PL97318B1 - Sposob wytwarzania modyfikowanych polipeptydow - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania modyfikowanych polipeptydów, w których skladni¬ kiem polipeptydowym jest hormon stymulujacy folikuline FSH, hormon luteinizujacy (LH), ludzka kosmówkowa gonadotropina lub jej p-podjednostka, ludzi lozyskowy laktogen (HPL), ludzka prolak- tyka lub zwiazek o wzorze ogólnym X-Ser-Ser-Ser- -Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Y, w któ¬ rym X oznacza grupe o wzorze Ser-Lys-Glu-Pro- * -Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn-Ala-Thr- -Leu-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys- * -Ile-Thr-Val-Asn-Thr-Thr-Ile-Cys-Ala-Gly-Try- 40 -Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val- 50 -LoUHPLro-AlA-Lev-Pro-Gln-Val-Val-Cys-Asn-Try- 60 70 -Arg-Asp-Val-Arg-Phe-Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro- 80 -Gly-Cys-Pro-Arg-Gly-Val-Asn-Pro-Val-Val-Ser- 90 -Tyr-Ala-Val-Ala-Leu-Ser-Cys-Gln-Cys-Ala-Leu- 100 -Cys-Arg-ArgnSer-Thr-Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-Pro- 100 -Phe-Gln-Asp-Ser lub o wzorze Ser-Lys-Gln-Pro- ? -Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn-Ala-Thr- -Leu-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys- 29 * -Ile-Thr-Val-Asn-Thr-Thr-Ile-Cys-Ala-Gly-Tyr- 40 -Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val- 50 -Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Glx-Leu-Val-Cys-Asn-Tyr- 60 70 -Arg-Asp-Val-Arg-Phe-Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro- 80 -Gly-Cys-Pro-Arg-Gly-Val-Asn-Pro-Val-Val-Ser- 90 -Tyr-Ala-Val-Ala-Leu-Ser-Cys-Gln-Cys-Ala-Leu- 100 -Cys-Arg-(Arg)-Ser-Thr-Thr-Asp-Cys-Gly-Gly- 110 -Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro- -Arg-Phe-Gln-Asp lub o wzorze Asp~Asp-Pro-Arg- * -Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Se--Lys-Ala-Pro-Pro- * * Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser lub o wzorze Gln- -Asp-Ser lub o wzorze Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg- -Phe-Gln-Asp lub o wzorze Phe-Gln-Asp lub o wzorze Phe-Gln-Asp-Ser lub o wzorze Asp-Asp- -Pro-Arg-Phe-Gln-Asp lub o wzorze Asp-Asp-Pro- -Arg-Phe-Gln-Asp-Ser lub o wzorze Asp-His-Pro- -Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg- st -Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser, •711867 316 130 * a Y oznacza grupe o wzorze Pro-Ser-Arg-Leu-Pro- * 140 -Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Pro- 140 -Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile- 147 -Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro- -Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln lub o wzorze * * Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro- * -Ile-Deu-Pro-Gln lub o wzorze Pro-Ser-Arg-Deu- -Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln- * -Ser-Leu-Pro, lub o wzorze Pro-Ser-Arg-Leu-Pro- -Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser- * -Leu-Pro, lub o wzorze Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly- -Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln lub Gly o wzorze Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, albo Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro- -Ile-Leu-Pro-Gin-Ser-Leu-Pro.Wedlug wynalazku modyfikowane polipeptydy mozna wytwarzac sprzegajac polipeptydy, takie jak hormon stymulujacy folikuline FSH, hormon lutei- nizujacy (LH), ludzka kosmówkowa gonadotropina lub jej (3-podjednostka, ludzki lozyskowy laktogen (HPL), ludzka prolaktyna lub zwiazek o powyz¬ szym wzorze z jedna lub kilkoma grupami mody¬ fikujacymi.Jako grupy modyfikujace stosuje sie grupy po¬ chodne kwasu dwuazasulfonilowego, dwunitrofeno- lu, trójnitrofenolu, bezwodnika kwasu S-acetomer- kaptobursztynowego, polityrozyny o lancuchu pro¬ stym lub rozgalezionym, polialaniny o lancuchu prostym lub rozgalezionym, spolimeryzowanych cukrów, takich jak kopolimer sacharozy z epichlo- rohydryna albo poliglukozy, protein surowicy, ta¬ kich jak homologi surowicznej albuminy, hemocy- janiny z Keyhole limpet (morski mieczak) lub bia¬ lek naturalnych, takich jak tyroglobulina.Wiadomo, ze przeciwciala powstaja w organizmie czlowieka i zwierzat jako reakcja na obecnosc obcych antygenów. Wiadomo równiez, ze mozna przekazac odpornosc zwierzeciu przez podawanie przeciwciala wytworzonego poza nim. Na przyklad nastepujace opisy patentowe St. Zjedn. Am.: Mi- chaelson nr 3 553 317, Friedheim nr 2 388 260, Reus- ser nr 3 317 400 i Peterson nr 3 376 198 dotycza wy¬ twarzania przeciwcial, które wstrzykniete zwierze¬ ciu innego gatunku lub czlowiekowi wywoluja bierna immunizacje. W opisach patentowych St.Zjedn. Am. nr 2 301 532 i nr 2 372 066 Feli opisuje aktywna immunizacje przy zastosowaniu zmody¬ fikowanej histaminy u takich zwierzat, jak konie, krowy itp. R.G. Edwards w British Medical Jour¬ nal, tom 26, strony 72 — 78, 1970 r. „Immunologia zaplodnienia i ciazy" podaje przeglad literatury dotyczacej mozliwosci wykorzystania metod immu¬ nologicznych do wplywania na ciaze lub jej regu¬ lacje, dajac wpierw przeglad wytwarzania przeciw¬ cial w stosunku do jader lub spermatozoów. Znacz¬ na czesc omówionej literatury dotyczy wytwarza¬ nia obcych przeciwcial, które wstrzykuje sie osob¬ nikowi (bierna immunizacja). Przeciwciala hormo¬ nowe badano od dluzszego czasu, a efektj specy¬ ficznych przeciwsurowic notuje sie od szentgu lat.Wiadomo, ze podanie okreslonych przeciwcial pod¬ czas ciazy moze zahamowac implantacje lub spo- wodowac resorpcje plodu. Próbowano szeregu me¬ tod, poczynajac od spowodowania prawie stalej bez¬ plodnosci w przypadku aglutynacji spermatozoów u samców do wywolania zaburzen w pojedynczej ciazy za pomoca biernej immunizacji przeciwcia¬ lo lami.Istnieja powazne ograniczenia w stosunku do sto¬ sowania biernej immunizacji w leczeniu ludzi.Poniewaz przeciwciala sa praktycznie wytwarzane jedynie u zwierzat, a nie u ludzi, powtórne wstrzyk- niecie bialka zwierzecego czlowiekowi wywoluje, jak wiadomo, powazne reakcje u wiekszosci osob¬ ników.Ostatnio stwierdzono, ze dawki pewnych stero¬ idów, skladajace sie z syntetycznych hormonów niebialkowych („pigulka") podawane w okreslo¬ nych odstepach czasu, zwykle powoduja ochrone przedciaza przez krótki okres czasu (moze na mie¬ siac). Ten sposób leczenia, jak stwierdzono, wy¬ woluje czasem niepozadane objawy uboczne, po- wodujac niepozadane zmiany w metabolizmie i czasem zmiany w mechanizmie krzepniecia krwi.Ponadto skutek kazdej dawki trwa tak krótko, ze czesto stosowanie jej jest ograniczone, zwlaszcza w odleglych polaciach kraju dla osób nie odpowied- nio pouczonych o odpowiednim i stalym jej sto¬ sowaniu.Istnieje dlatego koniecznosc skutecznej i pewnej metody wywolywania czasowo, lecz przez stosun¬ kowo dlugi okres czasu immunizacji przeciw ciazy, nie wywolujac powaznych objawów ubocznych.Istnieje równiez potrzeba skutecznej bezpiecznej metody przerywania ciazy zaraz po zaplodnieniu bez powaznych szkodliwych objawów ubocznych.Metoda taka moze byc zabójetnienie hormonu re- 40 produkcji, który jest konieczny dla normalnego przebiegu zaplodnienia i/lub ciazy.Istnieje równiez zapotrzebowanie na srodek, po¬ zwalajacy na opanowywanie róznych stanów cho¬ robowych lub schorzen wywolywanych lub podle- 45 gajacych wplywowi nadmiaru pewnych polipepty- dów, takich jak gastryna, angiotensyna II lub so- matomedian. Wynalazek niniejszy zaspakaja to zapotrzebowanie w sposób bezpieczny i skuteczny.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 50 antygenów do aktywnej immunizacji, a zwlaszcza antygenów skladajacych sie z naturalnych pro¬ teinowych hormonów reprodukcji, niehormonal- nych protein i specyficznych fragmentów takich hormonów i protein i syntetycznie wytworzonych 55 czesci wymienionych hormonów i protein, przy czym wszystkie one moga byc modyfikowane, jak to zo¬ stanie szczególowo omówione dalej. Dla uproszcze¬ nia zarówno w opisie, jak i w PL

Claims (1)

1. zastrzezeniach an¬ tygeny te okresla sie zbiorowo jako zmodyfikowa- 60 ne polipeptydy. Zmodyfikowane polipeptydy stosuje sie do aktyw¬ nego immunizowania zwierzecia a zwlaszcza ssa¬ ków, przeciw biologicznemu dzialaniu niezmodyfi- kowanej niehormonalnej naturalnej proteiny lub 65 hormonu. Stan immunizacji wystepuje, poniewaz97 318 6 powstaja przeciwciala, które dzialaja zarówno prze¬ ciw zmodyfikowanym antygenowym polipeptydom i niemodyfikpwanym naturalnym niehormonalnym proteinom lub hormonom, które ulegaja zobojetnie¬ niu (staja sie biologicznie wzglednie nieskuteczne) 5 w wyniku obecnosci wymienionych przeciwcial. Odpornosc moze wystapic, poniewaz przeciwcialo dziala zarówno na zmodyfikowane polipeptydy, jak i na naturalne proteiny, lecz nie jest pewne, czy ma to miejsce w tym przypadku. 10 Modyfikowanie proteinowych hormonów repro¬ dukcji polega na dodaniu pewnej ilosci obcych skladników do kazdej czasteczki hormonu lub fragmentu hormonu. Modyfikacja musi byc do¬ stateczna, aby wywolac w organizmie wytworzenie 15 przeciwcial w stosunku do zmodyfikowanych hor¬ monów, które moga posrednio zarówno hamowac wydzielanie i zobojetniac (dalej w opisie obydwie czynnosci okresla sie jako „zobojetnianie") dziala¬ nie naturalnych hormonów wytwarzanych przez 2o organizm. Tak wiec zmodyfikowane hormony staja sie antygenowe i wywoluja wytwarzanie przeciw¬ cial, które przerywaja naturalny proces zaplodnie¬ nia i/lub ciazy. Okreslenie „proteinowe hormony reprodukcji" obejmuje te hormony, które sa nie- 25 zbedne dla normalnego przebiegu procesu repro¬ dukcji. Przy uzyciu wyzej omówionej metody mozna tez leczyc stan chorobowy polegajacy na zaburzeniach trawiennych, znanych w dziedzinie medycyny jako 30 zespól Zollingera-Ellisona. Zespól ten lub stan chorobowy opisuje sie zwykle jako stan, w któ¬ rym nadmierne wydzielanie polipeptydu gastryny wytwarzanego w trzustce prowadzi do stanu nad- kwasoty zoladka, prowadzacego do chronicznych 35 zaburzen w trawieniu. Dotychczas jedynym sku¬ tecznym leczeniem tego schorzenia bylo chirur¬ giczne usuniecie czesci lub calego zoladka chorego. Chociaz zycie takiego chorego nie ulega zwykle zagrozeniu, stan zdrowia i sposób zycia takich osobników sa powaznie zaklócone przez taki zabieg. Leczenie takich osobników za pomoca sprzezo¬ nych haptenów (wytworzonych wedlug opisanego w tym opisie ogólnego sposobu) lub w inny sposób chemicznie modyfikowanej gastryny mozna stoso¬ wac w celu wzmozenia wytwarzania przeciwcial przeciw nadmiernemu wydzielaniu gastryny i w ten sposób przyniesc ulge lub zmniejszyc objawy tego schorzenia bez interwencji chirurgicznej. Do¬ stateczne zmniejszenie srodkami immunologicznymi ilosci tej substancji w organizmie byloby wystar¬ czajace do unikniecia skomplikowanych i powaz¬ nych konsekwencji stosowanego obecnie zabiegu chirurgicznego. W praktyce wstrzykuje sie po pro¬ stu choremu skuteczna ilosc zmodyfikowanej ga¬ stryny, potrzebna do regulacji /wydzielania lub 55 obecnosci gastryny. Innym powaznym problemem medycznym, który leczy sie przez stosowanie techniki tego wynalaz¬ ku, jest nadcisnienie. Ogólnie mówiec stan nadci¬ snienia jest stanem odbiegajacym od normalnego 60 poziomu lub fluktuacja cisnienia krwi. Cisnienie krwi u osobnika jest regulowane za pomoca sze¬ regu procesów fizjologicznych w organizmie. Jed¬ nak jedna z glównych substancji wplywajacych na regulacje takiego cisnienia jest hormon poli- 65 45 50 peptydowy znany jako angiotensyna II. W pew¬ nych stanach wysokiego cisnienia krwi (nadcisnie¬ nie) trudno jest kontrolowac srodkami medyczny¬ mi wydzielanie, a zatem poziom angiotensyny II w ukladzie krazenia. Za pomoca odpowiedniej mo¬ dyfikacji tego hormonu i nastepujacego zimmuni- zowania za pomoca tego zmodyfikowanego pro¬ teinowego hormonu jest mozliwe obnizenie wy¬ dzielania angiotensyny II u chorych z chronicznie podwyzszonym poziomem hormonu. Dajace sie prze¬ widziec i kontrolowac obnizenie poziomu tej sub¬ stancji jest korzystne dla chorych z chronicznym nadcisnieniem. Zmodyfikowana angiotensyne II mozna wytworzyc za pomoca znanej techniki mo¬ dyfikowania bialek, opisanej nizej. Wytworzona zmodyfikowana angiotensyne II wstrzykuje sie choremu w ilosci wystarczajacej do kontroli lub regulacji pozadanego poziomu nie zmodyfikowanej angiotensyny II. Wynalazek mozna równiez stosowac do leczenia cukrzycy i polaczonych z nia schorzen mikro- i makronaczyniowych. Obecnie leczenie cukrzycy ogranicza sie do leczenie dieta i/lub za pomoca leków, celem regulowania poziomu glukozy we krwi. Ostatnie dane naukowe potwierdzaja kon¬ cepcje, ze hormony wzrostowy i somatomediano- wy (obydwa polipeptydy) biora udzial w tym ze¬ spole chorobowym. Substancje te mozna modyfi- kiwac za pomoca techniki opisanej nizej i stoso¬ wac w skutecznej ilosci, celem opanowania poste¬ pu tej choroby. W praktyce wstrzykuje sie chore¬ mu zmodyfikowany hormon wzrostowy lub zmo¬ dyfikowany hormon somatomedianowy, celem wy¬ tworzenia przeciwcial do regulacji normalnie wy¬ dzielanych hormonów. Innym zagadnieniem zdrowotnym; które mozna leczyc przez zastosowanie tego wynalazku sa nie¬ które guzy i raki piersi pochodzenia endokrynolo¬ gicznego lub hormonalnego. Stale utrzymywanie sie niektórych z tych rodzajów raka zalezy, jak to wykazano, od obfitego wydzielania hormonu prolaktyny. Zahamowanie wydzielania prolaktyny, jak to wykazano, zmniejsza szybkosc wzrostu i fak¬ tycznie utrzymywanie sie niektórych z tych gó- zów. Immunizacja takich osobników haptenami sprzegnietymi z prolaktyna lub w inny sposób zmieniona prolaktyna, powoduje systematyczne ob¬ nizanie poziomu tego hormonu krazacego w ukla¬ dzie i w konsekwencji prowadzi do regresji lub remisji wzrostu nowotworu. Wynik takiego leczenia jest znacznie bardziej korzystny z punkty widze¬ nia efektywnosci leczenia tego schorzenia, ponie¬ waz chirurgiczne usuniecie piersi jest obecnie je¬ dyna skuteczna metoda leczenia. Ten sposób le¬ czenia jest skuteczny jedynie w stosunku do no¬ wotworów, których istnienie zalezy od wydzielania prolaktyny. Równiez inne schorzenia mozna leczyc przez, sto¬ sowanie zmienionych lub zmodyfikowanych protein hormonalnych lub niehormonalnych jako antyge¬ nów. Stany chorobowe i zwiazane z nimi substan¬ cje, które mozna stosowac jako zmodyfikowane an¬ tygeny do leczenia immunologicznego tych scho¬ rzen sa podane nizej: '"¦* 1. ) zmodyfikowany hormon przytarczycowy do le¬ czenia kamicy nerkowej.67 31* 8 2. ) zmodyfikowana insulina i/lub glukagon do le¬ czenia hyperin$ulinomy, 3. ) zmodyfikowany hormon stymulujacy tarczyce (TSH) do leczenia nadczynnosci tarczycy i 4. ) zmodyfikowana sekretyna do leczenia zespolu 5 podraznienia jelit. Do imnej grupy polipeptydów, które mozna zmie¬ nic za pomoca sposobu wedlug wynalazku stoso¬ wanych w dziedzinie regulacji plodnosci u ludzi, naleza antygeny niehormonalnych protein wyizo- 10 lowanych z tkanki lozyska. Stwierdzono, ze hamo¬ wanie substancji specyficznych dla tkanki lozyska i nie wykazujacych podobnych wlasnosci antyge¬ nowych w stosunku do innych antygenów z orga¬ nów w innych czesciach ciala, moze prowadzic 15 do przerwania ciazy przez bierna immunizacje. Ta¬ kie specyficzne substancje z lozyska, gdy zostaly zmodyfikowane celem wytworzenia zmodyfikowa¬ nych polipeptydów za pomoca sposobów opisanych nizej, mozna wstrzyknac do ciala zwierzecia tego 20 samego gatunku jako skuteczny srodek regulujacy plodnosc za pomoca mechanizmu czynnej immu- ndzacji, podobnego do opisanego dla antygenowej modyfikacji hormonów. Szczególna zaleta tych sub¬ stancji jest, ze antygeny lozyskowe sa substancja- 25 mi obcymi dla nie ciezarnych kobiet i dlatego nie sa w stanie wywolac reakcji krzyzowej lub przer¬ wania normalnych czynnosci organizmu nieciezar- nej kobiety. Sposób wedlug wynalazku jest uzyteczny w sto- 30 sunku do gatunku ludzkiego, lecz jest równiez uzy¬ teczny w stosunku do zwierzat, takich jak ssaki. Nie ma znaczenia czy odnosny hormon, niehor- monalne bialko lub ich specyficzny zmodyfikowa¬ ny fragment wystepuje jako naturalny lub jest 35 produktem syntetycznym. Czasteczka syntentycz- nego bialka spelnia takie same funkcje, jak bialka naturalnego, poniewaz organizm nie rozróznia ich. Sa one wiec równorzedne dla celów tego wyna¬ lazku. Stwierdzono, ze jest mozliwe przeciwdzialanie róznym stanom chorobowym lub leczenie róznych stanów chorobowych (lub problemów medycznych) wywolanych lub podlegajacych wplywowi polipe- ptydów, za pomoca aktywnej immunizacji samców lub samic zwierzat przez wytwarzanie i stosowa¬ nie antygenów wytworzonych przez podawanie zmodyfikowanych polipeptydów.Modyfikowanie po¬ lipeptydów tworzy antygeny, które podaje sie zwierzeciu, u którego nalezy wywolac immuniza¬ cje. Modyfikacje prowadzi sie przylaczajac do po- 50 lipeptydu jedna lub wiecej obcych reaktywnych (modyfikujacych) grup lub przez przylaczenie dwóch lub wiecej polipeptydów do obcej reaktyw¬ nej (modyfikujacej) grupy tak, ze organizm zwie¬ rzecia rozpoznajac zmodyfikowany polipeptyd jako M cialo obce wytwarza przeciwciala, które oczywiscie zobojetniaja nie tylko zmodyfikowane bialko, lecz równiez bialko naturalne odpowiedzialne za scho¬ rzenie, które nalezy leczyc lub kontrolowac. Celem lepszego zdefiniowania zmodyfikowanych w polipeptydów ponizej podaje sie blizsze okresle¬ nie naturalnych hormonów i naturalnych niehor¬ monalnych protein zmodyfikowanych sposobem we¬ dlug wynalazku. Naleza do nich hormon stymulu¬ jacy folikuline FSH, hormon luteinizujacy LH, *s 40 45 ludzka kosmówkowa gonadotropina HCG, Ijdtki lozyskowy laktogen HPL i ludzka prolaktyna, przy czym wszystkie one sa bialkowymi hormonami procesu reprodukcyjnego, gastryna, angiotensyna II, hormon wzrostowy, somatomedian, hormon przytarczycy, insulina, glukagon, hormon stymulu¬ jacy gruczol tarczowy (TSH), sekretyna i inne po- lipeptydy, które moga szkodliwie wplywac na funk¬ cje organizmu. Do specyficznych fragmentów proteinowych hor¬ monów reprodukcyjnych naleza: beta podjednost¬ ka naturalnego hormonu stymulujacego folikuli¬ ne, beta podjednostka naturalnej ludzkiej kos- mówkowej gonadotropiny, peptyd z 20—30 lub 30— 39 aminokwasów skladajacy sie z C-konoowych reszt beta podjednostki naturalnej ludzkiej kos- mówkowej gonadotropiny, jak równiez specyficzne pojedyncze fragmenty naturalnej ludzkiej prolak- tyny i naturalnego ludzkiego lozyskowego lakto- genu, które moga byc niepodobne do analogicznych czesci innych hormonów proteinowych. Ponizej po¬ daje sie na przyklad konfiguracje chemiczna beta podjednostki HCG. Struktura ta przedstawia sie nastepujaco: 10 Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro^ * 20 -Ile-Asn-Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-Lys-Glu * -Gly-Cys-Pro-Val-Cys-Ile-Thr-Val-Asn-Thr-Thr- 40 Ile-Cys-Ala-Gly-Try-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg^ 50 Val-Leu-Gln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Gln- 60 Val-Val-Cys-Asn-Try-Arg-Asp-Val-Arg-Phe-Glur 70 Ser-Ile-Arg-Leu-Pro-Gly-Cys-Pro-Arg-Gly-Val- 80 Asn-Pro-Val-Val- Ser-Tyr-Ala-Val-Ala-Leu-Ser- ¦-¦ 90 Cys-Glri-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-Arg-Ser-Thr-Thr- 100 Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr- 110 Cys-Asp-Asp-Pro-ArgHPhr-Gln-Asp-Ser-Ser- 120 * * 130 Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-iPro^Pro-Ser-Leu-IPro-Ser- * * 140 Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr- Pro-Ile-Leu-Pro-Glu Struktura I Istnieja dwa autorytatywne poglady na dokladna budowe beta-podjednostki HCG. Druga struktura przedstawia sie jak nastepuje: 10 Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro- * ~ 20 Ile-Asn-Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly- 29 * Cys-Pro-Val-Cys-Ile-Thr-Val-Asn-Thr-Thr-Ile- 40 Cys-Ala^Gly-Tyr-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-yal- 50 Leu-Gln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Glx-Leu- 60 Val-Cys-Asn-Tyr-Arg-Asp-Val-Arg-Phe-Glu-Ser-. 70 Ile-Arg-Leu-Pro-Gly-Cys-Pro-Arg-Gly-Val-Asn-W 818 • 10 nowych wystarczajacych do wywolania pozadanej reakcji immunologicznej. Na przyklad dodanie lan¬ cucha polityrozynowego moze pomóc w nadaniu strukturze III wlasciwosci antygenowych tak, ze 5 podanie zmodyfikowanej struktury III wywola po¬ zadane dzialanie immunologiczne w stosunku do naturalnego HCG. Do dalszych lancuchów polipeptydowych korzyst¬ nych w ulatwianiu wytwarzania przeciwcial w sto- io sumku do naturalnego HCG naleza nastepujace struktury oznaczone jako struktury VII, VIII, IX i X: 80 Pro-Val-Val-Ser-Tyr-Ala-Val-Ala-Leu-Ser-Cys- 90 Glu-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-(Arg)-Ser-Thr-Thr-Asp- 100 110 Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys- * 120 Asp * 130 * Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg- 140 Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-LeuHPro- 147 GkiHSer-Leu-Pro Struktura II Dla uproszczenia ponizszy opis i zastrzezenia be¬ da odnosily sie tylko do wyrazenia „beta-podjed- nostka HCG", lecz wyrazenie to obejmuje zarówno strukture (II), jak i strukture (I). Beta-podjednostka HCG zawiera lancuch lub lancuchy zlozone z czasteczek aminokwasów, przy czym lancuchy te róznia sie zupelnie lub w duzym stopniu od lancucha polipeptydowego ludzkiego hormonu luteinizujacego. Lancuchy te w postaci zmodyfikowanej równiez wchodza w zakres wyna¬ lazku. Zgodnie z tym struktury polipeptydowe III i IV (koncowe czesci struktury I) * Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys- Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Sfer-Arg- * Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro- Gin. Struktura III • * * Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Ser- * * Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser- Asp-Thr-ProHlle-Leu-Pro-Gln Struktura IV i struktury V i VI (koncowe czesci struktury II). Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser- * Ser-Lys-Ala-PrVPro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro- Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile- Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro Struktura V * Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro- Pro-Asx-Thr-Pro-He-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro Struktura VI czy to wytworzone czysto syntetycznymi sposobaJ mi, czy tez za pomoca enzymatycznej degrad&bji pokróWnego polipeptydu (Carlson i inini, J. Biold- gical Chemistry, 284 (19), str. 6810, (1978)), g<& !sa zmodyfikowanie sposobem wedlug wynalazku; sta¬ nowia podobnie material o wlasciwósiciach &n$g& Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro- Pro-Ser-Leu-PronSer-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly- 15 Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln Struktura VII Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Lys- 20 Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Gly Struktura VIII Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser- Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser- 25 Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu- Pro-Gln-Ser-Leu-Pro Struktura IX 30 Asp-His-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe- Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys^Ala-Pro-Pro-Pro- Ser-Leu-Pro-Ser-P~o-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro- Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-LeuHPro-Gln-Ser-Leu-Pro- 35 Struktura X Po zmodyfikowaniu sposobem wedlug wynalazku, na przyklad przez sprzeganie z Ficoll 70+, polipe- ptydy te wykazuja czynnosc immunogeinna. Wszystkie te polipeptydy uwaza sie za fragmenty 40 HCG,. dzieki ich istotnemu podobienstwu do kon¬ figuracji chemicznej naturalnego hormonu i rea¬ kcji immunologicznej, która wywoluja, gdy ule¬ gly modyfikacji jak tu-wskazano. ,fn + Pharmacia Fine Chemicals, Pharmacja Labbrfc- 45 tories. anc. 800 Contennial Ave, Piscatawy,-!lT.!fJ? 08854 • !"r;v' ¦¦'''0TT Syntetyczny kopolimer sacharozy i fefritflfldróh^ dryny, o srednim ciezarze czasteczkówyn¥r70,Wlfcf ± 10,000, dobrej rozpuszczalnosci w Wódzie!, i-'tifW 50 mien Stokesa okolo 5.1, trwaly' w s^ó<3ówiskich fri kalicznych i obojetnych. • k ;^; ^ ^ ;t /to^ Ilosc obcych reaktywnych -:gnipV''rWtdra/;:iha!le^ przylaczyc do '! $oiipeptydu:VV ilosc ^pTolipe^t^ciów, która nalezy przylaczyc! do obcyfch':]reaktywnym? 55 grup, zalezy od konkretnego problemu, którys m18 byc rozwiazany. W1 zas&dzi^ wynajle si^c konieczne, abyjÓany ^blip^^tf zoslistl-zniódyf^wgnyvwr *ó- ltii& ttAaftftftyh atffw^wafi[nfa 'W*11 &HUM* antygenowego, fri^2Ks^¥'H^z^ dyfikówmfegó; ^ wytworzy p^ciwkó 'hiemu tirzbciw^ial.1'-^Wzfc&Wdtó obcych c^astebzefe 'dodanych do póiiye^dli' jtt^t W zb^t dtfz^ wtedy^ órgfcniztti wyt^rz^ ptó^ciw^tó^97 818 li lfl w stosunku do obcego antygenu, lecz przeciwciala beda wtedy specyficzne dla antygenu i nie beda zobojetnialy dzialania odnosnego naturalnego hor¬ monu lub niehormonalnej proteiny. W zasadzie stwierdzono, ze korzystnie stosuje sie okolo 1—40 reaktywnych grup na czasteczke polipeptydu i wówczas zmodyfikowany odpowiednio polipeptyd pozwoli na uzyskanie pozadanego efek¬ tu immunologicznego. Ten stosunek ilosci grup modyfikujacych do polipeptydu bedzie ulegal zmia¬ nom w zaleznosci na przyklad od tego, czy stosu¬ je sie do modyfikacji caly hormon lub tez czy na przyklad modyfikuje sie stosunkowo niewielki syn¬ tetyczny fragment tego hormonu. W zasadzie uwa¬ za sie za korzystne stosowanie 2—40 grup modyfi¬ kujacych na czasteczke polipeptydu. W przypadku, gdy polipeptyd jest beta podjednostka HCG, szcze¬ gólnie korzystnie stosuje sie 5—30, a zwlaszcza 10 —26 modyfikujacych grup na czasteczke polipepty¬ du. Wazne jest uwzglednienie przy kazdym mody¬ fikowanym polipeptydzie, aby stopien modyfikacji odpowiadal celowi wytworzenia przez organizm przeciwcial odpowiednich do zobojetnienia niektó¬ rych naturalnych hormonów lub niehormonalnych bialek, w stosunku do których pozadane jest zo¬ bojetnianie. Bedzie sie to zmienialo w stosunku do kazdego odnosnego polipeptydu i w stosunku do stopnia korektury lub zmiany pozadanej dla od¬ nosnej czynnosci organizmu. Modyfikacje polipeptydu prowadzi sie przylacza¬ jac rózne rodzaje grup modyfikujacych do hormo¬ nu bialkowego, niehormonalnych protein lub ich specyficznych fragmentów w znany sposób. Tak na przyklad do takich polipeptydów mozna przylaczyc £rupy dwuazowe pochodzace od kwasu sulfanilo- . 'wego. Do dodatkowych grup modyfikujacych naleza ta¬ kie grupy, które wytworzono za pomoca reakcji po¬ lipeptydów z dwunitrofenolem, trójnitrofenolem, bezwodnikiem S-acetomerkaptobursztynowym, poli- tyrozyna o lancuchach prostych lub rozgalezionych, polidekstranami, dajacymi sie biologicznie odbudo¬ wac, naturalnymi bialkami itp. spolimeryzowany- mi cukrami takimi, jak sacharoza kopolimeryzowa- na z epichlorohydryna, na przyklad Ficoll 70 i Fi- coll 400+, lub z poliglukoza, taka jak Dextran T 70++, bialkami surowicy takimi, jak homologicz¬ na albumina surowicy, hemocyjanina z Keyphole limpet, morskiego mieczaka z gastropodów, lub mniej korzystnie z naturalnymi bialkami, takimi jak tyroglobulina i tym podobne. W zasadzie syn¬ tetyczne modyfikatory sa korzystniejsze od mody¬ fikatorów naturalnych. + Pharmacia Fine Chemicals, Pharmacia Labora¬ tories, Inc. 800 Centenn^al Ave, Piscataway, N. J. 08854 . ' .. + + Syntetyczny kopolimer sacharozy i epichloro- hydryny, posiadajacy sredni ciezar czasteczkowy 400,000 ± 100,000 i rzeczywista lepkosc 0.17 dl/g, skrecalnosc wlasciwa ( PL