispielsweise Dextran T70, durchgeführt wird, erfolgt durch Umsetzung des Modifizierungsmittels mit einem Cyanursäure-halogenid, beispielsweise Cyanursäurechlorid, beispielsweise bei einer Temperatur von 0 bis 20° C in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, während V2 bis 4 Stunden. Das erhaltene Dihalotriazinyl-Zwischenprodukt wird bis zur Halogeni-dion-Freiheit dialysiert, danach lyophilisiert, und anschliessend 5 mit dem Peptid bei einem pH-Wert von 8 bis 11, vorzugsweise 9 bis 10, bei Raumtemperatur während V2 bis 12 Stunden umgesetzt.
Das im Abschnitt e) beschriebene Verfahren kann ebenfalls für polymerisierte Zuckermodifizierungsmittel, beispiels-10 weise Copolymere von Saccharose mit Epichlorhydrin, insbesondere Ficolls, wie Ficoll 70 oder 400, oder Polyglucosen, wie Dextran T70, angewendet werden. Die Umsetzung erfolgt zweckmässigerweise durch Behandlung des Modifizierungsmittels mit einem Alkalimetallperjodat, wie Natriumperjodat, bei 15 einer Temperatur von 30 bis 60° C und einem pH-Wert von 3 bis 6. Das erhaltene Zwischenprodukt wird mit dem Polypeptid bei einem pH von 7 bis 11, vorzugsweise von 8 bis 10, bei Temperaturen von 15 bis 80° C, vorzugsweise von 20 bis 60° C, umgesetzt. Die Reaktionszeit kann beispielsweise von 20 V2 bis 4 Stunden betragen. Das Reaktionsprodukt wird anschliessend zweckmässigerweise mit einem Alkalimetallborhydrid, beispielsweise Natriumborhydrid, reduziert.
Die erhaltenen modifizierten Peptide können auf an sich bekannte Weise isoliert und gereinigt werden, so wie bei-25 spielsweise durch Gelfiltration, Kolonnenchromatographie oder Dialyse und Lyophilisation. Vor der Konjugation (Modifikation) können mit Picogrammen I125 markierte Polypeptide als Tracer dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Die Menge des an die modifizierenden Gruppen konjugierten 30 Polypeptides (Molverhältnis) kann durch die Menge der Radioaktivität festgestellt werden.
Kupplungen, die mit den protein-reproduktiv determinanten Peptiden ebenfalls ausgeführt werden können, sind f) die Polymerisation des unmodifizierten Peptids über ein 35 geeignetes bifunktionelles Agens und g) die Dimerisierung des unmodifizierten Peptids über eine Schwefel-Schwefelbrücke, erhalten aus der Thiolgruppe eines Cysteinrestes, der im unmodifizierten Peptid anwesend ist,
oder zu dem unmodifizierten Peptid, sofern dieses keine Cy-
40 steinreste enthält, zugegeben wird.
Die Antigene der Kupplung f) können durch Polymerisation des unmodifizierten Peptids mit einem geeigneten bifunktionellen Reagens, beispielsweise einem bifunktionellen Imi-doester, wie Dimethyladipimidat, Dimethylsuberimidat oder 45 Diäthylmalonimidat, in an sich bekannter Weise [beispielsweise Hartmann und Wold, Biochem. 6, 2439 (1967)] erhalten werden. Die Polymerisation kann bei Raumtemperatur in einem wässerigen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 9 bis 12, vorzugsweise 10 bis 12, zweckmässigerweise während V4 so bis 2 Stunden durchgeführt werden.
Die Antigene der Kupplung g) können erhalten werden durch Oxidation der Thiolgruppe eines Cysteinrestes, beispielsweise unter Verwendung von Jodbenzoesäure in bekannter Weise, beispielsweise bei Raumtemperatur während 10 bis 55 40 Minuten. Falls die zu modifizierenden Peptide keine Cy-steingruppen enthalten, müssen diese zunächst in das Peptid auf an sich bekannte Weise eingebaut werden.
Durch Verabreichung der erfindungsgemässen Mittel werden Antikörper gebildet, die nicht nur die Antigene, son-60 dem auch die natürlichen Proteine der Fortpflanzungshormone, die wesentlich sind für den normalen Ablauf des Fortpflanzungsprozesses, neutralisieren, wodurch der natürliche Prozess der Empfängnis unterbrochen wird. Diese Antigene können deshalb in der Empfängnisverhütung verwendet werden. 65 Es versteht sich von selbst, dass, obzwar die Methoden zur Fruchtbarkeitsregulierung meistens bei Frauen angewendet werden, bestimmte Antigene - insbesondere aus FSH und deren /^-Untergruppen -, sofern sie gemäss der vorliegenden
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Erfindung modifiziert sind, auch bei Männern angewendet werden können.
Die erfindungsgemässen Mittel werden zweckmässigerweise parenteral verabreicht. Die zu verabreichende Dosis hängt von verschiedenen Faktoren ab, wobei die zu behandelnden Zustände und deren Schwere zu berücksichtigen sind. Im allgemeinen sind Einheitsdosen von 0,1 bis 50 mg angezeigt, die zweckmässigerweise 1- bis 5mal in Intervallen von 1 bis 3 Wochen verabreicht werden sollen.
Fortpflanzungshormone verschiedener Spezies werden, wie in den Beispielen 1 bis 9 beschrieben, modifiziert und im Pavian, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Resultate zeigen, dass modifizierte Hormone nicht verwandter Spezies die erwünschten Resultate nicht liefern, während modifizierte Hormone der gleichen Spezies oder naher verwandter Spezies dies tun. Die Beispiele 10 bis 20 beschreiben ebenfalls die Erfindung.
Beispiel 1
Bei erwachsenen weiblichen Pavianen wurde während zumindest einem Menstruationszyklus die Art der im Urin enthaltenen Östrogene, Plasma und Progestine und in einigen Fällen das im Urin enthaltene LH untersucht. Nur diejenigen Tiere, die den normalen Typ dieser Hormone zeigten, wurden immunisiert. Die Kriterien für die Normalität dieser Hormone und die Methoden der Tierhaltung sind bekannt und werden deshalb nicht beschrieben.
Gonadotropische Präparate
Menschliches luteinisierendes Hormon (HLH) - teilweise gereinigte Zubereitung aus menschlicher Hypophyse mit einer biologischen Potenz von 2,5 Einheiten/mg (NIH-LH-SI).
Menschliches follikelstimulierendes Hormon (HFSH) -eine teilweise gereinigte Zubereitung aus menschlicher Hypophyse mit einer biologischen Potenz von 86 Einheiten/mg (NIH-FSH-SI). (National Institutes of Health-Luteinizing Hormone Standard 1.)
Menschliches Chorion Gonadotropin (HCG) - eine höchst gereinigte Zubereitung aus menschlichem Schwangerenurin mit einer biologischen Potenz von 13 2001.E./mg (2. IRP-HCG). (Second International Reference Préparation for HCG.)
Luteinisierendes Hormon des Affen (MLH) - eine rohe Zubereitung aus der Hypophyse von Rhesusaffen mit einer biologischen Potenz von 0,75 Einheiten/mg (NIH-LH-SI).
Luteinisierendes Hormon des Ochsen (OLH) (NIH-LH-S5).
Luteinisierendes Hormon des Pavians (BLH) — teilweise gereinigte Zubereitung aus der Hypophyse des Pavians mit einer biologischen Potenz von 1,1 Einheiten/mg (NIH-LH-SI).
Alle Zubereitungen mit Ausnahme der Zubereitung von OLH wurden im Laboratorium des Erfinders hergestellt. Die biologische Aktivität von LH und HCG wurde mit Hilfe des Eierstock-Ascorbinsäure-Entzugtestes gemessen und die FSH-Zubereitung mit Hilfe des Eierstock-Vergrösserungstests untersucht.
Die Hormone wurden durch Kuppeln mit Hapten in verschiedenen Verhältnissen von Hapten zu Hormonen, wie von Cinader et al. (siehe oben) beschrieben, in Antigene verändert. Das Cinader-Verfahren wird hier aus Gründen der Zweckmässigkeit besprochen, obzwar das von Phillips (siehe oben) beschriebene Verfahren unter bestimmten Bedingungen stabilere Bindungen ergeben kann. In diesem Verfahren wirken die Proteinhormone als Träger und das Hapten wird daran mittels Diazobindung angekuppelt. Obzwar eine grosse Zahl von Haptengruppen an bestimmte Hormone angekuppelt wurde, verwendete man das gleiche Basisverfahren für jede Kombination. Es wurde gefunden, dass 15 bis 35 Haptengruppen für jedes Hormonmolekül am zweckmässigsten sind für die Herstellung des Immunisierungsantigens. Die Basisreaktion bestand darin, dass man das Hapten (Sulfanilsäure) in eine Lösung einer 0,1 In Chlorwasserstoffsäure eintrug und das erhaltene Gemisch langsam tropfenweise einer 1 %igen Natriumnitrit-Lösung bei 4° C unter konstantem Rühren zufügte und damit diazotierte. Der Nachweis von freier salpetriger Säure im Reaktionsgemisch zeigte an, dass die Diazotierung vollständig war. Obzwar diese Reaktion bei 4° C durchgeführt wurde, beträgt der günstigste Temperaturbereich für diese Reaktion normalerweise 0 bis 6° C, hierbei wird die Temperatur von 4° C bevorzugt.
Die Hapten-Protein-Kupplung wurde durch Auflösen des Proteinhormons in einem Alkalipuffer bei pH 8,0 durchgeführt. Hierbei wird das diazotierte Hapten langsam zur Hormonlösung unter beständigem Rühren bei 4° C zugefügt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde konstant überwacht und bei etwa 8,0 gehalten. Nachdem alles Hapten zugegeben war, wurde der pH-Wert schliesslich auf 8,0 eingestellt und das Gemisch während 1 bis 2 Stunden gerührt. Danach wurde es bei 4° C über Nacht stehengelassen. Das Gemisch wurde anschliessend während 6 bis 8 Tagen gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei nicht umgesetztes Hapten entfernt wurde.
Obzwar die Zahl der Diazogruppen per Hormonmolekül durch die Zahl der zugegebenen Mole von Hapten und des umgesetzten Hormons gesteuert werden konnte, wurde eine parallele Kontrolle mit S35 markierter Sulfanilsäure durchgeführt, mit der Absicht, die genaue Zusammensetzung der Hapten-Protein-Muster nach jeder Diazotierung aufzufinden. Die gleiche Hormonzusammensetzung, die für die Immunisierung verwendet wurde, wurde für die Kontrolle herangezogen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde eine Probe dem Reaktionsgemisch entnommen und der verbleibende Teil dialysiert. Gleiche Anteile der dialysierten und der nicht dialysier-ten Lösungen wurden mit Hilfe der Flüssigkeitszintillation untersucht. Durch Vergleich der Resultate der dialysierten und nichtdialysierten Muster konnte man die Mole Hapten, die mit jedem Mol des Hormons gekuppelt haben, berechnen, da nichtumgesetztes Hapten durch Dialyse entfernt wurde. Bei dieser Berechnung wurde ein Molekulargewicht von 30 000 für alle Gonadotropinzusammensetzungen angenommen.
Im Anschluss an die Dialyse wurden die Haptenhormone lyophilisiert und bei 4° C aufbewahrt. Diazo-HCG (35 Gruppen/Molekül) und HLH (26 Gruppen/Molekül) wurden einer Untersuchung im Eierstock-ascorbinsäure-Entzungstest unterworfen, und es wurde gefunden, dass diese 62 bzw. 85% der Aktivität der unveränderten Hormone, aus denen sie entstanden waren, besitzen. Kein anderes Hormon wurde auf biologische Aktivität untersucht.
Immunisierungsverfahren
Weibliche Paviane erhielten ihre Ausgangsimmunisierung am dritten bis fünften Tag ihres Menstruationszyklus und die 2. und 3. Injektion jeweils eine Woche voneinander getrennt. Die 4. Injektion wurde 2 bis 3 Wochen nach der 3. gegeben. Einige Tiere erhielten auch eine 5. Injektion etwa 70 bis 80 Tage nach der ersten Injektion. Alle Antigene wurden subcutan in einer Mannid-manoleat oder einer Erdnussölsuspen-sion verabreicht. Die Antigendosen variierten bei jeder Injektion zwischen 3 und 5 mg. Die Injektionsorte wurden täglich während 5 Tagen nach jeder Immunisierung untersucht, um aufzufinden, ob lokale Reaktionen auftraten.
Registrierung der Wirkung der Immunisation
Täglich wurden 24-Stunden-Urinproben und öfters Serumproben während zumindest eines Menstruationszyklus vor der Immunisierung und im Anschluss an die Immunisierung ge5
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sammelt, um die Wirkung der Behandlung abschätzen zu können. Die (LH) des Urins, Östrogene des Urins und Plasma-progestine wurden gemessen. Hierbei wurden in Serumproben, die nach der Immunisation entnommen wurden,
durch Reaktion von 0,2 ml einer 1:1000 Serumverdünnung in einem Phosphat-Kochsalze-Puffer (pH 7,4) eines 0,5%igen normalen Pavianserums mit 250 pg eines Jm markierten Hormons, Antikörper aufgefunden. Die Sera wurden sowohl mit unverändertem Immunisierungshormon und unverändertem Pavian LH zur Auffindung der Antikörper reagieren gelassen. Eine gereinigte Pavian-LH-Zusammensetzung (1,9 x NIH-LH-SI) wurde als Antigenanzeiger verwendet. Antigen-Antikörperkomplexe wurden mit vom Ochsen stammenden Anti-Pavian-gamma-Globulin nach 24stündiger Inkubation bei 4° C ausgefällt. Der Anteil der Antikörper wurde bezeichnet als pg der markierten Hormonbindungen. Als signifikante Antikörperanteile wurden diejenigen angesehen, die in der Lage sind, 5 pg oder mehr des J131 markierten Antigens zu binden.
Die Antisera wurden durch Gelfiltration auf Sephadex G-200 unter Verwendung des Verfahrens von Fahey und Terry (Seite 36, Expérimental Immunology, F.A. Davies Co., Philadelphia, Pa., 1967) fraktioniert, um den Anteil von IgM-und IgG-Antikörpern im Pavianserum festzustellen. Nachdem der IgG-Anteil in diesem Verfahren Anteile von IgA- und IgD-Antikörpern enthielt, wurden nur die IgM-Anteile und der Gesamttiter bestimmt. Die IgM-Fraktion der Kolonne wurde J131 Hormonen zur Umsetzung gebracht und die Bindungskapazität bestimmt. Die Volumina der fraktionierten Sera wurden einander angepasst, so dass die Anteile der Antikörper mit denen des ganzen Serums vergleichbar wurden.
Antikörper-Produktion
An den Injektionsstellen wurden im Anschluss an die Immunisierung keine signifikanten Reaktionen beobachtet. Bei 4 Gelegenheiten machte sich eine leichte Verhärtung (2 bis 3 cm im Durchmesser) bemerkbar, insbesondere, wenn Mannid-manoleat als Vehikel verwendet wurde, die Rötung und Schwellung verschwand jedoch innerhalb von 4 bis 5 Tagen.
Antikörper gegen das immunisierende Antigen wurden innerhalb von 3 bis 5 Wochen in allen Tieren festgestellt. Das Ausmass, die Dauer und die Kreuzreaktionsfähigkeit dieser Antikörper wurden festgehalten. Im allgemeinen wurde festgestellt, dass höhere Anteile an Antikörpern bei einer heterogenen Gonantropin-Immunisierung auftraten als bei einer homogenen Immunisierung.
Die Kreuzreaktionsfähigkeit der induzierten Antikörper mit Pavian-LH wurde bei jedem Tier untersucht. Die Kreuzreaktionsfähigkeit der Antisera bei hohen Anteilen wurde registriert. Obwohl eine relativ hohe Antikörper-Aktivität gegen menschliches LH und HCG gefunden wurde, sind relativ wenig Reaktionen mit Pavian-LH aufgetreten. Eine intermediäre Kreuzreaktion mit Anti-LH-Hormon des Ochsen und ein hoher Grad von Kreuzreaktionsfähigkeit mit Anti-LH-Serum des Affen wurden festgestellt. Menschliches Diazo-FSH-Serum war beim Pavian schwach antigenisch. Die Dauer der Antikörper-Produktion war im allgemeinen grösser bei der menschlichen und vom Schaf stammenden Gonadotropin-Immunisie-rung als bei solcher vom Affen oder Pavian stammenden.
Sehr hohe Antikörper-Anteile wurden bei der Gelegenheit erhalten, wenn die Antikörper hauptsächlich zum IgG-Typus überwechselten. Frühe Antikörper hatten grössere Anteile des IgM-Typus und waren im allgemeinen stärker kreuzreaktiv mit LH-Serum des Pavians. Die Änderung in der Zusammensetzung der gesamten Antikörper-Population, insbesondere des IgM-Musters wurde aufgezeichnet von dem Zeitpunkt an, an dem Antikörper zum ersten Mal aufgefunden wurden. Merkliche Kreuzreaktivität zum Pavian-LH fiel auf in menschlichem Anti-Gonadotropin, wenn IgM in grossem Anteil vorhanden war, jedoch scharf zurückgedrängt wurde, als das Antiserum beinahe gänzlich zum IgG-Typus überwechselte. Dieses Zurückdrängen in der Kreuzreaktionsfähigkeit erfolgte nicht bei der Affen- und Pavianimmunisierung. Die Immunisierung des LH-Serums des Ochsen führte zu einem vorübergehenden Wechsel in der Reaktivität durch die Änderung von IgM zu IgG.
Wirkung auf den normalen Menstruationszyklus
Die Wirkung der Immunisierung auf den Menstruationszyklus wurde bestimmt durch Beobachtung der Veränderung der Geschlechtshautanschwellung und der Anteile der Hypophysen und/oder Eileiterhormone. Unter Bezugnahme auf diese Parameter wurde die Verzögerung der Ovulation von der vorausberechneten Zeit, bezogen auf den Kontrollzyklus, berechnet. Ein Tier, das mit HCG immunisiert wurde, hatte keinen Unterbruch in der Ovulation und ein anderes, das mit HFSH immunisiert wurde, hatte eine Verzögerung während eines Zyklus. Zwei Tiere, denen HLH injiziert wurde, und zwei Tiere, die HCG injiziert bekamen, hatten Ovulations-verzögerungen, die zwei Menstruationszyklen äquivalent waren. Ein drittes Tier, das mit HLH immunisiert wurde, war um 86 berechnete Tage verzögert. Das LH-Serum vom Ochsen führte zu einer Immunisierung, die eine 88tägige Verzögerung der Ovulation zur Folge hatte.
Die Immunisierung mit Diazoserum des Affen oder LH-Serum des Pavians führte zu längeren Verzögerungen des Menstruationszyklus. Die berechnete Verzögerung der Ovulation dieser beiden Tiere, die LH-Serum des Affen erhielten, betrug 146 und 122 Tage; die Tiere, die ein modifiziertes LH-Serum des Pavians erhielten, zeigten eine Ovulationsver-zögerung von 224 und 210 Tagen.
Die Wirkung auf spezifische Hormonschemen im Anschluss an die Immunisierung mit HLH in einem Tier wurde festgehalten. Der Intervall zwischen den Menstruationen wurde als ein Zyklus festgesetzt. Die im Urin enthaltenen Östrogene und im Plasma enthaltenen Progestine zeigten an, dass während der Dauer der Immunisierung, die 85 Tage betrug, keine Ovulation stattgefunden hatte. Im Urin enthaltene Östrogenanteile waren während der Behandlung erhöht, zeigten jedoch nicht ein typisches Muster. Plasmaprogestine wurden nicht erhöht, bis ungefähr zum 19. Tag des ersten Zyklus nach der Behandlung. Sowohl die Östrogen- als auch die Progestintypen wurden normal innerhalb der Grenzen während des zweiten Zyklus nach Behandlung. Der Anteil der Antikörper stieg von 35. Tag der Behandlung bis zum 289. Tag von der ersten Auffindung der Antikörper. Eine LH-Messung war, während der Zeit das Tier unter Beobachtung stand, nicht verfügbar, und keine Daten über die Plasma- oder Urinanteile dieser Hormone konnten erhalten werden.
Hormonmuster, die nach einer Immunisierung mit Diazo-LH-Serum aufgetreten sind, wurden registriert. In diesem Tier waren die Antikörper-Anteile geringer und im allgemeinen weniger dauerhaft, als nach Immunisierung mit menschlichen Gonadotropinen. Während des Behandlungszyklus folgten die Anteile der Urinöstrogene und Plasmaprogestine dem normalen Muster, sie waren jedoch mengenmässig geringer als normal. Die Muster des dem Urin entstammenden LH veränderten sich merklich infolge der Injektion von Diazo-LH während dieser Periode. Es wurde deshalb kein endgültiger Nachweis der Ovulation für den Behandlungszyklus erbracht. Der erste Zyklus nach Behandlung dauerte 246 Tage. Während dieses Zyklus war das dem Urin entstammende LH und die Östrogene erhöht am 35. bis 41. Tag, aber es fand anschliessend keine Erhöhung der Plasmaprogestine statt, die darauf hingewiesen würden, dass eine Ovulation stattgefunden hat. Im
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Anschluss an den 42. Tag dieses Zyklus fand keine signifikante Erhöhung in einem dieser drei Hormonanteile statt, bis zum 231. Tag, als signifikante Erhöhungen der Urinöstrogene und des LH stattfanden. Diesen Erhöhungen folgte drei Tage später eine Erhöhung im Plasmaprogestin, die auf die Gegenwart eines funktionierenden Gelbkörperhormons hinwies. Ein zweiter Menstruationszyklus nach der Behandlung war von normaler Dauer und die endoctrinalen Muster waren normal.
Die Anteile der Antikörper des unveränderten Pavian-LH-Serums erzielten die Maximalwerte am 70. Tag des Zyklus nach Behandlung und blieben relativ konstant bis zum 190. Tag, als ein stetiger Abfall beobachtet wurde. Am 215. Tag dieses Zyklus konnten Antikörper kaum mehr entdeckt werden. Ungefähr 16 Tage später wurde ein LH-Serum-Anteil beobachtet, der einer normalen erhöhten Menge in der Mitte des Zyklus entsprach. So gesehen, schien das Tier die normale Funktion einer Hypophysen-Eierstockachse zu besitzen. Hormonale Muster der Tiere mit anderen heterogenen Gona-dotropin-Immunisationen waren ähnlich denen, die HLH erhielten, und die hormonalen Muster von Tieren, die LH von Testaffen oder Pavianen erhielten, entsprachen den Mustern von Tieren, die LH des Pavians erhielten.
Diese Resultate bei Pavianen zeigten auf, dass die Modifizierung eines Fortpflanzungshormons nach der besprochenen Methode dieses antigenisch macht und die so erhaltenen Antikörper neutrale endogene Hormone neutralisierten, falls die natürlichen Hormone aus den Spezies erhalten wurden, die mit modifizierten Hormonen immunisiert wurden.
Beispiel 2
HCG ist ein natürliches Hormon, das nur in schwangeren Frauen anzutreffen ist. HCG kann käuflich erworben werden. LH-Hormon ist immunologisch und biologisch identisch mit HCG-Hormon, obwohl dieses chemisch verschieden ist.
Nachdem diese biologisch identisch sind und HCG bereits im Handel gekauft werden kann, wurde angenommen, dass die Wirksamkeit dieses Immunisierungsverfahrens durch Injektion modifizierter HCG in nichtschwangere Frauen und Registrierung der Blutanteile von LH, die die gebildeten Antikörper, sowohl LH als auch das modifizierte HCG, neutralisieren würden, festgestellt werden könnte.
Frauen haben einen bestimmten LH-Anteil; der Anteil ist substantiell konstant bis zu der mittleren Periode zwischen den Menstruationszyklen bis knapp vor der Ovulation. An diesem Punkt steigt der LH-Anteil stark an und hilft, die Ovulation auszulösen. Durch Messung des LH-Anteils und des Antikörperanteils kann man feststellen, ob das Verfahren die Produktion von Antikörpern, die fähig sind, endogene Fortpflanzungshormone wie LH zu neutralisieren, bewirkte oder nicht.
Für die obige Studie wurde eine 27jährige Frau ausgewählt. Die Hormone wurden erhalten, gereinigt und modifiziert. Menschliches modifiziertes Hormon (HCG) wurde injiziert. Es ist bekannt, dass Antikörper gegen HCG, auch gegen LH wirken. Der Immunisierungseffekt war erhöht, hauptsächlich durch Registrierung des Blutspiegels des LH-Hormons. Schliesslich wurden die Resultate bestimmt.
Bereitung der Hormone
Klinisches HCG, das man aus dem Urin Schwangerer erhalten hat, wurden von der Vitamerican Corp., Little Falls, New Jersey, geliefert. Dieses Material hatte eine immunologische Potenz von 2600 IE/mg. In diesem Präparat wurden Verunreinigungen entdeckt. Die Reinigung erfolgte mit Hilfe der Chromatographie und Eluierung. Die Fraktionen wurden dialysiert und lyophilisiert. Die am stärksten potente Fraktion enthielt ungefähr 7600 IE/mg, war jedoch heterogen, wie den Resultaten der Polyacrylamid-gel-electrophorese zu entnehmen war.
Die Fraktion wurde anschliessend durch Gelfiltration weiter gereinigt. Die Eluierung zeigte zwei starke Proteinanteile. Das am stärksten wirksame HCG wurde im ersten Anteil gefunden und hatte eine immunologische Potenz von s 13 670 IE/mg. Diese Fraktion wurde einer Polyacrylamid-gel-electrophorese unterworfen. Eine weitere Reinigung durch Gelfiltration zeigte keine Heterogenität des HCG mehr an. Dementsprechend wurden die für die Studie benötigten Materialien nach dem obigen Verfahren hergestellt.
io Die Verunreinigung des gereinigten HCG wurde mit J131 getestet und für die Identifizierung verwendet. Ein Muster wurde mit Antisera gegen verschiedene Proteine zur Reaktion gebracht, nachdem diese als Verunreinigung auftreten könnten. Diese Proteine waren follikelstimulierende Hormone, 15 menschliche Wachtumshormone, ganzes menschliches Serum, menschliches Albumin, Transferin, Alpha-l-globulin, Alpha-2-globuIin und Orsomucoid. Keine feststellbare Bindung des gereinigten HCG wurde mit irgendeinem Antiserum bei einer Verdünnung von 1:50 festgestellt. Diese negativen Resultate 20 wurden gegen Bindungen entsprechender Proteine berechnet, wobei gezeigt werden konnte, dass die Verunreinigung, falls überhaupt vorhanden, geringer war als 0,005 %.
Veränderung der Hormone 25 Hormone wurden verändert durch Kupplung mit Hapten (Sulfanilazo). Diese Methode kuppelt Haptenmoleküle an Proteine über die Aminogruppe des aliphatischen oder aromatischen Teils von Hapten. Die Zahl der Haptenmoleküle, die an das HCG-Molekül (Ha-HCG) gekuppelt wurden, konnte 30 für diese Untersuchung reguliert werden. 40 Haptengruppen für jedes HCG-Molekül wurden verwendet zur Herstellung des immunisierenden Antigens. Im Anschluss an die Hapten-kupplung wurde das Ha-HCG sterilisiert und getestet.
35 Subjekt
Das Subjekt war vielgebärend und hatte ihre Fortpflanzungsfähigkeit durch vorhergehende beidseitige Tubenextirpa-tion beendet. Sie war bei guter Gesundheit und hatte einen regelmässigen Menstruationszyklus. Sie wurde einer komplet-40 ten ärztlichen Untersuchung und einer Laboratoriumsbestimmung einschliesslich Blutmessung, Urinmessung, Latexfixierung und Feststellung des Papanicolau-Abstrichs unterworfen. Sie zeigte keine Allergien.
Zum Nachweis des normalen Funktionierens der Hypophy-45 sen-Eierstock-Achse vor der Immunisierung wurden Blutproben jeden Tag vom ersten Tag der Menstruation während 10 Tagen entnommen, dann täglich während 10 Tagen und schliesslich jeden Tag bis zur nächsten Menstruation. Es wurden Serumbestimmungen von FSH, LH, Östron, Östradiol und sc Progesteron durchgeführt. Diese Studien zeigten ein Ovula-tionsmuster.
Immunisierungsprozeduren 10 mg des Ha-HCG-Antigens wurden in 1 ml Kochsalzlösung gelöst und mit dem gleichen Volumsanteil Öl emulgiert. 55 Vor der Injektion wurden Kratztests auf Antigen und Vehikel durchgeführt. Die Immunisierung wurde in der Lutealphase des Behandlungszyklus begonnen, um eine Superovulation durch verabreichtes HCG zu vermeiden. Vier Injektionen in einem 2wöchigen Intervall wurden dem Subjekt verabreicht. 60 Die ersten beiden wurden in Öl subcutan (1 ml in jeden Oberarm) verabreicht, die zwei letzten wurden in Salzlösung nur über intracutanen Weg gegeben. Nach jeder Injektion wurden Blutdruckmessungen durchgeführt und das Subjekt auf allergische Reaktionen beobachtet.
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Registrierung des Immunisierungseffektes Blutproben wurden in einem wöchentlichen Intervall entnommen, wobei 2 Wochen nach der ersten Injektion begonnen
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wurde, um die Gegenwart von humoralen und zellularen Antikörpern festzustellen. Nach Vervollständigung des Immunisa-tionsplanes wurden Blutmuster gesammelt in der gleichen Art wie im Kontrollzyklus, um den Effekt der Immunisation auf die Hormonmuster des Menstruationszyklus abzuschätzen. Nachdem die Antikörper gegen HCG in gleicher Weise gegen LH und HCG reagieren, wurde LH festgesetzt als Index der Wirksamkeit des Verfahrens. Ein dritter Zyklus wurde in gleicher Weise 6 Monate nach der ersten Immunisierung untersucht. Nach Vervollständigung der Studie wurden Untersuchungen des Körpers und Beckens und Laboratoriumsmessungen wiederholt. Serummuster der Kontrolle und des Zyklus nach Behandlung wurden für FSH, LH, Östron, östradiol und Progesteron untersucht. Das Subjekt wurde auf eine verzögerte Hypertension vor der Immunisation und in 2-Wochen-Intervallen, bis der Injektionsplan vollständig war, in einem in vitro Lymphocyten-Transformationstest untersucht.
Resultate
Es wurden vorübergehende Beziehungen der Serumhypophysen und der gonadalen Hormone in den Kontrollzyklen des Subjektes festgestellt. Antikörpertiter gegen HCG wurden im Subjekt nach 2 Injektionen gefunden. Die Menstruation trat in regelmässigen Intervallen während der Immunisierung auf.
Im Anschluss an die erste Injektion in Mannid-manoleat trat ein Jucken und eine Schwellung des Injektionsortes auf. Nachfolgende intradermale Injektionen in Kochsalzlösung zeigten keine Reaktion, und es wurde deshalb angenommen, dass die lokalen Reaktionen durch Mannid-manoleat hervorgerufen wurden. Die Lymphocyt-Transformationstests in Plasmamustern waren negativ.
Im Zyklus nach Behandlung waren die grundlegenden follikulären und lutealen Phasen-LH-Anteile nicht merklich verändert. Sehr geringe Erhöhungen des LH-Anteiles in der Zwischenzyklusperiode wurden beobachtet im Vergleich zu den normalen starken Erhöhungen. Die FSH-Muster im Zyklus nach der Behandlung waren normal. Dies zeigte, dass die Antikörper die Aktion des endogenen LH neutralisierten. Das Subjekt zeigte ein Progesteronmuster einer Ovulation, jedoch erreichte relativ hohe Antikörpertiter gegen LH und HCG nach nur 2 Injektionen von Ha-HCG.
Das Subjekt wurde während eines weiteren Zyklus ungefähr 6 Monate nach der ersten Immunisierung untersucht. Es wurden signifikante Antikörpertiter gefunden. LH-Muster zeigten eine leichte Erhöhung bei Zyklusmitte. FSH-Muster waren normal. Dementsprechend wurde die Spezifität der Anti-HCG-Antikörper gegen LH gezeigt, jedoch nicht gegen FSH.
Beispiel 3
Es wurde eine weitere Frau von 29 Jahren für die Untersuchungen ausgewählt. Es wurden Hormone erhalten, gereinigt und modifiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Diese modifizierten Hormone wurden dem Subjekt in der gleichen Art, wie im Beispiel 2 beschrieben, verabreicht. Das Subjekt wurde registriert und getestet wie im Beispiel 2.
Die erhaltenen Resultate waren ähnlich den im Beispiel 2 gefundenen Resultaten, mit der Ausnahme, dass
1. der Anteil von Östron und Östradiol ziemlich normal war,
2. das Subjekt merkliche Antikörper-Anteile spät im Nach-
immunisationszyklus aufwies und
3. in dem Zyklus, der 6 Monate später untersucht wurde, das
Subjekt keine signifikante auf die Zyklusmitte hinweisende
Erhöhung der LH-Werte zeigte.
Beispiel 4
Es wurde eine weitere 29jährige Frau für die Untersuchungen ausgewählt. Die Hormone wurden erhalten und gereinigt und modifiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Das modifizierte Hormon wurde diesem Subjekt in der gleichen Art, wie im Beispiel 2 beschrieben, injiziert. Das Subjekt wurde gemessen und untersucht wie im Beispiel 2.
Die erhaltenen Resultate waren ähnlich den Resultaten, s die im Beispiel 2 gefunden wurden mit der Ausnahme, dass
1. die Grundlinien der LH-Anteile in der follikulären und lutealen Phase merklich erniedrigt waren im Zyklus nach Behandlung,
2. keine Erhöhung des LH-Wertes in der Zyklusmitte erfolg-10 te,
3. Östronanteile während der Follikularphase des Nachim-munisationszyklus erhöht waren und
4. während der 6 Monate dauernden Studie keine merkliche Erhöhung der LH-Anteile in der Zyklusmitte auftrat.
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Beispiel 5
Eine andere Frau von 35 Jahren wurde für weitere Studien ausgewählt.
Die Hormone wurden erhalten, untersucht und modifiziert 20 wie im Beispiel 2 beschrieben. Das modifizierte Hormon wurde injiziert in der gleichen Art, wie im Beispiel 2 beschrieben. Das Subjekt wurde gemessen und getestet wie im Beispiel 2.
Die Resultate waren ähnlich den Resultaten, die im Bei-25 spiel 2 gefunden wurden mit der Ausnahme, dass
1. die Grundlinien der LH-Anteile in der follikulären und lutealen Phase erniedrigt waren im Zyklus nach der Behandlung,
2. sehr kleine Erhöhungen des LH-Wertes in der Mitte des 30 Zyklus auftraten,
3. die Anteile der FSH-Muster im Zyklus nach der Behandlung erniedrigt waren und
4. die Anteile von Östron und östradiol reduziert waren während der follikulären Phase der Postimmunisation.
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Beispiel 6
Eine Frau von 28 Jahren wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die Hormone wurden erhalten, gereinigt und modifiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Das modifizierte 40 Hormon wurde injiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Das Subjekt wurde gemessen und untersucht wie im Beispiel 2.
Die erhaltenen Resultate waren ähnlich den Resultaten, die im Beispiel 2 gefunden wurden mit der Ausnahme, dass
1. die Anteile von LH in der lutealen und follikulären Phase 45 im Zyklus nach der Behandlung niedriger waren,
2. keine erhöhten Werte von LH-Serum in der Mitte des Zyklus beobachtet wurden,
3. Östronanteile in der follikulären Phase des Zyklus nach der Immunisation erhöht schienen und so 4. LH-Muster keine signifikante Erhöhung in der Mitte des Zyklus im ómonatigen Zyklus nach der Immunisierung zeigten.
Beispiel 7
Eine 28jährige Frau wurde für weitere Untersuchungen 55 ausgewählt. Die Hormone wurden erhalten, gereinigt und modifiziert wie im Beispiel 2. Das modifizierte Hormon wurde injiziert wie im Beispiel 2 beschrieben. Das Subjekt wurde registriert und untersucht wie im Beispiel 2.
Die Resultate waren ähnlich den im Beispiel 2 erhaltenen 60 Resultaten mit der Ausnahme, dass
1. Antikörper-Titer gegen HCG bis nach 3 Injektionen nicht gefunden werden konnten,
2. die LH-Werte der follikulären und lutealen Phase im Zyklus nach der Behandlung erniedrigt waren,
65 3. keine erhöhten Werte und auch keine Erhöhung der Werte von LH in der Mitte des Zyklus beobachtet wurden,
4. Östronwerte während der follikulären Phase erhöht waren und
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5. keine merklichen Antikörper-Titer im 6-Monatszyklus gefunden wurden.
Die obigen Beispiele zeigen die Möglichkeit, dass durch Injektion von modifizierten Hormonen endogene Fortpflanzungshormone neutralisiert werden, wobei hierbei die Möglichkeit zur Verhinderung der Empfängnis geboten wird.
Beispiel 8
Daten, die in früheren Experimenten erhalten und in den Beispielen 1 bis 7 diskutiert wurden, zeigen, dass ein modifiziertes natürliches Fortpflanzungshormon, sobald es einem Tier der Spezies, der es entstammt, injiziert wird, Antikörper bildet, die die Wirkung von unmodifizierten endogenen Hormonen im Körper des Tieres neutralisieren. Die in den Untersuchungen der Beispiele 1 bis 7 verwendeten Hormone waren FSH, LH und HCG. Neue Experimente wurden durchgeführt, beruhend auf dieser Kenntnis, um andere Fortpflanzungshormone (plazentales Lactogen), das in der gleichen Art verwendet werden könnte, zu identifizieren.
Zubereitung von Hormonen
Eine gereinigte Zubereitung des plazentalen Lactogens wurde aus der Plazenta von Pavianen erhalten. Es bestand die Absicht, modifiziertes Placenta-Lactogen zur Immunisierung von Pavianen zu verwenden. Die Plazenta wurde extrahiert und das Extrakt mit Hilfe der Kolonnenchromatographie gereinigt unter Verwendung von bekannten Verfahren. Die Reinheit wurde mit Hilfe von Polyacrylamidgel, Elektrophorese und radioimmunologischen Versuchen getestet. Das Material zeigte einen hohen Reinheitsgrad bei der Elektrophorese und im radioimmunologischen Versuch sowie keine weitere Verunreinigung mit anderen plazentalen Hormonen.
Hormonmodifizierung und Immunisierung
Das Plazenta-Lactogen (BPL) des Pavians wurde durch Kupplung mit dem Diazoniumsalz der Sulphanilsäure verändert, wie bereits für andere Hormone im Beispiel 1 beschrieben. Die Zahl der Diazomoleküle für jedes BPL-Molekül war 15. Die Immunisierungsverfahren entsprachen denjenigen des Beispiels 1 für andere Hormone.
Resultate
Innerhalb von 4 bis 6 Wochen nach der ersten Injektion von Diazo-BPL wurden Antikörper-Anteile gegen natürliches unmodifiziertes BPL in vitro bei 6 weiblichen Pavianen aufgefunden. Die Anteile wuchsen zu einem Plateau innerhalb von 8 bis 10 Wochen und verblieben hier während mehrerer Monate. Hormonmessungen zeigten, dass hierdurch kein Ein-fluss auf den Menstruationszyklus aufgrund dieser Immunisierung stattgefunden hat. Nachdem BPL normalerweise nur in der Schwangerschaft abgesondert wird, war dies keine überraschende Beobachtung.
Falls in den obigen Beispielen 1 bis 8 die Strukturen 1 bis 7 durch Verwendung von Diazosulfonsäure, Dinitriphenol oder S-Aceto-mercaptobernsteinsäure-anhydrid oder Strukturen III bis VI modifiziert werden, oder die Modifizierung durch Polytyrosin oder Polyalanin stattfand, erhielt man die gleichen Resultate.
In der gleichen Weise führte FSH das durch die Verwendung von Diazosulfanilsäure oder Trinitriphenol modifiziert wurde, nach der Verabreichung des gereinigten modifizierten Proteins an einen männlichen oder weiblichen Menschen oder an ein männliches oder weibliches Tier zu einer Stimulierung der Bildung von Antikörpern, die sowohl das modifizierte als auch das entsprechende unmodifizierte Protein neutralisieren.
Beispiel 9
Die Subjekte, die in diesem Beispiel untersucht wurden, waren weibliche Paviane. Alle Paviane waren erwachsen und im fortpflanzungsfähigen Alter. Eine Beschreibung der Sub-5 jekte und der Untersuchungsbedingungen enthält das Beispiel 1. Die Tiere wurden untersucht unter Verwendung von hochgereinigten ß-Untergruppen von HCG unter Verwendung einer Zubereitung mit einer biologischen Aktivität von weniger als 1 IE/mg. Die Tiere wurden immunisiert mit 14 bis 26 io Mol/Mol-Sulfonsäure-Peptid-Untereinheiten in Mannid-man-oleat.
Antikörperanteile wurden geschätzt durch Feststellung der Bindung von Serumverdünnungen mit J12S markierten Antigenen. Die Kreuzreaktionsfähigkeit der Antisera wurde durch 15 direkte Bindung markierter Antigene und durch radioimmunologische Untersuchungen gemessen. Eine fruchtbarkeitshem-mende Wirkung bei aktiv-immunisierten Tieren wurde festgestellt nach Begattung der Weibchen durch Männchen mit nachgewiesener Fruchtbarkeit. Die Effekte in trächtigen Pa-20 vianen, die entweder mit Schaf- oder Pavian-anti-/?-HCG passiv immunisiert wurden, wurden festgestellt durch Registrierung der Serumanteile von Gonadotropinen und Geschlechtshormonen vor und nach der Immunisierung.
8 weibliche Paviane wurden mit modifizierten /3-Subgrup-25 pen von HCG immunisiert. Merkbare Anteile an Antikörpern wurden in allen Tieren erreicht.
Eine Pavianimmunisierung mit modifizierten /3-Subgruppen von HCG führten zu hohen Antikörper-Anteilen gegen HCG, menschliches LH und CG des Pavians, jedoch nicht gegen LH 30 des Pavians. Alle Tiere blieben ovulationsfähig, jedoch keine Schwangerschaften ergaben sich aus zahlreichen Begattungen mit männlichen Tieren nachgewiesener Fruchtbarkeit. Eine passive Immunisierung von nicht immunisierten trächtigen Pavianen mit Schaf-anti-/3 -HCG führte zu Aborten innerhalb 35 von 36 bis 44 Stunden.
In ähnlicher Weise wie in den Beispielen 1 und 2 unter den Immunisierungsmethoden beschrieben, werden von den folgenden neuen Wirkstoffen ebenfalls Injektionspräparate zubereitet: .
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Struktur X — Hemocyanin von Keyhole-limpet
Es wird eine Hemocyanin-Lösung von Keyhole-limpet (KLH) (7 mg/ml) in einem 0,05 M Natriumphosphat-Puffer in 0,2molarer wässeriger Natriumchlorid-Lösung bei einem 45 pH-Wert von 7,5 bereitet. Unlösliche Teile werden durch Zentrifugieren entfernt. Zu 1 ml dieser Lösung fügt man 20 «1 Toluol-diisocyanat, das auf V30 mit Dioxan verdünnt wurde, wobei dieser Anteil das Äquivalent der Mole der Lysyl-Reste im KLH-Molekül darstellt. Nach 40minutigem Stehen bei 0° C so wird die durch Toluol-diisocyanat aktivierte KLH-Lösung mit 0,5 mg eines synthetischen /?-HCG-Peptides, das die obige Struktur X besitzt und vorgängig in 25 fA eines 0,5molaren Natriumsulfat-Puffers in einer 0,2molaren wässerigen Na-triumchlorid-Lösung bei pH 7,5 gelöst wurde, versetzt. Das 55 Gemisch wird bei 37° C während 4 Stunden inkubiert. Das erhaltene Produkt wird durch Gelfiltration gereinigt.
Struktur III - vom Rind stammendes Gamma-Globulin
Zu einer Lösung von 0,23 ml vom Rind stammendem 60 Gamma-Globulin (10 mg/ml) in 0,05 M Phosphat-Puffer und einer normalen Kochsalz-Lösung bei pH 7,5, die in einem Eiswasserbad gekühlt und stark gerührt wird, werden 50/d einer V10 Lösung von Toluol-diisocyanat in Dioxan zugefügt. Nach 40 Minuten wird der Überschuss von Toluol-diisocyanat 65 durch Zentrifugieren (0° C, 10 Minuten, 10 000 g) entfernt und der Niederschlag 2mal mit jeweils 0,1 ml einer normalen Kochsalz-Lösung gewaschen. Die kombinierten Überstände werden zu 7,7 g des Peptids der Struktur III, das in 0,8 ml
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einer normalen Kochsalz-Lösung bei pH 7,5 gelöst ist, zugefügt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 10 Minuten gerührt und danach während 4 Stunden bei 37° C inkubiert. Das konjugierte Reaktionsprodukt wird durch Dialyse gereinigt.
Struktur VI - vom Rind stammendes Serumalbumin Vom Rind stammendes Serumalbumin (10 mg/ml), das in 0,25 ml einer normalen Kochsalz-Lösung gelöst ist, wird mit 50/d einer 1:10 Toluol-diisocyanat-Lösung in Dioxan behandelt und anschliessend mit 7,5 mg eines synthetischen ß-HCG-Peptides der Struktur VI, das in 0,8 ml einer normalen Kochsalz-Lösung gelöst ist (pH 7,5), wie im Beispiel 2 beschrieben, konjugiert, wobei das im Titel genannte Produkt erhalten wird.
Struktur VI - Poly(D,L-Lys-Ala)
Zu 0,6 ml der Lösung eines ß-HCG-Peptids der Struktur VI (10 mg/ml) in Phosphat gepufferter wässeriger Kochsalz-Lösung bei pH 7,5, die in einem Eiswasserbad gekühlt und stark gerührt wird, werden 30/d einer 1:10 Toluol-diisocyanat-Lösung in Dioxan zugesetzt. Nach 40 Minuten wird der Über-schuss von Toluol-diisocyanat durch Zentrifugieren (10 000 g, 0° C, 10 Minuten) entfernt und der Niederschlag 2mal mit jeweils 0,1 ml wässeriger Kochsalz-Lösung gewaschen. Das Gemisch wird während 4 Stunden bei 37° C inkubiert. Das Reaktionsprodukt wird anschliessend dialysiert und lyophilisiert.
Struktur III - Keyhole-limpet-hemocyanin 2 mg der Verbindung der Struktur III, die in Picogramm-Anteilen I12S enthält, und 1,6 mg KLH werden in 1 ml von 1 M Glycinmethylester in 5 M Guanidinhydrochlorid gelöst. 19,1 mg Äthyl-dimethylaminopropylcarbodiimid werden zu dieser Lösung zugefügt. Der pH-Wert des Gemisches wird mit Hilfe von In Chlorwasserstoffsäure während 5 Stunden bei Raumtemperatur auf pH 4,75 eingestellt. Das KLH-Peptid-Konjugat wird an einer Biogel p-60 2,2 x 28 cm Kolonne, die mit 0,2molarer Natriumchlorid-Lösung äquilibriert wurde, gereinigt.
Ficoll 70 - Äthylendiamin 1 g Ficoll 70 wird in 1 ml von jeweils einer normalen Koch-salz-Lösung und einer 2 M Äthylendiamin-Lösung, die auf pH 10 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt wurden, gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur in einem Wasserbad gehalten und mit Hilfe eines Magnetrührers gerührt. Danach werden 4 g Bromcyan, die in 8 ml Dioxan gelöst sind, zu der Fi-coIl-70-Lösung zugefügt. Der pH-Wert des Gemisches wird auf 10 bis 10,5 während 8 Minuten durch Zugabe von Tropfen einer 2n wässerigen Natriumhydroxid-Lösung gehalten. Danach werden weitere 2 ml einer 2 M Äthylendiamin-Lösung (pH 10) zugesetzt und das Rühren bei Raumtemperatur während 3 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird an einer Biogel p-60 Kolonne gereinigt. Das erhaltene Material kann verwendet werden zum Kuppeln von Ficoll 70 an Peptide unter Verwendung des Verfahrens b).
Struktur IX - homologes Serumalbumin Zu einer 20 mg/ml Lösung eines homologen Serumalbumins in 0,1 M Borat-Puffer bei pH 8,5 wird ein 1000 M% Überschuss einer 25%igen wässerigen Lösung von Glutarsäu-re-dialdehyd bei Raumtemperatur zugefügt. Der Überschuss von Dialdehyd wird durch Gelfiltration in Wasser unter Verwendung von Biogel p-2 entfernt. Das erhaltene Material wird lyophilisiert, und das getrocknete Produkt in einem 0,1 M Borat-Puffer bei pH 8,5 (20 mg/ml) wieder gelöst und danach mit der gewünschten Menge eines Peptids der Struktur IX
(20 mg/ml) im gleichen Puffer bei Raumtemperatur vermischt. 20 Minuten später wird Natriumborhydrid in einem 250 Mol% Überschuss, bezogen auf Peptid IX, zugefügt. Die Reaktion ist nach 1 Stunde beendet. Das konjugierte Produkt wird durch Gelfiltration an einer Biogel p-60 Kolonne gereinigt, salzfrei dialysiert und lyophilisiert.
Struktur X - Ficoll 70 1 g Ficoll 70, 500 mg Natriumbicarbonat, 3 g Cyanursäu-rechlorid, 20 ml Wasser und 80 ml Dimethylformamid werden während 2 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 16° C gerührt. Das erhaltene Produkt wird gegen destilliertes Wasser bis zur Chlorfreiheit dialysiert und anschliessend lyophilisiert. 2 mg eines Peptids der Struktur X, das geringste Anteile von I125 enthält wird mit 1 mg des vorgängig erhaltenen Produktes in 0,25 ml eines 0,2 M Natriumborat-Puffers bei pH 9,5 während 1 Stunde bei 20° C inkubiert und danach das Produkt nach Chromatographie an einer Biogel p-60 2,2 x 28 cm Kolonne rein erhalten.
Unter Verwendung des obigen Verfahrens, jedoch bei Ersatz von Ficoll 70 durch Dextran T70 enthält man das entsprechend modifizierte Peptid.
Struktur X — Ficoll 70 1 g Ficoll 70, 1,2 g NaI04 und 0,42 g Kaliumchlorid werden in 1,5 ml eines 1 M Natriumacetat-Puffers bei pH 4,5 gelöst und bei 37° C während 1 Stunde inkubiert. 2 mg (588 «Mol) eines Peptids der Struktur X wird mit geringen Mengen eines I125 markierten Analogs vermischt und mit 2 mg des obigen Gemisches in 0,3 ml eines 0,2 M Borat-Puffers bei pH 9,5 bei 55° C während 1 Stunde inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird anschliessend in einem Eiswasserbad abgekühlt und das Gemisch mit 1 ml Natriumborhydrid versetzt. Die Reduktion ist beim Durchlaufen des Produktes durch eine Biogel p-60 2,2 x 28 cm Kolonne, die mit einer 0,2 M Natriumchlorid-Lösung äquilibriert und eluiert wurde, beendet.
Struktur III - Polymer 3 Mole eines festen bifunktionellen Imidoester-dihydro-chlorids werden in 2-mg-Portionen in 5-Minutenabständen zu einer konstant gerührten Lösung von 1 Mol eines Peptids der Struktur III (1 bis 20 mg/ml) in einer 0,1 M Natriumphosphat-Lösung bei pH 10,5 bei Raumtemperatur zugefügt. 0,ln Natriumhydroxyd-Lösung wird zugefügt, um den pH-Wert bei 10,5 zu halten. Eine Stunde, nachdem die Zugabe des Diimi-doesters beendet wurde, erhält man ein polymerisiertes Produkt.
Strukturen V oder X - Dimere Jodosobenzoesäure wird in einem geringen Überschuss einer In Kaliumhydroxid-Lösung (10%iger molarer Überschuss) gelöst und die Lösung zu Peptiden der Struktur V oder X in einem Phosphat-Puffer und einer normalen Kochsalz-Lö-sung bei pH 7,0 zugefügt. Nach 30minutigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das Peptid-dimere durch Gelfiltration gereinigt.
Testresultate
Zahlreiche Kaninchen werden mit verschiedenen synthetischen Peptiden, die mit verschiedenen Modifizierungsgruppen konjugiert sind, immunisiert. Nach 2 oder 3 Immunisierungen bei 3- bis 5wöchigen Intervallen werden die Sera der Tiere nach ihrer Fähigkeit, in vitro radioaktiv marjkiertes HCG zu binden, beurteilt. Die Spezifität dieser Bindung wird durch Untersuchung der Reaktion der gleichen Sera gegen ähnlich markierte Proteinhormone, insbesondere von der Schilddrüse abstammendem LH, festgestellt. Die Sera werden überdies aufgrund ihrer Fähigkeit, die biologische Aktion von exogen
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zugefügtem HCG bei den Tieren zu inhibieren, beurteilt. Festgestellt wird die Zunahme des Uterusgewichtes der unreifen weiblichen Ratte als Reaktion auf die verabreichte Dosis von HCG. Die Dosis HCG wird subcutan in Kochsalzlösung in 5 Injektionen während einer 3tägigen Periode verabreicht und das Tier zur Entfernung des Uterus am 4. Tage getötet. Das Gewicht des Uterus nimmt zu mit der Reaktion auf die verabreichten Dosen der Hormone. Bei Beurteilung der Wirkung der Antisera werden verschiedene Anteile des Testserums i.p. unabhängig von der subcutanen Verabreichung der Hormone verabreicht. Dieses Vorgehen erlaubt, dass das Antiserum rasch in die Blutzirkulation der Ratte aufgenommen wird und eine rasche Wechselwirkung mit dem Hormon stattfindet, wenn dieses in den Blutstrom eintritt.
Falls das Antiserum in der Lage ist, mit dem Hormon zu reagieren, um eine Stimulierung des Uterus zu verhindern, so wird das Antiserum als wirksam für die biologische Hormonwirkung angesehen.
5 Die Zahl der Tiere, die eine positive Reaktion auf die immunologische Bindung und Neutralisierung der biologischen Aktivität zeigen, ist in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Die Resultate dieser Tabelle zeugen von den weiten Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung, wie bereits vorhergehend io angegeben. Unter Verwendung von Standardmethoden bei der Untersuchung von Kaninchen zeigen sowohl die Reaktion auf die immunologische Bindung, als auch die Neutralisierung der biologischen Wirkung die für die modifizierten Peptide festgestellt wurde, die nachfolgenden Resultate:
Anzahl der positiven Antikörper-Reaktionen auf verschiedene HCG-Peptid-Konjugate
Peptid
Träger
Immunisiert Anzahl der Kaninchen
Reaktionen auf Neutralisierung immunologische der biologischen Verbindungen Aktivität
35 Aminosäuren 111-145 Morgan et al. Peptid III
31 Aminosäuren 115-145 Morgan et al. Peptid VI
44 Aminosäuren 105-148 Peptid X
Natürliches 109-145 Keutmann Peptid V
vom Rind stammendes 10 Gamma-Globulin
Keyhole-Limpet-Hemocyanin 10
Poly-D-L-alanin 10
vom Rind stammendes 12 Serum-Albumin
Keyhole-Limpet-Hemocyanin 10
Keyhole-Limpet-Hemocyanin 10
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9 12
10
* Zusätzliche Zeit für die Beurteilung nötig
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