DE69534723T2

DE69534723T2 - Einzelketten-Gonadotropin

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Publication number: DE69534723T2
Application number: DE69534723T
Authority: DE
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2015-02-18
Also published as: PT751782E; CA2183564A1; AU695111B2; ATE314392T1; EP0839831A3; AU1878795A; EP0751782A1; CA2183564C; JP2002060347A; EP0839831B1; EP1849802A2; EP0839831A2; JPH11263799A; DE69535260D1; ES2273335T3; ATE342061T1; EP0751782B1; DE69535260T2; WO1995022340A1; EP0751782A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Glycoprotein-Hormon-Agonisten und -Antagonisten, welche die Aktivitäten von Hormonen mit LH-Aktivitäten vermindern und/oder die Aktivitäten von Hormonen mit Follitropin-Aktivität erhöhen.
Die Offenbarungen, auf denen hierin Bezug genommen wird, um den Hintergrund der Erfindung zu veranschaulichen und um zusätzliche Details mit Bezug auf ihre Anwendung zur Verfügung zu stellen, werden zur Bequemlichkeit in dem nachfolgenden Text in numerischer Reihenfolge als Referenz angegeben und dementsprechend in der angehängten Bibliographie gruppiert.
Die Glycoprotein-Hormon-Familie (1) besteht aus drei α,β-heterodimeren Glycoproteinen, die in der vorderen Hypophyse gefunden werden, wo sie hergestellt werden. Zu den Glycoprotein-Hormonen gehören das luteinisierende Hormon (auch als Lutropin oder LH bekannt), das Follikel-stimulierende Hormon (Follitropin oder FSH) und das Thyroid-stimulierende Hormon (auch als Thyrotropin oder TSH bekannt). Die Hormone von Menschen sind als hLH, hFSH beziehungsweise hTSH bekannt. In einigen Arten wird ein Glycoprotein-Hormon, das in der Struktur dem LH ähnelt und das Choriogonadotropin oder CG genannt wird, von der Plazenta hergestellt und in den Kreislauf entlassen. In Menschen wird dieses Glycoprotein-Hormon hCG genannt. In Primaten werden deutliche Mengen von jedem dieser Hormone ebenfalls als Ausscheidungsprodukte im Urin gefunden. Nach der Menopause, wenn die Sekretion von LH und FSH von der vorderen Hypophyse stark erhöht ist, werden deutliche Mengen von LH und FSH im Urin gefunden. Extrakte von Gonadotropin aus Urin von Frauen in der Menopause werden menschliche Menopause-Gonadotropine (hMG) genannt. Im Unterschied zu hCG, das wie LH mit LH-Rezeptoren interagiert, aber nur schwach mit FSH-Rezeptoren, interagiert hMG sowohl mit LH- als auch mit FSH-Rezeptoren. Die zweifache Aktivität von hMG ist auf die Anwesenheit von hLH, hFSH und ihrer Metaboliten im Urinextrakt zurückzuführen. Die Urine von schwangeren Frauen und Frauen in der Menopause sind die Hauptquellen von Gonadotropin-Aktivitäten und besitzen wichtige kommerzielle Verwendungen.
Gonadotropine wie FSH, LH und in einigen Arten CG spielen eine Hauptrolle im reproduktiven Prozess (1-6), während das strukturell verwandte Hormon, TSH, für die Schilddrüsenfunktion wichtig ist (1). Sowohl LH als auch FSH sind essentiell für die Pubertät und für die normale reproduktive Funktion. Das Fehlen einer ausreichenden Menge an FSH, LH oder hCG zu geeigneten Zeitpunkten führt zur Unfruchtbarkeit oder zur Beendigung einer Schwangerschaft. Überschüssige Mengen dieser Hormone können zu einer frühzeitigen Pubertät oder zur Hyperstimulation der Gonaden führen. Im Mann ist FSH essentiell für den Beginn und die Aufrechtbehaltung der Spermatogenese (7, 8). Die Immunneutralisierung von FSH führt zu einer Verminderung der Spermatogenese und zu einem Verlust der Fruchtbarkeit. In der Frau ist FSH essentiell für die Follikelentwicklung, die zur Herstellung der weiblichen Gamete bei der Ovulation führt. Die Erkrankung der polyzystischen Ovarien ist eine häufige Ursache für Unfruchtbarkeit bei Frauen und ist ein Zustand, der durch eine unvollständige follikuläre Entwicklung gekennzeichnet ist. Die Fruchtbarkeit kann im Allgemeinen durch die Verabreichung von FSH oder hMG wiederhergestellt werden. Die Fruchtbarkeit kann ebenfalls häufig durch Behandlungen mit Antiöstrogenen, Verbindungen, welche die negative Feedback-Wirkung von Östrogenen auf die Sekretion von FSH hemmen, wodurch der FSH-Spiegel steigen kann, behandelt werden. Bei Männern wird LH für die Pubertät benötigt und bei seinem Fehlen, erfolgt ein Versagen, die sexuellen Attribute und die Fruchtbarkeit eines Erwachsenen zu erwerben. LH ist hauptsächlich für die Synthese von Androgenen im Hoden verantwortlich. Diese Steroide besitzen einen vorteilhaften Einfluss auf die Spermatogenese und abnormal hohe Mengen von Androgenen können die Spermatogenese aufrechterhalten, wenn sie einmal initiiert wurde (9). Bei Frauen ist LH essentiell für die Ovulation und die Erzeugung des Corpus luteum. LH besitzt ebenfalls einen synergistischen Einfluss mit FSH auf die Follikelentwicklung (4) und ist dafür gut bekannt, die Synthese von follikulären Androgenen zu fördern. Diese Androgene dienen als Vorläufer für die Erzeugung von FSH-stimuliertes Östrogen. LH kann ebenfalls die Wirkung von FSH auf Granulosa-Zellen verstärken, besonders in den späteren Stadien der Follikelreifung, wenn die Granulosa-Zellen LH-Rezeptoren erworben haben. Das hCG, das von dem Trophoblasten hergestellt wird, ist für die Aufrechterhaltung der Sekretion von Progesteron vom Corpus luteum während der frühen menschlichen Schwangerschaft wichtig. Die klinischen Aktivitäten dieser Hormone und ihre Verwendungen sind umfassend in mehreren Standard-Fachbüchern, einschließlich das von Yen und Jaffe (2), als Übersichtsartikel dargestellt worden.
Die Unterschiede in den Wirkungen von FSH und LH und die komplexen endokrinen Interaktionen zwischen den zwei Hormonen führt dazu, dass sie synergistische Wirkungen auf die follikuläre Entwicklung und die Synthese von Östradiol haben (4). Die normale Herstellung von Östrogen im Eierstock ist auf die Wirkung von LH auf die Erzeugung von Androgen und auf den Einfluss von FSH auf die Umwandlung von Androgenen zu Östradiol zurückzuführen. Andererseits kann Östradiol die Sekretion von FSH aus der Hypophyse unterdrücken. Während des normalen Menstruationszyklus nehmen die FSH-Spiegel ab, während sich das Follikel vergrößert und steigende Mengen von Östradiol absondert. Wenn die Östradiol-Spiegel während der follikulären Phase eine ausreichende Menge erreichen, können sie eine Zunahme der Sekretion von LH aus der Hypophyse auslösen, was eine Ovulation verursacht. Das Verhältnis der LH/FSH-Aktivität sowie die absoluten Hormonspiegel im Blut sind wichtig für die reproduktiven Funktionen wie z.B. die Follikelreifung und die Ovulation der geeigneten Anzahl von Oocyten während der Menstruations- und Östruszyklen.
Während die Sekretion sowohl von LH als auch von FSH durch Steroidhormone gehemmt werden kann, ist die Sekretion von FSH im Allgemeinen sensitiver gegenüber einer negativen Feedback-Regulation durch Östrogene als LH.
Tatsächlich können in vielen Arten hohe Mengen von Östrogenen die Sekretion von LH steigern, besonders, wenn die Progesteronspiegel niedrig sind. Die Verabreichung von Anti-Östrogenen, Verbindungen, welche die normale negative Feedback-Regulierung von Östradiol auf die Sekretion von FSH unterbrechen, führen häufig zu einer erhöhten Freisetzung von FSH und einer gesteigerten Herstellung von Gameten. Klinisch werden Anti-Östrogene umfangreich verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer Ovulation bei Frauen, die eine Erkrankung der polyzystischen Ovarien haben, zu erhöhen. Weil die negativen Wirkungen von Östradiol auf die Sekretion von FSH teilweise für die Kontrolle der Anzahl der Follikel, die sich am Punkt der Ovulation entwickeln, verantwortlich sind, kann die Unterbrechung des normalen negativen Östrogen-FSH-Feedback-Regelkreises zu der Ausstoßung einer ungeeigneten Anzahl von Eizellen führen. Ein Mechanismus, der zu einer erhöhten Sekretion von FSH führt, ohne die negative Feedback-Kontrolle der FSH-Sekretion zu eliminieren, würde eine wertvolle Verwendung bei der Steigerung der Fruchtbarkeit besitzen.
Gereinigtes FSH kann die Follikelentwicklung bei Frauen stimulieren, besonders wenn ebenfalls etwas endogenes LH vorhanden ist. Das Verhältnis von FSH/LH ist an dem Zeitpunkt des Menstruationszyklus am höchsten, wenn die Follikelentwicklung eingeleitet wird. Beide Hormone sind jedoch für die Fruchtbarkeit essentiell. Die Immunneutralisierung von LH führt zur Unfruchtbarkeit bei Männern und Frauen (10-12). Ebenso wurde gezeigt, dass die Immunneutralisierung von CG, einem Hormon, das über die LH-Rezeptoren wirkt, die Fruchtbarkeit in Primaten blockiert (13-16). Es wurde zuvor nicht gezeigt, dass Antikörper gegen LH die Fruchtbarkeit stimulieren.
Es wurde gezeigt, dass monoclonale Antikörper gegen hCG (hCG-mAk genannt) die Bindung von hCG an seinen Rezeptor in vitro hemmen (17). In Abhängigkeit von der Lage ihrer Epitope besitzen hCG-mAks unterschiedliche Fähigkeiten, um die Bindung hCG an die LH-Rezeptoren zu hemmen. B105 und B110 sind Beispiele von monoclonalen Antikörpern, die Epitope auf hCG und LH erkennen, die exponiert bleiben, wenn die Hormone an die LH-Rezeptoren binden (17). Komplexe der Hormone mit diesen monoclonalen Antikörpern binden an die LH-Rezeptoren, aber mit einer geringeren Affinität als die freien Hormone. Daher hemmen diese Antikörper die Bindung der Hormone an die LH-Rezeptoren. Der höchste Grad der Hemmung, der beobachtet wird, wenn der Antikörper im Überschuss vorliegt, beträgt jedoch weniger als 100% und ist niedriger als der von den Antikörpern, die Komplexe mit den Hormonen erzeugen, die nicht an LH-Rezeptoren binden. In der Gegenwart von ausreichend B105 oder B110 wird die Menge des Hormons, die benötigt wird, um eine biologische Antwort zu induzieren, erhöht. Daher ist auch ein starker Überschuss von einem der Antikörper, der ausreichend ist, um so gut wie alle freien hCG oder LH in einer Analyse zu binden, nicht dazu fähig, eine Antwort auf eines der Hormone zu verhindern, wenn die Konzentrationen der Hormon-Antikörper-Komplexe den Schwellenwert übersteigt.
Wie vorstehend diskutiert wurde, wurde vor mehreren Jahren gezeigt, dass die Immunneutralisierung von LH die Fruchtbarkeit verhindert. Dieses Phänomen erfolgt, weil die Antiseren, die in diesen Studien verwendet wurden, die biologischen Aktivität von LH neutralisierten. Wenn jedoch geeignete Antiseren oder Antikörper wie z.B. B105 oder B110 verwendet werden, wird die biologische Aktivität von LH nicht eliminiert. Sie wird dagegen auf eine zuvor bestimmte Menge vermindert. Wenn dies erfolgt, wird die Androgensynthese vermindert. Da Androgene die Vorläufer von Östrogenen sind, wird die Östrogensynthese ebenfalls vermindert. Die Abnahme von Östradiol besitzt eine größere Wirkung auf die Sekretion von FSH als auf die Sekretion von LH. Die Sekretion von FSH wird verstärkt werden und dies wird zu einem erhöhten Verhältnis von FSH/LH führen und die follikuläre Entwicklung verstärken. Bei Frauen wird dieses Verhältnis von FSH/LH zu einer erhöhten Follikelentwicklung führen. Bei Männern wird dieses Verhältnis von FSH/LH zu einer erhöhten Funktion der Sertoli-Zellen führen und zu einer erhöhten Spermatogenese.
Ein Ansatz zur Erhöhung der Fruchtbarkeit, der auf die Verminderung der LH-Spiegel beruht, wurde zuvor nicht verwendet. Zum Teil ist dies auf die vielen Berichte zurückzuführen, dass Antikörper gegen LH die Fruchtbarkeit hemmen, und darauf, dass die Verfahren für die Herstellung und die Selektion von Antikörpern, welche die Aktivität von LH vermindern, aber nicht neutralisieren, zuvor unbekannt waren. Daher würde man nicht erwarten, dass dieser Ansatz zur Erhöhung der Fruchtbarkeit erfolgreich sein würde. Wie nachfolgend diskutiert wird, besitzt dieser Ansatz zur Erhöhung der Fruchtbarkeit mehrere Vorteile im Vergleich zu den gegenwärtigen Techniken, besonders bei Frauen, die LH und FSH in der Hypophyse herstellen und daraus freisetzen. Weil die Verminderung der LH-Spiegel nicht die normalen endokrinen Feedback-Beziehungen zwischen Östradiol und FSH auf die Funktion der Hypophyse unterbricht, ist die Chance, eine Hyperstimulation der Ovarien zu induzieren, viel geringer als bei den existierenden Techniken. Dies bedeutet, dass der Bedarf für eine teure und aufwendige Überwachung des Patienten geringer ist. Zusätzlich wird nur eine oder höchstens einige wenige Behandlungen notwendig sein, um Fruchtbarkeit zu induzieren.
Ein anderes neues Verfahren zur Steigerung der Fruchtbarkeit besteht darin, einen LH-Antagonisten während der follikulären Phase des Menstruationszyklus zu verwenden. Seit mehreren Jahren ist bekannt, dass die Oligosaccharidketten auf den Glycoprotein-Hormonen für ihre Fähigkeit, eine Signaltransduktion zu erzeugen, essentiell sind (1). Die Fähigkeiten von Glycoprotein-Hormonen, denen Kohlenhydratreste fehlen, eine biologische Antwort zu erzeugen, ist beeinträchtigt. Diese Analoga können verwendet werden, um die Bindung von LH an seine Rezeptoren zu hemmen. Dies wird die Aktivität des zirkulierenden LH vermindern und dadurch die Fruchtbarkeit verbessern. Man hat nachgewiesen, dass deglycosylierte Gonadotropine kurze biologische Halbwertzeiten besitzen, und man zeigte, dass sie für ihre ursprünglich beabsichtigte Verwendung, nämlich die Fruchtbarkeit durch die Verminderung der Synthese des Lutealprogesterons und der Verursachung einer Fehlgeburt zu hemmen, nicht nützlich sind. Durch das Bewegen der Kohlenhydratreste zu abwechselnden Teilen des Hormons durch die Entfernung der Glycosylierungssignale (das heißt, die Aminosäuresequenzen Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X für jede Aminosäure außer Prolin steht) von einer Seite und das Erzeugen von Glycosylierungssignalen an abwechselnden Stellen der α- und β-Untereinheiten ist es möglich, Analoga mit einer verminderten Agonistenaktivität zu entwerfen, die ausreichend lange Halbwertzeiten besitzen, um nützlich zu sein. Zusätzlich ist es durch die Herstellung von Einzelketten-Gonadotropinen, in denen die α- und β-Untereinheiten kovalent verbunden sind, möglich, die Stabilität der Hormone im Kreislauf zu erhöhen. Dies liegt daran, dass die Rezeptor-Bindungsaktivitäten und die Halbwertzeiten der heterodimeren Gonadotropine im Plasma größer sind als bei einer der Untereinheiten. Die kovalente Bindung verhindert die Trennung der zwei Untereinheiten im Kreislauf. Die kovalente Bindung wurde schon für die Bindung von zwei Polypeptiddomänen, die durch einen Polypeptid-Linker verbunden waren, offenbart. Diese zwei Polypeptiddomänen definieren eine synthetische Hybridbindungsstelle, die eine Spezifität für ein zuvor ausgewähltes Antigen besitzt (66). Neue Peptid-Linker, die eine größere Stabilität zur Verfügung stellen und die weniger anfällig für eine Aggregation sind als Peptid-Linker, die zuvor bekannt waren, wurden für die Verbindung von Fusionspolypeptiden verwendet (67).
Während die Stimulierung der Fruchtbarkeit wichtig ist, um die Fruchtbarkeit bei sterilen Paaren wiederherzustellen, ist die Hemmung der Fruchtbarkeit häufig als ein Verfahren für die Familienplanung erwünscht. Zusätzlich wäre die Hemmung der Fruchtbarkeit bei der kommerziellen Züchtung von Vieh nützlich, da es den Bedarf an Kastration eliminieren würde und die Entwicklung der Brunst bei Rindern verhindern würde, die auf der Weide gehalten werden. Die Hemmung der Fruchtbarkeit bei anderen Tieren einschließlich Hunden und Katzen würde ebenfalls als ein Ersatz für deren Sterilisation und die Kastration wünschenswert sein. Die Hemmung der Fruchtbarkeit bei Pferden würde ebenfalls vor der Kastration bevorzugt werden, besonders wenn diese rückgängig gemacht werden kann. Wie vorstehend beschrieben wurde, kann die Fruchtbarkeit durch die Verabreichung von neutralisierenden Antikörpern gegen LH oder FSH gehemmt werden. Sie kann ebenfalls durch die Verwendung eines Impfstoffes gehemmt werden, um die Erzeugung dieser Antikörper zu induzieren. Durch die Wirkung von hCG bei der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft würde von Behandlungen, die dazu führen, dass die Sekretion oder Aktivität von hCG verringert wird, erwartet werden, dass sie eine Unfruchtbarkeit hervorrufen. Bei Frauen wäre es wünschenswerter, die Fruchtbarkeit durch die Hemmung von hCG als von hLH oder hFSH zu hemmen. Dies liegt darin begründet, dass Behandlungen, die hLH oder hFSH neutralisieren, einen Stillstand der Eierstockfunktion hervorrufen und den Beginn von Problemen, die mit der Menopause zusammenhängen, beschleunigen würden. In Rindern und anderen Haustieren wäre es wichtiger, LH zu hemmen, um die Pubertät zu verhindern oder die Hitze zu unterbrechen. Wie zuvor beschrieben wurde, können geeignete Antikörper gegen Choriogonadotropin die Fruchtbarkeit bei Primaten und Frauen hemmen, und die Entwicklung von Antikörpern gegen hCG wurde schon vor vielen Jahren als ein wichtiges mögliches Verfahren zur Empfängnisverhütung erkannt (18). Da hCG von einer großen Anzahl von menschlichen Krebsarten hergestellt wird und da Antikörper gegen hCG diese Tumore zerstören können, würde eine Immunisierung ebenfalls eine wichtige Auswirkung auf die Krebstherapie oder die Krebsprävention besitzen (19).
Verschiedene Versuche wurden unternommen, um einen solchen auf hCG basierenden Impfstoff zur Empfängnisverhütung zu entwickeln, wobei die Unterschiede zwischen hCG und den anderen Glycoprotein-Hormonen berücksichtigt wurden (14, 18). Leider wurde die Entwicklung des Impfstoffs durch die strukturellen Homologien zwischen allen Glycoprotein-Hormonen behindert. Das bevorzugte Immunogen muss hoch antigen sein, darf aber nicht Antikörper induzieren, die mit den anderen Glycoproteinen wie z.B. menschliches FSH, LH oder TSH kreuzreagieren. Basierend auf der Kenntnis der Wirkungen von Glycoprotein-Hormonen, die vorstehend skizziert wurden, würde ein Impfstoff, der Antikörper induziert, die mit LH, FSH oder TSH interagieren, ebenfalls Unfruchtbarkeit und/oder die Hemmung der Schilddrüsenfunktion verursachen. Leider würde die Neutralisierung von LH oder FSH ebenfalls zum Stillstand des normalen Menstruationszyklus und zum Verlust der Östrogen-Herstellung führen, die bei Frauen mit der Fruchtbarkeit assoziiert ist. Die Aufhebung der Eierstockfunktion würde sehr wahrscheinlich zu der frühzeitigen Entwicklung von Osteoporose und anderen Problemen, die mit der Menopause assoziiert sind, führen. Die Hemmung der Schilddrüsenfunktion würde zu einer Schilddrüsenunterfunktion führen. Die Ähnlichkeiten in den Strukturen von hCG und hLH haben es besonders schwierig gemacht, ein geeignetes Immunogen zu entwerfen, das keine kreuzreagierenden Antikörper erzeugt. Die meisten Anstrengungen wurden der Herstellung von Antikörpern gegen den einzigartigen C-Terminus der hCG β-Untereinheit gewidmet, da dieser Anteil des Moleküls nicht in hLH gefunden wird (1). Diese Region ist jedoch nicht sehr antigen. Es sind Anstrengungen unternommen worden, Immunogene zu entwickeln, die ebenfalls Peptide einschließen, die von der β-Untereinheit erhalten wurden (14), von Konjugaten der β-Untereinheit mit anderen Proteinen (20) oder von Heterodimeren, die Konjugate von β-Untereinheiten von hCG, und von α-Untereinheiten von Schafen (18) enthielten. Leider sind die meisten dieser Immunogene nicht sehr wirksam und ein besseres Immunogen wird benötigt, um dieses Verfahren praktikabel zu machen.
Die Schwierigkeiten, einen Impfstoff, der auf hCG basiert, zu entwickeln, können durch Verständnis der Strukturen der Glycoprotein-Hormone verstanden werden. Jedes der Glycoprotein-Hormone enthält eine gemeinsame α-Untereinheit. Während die Konformation von Teilen der α-Untereinheit sich in allen Hormonen unterscheiden und durch ausgewählte monoclonale Antikörper erkannt wird (21), besitzen Teile der α-Untereinheit die gleiche Konformation in jedem Glycoprotein-Hormon. Daher erkennen viele Antikörper gegen die α-Untereinheit LH, FSH, hCG und TSH. Da Antikörper gegen die α-Untereinheit häufig die Aktivitäten der Hormone blockieren können (22), besitzt ein Immunogen, das eine Antwort auf die α-Untereinheit induziert, sehr wahrscheinlich unerwünschte Nebenwirkungen. Daher sind die meisten Strategien zur Entwicklung eines Impfstoffs zur Empfängnisverhütung gegen die für das Hormon spezifische β-Untereinheit von hCG gerichtet.
Die β-Untereinheit von hCG ist am engsten mit der β-Untereinheit von hLH verwandt. Viele Antikörper, die gegen die intakte β-Untereinheit von hCG gerichtet sind, werden ebenfalls die β-Untereinheit von LH binden. Während die β-Untereinheiten der anderen Hormone sich deutlich von der von hCG unterscheiden, sind einige der Reste in allen β-Untereinheiten identisch und es besteht die Möglichkeit, wenn auch nur im geringen Maße, dass einige Antikörper gegen die β-Untereinheit auch mit diesen Hormonen kreuzreagieren. Die 31 Aminosäuren am Carboxy-Terminus der β-Untereinheit von hCG (CTP) sind nicht mit einem der Reste in den anderen Glycoprotein-Hormonen verwandt. Theoretisch können Antikörper gegen diese Region keine Kreuzreaktion mit den anderen Hormonen hervorrufen. Wenn diese Region als ein Immunogen verwendet wird, werden Antikörper entwickelt, die, wie erwartet, nicht mit den anderen Glycoprotein-Hormonen kreuzreagieren. Leider binden die Antikörper, die gegen synthetische CTP-Peptide hergestellt werden, nicht mit einer hohen Affinität an hCG. Teilweise ist dies auf die Beobachtung zurückzuführen, dass diese Region von hCG vier mögliche Serin gebundene Glycosylierungsstellen enthält und stark glycosyliert ist. Des weiteren ist ein großer Bereich dieser Region von hCG für die Interaktion mit den LH-Rezeptoren nicht essentiell. Daher binden die Antikörper, die gegen das CTP von hCG gerichtet sind, an hCG-Rezeptor-Komplexe und sind in erster Linie von der nichtneutralisierenden Art. Dementsprechend hemmen sie nicht die Wirkung von hCG, ähnlich wie Antikörper wie z.B. B101 (22), welche die Bindung von hCG an die LH-Rezeptoren hemmen.
Es wurden ebenfalls Anstrengungen unternommen, Antikörper gegen andere Anteile der β-Untereinheit von hCG zu entwickeln. Eine Region, die weitgehend untersucht wurde, ist die, die sich zwischen den Cysteinresten 38 und 57 befinden. Von diesem Anteil des Proteins ist bekannt, dass er eine große Schleife erzeugt, und Studien haben gezeigt, dass diese Schleife Steroidbiosynthese stimulieren kann (23,24). Daher würde man erwarten, dass Antikörper gegen diese Schleife von der neutralisierenden Art sein würden. Tatsächlich kann B101, ein Antikörper, von dem gezeigt wurde, dass er Reste innerhalb dieser Schleife erkennt (22,25,26), die Aktivität von hCG neutralisieren. Das Problem bei der Verwendung dieser Schleifenstruktur ist, dass die Antikörper, die hergestellt werden, häufig von einer niedrigen Affinität sind. Da hCG und hLH in dieser Region des Moleküls zusätzlich ähnlich sind (das heißt, nur drei der Aminosäuren sind unterschiedlich), wird erwartet, dass die Immunisierung mit dieser Schleife die Herstellung von Antikörpern gegen hLH hervorruft. Tatsächlich besitzt B101, ein Antikörper, der diese Region des Moleküls bindet, eine nicht akzeptierbar hohe Affinität für hLH.
Neueste Bemühungen für die Identifizierung der Tertiärstruktur der Glycoprotein-Hormone waren von der Charakterisierung der Bindungsstellen von Reihen von monoclonalen Antikörpern abhängig (26). Es wurden Antikörper identifiziert, welche die biologische Aktivität von hCG verhindern oder die seine biologische Aktivität teilweise neutralisieren. Wie in Beispiel 7 der vorliegenden Beschreibung dargestellt wird, können diese und ähnliche Antikörper verwendet werden, um Immunogene zu entwickeln, die das Potential besitzen, hCG nicht aber hLH zu neutralisieren, wobei Verfahren zur positiven und negativen Selektion verwendet werden, die in den Beispielen 6 und 7 skizziert werden, die nachfolgend dargelegt werden. Obwohl das Hormon kristallisiert wurde und die Kristallstruktur für die Bestimmung von Immunogenarten, die einen hohen Spiegel der Immunantwort auf bestimmte Teile des Moleküls geben würden, wertvoll wären, haben Schwierigkeiten bei der Lösung der Kristallstruktur diesen Ansatz ausgeschlossen. Bei dem derzeitigen Wissensstand der hCG-Struktur gibt es daher kein gutes Verfahren, das verwendet werde könnte, um vorherzusagen welche Art Immunogen am wirksamsten wäre.
Ein anderes nützliches Verfahren zur Steigerung der Fruchtbarkeit besteht darin, die Spiegel der FSH-Aktivität zu erhöhen. Ein Weg dies zu erreichen, besteht darin, kleine Dosen von über einen langen Zeitraum wirkenden Follitropinen zu verabreichen. Dies kann durch die Bindung von Molekülen mit einer Follitropinaktivität an Molekülen mit langen Halbwertzeiten im Plasma (das heißt Immunglobuline) oder durch die Herstellung von Einzelketten-Gonadotropin-Analoga, die Follitropinaktivität besitzen (Tabelle 1 und 2), hergestellt werden. Einzeln oder in Kombination mit Antikörpern gegen LH und/oder LH-Antagonisten erleichtern diese Hormone die Follikelentwicklung bei Frauen mit einer Erkrankung der polyzystischen Ovarien.
1 ist ein Graph, der den Einfluss von Antikörpern und Antiseren auf die Bindung des radioaktiv markierten hLH an die LH-Rezeptoren darstellt.
2 ist ein Graph, der den Einfluss von Antikörpern und Antiseren auf die Fähigkeit von hLH, Steroidbiosynthese in vitro zu induzieren, darstellt.
3 ist ein Graph, der den Einfluss von Antikörpern und Antiseren auf die Fähigkeit von hLH, Steroidbiosynthese in vivo zu induzieren, darstellt.
4 zeigt Vektoren, die in Strategien zur Matrize/Ausschlussselektion verwendet werden können.
5 zeigt Arten von Immunogenen, die eine erhöhte Antigenizität zur Verwendung bei der aktiven Immunisierung gegen LH, hCG oder FSH besitzen.
6 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #1 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
7 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #2 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
8 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #3 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
9 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #4 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
10 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #5 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
11 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #6 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
12 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #7 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
13 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #8 des Einzelketten-Gonadotropins und die Primer (unterstrichen) dar.
14 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #9 des Einzelketten-Gonadotropins und die Kassette (unterstrichen) dar.
15 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #10 des Einzelketten-Gonadotropins und die Kassette (unterstrichen) dar.
16 stellt die Herstellung der codierenden Region einer alpha-Untereinheit dar, der die Oligosaccharid-Signalsequenzen fehlen.
17 stellt die Herstellung der n Region einer beta-Untereinheit dar, der die asn-gebundenen Oligosaccharid-Signalsequenzen fehlen.
18 stellt die codierende Sequenz für das Analogon #1a des Einzelketten-Gonadotropins dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA- oder ein RNA-Molekül, das ein Einzelkettenprotein codiert, das ein Agonist oder ein Antagonist eines Vertebratenhormons ist, das aus der Gruppe bestehend aus dem luteinisierenden Hormon (LH), dem Follikel-stimulierenden Hormon (FSH), und Choriogonadotropin (CG) ausgewählt ist, wobei das Einzelkettenprotein eine Aminosäurensequenz der Formel
β-(Linker)-α oder
α-(Linker)-β aufweist,
wobei β die β-Untereinheit von LH, FSH oder CG oder eine Variante davon ist;
„Linker" sich auf einen Peptidlinker bezieht, der mindestens 1 und nicht mehr als 16 Aminosäuren enthält; und
α die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit darstellt, die LH, FSH und CG oder einer Variante davon gemeinsam ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Expressionssystem zur Herstellung eines Einzelkettenproteins, wie vorstehend definiert wurde, dessen Expressionssystem eine erste Nucleotidsequenz umfasst, die das Einzelkettenprotein codiert, das mit Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression der ersten Nucleotidsequenz zu bewirken.
Die Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante Wirtszellen, die so modifiziert wurden, dass sie das vorstehend erwähnte Expressionssystem enthalten, und ein Verfahren zur Herstellung eines Einzelkettenproteins, welches ein Agonist oder ein Antagonist eines Vertebratenhormons ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LH, FSH und CG, wobei das Verfahren, die Züchtung der vorstehend genannten Zellen unter Bedingungen umfasst, bei denen das Protein hergestellt wird, und gegebenenfalls die Gewinnung des Proteins aus der Kultur.
Die Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform das Einzelkettenprotein, wie es vorstehend definiert wurde.
In den vorstehend erwähnten Ausführungsformen kann das Einzelkettenprotein eine Formel haben, wie in Tabelle 1 dargelegt wird, oder worin β die β-Untereinheit von Choriogonadotropin ist und α eine Vertebraten-α-Untereinheit ist.
Die vorliegenden Anmeldung offenbart Verfahren zur Steigerung der Fruchtbarkeit durch die Verminderung der Aktivitäten und/oder der Spiegel von zirkulierenden Glycoprotein-Hormonen, die Lutropin (LH)-Aktivität besitzen. Die Moleküle, die dafür verwendet werden können, sind Antikörper, welche die biologische Aktivitäten von LH vermindern. Da Moleküle mit einer Lutropin-Aktivität für die Fruchtbarkeit essentiell sind, würde man von der Blockierung ihrer Aktivitäten erwarten, dass sie die Fruchtbarkeit eher vermindert als erhöht. Man findet im Allgemeinen aber, dass Lutropine, die Herstellung von Steroiden erhöhen, welche die Sekretion von Follitropinen (FSH) vermindern, Hormonen, die wichtige Rollen in der Fruchtbarkeit spielen. Dementsprechend führt die Reduktion der Aktivitäten von Lutropinen zu erhöhten Spiegeln von Follitropinen und/oder Verhältnissen von Follitropin/Lutropin. Wenn die LH-Aktivität vermindert, aber nicht vollständig unterdrückt ist, führt der Anstieg der FSH-Aktivität und/oder des Verhältnisses von FSH/LH zu einer verstärkten Herstellung von Gameten und einer erhöhten Fruchtbarkeit bei Menschen und Tieren. Die vorliegende Anmeldung offenbart ebenfalls neue Verfahren zur Entwicklung und/oder zur Selektion von Antikörpern gegen spezifische Anteile von Proteinen einschließlich LH und menschliches Choriogonadotropin (hCG), welche es erlauben, deren biologische Aktivitäten auf das gewünschte Maß zu vermindern. Es werden hierin Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie Antikörper und Immunogene gegen spezifische Anteile von ausgewählten Gonadotropinen entwickelt werden können, einschließlich solchen Antikörpern und Immunogenen, die in der Struktur sehr ähnlich sind. Einige dieser Antikörper und Immunogene werden für die Unterdrückung der Fruchtbarkeit Verwendung finden und andere Antikörper und Immunogene werden für die Steigerung der Fruchtbarkeit Verwendung finden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Molekülen, die an LH- und FSH-Rezeptoren binden können und die in Abhängigkeit von dem Zeitpunkt, an dem sie verabreicht werden, entweder die Fruchtbarkeit erhöhende oder die Fruchtbarkeit hemmende Wirkungen besitzen. Einige von diesen sind Moleküle, die an die LH-Rezeptoren binden und die Wirkung von LH blockieren werden. Wenn diese in der follikulären Phase verabreicht werden, werden sie die LH-Aktivität unterdrücken und dabei die Sekretion von Androgen- und Östrogen unterdrücken. Dementsprechend werden die FSH-Spiegel steigen und die Fruchtbarkeit wird erhöht werden. Wenn sie nach dem Eisprung während der Lutealphase des Menstruationszyklus gegeben werden, werden sie die Aktivität von hCG unterdrücken und dazu führen, dass die Schwangerschaft beendet wird. Andere Moleküle binden an FSH-Rezeptoren und besitzen FSH-Aktivität. Diese sind langwirkende Analoga von FSH und wenn sie in geringen Mengen gegeben werden, werden sie die Follikelreifung stimulieren. Weil sie die Östrogensynthese stimulieren werden, werden die Östrogenspiegel steigen und der Spiegel der FSH-Sekretion in der Hypophyse wird sinken. Vorausgesetzt, dass diese in begrenzten Mengen verabreicht werden, werden sie keine Hyperstimulation der Eierstöcke induzieren. Dies wird ebenfalls direkte Wirkungen auf die Stimulierung der Fruchtbarkeit bei Männern haben. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Molekülen, die in der Lage sind, die Wirkungen von FSH und sowohl von FSH als auch LH zu hemmen. Diese Moleküle werden für die Behandlung von Frauen nützlich sein, die ein hyperaktives Eierstockgewebe besitzen, häufig als Folge einer Gonadotropin-Therapie. Die Hyperstimulierung der Eierstöcke ist möglicherweise fatal und diese Analoga binden an FSH-Rezeptoren oder sowohl an FSH- als auch an LH-Rezeptoren, um eine weitere Entwicklung der Eierstöcke zu unterdrücken.
Gemäß der vorliegenden Anmeldung werden Verfahren beschrieben, um die Fruchtbarkeit bei Menschen und Tieren durch das neue Verfahren der Hemmung der Aktivität von Lutropin zu verbessern, wobei eine passive oder eine aktive Immunisierung verwendet wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Blockierung der Wirkungen von LH zu einer Hemmung der Fruchtbarkeit führen wird. Hier wird gezeigt, dass geeignete LH-Antikörper verwendet werden können, um die Fruchtbarkeit wiederherzustellen oder zu stimulieren. Dieser Ansatz sollte das Risiko der Hyperstimulierung vermindern und eine normalere Regulierung der Fruchtbarkeit mit einer geringeren Überwachung erlauben. Es werden verschiedene Verfahren zur Herstellung und zum Test der Antikörper oder der Antiseren, die zur Förderung der Fruchtbarkeit benötigt werden, zur Verfügung gestellt.
Andere Verfahren sind erhältlich, um das Verhältnis von FSH/LH zu verändern, einschließlich Verfahren zur Verabreichung von FSH oder der Gabe von Antiöstrogen. Das hierin beschriebene Verfahren, das auf die Verwendung von anti-LH basiert, besitzt jedoch wichtige Vorteile gegenüber diesen anderen Verfahren. Der Grad der maximalen Hemmung kann für jeden Antikörper durch einen in vitro Test vorsichtig bestimmt werden. Unabhängig von der Menge des verabreichten Antikörpers kann daher durch die geeignete Wahl des Antikörpers verhindert werden, dass die Aktivität von LH unter einem zuvor bestimmten Spiegel inhibiert wird. Zum Beispiel würde B105 die wirksamen hLH-Spiegel um einen Faktor von etwa 4 vermindern, während B110 die wirksamen hLH-Spiegel um einem Faktor von etwa 2 vermindern wird. Die verminderten LH-Spiegel werden es erlauben, dass die FSH-Spiegel steigen. Wenn die FSH-Spiegel steigen, werden sie die Follikelentwicklung und die Herstellung von Östrogenen hervorrufen. Wenn diese Spiegel die physiologischen Konzentrationen, die kennzeichnend für eine geeignete Follikelentwicklung sind, erreicht haben, werden sie die Sekretion von mehr FSH negativ hemmen. Daher behält die hierin beschriebene Behandlung die wertvollen Aspekte der Selbstregulation, die bei den existierenden Verfahren fehlen, die von der Verabreichung von FSH oder Antiöstrogenen abhängig sind, um die Fruchtbarkeit zu stimulieren. Des weiteren benötigt das auf anti-LH basierende Verfahren, im Gegensatz zur Induktion der Ovulation mit GnRH (gonadotropin releasing hormone oder mit GnRH-Analoga, nicht die wiederholenden Infusionen eines Hormons oder eines Hormon-Analogons. Diese Behandlung bietet den möglichen Vorteil einer einzelnen oder höchstens einigen wenigen Behandlungen über mehrere Tage. Dies wird besonders bei der Regulierung der Ovulation bei Menschen oder Tieren wichtig sein. Bei Menschen sollte dieses Verfahren am geeignetsten für die Behandlung der Erkrankung der polyzystischen Ovarien sein, die häufig durch ungeeignete hohe Spiegel von LH gekennzeichnet sind. Weil die LH-Spiegel vermindert werden, werden die FSH-Spiegel steigen und eine Follikelentwicklung wird stattfinden. Wenn die Follikelentwicklung stattfindet, werden jedoch die steigenden Östrogenspiegel die Sekretion von zusätzlichem FSH blockieren. Die Tendenz, die Entwicklung von zu vielen Follikeln zu fördern mit potentiell gefährlichen Konsequenzen, wird dadurch minimiert.
Es werden ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Immunogens beschrieben, welches auf die Verwendung von Matrizen- und Ausschlussantikörpern basiert. Die Verwendung dieser Antikörper wird es ermöglichen, eine spezifische Immunantwort auf bestimmte Domänen des Proteins zu entwickeln. Dieses Verfahren wird Verwendungen für die Induzierung oder die Hemmung der Fruchtbarkeit besitzen, wie hierin gezeigt wurde. Da die Antikörper gegen hCG Tumorwachstum hemmen können, sollte dieses Verfahren ebenfalls für die Entwicklung von Impfstoffen, die benötigt werden, um die Entwicklung oder die Progression von hCG-sezernierenden Tumoren zu hemmen, nützlich sein. Dieses Verfahren sollte ebenfalls in jedem System, in dem ein spezifisches Immunogen benötigt wird, Verwendung finden.
Mit Bezug auf die Struktur der Antikörper ist nichts einzigartig, was sie nützlich für die Induzierung der Fruchtbarkeit macht, mit Ausnahme der Tatsache, dass sie hLH oder anderes LH binden. Daher würde man vermuten, dass Teile der Antikörper, welche die Fähigkeit behalten, LH zu binden, ebenfalls eine ähnliche Aktivität besitzen. Diese würden Fab-Fragmente, (Fab')₂-Fragmente, Einzelketten-Antikörper oder jedes Molekül, dass an hLH oder LH bindet, was seine biologische Aktivität vermindert, einschließen. Das Fab-Fragment ist ein Teil eines Antikörpers, der die Antigen-Bindungsstelle enthält und der durch Spaltung mit Papain hergestellt wird. Das (Fab')₂-Fragment ist ein Teil eines Antikörpers, der zwei Antigen-Bindungsstellen enthält und der durch Spaltung mit Pepsin hergestellt wird.
Vorzugsweise werden die Verfahren zur Erhöhung der Fruchtbarkeit während der follikulären Phase des Säugetiers durchgeführt und stärker bevorzugt während der follikulären Phase des Menstruationszyklus.
Das Glycoprotein-Hormon, das in der vorliegenden Anmeldung reguliert werden soll, ist ein Reaktionspartner in einer Reaktion zwischen bindenden Gegenstücken. Die bindenden Gegenstücke sind Proteine, die eine spezifische Bindungsaktivität für einander besitzen. Einer der bindenden Gegenstücke ist ein Stoff, der gebunden werden kann, der aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen und einem Hapten ausgewählt wird. Bevorzugt ist ein Antigen als Stoff, der gebunden werden kann. Das andere bindende Gegenstück ist ein Stoff, der gebunden werden kann, der aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einem spezifisch bindenden Protein ausgewählt ist. Der bevorzugte bindende Stoff ist ein Antikörper.
Antigene sind Substanzen, die unter geeigneten Bedingungen die Erzeugung von Antikörpern induzieren und die in einer nachweisbaren Weise mit den so induzierten Antikörpern spezifisch reagieren können. Antigene können lösliche Substanzen wie z.B. Toxine und fremde Proteine oder bestimmte Substanzen wie z.B. Bakterien oder Gewebezellen sein. Im Allgemeinen sind Antigene Substanzen mit hohem Molekulargewicht wie z.B. einfache oder konjugierte Proteine oder Kohlenhydrate.
Antikörper sind Immunglobulinmoleküle, die eine spezifische Aminosäuresequenz besitzen, die es erlaubt, nur mit dem Antigen zu interagieren, das seine Synthese im lymphatischen Gewebe induziert, oder mit einem Antigen, das eng mit diesem Antigen verwandt ist. Immunglobuline sind Proteine, die aus zwei leichten Ketten und zwei schweren Ketten aufgebaut sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper aus der Gruppe bestehend aus rekombinanten Proteinen und synthetischen Peptiden ausgewählt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Säugern, z.B. Tieren oder Menschen, in Mengen verabreicht werden, die wirksam sind, um die erwünschte Aktivität zu liefern. Da die Aktivität der Verbindungen und der Grad des gewünschten therapeutischen Effekts variiert, wird der Dosierungsspiegel der verwendeten Verbindung ebenfalls variieren. Die tatsächliche Dosis, die verabreicht wird, wird ebenfalls durch solche im Allgemeinen anerkannten Faktoren wie z.B. Körpergewicht des Patienten und die individuelle Hypersensitivität des bestimmten Patienten bestimmt werden. Daher kann die Dosierungseinheit für einen bestimmten Patienten (Mann) von einem niedrigen Wert wie etwa 0,1 μg pro kg Körpergewicht ausgehend variieren, welcher durch den praktizierenden Arzt bis zu der gewünschten Wirkung titriert werden kann. Eine bevorzugte minimale Dosis für die Titration ist 1 μg/kg Körpergewicht.
Die vorliegende Anmeldung wird weiter durch die nachfolgenden Beispiele dargestellt. Alle Anteile und Prozentausgaben in den Beispielen und innerhalb der Beschreibung und der Ansprüche beziehen sich auf das Gewicht der endgültigen Zusammensetzung, außer, es wird anders beschrieben.
Bindende Agenzien, welche die biologische Aktivitäten des luteinisierenden Hormons und des menschlichen Choriogonadotropin vermindern, um zu ermöglichen, dass ihre biologischen Aktivitäten auf das gewünschte Maße vermindert werden.
Beispiel 1
Verwendung von anti-LH-Antikörpern zur Induktion der Fruchtbarkeit
Weil einige anti-Hormon-Antikörper die biologische Aktivität der Hormone hemmen, entweder weil sie die Bindung des Hormons an Rezeptoren verhindern oder durch die Erhöhung seines Metabolismus, werden sie nützlich sein, um den Spiegel der aktiven Hormone im Kreislauf zu vermindern. Antikörper gegen LH können das Verhältnis des biologisch aktiven FSH zu LH im Kreislauf erhöhen. Teilweise liegt dies daran, dass sie die Aktivität von LH vermindern. Da LH ein Hormon ist, das die Synthese von Steroidsubstraten, die in Östrogene umgewandelt werden können (4), stimuliert, wird die Verminderung der LH-Aktivität zusätzlich durch eine Verminderung der Östrogene begleitet werden. Die Verminderung der Östrogenspiegel wird die Hemmung der Sekretion von FSH vermindern und die FSH-Spiegel werden steigen. Als eine Konsequenz wird bei der Frau die Follikelentwicklung verstärkt werden. Bei dem Mann wird die Spermatogenese unterstützt werden. Nicht alle Antikörper besitzen die Fähigkeit, die LH-Spiegel in einer nichtneutralisierenden Weise zu reduzieren. Antikörper, welche die Wirkungen von LH vollständig neutralisieren, werden die Fruchtbarkeit herabsetzen, außer sie werden in einer begrenzenden Weise verabreicht (das heißt, die Gesamtmenge des verabreichten Antikörpers ist geringer als die Gesamtmenge des zirkulierenden LH). Nichtneutralisierende Antikörper werden für die Erhöhung der Fruchtbarkeit bevorzugt, da sie im Überschuss zu der Gesamtmenge von LH verabreicht werden können. Daher wird, sogar wenn das meiste LH an die Antikörper gebunden werden kann, die LH-Aktivität vermindert, aber nicht neutralisiert. Weil mehr als ausreichend LH zur Follikelentwicklung vorhanden ist, verhindert die teilweise Verminderung der LH-Aktivität nicht die Follikelentwicklung. Zusätzlich werden die gesteigerten Mengen an Östrogenen, die hergestellt werden, wenn der Follikel seine Entwicklung verstärkt, die normale Feedback-Kontrolle der Sekretion von FSH nachahmen, um eine Hyperstimulierung der Ovarien zu verhindern. Die Verabreichung von 10 μg – 10 mg Antikörper mit hoher Affinität (das heißt, Ka > 5 × 10⁷ M^–1) wird ausreichend sein, um bei Frauen, die eine Erkrankung der polyzystischen Ovarien haben, die Fruchtbarkeit zu induzieren. Die Identifizierung und Charakterisierung von geeigneten Antikörpern wird in Beispiel 2 dargestellt.
Beispiel 2
Identifizierung und Auswahl der besten LH-Antikörper
Nicht alle Antikörper, welche die LH-Aktivität hemmen, sind gleichermaßen nützlich zur Behandlung von Unfruchtbarkeit. Zum Beispiel können hohe Überschusskonzentrationen von Antikörpern wie B101, die an hCG und LH (wenn auch mit einer geringeren Affinität) binden, die Bindung der Hormone an die LH-Rezeptoren verhindern (22). Wenn sie im Überschuss vorhanden sind, „neutralisieren" die Antikörper, welche die Bindung von LH oder hCG an ihre Rezeptoren verhindern, die biologische Aktivität des Hormons. Während die Neutralisierung von LH von einem Abfallen der Androgen- und Östrogenspiegel und einem Ansteigen der FSH-Spiegel gefolgt würde, würde die Verminderung der LH-Aktivität unter den minimalen Spiegel, der für die Fruchtbarkeit benötigt wird, die Fruchtbarkeit so lange verhindern, wie ein Überschuss des Antikörpers vorhanden wäre, da LH für die Fruchtbarkeit benötigt wird. Tatsächlich wurde gezeigt, dass neutralisierende Antikörper oder Antigene, welche die Herstellung von neutralisierenden Antikörpern hervorrufen, die Fruchtbarkeit in Tieren hemmen (10). Es wäre möglich, limitierte Mengen der neutralisierenden Antikörper zu verabreichen, um die Konzentrationen von LH auf einen zuvor bestimmten Spiegel zu vermindern, oder die hemmende Wirkung eines neutralisierenden Antikörpers durch die Verabreichung eines anti-idiotypischen Antikörpers umzukehren. Aufgrund der Variationen zwischen Individuen wäre es jedoch schwierig zu bestimmen, wie viel Antikörper nötig sein würde, um die gewünschte Wirkung zu erzielen außer eine fast vollständige Hemmung der LH-Aktiviät wäre erwünscht oder die Messungen von FSH und/oder der Gonadenfunktion (z.B. die Bestimmung der Steroidspiegel im Plasma) würden durchgeführt. Obwohl dies möglich ist, vermindert die Notwendigkeit diese Messungen durchzuführen, die Attraktivität Antikörper zu verwenden, die vollständig die Aktivität von LH neutralisieren, um die Fruchtbarkeit zu unterstützen. Neutralisierende Antikörper können ebenfalls verabreicht werden, um die Wirkung von LH vorübergehend zu verhindern, bis die FSH-Spiegel gestiegen sind. Anschließend könnte der im Überschuss vorliegende, neutralisierende Antikörper durch verabreichen eines anti-idiotypischen Antikörpers entfernt werden, wodurch die anti-LH-Antikörper neutralisiert werden, um die Fruchtbarkeit wiederherzustellen, oder durch Überwinden der Wirkung des Antikörpers durch die Verwendung von LH oder CG oder einer Menge des Antikörpers, die ausreichend herabgesetzt wäre, um die Wirkung des LH-Anstiegs in der Mitte des Zyklus zu erlauben. Dieser Ansatz ist jedoch komplexer als die Verwendung von nichtneutralisierenden Antikörpern, die nachfolgend dargestellt werden.
Die bevorzugten Antikörper hemmen die Aktivität von LH, aber sie können nicht vollständig seine Wirkung blockieren, sogar wenn sie in Konzentrationen verabreicht werden, die ausreichend sind um das gesamte LH, das im Kreislauf vorhanden ist, zu binden. Diese Antikörper können im Allgemeinen die freien Hormone sowie die Hormon-Rezeptor-Komplexe binden. Sie hemmen die Wirkung des Hormons durch die Verringerung der Affinität des Hormons für seinen Rezeptor, vermindern die Aktivität der gebundenen Hormone und/oder steigern die Clearance-Rate des Hormons. Beispiele von solchen Antikörpern schließen B105 und B110 ein. Diese Antikörper vermindern die biologischen Aktivitäten der Hormone in verschiedenem Ausmaß (17) und können von der Columbia University, New York, NY oder von UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ erworben werden. Andere kommerziell erhältliche Antikörper schließen 518B7 (erhältlich von Dr. Janet Roser, University of California at Davis, Davis, CA) und ZMCG7 (erhältlich von Pierce Chemical Co., 3747 North Meridian Road, Rockford, IL) ein. Weil Komplexe dieser Antikörper mit hCG die Rezeptoren binden können, ist der Grad der Hemmung begrenzt, auch wenn der Antikörper in einem sehr hohen Überschuss vorliegt. Die Stärke der Hemmung kann einfach durch Analysen in vitro vor ihrer Verwendung in vivo bestimmt werden. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass ein sehr großer Überschuss von B110 die Aktivität von hCG nur um etwa die Hälfte vermindert, während ein sehr hoher Überschuss an B105 die Aktivität von hCG um etwa drei viertel vermindert. Jeder dieser Antikörper bindet an hLH und man würde erwarten, dass er den gleichen Einfluss auf die LH-Aktivität ausübt.
Die Identifizierung von geeigneten Antikörpern aus einer Gruppe von monoclonalen Antikörpern, die gegen hLH hergestellt wurden, kann wie folgt hergestellt werden. Diese Antikörper können durch Standardverfahren (22, 27-32), durch die Immunisierung von Mäusen mit hLH, hCG oder LH von anderen Arten, LH- oder hCG-Fragmenten, teilweise oder vollständig deglycosyliertem LH oder hCG oder LH- oder hCG-Analoga, die eine Immunantwort auf die gewünschten Arten von LH hervorrufen können, erhalten werden. Diese Antikörper können ebenfalls durch die Auswahl von künstlich hergestellten Antikörpern erhalten werden (33-36). Diese gleiche Strategie könnte verwendet werden, um Antikörper gegen LH von fast jeder anderen Art zu identifizieren. Sie könnte ebenfalls verwendet werden, um Antiseren zu identifizieren, die ähnliche Eigenschaften besitzen. Diese Antiseren könnten als Antwort auf LH- oder hCG-Analoga hergestellt werden oder sie könnten durch Immunadsorption oder durch die Entfernung von unerwünschten Antikörperkomponenten erhalten werden.
Die Antikörper, welche die gewünschten hemmenden Eigenschaften besitzen, können durch das Messen ihrer Fähigkeiten, die Bindung von LH an die LH-Rezeptoren zu hemmen, identifiziert werden. Diese Art der Untersuchung kann durch einen Fachmann auf dem Gebiet der Messung der Rezeptorbindung durchgeführt werden und das nachfolgende Beispiel bezieht sich darauf, wie man Antikörper gegen hLH auswählen könnte. Selbstverständlich würde dies ebenfalls für jede Art von LH, für die Antikörper erhältlich wären, anwendbar sein. Da hLH gut an LH-Rezeptoren von Nagetieren bindet, ist es nicht notwendig, dass menschliche LH-Rezeptoren in der Untersuchung verwendet werden, obwohl menschliche LH-Rezeptoren ebenfalls funktionieren würden. Ein einfacher erster Schritt ist, den Einfluss des Antikörpers auf die Bindung von radioaktiv markiertem hLH an Luteal-LH-Rezeptoren von Ovarien von Ratten zu messen. Das radioaktiv markierte hLH kann durch Inkubation von 10 μg hLH mit 500 μCi Na¹²⁵I für 30 Sekunden bei 4°C in einem kleinen Glassröhrchen, das mit 1,5 μg Iodo-Gen^® (Pierce Chemical Co.) beschichtet wurde, hergestellt werden. Das ¹²⁵I-hLH und das nicht umgesetzte ¹²⁵I werden durch Gelfiltration getrennt. Die Rezeptoren können durch die Verabreichung von 50 IE Serum-Gonadotropin von schwangeren Stuten, auch bekannt als PMSG oder Pferde-CG (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), an weibliche Sprague-Dawley-Ratten, die 23 – 26 Tage alt sind, hergestellt werden. Das PMSG stimuliert die Follikelentwicklung. Nach etwa 56 – 65 Stunden wird den Tieren 25 IE hCG (ebenfalls erhältlich von Sigma Chemicals Co.) verabreicht, um die Erzeugung der Corpora Lutea hervorzurufen. Die hoch luteinisierenden Ovarien werden eine Woche später entfernt und in einem Puffer, der 40 mM Tris (pH-Wert 7,4) und 5 mM MgCl₂ enthält, homogenisiert. Eine rohe Fraktion von nucleären und Membranproteinen des Homogenats wird durch die Zentrifugation des Homogenats bei 1000 × g für 20 Minuten bei 4°C gewonnen. Diese wird einmal durch ihre Resuspension in dem Tris-MgCl₂-Puffer und ihrer erneuten Sedimentierung bei 1000 × g für 20 Minuten bei 4°C gewaschen. Das endgültige Pellet (welches das „Ovarien-Homogenat-Pellet" genannt wird) wird in dem Tris-MgCl₂-Puffer resuspendiert, wobei ein Volumen von 2 ml für jedem Eierstock, der zu Beginn der Homogenisierung vorhanden war, verwendet wird. Eine Menge des Ovarien-Homogenat-Pellets, das ungefähr 1/20 eines Eierstocks entspricht (das heißt, etwa 5 mg des Materials in 100 μl Puffer) wird in Reaktionsgefäße, die etwa 1 – 2 ng mit radioaktivem Iod markiertes LH (das heißt, etwa 100.000 cpm) und verschiedene Mengen des Antikörpers (das heißt, in einem Bereich von 1 pg bis 10 μg oder mehr) enthalten, gegeben. Nachdem die Reaktionsgefäße für einen ausreichenden Zeitraum inkubiert wurden, um zu ermöglichen, dass das radioaktiv markierte LH an die Rezeptoren binden kann (das heißt, 30 – 60 min bei 37°C oder über Nacht bei Raumtemperatur), werden die Rezeptor-gebundenen und die freien, radioaktiv markierten Proteine durch die Verdünnung des Reaktionsgemisches auf 2 ml mit einer 0,9% NaCl-Lösung, die Zentrifugation des Gemisches und dem Verwerfen des Überstandes getrennt. Die Menge des radioaktiv markierten hLH, das an die LH-Rezeptoren von Ovarien von Ratten gebunden ist, wird durch die Untersuchung des Pellets in einem Gamma-Zähler bestimmt. Man würde vermuten, dass die Arten der Hemmung, die in 1 gezeigt werden, zu beobachten sind. Einige Antikörper werden die Bindung des radioaktiv markierten hLH in dem gleichen Ausmaß wie ein sehr großer Überschuss an nichtmarkiertem hLH oder hCG vollständig hemmen, während andere die Bindung nicht hemmen werden oder sogar die Bindung verstärken können, wenn sie in einem großem molaren Überschuss relativ zu dem radioaktiv markierten LH vorhanden sind. Diese beiden Arten von Antikörpern sind weniger wünschenswert als solche Antikörper, welche die Bindung von hLH auf ein mittleres Niveau senken (vergleiche 1). Die nützlichsten Antikörper werden daher die Bindung des radioaktiv markierten LH nicht in dem gleichen Ausmaß wie ein sehr großer Überschuss an nichtmarkiertem LH hemmen. Antikörper, welche die Bindung des radioaktiv markierten LH in dem gleichen Ausmaß wie ein sehr großer Überschuss an nichtmarkiertem LH hemmen, werden ebenfalls nützlich sein, aber es wird eine größere Sorgfalt notwendig sein, um sicherzustellen, dass der Antikörper nicht die Aktivität von LH zu stark unterdrückt, wenn er in vivo verwendet wird. Wenn zu viel der LH-Aktivität in dem LH-Anstieg neutralisiert wird, wird dies zur Unfruchtbarkeit führen.
Ein anderes nützliches Verfahren, um Antikörper zu identifizieren, welche die gewünschte Fähigkeit besitzen, die LH-Aktivität zu vermindern, besteht darin, einen in-vitro-Test durchzuführen, um zu bestimmen, ob die Antikörper die Wirkung von hLH auf die Biosynthese von Steroiden hemmen. In dieser Untersuchung kann man die Hoden von männlichen Nagetieren verwenden. Ein typisches Beispiel, in dem hLH verwendet wird, ist in 2 dargestellt. Eine rohe Leydig-Zellsuspension von Ratten wird unter Verwendung von Collagenase hergestellt, wie beschrieben wurde (37), und die Zellen werden mit verschiedenen Mengen von LH und den zu testenden Antikörpern inkubiert. Nach etwa 2 – 4 Stunden bei 37°C wird der Testosterongehalt in den Reaktionsgefäßen mittels einer Radioimmunanalyse gemessen. Wenn steigende Konzentrationen von hLH mit den Leydig-Zellen inkubiert werden, rufen sie eine verstärkte Produktion von Testosteron hervor und sie werden eine Steigung mit einer typischen Dosis-Reaktions-Kurve ergeben, in der die hLH-Konzentrationen von 1 – 10 pM ausreichend sein werden, um die Steroidproduktion auf etwa 50% des maximalen Spiegels zu erhöhen (vergl. 2, Kurve A). Die nützlichsten Antikörper werden durch ihre Fähigkeiten identifiziert, die LH induzierte Steroidbiosynthese zu hemmen. Wenn verschiedene monoclonale Antikörper zu LH zugegeben werden, bevor das Hormon zu den Zellen gegeben wird, werden einige gefunden werden, welche die Fähigkeit von LH, die Erzeugung von Testosteron zu stimulieren, vermindern. Die nützlichsten hemmenden Antikörper werden die Dosis-Reaktions-Kurve zu weniger sensitiven Werten verschieben (vergl. 2, Kurven B und C). Während der Grad der Verschiebung anfänglich von der Konzentration des Antikörpers abhängig sein wird, wird ein sehr hoher Überschuss des Antikörpers (das heißt, mehr als 100fach größer als die maximal verwendete Menge von hLH) die LH induzierte Erzeugung von Testosteron nicht verhindern. Die am wenigsten nützlichen Antikörper werden die Stimulation der Erzeugung von Testosteron verhindern, wenn der Antikörper in einem 100fachen molaren Überschuss vorliegt (vergl. 2, Kurve D). Diese Art von Untersuchung wird Antikörper nachweisen, welche die LH-Aktivität durch die Verminderung seiner Bindung an LH-Rezeptoren hemmen und sie wird ebenfalls Antikörper nachweisen, welche die Aktivität von gebundenem LH hemmen. Beispiele von nützlichen Antikörpern schließen B105, B110, 518B7 und ZMCG7 ein, wie vorstehend beschrieben wurde. Es wird notwendig sein, diese zu modifizieren, wie nachfolgend beschrieben wird, bevor sie wiederholt in Frauen verwendet werden können.
Wenn Antikörper oder Antiseren ausgewählt wurden und bestätigt wurde, dass sie die Kriterien erfüllen, die vorstehend beschrieben und in den 1 und 2 dargestellt werden, sollten ihre Fähigkeiten, die Wirkungen von LH zu hemmen, in vivo getestet werden. Ein großer Überschuss des Antikörpers (das heißt, 100 μg oder mehr) wurde männlichen Ratten verabreicht. Zwanzig Minuten später wurden einige der Ratten nur mit dem Vehikel behandelt (Kontrolle) und anderen wird hLH oder LH, das in der Struktur dem des Tieres ähnlich ist, für das der Antikörper verwendet werden soll, verabreicht. Eine Stunde später werden die Testosteronspiegel des Plasmas durch eine Radioimmununtersuchung gemessen. Ein typisches Beispiel wird in 3 dargestellt. Die nützlichsten Antikörper oder Antiseren werden die Potenz von hLH vermindern, nicht aber seine Aktivität verhindern, sogar wenn sie im Überschuss zu der Gesamtmenge des verabreichten LH vorliegen. Die Untersuchung wird Antikörper nachweisen, welche die Hormonaktivität durch die Hemmung der Bindung von LH an die Rezeptoren vermindern, welche die Aktivität von gebundenem LH hemmen und/oder welche die Clearance-Rate von LH erhöhen. Unabhängig von dem Grund der Hemmung in vivo werden die nützlichsten Antikörper oder Antiseren nicht die Aktivität von hohen Spiegeln von LH verhindern, sogar wenn sie im Überschuss zum zirkulierenden LH vorliegen. Dies kann durch die Messung der Fähigkeit des Serums, mit radioaktivem Iod markiertes hLH nach der Verabreichung des Antikörpers zu binden. Eine Serumprobe (0,01 – 1 μl) wurde auf 25 μl mit einer Lösung, die 0,9% NaCl, 1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2) enthält, verdünnt. Dazu wird 25 μl mit radioaktivem Iod markiertes LH (etwa 50 nCi, das etwa 1 ng enthält) gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Eine Lösung von Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) (erhältlich von Cappel, Organon Teknia Corp., West Chester, PA), die 2 μg IgG in 50 μl der NaCl-Albumin-Lösung enthält, die vorstehend beschrieben wurde, wurde zugegeben und die so erhaltene Lösung wurde 90 Minuten bei 37°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Zu dieser Lösung wurde 100 μl 1% IgGsorb (erhältlich von The Enzyme Center, Inc., 36 Franklin St., Malden, MA), das in Wasser rekonstituiert wurde, gegeben. Diese Suspension wurde 30 Minuten bei 22°C gemischt und anschließend durch die Zugabe von 3 ml der NaCl-Albumin-Lösung, die eiskalt war, verdünnt. Das Gemisch wurde für 10 Minuten bei 2000 × g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Radioaktivität in dem Pellet mit einem Gamma-Zähler gemessen. Als eine Negativkontrolle verwendet man ein Serum von einem Tier, das nicht aktiv oder passiv immunisiert wurde. Als eine Positivkontrolle verwendet man 0,1 – 1 ng des Antikörpers, der ursprünglich dem Tier injiziert wurde. Die Radioaktivität, die in dem Pellet von der Negativkontrolle gemessen wurde, wird von der in der Positivkontrolle und von der in den Serumproben, die getestet wurden, abgezogen. Beim Vergleich der Werte für die Positivkontrolle und den Serumproben wird das Serum, das den Antikörper im Überschuss zu LH enthält, zur Immunpräzipitation von mindestens 1% – 10% des mit radioaktivem Iod markierten LH ebenso wie Positivkontrolle in der Lage sein.
Die Verabreichung von Antikörpern gegen hLH bei Menschen wird die wirksamen Konzentrationen des zirkulierenden LH vermindern. Der maximale Umfang der Verminderung ist von der Lokalisation der Bindungsstelle des Antikörpers an LH abhängig. Die Verminderung der LH-Aktivität vermindert die Sekretion von Hormonen der Ovarien und der Hoden und vermindert somit die Feedback-Hemmung von FSH. Daher steigen die FSH-Spiegel und die Fruchtbarkeit wird erhöht. Antikörper gegen hLH, die mit LH von anderen Arten kreuzreagieren, oder Antikörper, die wegen ihrer Fähigkeit ausgewählt wurden, LH von anderen Arten zu binden und die Hormonaktivität zu vermindern, nicht aber aufzuheben, werden ähnliche Wirkungen in den anderen Arten haben. Die geeignetsten Antikörper zur Verwendung bei Menschen werden jene sein, die ein Gerüst und konstante Regionen besitzen, die ähnliche zu den menschlichen Immunglobulinen sind, und die ihrerseits nicht antigen oder nur schwach antigen sind, wenn sie in Menschen injiziert werden. Geeignete Antikörper können durch die „Humanisierung" von Maus monoclonalen Antikörpern (das heißt, das Austauschen des Gerüsts und der konstanten Regionen der Maus durch ähnliche Sequenzen, die in menschlichen Immunglobulinen gefunden werden) hergestellt werden. Verfahren, um dies zu erreichen, sind in dem Fachgebiet gut bekannt (38-40). Andere Verfahren der Herstellung von geeigneten Antikörpern schließen die Immunisierung von Primaten wie z.B. des Cynomolgus-Affen ein (41), gefolgt von der Isolierung und der Clonierung von einzelnen Lymphozyten (42). Die Immunglobuline in diesen Primaten besitzen ähnliche Gerüstregionen wie menschliche Immunglobuline. Monoclonale Antikörper, die von diesen Tieren hergestellt wurden, sollten als ein guter Ausgangspunkt für Antikörper dienen, die in Menschen verwendet werden können.
Beispiel 3
Alternative Verfahren zum Erhalt und Auswahl der gewünschten Antikörper
Viele Antikörper, welche die hLH-Aktivität teilweise hemmen können, besitzen eine Neigung, an hLH oder an andere LH-Molekülen, die an Plastik oder an anderen Oberflächen adsorbiert sind, zu binden. Das Screening von gewünschten Antikörpern wird daher häufig durch das Untersuchen der Fähigkeiten der Antikörper zur Bindung an hLH oder an anderes LH, das an Plastikmikrotiterplatten adsorbiert ist, oder an LH, das an LH-Rezeptor-Komplexe gebunden ist, erleichtert. Das Screening von Antikörpern, die an hLH binden, das an einer Plastikoberfläche gebunden ist, kann erreicht werden, wie nachfolgend beschrieben wird. Die Vertiefungen einer Plastikmikrotiterplatte wurden mit 50 µl einer Lösung beschichtet, die 0 oder 1 µg hLH in 0,9% NaCl-0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2) enthält. Dies ermöglicht dem hLH an der Oberfläche der Mikrotiterplatte adsorbiert zu werden. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden die Lösungen entfernt und mit 200µl 0,9% NaCl-0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2), der 200 µg Rinderserumalbumin enthält, für länger als 1 Stunde bei 37°C ersetzt. Dieses füllt die meisten der verbleibenden Adsorptionsstellen. Die Albuminlösung wurde entfernt und durch 50 µl 0,9% NaCl-0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2), der 50.000 – 100.000 dpm des monoclonalen Test-Antikörpers enthält, der mit ¹²⁵I markiert ist, ersetzt. Die Markierung des monoclonalen Antikörpers wird unter Verwendung von Iodo-Gen oder anderen Oxidationsmitteln durchgeführt (22, 43), wie vorstehend für LH beschrieben wurde, wobei 10 µg Antikörper und 500 µCi. Na¹²⁵I verwendet wurden mit der Ausnahme, dass die Reaktionszeit auf 1 – 5 Minuten ausgedehnt wird. Nach einer Stunde bei 37°C, wird die Flüssigkeit entfernt und die Radioaktivität, die an der Oberfläche der Mikrotiterplatte gebunden ist, wird in einem Gamma-Zähler gemessen. Man wird Antikörper, die mit hoher Wahrscheinlichkeit für die Hemmung der hLH-Aktivität nützlich sind, in größeren Mengen in den Vertiefungen finden, die mit hLH beschichtet sind, als in solchen Vertiefungen, die nicht mit hLH beschichtet sind. Durch diese Analyse werden auch andere Arten von Antikörper nachgewiesen und es sollte ein weiteres Screening der positiven Antikörper durchgeführt werden, wie nachfolgend oder in Beispiel 2 dargestellt wird.
Obwohl die Bindung an LH-Rezeptor-Komplexe nicht dafür garantiert, dass ein Antikörper für die teilweise Neutralisierung der LH-Aktivität nützlich sein wird, werden viele der bevorzugten Antikörper an die LH-Rezeptor-Komplexe binden. Daher ist es möglich, zunächst nach wünschenswerten Antikörpern durch die Messung ihrer Fähigkeiten, an LH-Rezeptor-Komplexe zu binden, zu suchen. Diese Analyse ist im Wesentlichen die gleiche wie Bio-IRMA, das zuvor beschrieben wurde (44), und kann hintereinander oder gleichzeitig durchgeführt werden. Bei gleichzeitigem Bio-IRMA werden 0,025 µCi – 0,1 µCi des mit radioaktivem Iod markierten Test-Antikörpers (das heißt, hergestellt wie vorstehend beschrieben) zu einem Ratten-Eierstock-Homogenat (das heißt, hergestellt wie vorstehend beschrieben) und steigenden Mengen von LH, einschließlich 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100 und 1000 ng, zugegeben. Nach einer Stunde bei 37°C wird der Membrananteil des Homogenats durch Zentrifugation bei 1000 × g für 10 – 20 Minuten in ein Pellet sedimentiert, der Überstand wird verworfen und die Radioaktivität im Pellet wird in einem Gamma-Zähler bestimmt. Antikörper, die an LH-Rezeptor-Komplexe binden, werden durch ihre gesteigerte Fähigkeit, an Membrane zu binden, die mit mindestens einer der LH-Konzentrationen über dem Analysen-Nullwert (das heißt, LH wird nicht zugegeben) inkubiert werden. Bei der hintereinander folgenden Bio-IRMA werden die Membrane zunächst mit LH für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, durch Zentrifugation und Absaugen gewaschen, wie vorstehend beschrieben wurde, und anschließend mit 50.000 – 100.000 dpm der mit radioaktivem Iod markierten Antikörper inkubiert. Nach einer zusätzlichen Inkubation von 1 Stunde bei 37°C werden die gebundenen und die freien Antikörperfraktionen durch Zentrifugation und Absaugen getrennt, wie vorstehend beschrieben wurde, und das Pellet wird in einem Gamma-Zähler gezählt. Die nützlichsten Antikörper werden an die LH-Rezeptor-Komplexe binden. Dieses Verfahren ist jedoch nur ein nützliches Screeningverfahren und ein schlüssigerer Test für einen Antikörper bezieht die Verwendung einer biologischen in vitro-Analyse ein, wie z.B. einer, die auf die Erzeugung von Testosteron basiert, wie in Beispiel 2 beschrieben wurde.
Die Neigung der nützlichsten Antikörper, an Oberflächen zu binden, die LH oder Komplexe von LH und LH-Rezeptoren enthalten, kann ebenfalls die Isolierung von Lymphozyten erleichtern, die der Immunisierung von Affen oder Mäusen folgt, wobei ein Panning-Verfahren verwendet wird. In diesem Verfahren werden Lymphozyten zu Plastikoberflächen gegeben, die mit menschlichem Serumalbumin oder mit anderen Proteinen, die eine nichtspezifische Bindung verhindern, beschichtet sind, indem sie mit Lösungen, die 1 mg/ml menschliches Serumalbumin in 0,9% NaCl-0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,2) enthalten, für länger als 1 Stunde bei 37°C in Kontakt gebracht werden. Die Lymphozyten, die nicht an diese Oberflächen binden, werden anschließend zu Oberflächen gegeben, die beschichtet wurden, indem sie mit hLH und anschließend mit menschlichem Serumalbumin in Kontakt gebracht werden, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Menge von hLH, die verwendet wird, ist nicht kritisch, solange genügend Material an dem Plastik adsorbiert wurde. Dies kann unter Verwendung von 20 – 50 µg hLH/ml erreicht werden. Geringere und höhere Mengen werden jedoch ebenfalls funktionieren. Die Lymphozyten, die an. den Oberflächen binden, die mit LH beschichtet sind, werden ausgewählt und entweder mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen (30), mit dem Epstein-Barr-Virus oder einem anderen Virus transformiert, einer Clonierung im Lambda-Phagen unterzogen (36) oder einzelne Zellen werden zur Clonierung mittels der Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt (42). Die Antikörper, die hergestellt werden, werden einem Screening unterzogen, wie in Beispiel 2 dargestellt wurde. Diese Strategien erhöhen die Prozentzahl der Antikörper, die wünschenswert sein werden.
Viele Antikörper, welche LH teilweise hemmen können, können ebenfalls durch einen Prozess ausgewählt werden, der von ihren Fähigkeiten abhängig ist, LH zu binden, das an LH-Rezeptoren gebunden ist. Nach der Immunisierung von Mäusen oder Affen mit hLH werden die Milzzellen und andere Lymphozyten isoliert und auf Monoschichten eukaryontischer Zellen, die LH-Rezeptoren exprimieren, aufgeschichtet. Diese Zell-Monoschichten können durch die Transfektion von Zellen mit Expressionsvektoren, die Ratten- (45), Menschen- (46), Schweine- (47) oder andere LH-Rezeptor-cDNA exprimieren können, durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet Standard sind (48,49), hergestellt werden. Lymphozyten, die an den Monoschichten haften, werden verworfen. Lymphozyten, die nicht an den Monoschichten haften, werden zu ähnlichen Monoschichten von Zellen gegeben, die hLH oder anderes LH enthaltende LH-Rezeptoren exprimieren. Diese können durch die Zugabe von 100 ng hLH oder anderem LH zu den Monoschichten über Nacht bei 4°C und dem Auswaschen des Hormons, das nicht gebunden wurde, hergestellt werden. Lymphozyten, die an diese Zellen binden, werden ausgewählt und entweder mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen (30), mit dem Epstein-Barr-Virus oder einem anderen Virus transformiert oder der Clonierung mittels der Polymerase-Kettenreaktion unterworfen (42). Die Antikörper, die hergestellt werden, werden einem Screening unterzogen, wie sie in Beispiel 2 dargestellt wurde. Diese Strategien werden ebenfalls die Prozentzahl der Antikörper erhöhen, die wünschenswert sind. Obwohl diese Rezeptor basierende Strategie aufwendiger ist als eine Strategie, die auf das Screening von Lymphozyten basiert, die an Plastikoberflächen binden, die mit LH beschichtet sind, wird sie eine höhere prozentuale Ausbeute an nützlichen Antikörpern ergeben.
Beispiel 4
Verwendung von Antikörper, um das Syndrom der polyzystischen Ovarien zu behandeln
Das Syndrom der polyzystrischen Ovarien (PCO) ist durch eine unvollständige Follikelentwicklung und durch eine Unfähigkeit einer Frau, einen normalen Eisprung zu erzeugen, gekennzeichnet. Der Eierstock enthält viele kleine unreife Follikel, von denen sich wenige, wenn überhaupt, bis zu dem Punkt des Eisprungs ohne eine klinische Intervention weiterentwickeln. Diese Frauen besitzen im Vergleich zu fruchtbaren Frauen mit einem normalen Zyklus häufig erhöhte Androgenspiegel und ein hohes Verhältnis von LH/FSH. Es gibt zwei Hauptverfahren für die Induktion des Eisprungs bei Frauen mit PCO. Diese schließen die Verabreichung von FSH, um die Follikelentwicklung zu verstärken, oder von Antiöstrogenen, um die Sekretion von FSH von der vorderen Hypophyse zu erleichtern, ein. Während beide Behandlungen einen Eisprung induzieren können, besitzen sie ein Risiko, multiple Eisprünge zu induzieren, da sie die normale negative Östrogen-Feedback-Schleife umgehen, welche die Sekretion von FSH reguliert. Als ein Ergebnis werden Frauen, die mit diesem Agens behandelt werden, normalerweise sorgfältig überwacht, um eine Hyperstimulation, eine möglicherweise letale Nebenwirkung der Behandlung, zu verhindern.
Die Verabreichung von 10 µg – 10 mg eines nichtneutralisierenden Antikörpers gegen LH, die eine transiente und selbstbegrenzende Erhöhung der FSH-Sekretion hervorruft, wird einen Eisprung mit einem geringeren Risiko der Hyperstimulierung als die Behandlung mit Gonadotropin induzieren. Die Wirkung ist transient, weil der Antikörper metabolisiert oder auf anderer Weise aus dem Kreislauf entfernt wird, und seine Wirkung wird innerhalb von 1 – 2 Wochen nach der Verabreichung verloren gegangen sein. Die Behandlung ist selbstbegrenzend, weil die negative Feedback-Wirkung von Östradiol auf die FSH-Sekretion nicht eliminiert werden wird. Daher werden die FSH-Spiegel steigen und eine Follikelentwicklung stimulieren, die Sekretion von Östradiol wird steigen und weitere Zunahmen bei der Sekretion von FSH hemmen.
Beispiel 5
Induktion des Eisprungs durch die Behandlung mit einer oder zwei Dosen
Es existieren keine guten Verfahren, die verwendet werden können, um den Eisprung bei Frauen mit PCO zu induzieren, die nur eine einzelne oder eine zweifache Behandlung involvieren. Die meisten Behandlungen für dieses Syndrom benötigen mehrfache Behandlungen mit FSH, FSH plus LH oder hCG, hMG, Antiöstrogenen, GnRH oder verschiedenen Kombinationen dieser Agenzien. Bei solchen Ansätzen wurden auch GnRH-Antagonisten verwendet, um die zirkulierenden Spiegel von sowohl LH als auch FSH zu vermindern, so dass der Eisprung durch die Behandlung mit exogenen Hormonen induziert werden konnte. Eine einzelne Verabreichung einer hohen Konzentration des bevorzugten Antikörpers von der Art, die hierin beschrieben wird, kann den Eisprung induzieren. Dies liegt daran, dass der Antikörper sicher in einem sehr großen Überschuss gegeben werden kann, und, da Antikörper lange Halbwertzeiten im Plasma besitzen, dass der Antikörper weiterhin für mehrere Tage für die Erhöhung der FSH-Spiegel wirksam sein wird. Wegen der natürlichen Feedback-Wirkung von Östradiol auf die FSH-Sekretion wird die Sekretion von FSH durch die Östrogene kontrolliert, die von dem Follikel hergestellt werden, während sich der Follikel entwickelt. Zu dem Zeitpunkt, wenn der dominante Follikel ausgewählt wurde und sich die Östradiol-Spiegel erhöht haben, wird viel von dem Antikörper aus dem Kreislauf entfernt worden sein. Der Antikörper wird die Wirkungen des LH-Anstiegs, der für den Eisprung benötigt wird, wegen dem einen oder wegen mehreren verschiedenen Gründe nicht beeinflussen. Als erstes liegt die freigesetzte Menge LH im Überschuss zu der Menge vor, die für einen Eisprung benötigt wird. Zweitens wird der Antikörper nur die Aktivität von LH vermindern, nicht aber neutralisieren. Und drittens wird zu dem Zeitpunkt des LH-Anstiegs viel von dem Antikörper aus dem Kreislauf entfernt worden sein. Daher wird auf die Behandlung mit dem Antikörper die Follikelentwicklung und der Eisprung folgen.
Beispiel 6
Antigene, die geeignete hemmende Antiseren induzieren
Die Verabreichung von geeigneten Antikörpern, wie in Beispiel 1 dargestellt, kann verwendet werden, um die Fruchtbarkeit zu unterstützen. Weil dies eine „passive" Immunisierung ist, wird jedoch eine wiederholte Verabreichung von Antikörpern notwendig sein, um die Spiegel des Antikörpers für mehr als einige Tage oder Wochen hoch zu halten. Die Erhöhung für einen kurzen Zeitraum (z.B. Tage) ist für die Induktion des Eisprungs bei Frauen oder für die Erhöhung der Anzahl der Eisprünge bei Tieren in einem oder in mehreren Zyklen ausreichend. Wenn es erwünscht ist, die Aktivität von LH teilweise zu unterdrücken und dadurch die Fruchtbarkeit für längere Zeiträume oder für mehrere Zyklen zu unterstützen, ist es nützlich, eine Immunantwort zu induzieren, welche die aktive Erzeugung von Antikörpern gegen LH hervorruft. Um diese nützlichsten Antikörper zu erhalten, ist es notwendig, ein Immunogen zu entwickeln, das eine Antwort gegen einen Teil des LH-Moleküls induzieren kann, ähnlich zu dem, das von B105, B110 oder von anderen Antikörpern, die Komplexe mit LH bilden, erkannt wird und die etwas der LH-Aktivität beibehalten. Die geeignetsten Immunogene werden von der β-Untereinheit von LH abgeleitet, da diese Untereinheit für LH einzigartig ist. LH, TSH und FSH besitzen eine gemeinsame α-Untereinheit. Ihre Konformation scheint bei den Hormonen leicht unterschiedlich zu sein (21) und daher können nützliche Antikörper gegen die α-Untereinheit ebenfalls hergestellt werden. Die Antikörper gegen die alpha-Untereinheit besitzen jedoch das Potential zur Hemmung der Wirkungen von allen drei Hormonen. Wenn die Immunantwort gegen hFSH gerichtet ist, kann sie vielleicht nicht die Fruchtbarkeit erhöhen und kann zur Unfruchtbarkeit führen. Wenn es wünschenswert ist, Frauen aktiv gegen hLH zu immunisieren, um die Fruchtbarkeit zu erhöhen, muss sorgsam darauf geachtet werden, dass die Induktion von Antikörpern gegen hCG vermieden wird. Antikörper gegen hCG besitzen das Potential, die Fruchtbarkeit zu senken (vergl. nachfolgend). Dies ist im Allgemeinen kein Problem bei einer passiven Immunisierung, die vorstehend beschrieben wurde, da die verabreichten Antikörper gegen LH im Allgemeinen aus dem Kreislauf vor dem Zeitpunkt, an dem das hCG für die Fruchtbarkeit benötigt wird, entfernt wurden.
Antigene, welche die Erzeugung von Antikörpern gegen einen Teil von LH induzieren, die seine Aktivität nicht neutralisieren (das heißt, die gewünschte Immunantwort), enthalten eine Sequenz, die von einem Teil der β-Untereinheit von LH abgeleitet wurde. Oft ist dies eine Region der beta-Untereinheit, die nach der Bindung von LH an die LH-Rezeptoren exponiert bleibt. Um stark antigen zu sein, sollte das Immunogen auch Sequenzen enthalten, die fremd gegenüber der Person oder dem Tier sind, die oder das immunisiert werden soll. Wenn die gesamte β-Untereinheit von LH für die Immunisierung verwendet wird, können Antikörper erzeugt werden, welche die LH-Aktivität vollständig hemmen. Hohe Spiegel von neutralisierenden Antikörpern können zur Unfruchtbarkeit führen oder andere negative Konsequenzen wie z.B. die Induktion einer vorzeitigen Menopause oder ein Verlust der Hodengröße oder -funktion haben. Die beste Wahl der Reste der beta-Untereinheit von LH, die in dem Immunogen eingeschlossen werden sollten, sind solche, die exponiert bleiben, wenn das Hormon an die LH-Rezeptoren bindet. Diese schließen den Teil des Hormons in der Nähe der Reste 74 – 77 ein, eine Region des Hormons, die von Antikörpern erkannt wird, die an β-Untereinheiten von hLH oder hCG und an hLH- oder hCG-Rezeptor-Komplexe binden (26,50). Regionen der β-Untereinheit, die nicht für die Immunisierung verwendet werden sollten, schließen Sequenzen in der Nähe der Reste 89 – 92 und 47 – 51 ein. Diese sind die Orte der Bindungsstellen für Antikörper, welche die Aktivität neutralisieren.
Der Entwurf eines minimalen synthetischen Antigens schließt die Reste der β-Untereinheit von hLH ein, die exponiert sind, wenn LH an LH-Rezeptoren gebunden sind. Einige von diesen schließen Pro73-Arg74-Gly75-Val76-Asp77-Pro78-Val79-Val80-Ser81 ein. Synthetische Peptide, die diese Sequenzen enthalten, können an große Trägermoleküle gebunden und zur Immunisierung verwendet werden, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (14-16, 51-53). Die hergestellten, nichtneutralisierenden Antikörper werden an hLH binden und seine biologische Aktivität hemmen.
Häufig ist die Fähigkeit von kleinen Peptid-Antigenen gering, einen hohen Immunantwortspiegel zu erzeugen. Nachfolgend wird dargestellt, wie ein Antigen hergestellt wird, das wirksamer bei der Erzeugung von Antikörpern gegen Regionen von hLH sein wird, die exponiert bleiben, wenn das Hormon an die LH-Rezeptoren bindet. Ein ähnlicher Ansatz könnte verwendet werden, um Immunogene für jedes Protein einschließlich LH von anderen Vertebraten zu entwerfen. Es ist gut bekannt, dass die besten Immunogene solche sind, die sich deutlich von den Proteinen unterscheiden, die in einem Tier gefunden werden, die jedoch die tertiäre Konfiguration des Epitops oder der Epitope behalten, für die eine Immunantwort erwünscht ist. Ein geeignetes Immunogen kann durch die Modifizierung der β-Untereinheit von hLH hergestellt werden, so dass es i) die Fähigkeit behält, an B105 und/oder an anderen Antikörpern zu binden, welche die Wirkungen von hLH teilweise hemmen, ii) die Fähigkeit verliert, an Antikörper zu binden, welche die Aktivität von LH neutralisieren, und iii) antigen ist. Geeignete Immunogene können ebenfalls ausgehend von einem anderen Protein als der beta-Untereinheit von LH und durch Modifikation, um die Fähigkeit zu erhalten, an B105 und/oder anderen Antikörpern, die teilweise die Wirkungen von hLH hemmen entworfen werden. Antikörper, die teilweise die Wirkungen von hLH hemmen, werden „Matritzen"-Antikörper genannt und sie werden verwendet, um die Beibehaltung von gewünschten Epitopen zu überprüfen und/oder dementsprechend positiv auszuwählen. Gute Beispiele von Matritzen-Antikörpern sind solche, von denen nachgewiesen wird, dass sie bei der Erhöhung der Fruchtbarkeit wirksam sind, wie in Beispiel 2 dargestellt wird. Andere Antikörper, die „Exklusions"-Antikörper genannt werden, werden verwendet, um gegen Antigen-Analoga auszuwählen, die unerwünschte Epitope enthalten. Beispiele von Exklusions-Antikörpern sind solche, welche die biologische Aktivität von hLH vollständig neutralisieren und/oder welche die Bindung an seinen Rezeptor verhindern.
Es gibt zwei allgemein unterschiedliche Strategien, die „A" und „B" genannt werden, um die Antigene zu erzeugen, wobei eine Strategie der positiven/negativen Auswahl verwendet wird, die auf Matrizen- und auf Exklusions-Antikörpern basiert. Bei Ansatz „A" beginnt man mit der β-Untereinheit von LH und verwendet die Zufallsmutagenese, um Substitutionen in Regionen des Moleküls außerhalb des Epitops, das von dem „Matrizen"-Antikörper erkannt wird, herzustellen. Die neuen Moleküle, die hergestellt werden, werden exprimiert (vergl. nachfolgend) und ihre Fähigkeiten, den Matrizen-Antikörper zu binden, wird überwacht. Solche, die weiterhin an den Matrizen-Antikörper binden und Mutationen in den anderen Regionen des Moleküls besitzen, werden in einer zweiten Runde der Mutagenese in einem anderen Teil des Moleküls verwendet. Dieses Verfahren wird fortgeführt, bis alle Regionen des Proteins mit Ausnahme der einen, die in der Antikörperbindungsstelle involviert ist (z.B. B105) modifiziert wurden. Die endgültigen Analoga werden an die Matrizen-Antikörper, nicht aber an die Exklusions-Antikörper binden. Bei einer Variante dieses Verfahrens beginnt man mit einer Hormon-Chimäre, die an den Matrizen-Antikörper bindet. Solche Chimären können ausgehend von verschiedenen Arten von LH, von denen bekannt ist, dass sie nicht an die Matrizen-Antikörper binden oder eine neutralisierende Immunantwort auf hLH induzieren, hergestellt werden. Beispiele für diese Art des Immunogens sind Chimäre der β-Untereinheiten von menschlichem LH und Rinder-LH. Diese schließen die β-Untereinheit von Rinder-LH ein, die durch die Substitution von Prolin 74 durch Arginin, der Rest, der in der β-Untereinheit des menschlichen LH gefunden wird, modifiziert wurde. Reste von hLH werden gegen homologe Regionen von verschiedenen Arten ausgetauscht, um die Bindungsstelle für die Matrizen-Antikörper zu erzeugen. Die homologen Regionen werden durch das Ausrichten der Sequenzen von hLH und den anderen LH an den Positionen der hoch konservierten Cysteinreste identifiziert, wie von Pierce und Parsons (1) gezeigt wurde.
Bei Ansatz „B" verwendet man ein Gerüstmolekül, das nicht verwandt oder nur geringfügig der Struktur der β-Untereinheiten von Glycoprotein-Hormonen ähnelt. Dies kann jedes Protein einschließen, das Schleifenstrukturen enthält, wie z.B. solche, die in Immunglobulinfaltungen oder zwischen den Helices in vier-Helix-Bündel-Proteinen gefunden werden. Die Sequenz von hLH zwischen den Resten 65 – 85 wird gegen eine dieser Schleifen durch Verfahren der Standard-Mutagenese substituiert. Wenn dieses Protein in einem geeigneten Expressionsvektor von E. coli (z.B. einen der T7-Vektoren, erhältlich von Novagen) hergestellt wird, kann es auf seine Fähigkeit getestet werden, an monoclonale Antikörper zu binden, die an hLH-Rezeptor-Komplexe binden. Da nur ein Teil der Reste, die das Epitop erzeugen, in dem exprimierten Protein vorhanden sein werden, wird seine Affinität niedriger sein als die von hLH für den Antikörper.
Um die Selektivität und Affinität der Proteine, die in den Ansätzen „A" oder „B" hergestellt wurden zu verbessern, kann entweder ein bakterielles oder ein Bakteriophagen-Expressionssystem (34,36,55-58) verwendet werden. In beiden Fällen werden Bibliotheken von mutierten Analoga hergestellt und es werden die Mutanten ausgewählt, welche die höchste Affinität für B105, B110 oder für andere ähnliche Matrizen-Antikörper, die in Beispiel 2 als nützlich eingestuft wurden, besitzen. Zusätzlich kann ebenfalls die negative Selektion verwendet werden, wobei neutralisierende Antikörper oder Antiseren verwendet werden, die in Beispiel 2 als nicht nützlich eingestuft wurden. Dies wird die Fähigkeit des Antigens minimieren, unerwünschte Antikörper hervorzurufen, wenn es in einem Impfstoff verwendet wird.
Die nachfolgende Beschreibung betrifft ein Selektionsverfahren, das auf Phagen-Display basiert, könnte aber durch einen Fachmann leicht für die Herstellung und das Screening von Genbanken für fast jedes Expressionssystem adaptiert werden. Ein System, das für die Selektion zugänglich ist, basiert auf Protein-Blotting (59). Mehrere verschiedene Phagen-Display-Systeme können ebenfalls verwendet werden. Eines involviert die Verwendung eines Vektors (d.h. pX-M13gIII) ähnlich dem phGH-M13gIII (34). Wenn Ansatz „A", der vorstehend diskutiert wurde, verwendet wird, enthält dieser neue Vektor, der pA-M13gIII genannt wird, entweder die β-Untereinheit von hLH oder eine hLH-LH-β-Untereinheit-Chimäre an der Stelle der codierenden Sequenzen des Wachstumshormons von phGH-M13gIII (4). Wenn Ansatz „B", der vorstehend diskutiert wurde, verwendet wird, werden die codierenden Sequenzen des Wachstumshormons von phGH-M13gIII durch ein Gen ausgetauscht, das ein Molekül codiert, das mit der β-Untereinheit von hLH nicht verwandt ist, mit Ausnahme des Einschlusses der codierenden Sequenzen der beta-Untereinheit von hLH in der Blähe von dem Rest 74, um einen neuen Vektor herzustellen, der pB-M13gIII genannt wird. Die codierende Sequenz der Region des Vektors, der die „B"-Sequenzen codiert, enthält ebenfalls Restriktionsstellen, welche die Kassetten oder andere Arten der Mutagenese ermöglicht, um das Einbringen von Zufallssequenzen zu ermöglichen. Wenn Zufallssequenzen in die codierenden Regionen der Vektoren pA-M13gIII oder pB-M13gIII eingebracht werden und die Vektoren verwendet werden, um E. coli zu transformieren, wird eine Genbank von Mutanten hergestellt. Diese mutierten Proteine können auf der Oberfläche von M13-Phagmid-Partikeln als Gen III-Fusionsproteine durch die Zugabe des Helfer-Phagen M13KO7 zu E. coli exprimiert werden. Diese Phagmid-Partikel werden an den Antikörper im Verhältnis zu den Affinitäten der modifizierten Proteine „A" oder „B" für den Antikörper binden. Ein geeignetes Verfahren um Phagmid-Partikel auszuwählen, die an die Matrizen-Antikörper binden, ist die Verwendung eines Festphasen-Analysenprotokolls. In dieser Analyse wird der Matrizen-Antikörper verwendet, um eine Oberfläche zu beschichten, wie beschrieben wurde (22), und anschließend wird eine Lösung, welche die Phagmid-Partikel enthält, zugegeben. Phagmid-Partikel, die nicht an der Oberfläche binden, können verworfen werden. Solche Partikel, die an dem Antikörper auf der Oberfläche binden, können von dem Antikörper durch die Zugabe eines Puffers mit einem niedrigen pH-Wert (z.B. pH-Wert 3) entfernt werden und dazu verwendet werden, um E. coli erneut zu transformieren. Wenn eine negative Selektion erwünscht wird, können die Exklusions-Antikörper gegen die Matrizen-Antikörper auf der Oberfläche ausgetauscht werden. In diesem Fall werden die Partikel, die an der Oberfläche binden, verworfen. Dieses Verfahren wird mehrere Male wiederholt und anschließend werden die codierenden Regionen von mehreren Genen für die „A"- und „B"-Proteine einer DNA-Sequenzierung unterzogen. Auf diese Weise können Sequenzen identifiziert werden, die für die Bindung an Matrizen-Antikörper kritisch sind. Falls Exklusions-Antikörper verwendet werden, kann zusätzlich gegen unerwünschte Epitope selektiert werden. Man kann auch Substitutionen in anderen Teilen des Moleküls identifizieren, die nur eine geringe oder keine Wirkung auf die Konformation der bindenden Region des gewünschten Antikörpers ausüben. Wenn Moleküle, die durch diese Sequenzen codiert werden, verwendet werden, um Tiere oder Menschen zu immunisieren, werden sie die Erzeugung von Antikörpern hervorrufen, die mit hLH kreuzreagieren. Da diese Antikörper einen Teil des Moleküls erkennen werden, von dem bekannt ist, das er nach der Bindung von hLH an seine Rezeptoren exponiert ist, werden sie die Wirkungen von hLH hemmen können, aber nicht seine biologische Aktivität verhindern können.
In einigen Fällen können Matrizen- und Exklusions-Antikörper nicht erhältlich sein. In diesen Fällen können Matrizen-Antiseren und Exklusions-Antiseren erzeugt werden, die anstelle der Antikörper unter Verwendung der nachfolgenden Strategie verwendet werden können. Die Corpora lutea von Eierstöcken von Ratten werden durch die Behandlung von weiblichen Ratten mit PMSG und hCG hergestellt, wie vorstehend beschrieben wurde. Diese Corpora lutea werden mit hLH inkubiert, um dem Hormon zu ermöglichen, an die LH-Rezeptoren in den Membranen zu binden. Anschließend werden die Membrane gewaschen, um das freie hLH zu entfernen, und die Membranen werden mit den Antiseren inkubiert. Antikörper, die an das hLH gebunden werden, das an den LH-Rezeptoren der Membran gebunden ist, werden anschließend von dem Rest der Antiseren durch das Waschen der Membranen getrennt. Diese Antikörper werden durch die Behandlung der Membranen bei einem pH-Wert unter 5 freigesetzt. Diese Behandlung setzt sowohl die Antikörper als auch das hLH von den Rezeptoren frei. Die Antikörper werden von hLH durch Gelfiltration oder durch andere Verfahren getrennt und können anschließend als Matrizen verwendet werden: die Antikörper, die im Serum zurückbleiben, das vollständig frei von Matrizen-Antikörpern ist, können als Exklusions-Antikörper verwendet werden.
Beispiel 7
Entwicklung eines Immunogens, um neutralisierende Antikörper gegen hCG zu erzeugen
Die bevorzugten Immunogene zur Verhinderung der Fruchtbarkeit werden die Herstellung von Antikörpern gegen hCG, nicht aber gegen hLH hervorrufen. Diese können hergestellt werden, wobei das Matrizen/Exklusions-Verfahren verwendet wird, das in Beispiel 6 beschrieben wurde, wobei unterschiedliche Antikörper verwendet werden. Matrizen-Antikörper, die verwendet werden können, schließen B107 und B109 ein, die von der Columbia University erhältlich sind. Diese Antikörper binden hCG mit einer hohen Affinität und besitzen eine sehr geringe Affinität für die freie β-Untereinheit von hCG oder für hLH. Weil sie sehr spezifisch für die heteromere Form von hCG sind (das heißt, für die biologisch aktive Form des Moleküls), weil sie nicht an die meisten anderen inaktiven Formen von hCG im Kreislauf binden und weil sie neutralisierend sind, werden Immunogene, die von diesen Antikörpern mit einer hohen Affinität (das heißt, Ka > 5 × 10⁷M^–1) erkannt werden können, die Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern gegen hCG hervorrufen. Teile der β-Untereinheit, die vorzugsweise in diesen Immunogenen beibehalten werden sollten, schließen die Reste 43 – 53 und 91 – 92 ein. Zusätzlich gibt es andere nützliche Matrizen-Antikörper HCZ107 und HCO514, die von Hybritech, San Diego, CA, erhältlich sind. Diese Antikörper binden sowohl an hCG als auch an seine freie β-Untereinheit mit einer hohen Affinität und neutralisieren die Aktivität des Hormons. Beide besitzen eine niedrige Affinität für hLH. Kritische Reste für die Interaktion von HCZ107 mit hCG schließen solche in der Nähe von 114 ein und Reste, die kritisch für die Interaktion von HCO514 mit hCG sind, schließen solche in der Nähe von 77 ein.
Beispiel 8
Verstärkung der immunologischen Aktivität
Während der aktiven Immunisierung gegen LH oder Choriogonadotropin wird eine ortsgerichtete Autoimmunantwort erzeugt. Daher ist es essentiell, Proteine zu verwenden, die hoch antigen sind. Dies kann durch die Verwendung des Matrizen/Exklusions-Ansatzes, der in Beispiel 6 beschrieben wird, erleichtert werden, um das Immunogen so fremd wie möglich zu machen. Zusätzlich ist es wünschenswert, die Moleküle multivalent herzustellen, um die Chancen zu erhöhen, dass sie mit dem Immunsystem interagieren. Ein gutes Verfahren, um das Molekül multivalent zu machen, ist die Zugabe von Resten entweder an dem C-Ende oder an dem N-Ende, welche die Erzeugung einer α-Helix hervorrufen, die eine Coiled-Coil-Wechselwirkung mit anderen Molekülen erzeugen können. Die Regeln für den Entwurf von Peptidsequenzen, die Coiled-Coil-Wechselwirkungen erzeugen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (60, 61). Zusätzlich ist es ebenfalls möglich, natürlich vorkommende Sequenzen von Proteinen zu verwenden, von denen bekannt ist, dass sie Coiled-Coil-Wechselwirkungen erzeugen, wie z.B. solche, die im Hemagglutinin-Protein des Grippevirus, Laminin, GCN4 oder jedes von mehren anderen Proteinen gefunden werden. Es ist ebenfalls möglich, Reste an den C-Terminus oder an den N-Terminus anzufügen, die zu der Erzeugung einer Dreifach-Helix führen, die ähnlich zu der ist, die in Collagen gefunden wird. Diese Dreifach-Helix wird die Kombination von drei oder mehr Moleküle des Antigens ermöglichen. Andere Strategien zur Erhöhung der Antigenizität des Immunogens können ebenfalls verwendet werden, einschließlich der Bindung der Immunogene Ende-zu-Ende, um ein Polyprotein herzustellen. Wie dargestellt wurde (5), ist es unter Verwendung dieser Strategie möglich, ein Protein zu entwerfen, das eine beliebige Anzahl von sich wiederholenden Einheiten besitzt.
Die bevorzugten Antikörper, die eine nichtneutralisierende Hemmung der LH-Aktivität ergeben, interagieren im Allgemeinen gut mit der freien β-Untereinheit und dem Heterodimer. Bei der Herstellung von Immunogenen ist es daher im Allgemeinen geeignet, mit der freien β-Untereinheit anzufangen um die Erzeugung dieser Antikörper hervorzurufen. Viele bevorzugte Antikörper, die eine neutralisierende Hemmung der hCG-Aktivität ergeben, binden dagegen an das α,β-Heterodimer besser als an die freie β-Untereinheit von hCG. Um die Erzeugung dieser Antikörper hervorzurufen, ist es häufig nützlich, mit einem Immunogen zu beginnen, das ein Fusionsprotein ist, das durch die Bindung des C-Terminus des Peptids, der die Reste 1 – 114 der β-Untereinheit von hCH umfasst, an den N-Terminus eines flexiblen Proteinlinkers, der aus sechs sich wiederholenden Einheiten von Glycin und Serin aufgebaut ist, hergestellt wird. Der C-Terminus des Fusionsproteins wird anschließend an den N-Terminus der Reste 1 – 96 der Rinder-α-Untereinheit gebunden. Dies stellt ein einzelnes Polypeptid zur Verfügung, das die allgemeine Konformation der Reste der β-Untereinheit besitzt, die in hCG gefunden werden, und das direkt zur Immunisierung verwendet werden kann oder das als Ausgangsverbindung in Beispiel 6 verwendet werden kann. Die Verabreichung des Antigens kann in jeder Weise durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Dies schließt die Injektion, die Injektion in Hilfssubstanzen und die Bindung des Antigens an einen Virus ein.
Beispiel 9
Umkehrung der Wirkung von hCG
Die Impfung von Frauen mit hCG, um eine Unfruchtbarkeit zu induzieren, besitzt mehrere wünschenswerte Eigenschaften einschließlich 1) die Antikörper werden nur funktionieren, wenn eine Befruchtung stattgefunden hat, 2) die Behandlung kann über eine langen Zeitraum stattfinden (das heißt, sie findet für viele Menstruationszyklen statt) und 3) die Frauen müssen keine Pillen nehmen oder Implantate bekommen. Zusätzlich wird die Impfung reversible sein, wobei Progestine verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie die Abstoßung des Fötus durch den Uterus verhindern. Diese schließen viele Progesteron-Verbindungen wie z.B. Dydrogesteron ein (62). Diese Verbindung ist im Handel von Solvay Pharmaceuticals, 901 Sawer Road, Marietta, Georgia, erhältlich und besitzt die gewünschte Eigenschaft, dass sie nicht mit Progesteron in Immunassays kreuzreagiert. Die Behandlung mit Dydrogesteron wird daher nicht die genaue Messung der Progesteronspiegel verhindern. Frauen, die aktiv gegen hCG immunisiert werden, werden weiterhin normale Menstruationszyklen behalten und sollten einen Eisprung an dem erwarteten Zeitpunkt in der Mitte ihres Menstruationszyklus besitzen. In dem Verfahren zur Induktion der Fruchtbarkeit ist es wünschenswert zu wissen, wann der Eisprung stattgefunden hat. Es kann jedoch auch angenommen werden, dass er an Tag 18 des Menstruationszyklus stattgefunden hat. Bei dem Eisprung wird Progesteron durch das Corpus luteum unter dem Einfluss von LH hergestellt. Das Progesteron ruft den Anstieg der Grundkörpertemperatur hervor, die mit dem Eisprung assoziiert ist, und ein bekanntes Verfahren zur Überwachung des Eisprungs darstellt. Ein anderes Verfahren zur Überwachung des LH-Anstiegs besteht darin, LH im Urin zu messen, wobei rezeptfreie Kits zum Ovulationsnachweis verwendet werden. Nach Tag 20 beginnt die Frau, die schwanger werden möchte, Dydrogesteron (3 – 6 mg dreimal pro Tag) und 0,625 – 1,25 mg Premarin^® (Ayerst Limited, New York, NY) zu nehmen. Dies ist ausreichend, um die Sekretion des lutealen Progesteron nachzuahmen, das durch hCG hervorgerufen würde, wenn es nicht als Folge der Impfung neutralisiert worden wäre. Die Behandlung mit Dydrogesteron wird fortgeführt, um die Menstruation für 6 Wochen zu verhindern. Zu diesem Zeitpunkt wird die Therapie mit Dydrogesteron beendet. Wenn die Progesteronspiegel im Serum niedrig sind, hat eine Schwangerschaft nicht stattgefunden, die Menstruation wird eintreten und ein weiterer Versuch der Schwangerschaft kann unternommen werden. Wenn die Progesteronspiegel im Serum hoch sind, werden die Progesteronspiegel aufgrund der Schwangerschaft und durch die Herstellung von Progesteron durch die Plazenta hoch sein. Die Beendigung von Dydrogesteron wird die Schwangerschaft nicht unterbrechen. Der Serumspiegel von Progesteron kann ebenfalls überwacht werden, wobei Standardtechniken der Radioimmunassays verwendet werden.
Beispiel 10
Unterdrückung der männlichen Fruchtbarkeit durch die Impfung mit FSH
Es wurde gezeigt, dass die Immunneutralisierung von FSH die Fruchtbarkeit in Affen blockiert, und man würde vermuten, dass sie die Fruchtbarkeit bei Männern blockiert (8). Es war aufgrund der hochkonservierten Natur der β-Untereinheit von FSH sehr schwierig, einen hochspezifischen Impfstoff gegen hFSH zu entwickeln, der hohe Spiegel neutralisierender Antikörper gegen FSH in irgendeiner Art hervorruft. Verfahren, die für die Entwicklung von Antikörpern gegen hCG beschrieben wurden, können ebenfalls zur Entwicklung von Antikörpern gegen hFSH angewendet werden. Man beginnt daher mit Molekülen, in denen die Reste 1 – 111 der β-Untereinheit von hFSH gegen die Reste 1 – 114 oder 1 – 117 der β-Untereinheit von hCG ausgetauscht sind. Als ein Matrizen-Antikörper kann FSG761 (Hybritech) verwendet werden. Da neutralisierende Antikörper erwünscht sind, wird ein bevorzugtes Ausgangsmolekül ebenfalls das Polypeptid der Rinder-α-Untereinheit enthalten, das an das Polypeptid der β-Untereinheit von hFSH durch einen Glycin-Serin-Linker gebunden ist. Die Verwendung dieses Impfstoffes bei Männern wird die Fruchtbarkeit verhindern.
Beispiel 11
Details des Testansatzes der vorliegenden Beschreibung für hCG

1. Neutralisierende Antikörper werden entweder durch die Herstellung von monoclonalen Antikörpern oder durch ihren Erwerb erhalten. Es wird ebenfalls nützlich sein, Antikörper oder Antiseren gegen hLH zu erhalten.
2. Diese Antikörper oder Antiseren werden als positive oder negative Matrizen verwendet, um Genbanken von Mutanten der β-Untereinheit von hCG abzusuchen. Diese Genbanken können durch die Zufallsmutagenese der β-Untereinheit von hCG in bestimmten Regionen des Moleküls hergestellt werden. Es sollte darauf geachtet werden, dass vorzugsweise eine β-Untereinheit von hCG verwendet wird, dem der C-Terminus fehlt oder die eine andere Sequenz für diesen Teil des Moleküls besitzt, um zu vermeiden, dass Immunogene ausgewählt werden, die nichtneutralisierend sind. Ein geeignetes Verfahren involviert die Verwendung von Phagen-Display-Techniken, die ebenfalls nachfolgend aufgelistet sind. Der Phagen-Display ist jedoch nicht essentiell, damit die Technik funktioniert.
3. Man lässt die Mutanten zuerst an den negativen Selektions-Antikörper binden. In dem vorliegenden Beispiel, nämlich die Entwicklung eines hCG-Impfstoffs, würde dies die Bindung an die Antikörper gegen LH oder an die Antiseren gegen LH involvieren, um Mutanten zu entfernen, die strukturell identisch zu LH sind.
4. Man lässt anschließend die Mutanten, die nicht an die negativen Selektions-Antikörper binden, an positive Selektions-Antikörper binden, nämlich solche, die durch die Immunisierung mit hCG hergestellt wurden. Während des positiven Selektionsverfahrens werden freie β-Untereinheiten von hCG ebenfalls zugegeben, um Antikörper zu eliminieren, welche die freie Untereinheit binden, und somit den Selektionsprozess auf solche Antikörper zu begrenzen, die dimerspezifisch sind. Die Mutanten, die nicht an die positiven Selektions-Antikörper binden, werden verworfen. Im Fall der durch Phagen exprimierten Proteine werden die Phagen von den positiven Selektions-Antikörper eluiert und dazu verwendet, E. coli zu infizieren.
5. Dieses Verfahren wird für mehrere Runden wiederholt, um mögliche Immunogene zu entfernen, die an die hLH-Antikörper binden können, und um weiterhin solche auszuschließen, die eine geringe Affinität für hCG-Antikörper besitzen. Die DNA-Sequenzen, welche die Immunogene codieren, werden sequenziert. Immunogene, die sich am stärksten von hCG unterscheiden, aber die Fähigkeit behalten, an hCG spezifische Antikörper oder Antiseren mit einer hohen Affinität zu binden, werden weiter verwendet.
6. Falls es notwendig ist, wird eine zweite Runde der Mutagenese durchgeführt, um die Anzahl der Unterschiede zwischen dem möglichen Immunogen und hCG zu erhöhen. Das Ziel ist, ein Immunogen herzustellen, das sich von hLH und so stark wie möglich von hCG unterscheidet, aber die Schlüsselaspekte der hCG-Struktur behält, das es ermöglicht, einen hohen Spiegel von neutralisierenden Antikörpern zu erzeugen. Dieses schließt die Regionen der β-Untereinheit ein mit Ausnahme des C-Terminus, der sich am stärksten von der β-Untereinheit von hLH unterscheiden.
7. Wenn die einzelnen antigenen Hauptdeterminanten ausgewählt wurden, wird das Immunogen multivalent gemacht. Es existieren verschiedene Verfahren, um dies zu erreichen. Eines besteht darin, die Determinante an ein Protein zu fusionieren, das selber multivalent ist oder das Multimere erzeugt (z.B. Immunglobuline). Ein anderes Verfahren besteht darin, Reste an ein Protein zu fusionieren, die Coiled-Coil-Wechselwirkungen erzeugen und die eine Assoziation fördern werden. Wenn es möglich ist, werden diese von natürlichen Proteinen abgeleitet, von denen bekannt ist, dass sie eine Immunantwort hervorrufen (z.B. Grippe).
8.A. Wenn es erwünscht ist, dass die Fruchtbarkeit verhindert wird, ist es essentiell, hohe Spiegel gegen das intakte hCG-Molekül zu erhalten. Dies kann erfordern, dass hCG mit einem Molekül kombiniert wird, das ähnlich zu einer α-Untereinheit ist. Die α-Untereinheit von anderen Säuger-Glykoproteinen ist als Ausgangsmaterial geeignet.
8.B. Ebenfalls ein geeignetes Ausgangspunkt ist ein Molekül, das die gewünschten Eigenschaften besitzt, ein einzelnes Polypeptid zu sein, und die Struktur des Heterodimers beizubehalten. In diesem Fall ist es wünschenswert, Mutationen auch in dem Teil des Moleküls zu machen, der von der α-Untereinheit abgeleitet ist.
8.C. Die Immunogene können mittels jedem geeigneten Verfahren, wie z.B. die Expression in E. coli, Hefe oder Säugerzellen hergestellt werden. Es ist nicht notwendig, dass die Immunogene glycosyliert sind. Die Immunogene können ebenfalls DNA oder RNA sein. Sie können ebenfalls in der Virenhülle integriert sein.
8.D. Es ist ebenfalls nicht notwendig, mit der β-Untereinheit von hCG zu beginnen. Es kann mit jedem Protein begonnen werden. Der Schlüssel ist, die Matrizen-Strategie zu verwenden, um die Proteine auszuwählen, die man möchte. Zum Beispiel kann man mit einem vierfachen Helix-Bündel beginnen und die Aminosäuresequenzen von Teilen der β-Untereinheit von hCG einfügen, die in der Nähe der Reste 38 – 57 und 91 – 92 liegen. Man kann ebenfalls mit einem Immunglobulin beginnen, einschließlich einem, das ein antiidiotypischer monoclonaler Antikörper gegen einen hCG-spezifischen Antikörper ist.

1 ist ein Graph, der den Einfluss von Antikörpern und Antiseren auf die Bindung von radioaktiv markiertem hLH an LH-Rezeptoren darstellt. 1 stellt den Einfluss von drei verschiedenen Arten von Antikörpern oder Antiseren auf die Bindung von hLH an die LH-Rezeptoren dar. Antikörper „A" besitzt nur eine geringe oder keine Wirkung auf die Bindung des Hormons an die Rezeptoren. Sein hauptsächlicher möglicher hemmender Einfluss in vivo würde sich auf den Metabolismus des Hormons beziehen. Antikörper „B" besitzt die Fähigkeit, die Bindung von hLH an die LH-Rezeptoren teilweise zu blockieren. Obwohl der Antikörper in vivo hemmend sein würde, würde auch ein sehr großer Überschuss dieses Antikörpers relativ zu LH nicht in der Lage sein, seine Aktivität unter 40% zu vermindern, wie hier gezeigt wird. Es sollte beachtet werden, dass verschiedene Antikörper hergestellt werden können, die unterschiedliche Fähigkeiten besitzen, die Aktivitäten von LH zu blockieren (z.B. B105 und B110). Antikörper „B" ist ein Beispiel der allgemeinen Art des Antikörpers, der in vivo am nützlichsten ist. Antikörper „C" ist ein neutralisierender Antikörper, da er bei hohen Konzentrationen die Aktivität von hLH verhindern kann. Aufgrund seines Potentials, die LH-Aktivität zu verhindern, würde ein Überschuss dieses Antikörpers die Fruchtbarkeit hemmen.
2 ist ein Graph, der den Einfluss von Antikörpern und Antiseren auf die Fähigkeit von hLH, in vitro Steroidbiosynthese zu induzieren, darstellt. 2 stellt die Wirkungen von drei Antikörpern auf die Fähigkeit von LH dar, die Synthese von Testosteron von Leydig-Zellsuspensionen von Rattenhoden zu induzieren (das heißt, Steroidbiosynthese). Kurve „A" stellt die Fähigkeit von hLH dar, die Steroidbiosynthese bei Abwesenheit der Antikörper zu induzieren. Kurve „B" stellt die Fähigkeit von hLH dar, die Steroidbiosynthese in der Gegenwart eines sehr großen Überschusses des Antikörpers, der die hLH-Aktivität auf etwa ein Drittel vermindern kann, zu induzieren. Kurve „C" stellt die Fähigkeit von hLH dar, die Steroidbiosynthese in der Gegenwart eines sehr großen Überschusses des Antikörpers, der die hLH-Aktivität auf etwa ein zwanzigstel vermindern kann, zu induzieren. Kurve „D" stellt die Fähigkeit von hLH dar, die Steroidbiosynthese in der Gegenwart eines sehr großen Überschusses des Antikörpers, der die hLH-Aktivität neutralisieren kann, zu induzieren. Die Entscheidung, Antikörper „B" und/oder „C" in vivo zu verwenden, wird von dem Verhältnis von LH/FSH und dem Ausmaß, das erwünscht wird, die LH-Aktivität zu unterdrücken, abhängig sein. Wenn die hLH-Spiegel hoch sind und es notwendig ist, sie stark zu vermindern, würde Antikörper „C" bevorzugt werden. Wenn die hLH/hFSH-Verhältnisse nur leicht erhöht sind, würde Antikörper „B" bevorzugt werden. Die Verwendung von Antikörper „D" in sehr hohen Dosen würde eine Unfruchtbarkeit hervorrufen. Es wird erwartet, dass viele nützliche Antikörper gefunden werden, welche die Fähigkeit besitzen, die Aktivität von hLH oder von anderem LH sowohl auf die Zellen des Eierstocks als auch auf Hodenzellen zu vermindern.
3 ist ein Graph, der den Einfluss von Antikörpern und Antiseren auf die Fähigkeit von hLH, Steroidbiosynthese in vivo zu synthetisieren, darstellt. 3 stellt die Wirkungen von drei verschiedenen Antikörpern auf die Erzeugung von Testosteron bei Männern dar, wenn sehr große Mengen des Antikörpers intravenös vor den verschiedenen Mengen von hLH, das ebenfalls intravenös verabreicht wird, verabreicht werden. In allen dargestellten Beispielen, war die Menge des verabreichten Antikörpers in einem hohen Überschuss auf einer molaren Basis zu der von hLH. Ähnliche Wirkungen würde man für die Antikörper auf die Steroidbiosynthese bei Frauen erwarten. Kurve „A" zeigt die Wirkung von hLH auf die Steroidbiosynthese in der Abwesenheit von Antikörper. Kurve „B" zeigt die Wirkung einer sehr großen Menge eines Antikörper, der die Aktivität von hLH höchstens um 40% hemmen kann. Kurve „C" stellt den Einfluss einer sehr großen Menge eines Antikörper dar, der die Aktivität von hLH höchstens um 95% hemmen kann. Kurve „D" stellt die Wirkungen einer sehr großen Menge eines neutralisierenden Antikörpers dar.
4 zeigt Vektoren, die in Matrizen/Exklusions-Selektions-Strategien verwendet werden können. Diese Vektoren sind im Entwurf denen ähnlich, die von Bass et al. (34) beschrieben wurden, und die durch den Austausch der codierenden Sequenzen des menschlichen Wachstumshormons mit solchen der α-Untereinheiten von hLH oder einer hLH-Chimäre hergestellt werden, wobei Polymerase-Ketten- Reaktions-Mutageneseverfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet Standard sind, wie z.B. das SOEing-Verfahren, das von Ho et al. beschrieben wurde (63). Ähnliche Vektoren für die Herstellung von Immunogenen für hCG und hFSH können durch den Austausch der Sequenz des Wachstumshormons durch die codierenden Sequenzen der Reste 1 – 114 der β-Untereinheit von hCG, die codierenden Sequenzen der Reste 1 – 111 der β-Untereinheit von hFSH, der codierenden Sequenzen der Reste 1 – 114 der β-Untereinheit von hCG, die an das 5'-Ende der codierenden Sequenzen für die Aminosäuren Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin gebunden sind, die an das 5'-Ende der codierenden Sequenzen der Rinder-α-Untereinheit gebunden sind, oder die codierenden Sequenzen der Reste 1 – 111 der β-Untereinheit von hFSH, die an das 5'-Ende der codierenden Sequenzen der Aminosäuren Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin gebunden sind, die an das 5'-Ende der codierenden Sequenzen der Rinder-α-Untereinheit gebunden sind, hergestellt werden. In dieser Figur stellt das „lac p" den lac-Promotor dar, stlI stellt die Leader-Sequenz dar, „hLH beta" stellt die codierende Sequenz von Codon 1 bis Codon 114 der beta-Untereinheit des menschlichen LH dar, „M13 gene III" stellt die codierende Sequenz der Codons 198 – 410 des M13-Gen-Proteins im gleichen Leserahmen wie die Codons von stlI und des menschliche LH-beta dar. „Amp Resistenz" ist das Gen von dem pBR322, das das β-Lactamase-Enzym codiert, „322 ori" ist der Replikationsursprung von pRB322, und „f1 ori" ist der Ursprung der Replikation von M13. Mutationen würden in dem „hLH-beta"-Anteil dieses Vektors eingeführt. Zusätzlich können die „hLH-beta"-Codons durch die Codons für die anderen Proteine ausgetauscht werden, die in dem Text beschrieben werden.
5 zeigt die Arten von Immunogenen, die eine erhöhte Antigenizität für die Verwendung bei der aktiven Immunisierung gegen LH, hCG oder FSH besitzen. Einige von ihnen besitzen das Heptad-Repeat, von dem bekannt ist, dass es eine Coiled-Coil-Wechselwirkung erzeugt (Bild A). Andere besitzen ein Repeat, von dem bekannt ist, dass es eine Tripel-Helix erzeugt (Bild B). Diese ergeben eine erhöhte Antigenizität, weil sie polymer sind. Andere Verfahren der Herstellung von polymeren Immunogenen schließen die Herstellung von Fusionsproteinen mit entweder dem C-Terminus (Bild C) oder dem N-Terminus des Immunglobulins (Bild D) ein. Ein Einzelketten-Immunogen, das ein Fusionsprotein der Rinder-α-Untereinheit und der β-Untereinheiten von hCG und hFSH umfasst, würde eine erhöhte Antigenizität im Menschen hervorrufen.
5A: Die Codons für zwei oder mehrere Heptad-Repeats werden im Leserahmen zwischen dem Codon 114 und dem Terminationscodon des LH oder der analogen β-Untereinheit eingebracht. Die Konstruktion des Heptad-Repeats ist ähnlich zu der, die in der Referenz 60 beschrieben wurde. Jedes Repeat enthält 7 Aminosäuren, die in der Reihenfolge „A, B, C, D, E, F, G" markiert sind, welche die nachfolgenden Eigenschaften besitzen. Aminosäuren a und d sind hydrophob und sind Leucin, Isoleucin oder Valin. Aminosäuren E und G sind geladene Aminosäuren. Aminosäure E sollte die entgegengesetzte Ladung als Aminosäure G besitzen, um Homodimere zu erzeugen. Wenn E ein Glutamat ist, dann sollte G daher ein Lysin sein. Aminosäuren „B, C, F" können von fast jeder Art sein, welche die Helix-Erzeugung begünstigt. Daher sollten sie wenige Proline oder Glycine enthalten, wenn überhaupt.
5B: Die Codons für 6 oder mehr Triplet-Aminosäuren-Repeats werden im Leserahmen zwischen Codon 114 und dem Terminations-Codon der β-Einheit eingebracht. Diese Triplets codieren die Aminosäuren Glycin, X, Y, wobei X und Y jede Aminosäure sein können, von der bekannt ist, dass sie ein Teil der Collagensequenz ist, welche eine Triplet-Helix erzeugt.
5C: Die Codons für die schwere Kette von IgG werden direkt am 5'-Ende von Codon 1 der β-Untereinheit eingebracht. Wenn diese Gene mit der lamda- oder kappa IgG-leichten Kette coexprimiert werden, werden sie die Herstellung eines IgG hervorrufen, das zwei β-Untereinheiten an seinem C-Terminus enthält.
5D: Die Codons für die Region der schweren Kette von IgG, der die variable und die erste konstante Region fehlt, werden im Leserahmen zwischen Codon 114 und dem Terminations-Codon der β-Untereinheit eingebracht.
5E: Codons für eine Glycin-Serin-Repeat-Sequenz (das heißt GS-Repeat) wie z.B: die Sequenz Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin-Serin-Glycin werden im Leserahmen zwischen Codon 114 und dem Terminations-Codon eines Analogons der β-Untereinheit eingebracht. Das letzte Codon dieses Analogons wird 126. Dann werden die Codons 1 – 96 der Rinder- oder einer anderen α-Untereinheit oder die Codons 1 – 92 der menschlichen α-Untereinheit im Leserahmen zwischen dem Codon 126 und dem Terminations-Codon des Konstrukts der β-Untereinheit, die den Poly-Glycin-Serin-Schwanz enthält, eingebracht. Dieses erzeugt eine einzelne Untereinheit von Gonadotropin, welche die Struktur des Heterodimers des Glycoprotein-Hormons vermittelt.
5F: Die Codons der α-Untereinheit von Mensch, Rind oder anderen Vertebraten oder eine analoge Sequenz werden zwischen dem letzten Codon und dem Terminations-Codon eines Gens eingebracht, das ein Heptad-Repeat codiert, das nur positiv geladene Aminosäuren in den Positionen E und G in dem Heptad-Repeat enthält (das heißt, Heptad-Repeat #1), wobei Verfahren verwendet werden, die jedem Fachmann für rekombinante DNA-Standardtechniken zur Herstellung und Expression von Genen bekannt sind. Wenn dieses Gen in Bakterien oder in Hefe oder in eukaryontischen Zellen oder Organismen exprimiert wird, wird es ein Protein herstellen, das den positiv geladenen Heptad-Repeat an seinem Amino-Terminus und eine α-Untereinheit oder ein α-Untereinheit-Analogon an seinem Carboxy-Terminus besitzt. Die Codons für ein Heptad-Repeat, das negativ geladene Aminosäuren in den Positionen E und G codiert (das heißt, Heptad-Repeat #2), werden zwischen dem letzten Codon und dem Terminations-Codon für ein Analogon der β-Untereinheit eingebracht. Wenn dieses Gen in Bakterien oder in Hefe oder in anderen eukaryontischen Zellen oder Organismen exprimiert wird, wird es ein Protein herstellen, das eine β-Untereinheit oder ein Analogon an seinem Amino-Terminus und den negativ geladenen Heptad-Repeat an seinem Carboxy-Terminus besitzt.
5G: Dies zeigt das Heterodimer, das erzeugt wird, wenn die Proteine, welche die Form besitzen, die in der Erklärung F beschrieben wird, gemischt werden. Die Sequenzen des Heptad-Repeats #1 und des Heptad-Repeats #2 werden gewählt, um die Erzeugung von Heterodimeren zu fördern und die Erzeugung von Homodimeren zu vermindern.
5H: Multimere werden gebildet, wenn die Verbindungen in den 5F und 5G gemischt werden, was auf die Kombination der α- und β-Untereinheiten und der Heptad-Repeats zurückzuführen ist. In den 5A – 5H bezieht sich das „N-„ und das „C-„ auf den Amino-Terminus und den Carboxy-Terminus der Proteine. Das „i" bezieht sich auf eine einzelne Einheit, die mehrere Male wiederholt werden kann. Es sollte beachtet werden, dass, auch wenn die Heptad-Repeats, die hierin erklärt werden, identisch sind, die Verwendung von identischen Repeats nicht wesentlich ist. Es existiert eine hohe Anzahl von Proteinen, die nicht identische Heptad-Repeats enthalten, die in der Lage sind, Homodimere oder Heterodimere zu erzeugen (60).
Einzelketten-Gonadotropine mit Lutropin- und/oder Follitropin-Aktivität
Beispiel 12
Herstellung und Verwendung des Analogons #1 (vergleiche Tabelle 1), ein Einzelketten-Gonadotropin mit Lutropin-Aktivität (vergleiche 6).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #1, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungsansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können hergestellt werden, wobei mit den codierenden Sequenzen für die β-Untereinheit von hCG und für die menschliche α-Untereinheit begonnen wird. Diese können von einer menschlichen Plazenta-cDNA-Genbank kloniert werden. Die Sequenzen, die das Signalpeptid der menschlichen α-Untereinheit codieren, werden deletiert und die codierenden Sequenzen der Proteine werden zusammengespleißt, wobei die SOEing-Technik (63) wie nachfolgend verwendet wird: Primer #1 (100 ng), der die Sequenz 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAG- GATGGAGATGTTCCAGGGGCTGCT-3' besitzt, und Primer #2 (100 ng), der die Sequenz 3'-GGGAGCCTGTGGGGCTAG- GAGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCAT CG-5' besitzt, werden mit der cDNA der β-Untereinheit von hCG (1 μg), das als eine Matrize dient, gemischt und die PCR wird für 25 Temperaturzyklen von 94°C (30 Sekunden), 50°C (60 Sekunden), 72°C (60 Sekunden) durchgeführt, wobei die Pfu-DNA-Polymerase, gekauft von Statagene, La Jolla, CA, und Desoxynucleotidtriphosphate und der PCR-Puffer verwendet werden, wie in (63) beschrieben. Primer #3 (100 ng), der die Sequenz 5'-GGATCCGGTAGCGGATCTGGTAGCGCTC- CTGATGTGCAGGATTGCCCA-3' besitzt, und Primer #4 (100 ng), der die Sequenz 3'-ACGTCATGAACAATAATAGTGTT- TAGAATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5' besitzt, werden mit der cDNA der menschlichen α-Untereinheit (1 μg), die als eine Matrize dient, gemischt und die PCR wird für 25 Temperaturzyklen von 94°C (30 Sekunden), 50°C (60 Sekunden), 72°C (60 Sekunden) durchgeführt, wobei die Pfu-DNA-Polymerase und Desoxynucleotidtriphosphate und der PCR-Puffer verwendet werden, wie in (63) beschrieben. Diese zwei PCR-Reaktionen ergeben Produkte, die als Zwischenmatrizen in einer dritten (endgültigen) PCR-Reaktion dienen, welche die gewünschten Konstrukte in einer Form, die für das Klonieren geeignet ist, ergibt. Die endgültige PCR-Reaktion wird durch das Mischen von 1 μl der Produkte von den ersten beiden PCR-Reaktionen zusammen mit dem Primer #5, der die Sequenz 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTC- GAGCCAAGG-3' besitzt, und dem Primer #6, der die Sequenz 3'-ATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5' besitzt, für 25 Temperaturzyklen von 94°C (30 Sekunden), 50°C (60 Sekunden), 72°C (60 Sekunden) durchgeführt, wobei die Pfu-DNA-Polymerase, zusätzliche Desoxynucleotidtriphosphate und PCR-Puffer verwendet werden. Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BglII gespalten und in pSVL (einen Expressionsvektor, der von Pharmacia, Piscataway, NJ erhalten wurde), der mit XhoI und BamHI gespalten wurde, ligiert, um einen Vektor herzustellen, der die Synthese von Analogon 1 steuern wird. Die XhoI-Stelle des PCR-Produkts wird in die XhoI-Stelle von pSVL ligiert und die BglII-Stelle des PCR-Produkts wird in die BamHI-Stelle von pSVL ligiert. Die XhoI-Stelle wird wieder hergestellt und die BglII- und die BamHI-Stellen werden entfernt. Die Sequenzen der codierenden Regionen (das heißt, zwischen der XbaI-Stelle und der KpnI-Stelle, vergleiche 6) von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die gewünschte Aminosäuresequenz besitzt, die in 6 dargestellt ist. Dies wird durchgeführt, um mögliche Fehler auszuschließen, die als ein Ergebnis der PCR oder einer anderen Manipulation der DNA hervorgerufen werden könnte, und ist eine Standardvorsichtsmaßnahme, um sicherzustellen, dass die gewünschte Sequenz erhalten wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hCG gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Dieser Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert, wie beschrieben wurde (64), und das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des mit radioaktivem Iod markierten hCG an die monoclonalen Antikörper oder an die Antiseren, die gegen hCG hergestellt wurden, zu hemmen. Das Protein, das von den COS-7-Zellen hergestellt wird, wird mit dem radioaktiven Iod markierten hCG um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia University), B107 (erhalten von der Columbia University), B109 (erhalten von der Columbia University), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech), HCZ107 (erhalten von Hybritech) oder HCO514 (erhalten von Hybritech), ZMCG18 (erhalten von Pierce), ZMCG13 (erhalten von Pierce) oder ZMCG7 (erhalten von Pierce) oder 518B7 (erhalten von Dr. Janet Roser, University of California at Davis). Das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird mit dem radioaktiv markierten hCG um die Bindung an die Rezeptoren der Corpora lutea konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Testosteron in einer Leydig-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Moyle et al. (37) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Ovulation in weiblichen Tieren stimuliert wird und dass die Erzeugung von Testosteron in männlichen Säugern stimuliert wird. Es wird ebenfalls erwartet, dass dieses Analogon ein guter Ausgangspunkt für die Verwendung in einem Impfstoff zur Empfängnisverhütung ist, wobei der Matrizen-Ansatz verwendet wird, der in Beispiel 11 dargestellt wird. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #1 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS.
Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die ApaI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen erzeugt wurden, und der Expression des Proteins in COS-7-Zellen, modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 13
Herstellung und Verwendung von Analogon #2, ein Einzelketten-Gonadotropin mit Lutropin-Aktivität (vergleiche 7)
Die codierenden Sequenzen für Analogon #2, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können durch PCR hergestellt werden, wobei die Primer #1 und #7 und als eine Matrize das Expressionskonstrukt, das in Beispiel 12 und in 7 beschrieben wurde, verwendet werden. Die Sequenz von Primer #7 ist 3'-TGGTGGGGAACTGGACACTACT- GGGCGCCCCTAGGCCATCG-5'. Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI gespalten und mit dem großen DNA-Fragment ligiert, das durch die Spaltung mit XhoI und BamHI des Expressionskonstrukts, das in Beispiel 12 beschrieben wird, erhalten wird. Die Sequenzen der codierenden Regionen zwischen der XhoI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 7 beschrieben wird. Dies wird sicherstellen, dass keine Klonierungsartefakte in der Region, die verändert wurde, vorhanden sind.
Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hCG gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des mit radioaktivem Iod markierten hCG an die monoclonalen Antikörper oder an die Antiseren, die gegen hCG hergestellt wurden, zu hemmen. Das Protein, das von den COS-7-Zellen hergestellt wird, wird mit dem mit radioaktiven Iod markierten hCG um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia University), B107 (erhalten von der Columbia University), B109 (erhalten von der Columbia University), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech) oder HCO514 (erhalten von Hybritech), ZMCG18 (erhalten von Pierce), ZMCG13 (erhalten von Pierce) oder ZMCG7 (erhalten von Pierce) oder 518B7 (erhalten von Dr. Janet Roser, University of California at Davis). Das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird mit dem radioaktiv markierten hCG um die Bindung an die Rezeptoren der Corpora lutea konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Testosteron in einer Leydig-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Moyle et al. (37) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Ovulation in weiblichen Tieren stimuliert wird und dass die Erzeugung von Testosteron in männlichen Säugern stimuliert wird. Es wird ebenfalls erwartet, dass dieses Analogon ein guter Ausgangspunkt für die Verwendung in einem Impfstoff zur Empfängnisverhütung ist, wobei der Matrizen-Ansatz verwendet wird, der in Beispiel 11 dargestellt wird. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #2 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen SstII und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die SstII/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen SstII/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen erzeugt wurden, und der Expression des Proteins in COS- 7-Zellen, modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 14
Herstellung und Verwendung von Analogon #3, ein Einzelketten-Gonadotropin mit Lutropin-Aktivität (vergleiche 8).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #3, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können in der Weise hergestellt werden, die für Analogon #2 in Beispiel 13 beschrieben wird, mit der Ausnahme, dass die Primer #1 und #7 durch die Primer #8 und #9 ausgetauscht werden und dass die cDNA der β-Untereinheit von hLH als eine Matrize anstelle der cDNA der β-Untereinheit von hCG verwendet wird. Die cDNA der β-Untereinheit von hLH kann durch Sreening einer menschlichen hypophysären Genbank erhalten werden. Die Sequenz des Primers # 8 lautet 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGAATGGAGATGCTCCAGGGGCTGCT-3' und die Sequenz des Primers #9 lautet 3'-GTGGGGAACTGGACACTGGTGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCATC G-5'
Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI gespalten und in die XhoI/BamHI-Stellen des Expressionsvektors subkloniert, der hergestellt wird, wie in Beispiel 12 beschrieben wird. Die Sequenzen der codierenden Regionen zwischen der XhoI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 8 beschrieben wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MEMLQGLLLLLLLSM- GGAWA fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hLH gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des mit radioaktivem Iod markieren hCG an die monoclonalen Antikörper oder an die Antiseren, die gegen hCG hergestellt wurden, zu hemmen. Das Protein, das von den COS-7-Zellen hergestellt wird, wird mit dem mit radioaktiven Iod markierten hCG um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia University), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech), ZMCG7 (erhalten von Pierce) oder 518B7 (erhalten von Dr. Janet Roser, University of California at Davis). Das Protein, das in das Medium entlassen wurde, wird mit dem radioaktiv markierten hCG um die Bindung an die Rezeptoren der Corpora lutea konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Testosteron in einer Leydig-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Moyle et al. (37) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Ovulation in weiblichen Tieren stimuliert wird und dass die Erzeugung von Testosteron in männlichen Säugern stimuliert wird. Es wird ebenfalls erwartet, dass dieses Analogon ein guter Ausgangspunkt für die Verwendung bei der Entwicklung von Impfstoffen zur Verstärkung oder zur Hemmung der Fruchtbarkeit, wobei das Matrizen-Verfahren verwendet wird, das vorstehend beschrieben wurde. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #3 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen BamHI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DIVA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die BamHI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen BamHI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen durchgeführt wurden, und der Expression des Proteins in COS-7-Zellen modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 15
Herstellung und Verwendung von Analogon #4, ein Einzelketten-Gonadotropin mit Follitropin-Aktivität (vergleiche 9).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #4, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können in der Weise hergestellt werden, die für Analogon #2 in Beispiel 13 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass die Primer #1 und #7 durch die Primer #10 und #11 ausgetauscht werden und dass die cDNA der β-Untereinheit von hFSH als eine Matrize anstelle von der cDNA der β-Untereinheit von hCG verwendet wird. Die cDNA der β-Untereinheit von hFSH kann von einer Genbank einer menschlichen Hypophyse erhalten werden. Die Sequenz des Primers #10 lautet 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGATGAAGACACTCCAGTT TTTCTTCC-3' und die Sequenz des Primers #11 lautet 3'-GACGAGGAAACCACTTTACTTTCTTCCTAGGCCATCGCCTAGACGA-5'. Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI gespalten und in die XhoI/BamHI-Stellen des Expressionsvektors subkloniert, der hergestellt wird, wie in Beispiel 12 beschrieben wird. Die Sequenzen der codierenden Regionen zwischen der XbaI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 9 beschrieben wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MKTLQFFFLFCCWKA- ICC fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hFSH gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das von den Zellen hergestellt wird, wird mit dem mit radioaktiven Iod markierten hFSH um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia ZMFS1 erhalten von Pierce), A201 (erhalten von der Columbia University), FSG761 (erhalten von Hybritech), FSR093.3 (erhalten von Hybritech), FSH 107 (erhalten von Hybritech), FSB061 (erhalten von Hybritech), FSM210 (erhalten von Hybritech) und FSM268 (erhalten von Hybritech). Das Protein, das in das Medium entlassen wurde, wird mit dem hFSH um die Bindung an die Rezeptoren von Rinderhoden konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Östradiol in einer Granulosa-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Skaf et al. (65) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Follikelentwicklung und die Spermatogenese in weiblichen und männlichen Säugern stimuliert wird. Dieses Analogon ist ebenfalls eine nützliche Ausgangsverbindung für die Selektion eines Immunogens, das Antikörper gegen FSH erzeugt und ein Teil eines Impfstoffs zur Empfängnisverhütung ist. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #4 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die ApaI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen durchgeführt wurden, und der Expression des Proteins in COS-7-Zellen modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 16
Herstellung und Verwendung von Analogon #5, ein Einzelketten-Gonadotropin mit FSH-Aktivität, das strukturell mehr Ähnlichkeit mit hCG als mit hFSH besitzt (vergleiche 10).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #5, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können in der Weise hergestellt werden, die für Analogon #2 in Beispiel 13 beschrieben wird, mit der Ausnahme, dass der Primer #7 durch den Primer #12 ausgetauscht wird. Die Sequenz des Primers #12 lautet 3'-CGACAGTCGACAGTTACACGTGAGACGCTGTCGCT- GTCGTGACTAACATG ACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGAGGAAACCACTTTACTTTCTTC CTAGGCCATCG-5'. Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI gespalten und in die XhoI/BamHI-Stellen des Expressionsvektors subcloniert, der hergestellt wird, wie in Beispiel 12 beschrieben wird. Die Sequenzen der codierenden Regionen zwischen der XhoI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 10 beschrieben wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hCG gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des mit radioaktivem Iod markierten hCG an monoclonale Antikörper oder an Antiseren, die gegen hCG hergestellt wurden, zu hemmen. Das Protein, das von den COS-7-Zellen hergestellt wird, wird mit dem mit radioaktiven Iod markierten hCG um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia University), B107 (erhalten von der Columbia University), B109 (erhalten von der Columbia University), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech) oder HCO514 (erhalten von Hybritech), ZMCG18 (erhalten von Pierce), ZMCG13 (erhalten von Pierce) oder ZMCG7 (erhalten von Pierce) oder 518B7 (erhalten von Dr. Janet Roser, University of California at Davis). Das Protein, das in das Medium entlassen wurde, wird mit dem hFSH um die Bindung an die Rezeptoren von Rinderhoden konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Östradiol in einer Granulosa-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Skaf et al. (65) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Follikelentwicklung und die Spermatogenese in weiblichen und männlichen Säugern stimuliert wird. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #5 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die ApaI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen erzeugt wurden, und der Expression des Proteins in COS-7-Zellen, modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 17
Herstellung und Verwendung von Analogon #6, ein Einzelketten-Gonadotropin mit FSH- und LH-Aktivitäten, das strukturell mehr Ähnlichkeit mit hCG als mit hFSH besitzt (vergleiche 11).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #6, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können in der Weise hergestellt werden, die für Analogon #2 in Beispiel 13 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass der Primer #7 durch den Primer #13 ausgetauscht wird. Die Sequenz des Primers #13 lautet 3'-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGA TGACGAGGAAACCACTTTACTTTCTTCCTAGGCCATCG-5'. Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI gespalten und in die XhoI/BamHI-Stellen des Expressionsvektors subkloniert, der hergestellt wird, wie in Beispiel 12 beschrieben wird. Die Sequenzen der codierenden Regionen zwischen der XbaI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 11 beschrieben wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der Untereinheit von hCG gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des mit radioaktivem Iod markierten hCG an monoclonale Antikörper oder an Antiseren, die gegen hCG hergestellt wurden, zu hemmen. Das Protein, das von den COS-7-Zellen hergestellt wird, wird mit dem mit radioaktiven Iod markierten hCG um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia University), B107 (erhalten von der Columbia University), B109 (erhalten von der Columbia University), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech), oder HCO514 (erhalten von Hybritech), ZMCG18 (erhalten von Pierce), ZMCG13 (erhalten von Pierce) oder ZMCG7 (erhalten von Pierce) oder 518B7 (erhalten von Dr. Janet Roser, University of California at Davis). Das Protein, das in das Medium entlassen wurde, wird mit dem hFSH um die Bindung an die Rezeptoren von Rinderhoden konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Östradiol in einer Granulosa-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Skaf et al. (65) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Follikelentwicklung und die Spermatogenese in weiblichen und männlichen Säugern stimuliert wird. Das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird mit dem radioaktiv markierten hCG um die Bindung an Rezeptoren auf der Corpora lutea konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Testosteron in einer Leydig-Zell-Analyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Moyle et al. (64) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Ovulation in weiblichen Tieren stimuliert wird und die Erzeugung von Testotsteron in männlichen Säugern stimuliert wird. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #6 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die ApaI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen erzeugt wurden, und der Expression des Proteins in COS-7-Zellen, modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 18
Herstellung und Verwendung von Analogon #7, ein Einzelketten-Gonadotropin mit FSH- und LH-Aktivitäten, das strukturell mehr Ähnlichkeit mit hCG als mit hFSH besitzt.
Die codierenden Sequenzen für Analogon #7, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können in der Weise hergestellt werden, die für Analogon #2 in Beispiel 13 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass der Primer #7 durch den Primer #14 ausgetauscht wird. Die Sequenz des Primers #14 lautet 3'-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGA TGACGAGGAAACCACTTCCTAGGCCATCG-5'. Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI gespalten und in die XhoI/BamHI-Stellen des Expressionsvektors subkloniert, der hergestellt wird, wie in Beispiel 12 beschrieben wird. Die Sequenzen der codierenden Regionen zwischen der XbaI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 12 beschrieben wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hCG gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des mit radioaktivem Iod markierten hCG an monoclonale Antikörper oder an Antiseren, die gegen hCG hergestellt wurden, zu hemmen. Das Protein, das von den COS-7-Zellen hergestellt wird, wird mit dem mit radioaktiven Iod markierten hCG um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia University), B107 (erhalten von der Columbia University), B109 (erhalten von der Columbia University), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech), oder HCO514 (erhalten von Hybritech), ZMCG18 (erhalten von Pierce), ZMCG13 (erhalten von Pierce), oder ZMCG7 (erhalten von Pierce) oder 518B7 (erhalten von Dr. Janet Roser, University of California at Davis). Das Protein, das in das Medium entlassen wurde, wird mit dem hFSH um die Bindung an die Rezeptoren von Rinderhoden konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Östradiol in einer Granulosa-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Skaf et al. (65) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Follikelentwicklung und die Spermatogenese in weiblichen und männlichen Säugern stimuliert wird. Das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird mit dem radioaktiv markierten hCG um die Bindung an Rezeptoren auf der Corpora lutea konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Testosteron in einer Leydig-Zell-Analyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Moyle et al. (37) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Ovulation in weiblichen Tieren stimuliert wird und die Erzeugung von Testotsteron in männlichen Säugern stimuliert wird. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #7 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die ApaI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen erzeugt wurden, und der Expression des Proteins in Cos-7-Zellen, modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 19
Herstellung und Verwendung von Analogon #8, ein Einzelketten-Gonadotropin mit FSH- und LH-Aktivitäten, das strukturell mehr Ähnlichkeit mit hCG als mit hFSH besitzt (siehe 13).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #8, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können in der Weise hergestellt werden, die für Analogon #2 in Beispiel 13 beschrieben wird, mit der Ausnahme, dass der Primer #7 durch den Primer #15 ausgetauscht wird. Die Sequenz des Primers #15 lautet 3'-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGA TGACGCTACTGGGCGCCCCTAGGCCATCG-5'. Das endgültige PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI gespalten und in die XhoI/BamHI-Stellen des Expressionsvektors subkloniert, der hergestellt wird, wie in Beispiel 12 beschrieben wird. Die Sequenzen der codierenden Regionen zwischen der XbaI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten werden bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz, die in 13 beschrieben wird, erhalten wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hCG gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird auf seine Fähigkeit getestet, die Bindung des mit radioaktivem Iod markierten hCG an monoclonale Antikörper oder an Antiseren, die gegen hCG hergestellt wurden, zu hemmen. Das Protein, das von den COS-7-Zellen hergestellt wird, wird mit dem radioaktiven Iod markierten hCG um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: B101 (erhalten von der Columbia University), B105 (erhalten von der Columbia University), B107 (erhalten von der Columbia University), B109 (erhalten von der Columbia University), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech) oder HCO514 (erhalten von Hybritech), ZMCG18 (erhalten von Pierce), ZMCG13 (erhalten von Pierce) oder ZMCG7 (erhalten von Pierce) oder 518B7 (erhalten von Dr. Janet Roser, University of California at Davis). Das Protein, das in das Medium entlassen wurde, wird mit dem hFSH um die Bindung an die Rezeptoren von Rinderhoden konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Östradiol in einer Granulosa-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Skaf et al. (65) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Follikelentwicklung und die Spermatogenese in weiblichen und männlichen Säugern stimuliert wird. Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Testosteron in einer Leydig-Zell-Analyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Moyle et al. (37) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Ovulation in weiblichen Tieren stimuliert wird und die Erzeugung von Testotsteron in männlichen Säugern stimuliert wird. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #8 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die jede Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die ApaI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen durchgeführt wurden, und der Expression des Proteins in Cos-7-Zellen modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 20
Herstellung und Verwendung von Analogon #9, ein Einzelketten-Gonadotropin mit Follitropin-Aktivität (vergleich 14).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #9, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können durch die Spaltung des Konstrukts, das in Beispiel 15 beschrieben wird und das verwendet wird, um Analogon 4 zu exprimieren, mit den Restriktionsenzymen ApaI und BamHI hergestellt werden. Das kleine Stück wird durch eine Kassette einer synthetischen DNA ersetzt, um die Sequenz zu erzeugen, die in 14 dargestellt ist. Die codierende Sequenz zwischen der ApaI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten wird bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 14 beschrieben wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MKTLQFFFLFCCWKAICC fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hCG gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das von den Zellen hergestellt wird, wird mit dem mit radioaktiven Iod markierten hFSH um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: ZMFS1 (erhalten von Pierce), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech), FSG761 (erhalten von Hybritech), FSR093.3 (erhalten von Hybritech), FSH 107 (erhalten von Hybritech), FSB061 (erhalten von Hybritech), FSM210 (erhalten von Hybritech) und FSM268 (erhalten von Hybritech). Das Protein, das in das Medium entlassen wird, wird mit dem hFSH um die Bindung an die Rezeptoren von Rinderhoden konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Östradiol in einer Granulosa-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Skaf et al. (65) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Follikelentwicklung und die Spermatogenese in weiblichen und männlichen Säugern stimuliert wird. Dieses Analogon ist ebenfalls eine gute Ausgangsverbindung für die Selektion eines Immunogens, das Antikörper gegen FSH erzeugt und ein Teil eines Impfstoffs zur Empfängnisverhütung ist. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #9 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die ApaI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen durchgeführt wurden, und der Expression des Proteins in COS-7-Zellen, modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 21
Herstellung und Verwendung von Analogon #10, ein Einzelketten-Gonadotropin mit Follitropin-Aktivität (vergleiche 15).
Die codierenden Sequenzen für Analogon #10, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, können synthetisiert werden, wobei der Blockierungs-Ligierungs-Ansatz verwendet wird, der beschrieben wurde (54), oder sie können durch die Spaltung des Konstrukts, das in Beispiel 15 beschrieben wird und das verwendet wird, um Analogon 4 zu exprimieren, mit den Restriktionsenzymen ApaI und BamHI hergestellt werden. Das kleine Stück wird durch eine Kassette einer synthetischen DNA ersetzt, um die Sequenz zu erzeugen, die in 15 dargestellt ist. Die codierende Sequenz zwischen der ApaI-Stelle und der BamHI-Stelle von mehreren Konstrukten wird bestimmt, bis eine gefunden wird, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die in 15 beschrieben wird. Es wird erwartet, dass dem exprimierten Protein die Aminosäurereste MKTLQFFFLFCCWKAICC fehlen, die der Anteil der Signalsequenz sind, die in der β-Untereinheit von hFSH gefunden wird und die von der Zelle während der Proteinsynthese entfernt wird. Der Vektor wird in COS-7-Zellen exprimiert und das Protein, das von den Zellen hergestellt wird, wird mit dem radioaktiven Jod markierten hFSH um die Bindung an einen oder an mehreren der nachfolgenden Antikörper konkurrieren: ZMFS1 (erhalten von Pierce), A201 (erhalten von der Columbia University), HCU061 (erhalten von Hybritech), FSG761 (erhalten von Hybritech), FSR093.3 (erhalten von Hybritech), FSH107 (erhalten von Hybritech), FSB061 (erhalten von Hybritech), FSM210 (erhalten von Hybritech) und FSM268 (erhalten von Hybritech). Das Protein, das in das Medium entlassen wurde, wird mit hFSH um die Bindung an die Rezeptoren von Rinderhoden konkurrieren, wie von Campbell, Dean-Emig und Moyle beschrieben wurde (64). Es wird erwartet, dass die Erzeugung von Östradiol in einer Granulosa-Zellanalyse, die ähnlich zu der durchgeführt wird, die von Skaf et al. (65) beschrieben wurde, stimuliert wird und dass die Follikelentwicklung und die Spermatogenese in weiblichen und männlichen Säugern stimuliert wird. Dieses Analogon ist ebenfalls eine gute Ausgangsverbindung für die Selektion eines Immunogens, das Antikörper gegen FSH erzeugt, und ein Teil eines Impfstoffs zur Empfängnisverhütung ist. Dieses Analogon wird in Tabelle 1 als Analogon #10 gezeigt und enthält eine Linker-Sequenz GSGSGSGS. Dieser Linker kann durch die Spaltung des Expressionsvektors mit den Endonuclease-Restriktionsenzymen ApaI und Eco47III, dem Verwerfen des kurzen Fragments, der Ligierung einer Kassette einer synthetischen doppelsträngigen DNA mit den gewünschten Aminosäure-Codons, die eine beliebige Anzahl von Glycin- oder Serin-Codons oder Codons anderer Aminosäuren enthalten, in die BamHI/Eco47III-Stelle durch Standardverfahren, der Sequenzierung der Region zwischen ApaI/Eco47III, um zu bestätigen, dass die gewünschten Mutationen durchgeführt wurden, und der Expression des Proteins in COS-7-Zellen, modifiziert werden. Dies kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Einzelketten-Gonadotropins zu optimieren. Es wird erwartet, dass das Protein als ein Monomer funktioniert oder dass es sich zusammenlagert, um aktive Homodimere zu erzeugen. Zusätzlich wird erwartet, dass mehrere Kopien des Proteins sich zusammenlagern, um Multimere zu erzeugen.
Beispiel 22
Herstellung eines Analogons der α-Untereinheit, dem die Glycosylierungsstellen fehlen (vergleiche 16)
Es wird erwartet, dass die Analoga 1 – 10 4 Asparagin gebundene Oligosaccharide enthalten, da sie 4 Gruppen von Codons für die Sequenz Asparagin-X-Threonin/Serin enthalten, wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann. Es wurde gezeigt, dass die Entfernung der Asparagin gebundenen Oligosaccharide, besonders solche der α-Untereinheit, die Wirkung des Hormons vermindert. Die Asparagin gebundene Glycosylierungssignale können von dem Anteil der α-Untereinheit des Einzelketten-Gonadotropins unter Verwendung der PCR entfernt werden, wie hierin beschrieben wird. Der PCR-Primer 16, der die Sequenz: 5'-TGCTTCTCTAGAGCATATCCCACTCCACTAAGGTCCAAGAAGACGATGTT GGTCCAAAAGCAAGTCACCT-3' besitzt, und der PCR-Primer 17, der die Sequenz: 3'-CAAAGTTTCACCTCGTTGTGTGCCGCACGGTGACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCATG-5' besitzt, werden in einer PCR-Reaktion mit einem Vektor, der die Expression von Analogon 1 lenken kann und der in Beispiel 12 und 6 beschrieben wurde, verwendet. Nach 25 Zyklen unter den Bedingungen, die in Beispiel 12 beschrieben werden, werden das PCR-Produkt und der Expressionsvektor mit XbaI und KpnI gespalten. Das kleine Fragment, das durch die Spaltung des Vektors hergestellt wird, wird verworfen, und das gespaltenen PCR-Produkt wird in den Vektor an seine Stelle ligiert. Dies stellt einen Expressionsvektor her, der Analogon 11 codiert, ein Analogon, das nur zwei Asn-gebundene Glycosylierungssignale enthält, von dem aber erwartet wird, dass es seine Affinität für Antikörper und Antiseren behält, die an hCG binden. Es wird ebenfalls erwartet, dass es seine Affinität für LH-Rezeptoren behält, wie durch seine Fähigkeit gezeigt wird, mit hCG um die Bindung an Membrane der Corpora lutea von Ratten zu binden. Es wird jedoch erwartet, dass es eine verminderte Fähigkeit besitzt, eine Signaltransduktion zu induzieren, besonders wenn seine Fähigkeit; die Akkumulation von zyklischem AMP hervorzurufen, getestet wird (37). Es ist möglich, ähnliche Derivate der Analoga 2 – 10 zu erzeugen, in denen die Oligosaccharide von dem Anteil des Proteins entfernt werden, das von der α-Untereinheit durch die Spaltung jedes der Expressionsvektoren mit BamHI und KpnI, dem Verwerfen des kleineren Fragments und der Ligierung des kleinen BamHI/KpnI-Fragments, das durch die Spaltung von Analogon 11 erhalten wird, abgeleitet wird. Daher würde Analogon 2 zu Analogon 12, Analogon 3 würde zu Analogon 13, Analogon 4 würde zu Analogon 14, Analogon 5 würde zu Analogon 15, Analogon 6 würde zu Analogon 16, Analogon 7 würde zu Analogon 17, Analogon 8 würde zu Analogon 18, Analogon 9 würde zu Analogon 19 und Analogon 10 würde zu Analogon 20. Es sollte beachtet werden, dass es ebenfalls möglich ist, nur eine der zwei Glycosylierungssignale von dem Anteil des Einzelketten-Gonadotropins zu entfernen, der von der α-Untereinheit abgeleitet ist, indem einfach die Sequenzen der Primer 16 und 17 während ihrer Synthese ausgetauscht werden und das Protokoll befolgt wird, das hierin beschrieben wird. Jedes dieser Analoga würde die gleiche Antikörper- und Rezeptor-Bindung wie sein Vorläufer zeigen. Sie würden eine verminderte Wirkung besitzen und als eine Konsequenz würden sie die Signaltransduktion hemmen. Analoga 11, 12 und 13 würden die Aktivität von LH vermindern und würden die Fruchtbarkeit stimulieren, wenn sie zu einem frühen Zeitpunkt der follikulären Phase des Menstruationszyklus verabreicht werden. Sie würden die Aktivität von hCG vermindern und sie würden die Fruchtbarkeit verhindern, wenn sie in zeitlicher Nähe der erwarteten Menstruation verabreicht werden.
Beispiel 23
Herstellung des Analogons 1a, dem Asparagin gebundene Oligosaccharide fehlen (vergleiche 17 und 18).
Die Wirkung der Gonadotropine ist proportional zu ihrem Gehalt an Kohlenhydraten und während die Analoga 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20 eine niedrige Wirkung besitzen, ist es möglich ihre Wirkung weiter zu vermindern, indem alle Oligosaccharidketten entfernt werden. Die Asparagin gebundenen Oligosaccharidketten können von Analogon 11 durch PCR-SOEing (63) entfernt werden, wobei die Primer 1 und 18 in einer Reaktion und die Primer 2 und 19 in einer zweiten Reaktion verwendet werden. Der Expressionsvektor für das Analogon 11 dient als eine Matrize in beiden Reaktionen. Die Sequenz des Primers #18 lautet 5'-CGGGGTAGGTTCGGTGGGAC- CGACACCTCTTCCTCCCGACGGGG-3' und die Sequenz des Primers 19 lautet 3'-GTGGAGAAGGAGGGCTGCCCCGT- GTGCATCACCGTCAACACCACCATC-5'. Nach 25 Temperaturzyklen bei 94°C (30 Sek.), 55°C (60 Sek.) und 72°C (60 Sek.) wird 1 μl jeder PCR-Reaktion mit dem Primer #5 und zusätzlich mit dem Primer #2, neuem Puffer, Enzym und Desoxynucleotidtriphosphaten gemischt. Nach 25 zusätzlichen Zyklen wird das Reaktionsprodukt mit XhoI und BamHI gespalten und anstelle der ursprünglichen DNA, die zwischen den XhoI/BamHI-Stellen des Vektors gefunden wird, der das Analogon 11 codiert, eingefügt. Dies wird dadurch erreicht, dass der Vektor mit XhoI und BamHI gespalten wird, das kleine Fragment verworfen wird und anschließend das große Fragment mit dem XhoI/BamHI gespaltenen PCR-Produkt ligiert wird. Mehrere Klone werden einer DNA-Sequenzierung unterzogen, bis einer erhalten wird, der das Analogon codiert, das in 18 dargestellt wird und das Analogon 1a genannt wird. Wenn dieses in COS-7-Zellen exprimiert wird, wird das Protein, das hergestellt wird, von den gleichen Antikörpern und Antiseren wie Analogon 1 erkannt werden. Analogon 1a wird ebenfalls an Lutropin-Rezeptoren binden, aber es wird eine verminderte Wirkung relativ zu hCG besitzen. Daher wird es nützlich für die Verminderung der Funktion von LH oder hCG sein. Wenn es früh in der follikulären Phase des Menstruationszyklus verabreicht wird, wird Analogon 1a die Androgen-Synthese vermindern. Als eine Folge davon wird die Östradiol-Synthese sinken, die FSH-Spiegel werden steigen und die Fruchtbarkeit wird stimuliert. Analogon 1a wird ebenfalls nützlich für die Hemmung der vorzeitigen Luteinsierung des Follikels sein. Wenn es in der Luteal-Phase etwa zu dem Zeitpunkt der erwarteten Menstruation verabreicht wird, wird das Analogon die Wirkung von hCG blockieren und als ein Induktor der Menstruation und ein Inhibitor der Fruchtbarkeit dienen. Analogon 1a wird ebenfalls als eine gute Ausgangsverbindung dienen, um Impfstoffe zu entwerfen, wobei die Matrizen-Strategie verwendet wird, die vorstehend beschrieben wurde.
Beispiel 24
Herstellung anderer Gonadotropine, denen Asparagin gebundene Oligosaccharide fehlen
Die codierenden Vektoren für die Analoga 2a, 5a, 6a, 7a und 8a werden leicht von dem Analogon 1a und den Analoga 12, 15, 16, 17 und 18 hergestellt. Analogon 1a wird mit KpnI und MstII gespalten und das kleine Fragment wird verworfen. Das große Fragment wird getrennt von dem kleinen Fragment, das durch die Spaltung mit KpnI und MstII des codierenden Vektors für die Analoga 12, 15, 16, 17 und 18 hergestellt wird, ligiert. Die Analoga 2a, 5a, 6a, 7a und 8a werden die gleichen Antikörper und Rezeptoren wie jeweils die Analoga 2, 5, 6, 7 und 8 binden. Ihre Fähigkeit, Signaltransduktion zu erzeugen, wird jedoch vermindert sein. Daher werden sie als Inhibitoren dienen. Analogon 2a wird hauptsächlich bei der Blockierung der Bindung der Hormone an die LH-Rezeptoren wirksam sein. In Abhängigkeit von dem Zeitpunkt, an dem es verabreicht wird, wird Analogon 2a die Fruchtbarkeit steigern (das heißt, wenn es früh in dem Menstruationszyklus gegeben wird) oder es wird die Fruchtbarkeit hemmen (das heißt, wenn es zeitnah zur Implantation oder der erwarteten Menstruation gegeben wird). In dieser Hinsicht werden die Analoga 1a und 2a ähnliche Aktivitäten besitzen. Analogon 5a wird hauptsächlich bei der Blockierung der Bindung der Hormone an die FSH-Rezeptoren wirksam sein. Das Analogon 5a wird nützlich für die Unterdrückung einer Hyperstimulation der Ovarien sein. Die Analoga 6a, 7a und 8a werden Inhibitoren der Bindung an LH- und FSH-Rezeptoren sein. Diese werden für die Unterdrückung der Hyperstimulation der Ovarien und für die Blockierung der vorzeitigen Luteinisierung nützlich sein.
Die codierenden Vektoren für die Analoga 3a und 4a können durch die SOEing-PCR (63) hergestellt werden, in der die Analoga 13 und 14 als Matrizen dienen. Die Strategie für den Entwurf der Primer ist ähnlich zu der, die für die Herstellung der Primer beschrieben wurde, die verwendet werden, um den Expressionsvektor für Analogon 1a zu modifizieren. Wenn die Analoga 3a und 4a in COS-7-Zellen exprimiert werden, werden die Proteine, die hergestellt werden, von den gleichen Antikörpern und Antiseren wie entweder Analogon 3 oder Analogon 4 erkannt werden. Analogon 3a wird für die Hemmung der Aktivität der Hormone, die an die LH-Rezeptoren binden, nützlich sein. Daher wird es die Fruchtbarkeit stimulieren, wenn es früh in der follikulären Phase gegeben wird. Analogon 4a wird für die Hemmung der Aktivität von FSH nützlich sein. Analogon 3a wird als ein Ausgangsmolekül für die Entwicklung des Impfstoffes nützlich sein, der verwendet werden soll, um die Fruchtbarkeit zu erhöhen, wobei die Matrizen-Strategie und die Antikörper verwendet werden, die in der Lage sind, die Aktivität von LH teilweise zu neutralisieren. Analogon 3a wird außerdem als ein Startmolekül für die Entwicklung des Impfstoffes nützlich sein, um die Fruchtbarkeit zu verhindern, wobei die Matrizen-Strategie und die Antikörper verwendet werden, die in der Lage sind, die LH-Aktivität zu neutralisieren. Antikörper 4a wird ebenfalls als ein Ausgangsmolekül für die Entwicklung des anti-FSH-Impfstoffs nützlich sein, der vorstehend beschrieben wurde, wobei die Matrizen-Strategie verwendet wird.
Die codierenden Vektoren für die Analoga 9a und 10a können von dem codierenden Vektor für Analogon 4a hergestellt werden. Der codierende Vektor für Analogon 4a wird mit BalI und KpnI gespalten und das kleine Fragment wird verworfen. Die kleinen BalI-KpnI-Fragmente von den codierenden Vektoren für die Analoga 19 und 20 werden getrennt in das große Analogon 4a-Fragment ligiert, um die codierenden Vektoren für die Analoga 9a und 10a herzustellen. Wenn sie in COS-7-Zellen hergestellt werden, werden die Analoga 9a und 10a ähnliche Bindungsspezifitäten für Antikörper und den FSH-Rezeptor wie die Analoga 9 und 10 besitzen. Die Analoga 9a und 10a werden eine geringere Wirksamkeit besitzen und sie werden die Aktivität von FSH hemmen. Daher werden sie für die Verminderung der Hyperstimulation der Eierstöcke nützlich sein. Sie werden ebenfalls ein nützlicher Ausgangsvektor für die Entwicklung von anti-FSH-Impfstoffen sein, wobei die Matrizen-Strategie verwendet wird.
Beispiel 25
Typisches Verfahren zum Einbringen einer Glycosylierungsstelle in ein Gonadotropin
Zurückzuführen auf den positiven Einfluss der Oligosaccharidreste auf die Stabilität der Hormone im Kreislauf, ist es häufig nützlich, an die Proteine zusätzliche Oligosaccharidketten anzuheften. Die Zugabe der Oligosaccharide kann ebenfalls verwendet werden, um unerwünschte Interaktionen mit Antikörpern oder Rezeptoren zu verhindern. Die Oberflächen des Proteins, das nicht mit Rezeptoren interagiert, sind nützliche Stellen, um Oligosaccharidketten einzufügen, die dazu verwendet werden sollen, die Hormonfunktion zu stimulieren. Dies kann eine wertvolle Wirkung bei der Modulation der Aktivitäten von Einzelketten-Glycoprotein-Hormonen oder bei der Modulation der Aktivitäten der α,β-heterodimeren Glycoprotein-Hormone haben. Zum Beispiel wird das Einfügen eines Glycosylierungssignals an den Resten 71 – 73 der β-Untereinheit von FSH, um ein Asparagin gebundenes Oligosaccharid am Rest 71 zu erzeugen, zu einem Hormon führen, das eine höhere Aktivität besitzt. Dementsprechend wird das Einbringen eines Glycosylierungsrests in dieser Region des Proteins, nachdem die anderen Glycosylierungen entfernt wurden, seine hemmende Aktivität steigern. Verfahren zum Ausführen der Mutagenese sind auf dem Fachgebiet Standard und variieren von der vollständigen Synthese der codierenden Sequenzen durch Blockierungs-Ligierung von synthetischen Oligonucleotiden (54) bis zur SOEing-PCR (63). Mehrere Beispiele der Mutagenese mittels der SOEing-PCR wurden bereits gegeben.
Beispiel 26
Verwendung von anderen Sequenzen als solche, die von menschlichen Untereinheiten abgeleitet wurden
Die Analoga 1 – 20, Analoga 1b – 10b und insbesondere die Analoga 1a – 10a werden als nützliche Ausgangsverbindungen für eine Matrizen gerichtete Impfstoffentwicklung dienen. Für die Entwicklung von Hormon spezifischen Impfstoffen für die Verwendung im Menschen ist es nützlich, Analoga herzustellen, die ähnlich zu denen sind, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, mit einer nichtmenschlichen α-Untereinheit anstelle der menschlichen α-Untereinheit. Dies ist so, weil die Rinder-α-Untereinheit die Proteine unähnlicher zu den menschlichen Hormonen macht als die Analoga, die in Tabelle 1 aufgelistet sind. Der Ansatz zum Entwerfen von Einzelketten-Glycoprotein-Hormonen ist ähnlich zu denen, die in den Beispielen 12 – 21 aufgelistet sind, mit der Ausnahme, das die codierenden Sequenzen für die nicht menschlichen α-Untereinheiten für die dargestellten Sequenzen der menschlichen α-Untereinheiten ausgetauscht sind. Die Glycosylierungssignale können auf ähnlicher Weise durch das Verändern der Codons für Asparagin oder Serin oder Threonin oder durch das Einfügen eines Prolins zwischen dem Asparagin und dem Serin oder dem Threonin entfernt werden.
Wenn die Matrizen-Strategie verwendet wird, um Immunogene zu entwerfen, ist es häufig wünschenswert, zusätzlich mit einem nichtmenschlichen Molekül zu starten, das nur wenig oder keine Affinität für die Matrize besitzt, die in der positiven Selektion verwendet wird, und Reste einzufügen, die zu einer Selektion führen werden. Diese Analoga können durch den Austausch der Sequenzen der β-Untereinheit von FSH, LH oder TSH von nichtmenschlichen Quellen anstelle der Sequenzen des menschlichen FSH, LH und hCG, die in den Beispielen 1 – 25 und Tabelle 1 dargestellt wurden, hergestellt werden. Tabelle 1 Strukturen der Einzelketten-Gonadotropine
Definitionen der Buchstaben und Sequenzen in Tabelle 1

„n-" bezieht sich auf das N-Ende des Proteins
„-c" bezieht sich auf das C-Ende des Proteins
„hCGβ(1-145)" bezieht sich auf die Reste 1-145 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hCG:
"hCGβ(1-114)" bezieht sich auf die Reste 1 – 114 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hCG:
"hCGβ(1-93)" bezieht sich auf die Reste 1 – 93 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hCG:
"hLHβ(1-114)" bezieht sich auf die Reste 1 – 114 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hLH:
"hFSHβ(1-111)" bezieht sich auf die Reste 1 – 111 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hFSH:

Definitionen der Buchstaben und Sequenzen in Tabelle 1 (Fortsetzung)

„hFSHβ(1-108)" bezieht sich auf die Reste 1-108 der Aminosäurereste der β-Untereinheit von hFSH:
"hFSHβ(1-104)" bezieht sich auf die Reste 1 – 104 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hFSH:
"hFSHβ(88-111)" bezieht sich auf die Reste 88 – 111 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hFSH:
"hFSHβ(95-111)" bezieht sich auf die Reste 95 – 111 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hFSH:
"hFSHβ(95-108)" bezieht sich auf die Reste 95 – 108 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hFSH:
"hFSHβ(95-103)" bezieht sich auf die Reste 95 – 103 der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von hFSH:
„N13X" bezieht sich auf die Substitution von Glutamin oder von einer anderen Aminosäure für den Rest Asparagin 13 der β-Untereinheit und Analoga von hCG
„N30X" bezieht sich auf die Substitution von Glutamin oder von einer anderen Aminosäure für den Rest Asparagin 30 der β-Untereinheit und Analoga von hLH

Definitionen der Buchstaben und Sequenzen in Tabelle 1 (Fortsetzung)

„N52X" bezieht sich auf die Substitution von Glutamin oder von einer anderen Aminosäure für den Rest Asparagin 52 der menschlichen α-Untereinheit und Analoga
„N78X" bezieht sich auf die Substitution von Glutamin oder von einer anderen Aminosäure für den Rest Asparagin 78 der menschlichen α-Untereinheit und Analoga
„P78X" bezieht sich auf die Substitution von jeder Aminosäure außer Prolin für Prolin 78 der β-Untereinheiten und Analoga von hCG und hLH
„V79T" bezieht sich auf die Substitution von Threonin oder Serin für Valin 79 in den β-Untereinheiten und Analoga von hCG oder hLH
„D71N" bezieht sich auf die Substitution von Asparagin für Asparaginsäure 71 in den β-Untereinheiten und Analoga von hFSH
„L73T" bezieht sich auf die Substitution von Threonin oder Serin für Leucin 73 in den β-Untereinheiten und Analoga von hFSH
„humanα(1-92)" bezieht sich auf die Reste 1 – 92 der Sequenz der menschlichen α-Untereinheit
„Linker" bezieht sich auf eine Sequenz, welche die sich wiederholenden Aminosäuren Glycin und Serin wie z.B. GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS oder jede andere Aminosäurensequenz enthält, die den Sequenzen der β- und α-Untereinheiten von Einzelketten-Gonadotropin erlaubt, einen Komplex zu erzeugen, in dem die Teile der α- und β-Untereinheit die Teile der β- und α-Untereinheit des gleichen oder eines anderen Moleküls binden.
„DDPR" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz Asparagin-Asparagin-Prolin-Arginin

Anmerkungen für Tabelle 1

1. Die Reihenfolge der Komponenten von links nach rechts in der Tabelle ist die Reihenfolge, in der die Komponenten in dem Protein von dem Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus auftreten.
2. Zurückzuführen auf die hohe Konservierung der Sequenz in allen Gonadotropinen von Vertebraten, die durch das Alignment ihrer Cysteinreste gesehen werden kann, können Einzelketten-Gonadotropine durch die Substitution von jedem homologen Rest an die entsprechenden Stellen der β-Untereinheiten von hCG, hLH und hFSH hergestellt werden.
3. Die Sequenz der α-Untereinheiten von Gonadotropin von anderen Vertebraten kann für das menschliche α(1-92) ersetzt werden. Dies schließt die Reste 1 – 96 der Rinder-α-Untereinheit ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
4. Wie gezeigt wurde, liegen die Sequenzen, die von der β-Untereinheit abgeleitet wurden, in der Reihenfolge der Komponenten amino-terminal von der α-Untereinheit. Die Reihenfolge der Komponenten in der Tabelle kann so umgekehrt werden, das die Sequenzen der α-Untereinheit amino-terminal von den Sequenzen der β-Untereinheit liegen.
5. Die Aminosäuresequenzen werden in dem Standard-Einzelbuchstaben-Code gezeigt, außer, es wird anders angezeigt.
6. Die codierenden Sequenzen für alle diese Analoga können durch Standardverfahren der rekombinanten DNA hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Ein Verfahren für ihre Herstellung ist das, das von Campbell et al. (54) zur Verfügung gestellt wurde. Sie können in eukaryontischen Zellen durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, exprimiert werden, wobei Vektoren verwendet werden, die für die eukaryontische Expression entworfen wurden und die von InVitrogen, San Diego, CA erhältlich sind. Solche, die keine Oligosaccharidketten enthalten, können ebenfalls in E. coli durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden, wobei Vektoren wie z.B. pET-Vektoren, die von Novagen erhalten werden können, verwendet werden.
7. Die Glycosylierungstellen bei Asparagin 13 und/oder 30 der β-Untereinheit von hCG können durch die Substitution des Asparagins, wie gezeigt wurde, und/oder durch die Substitution der Reste 14 und/oder 31 mit einem Prolin und/oder durch die Substitution der Reste 15 und/oder 32 durch jede andere Aminosäure außer Serin oder Threonin zerstört werden.
8. Die Glycosylierungsstelle bei Asparagin 30 der β-Untereinheit von hLH kann durch die Substitution des Asparagins, wie gezeigt wurde, und/oder durch die Substitution des Rests 31 mit einem Prolin und/oder durch die Substitution des Rests 32 durch jede andere Aminosäure außer Serin oder Threonin zerstört werden.
9. Die Glycosylierungsstellen bei Asparagin 52 und/oder 78 der menschlichen α-Untereinheit können durch die Substitution des Asparagins, wie gezeigt wurde, und/oder durch die Substitution der Reste 53 und/oder 79 mit einem Prolin und/oder durch die Substitution der Reste 54 und/oder 80 durch jede andere Aminosäure außer Serin oder Threonin zerstört werden.
10. Die Glycosylierungsstellen bei Asparagin 56 und/oder 82 der nichtmenschlichen α-Untereinheit können durch die Substitution des Asparagins mit jeder anderen Aminosäure und/oder durch die Substitution der Reste 57 und/oder 83 mit einem Prolin und/oder durch die Substitution der Reste 58 und/oder 84 durch jede andere Aminosäure außer Serin oder Threonin zerstört werden.

Tabelle 2
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Säugern, z.B. Tieren oder Menschen, in Mengen verabreicht werden, die wirksam sind, um die gewünschte therapeutische Wirkung zur Verfügung zu stellen. Da die Aktivität der Verbindungen und der Grad der gewünschten therapeutischen Wirkung variieren, wird der Dosierungsspiegel der verwendeten Verbindung ebenfalls variieren. Die tatsächliche Dosis, die verabreicht wird, wird ebenfalls durch solche im Allgemeinen anerkannten Faktoren bestimmt, wie z.B. das Körpergewicht und die individuelle Hypersensitivität des bestimmten Patienten.
Innerhalb der Beschreibung wurden verschieden Publikationen zitiert.

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Claims

DNA- oder RNA-Molekül das ein Einzelkettenprotein codiert, welches ein Agonist oder Antagonist eines Vertebratenhormons ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus luteinisierendem Hormon (LH), Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und Choriogonadotropin (CG), wobei das Einzelkettenprotein eine Aminosäuresequenz der Formel β-(Linker)-α oder α-(Linker)-β aufweist, wobei β die β-Untereinheit von LH, FSH oder CG oder einer Variante davon ist; „Linker" sich auf einen Peptidlinker bezieht, der mindestens 1 und nicht mehr als 16 Aminosäuren enthält; und α die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit darstellt, die LH, FSH und CG oder einer Variante davon gemeinsam ist.
Expressionsvektor zur Herstellung eines Einzelkettenproteins, welches ein Agonist oder Antagonist eines Vertebratenhormons ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus luteinisierendem Hormon (LH), Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und Choriogonadotropin (CG), wobei das Einzelkettenprotein eine Aminosäuresequenz der Formel β-(Linker)-α oder α-(Linker)-β aufweist, wobei β die β-Untereinheit von LH, FSH oder CG oder einer Variante davon ist; „Linker" sich auf einen Peptidlinker bezieht, der mindestens 1 und nicht mehr als 16 Aminosäuren enthält; und α die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit darstellt, die LH, FSH und CG oder einer Variante davon gemeinsam ist, wobei der Expressionsvektor eine erste Nucleotidsequenz umfasst, die das Einzelkettenprotein codiert, die mit Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression der ersten Nucleotidsequenz zu bewirken.
Rekombinante Wirtszellen, die so modifiziert wurden, dass sie den Expressionsvektor nach Anspruch 2 beinhalten.
Verfahren zur Herstellung eines Einzelkettenproteins, welches ein Agonist oder Antagonist eines Vertebratenhormons ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LH, FSH und CG, wobei das Verfahren die Züchtung der Zellen nach Anspruch 3 unter Bedingungen umfasst, bei denen das Protein produziert wird.
Einzelkettenprotein, welches ein Agonist oder Antagonist eines Vertebratenhormons ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus luteinisierendem Hormon (LH), Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und Choriogonadotropin (CG), wobei das Einzelkettenprotein eine Aminosäuresequenz der Formel β-(Linker)-α oder α-(Linker)-β aufweist, wobei β die β-Untereinheit von LH, FSH oder CG oder einer Variante davon ist; „Linker" sich auf einen Peptidlinker bezieht, der mindestens 1 und nicht mehr als 16 Aminosäuren enthält; und α die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit darstellt, die LH, FSH und CG oder einer Variante davon gemeinsam ist.
DNA- oder RNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das codierte Einzelkettenprotein eine Formel hat, wie in Tabelle 1 dargestellt oder wobei β die β-Untereinheit des Choriogonadotropins und α eine Vertebraten-α-Untereinheit ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei das codierte Einzelkettenprotein eine Formel hat, wie in Tabelle 1 dargestellt oder wobei β die β-Untereinheit des Choriogonadotropins und α eine Vertebraten-α-Untereinheit ist.
Rekombinante Wirtszellen nach Anspruch 3, wobei das codierte Einzelkettenprotein eine Formel hat, wie in Tabelle 1 dargestellt oder wobei β die β-Untereinheit des Choriogonadotropins und α eine Vertebraten-α-Untereinheit ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Einzelkettenprotein eine Formel hat, wie in Tabelle 1 dargestellt oder wobei β die β-Untereinheit des Choriogonadotropins und α eine Vertebraten-α-Untereinheit ist.
Protein nach Anspruch 5, wobei das Einzelkettenprotein eine Formel hat, wie in Tabelle 1 dargestellt oder wobei β die β-Untereinheit des Choriogonadotropins und α eine Vertebraten-α-Untereinheit ist.
Verfahren nach Anspruch 4 ferner umfassend außerdem die Gewinnung des Proteins aus der Kultur.