DE69015175T2 - Glykoprotein-hormonrezeptor-moleküle. - Google Patents

Glykoprotein-hormonrezeptor-moleküle.

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft die Reinigung und das Klonieren der zellulären Rezeptormoleküle für das luteinisierende Hormon, Choriogonadotropin, das follikelstimulierende Hormon und das schilddrüsenstimulierende Hormon. Die Erfindung betrifft weiters die Verwendung der gereinigten Hormonrezeptormoleküle.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG I. Hormone des Hypophysevorderlappens
  • Der Hypophysevorderlappen Adenohypophyse) ist die Quelle zahlreicher wichtiger Glykoproteinhormone, umfassend das luteinisierende Hormon (Lutropin oder "LH"), Choriogonadotropin (oder "CG"), das follikelstimulierende Hormon (Follitropin oder "FSH") und das schilddrüsenstimulierende Hormon (Thyrotropin oder "TSH"). Ein Überblick über die Hormone des Hypophysevorderlappens findet sich bei Norman, A.W. et al (in: Hormones, Acad. Press, N.Y. (1987)). Die Hormone sind evolutionär hochgradig konserviert; die primären Aminosäuresequenzen der LH-, CG- und TSH- Hormone von Ratten und anderen Tieren sind jenen der Menschen äußerst ähnlich (Strickland, T.W. et al., in: Luteinizing Hormone Action and Receptors, Ascoli, M. (Hg), CRC Press, Boca Raton, FL (1985)).
  • Das luteinisierende Hormon, das follikelstimulierende Hormon, menschliches Choriogonadotropin (hCG) und das schilddrüsenstimulierende Hormon weisen viele gemeinsame Eigenschaften auf und gelten als Mitglieder einer Familie von Glykoproteinhormonen. Alle enthalten etwa 200-250 Aminosäurereste und bestehen aus einer gemeinsamen α-Untereinheit (mit einem Molekulargewicht von etwa 13-15 kDa) und einer unterscheidenden β-Untereinheit (mit einem Molekulargewicht von etwa 13-22 kDa). Die α-Untereinheiten von LH, FHS und TSH sind identisch; die α- Untereinheit von CG unterscheidet sich laut Berichten geringfügig von den anderen (Ganong, W.F. Review of Medical Physiology, 9. Ausgabe, Lange Medical Pub., Los Altos, CA (1979)).
  • Die Hormone vermitteln ihre biologischen Wirkungen durch Binden an Rezeptormoleküle, die aut aen Oberflächen von Zielzellen vorhanden sind. Die Wechselwirkung der α-Untereinheit mit den hormonspezifischen β-Untereinheiten der Hormone sind dafür verantwortlich, die Bindungsspezifität der Hormone zu verleihen. Die Hormone wirken durch das Aktivieren zellulärer Adenylatcyclase, um intrazelluläre cAMP-Werte zu erhöhen (de la Llose-Hermier et al., Acta Endocrinol., 118: 399-406 (1988)).
  • Das luteinisierende Hormon und das follikelstimulierende Hormon sind beide Gonadotropine (Ascoli, M. (Hg) Luteinizing Hormone Action and Receptors, CRC Press, Boca Raton, FL, (1985)). LH bindet sich an einen auf der Oberfläche von Leydig- oder Interstitialzellen exprimierten Rezeptor (Ascoli, M., in: The Receptors, (Conn, P.M. (Hg), Bd. 2, S. 368 (1985)). Bei Männern bewirkt die LH-Bindung, daß die Leydig-Zellen ihre Testosteronsynthese steigern. Bei Frauen bewirkt eine solche Bindung, daß die Granulose-, Theka-, Interstitial- und Lutealzellen die Konzentrationen von Androgenen, Östrogenen und Progestinen, insbesondere Progesteron, erhöhen.
  • Das follikelstimulierende Hormon reguliert die Entwicklung von Gameten. Bei Männern bindet sich FSH an einen auf der Oberfläche der Sertoli-Zellen vorhandenen Rezeptor und unterstützt den Entwicklungsprozeß, der zur Herstellung von reifen Spermatozoen führt. Bei Frauen bindet sich das Hormon an Rezeptoren auf der Oberfläche der Granulosezellen des Eierstocks. Man ist der Ansicht, daß es gemeinsam mit Östrogen und LH zusammenwirkt, um die Follikelentwicklung zu stimulieren. Bezüglich seiner Rolle in der Oozytenentwicklung wird FSH maximal zum Zeitpunkt des Eisprungs im weiblichen Fortpflanzungszyklus exprimiert. Aus diesem Grund kann man mithilfe eines Assays hinsichtlich FSH das Eintreten des Eisprungs ermitteln und vorhersagen. FSH bewirkt weiters eine Stimulierung der Expression von LH/CG-Rezeptoren durch Granulosezellen.
  • Choriogonadotropin ist ein Gonadotropin, das durch die trophoblastischen Zellen der Plazenta erzeugt wird. Es bewirkt eine Stimulierung des Wachstums und der Entwicklung des Corpus luteum im Eierstock durch Stimulierung der Herstellung von Progesteron. Choriogonadogropin spielt bei der Vorbereitung des Stoffwechsels der Mutter auf die Schwangerschaft eine Rolle. Die Verabreichung entweder von LH, FSH oder CG kann den Eisprung bei einer Frau induzieren. Die Hormone eignen sich für die Behandlung von Unfruchtbarkeit.
  • Die Hauptwirkungsweise von TSH besteht in der Stimulierung der Schilddrüsensekretion und des Schilddrüsenwachstums. TSH bindet sich an ein Rezeptormolekül, das auf der Oberfläche von Schilddrüsenzellen exprimiert wird. Monoklonale Antikörper wurden entwickelt, die sich an den TSH-Rezeptor binden können. Menschen, die an der Graves'schen Krankheit leiden, bilden Autoantikörper, die sich an das TSH-Rezeptormolekül binden können. Zum Unterschied von den monoklonalen anti-TSH-Rezeptorantikörpern ahmt das Binden durch die Autoantikörper TSH nach und wirkt daher als Stimulator der Schilddrüsenaktivität (Furmaniak, J. et al., Acta Endocrinol. Suppl) 281: 157-165 (1987)). Die klinischen Symptome der Graves'schen Krankheit sind durch Schilddrüsenüberfunktion gekennzeichnet.
    • II Rezeptoren der Glykoproteinhormone des Hypophysevorderlappens (einschließlich hCG)
  • Untersuchungen zeigten, daß das luteinisierende Hormon und Choriogonadotropin das gleiche zelluläre Rezeptormolekül besitzen (Ascoli, M. (Hg), Luteinizing Hormone Action and Receptors, CRC Press, Boca Raton, FL (1985)). Die Verwendung von chemischen und Photoaffinitäts-Vernetzungsmitteln ermöglichte es den Forschern, die Hormonbindungsstelle des Rezeptors zu untersuchen (Ji, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 7167 (1980); Rebois, R.V. et al., Proc. NAtl. Acad. Sci (USA) 78: 2086 (1981); Metsikko, M.K. et al., Biochem J. 208: 309 (1982)). Diese Untersuchungen konnten jedoch keine genauen Aufschlüsse über die Struktur des Rezeptormoleküls geben. Auf der Grundlage solcher Untersuchungen zogen mehrere Forschergruppen den Schluß, daß der Rezeptor ein einzelnes Polypeptid von etwa 70-105 kDa ist (Ascoli, M. et al., J. Biol. Chem. 261: 3807 (1986); Rebois, R.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 2086 (1981); Kellokumpu, S. et al., Endocrinol. 116: 707 (1985)). Ähnliche Studien brachten jedoch andere Forscher zum Schluß, daß der Rezeptor aus mehreren Polypeptiduntereinheiten besteht (Ji, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 7167 (1980): Ji, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 5465 (1981); Hwang, J. et al., J. Bio. Chem. 259: 1978 (1984); Hwang, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 81: 4667 (1984)). Diese unterschiedlichen Schlußfolgerungen der Forscher konnten bislang nicht miteinander in Einklang gebracht werden.
  • Über die Reinigung des LH/CG-Rezeptors wurde von mehreren Forschergruppen berichtet (Dufau, M.L. et al., J. Biol. Chem. 250: 4822 (1975); Kusuda, S. et al., J. Biol. Chem. 261: 6161 (1986); Bruch, R.C. et al., J. Biol. Chem. 261: 9450 (1986); Minegishi, T. et al., J. Biol. Chem. 262: 17138 (1987); Wimalasena, J. et al., J.Biol. Chem. 260: 10689 (1985); Keinanan, K.P. et al., J. Biol. Chem. 262: 7920 (1987); Dattatreyamurty, B. et al., J. Biol. Chem. 258: 3140 (1983)). Die angeführten Eigenschaften des gereinigten Proteins sind jedoch so unterschiedlich, daß man bezüglich der Beschaffenheit des LH/RH-Rezeptors oder der Anzahl der enthaltenen Untereinheiten keine Schlüsse ziehen kann.
  • Der FSH-Rezeptor wurde ebenfalls nicht gut charakterisiert. Unter Verwendung von Photoaffinitätsverfahren zogen Forscher den Schluß, daß der FSH-Rezeptor aus drei Untereinheiten betseht (Shih, J. et al., J. Biol. Chem. 260: 12822 (1985); Shih, J. et al., J. Biol. Chem. 260: 12828 (1985); Shih, J. et al., J. Biol. Chem. 260: 14020 (1985); Smith, R.A. et al., J. Biol. Chem. 260: 14297 (1985); Smith, R.A. et al., J, Biol. Chem. 260: 14297 (1985)). Der TSH-Rezeptor ist laut Berichten ein Protein von etwa 300 kDa, das gespalten wird, um zumindest zwei Proteine von 70 kDa zu bilden. Die Proteine von 70 kDa können selbst gespalten werden, um ein Protein von 50 kDa und eines von 20 kDa zu bilden (Chan, J. et al., Acta Endocrinol. (Suppl.) 281: 166 (1987); Smith, R.A. et al., Endocrinol. Rev. 9: 88 (1988)).
  • Zusammenfassend stellte sich heraus, daß die Glykoproteinhormone des Hypophysevorderlappens sowie das durch die Plazenta gebildete Choriogonadotropin ihre biologischen Wirkungen über eine Wechselwirkung mit einem zellulären Rezeptormolekül vermitteln, das an der Oberfläche der Zielzellen vorhanden ist. Trotz intensiver Bemühungen konnte die Beschaffenheit und Struktur dieser Rezeptormoleküle noch nicht geklärt werden.
  • Die Hormonrezeptormoleküle können sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Zwecke verwendet werden. Die Rezeptormoleküle können auch zur Entwicklung synthetischer Hormone oder Hormonantagonisten verwendet werden. Daher wäre die Fähigkeit zur Herstellung von gereinigten Hormonrezeptormolekülen äußerst wünschenswert.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft die Reinigung und das Klonieren von Rezeptoren für das luteinisierende Hormon, Choriogonadotropin, das follikelstimulierende Hormon und das schilddrüsenstimulierende Hormon. Zusätzlich betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Moleküle in der Diagnose und Therapie von Zuständen beim Menschen.
  • Die Erfindung betrifft im Detail eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Hormonrezeptormoleküls enthält, worin das Hormonrezeptromolekül aus der Gruppe bestehend aus dem LH/CG-Rezeptor, dem FSH-Rezeptor und dem TSH-Rezeptor ausgewählt ist.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des LH/CG-Rezeptors bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fruchtbarkeit, Brustkrebs, Prostatakrebs, gutartiger Prostatahypertrophie, vasomotorischer Instabilität, Osteoporose oder polyzystischer Eierstockerkrankung.
  • Die Erfindung betrifft weiters die Verwendung des TSH-Hormonrezeptormoleküls bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Graves'schen Krankheit, von gutartiger Prostatahypertrophie, Schilddrüsenunterfunktion oder Schilddrüsenkrebs.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig.1 zeigt die cDNA und vorhergesagte Aminosäuresequenz des Ratten-Eierstock- LH/CG-R. In der Figur sind chemisch bestimmte Peptidsequenzen durch Balken über korrespondierenden Sequenzen angezeigt, wobei Reste, die sich von den vorhergesagten unterscheiden, durch weiße Balken gekennzeichnet sind. Die Aminosäurenumerierung beginnt bei der für den reifen intakten Rezeptor gefundenen N-terminalen Sequenz, wobei negative Zahlen die kodierte Signalsequenz angeben. Vermeintliche extrazelluläre N-verbundene Glykosylierungsstellen sind durch umgekehrte Dreiecke angezeichnet, und die vorgeschlagenen membranüberspannenden hydrophoben Sequenzen sind eingerahmt. Reste mit Strichen darüber zeigen den Ort der Ähnlichkeit mit Sojabohnen-Lectin (L.O. Vodkin et al., Cell 34: 1023 (1983); D.J. Schnell et al., J. Biol. Chem. 262: 7220 (1987) Diflorus).
  • Fig.2 zeigt die Ausrichtung der transmembranen Regionen von LH/CG-R. Die transmembranen Regionen von ausgewählten G-Protein-gekuppelten Rezeptoren wurden durch Fastp- (D. J. Lipman et al., Science 227: 1435 (1985)) und hom.global(W.M. Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1382 (1983)) Computerprogramme ausgerichtet, wobei man eine händische Endausrichtung vornahm, um die Positionsidentität mit minimalen Einfügungen zu maximieren. Die Zahlen stellen die Resteanzahl dar; die Zahlen in Klammer zeigen die Anzanl der in der 5-6- Schleifenregion gelöschten Reste. Die eingerahmten Regionen zeigen Übereinstimmungen von 3 oder mehr Resten an jeder Position. Numerierte Balken zeigen die Positionen vermeintlicher Transmembran- (TM) Regionen. RHO: Rinder- Rhodopsin; SKR: Substanz K-Rezeptor; β-2AR: β-2 adrenerger Rezeptor; 5HT-2R: 5HT-2 (Serotonin)-Rezeptor (Rhodopsin: J. Nathans et al., Cell 34: 807 (1983); SKR: Y. Masu et al., Nature 329: 836-838 (1987); β-2AR: RAF Dixon et al., Nature, 321: 75 (1986); P.R. Schofield et al., Nucl. Acids Res. 15: 3636 (1987); 5HT-2: D.B. Pritchett et al., EMBO J. 7: 4135 (1988)).
  • Fig.3 zeigt die Struktur des Wiederholungsmotivs in der extrazellulären Domäne des LH/CG-R. Feld A: Ausrichtung der 14 imperfekten Wiederholungsstrukturen. Identische oder konservierte Reste unter den Segmenten I-XIV wurden eingeranmt. Striche zeigen das Setzen von Lücken zur Optimierung der Periodizität an. Feld B: Konsenssequenzen für die Leucin-reichen Wiederholungsmotive, die im Leucin-reichen Alpha 2- Glykoprotein von menschlichem Serum (Toll), der Alphakette vom menschlichem Blutplättchen-Glykoprotein Ib (GPIB), dem Toll-Gen von Dosophila (Toll) und der Hefe- Adenylatcyclase (ACY) beobachtet werden (N.Takanashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1906 (1985) (LGR); J. Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5615 (1987) GP Ib); C.Hashimoto et al., Cell 52: 269 (1988) (Toll); T. Kataoka et al., Cell 43: 493 (1985) (Adenylatcyclase, Hefe); T. Krusius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7683 1986) (PG40). "a" zeigt eine von drei aliphatischen Aminosäuren, Valin, Leucin oder Isoleucin an; "x" kennzeichnet eine Aminosäure.
  • Fig.4 zeigt die funktionale Expression der LH/CG-R-cDNA. Die spezifische ¹²&sup5;I-CG- Bindung (A) und CG-stimulierte cAMP-Anhäufung (B) in cos-Zellen, die transient mit dem Expressionsvektor pCLHR (geschlossene Kreise) oder ohne diesen (offene Kreise) transfiziert sind.
  • Fig.5 zeigt eine Northern-Analyse der Hybridisierung von LH/CG-R-cDNA in unterschiedlichen Geweben. Jede Bahn enthält 10 ug Gesamt-RNA. Die Zahlen links zeigen kb, die durch DNA-Größenmarker ermittelt werden. Die gezeigten Proben stammen aus den Eierstöcken von scheinträchtigen Ratten (Bahn a) und erwachsenen Ratteneierstöcken (Bahn b), Hoden (Bahn c), Lunge (Bahn d), Niere (Bahn e), und Leber (Bahn f). Die Felder A bzw. B zeigen das 6-stündige Ausgesetztsein oder das Ausgesetztsein über Nacht des gleichen Blots.
  • Figuren 6a und 6b zeigen die cDNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Ratten-Hoden-FSH-R. Die Aminosäurenumerierung beginnt bei der N-terminalen Sequenz für das vorhergesagte reife Rezeptorprotein, wobei negative Zahlen die Signalsequenz kennzeichnen.
  • Fig.7 zeigt einen strukturellen Vergleich zwischen den Gonadotropinrezeptoren. A) Sequenzähnlichkeiten von Rezeptordomänen. Die die extrazelluläre Domäne darstellende N-terminale Hälfte ist in 14 imperfekt duplizierte Einheiten von jeweils etwa 20 Resten unterteilt, und die C-terminale Hälfte zeigt die 7 transmembranen Segmente. Potentielle Glykosylierungsstellen sind durch ausgefüllte Quadrate gekennzeichnet. Verschiedene Grauabstufungen zeigen den Grad der Sequenzenkonservierung für verschiedene Rezeptorbereiche. B) Sequenzvergleich von Rezeptoren im Ein-Buchstaben-Code. Die FSH-R-Sequenz ist als die untere Sequenz dargestellt, und Unterschiede sowie Substitutionen in LH/CG-R sind oben dargelegt. Punkte kennzeichnen Einfügungen zum Zwecke optimaler Ausrichtung. Die extrazellulären Wiederholungen sind numeriert und durch vertikale Linien abgegrenzt. Konservierte Cysteinreste in der extrazellulären Domäne werden durch ausgefüllte Ovale gekennzeichnet. Transmembranregionen TMI-TMVII sind eingerahmt. Kleine Pfeile zeigen konservierte Cysteinreste in den zweiten und dritten extrazellulären Schleifen des Rezeptors an.
  • Fig.8 zeigt die Ausrichtung von Wiederholungsmotiven in der extrazellulären Domäne von FHS-R, wobei das unterschiedliche Ausmaß der Sequenzkonservierung zwischen den Wiederholungen veranschaulicht wird. N-verbundene Glykosylierungsstellen sind durch schraffierte Kreise dargestellt. Die Ausrichtung und Numerierung entspricht jener von LH/CG-R.
  • Fig.9 zeigt die funktionelle Expression des FSH-R. FSH-stimulierte cAMP-Anhäufung in transient mit Expressionsplasmid pCFSH-R transfizierten 293-Zellen. Intrazelluläre c-AMP wird als Funktion der Hormonkonzentration gemessen. Jeder Datenpunkt stellt den mittleren ±-Bereich von Doppelbestimmungen dar.
    • BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN I. LUTEINISIERENDES HORMON, FOLLIKELSTIMULIERENDES HORMON UND SCHILDDRÜSENSTIMULIERENDES HORMON
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen des biologischen Rezeptors für das luteinisierende Hormon, Choriogonadotropin, das schilddrüsenstimulierende Hormon und das follikelstimulierende Hormon.
  • Wie bereits erwähnt sind das luteinisierende Hormon (LH) und menschliches Choriogonadotropin (CG) Mitglieder einer evolutionär konservierten Familie von Glykoproteinhormonen, die auch das schilddrüsenstimulierende Hormon (TSH) und das follikelstimulierende Hormon (FSH) umfaßt. Alle vier sind heterodimere Glykoproteine von 28-38 kDa, die jeweils aus einer gemeinsamen α-Untereinheit kombiniert mit unterscheidenden β-Untereinheiten bestehen, die Rezeptorspezifität verleihen (Pierce et al., Annual Rev. Biochem. 50: 466 (1981)). Die β-Untereinheiten von LH und CG sind eng sequenzenverwandt, und diese zwei Hormone binden sich an den gleichen Rezeptor und ziehen identische biologische Reaktionen nach sich (Pierce et al, oben). Die akute Reaktion der Zielzellen auf das Binden von LH und CG ist eine Zunahme der Adenylatcyclase-Aktivität, die durch intrazelluläre, membranassoziierte G-Proteine vermittelt wird. Die resultierenden erhöhten cAMP-Werte führen schließlich zu einer Steigerung der Steroidsynthese und Sekretion (M. Hunzicker-Dunn et al., in: Luteinizing Hormone Action and Receptors, M. Ascoli (Hg.), CRC Press, Boca Raton, 1985, S. 57- 134). Die Kohlenhydratgruppen dieser Hormone scheinen bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle zu spielen (Sairam et al., J. Biol. Chem. 264: 2409 (1989)). Die Kohlenhydratgruppen der Hormone steigern auch ihre Wirksamkeit durch Senken der Rate, bei der die Hormone über den Stoffwechsel ausgeschieden werden.
  • In den letzten Jahren wurde eine Familie von G-Protein-gekuppelten Rezeptoren identifiziert, deren Mitglieder durch das gemeinsame Strukturmerkmal von 7 transmembranen Domänen charakterisiert sind (durch R.J. Lefkowitz et al., J. Biol. Chem. 263: 4993 (1988) im Überblick besprochen). Man erwartet, daß der Rezeptor für diese Hormone ein Mitglied dieser Familie ist.
  • Der hohe Ähnlichkeitsgrad zwischen den Bindungsdomänen von Tier-LH-, FSH- und TSH-Hormonen im Vergleich zu ihren menschlichen Gegenstücken untermauert die Schlußfolgerung, daß die zellulären Rezeptormoleküle für diese Hormone fähig sind, sich mit dem menschlichen Hormon zu binden. Somit kann man solche tierischen Rezeptormoleküle in gleicher Weise wie menschliche Rezeptormoleküle verwenden.
  • Der luteinisierende Hormon/der Choriogonadotropin-Hormonrezeptor (LH/CG-R) ist auf Hoden-Leydig, Zellen und auf Eierstock-Theka-, Granulose-, Luteal- und Interstitialzellen vorhanden. Der LH/CG-Rezeptor spielt in der Fortpflanzungsphysiologie eine entscheidende Rolle. Beim Mann und bei der nichtschwangeren Frau ist der LH/CG-R nur dem luteinisierenden Hormon (LH) ausgesetzt, das durch den Hypophysevorderlappen hergestellt und sekretiert wird. Während der Schwangerschaft ist jedoch der Eierstock-LH/CG-R auch dem durch die Plazenta erzeugten menschlichen Choriogonadotropin (CG) ausgesetzt.
  • Fortschritte bei einer Klärung der Struktur des LH/CG-R wurden durch die geringe Verfügbarkeit dieses Rezeptors und seine Proteolyseanfälligkeit beeinträchtigt (M.Ascoli et al., Endocrine Rev. 10: 27 (1989)). Der Ratten-LH/CG-Rezeptor wurde kürzlich aus Eierstöcken scheinträchtiger Ratten gereinigt (N. Rosemblit et al., Endocrinology 123: 2284 (1988)) und wurde laut Berichten aus Schweinehoden gereinigt (Jallal, B. et al., Reprod. Nutr. Dev. 28: 1177 (1988)).
  • Es stellte sich heraus, daß der gereinigte Ratten-LH/CG-Rezeptor ein einzelnes Glykoprotein mit einer Molekülmasse von 93 kDa ist (N. Rosemblit et al., Endocrinology 123: 2284 (1988); I.-C.Kim et al., J. Biol. Chem. 261: 3807 (1986); M. Ascoli et al., Endocrine Rev. 10: 27 (1989)). Andere Berichte schlugen jedoch vor, daß der LH/CG-R aus mehreren Untereinheiten besteht (in M. Ascoli et al., Endocrine Rev. 10: 27 (1989) im Überblick besprochen).
    • II. DIE REINIGUNG VON HORMONREZEPTORMOLEKÜLEN
  • Die unten angeführten Verfahren und Beispiele sind hinsichtlich der Isolierung und cDNA-Klonierung des LH/CG-Rezeptors "LH/CG-Rezeptors" beschrieben. Man beachte jedoch, daß eine solche Beschreibung angepaßt werden kann, ohne von den Lehren der vorliegenden Erfindung abzuweichen, um die Isolierung und das Klonieren nicht nur des LH/CG-Rezeptors, sondern auch des FSH- und TSH-Rezeptors zu ermöglichen.
  • Die erfindungsgemäßen Hormonrezeptoren können durch Routineanpassung jedes beliebigen Verfahrens gereinigt werden. Es ist vorzuziehen, das Verfahren nach Rosemblit, N. et al. (Endocrinology, 123: 2284-2289 (1988)) zu verwenden. Gemäß diesem Verfahren werden die Rezeptoren durch eine Kombination von Affinitätschromatographie, Lectinbindung und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert.
  • Zur Erleichterung der Gewinnung verwendet man eine angereicherte zelluläre Rezeptorquelle. Eine bevorzugte Quelle eines LH/CG-Rezeptors sind Ratten- Lutealzellen. Bevorzugte Quellen des FSH-Rezeptors sind Sertoli-Zellen. Eine bevorzugte Quelle des TSH-Rezeptors ist Schilddrüsengewebe.
  • Zum Erhalt von Gewebeproben wurden Tiere euthanisiert, oder es wurde das erwünschte Gewebe auf chirurgischem Wege gewonnen. Nach der Entfernung des rezeptorhältigen Gewebes aus dem Tier wird das Gewebe in einen Puffer gelegt, der 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH-Wert 7,4 enthält ("Puffer A"). Das Gewebe wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 4ºC gehalten. Da die Proteine äußerst proteolyseanfällig sind, wird der verwendete Puffer vorzugsweise eingestellt, 5 mM N- Äthylmaleimid, 10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 mM ETDA zu enthalten, um die Proteolyse zu hemmen (Kellokumpu, S. et al. Endocrinol. 116: 707 (1985)).
  • Gewebeproben weroen in 10 Volumina von Puffer A mittels eines Gewebeaufbrechers dispergiert und homogenisiert (vorzugsweise mit einem motorbetriebenen Motorpistill). Die dispergierten Zellpräparate werden zentrifugiert (beispielsweise bei 20.000 x g über einen Zeitraum von 30 min) und erneut in 5 Volumina Puffer A suspendiert, der zusätzliche 20% Glyzerin ("Puffer B") und 1% NP-40 enthält (welche Agenzien die Bindungsaktivität der Rezeptoren stabilisieren können). Die Präparate werden dann einer Hochgeschwindigkeitszentrifugierung ausgesetzt (10.000 x g über einen Zeitraum einer Stunde). Die Rezeptoren findet man im Überstand einer derartigen Zentrifugierung, und sie können bei -70ºC gelagert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Rezeptormoleküle durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines gereinigten Hormons als Ligand weiter gereinigt werden. Präparate eines hochgradig gereinigten Hormons sind im Handel erhältlich. Ein Hormon eines solchen Präparats kann an ein (vorzugsweise) immobilisiertes Harz wie Affi-Gel (Bio-Rad, Richmond, CA) o.dgl. mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren gekuppelt werden. Das Harz wird im oben beschriebenen Puffer äquilibriert (vorzugsweise ergänzt, um 0,5% NP-40 und 20% Glyzerin zu enthalten), und das Präparat der Rezeptormoleküle wird in Kontakt damit gebracht. Nach dem hintereinander erfolgenden Waschen des Harzes mit geeigneten Puffern (0,5% NP-40 enthaltender Puffer B; 0,5 M NaCl und 0,1% NP-40 enthaltender Puffer B; 0,1 % Deoxycholat enthaltender Puffer B; 0,1% NP-40 enthaltender Puffer B; und eine Lösung aus 0,1% NP-20, 20% Glyzerin und 50 mM Glyzin, pH-Wert 3) wird das Rezeptormolekül eluiert, vorzugsweise unter Verwendung eines Puffers von 50 mM Glyzin, pH-Wert 3, 0,1% NP-40, 20% Glyzerin und 100 mM NaCl.
  • Um das eluierte Material auf Rezeptormoleküle zu analysieren, wird ein Probenaliquot in Gegenwart eines Überschusses markienter Hormonmoleküle inkubiert. Radioaktives Iod ist eine bevorzugte Markierung. Ein bevorzugtes Verfahren zum Analysieren auf Rezeptor wird durch Roche, P.C. et al., Endocrinol., 117: 790 (1985) beschrieben. Nach dem Assay wird vorzugsweise Filtration durchgeführt, z.B. mittels des Verfahrens nach Buettner, K. et al., J. Biol. Chem 259: 15078 (1984). Der pH-Wert der Probenfraktionen, die das Rezeptormolekül enthalten, wird vorzugsweise mit Tris neutralisiert.
  • Um die Rezeptormoleküle weiter zu reinigen, eignet sich die Weizenkeimagglutinin- Reinigung. Dies kann geeigneterweise durch Inkubation gepoolter, rezeptorhältiger, affinitätsgereinigter Fraktionen in Gegenwart von Weizenkeimagglutinin-Agarose erfolgen (Vektor Laboratories, Burlington, CA). Nach dem Ermöglichen des Adsorptionseintritts kann das Gel zur Entfernung von Unreinheiten gewaschen werden. Der Rezeotor kann dann aus dem Gel eluiert (beispielsweise mittels 0,32 M N- Acetylglucosamin in 0,1% NP-40 enthaltendem Puffer B oder einem anderen Puffer) und in der oben beschriebenen Weise bestimmt werden.
  • Die weitere Reinigung kann man durch die Verwendung von entweder analytischer oder präparativer Gelelektrophorese erreichen. Es eignet sich jedes beliebige Elektrophoreseverfahren wie jenes nach Kim, I.-C. et al. (J. Biol. Chem. 262: 470 (1987) oder Laemmli, U.K. (Nature 227: 680 (1970)). Die Visualisierung des der Elektrophorese unterzogenen Materials kann durch Silberfärbung (Wray, W. et al., Anal. Biochem. 118: 197 (1981)) oder durch andere Mittel erreicht werden. Bei der präparativen Gelelektrophorese wird das Material vorzugsweise in der durch Holloway, P.W. (Anal. Biochem. 53: 303 (1973)) beschriebenen Weise vor der Elektrophorese konzentriert.
  • Das Rezeptorprotein kann durch Filtration/Konzentration beispielsweise unter Verwendung von Centricon-Filterkonzentratoren weiter gereinigt werden. Die Probe kann dann durch Acetonausfällen und anschließende Gelelektrophorese weiter gereinigt werden. Die aus einer solchen Elektrophorese erhaltenen Bänder können elektroeluiert und dazu verwendet werden, die Aminosäuresequenz des Aminoterminus des Proteins zu bestimmen.
  • Alternativ dazu kann das elektroeluierte Rezeptorprotein unter Verwendung von Methanol/Chloroform weiter ausgefällt und mit einer Endopeptidase digeriert werden, um einen Satz an Peptidfragmenten zu erhalten. Diese Fragmente können dann zur Ermittlung ihrer Aminosäuresequenz sequenziert werden.
  • Alternativ dazu können die elektroeluierten Rezeptormoleküle mit Aceton wiederausgefällt, in Puffer (z.B. Tris, pH-Wert 8,5) erneut suspendiert und mit Ameisensäure/CNBr gespalten werden. Die Spaltungsprodukte können lyophilisiert, auf einem Tricingel aufgelöst und sequenziert werden. Die Identifizierung eines Präparats, das ein im wesentlichen gereinigtes Hormonrezeptormolekül enthält (entweder den Rezeptor für das luteinisierende Hormon, Choriogonadotropin, das follikelstimulierende Hormon oder das schilddrüsenstimulierende Hormon), ermöglicht die Bestimmung der Aminosäuresequenz des Rezeptormoleküls und weiters die Herstellung des Moleküls durch die Anwendung rekombinanter DNA-Verfahren.
  • Zur Ermittlung der Aminosäuresequenz der Hormonrezeptormoleküle werden die Rezeptormoleküle in den im wesentlichen gereinigten Fraktionen durch jedes beliebige Verfahren gewonnen. Am bevorzugten erfolgt eine solche Gewinnung durch Lectin- und Hormonaffinitätschromatographie, wie sie allgemein durch N. Rosemblit et al. (Endocrinologa 123: 2284 (1988)) beschrieben ist, und durch anschließende Konzentration der Probe unter Verwendung von Centricon-30 (Amicon) und Auflösung durch Gelelektrophorese. Die gewonnenen Moleküle können dann vorzugsweise mittels eines automatischen Sequenzierers sequenziert werden, wodurch man die Aminosäuresequenz des Moleküls bestimmen kann. Obwohl jedes beliebige Mittel zur Bestimmung der Sequenz der Hormonrezeptormoleküle herangezogen werden kann, ist es vorzuziehen, die Sequenz mittels der Mikrosequenzierverfahren nach Rodriguez zu bestimmen (J. Chromatog. 350: 217 1985)). Alternativ dazu kann das Hormonrezeotormolekül durch Elektrophorese gereinigt und nach der Elektroeluierung durch Cyanogenbromid oder Lysyl-C-Endopepeptidase gespalten werden. Die Fragmente können dann aufgelöst werden, vorzugsweise durch HPLC oder durch Tricingels (H. Shägger et al. Anal. Biochem. 166: 368 (1987)) und anschließendes Elektroblotting und Gasphasenmikrosequenzieren. Dann kann man die Sequenz des gesamten Moleküls bestimmen.
    • III. KLONIEREN VON HORMONREZEPTOR-MOLEKÜLEN
  • Obwohl die Aufschlüsselung der gesamten Sequenz eines Hormonrezeptormoleküls die Synthese des Moleküls ermöglicht (beispielsweise durch Merrifield-Synthese, usw.), ist es vorzuziehen, das Rezeptormolekül durch rekombinante DNA-Technologie aus einer Gensequenz zu gewinnen, die für das Rezeptormolekül kodiert.
  • Zur Erreichung dieses Ziels kann man den genetischen Code verwenden (Watson, J.D. in: Molecular Biology of the Gene, 3. Ausgabe, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S, 356-357), um anhand der vollständigen Aminosäuresequenz eines Hormonrezeptormoleküls die Sequenz eines DNA-Moleküls vorherzusagen, das für das Molekül kodieren und es exprimieren kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dient die Klärung der Aminosäuresequenz eines Peptidfragments des Hormonrezeptormoleküls dazu, eine Gensequenz zu isolieren, die für das gesamte Rezeptorprotein kodieren kann. In dieser Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz des Rezeptormoleküls durch eine Analyse der DNA oder bevorzugter der cDNA-Sequenz jenes Gens bestimmt, das für das Molekül kodiert (die cDNA ist vorzuziehen, da sie keine intervenierenden Sequenzen oder "Intronen" besitzt, die in einer eukaryotischen Genomsequenz vorhanden sein können und die in prokaroytotischen Wirten nicht korrekt exprimiert werden können. Zur Erhaltung dieser Nukleinsäuresequenzen wird eine Quelle, welche das Hormonrezeptormolekül oder die cDNA enthält, mit Oligonukleotidsonden gescreent, die für Fragmente des Hormonrezeptormoleküls kodieren.
  • Zur Bildung der Oligonukleotidsonden wird ein im wesentlichen gereinigtes Hormonrezeptormolekül gewonnen und z.B. mit Cyanogenbromid oder mit Proteasen wie Papain, Chymotrypsin, Trypsin, Lysyl-C-Endopeptidase, usw. fragmentiert (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257: 9751-9758 (1982); Liu, C., et al. int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215 (1983)). Die resultierenden Peptide werden getrennt, vorzugsweise durch HPLC oder durch Auflösung auf Tricingels und Elektroblotting auf PVDF-Membranen und einer Aminosäuresequenzierung ausgesetzt. Dafür werden die Peptide vorzugsweise durch automatische Sequenzierer analysiert.
  • Eines oder mehrere geeignete Peptidfragmente wurden sequenziert und die für sie kodierenden DNA-Sequenzen untersucht. Wenn ein Peptid mehr als 6 Aminosäuren lang ist, reicht diese Sequenzinformation im allgemeinen aus, um es zu ermöglichen, eine Gensequenz zu klonieren, z.B. jene, die für die erfindungsgemäßen Hormonrezeptormoleküle kodieren. Da jedoch der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon zur Kodierung einer bestimmten Aminosäure verwendet werden (Watson, J.D. in: Molecular Biology of the Gene, 3. Ausgabe, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356-357). Somit es es wahrscheinlich, daß mehr als eine Oligonukleotidsequenz identifiziert werden kann, die für ein bestimmtes Hormonrezeptormolekül-Peptidfragment kodieren könnte.
  • Die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Oligonukleotid die eigentliche für das Hormonrezeptor-Molekülfragment kodierende Sequenz darstellt, kann geschätzt werden, indem man die abnormalen Basenpaarbeziehungen und die Häufigkeit betrachtet, mit der ein bestimmter Codon tatsächlich in eukaryotischen Zellen verwendet wird (um für eine bestimmte Aminosäure zu kodieren). Solche "Codonverwendungsregeln" sind durch Lathe, R., et al., J. Molec.Biol. 183: 1-12 (1985) geoffenbart. Unter Verwendung der "Codonverwendungsregeln" von Lathe wird ein einzelnes Oligonukleotid oder eine Gruppe von Oligonukleotiden identifiziert und synthetisiert, die eine theoretische "wahrscheinlichste" Nukleotidsequenz enthalten, die für die Peptidsequenzen des Rezeptormolekülfragments kodieren.
  • Wie bereits erwähnt macht es die degenerative Beschaffenheit des genetischen Codes relativ wahrscheinlich, daß eine Gruppe mehrerer Oligonukleotide synthetisiert werden kann, dessen Mitglieder jeweils fähig sind, an ein bestimmtes Peptidfragment zu hybridisieren. Während alle Mitglieder dieser Gruppe Oligonukleotide enthalten, die für das Peptidfragment kodieren können, ist es wichtig, daß nur ein Mitglied der Gruppe die Nukleotidsequenz enthält, die zur Nukleotidsequenz des Gens identisch ist. Da dieses Mitglied innerhalb der Gruppe vorhanden ist und selbst in Gegenwart der anderen Mitglieder der Gruppe an DNA hybridisieren kann, ist es möglich, eine unfraktionierte Gruppe von Oligonukleotiden in der gleichen Weise zu verwenden wie ein einzelnes Oligonukleotid zum Klonieren des für das Peptid kodierenden Gens.
  • Das Oligonukleotid oder die Gruppe von Oligonukleotiden, welche die theoretische "wahrscheinlichste" Sequenz enthält, die für das Hormonrezeptormolekül- Fragmentpeptid kodiert, wird dazu verwendet, die Sequenz eines komplementären Oligonukleotids oder einer Gruppe von Oligonukleotiden zu identifizieren, die an die "wahrscheinlichste" Sequenz oder Sequenzengruppe hybridisieren kann. Man kann ein Oligonukleotid, das eine solche Komplementärsequenz enthält, als Sonde verwenden, um eine Gensequenz zu identifizieren und zu isolieren, die für das Rezeptormolekül kodiert (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
  • Die DNA-Sonde kann mit einer nachweisbaren Gruppe markiert werden. Eine solche nachweisbare Gruppe kann jedes Material mit einer nachsweisbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche Materialien wurden auf dem Gebiet der Immunsassays in hohem Maße weiterentwickelt, und im allgemeinen kann jede Markierung, die sich für solche Verfahren eignet, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Besonders nützlich sind enzymatisch aktive Gruppen, z.B. Enzyme (siehe Clin. Chem. 22: 1243 1976)); Enzymsubstrate (siehe GB-PS 1.548.741); Coenzyme (siehe US PSen 4.320.797 und 4.238.5650; Enzyminhibitoren (siehe US PS 4.134.792); Fluoreszenzmittel (sieh Clin. Chem. 25: 353 (1979)); Chromophore; Lumineszenzmittel (z.B. Chemieluminszenzmittel und Biolumineszenzmittel (siehe Clin. Chem. 25: 512 1979))); spezifisch bindungsfähige Liganden; proximale zusammenwirkende Paare; und Radioisotope wie ³H, ³&sup5;S, ³²P, ¹²&sup5;I und ¹&sup4;C. Solche Markierungen und Markierungspaare werden auf der Grundlage ihrer eigenen physikalischen Eigenschaften (Fluoreszenzmittel, Chromophore und Radioisotope) oder ihrer reaktiven oder Bindungseigenschaften (z.B. Enzyme, Substrate, Coenzyme und Inhibitoren) nachgewiesen. Beispielsweise kann eine Cofaktor-markierte Sonde durch das Hinzufügen des Enzyms, für welches die Markierung ein Cofaktor ist, und eines Substrats für das Enzym nachgewiesen werden. Man kann z.B. ein Enzym verwenden, das auf ein Substrat einwirkt, um ein Produkt mit meßbarer physikalischer Eigenschaft zu erzeugen. Beispiele dvon sind unter anderem Beta-Glactosidase, alkalische Phosphatase und Peroxidase.
  • Ein geeignetes Oligonukleotid oder Gruppe von Oligonukleotiden, das bzw. die fähig ist, für ein Fragment der Gensequenz zu kodieren, die für das Hormonrezeptormolekül kodiert (oder die zu einem solchen Oligonukleotid oder Gruppe von Oligonukleotiden komplementär ist) wird (unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahrensweise) identifiziert, synthetisiert und mit auf dem Gebiet bekannten Mitteln gegen ein DNA- oder noch bevorzugter ein cDNA-Präparat hybridisiert, das aus Zellen abgeleitet ist, die das Rezeptormolekül exprimieren können.
  • Einstrangige Oligonukleotidmoleküle, die zu den "wahrscheinlichsten" Hormonrezeptormolekül-Peptidkodierungssequenzen komplementär sind, können mittels Verfahren synthetisiert werden, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist. (Belagaje R., et al., J. Biol. Chem. 254: 5765-5780 (1979); Maniatis T., et al., in: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression Nierlich, D.P., et al.. Hg., Acad. Press. NY (1976); Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21: 101-141 1978); Khorana, R.G., Science 203: 614-625(1979). Zusätzlich kann man die DNA- Synthese durch die Verwendung automatisierter Synthesierer erreichen. Verfahren zur Nukleinsäurehybridisierung sind durch Maniatis, T. et al. (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)) und durch Haymes, B.D., et al., (in: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) geoffenbart. Eine DNA-Sequenz, die für ein Hormonrezeptormolekül kodiert, kann aus einer Vielzahl an Quellen gewonnen werden. mRNA, die für jedes dieser Rezeptormoleküle kodiert, kann aus den Geweben jeder Spezies gewonnen werden, die das Rezeptormolekül bildet, und mit dem Northern Blot-Verfahren (Alwine et al., Method Enzymol. 68: 220-242 (1979)) und markierten Oligonukleotidsonden identifiziert werden. Die mRNA solcher Zellen kann dann durch Verfahren zu cDNA umgewandelt werden, mit denen Fachleute auf dem Gebiet vertraut sind. Alternativ dazu kann man genomische DNA isolieren und verwenden. Die Quelle der verwendeten DNA oder cDNA wird vorzugsweise bezüglich der Gensequenz angereichert, die für das Rezeptormolekül kodiert. Eine solche Anreicherung kann am leichtesten durch cDNA erreicht werden, die man durch Extrahieren von RNA aus jenen Zellen erhält, die hohe Mengen des Rezeptormoleküls erzeugen. Für LH und CG sind solche Zellen Lutealzellen. Für TSH sind solche Zellen Schilddrüsenzellen. Für FSH ist die bevorzugte Zellquelle Sertoli-Zellen oder unreife Granulosazellen.
  • Jedes einer Vielzahl an Verfahren kann angewendet werden, um eine Gensequenz zu klonieren, die für die erfindungsgemäßen Hormonrezeptormoleküle kodiert. Ein solches Verfahren umfaßt das Analysieren einer Shuttlevektor-Sammlung von cDNA-Einsätzen (stammen aus einer Zelle, die das erwünschte Rezeptormolekül exprimiert) hinsichtlich der Gegenwart eines Einsatzes, der eine Gensequenz enthält, die für das Rezeptormolekül kodieren kann. Eine solche Analyse kann durch Transfizieren der Zellen mit dem Vektor und Überprüfen hinsichtlich Rezeptormolekülexpression erfolgen.
  • Zum Identifizieren und Klonieren der Gensequenz, die für jedes der erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle kodieren kann, wird eine DNA- oder bevorzugter eine cDNA- Sammlung auf ihre Fähigkeit gescreent, mit den oben beschriebenen Oligonukleotidsonden zu hybridisieren. Geeignete DNA-Präparate (z.B. genomische DNA) werden enzymatiscn gespalten oder wahllos geschert und in rekombinante Vektoren ligiert. Die Fähigkeit dieser rekombinanten Vektoren, an die oben beschriebenen Oligonukleotidsonden zu hybridisieren, wird dann bestimmt. Man analysierte dann Vektoren, bei denen sich herausstellt, daß sie zur einer solchen Hybridisierung fähig sind, um das Ausmaß und die Beschaffenheit der Rezeptormolekülsequenzen zu bestimmen, die sie enthalten. Auf der Grundlage rein statistischer Überlegungen könnte eine Gensequenz, die für jedes der erfindungsgemäßen Hormonrezeptormoleküle kodieren kann, eindeutig (durch Hybridisierungsscreening) unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde mit nur 18 Nukleotiden identifiziert werden.
  • Bei einer anderen Klonierungsart einer Gensequenz, die für die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle kodiert, wird eine Sammlung von Expressionsvektoren durch Klonieren von DNA, oder bevorzugter von cDNA, (aus einer Zelle, die das Rezeptormolekül exprimieren kann) in einen Expressionsvektor gebildet. Die Sammlung wird dann hinsichtlich Mitgliedern gescreent, die ein Protein exprimieren können, das sich an einen Hormonrezeptormolekül-spezifischen Antikörper bindet und das eine Nukleotidsequenz aufweist, die Polypeptide kodieren kann, weiche die gleiche Aminosäuresequenz wie das Rezeptormolekül oder Fragmente davon aufweisen. Bei der Ausführungsform wird DNA, oder bevorzugter cDNA, aus einer Zelle extrahiert und gereinigt, die das Rezeptormolekül exprimieren kann. Die gereinigte cDNA wird fragmentiert (durch Scheren, Endonukleasedigestion, usw.), um einen Pool von DNA- oder cDNA-Fragmenten zu erzeugen. DNA- oder cDNA-Fragmente aus diesem Pool werden dann in einen Expressionsvektor kloniert, um eine genomische oder cDNA- Sammlung von Expressionsvektoren zu bilden, deren Mitglieder jeweils ein einziges geklontes DNA- oder cDNA-Fragment enthalten.
  • Somit ermöglicht es zusammenfassend die Herstellung eines im wesentlichen reinen Präparats eines Hormonrezeptormoleküls, die Sequenz eines Peptidfragments des Rezeptors zu bestimmen. Mit dieser Information ist es möglich, die Sequenz einer theoretischen "wahrscheinlichsten" DNA-Sequenz oder einer Gruppe von Sequenzen abzuleiten, welche die Peptidsequenz dieser Rezeptormoleküle kodieren können. Durch das Konstruieren eines Oligonukleotids, das zu dieser theoretischen Sequenz komplementär ist (oder durch Konstruieren eines Nukleotidsatzes, der zum Satz der "wahrscheinlichsten" Oligonukleotide komplementär ist) erhält man ein DNA-Molekül (oder einen Satz von DNA-Molekülen), das als Sonde zur Identifizierung und Isolierung einer Genseqzuenz wirken kann, die für jedes der erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle kodieren kann.
  • Solche oben beschriebenen oder ähnliche Verfahren ermöglichten das erfolgreiche Klonieren von Genen für menschliche Aldehyddehydrogenasen (Hsu, L.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985)), Fibronectin (Suzuki, S., et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J. 4: 2519-2524 (1985), das menschliche Östrogenrezeptorgen (Walter, P., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985)), den Gewebetyp Plasminogenaktivator (Pennica, D., et al., Nature 301: 214-221 (1983)) und die alkalische Phosphatase-Plazenta-Komplementär-DNA der menschlichen Schwangerschaft (Kam, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 871 5-8719 (1985)).
  • In der gleichen Weise, in aer das Ratten-LH/CG-Rezeptormolekül gereinigt und dazu verwendet wurde, eine Gensequenz zu erhalten, die für den Ratten-LH/CG-Rezeptor kodiert, ist es möglich, die Ratten-FSH- oder TSH-Rezeptoren zu reinigen.
  • Die Struktur und Sequenz der LH/CG-, FSH- und TSH-Hormone und ihrer jeweiligen Rezeptoren sind in Säugetieren in hohem Maße konserviert. Demnach ist z.B. der Ratten-LH/CG-Rezeptor fähig, sichn an den LH und CG von Menschen und anderen Säugetieren zu binden. In ähnlicher Weise können die Ratten-FSH- und TSH-Rezeptoren jeweils FSH und TSH von Menschen und anderen Säugetieren binden. Diese Tatsachen ermöglichen es, die Ratten-LH/CG-, FSH- und TSH-Rezeptoren zu verwenden, um Zustände und Erkrankungen bei Tieren und insbesondere beim Menschen zu behandeln, die mit diesen Hormonen und ihren jeweiligen Rezeptoren assoziiert sind.
  • Die konservierte Struktur und Sequenz der Säugetier-LH/CG-, FSH- und TSH-Rezeptoren und die Klärung der cDNA-Sequenz, die für den Ratten-LH/CG-Rezeptor kodiert, ermöglichen es, die Gensequenzen aus anderen Säugetieren zu klonieren, die für den LH/CG-, FSH- oder TSH-Rezeptor kodieren. Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung ist die Möglichkeit, die menschlichen LH/CG-, FSH- und TSH- Rezeptormoleküle mittels der oben beschriebenen für den Ratten-LH/CG-Rezeptor kodierenen Gensequenz zu klonieren.
  • In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt der erste Schritt zur Gewinnung einer Gensequenz, welche für den Ratten-FSH- oder TSH-Rezeptor, oder den LH/CG-, FSH- oder TSH-Rezeptor jedes anderen Säugetiers (insbesondere von Menschen) kodiert, das Gewinnen von DNA aus Zellen, die solche Gensequenzen enthalten (vorzugsweise wird cDNA aus Zellen gewonnen, die solche Rezeptoren exprimieren). Diese DNA wird dazu verwendet, eine genomische (oder noch bevorzugter eine cDNA-) Sammlung zu bilden. Verfahren zur Herstellung solcher Sammlungen sind durch Maniatis, T., et al., (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)) geoffenbart.
  • Zur Identifizierung und Isolierung der erwünschten Gensequenz wird die oben beschriebene Sammlung dann hinsichtlich Gensequenzen gescreent, die an eine Sondensequenz entweder der oben beschriebenen, für den gesamten Ratten- LH/CG- Rezeptor kodierenen Sequenz, an eine zu einer solchen für den Rezeptor kodierenden Sequenz komplementären Sequenz oder an ein Fragment einer der beiden derartigen Sequenzen hybridisieren. Zur Isolierung eines DNA-Moleküls beispielsweise, das für den menschlichen FSH- (oder TSH-) Rezeptor kodieren kann, werden menschliche FSH- (oder TSH-) Rezeptor-exprimierende Zellen zum Erhalt einer DNA- (oder cDNA-) Sammlung verwendet. Die Mitglieder dieser Sammlung weroen hinsichtlich ihrer Fähigkeit gescreent, mit der oben beschriebenen Ratten-LH/CG-Sondensequenz zu hybridisieren, wobei Verfahren angewendet werden, wie sie durch Maniatis, T., er al. (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982) oder durch Haymes, B.D., et al., in: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) geoffenbart sind.
  • Es ist für Fachleute auf dem Gebiet im allgemeinen offenkundig, daß man eine solche Hybridisierung unter Bedingungen unterschiedlicher Strenge durchführen kann, um es entweder einem stabilen Hybrid zu ermöglichen, sich nur zwischen zwei Gensequenzen zu bilden, die sehr ähnliche Sequenzen aufweisen (hohe Strenge) oder es einem solchen Hybrid zu ermöglichen, sich zwischen zwei Gensequenzen zu bilden, die mehrere unterschiedliche Sequenzen aufweisen (niedrige Strenge). Bedingungen hoher Strenge sehen hohe Temperaturen (z.B. 50-65ºC) und hohe Konzentrationen von Wirkstoffen wie Formamid (z.B. 50% Formamid) vor. Bedingungen niedriger Strenge verwenden niedrigere Temperaturen (etwa 42ºC) und geringere Konzentrationen von Wirkstoffen wie Formamid (beispielsweise 20-40% Formamid) ((Lawler, M. et al., Bone Marrow Transpl. 3: 473 (1988); Bhattacharya, S. et al., Ind. J. Med. Res. 87: 144 (1988); Arif, B.M. et al., Virus Res. 2: 85 (1985); Smith, G.E. et al., Virol. 123: 393 (1982); Priestly, J.V. et al., Histochem. 89: 467 (1988); Rohrmann, G.F. et al., J. Gen. Virol, 62: 137 (1982). Bei Verwendung von Hybridisierungsbedingungen von 42ºC und 20% Formamid können zwei Gensequenzen mit etwa 10% Homologie ein stabiles Hybrid bilden (Rohrmann, G.F. et al., J. Gen. Virol. 62: 137 (1982)).
  • Sobald Mitglieder der Sammlung identifiziert wurden, die fähig sind, an die Sonde zu hybridisieren, ist es notwendig zu bestimmen, ob sie für die LH/CG-, FSH- oder TSH- Rezeptormoleküle (oder ein Fragment davon) kodieren. Eine solche Charakterisierung kann geeigneterweise auf unterschiedliche Art erfolgen. Vorzugsweise kann die Gensequenz in eine geeignete Wirtszelle eingesetzt, exprimiert und der exprimierte Rezeptor hinsichtlich seiner Fähigkeit geprüft werden, sich an LH, CG, FSH oder THS zu binden. Eine Gensequenz, die einen Rezeptor exprimiert, der sich an LH, CG, FSH oder TSH binden kann, kodiert jeweils für den LH-, CG-, FSH- oder TSH-Rezeptor. Alternativ dazu kann das exprimierte Molekül hinsichtlich seiner Fähigkeit untersucht werden, sich an einen Antikörper zu binden (hergestellt wie unten beschrieben), der mit dem LH/CG-, FSH- oder TSH-Rezeptor reagiert. Die Autoantikörper, die durch Patienten mir Graves'scher Krankheit gebildet werden, können zur Bestimmung verwendet werden, ob ein exprimierter Rezeptor der TSH-Rezeptor ist.
  • Falls das exprimierte Molekül nicht fähig ist, sich an LH, CG, FSH oder TSH zu binden, kann man daraus schließen, daß die isolierte Sequenz nur für ein Fragment der erwünschten Gensequenz kodiert. Demzufolge dient die isolierte Gensequenz dazu, jegliche fehlende Fragmente der erwünschten Gensequenz zu identifizieren und zu isolieren (Bender, W. et al., J. Supramolec. Struc. 10 (suppl): 32 (1979), Chinault, A.C., et al., Gene, 5: 111 (1979), Clarke, L. et al., Nature 287: 504 (1980)). Sobald solche Sequenzen identifiziert und isoliert sind, ist es möglich, eine einzelne Gensequenz zu konstruieren, die fähig ist, für das gesamte erwünschte Rezeptormolekül zu kodieren, wobei bekannte Verfahren rekombinanter DNA-Technologie Anwendung finden.
  • Kovalente Modifizierungen der erfindungsgemäßen Hormonrezeptormoleküle sind m Schutzumfang der Erfindung enthalten. Varianten-Hormonrezeptormolekülfragmenre mit bis zu etwa 100 Resten können geeigneterweise durch in vitro-Synthese hergestellt werden. Solche Modifizierungen können durch Umsetzen gezielter Aminosäurereste des gereinigten oder rohen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das mit ausgewählten Seitenketten oder Terminalresten reagieren kann, in das Molekül eingebracht werden. Die resultierenden kovalenten Derivate eignen sich für Programme, die auf das Identifizieren von Resten gerichtet sind, die für die biologische Aktivität bedeutend sind.
  • Cysteinylreste werden meistens mit α-Haloacetaten und korrespondierenden Aminen) wie Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt, um Carboxymethyl oder Carboxyamidomethylderivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazolyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N- Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p- Chlorquecksilber-II-benzoat, 2-Chlorquecksilber-II-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenz- 2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
  • Histidylreste werden durch Reaktion mit Diäthylprokarbonat bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,0 derivatisiert, da dieses Mittel für die Histidyl-Seitenkette relativ spezifisch ist. Parabromphenacylbromid ist auch geeignet; die Reaktion erfolgt vorzugsweise in 0,1 M Natriumkakodylat bei einem pH-Wert von 6,0.
  • Lysinyl- und Aminoterminalreste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln bewirkt eine Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von α-Amino-hältigen Resten umfassen Imidoester wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O- Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und die Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
  • Arginylreste werden durch die Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifizieg, z.B. Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert es, daß die Reaktion aufgrund des hohen pK der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen stattfindet. Weiters können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie der epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.
  • Die spezifische Modifizierung von Tyrosylresten per se wurde ausführlich untersucht, wobei man sich vor allem mit dem Einführen von Spektralmarkierungen in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan befaßte. Am häufigsten wird N-Acetylimidazol und Tetranitromethan dazu verwendet, O-Acetyltyrosyl-Spezien bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²&sup5;I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in einem Radioimmunassay zu bilden, wobei das oben beschriebene Choramin T-Verfahren geeignet ist.
  • Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Umsetzen mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R') wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-äthyl) carbodiimid oder 1-Äthyl-3 (4 azonium 4,4dimethylpentyl) carbodiimid selektiv modifiziert. Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt.
  • Die Derivatisierung mit bifunktionalen Wirkstoffen eignet sich zum Vernetzen des Hormonrezeptormoleküls mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zum Spalten eines Hormonrezeptormolekül- Fusionspeptids, um das abgespaltene Polypeptid freizusetzen und zu gewinnen. Häufig verwendete Vernetzungsmittel sind z.B. 1,1bis(Diazoacetyl)-2-phenyläthan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, darunter Disuccinimidylester wie 3,3'- Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunkionale Maleimide wie bis-N-Maleimid-1,8- oktan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die Vernetzungen in der Gegenwart von Licht bilden können. Alternativ dazu verwendet man zur Proteinimmobilisierung reaktive wasserunlösliche Matrizen wie Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substanzen, die in den US PSen 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 und 4.330.440 beschrieben sind.
  • Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den korrespondierenden Glutamyl- und Aspartylreste deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter geringfügig sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den erfindungsgemäßen Schutzumfang. Andere Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten. die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 (1983)), die Acetylierung des N- terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
  • Aminosäuresequenzvarianten des Hormonrezeptormoleküls können auch durch Mutationen in der DNA gebildet werden. Zu solchen Varianten gehören beispielsweise Löschungen, Einfügungen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in Fig.1 dargestellten Aminosäuresequenz. Jede Kombination von Löschungen, Einfügungen und Substitutionen kann vorgenommen werden, um zum Endkonstrukt zu gelangen, vorausgesetzt das Endkonstrukt besitzt die erwünschte Aktivität. Offensichtlich dürfen die Mutationen, die man in der für die Variante kodierenden DNA vornimmt, die Sequenz nicht aus dem Leserahmen bringen und bilden vorzugsweise keine Komplementärregionen, die eine sekundäre mRNA-Struktur schaffen könnten (siehe EP- A Nr. 75.444).
  • Auf genetischer Ebene werden solche Varianten üblicherweise durch stellengerichtete Mutagenese von Nukleotiden in der für das Hormonrezeptormolekül kodierenden DNA, wodurch eine für die Variante kodierende DNA entsteht, und durch anschließendes Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur gebildet. Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie das natürlich vorkommende Analogon.
  • Während die Stelle zum Einführen der Aminosäuresequenzvariation vorbestimmt ist, muß die Mutation selbst nicht vorbestimmt sein. Zur Optimierung der Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle kann am Zielcodon oder der Zielregion eine Zufallsmutagenese durchgeführt werden, und die exprimierten Varianten können auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität gescreent werden. Verfahren zum Vornehmen von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA mit einer bekannten Sequenz sind wohlbekannr, z.B. stellenspezifische Mutagenese. Die Bildung einer erfindungsgemäßen Hormonrezeptormolekülvariante wird durch stellenspezifische Mutagenese von DNA erreicht, die für eine zuvor gebildete Variante oder eine Nicht-Variantenversion des Proteins kodiert. Stellenspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Hormonrezeptormolekülvarianten durch die Verwendung von spezifischen Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie für eine ausreichende Anzahl angrenzender Nukleotide kodieren, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der überbrückten Löschungsverbindungstelle zu bilden. Typischerweise ist ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nukleotiden vorzuziehen, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der Sequenz geändert werden. Im allgemeinen ist das Verfahren der stellenspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet wohlbekannt, wie dies in Veröffentlichungen wie Adelman et al., DNA 2: 183 (1983) angeführt ist. Man beachte, daß das stellenspezifische Mutagenseverfahren typischerweise die Verwendung eines Phagevektors vorsieht, der sowohl in einstrangiger als auch in doppelstrangiger Form besteht. Typische Vektoren, die sich für stellengerichtete Mutagenese eignen, umfassen Vektoren wie M13-Phage, wie z.B. durch Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Hg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981) geoffenbart. Diese Phagen sind im Handel leicht erhältlich, und ihre Verwendung ist durch Fachleute auf dem Gebiet im allgemeinen wohlbekannt. Alternativ dazu kann man zur Gewinnung von einstrangiger DNA Plasmidvektoren verwenden, die einen einstrangigen Phagen-Replikationsursprung enthalten (Vieira et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987).
  • Im allgemeinen wird die erfindungsgemäße stellengerichtete Mutagenese zunächst durch Bilden eines einstrangigen Vektors durchgeführt, der innernalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz aufweist, die für das relevante Protein kodiert. Ein Oligonukleotidprimer, der die erwünschte mutierte Sequenz trägt, wird im allgemeinen synthetisch, beispielsweise durch das Verfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 5765 (1978), gebildet. Der Primer wird dann mit dem einstrangigen Proteinsequenz-enthaltenden Vektor zusammengelagert und DNA- Polymerisationsenzymen wie einem E.coli Polymerase I Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des mutationstragenden Strangs abzuschließen. Der Heteroduplex- Vektor dient dann dazu, geeignete Zellen wie JM101-Zellen zu transformieren und diejenigen Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren enthalten, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen.
  • Nach der Auswahl eines solchen Klons kann man die mutierte Proteinregion entfernen und zur Proteinherstellung in einen geeigneten Vektor einsetzen, im allgemeinen einen Expressionsvektor des Typs, der zur Transformation eines geeigneten Wirten verwendet werden kann.
  • Die Aminosäuresequenzlöschungen reichen im allgemeinen von etwa 1 bis 30 Resten, noch bevorzugter von 1 bis 10 Resten und sind typischerweise angrenzend.
  • Aminosäuresequenzeinfügungen enthalten Amino- und/oder Carboxylterminalfusionen von einem Rest bis zu Polypeptiden von im wesentlichen uneingeschränkter Länge sowie Intrasequenzeinfügungen von einzelnen oder mehreren Aminosäureresten. Intrasequenzeinfügungen (d.h. Einfügungen innerhalb der vollständigen Hormonrezeptormolekülsequenz) können im allgemeinen von etwa 1 bis 10 Resten, noch bevorzugter von 1 bis 5 Resten, reichen. Ein Beispiel der terminalen Einfügung enthält eine Fusion einer Signalsequenz, die zu der Wirtszelle heterolog oder homolog sein kann, an den N-Terminus des Hormonrezeptormoleküls, um die Sekretion des reifen Hormonrezeptormoleküls durch rekombinante Wirte zu erleichtern.
  • Die dritte Gruppe von Varianten umfaßt jene, worin zumindest ein Aminosäurerest im Hormonrezeptormolekül (und vorzugsweise nur einer) entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle eingefügt wurde. Solche Substitutionen erfolgen vorzugsweise gemäß nachstehender Tabelle 1, wenn es darum geht, die Eigenschaften eines Hormonrezeptormoleküls fein zu modulieren. TABELLE 1 Ursprünglicher Rest Beispielhafte Substitutionen
  • Substantielle Veränderungen in der funktionalen oder immunologischen Identität werden durch das Auswählen von Substitutionen erreicht, die weniger konservativ als jene in Tabelle 1 sind, d.h. durch Auswählen von Resten, die sich in ihrer Auswirkung auf das Beibehalten (a) einer Struktur des Polypeptidrückgrats im Bereich der Substitution beispielsweise als Schicht- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Masse der Seitenkette deutlicher unterscheiden. Die Substitutionen, die man im allgemeinen erwarten kann, sind jene, worin (a) Glycin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure substituiert oder gelöscht oder eingefügt ist; (b) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl für (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert ist, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (c) ein Cysteinrest für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert ist; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen Rest mit einer elektronegativen Ladung substituiert ist, z.B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (e) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, für (oder durch) einen Rest ersetzt ist, der keine solche Seitenkette aufweist, z.B. Glycin.
  • Die meitsen Löschungen und Einfügungen, und insbesondere die Substitutionen, führen vermutlich zu keinen radikalen Veränderungen der Eigenschaften des Moleküls. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Auswirkung der Substitution, Löschung oder Einfügung vorherzusagen, bevor man sie vornimmt, ist für den Fachmann auf dem Gebiet zu beachten, daß die Auswirkung durch Routine-Screenassays bewertet wird. Eine Variante wird z.B. typischerweise durch stellenspezifische Mutagenese der für das native Hormonrezeptormolekül kodierenden Nukleinsäure, Expression der Variantennukleinsäure in rekombinanter Zellkultur und wahlweise durch Reinigung aus der Zellkultur gebildet, z.B. durch Immunoaffinitätsadsorption auf einer polyklonalen Antihormonrezeptormolekül-Säule (um die Variante zu absorbieren, indem sie an zumindest ein verbleibendes Immunepitop gebunden wird).
  • Die Aktivität des Zellysats oder der gereinigten Hormonrezeptormolekülvariante wird dann in einem geeigneten Prüfassay hinsichtlich der erwünschten Eigenschaft gescreent. Beispielsweise wird eine Änderung der immunologischen Eigenschaft des Hormonrezeptormoleküls, z.B. die Affinität für einen bestimmten Antikörper, durch einen Immunassay des kompetitiven Typs gemessen. Veränderungen der Immunmodulationsaktivität werden durch den geeigneten Assay gemessen. Modifizierungen solcher Proteineigenschaften wie Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder die Neigung zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren werden durch Verfahren geprüft, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist.
    • IV. EXPRESSION DER HORMONREZEPTORMOLEKÜLE
  • DNA- oder cDNA-Moleküle, die für ein Hormonrezeptormolekül für LH, CG, FSH oder TSH kodieren, können operabel in einen Expressionsvektor verbunden und in eine Wirtszelle eingefügt werden, um die Expression des Rezeptormoleküls durch diese Zelle zu ermöglichen. Man sagt, daß zwei DNA-Sequenzen (z.B. eine Promotorregionsequenz und eine erwünschte für ein Rezeptormolekül kodierende Sequenz) operabel verbunden sind, wenn die Beschaffenheit der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen (1) nicht zur Einführung einer Ramenverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit der Promotorregionsequenz nicht beeinträchtigt, die Transkription der erwünschten für ein Rezeptormolekül kodierenden Gensequenz zu leiten oder (3) die Fähigkeit der erwünschten Rezeptormolekül- Gensequenz nicht beeinträchtigt, durch die Promotorregionsequenz transkribiert zu werden.
  • Eine für ein Hormonrezeprormolekül kodierende DNA-Sequenz kann mit Vektor-DNA gemäß herkömmlicher Verfahren rekombiniert werden, umfassend Termini mit stumpfen oder versetzten Enden zur Ligation, Restriktionsrezeptormolekül-Digestion, um geeignete Termini bereitzustellen, Auffüllen kohäsiver Enden je nach Bedarfsfall, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um ein unerwünschtes Verbinden zu vermeiden und Ligation mit geeigneten Ligasen.
  • Die vorliegende Erfindung sieht die Expression des erwünschten Rezeptormoleküls in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen vor. Bevorzugte eukaryotische Wirte sind Hefe (insbesondere Saccharomyces), Pilze (insbesondere Apsergillus), Säugetierzellen (z.B. Zellen von Menschen oder Primaten) entweder in vivo oder in Gewebekultur.
  • Hefe- und Säugetierzelien sind in der vorliegenden Erfindung bevorzugte Wirte. Die Verwendung solcher Wirte bietet insoferne entscheidende Vorteile, als sie auch posttranslationale Peptidmodifizierungen durchführen können, z.B. Glykosylierung. Es gibt eine Anzahl rekombinanter DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und eine hohe Kopienanzahl von Plasmiden vorsehen, die zur Bildung der erwünschten Proteine in diesen Wirten verwendet werden können.
  • Hefe erkennt Leadersequenzen auf klonierten Säugetiergenprodukten und sekretiert peptidtragende Leadersequenzen (d.h. Präpeptide). Säugetierzellen führen posttranslationale Modifizierungen in Proteinmolekülen herbei, darunter das korrekte Falten oder die Glykosylierung an richtigen Stellen.
  • Säugetierzellen, die sich als Wirte eignen, sind u.a. Zellen fibroblastischen Ursprungs, z.B. VERO oder CHO-K1 und ihre Derivate. Für einen Säugetierwirt stehen verschiedene mögliche Vektorsysteme zur Expression des erwünschten Rezeptormoleküls zu Verfügung. Eine Vielzahl von transkriptionalen und translationalen Regulationssequenzen kann je nach Beschaffenheit des Wirts verwendet werden. Die transkriptionalen und translationalen Regulatorsignale können aus viralen Quellen stammen, z.B. Adenovirus, Rinder-Papillomavirus, Affenvirus u.dgl., worin die Regulatorsiganale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, das hohe Expressionsmengen aufweist. Alternativ dazu kann man Promotoren aus Säugetier- Expressionsprodukten verwenden, z.B. Actin, Kollagen, Mysoin, usw. Transkriptionale Initiationsreaulationssignale können ausgewählt werden, welche eine Unterdrückung oder Aktivierung ermöglichen, sodaß die Expression der Gene moduliert werden kann. Von Interesse sind Regulationssignale, die temperaturempfindlich sind, sodaß man durch das Variieren der Temperatur die Expression unterdrücken oder einleiten kann, oder die chemischer Regulierung unterworfen sind, z.B. Metaboliten.
  • Die Expression des erwünschten Rezeptormoleküls in eukaryotischen Wirten erfordert die Verwendung von eukaryotischen Regulationsregionen. Solche Regionen enthalten im allgemeinen eine Promotorregion, die ausreicht, um die Initiation der RNA-Synthese zu lenken. Zu bevorzugten eukaryotischen Promotoren gehören der Promotor des Mäus-Metallothionein I-Gens (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982)); der TK-Promotor des Herpesvirus (McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); der SV40- frühe Promotor (Benoist, C., et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)); der Hefegal4-Genpromotor (Johnston, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971-6975 (1982); Silver, P.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-5955 (1984)).
  • Wie hinlänglich bekannt ist, wird die Translation eukaryotischer mRNA an jenem Codon eingeleitet, der für das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grund stellt man vorzugsweise sicher, daß die Verbindung zwischen einem eukaryotischen Promotor und einer DNA-Sequenz, die für das erwünschte Rezeptormolekül kodiert, keine intervenierenden Codone enthält, die für ein Methionin kodieren können (d.h. AUG). Die Gegenwart solcher Codone führt entweder zur Bildung eines Fusionsproteins (wenn sich das AUG-Codon im gleichen Leserahmen befindet wie die für das erwünschte Rezeptormolekül kodierende DNA-Sequenz) oder einer Rahmenverschiebungsmutation (wenn sich das AUG-Codon nicht im gleichen Leserahmen befindet wie die für das erwünschte Rezeptormolekül kodierende Sequenz).
  • Die Expression der Hormonrezeptormoleküle Kann auch in prokaryotischen Zellen erreicht werden. Zu bevorzugten prokaryotischen Wirten gehören Bakterien wie E.coli, Bacillus Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, usw. Der bevorzugteste prokaryotische Wirt ist E.coli. Bakterielle Wirte von besonderem Interesse sind u.a. E.coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446), E.coli X 1776 (ATCC 31537), E.coli W3110 (F&supmin;, Lambda, protophisch (ATCC 27325)) und andere Enterobakterien (wie etwa Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans), sowie zahlreiche Pseudomonas-Spezien. Der prokaryotische Wirt muß mit den Replikon- und Steuersequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
  • Zur Expression des erwünschten Rezeptormoleküls in einer prokaryotischen Zelle (wie etwa E.coli, B.subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, usw) ist es erforderlich, die für ein erwünschtes Rezeptormolekül kodierende Sequenz an einen funktionalen prokaryotischen Promotor operabel zu binden. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder vorzugsweise regulierbar sein (d.h. induzierbar oder derepressibel). Beispiele konstitutiver Promotoren sind der int-Promotor von Bakteriophage λ und der bla-Promotor des β-Lactamasegens von pBT322, usw. Beispiele induzierbarer prokaryotischer Promotoren sind die wichtigsten rechten und linken Promotoren von Bakteriophage λ (PL und PR), die trp, recA, lacZ, lacI, gaI und tac-Promotoren von E.coli, die α-Amylase (Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162: 176-182 (1985), die -28- spezifischen Promotoren von B.subtilis (Gilman, M.Z. et al., Gene 32: 11-20 (1984)), die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, T.J. in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), und Streptomyces-Promotoren (Ward, J.M., et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478 (1986)). Ein Überblick über prokaroytische Promotoren wird durch Glick, B.R., (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie, 68: 505-516 (1986)); und Gottesmann, S. (Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)) gegeben.
  • Die richtige Expression in einer prokaryotischen Zelle erfordert auch die Gegenwart einer Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts der genkodierenden Sequenz. Solche Ribosomenbindungsstellen sind beispielsweise durch Gold, L., et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365-404 (1981)) geoffenbart.
  • Die erwünschte für ein Rezeptormolekül kodierende Sequenz und ein operabel verbundener Promotor können in eine prokaryotische oder eukaryotische Empfängerzelle entweder als ein nichtreplizierendes DNA- (oder RNA) Molekül eingeführt werden, das entweder ein lineares Molekül oder vorzugsweise ein geschlossenes kovalentes kreisförmiges Molekül ist. Da solche Moleküle zur autonomen Replikation nicht fähig sind, kann die Expression des erwünschten Rezeptormoleküls durch die transiente Expression der eingeführten Sequenz eintreten. Alternativ dazu kann die permanente Expression durch die Integrierung der eingeführten Sequenz in das Wirtschromosom eintreten.
  • In einer Ausführungsform wird ein Vektor verwendet, der die erwünschten Gensequenzen in das Wirtszellenchromosom integrieren kann. Zellen, welche die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosome integriert haben, können auch durch die Einführung von einem oder mehreren Matierungen ausgewählt werden, die eine Auswahl von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Die Markierung kann eine Auxotrophie im Wirten (z.B. leu2 oder ura3, die üblichen auxotrophischen Hefemarkierungen) und die Biozidresistenz ergänzen, z.B. Antibiotika oder Schwermeralle wie Kupfer u.dgl. Das auswählbare Makierungsgen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gensequenzen verbunden werden oder durch Co-Transfektion in die gleiche Zelle eingeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die eingeführte Sequenz in ein Plasmid oder einen Viralvektor eingebaut, der zur autonomen Replikation im Empfängerwirt fähig ist. Zu diesem Zweck eignet sich jeder beliebige einer Vielzahl an Vektoren. Bedeutende Faktoren bei der Auswahl eines bestimmten Plasmids oder Viralvektors sind: die Leichtigkeit, mit der die den Vektor enthaltenden Empfängerzellen erkannt und aus jenen Empfängerzellen ausgewählt werden können, die den Vektor nicht enthalten; aie Anzanl an Vektorkopien, die in einem bestimmten Wirten erwünscht sind; und ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher Spezien "hin- und herbewegen" zu können.
  • Es eignet sich jedes beliebige einer Serie von Hefe-Genexpressionssystemen. Beispiele solcher Expressionvektoren sind der Hefe 2-u-Kreis, die Expressionsplasmide YEP13, YCP und YRP oder ihre Derivate. Solche Plasmide sind auf dem Gebiet wohlbekannt (Botstein, D., et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265-274 (1982); Broach, J.R., in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445-470 (1981); Broach, J.R., Cell 28: 203-204 (1982)).
  • Für einen Säugetierwirt stehen zur Expression verschiedene mögliche Vektorsysteme zur Verfügung. Eine Klasse von Vektoren verwendet DNA-Elemente, die autonom replizierende extrachromosomale Plasmide bereitstellen, die aus Tierviren wie dem Rinder-Papillomavirus, Polyomavirus, Adenovirus oder SV40-Virus stammen. Eine zweite Klasse von Vektoren basiert auf der Integration der erwünschten Gensequenzen in das Wirtschromosom. Zellen, welche die eingebrachte DNA stabil in ihre Chromosome integriert haben, können auch durch die Einführung von einer oder mehreren Markierungen ausgewählt werden, welche die Auswahl von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Die Markierung kann für die Prototropie eines auxotrophischen Wirten und Biozidresistenz sorgen, z.B. Antibiotika oder Schwermetalle wie Kupfer u.dgl. Das auswählbare Markierungsgen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Sequenzen verbunden oder durch Co- Transformation in die gleiche Zelle eingefügt werden. Zusätzliche Elemente sind für eine optimale Synthese von mRNA allenfalls erforderlich. Diese Elemente können Spleißsignale, sowie Transkriptionspromotoren, Verstärker und Terminationssignale umfassen. Zu den cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente enthalten, gehören jene, die durch Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983) beschrieben sind, sowie andere.
  • Zu bevorzugten prokaroytischen Vektoren gehören Plasmide wie jene, die zur Replikation in E.coli fähig sind. z.B. pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, πVX. Solche Plasmide sind z.B. in Maniatis, T., et al. (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) geoffenbart. Zu Bacillusplasmiden gehören pC194, pC221, pT127, usw. Solche Plasmide sind in Gryczan, T. (in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), S. 307-329) geoffenbart. Geeignete Streptomyces-Plasmide umfassen pIJ101 (Kendall, K.J. et al. J.Bacteriol. 169:4177-4183 (1987) sowie Streptomyces Bakteriophagen wie fC31 (Chater, K.F., et al. in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest (1986), S. 45-5(4). Pseudonomas-Plasmide sind durch John, J.F., et al. (Rev. Infect. Dis 8: 693-704 (1986) und Izaki, K. (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742 (1978)) im Überblick besprochen.
  • Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, der bzw. die die Konstrukte enthält, zur Expression vorbereitet wurde, können die DNA-Konstrukte in einen geeigneten Wirt eingesetzt werden. Es eignen sich unterschiedliche Verfahren, z.B. Protoplastenfusion, Kalziumphosphat-Ausfällung, Elektroporation oder andere herkömmliche Verfahren. Nach der Fusion werden die Zellen in Medien gezüchtet und hinsichtlich geeigneter Aktivitäten gescreent. Die Expression der Sequenz führt zur Herstellung des Hormonrezeptormoleküls.
  • Die erfindungsgemäßen Hormonrezeptormoleküle können isoliert und aus den oben beschriebenen rekombinanten Molekülen gemäß herkömmlicher Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Extraktion, Ausfällung, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese u.dgl.
    • V. DIE MOLEKÜLE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Rezeptoren des luteinisierenden Hormons, von Choriogonadotropin, des follikelstimulierenden Hormons und des schilddrüsenstimulierenden Hormons. Der hierin verwendete Ausdruck "Hormonrezeptor" umfaßt nicht nur das membrangebundene Rezeptormolekül, sondern auch die löslichen (d.h. nicht membrangebundenen) und vollständigen (d.h. mit der gesamten Aminosäuresequenz des Hormonrezeptors versehenen Rezeptormoleküle. Der Ausdruck "Hormonrezeptoren" umfaßt darüberhinaus die funktionalen Derivate solcher Moleküle. Der Ausdruck "Hormonrezeptoren" umfaßt weiters sowohl glykosylierte als auch unglykosylierte Formen jedes der oben beschriebenen Moleküle.
  • Ein "funktionales Derivat" eines Moleküls ist hierin eine Verbindung, die eine biologische Aktivität besitzt (entweder funktional oder strukturell), die einer biologischen Aktivität dieses Moleküls im wesentlichen ähnelt. Der Ausdruck "funktionale Derivate" soll hierin "Fragmente", "Varianten", "Analoge" oder "chemische Derivate" eines Moleküls umfassen. Der Ausdruck "Fragment" bezieht sich auf jede Polypeptid-Untergruppe des Moleküls. Fragmente der LH-, CG-, FSH- oder TSH- Rezeptoren, die fähig sind, jeweils LH, CG, FSH oder TSH zu binden, sind für die vorliegende Erfindung von besonderer Bedeutung. Der Ausdruck "Variante" bezieht sich auf ein Molekül, das im wesentlichen der Struktur und Funktion entweder des gesamten Moleküls oder eines Fragments davon ähnelt. Ein Molekül gilt einem anderen Molekül als "im wesentlichen ähnlich", wenn beide Moleküle im wesentlichen gleiche Strukturen aufweisen oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Soferne die beiden Moleküle eine ähnliche Aktivität besitzen, gelten sie als Varianten, da dieser Ausdruck hierin selbst dann verwendet wird, wenn die Struktur eines der Moleküle nicht im anderen zu finden ist, oder wenn die Sequenz von Aminosäureresten nicht identisch ist. Der Ausdruck "Analog" bezieht sich auf ein Molekül, das im wesentlichen eine ähnliche Funktion wie das gesamte Molekül oder ein Fragment davon aufweist. Ein Molekül gilt hierin als ein "chemisches Derivat" eines anderes Molekuls, wenn es zusätzliche chemische Gruppen enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Gruppen können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit, usw. des Moleküls verbessern. Die Gruppen können anderseits die Toxizität des Moleküls verringern und alle unerwünschten Nebenwirkungen des Moleküls usw. ausschalten oder mildern. Gruppen, die solche Wirkungen vermitteln können, sind in Remington s Pharmaceutical Sciences (1980) geoffenbart. "Toxin-abgeleitete" Moleküle stellen eine Sondergattung der "chemischen Derivate" dar. Ein "Toxin-abgeleitetes" Molekül ist ein Molekül, das eine Toxingruppe enthält. Die Bindung eines derartigen Moleküls an eine Zelle bringt die Toxingruppe in unmittelbare Nähe der Zelle und unterstützt dadurch das Absterben der Zelle. Man kann jede geeignete Toxingruppe verwenden; es ist jedoch vorzuziehen, Toxine wie das Ricintoxin, das Diphterietoxin, radioisotope Toxine, Membrankanal-bildende Toxine, usw. zu verwenden. Verfahren zum Kuppeln solcher Gruppen an ein Molekül sind auf dem Gebiet wohlbekannt.
  • Hierin bezieht sich der Ausdruck "Hormonantagonist" auf ein Nicht-Immunoglobulin- Molekül, das sich an einen Hormonrezeptor binden kann und dessen Bindung an einen solchen Rezeptor entweder (1) die Fähigkeit jedes anderen Moleküls imitiert, sich an den Rezeptor zu binden, um dadurch eine phyisiologisch signifikante (d.h. nachweisbare) Wirkung zu vermitteln oder (2) die Fähigkeit jedes anderen Moleküls erhöht, sich an den Rezeptor zu binden, um dadurch eine physiologisch signifikante Wirkung zu vermitteln. Ein Beispiel eines Hormonantagonisten ist ein organisches Molekül oder ein anderes Protein als LH, das eine luteinisierende Hormonaktivität äufweist.
  • Der hierin verwendete Ausdruck "Hormonantagonist" bezieht sich auf ein Nicht- Immunoglobulin-Molekul, das sich an einen Hormonrezeptor binden kann und dessen Bindung an einen solchen Rezeptor die Fähigkeit jedes anderen Moleküls verhindert oder abschwächt, sich an den Rezeptor zu binden, um dadurch eine physiologisch signifikante (d.h. nachweisbare) Wirkung zu vermitteln.
    • VI. VERWENDUNGEN DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN MOLEKÜLE THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN 1. VERWENDUNGEN VON LGH/CG/FSH-REZEPTOREN a. BEHANDLUNG VON FRUCHTBARKEIT
  • Das luteinisierende Hormon, Choriogonadotropin und das follikelstimulierende Hormon sind bei menschlicher und tierischer Fruchtbarkeit beteiligt. Die erfindungsgemaßen Rezeptoren können sich an diese Hormone binden und verringern daher die Verfügbarkeit dieser Hormone, sich an die auf den Oberflächen der Zielzellen vorhandenen Rezeptoren zu binden.
  • Somit kann man die erfindungsgemäßen FSH- und LH/CG-Rezeptormoleküle auch als Empfängnisverhütungsmittel zur Vermeidung der Oozytenentwicklung, des Eisprungs oder der Schwangerschaft bei Frauen verwenden. Da FSH und LH zur Spermatogenese errorderlich sind, führt die Verabreichung von LH- und FSH-Rezeptoren an Männer auch zu Unfruchtbarkeit. Somit können die LH- und FSH-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung entweder bei Männern oder bei Frauen zur Verhinderung der Schwangerschaft verwendet werden. Es ist bedeutsam, daß die kontrazeptiven Wirkungen solcher Mittel reversibel sind (d.h. der Abbruch der Therapie stellt wieder einen fruchtbaren Zustand beim Patienten her). Die Rezeptoren können auch zur Identifizierung von Antagonisten verwendet werden, die zur Stimulierung des Eisprungs bei Frauen zu stimulieren.
  • Obwohl ein vollständiges Rezeptormolekül als Verhütungsmittel verwendet werden kann, ist es vorzuziehen, ein lösliches Fragment des gesamten Rezeptormoleküls zu verwenden, das die extrazelluläre Domäne des Rezeptormoleküls enthält. Wie weiter unten erwähnt, ist es wünschenswert, ein solches Fragment an ein nicht-proteinartiges Polvmer zu kuppeln, um die biologische Halbwertszeit des Moleküls zu erhöhen.
  • Obwohl man durch das Verabreichen entweder des LH/CG-Rezeptors oder des FSH- Rezeptors an männliche und weibliche Empfänger eine empfängnisverhütende Wirkung erzielt, kann man durch die Verabreichung von beiden dieser Rezeptormoleküle (oder beider Derivate) an einen Empfänger eine höhere schwangerschaftsverhütende Wirksamkeit erreichen. In ähnlicher Weise kann man eine schwangerschaftsverhütende Wirksamkeit durch die Verabreichung von einem (oder beiden) dieser Moleküle in Kombination mit Östrogen, Progesteron oder einem anderen Steroidhormon erzielen. Die schwangerschaftsverhütende Wirksamkeit kann auch durch das Verabreichen von anderen Proteinhormonen, z.B. von Inhibin, die eine kontrazeptive Wirkung aufweisen an die Empfänger gesteigert werden.
  • Die Verfügbarkeit rekombinanter Moleküle, welche für die Rezeptormoleküle kodieren, ermöglicht die Isolierung von Varianten (durch Mutagenese oder durch andere Mittel), welche die Hormone fester binden oder die eine erhöhte biologische Aktivität oder Halbwertszeit aufweisen. Ebenso kann man solche Moleküle verwenden, um ein Hybridrezeptormolekül zu konstruieren, das zu einer Bindung von sowohl FSH als auch LH/CG fähig ist.
  • Die erfindungsgemäßen Schwangerschaftsverhütungsmittel können, wie weiter unten ausführlich beschrieben, in unterschiedliche Weise an Empfänger verabreicht werden. Die Mittel können entweder in gebundener oder nicht gebundener (d.h. löslicher) Form verabreicht werden.
  • Zusätzlich zur oben angeführten kontrazeptiven Fähigkeit der LH/CG- und FSH- Rezeptoren können die Rezeptoren einen verlängerten Zustand der Unfruchtbarkeit aurgrund ihrer Fähigkeit vermitteln, in Patienten als Immunogene zu dienen. Somit können die Hormonrezeptormoleküle einem Patienten in einer immunogenen Form verabreicht werden, wodurch der Patient Antikörper zu den Rezeptormolekülen bildet. Die Gegenwart von solchen Antikörpern im Serum eines Patienten kann diesen unfruchtbar machen. Es wurden zahlreiche Verfahren entwickelt, um die Immunogenität natürlicher Proteine zu erhöhen; sie werden zur Bildung solcher Antikörper eingesetzt (N.Rosemblit et al., Endocrinology 123: 2284 (1988); Copping, S. et al.. J. Endocrinol. 104: 78 (1985); Pala, A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 67: 1190 1988)).
  • Die Verabreichung des oder der Rezeptoren kann durch Injektion und vorzugsweise durch ergänzende regelmäßige Auffrischungsimpfungen erfolgen (etwa 1-4 Monate zwischen Injektionen und vorzugsweise 3 Montate zwischen Injektionen).
  • Die Erfindung betrifft insbesondere die Verabreichung des FSH-Rezeptors an Tiere und Menschen als Mittel zum Induzieren von Anti-FSH-Rezeptorantikörpern, die das Binden von FSH an das FSH-Rezeptormolekül verhindern können. Die Bildung solcher Antikörper in Männern würde die Spermatogenese hemmen und dadurch als Schwangerschaftsverhütungsmittel wirken. Die Bildung solcher Antikörper in Frauen würde die Follikelentwicklung hemmen und dadurch als Schwangerschaftsverhütungsmittel wirken. Somit dient die Verabreichung der Rezeptoren zur Bildung eines fruchtbarkeitshemmenden Impfstoffes.
    • b. BEHANDLUNG VON BRUSTKREBS
  • Brustkrebs ist in der westlichen Welt ein großes volksgesundheitliches Problem. Er ist eine der Haupttodesursachen für Frauen zwischen 35-45. Viele Faktoren, z.B. das Alter, die Menstruations- und Fortpflanzungsgeschichte, die Größe des Tumors, die Gegenwart und Anzahl allfälliger positiver Achsknoten, usw. beeinflussen die Prognose der Krankheit.
  • Insbesondere die Gegenwart oder das Fehlen des Östrogenrezeptor- ("ER") Proteins gilt bei der Erstellung der Prognose der Erkrankung als besonders wichtig. Bei Frauen, die hohe ER-Werte aufweisen, fällt die Prognose günstiger aus als bei Frauen, deren ER- Werte durchschnittlich oder negativ sind. Aufgrund dieses Ergebnisses kann man an Brustkrebspatientinnen Östrogenanaloge verabreichen, um Östrogen oder Östrogenvorläufer zu eliminieren. In akuteren Fällen wird eine Adrenalektomie und/oder Hyphosektomie vorgenommen.
  • Durch das Verabreichen des FSH-Rezeptors an eine Person ist es möglich, die FSH- Moleküle der Person zu binden und dadurch ihre Fähigkeit zu unterbinden oder einzuschränken, die Produktion von Östrogen durch Eierstockzellen einzuleiten. Somit führt eine solche Verabreichung zur Herbeiführung von Östrogenrezeptormolekülen. Wie weiter unten erwähnt können in einer alternativen erfindungsgemäßen Ausführungsform die oben angeführten Anti-FSH-Rezeptor und Anti-LH- Rezeptorantikörper zur Erreichung dieses Ziels an eine Person verabreicht werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Alternative zu den oben beschriebenen herkömmlichen Therapien dar.
    • c. BEHANDLUNG VON PROSTATAKREBS
  • Prostatakrebs ist eine der häufigsten bösartigen Geschwüre bei Männern und eine übliche Ursache für Krebstod. Die Behandlung dieser Erkrankung umfaßt die chirurgische Entfernung der Prostatadrüse, Chemo- und Strahlentherapie. Die Tatsache, daß das Wachstum der Prostatadrüse von Hodenandrogenen abhängt bietet eine zusätzliche Therapie für Prostatakrebs. Die Menge solcher Androgene wurde durch Kastration oder Östrogentherapie herabgesetzt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt für diese Erkrankung eine Alternativtherapie bereit. Wie bereits erwähnt besteht die Hauptwirkung von LH bei Männern darin, die Bildung von Testosteron durch durch Leydig-Zellen zu induzieren. Demzufolge ist es durch das Verabreichen des LH/CH-Rezeptors und/oder FSH-Rezeptors an einen Patienten möglich, die LH-Menge im Serum, das zur Einleitung der Testosteronbiosynthese verfügbar ist, abzusenken. Somit verringert die Verabreichung des oder der Rezeptoren die Testosteronsynthese und bewirkt daher ein Absinken der Wachstumsrate der Prostatadrüse. Selbst wenn eine solche Therapie nicht ausreicht, eine Tumorrückbildung oder ein Aufhören des Tumorwachstums zu bewirken, kann eine soiche Therapie zur Linderung des Knochenschmerzes beitragen, wobei dieses Symptom bei den meitsen Patienten in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium auftritt. In einer alternativen Ausführungsform können die oben angeführten Anti-LH-Rezeptorantikörper zur Erreichung dieses Ziels an einen Patienten verabreicht werden.
    • d. BEHANDLUNG VON OSTEOPOROSE
  • Viele Symptome der Menopause können den erhöhten Werten von FSH und LH im Kreislauf zugeschrieben werden, die bei Frauen in den Wechseljahren festzustellen sind. Häufige Symptome der Menopause umfassen vasomotorische Instabilität ("Wallungen"), die Atrophie des Urogenital-Epitheliums und der Haut, eine Schrumpfung der Brüste und Osteoporose.
  • Die FSH- und LH-Werte bei fortpflanzungsfähigen Frauen sind deutlich niedriger als bei Frauen während der Menopause. Die FSH-Werte können etwa um das Achtfache ansteigen; die LH-Werte können etwa um das 6,5-fache ansteigen (Petersdorf, R.G. et al. (HG) in: Harrison's Principles of Internal Medicine, 10. Ausgabe McGraw-Hill, NY, (1983), S. 704-705). Dieser Zunahme von Hormonwerten im Kreislauf kann durch das Verabreichen des FSH-Rezeptors und/oder des LH/CG-Rezeptors an eine Frau begegnet werden.
  • Die Osteoporose ist der Ausdruck, der zur Beschreibung einer heterogenen Gruppe von Erkrankungen verwendet wird, die jeweils durch eine Verringerung der Knochenmasse pro Volumseinheit bis zu einem Wert gekennzeichnet sind, bei dem eine adäquate Stützung für das Skelett nicht mehr gegeben ist. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Behandlung von Osteoporose (entweder phrophylaktisch oder therapeutisch) durch Verringerung der LH- und/oder FSH-Werte bereit. Gemäß einer solchen Therapie werden einer Frau therapeutisch wirksame Mengen des FSH- und/oder LH/CG- Rezeptors verabreicht, welche die FSH- und/oder LH-Serumwerte absenken können.
    • e. BEHANDLUNG VON PERIMENOPAUSALER VASOMOTORISCHER INSTABILITÄT
  • Wie bereits erwähnt kann man viele Symptome der Menopause den die Menopause kennzeichnenden höheren FSH- und LH-Werten im Kreislauf zuschreiben. Untersuchungen zeigten, daß die vasomotorische Instabilität ("Wallungen") mit einem Anstieg der LH-Werte in Zusammenhang stehen. Somit eignet sich zusätzlich zur oben beschriebenen Fähigkeit, eine Therapie für die Osteoporose bereitzustellen, die Verabreichung des FSH- und/oder der LH/CG-Rezeptoren zur Behandlung vasomotorischer Instabilität (d.h. zur Vermeidung oder Linderung ihrer Symptome).
    • f. BEHANDLUNG POLYZYSTISCHER EIERSTOCKERKRANKUNG
  • Bei normalen Frauen sind die Östrogenwerte eng mit dem Fortpflanzungszyklus synchronisiert. Die asynchron ablaufende Östrogenproduktion ist durch Unfruchtbarkeit, übermäßigen Haarwuchs, Fettleibigkeit, sowie Amenorrhöe oder Oligomenorrhöe gekennzeichnet. Dieser Zustand wird als polyzystische Eierstockerkrankung bezeichnet ("PCOD") (Petersdorf, R.G. et al. (HG.) in: Harrison's Principles of Internal Medicine, 10. Ausgabe McGraw-Hill, NY (1983), S. 710). Dieser Zustand ist durch hohe LH-Werte und niedrige FSH-Werte gekennzeichnet.
  • Die Behandlung von PCOD zielt auf die Unterbrechung der Östrogenproduktion ab. Eine derartige Behandlung wird durch Mittel, welche die Eierstock-Androgensekretion vermindern, oder durch die Steigerung der FSH-Sekretion erreicht.
  • Die vorliegende Erfindung bietet für diese Krankheit eine neuartige Therapie. Die transiente Verabreichung der FSH-Rezeptormoleküle kann dazu dienen, eine erhöhte FSH-Biosynthese zu induzieren, sodaß das Abstellen der Verabreichung zu einer Zunahme des FSH-Werts führt. Die Verabreichung des LH/CG-Rezeptors bewirkt eine Verringerung der Menge von LH, das zur Bindung an LH/CG-Rezeptoren auf Eierstockzellen zur Verfügung steht und sorgt demnach dafür, daß die synthetisierte Androgenmenge sinkt.
    • 2. VERWENDUNGEN DES TSH-REZEPTORS
  • Wie bereits erwähnt betrifft die Graves'sche Krankheit eine Überfunktion der Schilddrüse, die durch die Bildung eines Immunoglobulins bewirkt wird, das zur Bindung an den TSH-Rezeptor fähig ist, wodurch die Wirkungsweise von TSH imitiert wird. Zur Behandlung der Krankheit kann der Patient mit antithyroidalen Arzneimitteln, radioaktivem Iod oder durch chirurgische Entfernung eines Teils der Schilddrüse behandelt werden. In allen Fällen zielt die Therapie darauf ab, die Menge des Schilddrüsenhormons einzuschränken, das durch die Schilddrüse erzeugt werden kann.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Graves'sche Krankheit durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des TSH-Rezeptors an einen Patienten zu behandeln. Der verabreichte TSH-Rezeptor kann sich an das Immunoglobulin binden, das die Graves'sche Krankheit hervorruft. Somit dient die Verabreichung des Rezeptors dazu, die Menge an Immunoglobulin zu verringern, das zu einer Bindung an die TSH-Rezeptoren auf der Oberfläche der Schilddrüsenzellen fähig ist. Die Verabreichung von TSH-Rezeptoren stellt somit eine Therapie für die Graves'sche Krankheit dar, die nicht zu einer Zerstörung von normalem, gesundem Schilddrüsengewebe führt. Der Rezeptor kann auch zur Verringerung der physischen Auswirkungen der Schilddrüsenüberfunktion insbesondere während der Vorbereitung auf eine Operation des Patienten beitragen, wenn ein chirurgischer Eingriff aufgrund des Schweregrads der Krankheit gewählt wurde. Alternativ dazu könnte ein an eine feste Trägermatrix gekuppelter TSH-Rezeptor verwendet werden, um die schilddrüsenstimulierenden Immunoglobuline außerhalb des Körpers durch selektive Plasmapherese zu eliminieren.
  • Man kann des TSH-Rezeptor weiters zur Behandlung gutartiger Prostata-Hypertrophie einsetzen.
    • VII. VERABREICHUNG DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN MITTEL
  • Die therapeutische Wirkungen der Hormonrezeptormoleküle der vorliegenden Erfindung können durch die Verabreichung des gesamten Moleküls oder jedes therapeutisch aktiven Peptidfragments davon an einen Patienten erzielt werden. Von besonderem Interesse sind die therapeutisch aktiven Peptidfragmente solcher Moleküle, die löslich, d.h. nicht membrangebunden sind. Bevorzugte Fragmente sind jene, die die extrazelluläre Domäne eines Hormonrezeptors enthalten.
  • Die oben beschriebenen Moleküle und ihre funktionalen Derivate kann man entweder synthetisch, durch den Einsatz rekombinanter DNA-Technologie, durch Proteolyse oder durch eine Kombination solcher Verfahren gewinnen. Die therapeutischen Vorteile solcher Moleküle können durch die Verwendung funktionaler Derivate erhöht werden, die zusätzliche Aminosäurereste enthalten, die zur Steigerung des Kuppelns an den Träger oder der Aktivität der Moleküle hinzugefügt werden. Der erfindungsgemäße Schutzbereich umfaßt weiters funktionale Derivate jener Moleküle, die einen Mangel an bestimmten Aminosäureresten oder geänderte Aminosäurereste aufweisen, solange solche Derivate eine biologische oder pharmakologische Aktivität besitzen oder beeinflussen, welche die Hormonrezeptormoleküle oder der Hormonangatonist oder die Hormonantagonistenmoleküle der vorliegenden Erfindung besitzen oder durch die sie beeinflußt werden.
  • Die erfindungsgemäßen Hormonrezeptormoleküle gelten als "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen", wenn die sie enthaltenden Präparate im wesentlichen frei von Materialien sind, welche diese Produkte normalerweise und in natürlicher Form aufweisen.
  • Die erfindungsgemäßen Moleküle können gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen zu bilden, wodurch diese Materialien oder ihre funktionalen Derivate in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel kombiniert werden. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung, einschließlich anderer menschlicher Proteine, z.B. des menschlichesn Serumalbumins, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Ausgabe, Osol, A., Hg. Mack, Easton PA (1980)) beschrieben- Zur Bildung einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung, die zur wirkungsvollen Verabreichung geeignet ist, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge von zumindest einem der erfindungsgemäßen Moleküle gemeinsam mit einer geeigneten Menge Trägervehikel.
  • Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können zur Steuerung der Dauer der Wirkungsweise verwendet werden. Präparate mit gesteuerter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren gebildet werden, um die erfindungsgemäßen Moleküle zu komplexieren oder zu absorbieren. Ein besonders bevorzugtes Präparat ist das Ergebnis des Konjugierens eines erfindungemäßen Moleküls mit einem nichtproteinartigen Polymer zur Bildung eines Derivatmoleküls, das wasserlöslich ist und andere erwünschte Eigenschaften aufweist. Das nicht-proteinartige Polymer ist üblicherweise ein hydrophiles, synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das sonst nicht in der Natur vorkommt. Polymere, die in der Natur vorkommen und durch rekombinante oder in vivo-Verfahren gebildet werden, sind jedoch ebenso nützlich wie Polymere, die in der Natur nicht vorkommen. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den erfindungsgemäßen Schutzbereich, z.B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders geeignet sind Polyalkylenether wie Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyoxyethylenester oder Methoxypolyethylenglykol; Polyoxyalkylene wie Polyoxyethylen, Polyoxypropylen und Blockcopolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Pluronics); Polymethacrylate; Carbomere; verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, die die Saccharidmonomere D-Mannose, D- und L- Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, C-Glucuronsäure, Sialsäure, D- Galacturonsäure, C-Mannuronsäure (z.B. Polymannuronsäure oder Alginsäure), D- Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose, und Neuraminsäure, darunter Homopolysaccharide und Heteropolysaccharide wie Lactose, Amylopectin, Stärke, Hydroxethyl-Stärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glykogen, oder die Polysaccharid-Untereinheit von Säure-Mucopolysacchariden, z.B. Hyaluronsäure; Polymere von Zuckeralkoholen wie Polysorbit und Polymannit; Heparin; und Polyamide wie Polyserin oder Polyalanin enthalten. Wenn das Polysaccharid der native Glykosylierungsattendant oder der auf die rekombinante Expression jedes beliebigen erfindungsgemäßen Moleküls folgende Glykosylierungsattendant ist, befindet sich die Substitutionsstelle üblicherweise an einer anderen als der N- oder O-verbundenen Glykosylierungsstelle eines solchen Moleküls, oder das verwendete Molekül ist eine Aminosäuresequenzvariante, worin eine zusätzliche oder substituierende N- oder O- verbundene Stelle in das Molekül eingesetzt wurde.
  • Man verwendet Mischungen solcher Polymeren, oder das Polymer kann homogen sein. Das Polymer muß vor dem Vernetzen nicht wasserlöslich sein, ist es aber vorzugsweise; jedenfalls muß das Endkonjugat wasserlöslich sein. Zusätzlich sollte das Polymer nicht stark immunogen sein, wenn es an das erfindungsgemäße Molekül konjugiert ist, noch sollte es eine für intravenöse Infusion oder Injektion unverträgliche Viskosität aufweisen, wenn es auf derartigem Weg verabreicht werden soll.
  • Vorzugsweise enthält das Polymer nur eine mit dem erfindungsgemäßen Molekül reaktive Gruppe. Dies trägt dazu bei, Quervernetzung der Moleküle zu verhindern. Es liegt jedoch im erfindungsgemäßen Schutzumfang, die Reaktionsbedingungen zur Verringerung der Vernetzung zu optimieren, oder die Reaktionsprodukte durch Gelfiltration oder chromatographische Siebe zu reinigen, um im wesentlichen homogene Derivate zu gewinnen.
  • Das Molekulargewicht des Polymers reicht von etwa 100 bis 500.000 und beträgt vorzugsweise etwa 100 bis 20.000. Das ausgewählte Molekulargewicht hängt von der Beschaffenheit des Polymers und dem Substitutionsgrad ab. Im allgemeinen läßt sich folgendes sagen: je größer die Hydrophilie des Polymers und je höher der Substitutionsgrad, desto niedriger das verwendbare Molekulargewicht. Optimale Molekulargewichte werden durch Routineversuche bestimmt. Üblicherweise übersteigt das Molekulargewicht des Moleküls des erfindungsgemäßen Polymerkonjugats etwa 70.000, obwohl sich Moleküle mit niedrigerem Molekulargewicht ebenfalls eignen.
  • Das Polymer ist im allgemeinen mit einem erfindungsgemäßen Molekül durch ein multifunktionales Vernetzungsmittel kovalent verbunden, das mit dem Polymer und einem oder mehreren Aminosäure- oder Zuckerresten des Moleküls reagiert. Es liegt jedoch im erfindungsgemäßen Schutzbereich, das Polymer durch das Umsetzen eines derivatisierten Polymers mit dem Molekül oder umgekehrt direkt mit einem solchen Molekül zu vernetzen. Ebenfalls in den erfindungsgemäßen Schutzumfang fallen nichtkovalente assoziative Komplexe eines Moleküls der vorliegenden Erfindung und des Polymers. Solche Komplexe werden am besten durch nichtkovalentes Assoziieren von elektronegativ geladenen Polymeren wie Dextransulfat, Heparin, Heparan, Chondroitinsulfat oder anderen Glykosaminglykanen; oder amphoteren Polymeren mit elektronegativen Bereichen mit dem Molekül hergestellt. Ein alkalischer pH erleichtert die Bildung solcher Komplexe, die durch das Mischen von Lösungen oder Suspensionen der Polymeren und des Molekül und anschließendes Entfernen von Salzen oder Trocknen zur Beschleunigung der Assoziation zwischen dem Polymer und dem Molekül entstehen.
  • Die erfindungsgemäßen Moleküle sind vorzugsweise kovalent mit dem Polymer vernetzt. Die bevorzugte kovalente Vernetzungsstelle der erfindungsgemäßen Moleküle sind die N-terminale Aminogruppe und Epsilonaminogruppen, die sich auf Lysinresten befinden, obwohl andere Amino-, Imino-, Carboxyl-, Sulfhydryl- Hydroxyl- oder andere hydrophile Gruppen als nützliche Substitutionsstellen auf den Molekülen dienen. Das Polymer kann ohne Verwendung eines multifunktionalen (üblicherweise bifunktionalen) Vernetzungsmittels direkt an das Molekül gebunden werden. Beispiele solcher Vernetzungsmittel sind 1,1-bis(Diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, darunter Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis (succinimidylpropionat) und bifunktionale Maleimide wie bis-N-Maleimido-1,8-oktan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die Vernetzungen in der Gegenwart von Licht bilden können. Alternativ dazu werden reaktive wasserlösliche Matrizen wie Cyanogenbromidaktivierte Kohlenhydrate und die in den US PSen 3.959.080, 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537, 4.055.635 und 4.330.440 beschriebenen Systeme in geeigneter Weise für das Vernetzen des Polymers und des Moleküls modifiziert. Die kovalente Bindung an die Aminogruppen der erfindungsgemäßen Moleküle wird durch bekannte Chemikalien auf der Grundlage von Cyanurchlorid, Carbonyldiimidazol, Aldehyd-reaktive Gruppen (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Acetanhydrid, oder PEG-Chlorid plus Phenoxid von 4- Hydroxybenzaldehyd), Succinimidyl-aktive Ester, aktivertes Dithiokarbonat-PEG, 2,4,5- Trichlorphenylchlorformiat oder p-Nitrophenylchlorformiat-aktiviertes PEG erreicht. Carboxylgruppen werden durch Kuppeln von PEG-Amin unter Verwendung von Carbodiimid abgeleitet. Polymere werden an die Oligosaccharidsubstituenten durch chemische (z.B. Metaperiodat) oder enzymatische Oxidation (z.B. Glukose oder Galactoseoxidase) (zur Herstellung des Aldehydderivats des Kohlenhydrats) und anschließende Reaktion mit Hydrazid oder amino-derivatisierten Polymeren konjugiert, wie dies durch Heitzmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 3537-3561 (1974) oder Bayer et al., Methods in Enzymology 62: 310 (1979) bezüglich des Markierens von Oligosacchariden mit Biotin oder Avidin beschrieben ist. Weiters eignen sich andere chemische oder enzymatische Verfahren, die bislang zur Verbindung von Oligosacchariden und Polymeren verwendet wurden. Substituierte Oligosaccharide sind besonders für jene erfindungsgemäßen Moleküle geeignet, worin sich die Kohlenhydratsubstituenten in der C-terminalen Region der extrazellulären Domäne befinden und daher nicht an der Bindung an das Hormon beteiligt sind; dies unterstützt das Bewahren der Hormonbindungsaktivität, während andere Ziele der Erfindung erreicht werden. Da es außerdem weniger Substitutionen als Aminosäurestellen zur Derivatisierung gibt, sind Oligosaccharidprodukte im allgemeinen homogener. Die Oligosaccharidsubstituenten des Moleküls können z.B. durch Neuraminidasedigestion vor der Polymerderivatisierung zur Entfernung von Zuckern enzymatisch modifiziert werden.
  • Die Oligosaccharide von anderen Glykoproteinen als den oben beschriebenen werden so wie oben beschrieben vorzugsweise mit PEG kovalent substituiert, um die Ziele der vorliegenden Erfindung hinsichtlich der therapeutischen Anwendungen solcher Glykoproteine zu erreichen.
  • Das Polymer trägt eine Gruppe, die direkt mit einer Aminosäure-Seitengruppe oder dem N- oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Moleküls reaktiv ist oder mit dem multifunktionalen Vernetzungsmittel reaktiv ist. Im allgemeinen sind Polymere, die solche reaktiven Gruppen tragen, zur Bildung von immobilisierten Proteinen bekannt. Zur Verwendung solcher Chemikalien sollte man ein wasserlösliches Polymer verwenden, das ansonsten in der gleichen Weise wie die bisher zur Proteinimmobilisierung verwendeten unlöslichen Polymere derivatisiert wird. Die Cyanogenbromid-Aktivierung ist eine besonders nützliche Vorgangsweise, die man beim Vernetzen von Polysacchariden an ein erfindungsgemäßes Molekül anwendet.
  • "Wasserlöslich" bedeutet in Bezug auf das Konjugat, daß dieses in phyiologischen Fluids wie Blut in einer Menge löslich ist, die ausreicht, um eine therapeutisch wirksame Konzentration zu erreichen. Somit sind matrix-insolubilisierte Matrizen ausgeschlossen, die zur Reinigung von Hormonen in der Affinitätschromatographie verwendet werden.
  • "Wasserlöslich" in Bezug auf das Ausgangspolymer bedeutet, daß das Polymer oder sein zur Konjugation verwendetes reaktives Zwischenprodukt ausreichend wasserlöslich ist, um an einer Derivatisierungsreaktion mit jedem der erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt zu sein.
  • Der Substitutionsgrad eines erfindungsgemäßen Moleküls variiert und ist abhängig von der Anzahl reaktiver Stellen auf dem Protein, ob das gesamte Molekül oder ein Fragment davon verwendet wird, ob das Molekül eine Fusion mit einem Protein ist, das zu jedem der erfindungsgemäßen Moleküle heterolog ist, sowie vom Molekulargewicht, der Hydrophilie und anderen Eigenschaften des Polymers und von den jeweils ausgewählten Stellen. Im allgemeinen wird die Domäne des Moleküls des Konjugats mit etwa 1 bis 10 Polymermolekülen substituiert, während jede heterologe Sequenz, die mit dem Molekül verschmolzen ist, mit einer im wesentlichen unbeschränkten Anzahl von Polymermolekülen substituiert werden kann, solange die Aktivität der Gruppe nicht entscheidend negativ beeinflußt wird. Der optimale Vernetzungsgrad läßt sich leicht durch eine Versuchsmatrix feststellen, worin die Zeit, Temperatur und andere Reaktionsbedingungen zur Änderung des Substitutionsgrades variieren, wobei danach die Fähigkeit der Konjugate bestimmt wird, Hormone zu binden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird PEG durch einen Lysinrest und die N- terminale Aminogruppe mit einem beliebigen erfindungsgemäßen Molekül vernetzt.
  • Das Molekulargewicht des konjugierten Polymers, beispielsweise PEG, reicht von etwa 500 bis 100.000. Molekulargewichte von 2000, 5000 oder 20.000 sind typisch. Das Polymer, z.B. PEG, wird durch eine Vielzahl an Verfahren mit einem erfindungsgemäßen Molekül vernetzt, die an sich für die kovalente Modifizierung von Proteinen mit nicht-proteinartigen Polymeren wie PEG bekannt sind. Cyanurchloridchemie führt zu vielen Nebenreaktionen, darunter zu Proteinvernetzung. Zusätzlich kann sie wahrscheinlich zur Inaktivierung von Sulfhydrylgruppen enthaltenden Proteinen führen. Die Carbonyldiimidazolchemie (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131: 25-33 (1983)) erfordert einen hohen pH-Wert (> 8,5), der Proteine inaktivieren kann. Da das "aktivierte PEG-" Zwischenprodukt darüberhinaus mit Wasser reagieren kann, ist ein sehr großer Molüberschuß von "aktiviertem PEG" gegenüber Protein erforderlich. Die für die Carbonyldiimidazolchemie notwendigen hohen PEG- Konzentrationen können zu Problemen bei der Reinigung führen, da sowohl die Gelfiltrationschromatographie als auch die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie nachteilig beeinflußt werden könnten. Andererseits ist die Aldehydchemie (Royer, US PS 4.002.531) wirksamer, da sie nur einen 40-fachen Molüberschuß von PEG und eine 1-2-stündige Inkubation erfordert. Das durch Royer zur Herstellung des PEG-Aldehyds vorgeschlagene Mangandioxid ist jedoch aufgrund der "ausgeprägten Neigung des PEG-Aldehyds zur Bildung von Komplexen mit Oxidierungsmitteln auf Metallbasis" problematisch (Harris et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22: 341-352 (1984)). Die Verwendung einer Moffattoxidation unter Verwendung von DMSO und Essigsäureanhydrid löst dieses Problem. Weiters muß das durch Royer vorgeschlagene Natriumborhydrid bei einem hohen pH-Wert verwendet werden und besitzt eine deutliche Neigung zur Reduktion von Disulfidbindungen. Im Gegensatz dazu weist die Verwendung von Natriumcyanoborhydrid, das bei einem neutralen pH-Wert wirksam ist, eine äußerst geringe Neigung zur Reduktion von Disulfidbindungen auf.
  • Die erfindungsgemäßen Konjugate werden vorzugsweise durch Gelfiltration von nicht reagierten Ausgangsmaterialien getrennt. Rezeptormoleküle beispielsweise können durch Adsorption unter Verwendung von Antirezeptor-Antikörpern (vorzugsweise monoklonalen Antikörpern oder eines Hormons weiter gereinigt werden, wobei beide vorzugsweise auf eine Matrix immobilisiert werden. Die Reinigung mittels eines Hormons besitzt den Vorteil daß sie nur Konjugate bindet, worin der Grad oder die Stelle der Substitution nicht zur Inaktivierung von Hormonbindung führte. PEG- substituierte Moleküle könnnen durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie weiter gereinigt werden. Am geeignetsten werden die Konjugate vom hydrophoben Chromatographiemedium, z.B. Alkylsepharose, durch die Verwendung eines sinkenden Salzgradienten eluiert. Dies sowie das oben beschriebene Gelfiltrationsverfahren löst die Konjugate auf der Grundlage des Substitutionsgrads auf, sodaß es möglich ist, ein Konjugatpräparat zu erhalten, das hinsichtlich seines Grades molarer Substitution durch PEG im wesentlichen homogen ist, z.B. monosubstituierte oder disubstituierte Moleküle, die im wesentlichen frei von disubstituierten bzw. monosubstituierten Molekülen sind. Die hierin angeführten Derivate können in den meisten Fällen durch Ionenaustauschchromatographie (Adsorption des Moleküls an ein Kationen- oder Anionenaustauschharz mit anschließender Eluierung oder Adsorption von Verunreinigungen an ein Anionen- oder Kationenaustauschharz) gereinigt wreden.
  • Die erfindungsgemäßen Konjugate können in physiologisch annehmbare Träger formuliert und zur therapeutischen Verwendung sterilgefiltert werden. Eine Zusammensetzung gilt als "pharmakologisch annehmbar", wenn seine Verabreichung durch einen Empfänger-Patienten vertragen wird. Ein solches Mittel gilt als in einer "therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart zu einer nachweisbaren Änderung in der Physiologie eines Empfänger- Patienten führt.
  • Die Konzentration der erfindungsgemäßen Moleküle in therapeutischen Formulierungen ist nicht entscheidend, liegt aber typischerweise von etwa 1 ug/ml bis 20 mg/ml. Die Konjugate enthalten wahlweise ein nichtionisches Detergens, wie Tween 20 oder 80, Salze, Puffer und andere Exzipienten. Sie werden als wässerige Lösungen gelagert oder lyophilisiert.
  • Die Konjugate werden durch subkutane, intramuskuläre, intravenöse oder intrazerebrospinale Injektion, intrapulmonare oder intranasale Sprays, Hautflecke, intravesikulare Infusion u.dgl. verabreicht. Bei der Verabreichung durch Injektion kann die Verabreichung durch Dauerinfusion oder durch einen oder mehrere Boluse erfolgen.
  • Die Dosierung wird in Einklang mit der klinischen Praxis bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, z.B. vom Alter, Gewicht, der Größe, des Geschlechts, des allgemeinen Krankheitszustands und der Krankengeschichte usw. des Patienten ab. Im allgemeinen ist es vorzuziehen, dem Empfänger eine anfängliche Dosis von etwa 10 ug/kg bis etwa 300 ug/kg (Körpergewicht des Patienten)/ein- bis dreimal pro Woche zu verabreichen, obwohl man auch eine höhere oder niedrigere Dosis verabreichen kann. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Konjugate besteht darin, daß sie selten verabreicht werden und nicht kontinuierliche durch Infusion zugeführt werden müssen, um die therapeutischen Dosierungen in vivo aufrechtzuerhalten.
  • Die Verabreichung von einer oder mehrerer solcher Verbindungen kann entweder zu einem "prophylaktischen" oder "therapeutischen" Zweck erfolgen. Bei prophylaktischer Verabreichung wird bzw. werden die Verbindung(en) vor jedem Krankheitssymptom oder einem Anzeichen einer Erkrankung verabreicht. Die prophylaktische Verabreichung der Verbindung(en) dient dazu, eine allfällig später eintretende Krankheit bzw. einen Zustand zu unterbinden oder abzuschwächen. Bei therapeutischer Verabreichung wird bzw. werden die Verbindung(en) beim (oder kurz nach dem) Eintreten eines Symptoms einer bestehenden Krankheit oder beim Erkennen eines Anzeichens eines bestehenden Zustands verabreicht. Die therapeutische Verabreichung der Verbindung(en) dient dazu, die Symptome einer solchen Krankheit bzw. eines solchen Zustands abzuschwächen.
  • Ein weiteres mögliches Verfahren zur Steuerung der Dauer der Wirkungsweise durch Präparate gesteuerter Freisetzung ist der Einbau jedes beliebigen erfindungsgemäßen Moleküls in Teilchen eines Polymermaterials wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogels, Poly(milchsäure)- oder Ethylenvinylacetatcopolymere. Anstelle des Einbaus dieser Mittel in Polymerteilchen ist es alternativ dazu auch möglich, diese Materialien in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächen-Polymerisation gebildet werden, z.B. Hydroxymethylzellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacylat)mikrokapseln, oder in kollodialen Arzneimittelabgabesystemen einzuschließen, z.B. in Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) geoffenbart.
  • Nach dieser allgemeinen Erklärung der Erfindung wird nun zur besseren Erläuterung auf Beispiele Bezug genommen, die nur veranschaulichen und, soferne nicht anders angegeben, die vorliegende Erfindung nicht einschränken sollen.
    • BEISPIEL 1 Reinigung des Ratten-Luteal-LH/CG-Rezeptors
  • Ratten-LH/CG-Rezeptor wurde gemäß dem Verfahren von Rosemblit, N. et al. (Endocrinol. 123: 2284-2289 (1988)) aus den Eierstöcken scheinträchtiger Ratten gereinigt, mit der Ausnahme, daß die Weizenkeim-Agglutininchromatographie vor der CG-Affinitätschromatographie erfolgte. Der so erhaltene LH/CG-R wurde durch Lectin und CG-Affinitätschromatographie gereinigt und danach durch Centricon-30 (Amicon) konzentriert.
  • Das Rezeptorprotein wurde durch Ausfällen mittels Inkubation über einen Zeitraum von 10 Minuten bei -20ºC in 5 Volumina Aceton weiter gereinigt. Der Niederschlag wurde zentrifugiert (12.000 x g, 10 Minuten), in Laemmli-Gelprobenpuffer gelöst und durch Gelelektrophorese aufgelöst (Laemmli, U.K. (Nature 227: 680 (1970)).
  • Die Silberfärbung der SDS-Gele des gereinigten Materials zeigte ein Hauptband, das einem Protein von 93 kDa entsprach, wobei auch mehrere weniger intensiv gefärbte niedrigere Mr-Bänder festzustellen waren. Es stellte sich also heraus, daß der Rezeptor aus einem einzigen Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 93 kDa zusammengesetzt war.
  • Die Verwendung der Weizenkeimsäule vor der Affinitätssäule führt zu einer etwas intensiveren Reinigung des Rezeptors (durch SDS-Gele ersichtlich). Die Reinigung eines Proteins von 93 kDa mittels dieser Verfahrensweise stimmt mit den früheren Ergebnissen der Autoren bezüglich der Struktur dieses Rezeptors überein. Eine weitere Bestätigung, daß das gereinigte 93 kDa-Protein der LH/CG-Rezeptor ist, wurde durch zwei zusätzliche Versuche erbracht. ln einem stammte der Rezeptor aus den Eierstöcken scheinträchtiger Ratten, worin der LH/CG-Rezeptor nach unten reguliert war. Erwartungsgemäß war das Protein von 93 kDa in silbergefärbten SDS-Gelen des gereinigten Materials aus dieser Quelle nicht ersichtlich. Im anderen Versuch wurde ¹²&sup5;I-CG mit Western Blots inkubiert, die aus SDS-Gelen des ursprünglichen Detergensextrakts und des gereinigten Rezeptors gebildet waren. In beiden Fällen beobachtete man die spezifische Bindung an ein Protein von 93 kDa. Man schloß daraus, daß das durch die Autoren gereinigte Protein von 93 kDa tatsächlich der LH/CG- Rezeptor ist.
  • Interessanterweise erschien der gereinigte LH/CG-Rezeptor als einfaches Band von 93 kDa auf SDS-Gels-ob in An- oder Abwesenheit von reduzierenden Mitteln. Somit legen diese Daten auch nahe, daß der LH/CG-Rezeptor ein einzelnes Polypeptid ist.
    • BEISPIEL 2 Bildung von polyklonalen und monoklonalen anti-Rezeptor-Antiseren
  • Unter Verwendung der gereinigten LH/CG-Rezeptorpräparate war es möglich, den Antikörper zum Rezeptor zu erhalten. Dazu wurde eine rezeptorhältige Probe in Freunds vollständigem Adjuvans verdünnt und subkutan in den Rücken eines New Zealand White weiblichen Hasens injiziert. Nach 6 Wochen wurde 5 Monate lang dem Hasen jede Woche Blut abgenommen. Es stellte sich heraus, daß die Seren des Hasen LH/CG-rezeptorspezifische polyklonale Antikörper enthielten (Rosemblit, N. et al., Endocrinol. 123: 2284-2289 (1988)). Dieser Antikörper konnte jedoch nicht die Bindung von CG oder LH an den Rezeptor verhindern. Man erhielt jedoch gemäß der oben beschriebenen Verfahren ein zweites polyklonales Antikörperpräparat, das die Bindung von CG an den Rezeptor nicht hemmt. Ein drittes polyklonales Antikörperpräparat wurde mittels der oben beschriebenen Verfahren gebildet, das sich spezifisch an ein synthetisches Peptid bindet, das hinsichtlich der Sequenz der extrazellulären Domäne von CG entspricht.
    • BEISPIEL 3 Proteinsequenzieren und Molekularklonieren des LH/CG-R
  • Das oben beschriebene Präparat des LH/CG-Rezeptorproteins wurde einer weiteren Reinigung unterzogen, um seine Sequenz zu bestimmen.
  • Zum Erhalt der Sequenz der N-terminalen Aminosäuren wurde der aufgelöste Rezeptor von 93 kDa auf PVDF-Membranen elektrogeblottet (P. Matsudaira, J. Biol. Chem. 262: 10035 (1987)) und die reife N-terminale Sequenz durch Gasphasen-Mikrosequenzieren bestimmt (Rodriguez, J. Chromatog. 350: 217 (1985)).
  • Zur Bestimmung der Sequenz innerer Peptidfragmente verwendete man unterschiedliche Protokolle. Die Peptidfragmente Ihr26 und thr28 wurden durch Ausfällen des elektroeluierten Rezeptorproteins mittels Methanol/Chloroform gebildet. Das Protein wurde in 20 mM Tris, pH-Wert 8,5, 0,1 % SDS erneut aufgelöst und mit der Lysyl-C-Endopeptidase digeriert. Die aus dieser Digestion gewonnenen Fragmente wurden dann unter Verwendung von HPLC erneut aufgelöst und sequenziert.
  • Die Sequenz der inneren Peptidfragmente Ihrf, Ihrk, Ihrc und Ihrr wurde durch Elektroeluieren des Rezeptors von 93 kDa und durch Ausfällen des resultierenden Proteins in 5 Volumina Aceton bestimmt. Der Niederschlag wurde in 20 mM Tris, pH- Wert 8,5 aufgelöst und mit Ameisensäure/CNBr behandelt, um die Proteinspaltung zu bewirken. Die Spaltungsprodukte wurden dreimal lyophilisiert und erneut im Probenpuffer zur Tricingelelektrophorese aufgelöst (H. Shägger et.al., Anal. Biochem. 166: 368 (1987)), elektrogeblottet und dem Gasphasenmikrosequenzieren unterworfen.
  • Durch eine solche Analyse wurden die oben angeführten inneren Peptidfragmente unterschiedlicher Länge gewonnen und sequenziert (Fig.1). Die Sequenzen dieser Polypeptidfragmente sind im Kasten im unteren Teil von Fig.1 dargestellt (die für die Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendeten Sequenzen sind unterstrichen). Unter Verwendung des genetischen Codes (Watson, J.D., in: Molecular Biology of the Gene, 3. Ausg., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356- 357)) wurden Oligonukleotidsonden gebildet, die für die sequenzierten Peptidfragmente kodieren können. Aufgrund der degenerierten Beschaffenheit des genetischen Codes wurden mehrere Sonden mit alternativen Codons gebildet. Die aus diesen Peptidsequenzen konstruierten Oligonukleotide sind in Tabelle 2 dargestellt (die unterschiedlichen Nukleotide der alternativen Codone sind unterhalb der Oligonukleotidsequenz an ihren jeweiligen Positionen in der Sequenz gezeigt). TABELLE 2
  • Oligonukleotidmischungen von ks, rsrc und fsrc (jeweils 500 ng) wurden zum Primen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (D.M. Fowlkes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2313 (1984) unter Verwendung einer Schablonen-cDNA (25 ng) verwendet, die aus scheinträchtigen Ratteneierstöcken-poly(A)&spplus; lutealer RNA synthetisiert war (P. Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156 (1987)). Die Reaktion erfolgte in 100 ul (67 mM Tris, pH-Wert 8,3, 6,7 mM EDTA, 2,5 mM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1,6 mMM Ammoniumsulfat) unter Verwendung von 1 U Thermus aquaticus wärmestabiler DNA-Polymerase (Perkin Elmer - Cetus Instruments) und eines DNA- Wärmezyklisierers (Techne). Mineralöl (60 ul) wurde zur Verhinderung des Verdampfens hinzugefügt. Die Reaktionszyklen (25) bestanden aus der Inkubation bei 95ºC über einen Zeitraum von 1,3 min: 45ºC, 2 min; 72ºC, 5 min. DNA-Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel analysiert. Große DNA-Fragmente wurden ausgeschnitten, vom Gel eluiert und in die Smal-Stelle des M13 Vektors mp19 eingesetzt (J. Vieira et al., Methods in Enzymology 153: 3 (1987)).
  • Ein deutliches DNa-Hauptprodukt wurde durch die Polymerasekettenreaktions-Synthese geschaffen. Bei der Sequenzanalyse (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977)) stellte sich heraus, daß dieses DNA-Produkt 622 Basenpaare enthielt. Das DNA-Produkt enthielt einen Teil der LH/CG-Rezeptorkodierungssequenz, einschließlich der Sequenzen für Peptide Ihrr, Ihr26 und thr28 (siehe Fig.1 und Tabelle 2).
  • Dieses PCR-Produkt wurde zum Screenen einer lutealen Ratten-cDNA-Sammlung verwendet (T. Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)). Das Fragment diene dazu, eine cDNA-Sammlung (10&sup6; rekombinanter Phage) zu sondieren, die in λgt10 (R.D. Young et al., Science 222: 788 (1983)) aus Eierstock-RNA scheinträchtiger Ratten konstruiert wurde. Von 20 hybridisierenden Phagen wurden 12 durch DNA-Sequenzieren eingehender untersucht und dazu verwendet, die Nukleotidsequenz der LH/CG-cDNA zu bestimmen.
  • Die Nukleotid- und die voraussichtliche Aminosäuresequenz der Ratten-LH/CG-R-cDNA mit 43 Nukleotiden 5'-flankierender und 759 Nukleotiden 3'-flankierender Sequenz sind in Fig.1 dargestellt. Das Translationsinitiationscodon an Position 1 definiert den Beginn eines 2100 Nukleotide langen offenen Leserahmens, der für alle unabhängig bestimmten Peptidsequenzen kodiert. Die voraussichtliche N-terminale Aminosäuresequenz stellt ein Signalpeptid von 26 Resten dar (G. von Heijne, Nucleic Acids Res. 14: 4683 (1986)). Die Sequenz nach dem Signalpeptid entspricht dem Peptid, das aus dem ungespaltenen LH/CG-R-Polypeptid bestimmt wird. Daher schloß man, daß der reife LH/CG-R mit Arg beginnt und sich aus 674 Aminosäureresten zusammensetzt (Mr 75 kDa).
    • BEISPIEL 4 Analyse des klonierten lutealen Ratten-LH/CG-Rezeptors
  • Zusammenfassend wurden die Oligonukleotide auf der Grundlage der N-terminalen Sequenz und eine der inneren Sequenzen dazu verwendet, luteale Ratten-cDNA zu primen, und es wurde die Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Die resultierende, 624 Nukleotide umfassende cDNA kodierte für die N-terminale Aminosäuresequenz an einem Ende und für die verwendete innere Sequenz an ihrem anderen Ende. Zufällig kodierte sie auch innerhalb ihrer zusätzlichen inneren Aminosäuresequenzdaten, die anhand des Rezeptors bestimmt worden waren. Somit schloß man, daß diese cDNA eine Teil-cDNA für den lutealen Ratten-LH/CG-Rezeptors darstellt. Sie diente dann dazu, die luteale Ratten-lambda gt10-Sammlung zu screenen. Daraus erhielt man eine cDNA, die die vollständige Kodierungssequenz für den Rezeptor enthielt.
  • Der offene Leserahmen dieser cDNA umfaßt 2100 Nukleotide, die für ein Protein von 700 Aminosäuren kodieren. Die ersten 26 Aminosäuren stellen eine Signalsequenz dar, da die aus dem intakten Protein abgeleitete N-terminale Sequenz darauffolgt. Das errechnete Molekulargewicht des gereinigten Rezeptors (93.000) ist Glykoprotein- Beschaffenheit des Rezeptors zuschreibbar.
  • Da der LH/CG-Rezeptor an ein Gs-Protein kuppelt, war es von besonderem Interesse zu ermitteln, ob dieser Rezeptor irgendwelche strukturellen Ähnlichkeiten mit anderen G- Protein-gekuppelten Rezeptoren aufwies, die bis jetzt kloniert und charakterisiert wurden. Diese anderen Rezeptoren (die z.B. Rhodopsin und den adrenergen, Muscarinacetylcholin-, Serotonin- und Substanz K-Rezeptor enthalten) weisen eine eine deutliche Aminosäure-Übereinstimmung miteinander auf und besitzen auch ein gemeinsames Strukturmerkmal des siebenmaligen Überspannens der Plasmamembran (Lefkowitz, R.J. et al., J. Biol. Chem. 263: 4993 (1988)). Man beachte jedoch, daß diese Rezeptoren im Gegensatz zum LH/CG-Rezeptor alle relativ kleine Liganden binden. Eine Analyse des Hydropathieplans des LH/CG-Rezeptors legt nahe, daß die C-terminale Hälfte des Proteins tatsächlich sieben membranüberspannende Domänen aufweist. Ein Vergleich der Aminosäuren in dieser Region des LH/CG-Rezeptors mit den Aminosäuresequenzen der anderen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren zeigt eine Übereinstimmung von 18-22%, die jener ähnelt, die man bei den Mitlgiedern dieser Familie beobachtet. Ganz im Gegensatz zu diesen anderen Rezeptoren besitzt der LH/CG-Rezeptor jedoch eine große (etwa 340 Aminosäuren in der Länge aufweisende) N-terminale Domäne auf, die relativ hydrophil ist.
  • Anhand dieser Daten postulieren die Autoren, daß der LH/CG-Rezeptor aus einer großen N-terminalen extrazellulären Domäne besteht, die an einer Region befestigt ist, welche die Plasmamembran siebenmal überspannt und mit einem kleinen C-terminalen zytoplasmischen Schwanz endet.
  • Es ist wahrscheinlich, daß die extrazelluläre Domäne an der Bindung der großen Glykoproteinhormone CG und LH beteiligt ist. Diese Zuordnung stimmt mit biochemischen Daten, die zeigen, daß ein wasserlösliches Fragment von 64 kDa des LH/CG-Rezeptors CG binden kann (Keinanen, K.P., Biochem. J. 239: 83 (1986)), und mit Daten aus Collagenase-behandelten Zellen überein.
  • Die extrazelluläre Region des Rezeptors hat viele erwähnenswerte Merkmale. Erstens gibt es 6 potentielle Stellen zur N-terminalen Glykosylierung. Vorläufige Daten lassen vermuten, daß die meisten dieser Stellen wahrscheinlich glykosyliert sind. Zweitens gibt es eine Stelle, die aus 10 Aminosäuren besteht, die mit einer Region im Sojabohnen- Lectin identisch ist (Schnell, K.J. et al., J. Biol. Chem. 262: 7220 (1987)). Es ist wohlbekannt, daß sich zwar die entglykosylierten Formen von CG und LH an den LH/CG-Rezeptor binden, sie aber eine geringe oder überhaupt keine biologische Aktivität bewirken. Daher ist es interessant zu untersuchen, ob diese Stelle auf dem LH/CG-Rezeptor an der Erkennung der Kohlenhydratketten des Hormons beteiligt ist.
  • Drittens kann die extrazelluläre Domäne in eine 14-fach imperfekt wiederholte Gruppe von etwa 25 Aminosäuren ausgerichtet werden. Die Zusammensetzung dieser Leucinreichen Gruppe ist einigen anderen Proteinen gemeinsam. Dazu gehören Proteine so verschiedenartiger (oder unbekannter) Funktionen wie die Hefe-Adenylatcyclase (Kataoka, T. et al., Cell 43: 493-505 (1985)), das Toll-Entwicklungsgen der Drosophila (Hashimoto, C. et al., Cell 52: 269 (1988)), das menschliche Serum-alpha2-Glykoprotein (Takahashi, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 1906 (1985)), der Plättchen 1b- Rezeptor für den von Willebrand-Faktor und Thrombin (Lopez, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 5615 (1987)) und das Proteoglykan PG40 der extrazellulären Matrix (Krusius, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 7683 (1986)). Es sei hervorgehoben, daß von diesen Proteinen nur PG40 eine allgemeine Aminosäurehomologie mit der extrazellulären Region des LH/CG-Rezeptors aufweist. Die biologische Bedeutung dieser Leucin-reichen Wiederholungsstruktur ist nicht geklärt. Es wurde angenommen, daß sie eine amphiphatische Helixstruktur bilden und daher an der Zusammenwirkung sowohl mit einer wässerigen Umgebung als auch mit der Plasmamembran beteiligt sein kann. Die läßt vermuten, daß beim Binden von CG oder LH die extrazelluläre Domäne des LH/CG-Rezeptors mit den membranüberspannenden Regionen des Rezeptors zusammenwirken kann.
  • Wie bereits beschrieben scheint die membranüberspannende Region des LH/CG- Rezeptors mit der Familie der Rezeptoren verwandt zu sein, die an G-Proteine kuppeln. Von den anderen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren, die bisher geklont wurden, kuppelt nur der beta-adrenerge Rezeptor auch mit einem Gs-Protein. Die Transmembranhälfte des LH/CG-Rezeptors zeigt jedoch keine größere Aminosäureübereinstimmung mit dem beta-adrenergen Rezeptor als mit Rezeptoren, die an andere G-Proteine kuppeln, selbst in jenen Regionen, die laut Untersuchungen an der Gs-Kupplung beteiligt sind (d.h. der C-terminale Abschnitt der dritten zytoplasmischen Schleife und der N-terminale Abschnitt des zytoplasmischen Schwanzes).
  • Bei der Untersuchung des C-terminalen zytoplasmischen Schwanzes des LH/CG- Rezeptors sind zahlreiche potentielle Phosphorylierungsstellen (d.h. Serine, Theonine und Tyrosine) ersichtlich. Die Menge und/oder Funktionen des LH/CG-Rezeptors können durch Phosphorylierung moduliert werden. Ein anderes Merkmal dieser Region des LH/CG-Rezeptors besteht darin, daß er zwei benachbarte Cluster basischer Aminosäuren besitzt, wobei dies vermuten läßt, daß das reife Protein an einer dieser Positionen posttranslational gespalten wird.
  • Es wurde für Rhodopsin und für den beta-adrenergen Rezeptor gezeigt, daß sich ihre jeweiligen Liganden durch Einlagern innerhalb der Membran und Zusammenwirken mit den Transmembranhelices an diese Rezeptoren binden. Somit ist in diesen Rezeptoren diese die Membran mehrfach umspannende Strukturgruppe sowohl für das Binden des Liganden als auch für das Kuppen an das G-Protein wichtig. Daß slch der LH/CG- Rezeptor auch dazu entwickelt hat, eine große extrazelluläre Hormonbindungsdomäne zu besitzen, unterscheidet ihn klar von diesen anderen Rezeptoren und legt den Schluß nahe, daß (i) die die Membran siebenmal umspannende Struktur eine absolute Notwendigkeit für das Kuppeln des G-Proteins ist; (ii) sich die Translation der Ligandenbindung an das G-Protein-Kuppeln im LH/CG-Rezeptor inhärent von jener unterscheiden muß, die in anderen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren eintritt, worin sich der Ligand innerhalb der Membran einlagert; und (iii) daß sich der LH/CG-Rezeptor durch eine natürliche Rekombination zwischen einem löslichen Bindungsproteingen und einem G-Protein-gekuppelten Rezeptorgen entwickelte.
  • Die von den Autoren isolierte cDNA hybridisierte an mRNA, mit einer Gewebe- und Zellspezifität, die für eine cDNA an den LH/CG-Rezeptor zu erwarten war. Demnach zeigten Northern Blots aus Gesamt-RNA aus den Eierstöcken scheinträchtiger Ratten und aus den Eierstöcken, Hoden, der Lunge, Leber und Niere ausgewachsener Ratten nur in den Gonadengeweben eine Hybridisierung an die LH/CG-Rezeptor-DNA. Davon war die Hybridisierung an die RNA von Lutealgewebe am intensivsten. Die Hybridisierung erfolgte vorrangig an eine RNA von 4,5 kb und zu einem geringeren Ausmaß an mehrere RNAs geringerer Größe. Wenn die Hybridisierung in situ unter Verwendung von Schnitten erfolgte, die man von einer 9 Tage trächtigen Ratte gewann, beobachtete man eine intensive Hybridisierung an die Corpora lutea, wobei auch in den Theka- und Interstitialzellen etwas Hybridisierung auftrat.
  • Die Tatsache, daß isolierte cDNA für einen vollaktiven LH/CG-Rezeptor kodiert wird durch das transiente Transfizieren von menschlichen 293-Nierenzellen (ATCC CRL 1573) mit einem Expressionsvektor gezeigt, worin die LH/CG-Rezeptor-cDNA unter der Transkriptionssteuerung des Cytomegalovirus-Promotors steht. Diese Zellen (im Gegenwatz zu den scheintransfizierten 293-Zellen) binden spezifisch ¹²&sup5;I-CG mit hoher Affinität (Kd 80-160 pM) und reagieren auf cG mit erhöhter cAMP-Produktion (EC&sub5;&sub0; 40- 80 pM). Die zur Erzielung dieser Reaktionen erforderlichen CG-Konzentrationen sind mit jenen vergleichbar, die in normalen LH/CG-rezeptortragenden Zellen beobachtet werden. Weiters zeigt der durch diese cDNA kodierte Rezeptor insofern die erwartete Glykoproteinhormon-Bindungsspezifltät, als sich CG und oLH, aber nicht hTSH oder hFSH, mit hoher Affinität binden und die cAMP-Bildung stimulieren. Eine vollständigere Charakterisierung des LH/CG-Rezeptors, der durch diese cDNA exprimiert wird, erfolgt derzeit.
  • Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß die durch die Autoren klonierte cDNA für den LH/CG-Rezeptor kodiert. Außerdem liefern diese Daten einen schlüssigen Beweis, daß der LH/CG-Rezeptor ein einzelnes Polypeptid ist, das sowohl ein Hormon binden als auch ein cAMP-Produkt stimulieren kann, wenn es besetzt ist.
    • BEISPIEL 5 Durch chemische Vernetzung bestimmte Struktur des LH/CG-Rezeptors
  • Eine erste Annäherung der Größe und Organisation des LH/CG-Rezeptors der Zelloberfläche erhielt man durch die Analyse der Produkte, die sich aus der chemischen Vernetzung von ¹²&sup5;I-CG an die Zielzellen ergeben (Roche, P. et al., J. Biol. Chem. 264: 4636 (1989)). Bei dieser Vorgangsweise wurden entweder MA-10-Leydig-Tumorzellen oder Primärkulturen von Schweine-Granulosazellen mit ¹²&sup5;I-CG inkubiert, die exklusiv entweder in der alpha- oder der beta-Untereinheit markiert waren. Nach dem Waschen zum Entfernen von ungebundenem Hormon wurde das gebundene ¹²&sup5;I-CG mit der oder den hormonbindenden Komponente(n) der Zelloberfläche unter Verwendung von bifunktionalen Succinimidylestern vernetzt und die radiomarkierten vernetzten Produkte anschließend durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in der Gegenwart von Reduktionsmitteln analysiert.
  • Es stellte sich heraus, daß wenn das Hormon in den Alpha-Untereinheiten radiomarkiert wurde,Hormonrezeptorkomplexe mit 107 kDa und 132 kDa entsprechenden Molekülmassen beobachtet wurden. Unter Verwendung eines in der Beta-Untereinheit radiomarkierten Hormons wurden Komplexe beobachtet, die 117 kDa und 132 kDa entsprachen. Es wurde geschlossen, daß die Komplexe von 132 kDa, 117 kDa und 107 kDa jeweils das intakte Hormon (53 kDa), die Beta-Untereinheit (33 kDa) und die Alpha-Untereinheit (22 kDa) darstellen, die mit der gleichen zellularen Komponente von 83 kDa vemetzt sind. Somit lassen diese Untersuchungen vermuten, daß der LH/CG-Rezeptor aus einem einzigen Polypeptid mit einem Mr=83.000 sowohl in Mäuse- und in Leydig-Tumorzellen als auch in Schweine-Granulosazellen besteht.
  • Es stellte sich weiters heraus, daß die Behandlung beider Zelltypen mit Collagenase Typ I (dem zum Dispergieren von Geweben üblicherweise verwendetem Präparat) vor dem CG-Binden und Vernetzen zur beschränkten Proteolyse des LH/CG-Rezeptors führte. Somit konnten mit Collagenase behandelte Zellen CG mit normaler Affinität binden und reagierten bei erhöhter Steroidproduktion normal. Wenn jedoch ¹²&sup5;I-CG mit Collagenase-behandelten Zellen vernetzt und die Produkte auf SDS-Gelen in der Gegenwart von Reduktionsmitteln aufgelöst wurden, konnte man vernetzte Produkte mit niedrigerem Molekulargewicht beobachten (95 kDa, 75 kDa und 63 kDa). Das Auftreten dieser niedrigeren Mr-Bänder hing sowohl von der Konzentration und der Zeitdauer der Collagenase-Behandlung ab. Der Abbau des Rezeptors durch die Collagenase-Behandlung ist auf einen oder mehrere Verunreinigungen in den Collagenase-Präparaten zurückzuführen, da hochgradig gereinigte Collagenase keinerlei proteolytische Wirkungen aufwies. Interessanterweise schien der Rezeptor intakt, wenn Collagenase-behandelte Zellen mit ¹²&sup5;I-CG vernetzt und die Produkte auf SDS-Gelen in Abwesenheit von Reduktionsmitteln aufgelöst wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß Collagenase den Rezeptor einkerbt, doch daß die Gesamtstruktur (und die Bindungsaktivität) des Rezeptors trotzdem durch intramolekulare Disulfidbindungen aufrechterhalten wird.
  • Durch das Vernetzen von ¹²&sup5;I-CG mit Collagenase-behandelten Zellen und das anschließend Analysieren der Produkte in Gegenwart von Reduktionsmitteln kann man eine Peptidkarte des Rezeptors erstellen. Da die Collagenase-Behandlung sowohl von MA-10-Zellen als auch von Schweine-Granulosazellen die gleichen Rezeptorprodukte ergab, ist die Gesamtstruktur des LH/CG-Rezeptors in diesen beide Zelltypen (Leydig bzw. Granulosa) zweier unterschiedlicher Spezien (Mäuse bzw. Schweine) ähnlich.
    • BEISPIEL 6 Durch indirekte Immunausfällung ermittelte Struktur des LH/CG-Rezeptors
  • Eine zweite Vorgangsweise wurde zur Ermittlung der Gesamtstruktur des LH/CG- Rezeptors angewendet. Dabei wurde der biosynthetisch markierte Rezeptor spezifisch aus MA-10-Zellen immunausgefällt (Kim, I.-C. et al. (J. Biol. Chem. 262: 470 (1987)). Die Immunausfällung erfolgte "indirekt" durch Immunausfällen des Hormonrezeptorkomplexes unter Verwendung eines Antikörpers zu CG.
  • Somit wurden MA-10-Zellen biosynthetisch mit ³&sup5;S-Cystein markiert und danach mit unmarkiertem CG inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen zur Entfernung von nicht gebundenem Hormon wurde der Hormonrezeptorkomplex mit einem Detergens solubilisiert. Man beachte, daß die Solubilisierung des Hormon-besetzten Rezeptors ohne Hormon-Dissoziation möglich ist, da CG eine geringe oder keine Dissoziation von seinem Rezeptor zeigt, solange die Bedingungen bei 4ºC und einem neutralen pH-Wert gehalten werden. Nach dem partiellen Reinigen des Hormonrezeptorkomplexes auf einem Weizenkeim-Agglutininharz wurde er mit Anti-CG und Protein A-Sepharose ausgefällt. Zu diesem Zeitpunkt konnte der radiomarkierte Rezeptor spezifisch aus dem Immunniederschlag durch kurze Behandlung mit einem Puffer eines pH-Werts von 3 eluiert, auf einem SDS-Gel aufgelöst und durch Fluorographie visualisiert werden. Daher weist dieses Verfahren im Gegensatz zum oben beschriebenen chemischen Vernetzungsverfahren den Vorteil auf, daß man den freien Rezeptor (nicht den Hormonrezeptorkomplex) direkt auf dem SDS-Gel visualisieren kann.
  • Es wurde errechnet, daß der säureeluierte Rezeptor etwa 15.000-fach gereinigt worden war. Ein Band, das einem Protein von 93 kDa entspricht, wurde in drei unabhängigen, negativen und gleichzeitig vorgenommenen Kontrollen nicht beobachtet. Wenn daher der LH/CG-Rezeptor in den Zellen nach unten reguliert wurde, CG an der Bindungsinkubation nicht beteiligt war oder präimmunes IgG für immunes Anti-CG substituiert wurde, wurde das Protein von 93 kDa nicht beobachtet.
  • Da der immunausgefällte LH/CG-Rezeptor als Einzelprotein von 93 kDa erschien (gleichgültig, ob die Analyse in Abwesenheit oder Gegenwart von Reduktionsmitteln erfolgte), schloß man daraus, daß der Rezeptor aus einem einzigen Polypeptid bestand. Diese Ergebnisse stimmen mit jenen überein, die man beim chemischen Vernetzen erzielte, mit der Ausnahme, daß der geschätzte Mr des Rezeptors in diesen Untersuchungen 83 kDa betrug. Von den zwei Schätzungen ist es wahrscheinlicher, daß der durch indirekte Immunausfällungen ermittelte Wert von 93 kDa genauer ist, da er direkt vom Rf des freien Rezeptors (nicht des Hormonrezeptorkomplexes) auf den SDS-Gels abgeleitet wird.
  • Diese Schlußfolgerung wird durch ein Ergebnis bestätigt, das besagt, daß bei indirektem Immunausfällen des LH/CG-Rezeptors aus ³&sup5;S-Cystein-markierten Zellen, die vor dem Binden von CG mit Collagenase behandelt wurden, ein geringerer Wert von intaktem Rezeptor von 93 kDa (relativ zu den Kontrollzellen) und das Erscheinen mehrerer kleinerer Rezeptorfragmente von 66 kDa, 50 kDa und 32 kDa beobachtet wurde.
    • BEISPIEL 7 Domänenstruktur des LH/CG-R
  • Die N-terminale Hälfte der Polypeptidkette (Reste 1-341) stellt vermutlich die extrazelluläre Domäne dar (Fig.1). In Einklang mit der Glykoprotein-Beschaffenheit des LH/CG-R gibt es innerhalb dieser Domäne 6 potentielle N-verbundene Glykosylierungsstellen. Erste Hinweise deuten darauf hin, daß die meisten dieser Stellen tatsächlich glykosyliert sind, und dies kann für den Unterschied im Molekulargewicht zwischen dem natürlichen LH/CG-R (Mr 93 kDa) und dem erwarteten reifen unglykosylierten Polypeptid (Mr 75 kDa) verantwortlich sein. Die Molekulargewichte der durch Gelelektrophorese geschätzten CN Br-Fragmente stimmen tatsächlich mit einem durchschnittlichen Beitrag von 5-6 kDa pro Glykosylierungsstelle durch Oligosaccharid-Seitenketten überein.
  • Die C-terminale Hälfte des Polypeptids (Reste 342-647) enthält 7 hydrophobe Segmente von membranüberspannender Länge und weist eine Sequenzhomologie mit allen Mitgliedern der G-Protein-gekuppelten Rezeptorfamilie auf. Unter der Annahme einer transmembranen Topologie, die mit der für Rhodopsin vorgeschlagenen identisch ist (J. Nathans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4851 (1984); R. Henderson et al., Nature 257: 28 (1975); Y.A. Ovchinnikov, FEBS. Lett. 148: 179 (1982)) sind die C-terminalen 68 Reste des LH/CG-R intrazellulär angeordnet. Diese C-terminale Domäne enthält potentielle Phosphorylierungsstellen (Serin-, Threonin- und Tyrosinreste), wo eine zelluläre Steuerung der Rezeptoraktivität eintreten kann (D.R. Sibley et al., Endocrine Rev. 9: 38 (1988). Diese Domäne enthält weiters zwei Cluster basischer Aminosäuren (an Positionen 623-625 und 630-632), wodurch die Möglichkeit gegeben ist, daß der reife Rezeptor posttranslational gespalten werden kann, um an einer dieser Positionen zu enden (Posttranslationale Spaltung an KRR).
    • BEISPIEL 8 Homologie zu G-Protein-gekuppelten Rezeptoren
  • Die Tatsache, daß der LH/CG-R ein Mitglied der rasch wachsenden Familie von G- Protein-gekuppelten Rezeptoren ist, stimmte mit dem Ergebnis überein, daß LH und CG die Adenylatcyclase über ein G-Protein aktivieren (M. Hunzicker-Dunn et al., in: Luteinizing Hormone Action and Receptors, M. Ascoli, Hg., CRC Press, Boca Raton, 1985, S. 57-134). Die Homologie des LH/CG-R zu anderen Mitgliedern dieser Rezeptorenfamilie wurde durch eine Hydropathiekarte oberflächlich aufgezeigt und durch eine Ausrichtung mit mehreren Mitgliedem dieser Familie über die sieben vermeintlichen transmembranen Regionen detailliert dargestellt (Fig.2). Diese Domäne des LH/CG-R zeigt eine im allgemeinen niedrige doch signifikante Sequenzähnlichkeit mit anderen Mitgliedern. Die Ähnlichkeit ist mit Rhodopsin und dem Substanz K- Rezeptor am größten (22%) und mit Rezeptoren klassischer Neutrotransmitter am geringsten, z.B. mit Muscarinacetylcholin und Serotonin (18-20%) (Rhodopsin: J. Nathans et al., Cell 34: 807 (1983); SKR: Y. Masu et al., Nature 329: 836-838 (1987); β- 2AR: R.A.F. Dixon et al., Nature 321: 75 (1986); P.R. Schofield et al., Nucl. Acids Res. 15: 3636 (1987); 5HT-2: D.B. Pritchett et al., EMBO J. 7: 4135 (1988); Muscarinrezeptor: T. Kubo et al., Nature 321: 411 (1986)).
  • Es stellte sich heraus, daß eine Anzahl kurzer Sequenzen in allen Mitgliedern stark konserviert war und innerhalb der vermeintlichen transmembranen Helices und intrazellulären Schleifenregionen auftritt. Eine dieser konservierten Stellen überspannt 6- 7 Reste, die sich am C-terminalen Ende der dritten zytoplasmischen Schleife befinden. Die Länge dieser Schleife zeigt zwischen den verschiedenen Rezeptoren eine starke Variation, wobei sie in LH/CG-R am kürzesten ist. Die C-terminale Region dieser Schleife wurde auf der Grundlage der Analyse von Mutanten- und chimeren Rezeptoren mit dem G-Protein-Kuppeln in Verbindung gebracht (B.F. Dowd et al., J. Biol. Chem. 263. 15985 (1988); B.K. Kobilka et al., Science 240: 1310 (1988); C.D. Strader et al., J. Biol. Chem. 262: 16439 (1988); H. Kuhn, Prog. Retinal Res. 3: 123 (1984)). Diese Stelle ist nicht sequenzenkonservierter zwischen LH/CG-R und anderen Rezeptoren, die an G&sub5; kuppeln, als zwischen Rezeptoren, die erwiesenermaßen mit anderen G-Proteinen zusammenwirken.
    • BEISPIEL 9 Die extrazelluläre Domäne
  • Die extrazelluläre vermeintliche Hormonbindungsdomäne wies mehrere signifikante Sequenzmerkmale auf. Das auffälligste davon war eine 14-fach imperfekt wiederholte Sequenzgruppe von etwa 25 Resten, wobei die C-terminalen 6 Wiederholungen bezüglich der Länge und Sequenz am wenigsten konserviert waren (Fig.3a). Ähnliche Strukturen wurden in einer Vielzahl anderer Proteine ermittelt und als Leucin-reiche Wiederholungen bezeichnet (N. Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1906 (1985) (LRG); J. Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5615 (1987) (GP Ib); C. Hashimoto et al., Cell 52: 269 (1988) (Toll); T. Kataoka et al., Cell 43: 493 (1985) (Adenylatcyclase, Hefe); T. Krusius et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83: 7683 (1986) (PG40)).
  • Das der extrazellulären Domäne ähnlichste Protein ist PG40, ein Proteoglycan, das in großen Mengen in extrazellulären Matrizen von Bindegeweben vorhanden ist. Ein weiteres ähnliche Wiederholungen enthaltendes Protein ist das Plättchenglykoprotein Ib, ein glykolsyiertes Membranprotein, das sich erwiesenermaßen zwei glykosylierte Polypeptide bindet, den von Willebrand-Faktor und Thrombin. Weitere Beispiele sind so unterschiedliche Polypeptide wie Hefe-Adenylatcyclase und ein Drosophila- Entwicklungsgenprodukt, Toll.
  • Obwohl man bei Proteinen, die solche Leucin-reichen Wiederholungen enthalten, keine gemeinsamen Funktionen festetellen kann, können Mitglieder dieser Familie sowohl mit hydrophoben als auch mit hydrophilen Oberflächen zusammenwirken, wobei durch die Wiederholungsstrukturen gebildete amphipathische Heilices möglicherweise vermittelnd eingreifen. Die extrazelluläre Domäne des LH/CG-R kann sowohl für die Hormonbindung als auch für die Wechselwirkung mit den Transmembrandomänen verantwortlich sein, um die Signaltransduktion zu vermitteln.
  • Ein weiteres Merkmal, das man innerhalb der extrazellulären Domäne beobachtet, ist eine Stelle, die durch 10 Reste definiert ist, die mit einer Sequenz in Sojabohnen-Lectin identisch ist (L.O. Vodkin et al., Cell 34: 1023 (1983); D.J. Schnell et al., J. Biol. Chem. 262: 7220 (1987) (Diflorus) (siehe Fig.1). Die Stelle kann an der Erkennung des glykosylierten Hormons und dem funktionalen Kuppeln des Rezeptors an GS beteiligt sein, wobei dies maximal nur mit den glykosylierten Formen von LH und CG erreicht wird (Sairam et al., J. Biol. Chem. 264: 2409 (1989)). Während sich das entglykosylierte Hormon mit hoher Affinität an den Rezeptor bindet, führt diese Wechselwirkung zu einer geringen oder überhaupt keiner Stimulierung von Adenylatcyclase.
    • BEISPIEL 10 Funktionale Expression des LH/CG-R
  • Um zu bestätigen, daß die klonierte cDNA tatsächlich für den LH/CG-R kodiert, wurde ein als pCLHR bezeichneter Expressionsvektor konstruiert, worin die vermeintliche Rezeptorkodierungssequenz unter der Transkriptionssteuerung des Cytomegalovirus stand (D.L.Eaton et al., Biochemistry 25: 8343 (1986)).
  • Genauer gesagt wurde der Expressionvektor pCLHR durch das Einsetzen der gesamten Kodierungsregion der klonierten cDNA und zusätzlicher auf einem Eco R1-Fragment enthaltener Flankierungsregionen (Nukleotide 43-2559, siehe Fig.1) in den pCIS-Vektor konstruiert (D.L. Eaton et al., Biochemistry 25: 8343 (1986)).
  • Exponential wachsende 293-Zellen wurden transient (C. Chen et al., Mol. Cell Biol. 7: 2745 (1987)) mit pCLHR transfiziert. 42 Stunden nach der Transfektion wurden intakte Zellen hinsichtlich ¹²&sup5;I-CG-Bindung (Fig.4A) oder CG-stimulierter cAMP-Produktion (Fig.4B) geprüft.
  • Für den Assay der ¹²&sup5;I-CG-Bindung (Fig.4A) wurde jede Schale viermal mit 3 ml warmem Waymouth MB752/1-Medium gewaschen, das einen Mangel an Natriumbikarbonat aufweist und 20 mM Hepes und 1 mg/ml Rinder-Serumalbumin enthält, und danach in 2 ml desselben gefüllt. Nach 2 Stunden bei 4ºC wurden Aliquote von hochgradig gereinigtem CG (CR-123, 12.780 IU/mg), die nach I.-C. Kim et al. (J. Biol. Chem. 261: 3807 (1986)) iodiert wurden, alleine oder gemeinsam mit 50 IU Roh-CG (zur Bestimmung nichtspezifischer Bindung) hinzugefügt. Nach 24 Stunden bei 4ºC wurden die Bindungsmedien und die Zellen zu Kunststoffröhren auf Eis befördert. Die Zellen wurden zentrifugiert, einmal mit 2 ml kaltem 150 mM NaCl, 20 mM Hepes mit 1 mg/ml Rinder-Serumalbumin gewaschen und zentrifugiert. Zellpellets wurden in einem Gammazähler gezählt.
  • Zur Bestimmung von CG-stimulierter cAMP-Bildung (Fig.4B) wurde jede Schale viermal mit 3 ml warmem Waymouth MB 752/1 Medium gewaschen, das 1 mg/ml Rinder- Serumalbumin enthielt, und in 2 ml dieses Mediums gefüllt, das 0,5 mM 3-Isobutyl-1- methylxanthin enthielt. Nach einer 15-minütigen Präinkubation bei 37ºC wurden Aliquote von hochgradig gereinigtem CG hinzugefügt; die Inkubation wurde 30 min lang bei 37ºC fortgesetzt. Nach dem Entfernen der Assaymedien wurden die Zellen in 1,5 ml kalter 1 N Perchlorsäure gesammelt, die 1 mg/ml Theophyllin enthielt. Die Zellen wurden durch rasches Frieren lysiert, aufgetaut und dann zentrifugiert. Der Überstand wurde neutralisiert und dann hinsichtlich cAMP geprüft, wie dies bereits beschrieben wurde (D.L. Segaloff et al., J. Biol. Chem. 256: 11420 (1981)).
  • Wie aus Fig.4A ersichtlich, konnten sich intakte transfizierte Zellen, die höheren Konzentrationen von ¹²&sup5;I-CG ausgesetzt waren (über Nacht bei 4ºC) spezifisch in einer konzentrationsabhängigen und sättigbaren Weise an das Hormon binden. Es wurde bei keiner Konzentration des getesteten 125I-CG eine spezifische Bindung an nicht transfizierte Zellen festgestellt. Eine parallele Zellgruppe wurde 30 min lang bei 37ºC mit variierenden Konzentrationen von CG in Gegenwart des Phosphodiesterase- Inhibitors 3-Isobutyl-1-methylxanthin inkubiert. Die Ergebnisse sind bezüglich der nichtspezifischen Bindung korrigiert und stellen den mittleren +/- Bereich von Doppelbestimmungen dar.
  • Wie aus Fig.4B ersichtlich, zeigten transfizierte Zellen im Gegensatz zu nichttransfizierten Zellen, die als Reaktion auf CG keine höheren cAMP-Werte aufwiesen, eine konzentrationsabhängige und sättigbare Zunahme von intrazellulärem cAMP, wenn sie CG ausgesetzt waren. Die gezeigten Ergebnisse stellen den mittleren +/- Bereich von Doppelbestimmungen dar.
  • Die CG-Konzentrationen, die zum Bewirken einer Zunahme der CG-Bindung und cAMP-Anhäufung in den mit pCLHR transfizierten Zellen erforderlich sind, sind mit jenen vergleichbar, die diese Reaktionen in LH/CG-R-tragenden Gonadenzellen hervorrufen (M.E. Pereira et al., J. Biol. Chem. 262: 6093 (1988); K. Buettner et al., J. Biol. Chem. 259: 15078 (1984)). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß die klonierte cDNA für ein intaktes und funktionales LH/CG-R-Protein kodiert.
    • BEISPIEL 11 Gewebe- und zellspezifische Expression von LH/CG-R-mRNA
  • Nothern Blots aus RNA verschiedener Rattengewebe wiesen eine Gewebespezifität von LH/CG-R-mRNA-Expression auf (Fig.5).
  • Genauer gesagt wurde die Gesamt-RNA aus den Eierstöcken unreifer und scheinträchtig gemachter Ratten (N. Rosemblit et al., Endocrinology 123: 2284 (1988)) oder aus Geweben von 60 Tage alten Ratten gewonnen, wie dies durch C. Auffrey et al. (Eur. J. Biochem. 107: 303 (1980)) beschrieben ist. Die RNA wurde auf 1% Agarosegels aufgelöst, die Formaldehyd enthielten, und auf eine Nylonmembran geblottet. In Einklang mit den Anweisungen des Herstellers wurde die Membran prähybridisiert und dann über Nacht bei 42ºC unter Verwendung eines kerb-translatierten, ³²P-markierten pGEM-3Z-Vektors (Promega) hybridisert, der die durch PCR-erzeugte LH/CG-R-DNA enthielt. Der Blot wurde viermal in 2xSSC und 0,1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen (5 min pro Waschung). Der resultierende Blot wurde 6 Stunden lang (Fig.5, Feld A) oder über Nacht (Fig.5, Feld B) einen Röntgenfilm bei -70ºC unter Anwendung von Verstärkungsgittern ausgesetzt.
  • Ein deutliches Band, das einer mRNA von 4,4 kb entsprach, wurde in RNA beobachet, die aus den Eierstöcken scheinträchtiger Ratten sowie aus den Eierstöcken und Hoden ausgewachsener Ratten gewonnen wurde. Kleinere hybridisierende Spezien wurden auch während längerer Zeiträume des Ausgesetztseins beobachtet. Der relative Überfluß der mRNA-Spezies von 4,4 kb war in den Eierstöcken scheinträchtiger Ratten deutlich höher als in den Eierstöcken nicht trächtiger ausgewachsener weiblicher Ratten oder in den Hoden ausgewachsener Ratten. Dieses Ergebnis stimmt mit den relativen Werten von ¹²&sup5;I-CG-Bindung überein, die man in diesen Geweben beobachtete (M. Ascoli et al., Endocrine Rev. 10: 27 (1989)). Keine LH/CG-mRNA wurde in RNA aus Rattenlunge, -leber oder -niere festgestellt.
  • Zur Analyse von zellspezifischer Expresson von LH/CG-R-mRNA erfolgte eine in situ- Hybridisierung der LH/CG-R-cDHA an Gewebescheiben aus 9 Tage alten Eierstöcken trächtiger Ratten.
  • Genauer gesagt erfogten die Gewebefixierung und die in situ-Hybridisierung nach dem Verfahren von Wilcox et al. (J.N. Wilcox et al., J. Clin. Invest. 82: 1134 (1988)) mit den folgenden Modifizierungen. Vor der Hybridisierung wurden die Abschnitte mit 4% Paraformaldehyd (10 min) und Proteinase K (5-10 ug/ml) über einen Zeitraum vom 5-10 min behandelt. Die Prähybridisierung erfolgte 1 Stunde lang bei 42ºC in 100 ul Hybridisierungspuffer, der 50% Formamid, 0,1 M NaCl, 20 mM Tris, pH-Wert 8,0, 5 mM EDTA, 1 X Denhardt'sche Lösung, 10% Dextransulfat und 10 mM DTT enthielt. Die Hybridisierung wurde durch die Zugabe von 600.000 cpm einer markierten Sonde in 20 ml Puffer eingeleitet und über Nacht bei 55ºC fortgesetzt. ³&sup5;S-markierte sense- und anti-sense-Sonden wurden aus PCR-erzeugter LH/CG-R-DNA gewonnen, die in einen pGEM;-3Z-Vektor (Promega) kloniert war. Die spezifische Aktivität der Sonden betrug etwa 100 Ci/mmol. Die Belichtungszeit betrug etwa 1-3 Wochen (die gezeigten Mikrographen haben eine Belichtungszeit von 2 Wochen).
  • Eine deutliche Hybridisierung des radiomarkierten antisense-Strangs konnte an die Corpora lutea und die Theka- und Interstitialzellen festgestellt werden. Man beobachtete keine Hybridisierung an Granulosazellen, was mit dem unreifen Zustand der nichtluteinisierten Follikel übereinstimmte. Die beobachtete Verteilung und die relative Intensität hybridisierender mRNA (d.h. die intensive Färbung der Corporea lutea und die weniger intensive Färbung von Theka- und Interstitialzellen) stimmt mit der bereits beschriebenen ¹²&sup5;I-CG-Autoradiographie im Ratteneierstock überein (A.J. Zeleznik et al., Endocrinology 95: 818 (1974)). Diese Ergebnisse sind ein weiterer Beweis dafür, daß die klonierte cDNA für den in spezifischen Untergruppen von Eierstockzellen exprimierten funktionalen LH/CG-R kodiert.
    • BEISPIEL 12 Strukturmerkmale des Rezeptors
  • Zusammenfassend wurde ein cDNA-Molekül, das für den Ratten-luteal-LH/CG-Rezeptor (LH/CG-R) kodiert, unter Verwendung einer DNA-Sonde isoliert, die in einer Polymerasekettenreaktion mit Oligonukleotid-Primern auf der Grundlage von Peptidsequenzen von gereinigtem Rezeptorprotein gebildet wurde. Wie anhand der cDNA-Sequenz vorhergesagt, besitzt der LH/CG-Rezeptor ein Signalpeptid mit 26 Resten, eine extrazelluläre Domäne mit 341 Resten, die eine innere Wiederholungsstruktur aufweist, die für Mitglieder der Leucin-reichen Glykoproteinfamilie (LRG-Familie) charakteristisch ist, sowie eine Region von 333 Resten, die sieben membranüberspannende Segmente enthält. Die letztere Region weist eine Sequenzähnlichkeit mit allen Mitgliedern der G-Protein-gekuppelten Rhodopsin/b- Adrenergin-Rezeptorfamilie auf. Somit kann das LH/CG-R-Gen durch Rekombination von LRG- und G-Protein-gekuppelten Rezeptorgenen enstanden sein. Zellen, die konstruiert wurden, um LH/CG-R-cDNA zu exprimieren, binden CG mit hoher Affinität und zeigen erhöhte cAMP-Werte, wenn sie einem Hormon ausgesetzt sind. Wie durch die Northern-Analyse und in situ-Hybridisierung gezeigt wird ist die Cognat-mRNA von 4,4 kb prominent im Ratteneierstock lokalisiert.
  • Somit wurde das molekulare Klonieren und Exprimieren einer cDNA voller Länge für den Ratten-Luteal-LH/CG-R erreicht. Diese cDNA kodiert für ein einziges Polypeptid, das Hormon bindet und Adenylatcyclase stimuliert. Die Lokalisierung der Rezeptor- mRNA im Eierstock entspricht jener der Hormonbindung. Die abgeleitete Aminosäuresequenz deutet darauf hin, daß der LH/CG-R evolutionär mit anderen G- Protein-gekuppelten Rezeptoren verwandt ist, da er sieben membranüberspannende Regionen enthält. Im Gegensatz zu solchen Rezeptoren enthält jedoch der LH/CG-R eine große extrazelluläre Domäne, die vermutlich an der Ligandenbindung beteiligt ist.
  • Funktionale und morphologische Hinweise deuten darauf hin, daß die durch dei klonierte cDNA kodierte Proteinsequenz den Ratteneierstock-LH/CG-R darstellt. Dieses Protein weist sowohl die Strukturmerkmale eines Leucin-reichen Proteoglykans (extrazelluläre Domäne) als auch eines G-Protein-gekuppelten Rezeptors auf. Andere Mitglieder der G-Protein-gekuppelten Rezeptorfamile binden kleine Liganden (d.h. Serotonin oder Acetylcholin). Während das Binden solcher Liganden vermutlich an Stellen eintritt, die durch die Anordnung von sieben transmembranen Helices gebildet werden (T. Frielle et al., Proc. Natl. Acad. Scie. USA 85: 9494 (1988); R.A.F. Dixon et al., Nature 326: 73 (1987); S.K.F. Wong et al., J. Biol. Chem. 263: 7925 (1988); E.A. Dratz et al., Trends Biol. Sci. 8: 128 (1983)), binden sich LH und CG vermutlich an eine Stelle des extrazellulären Teils dieses Rezeptors (K.P. Keinanen et al., Biochem. J. 239: 83 (1986); I.-C. Kim et al., J. Biol. Chem. 261: 3807 (1986)). Somit unterscheiden die große extrazelluläre Domäne und der spezifische Mechanismus von Hormonvermittelter Transduktion den LH/CG-R von anderen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren. Dieser Rezeptor kann durch die Rekombination von Genen enstehen, die für ein Hormonbindungs-Glykoprotein und einen siebenmal membranüberspannenden Protorezeptor kodieren.
    • BEISPIEL 13 Isolierung von FSH-Rezeptor-(FSH-R)-cDNA
  • Polyadenylierte RNA, die aus Rattenhoden-Sertoli-Zellen isoliert wurde, diente als Schablone für Umkehrtranskriptase. Die resuliterende cDNA diente zur Konstruktion einer Sammlung in λgt10. Ein Aliquot (1 x 10&sup6; Klone) wurde auf Klone gescreent, die eine Sequenzähnlichkeit mit zwei Sonden abgeleitet aus der LH/CG-R-cDNA aufwiesen (Nukleotide 1-483 und 1499-2604). Verschiedene positive Klone wurden isoliert und geklonte cDNAs sequenziert, wie dies durch F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) beschrieben ist, wobei davor ein Subklonieren in M13- Vektoren erfolgte (J. Vieira und J. Messing, Meth. Enzymol., 153: 3-11 (1987)). Die Nukleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen dieses Rezeptors sind in Fig.6 dargestellt.
  • Der Translationsinitiationscodon an Position 1 definiert den Beginn eines offenen Leserahmens mit 2076 Nukleotiden, der eine N-terminale Signalsequenz von 17 Resten gefolgt von einer weitgehend hydrophilen Domäne von 348 Resten einer vermutlich extrazellulären Anordnung spezifiziert. Diese Domäne enthält drei N-verbundene Glykosylierungsstellen. Daran schließt sich eine Struktur mit 264 Resten an, die sieben Transmembransegmente umfaßt. Diese Segmente sind das typische Merkmal von G- Protein-gekuppelten Rezeptoren. Ähnlich zu anderen derartigen Rezeptoren befindet sich der C-Terminus des FSH-R mit 63 Resten vermutlich intrazellulär und enthält mehrere Aminosäuren (Ser, Thr, Tyr), deren Phosphorylierung die Rezeptoraktivität regulieren kann (K. Palczewski et al., Biochemistry, 27: 2306-2313 (1988); J.L. Benovic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2797-2801 (1986)). Diese Reste sind jedoch nicht Teil von Konsens-Phosphorylierungsstellen wie in anderen Rezeptoren. Für den reifen FSH-R werden 675 Aminosäuren vorhergesagt (Molekulargewicht von 75 K) und daß er ein integrales Membranglykoprotein darstellt.
    • Vergleich zwischen FSH-R und LH/CG-R
  • Hinsichtlich der vorgeschlagenen funktionalen Ähnlichkeiten ist es sehr aufschlußreich, die Gonadotropin-Rezeptoren FSH-R und LH/CG-R zu vergleichen (Fig.7). Beide Moleküle weisen eine ähnliche Größe und die gleiche Strukturgestaltung auf. Hinsichtlich der Primärstruktur weisen die extrazellulären Domänen eine Sequenzähnlichkeit von etwa 50% auf, während die durch die sieben transmembranen Segmente definierten Domänen eine Sequenzidentität von 80% besitzen. Die Bereiche der höchsten Sequenzdivergenz umfassen den N-Terminus, eine Region von 40 Resten vor dem ersten Transmembransegment und die 30 Reste, die den C-Terminus bilden.
  • Wie bei der extrazellulären Domäne des LH/CG-R erwähnt, kann man davon ausgehen, daß die homologe Domäne im FSH-R aus 14 imperfekt replzierten Einheiten von jeweils etwa 20 Resten besteht (Fig.8). Die dieser Wiederholung zugrundeliegende Gruppe läßt sich auch in anderen Proteinen feststellen und ist als Leucin-reiche Wiederholung bekannt (L. Patthy, J. Mol. Biol. 198: 567-577 (1987). Ein charakteristisches Merkmal von Mitgliedern der Familie Leucin-reicher Wiederholungen ist eine angebliche Neigung, sowohl mit hydrophilen als auch mit hydrophoben Proteinoberflächen wechselzuwirken (J.A. Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5615-5619 (1987). Diese Eigenschaft kann hinsichtlich der Funktion des extrazellulären Domäne von Gonadotropin-Rezeptoren bedeutsam sein.
  • Die Ausrichtung der extrazellulären Domänen beider Rezeptoren (Fig.7) zeigt, daß die Wiederholungen mit der höchsten Sequenzendivergenz (Wiederholungen 12 und 13) auch die im Verhältnis zur zugrundeliegenden Gruppe am wenigsten konservierten sind. Insbesondere weist diese Region zwischen den Gonadotropinrezeptoren und dem kürzlich charakterisierten TSH-Rezeptor eine unterschiedliche Länge auf (M. Parmentier et al., Science, 246: 1620-1622 (1989); F. Libert et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 5: 1250-1255 (1989); Y. Nagayama et al., Biophys. Res. Comm., 165: 1184-1190 (1989)) und ist zwischen den Glykoproteinhormonrezeptoren aus verschiedenen Spezien sequenzvariabel (F. Libert et al., oben), was darauf hindeutet, daß sie wahrscheinlich nicht an der Hormonerkennung beteiligt ist. Die Anordnung zeigt weiters acht konservierte Cysteinreste, von denen sich zwei in benachbarten Positionen befinden. Interessanterweise befinden sich mehrere dieser Reste in gut konservierten Regionen, die 13 und 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren umfassen. Da diese Cysteine auch im TSH-R konserviert sind (M. Parmentier, et al., oben; F. Libert et al., oben; Y.Nagayama et al., oben), scheint die Bildung von Disulfidbindungen für eine konformationale Integrität der großen extrazellulären Domäne von Glykoproteinhormonrezeptoren entscheidend zu sein.
  • Ein unterschiedliches Muster der Sequenzkonservierung läßt sich auch für die sieben Transmembran-Segmente feststellen. Während TMIII und TMVII in hohem Maße konserviert sind, enthalten TMIV und TMV viele Substitutionen. Obwohl die gesamte Sequenzähnlichkeit mit anderen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren gering ist (K.C. Mc Farland et al., Science, 245: 494499 (1989)) sind der Asparaginsäurerest innerhalb von TMII und das Asparagin innerhalb von TMVII, zwei konservierte Reste in G-Proteingekuppelten Rezeptoren (K.C. McFarland et al., oben; C.D. Strader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 4384-4388 (1987)), auch in den beiden Gonadotropinrezeptoren vorhanden. Das gleiche gilt für Prolinreste in TMIV, TMVI und TMVII und die zwei Cysteinreste, von denen man annimmt, daß sie eine Disulfidbrücke zwischen der zweiten und dritten extrazellulären Schleife in vielen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren bilden (R.A.F. Dixon et al., EMBO J., 6: 3269-3275 (1987)).
  • In den Gonadotropinrezeptoren ist die dritte durch TMV und TMVI flankierte intrazelluläre Schleife kurz und ziemlich divergent. Das niedrige Ausmaß an Sequenzähnlichkeit in dieser Region ist so wie bei Untertypen anderer G-Proteingekuppelter Rezeptoren (E.G. Peralta et al., EMBO J. 6: 3923-3929 (1987)). In einigen dieser Rezeptoren scheint die Region, die durch TMV und VI begrenzt wird und einen Teil davon umfaßt am Kuppeln an das G-Protein beteiligt zu sein (B.K. Kobilka et al., Science, 240: 1310-1316 (1988); R.A.F. Dixon et al., Nature, 326: 73-77 (1987)). Eine Sequenz von acht Aminosäuren am C-terminalen Ende dieser intrazellulären Schleife ist zwischen beiden Gonadotropinrezeptoren gut konserviert (E.G. Peralta et al., oben). Eine ähnliche Sequenz, die am Kuppeln an G&sub5; beteiligt ist, befindet sich im β- Adrenerginrezeptor (R.A.F. Dixon et al., Nature, oben). Die Wechselwirkung mit dem G-Protein kann über eine amphiphile α-Helixstruktur eintreten (C.D. Strader et al., FASEB J. 3: 1825-1832 (1989)), die durch diese Peptidsequenz gebildet wird. Eine Helixrad-Analyse, die an der konservierten Sequenz von acht Resten in den FSH und LH/CG-Rezeptoren erfolgte, zeigt, daß die geladenen Seitenketten an einer Seite und die hydrophoben auf der gegenüberliegenden Seite der Helix angeordnet sind, wie die für die homologe Region von α&sub2;- und β&sub2;-Adrenerginrezeptoren vorausgesagt wird (C.D. Strader et al., FASEB J., oben).
    • BEISPIEL 14 Funktionale Expression von FSH-Rezeptor-(FSH-R) cDNA
  • Hochgradig gereinigtes oFSH (NIDDK-o-FSH-17; 20 U/mg), hCG(CR-123; 12.780 IU/mg) und hTSH (NIDDK-hTSH-1-6; 17 IU/Mg) wurden den Autoren dankenswerterweise vom National Hormone and Pituitary Programm des NIDDK (N.I.H.) zur Verfügung gestellt.
  • Der Expressionsvektor pCFSH-R wurde durch das Einführen der gesamten Kodierungsregion der geklonten cDNA, die auf einem EcoRI-Bam HI-Fragment (Nukleotide -77 bis 2095) vorhanden war, in den pCIS-Vektor konstruiert (C.M. Gorman et al., Virology, 171: 377-385 (1989)). Exponential wachsende 293-Nierenzellen menschlicher Embryonen (ATCC CRL 1573) in 34 mm-Schalen wurden mit diesem Expressionsvektor transfiziert (C. Chen und H. Okayama, Mol. Cell. Biol., 7: 2745-2751 (1987)). Nach 42 Stunden wurden intakte Zellen hinsichtlich hormonstimulierter cAMP- Bildung geprüft. Jede Schale wurde einmal mit 3 ml warmem DMEM-Medium gewaschen, das 10% fötales Kalbsserum enthielt, und in 1 ml serumfreies DMEM- Medium gefüllt, das mit 25 mM HEPES, pH-Wert 7,4, gepuffert war, das 0,1 mM 3- Isobutyl-1-methylxanthin enthielt. Nach einer 15-minütigen Inkubationszeit bei 37ºC wurde hochgradig gereinigtes Glykoproteinhormon (oFSH, hTSH oder hCG) hinzugefügt und die Inkubation 30 Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Der Assay wurde durch rasches Frieren und Auftauen der Zellen in flüssigem Stickstoff abgebrochen, und dann wurde 1,2 ml kaltes Ethanol in jede Schale gefüllt. Die Zellbruchstücke und das ausgefällte Protein wurden durch Zentrifugieren (10 min; 13.000 x g) entfernt, und 5 ul oder 50 ul des Überstandes wurde unter Verwendung eines Amersham-Kits hinsichtlich cAMP geprüft. Wie aus Fig.9 und Tabelle 3 ersichtlich, zeigen die den klonierten Rezeptor exprimierenden Zellen eine FSH-abhängige und sättigbare Zunahme von intrazellularem cAMP. Untransfizierte und scheintransfizierte Zellen wiesen diene Reaktion nicht auf. TABELLE 3 Adenylcyclase-Stimulierung in FSH-R exprimierenden Zellen Hormon (25nM) cAMP (p Mol /10&sup6;zellen) none Legende zu Tabelle 3: 293-Zellen wurden unter Verwendung des pCFSH-R- Expressionskonstrukts transient transfiziert und in der Gegenwart von 26 nM mehrerer Glykoproteinhormone inkubiert. cAMP, das sich während der ersten 30 min hormonaler Stimulierung anhäuft, spiegelt die Spezifität des FSH-R zu seinem natürlichen Liganden wieder.
  • Die FSH-Konzentration, die zur halbmaximalen Stimulierung dieser Reaktion erforderlich ist (2-3 ng/ml, -80 pM) ist mit jener für hCG und seinen Rezeptor vergleichbar (K.C. McFarland et al., oben) und liegt deutlich innerhalb des Wertebereichs, über den bezüglich des FSH-Rezeptors berichtet wurde (H. Abou-Issa und L.E. Reichert, Jr., J. Biol. Chem., 251: 3326-3337 (1976)). Im Gegensatz dazu führte hCG selbst bei Konzentrationen von bis zu 25 nM zu keiner cAMP-Reaktion in FSH-R exprimierenden Zellen (Tabelle 3). Aus dem Fehlen an Daten, die ausgehend von rekombinant gebildeten FSH und LH gewonnen wurden, schließen die Autoren, daß die Rezeptorerkennung verschiedener Gonadotropine selektiv ist.
    • Diskussion
  • Der FSH-R weist Strukturähnlichkeiten mit dem LH/CG-R auf. Obwohl einige Untersuchungen durch andere Forscher nahelegten, daß die LH/CG- und die FSH- Rezeptoren aus mehreren Untereinheiten bestehen (L.E. Reichert, Jr und B- Dattatreyamurty, Biology of Reproduction, 40:13-26 (1989); J. Shin und T.H. Ji, J. Biol. Chem., 260: 12822-12827 (1985); R.A. Smith et al., J. Biol. Chem., 260: 14297-14303 (1985); J. Shin und T.H. Ji, 260: 14020-14025 (1985); R.A. Smith et al., J. Bio. Chem., 261: 9850-9853 (1986); J. Shin und T.H. Ji, J. Biol. Chem., 260: 12828-12831 (1985), besprochen in M. Ascoli und D.L. Segaloff, Endocrine Rev., 10: 27-44 (1989), zeigten biochemische Studien des LH/CG-R, daß er aus einem einzigen Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 92 K besteht, wenn er auf SDS-Gels in der Gegenwart oder Abwesenheit von Disulfid-reduzierenden Mitteln analysiert wird (N. Rosemblit et al., Endocrinology, 123: 2284-2289 (1988)). Da gezeigt wurde, daß der LH/CG-R ohne Schwierigkeiten in kleinere Fragmente proteolysiert werden kann (siehe die Zusammenfassung in M. Ascoli und D.L. Segaloff, oben), kann man vernünftigerweise postulieren, daß der FSH-R ähnlich proteolyseanfällig ist und daß dies für die unterschiedlichen Berichte über seine Struktur verantwortlich ist. Das molekulare Klonieren und die funktionale Expression der cDNAs für den LH/CG-R (K.C. McFarland et al., oben) und den FSH-R verdeutlichen, daß die Gonadotropin-Rezeptoren tatsächlich einzelne Polypeptide sind.
  • Als Ausdruck eines einzigartigen Mechanismus der Rezeptoraktivierung sind sowohl der FHS-R als auch der LH/CG-R durch das Vorhandensein einer großen, glykosylierten Domäne einer vermeintlichen extrazellulären Anordnung gekennzeichnet, die auf eine Struktur aufgepfropft ist, die sieben Transmembransegmente enthält und eine Homologie mit G-Protein-gekuppelten Rezeptoren aufweist. Die gleiche Strukturgestaltung kennzeichnet auch den TSH-R (M. Parmentier et al., oben; F. Libert et al., oben; Y. Nagayama et al., oben), ein weiteres Mitglied der Glykoproteinhormon- Familie. Im Vergleich zu anderen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren läßt diese charakteristische Gestaltung vermuten, daß die extrazelluläre Domäne für die Erkennung und das Binden der dimeren Hormone verantworlich ist.
  • Über die funktionale Bedeutung der inneren Wiederholungstruktur der extrazellulären Domäne der Glykoproteinhormonrezeptoren kann man lediglich mutmaßen. Es ist wahrscheinlich, daß die amphiphile Beschaffenheit der Wiederholungen die Doppeleigenschaft der Wechselwirkung mit einem Hormon und Transmembran- Domänen verleiht. Ein solches Zusammenwirken scheint für die Rezeptoraktivierung entscheident, die für die meisten anderen G-Protein-gekuppelten Rezeptoren durch das Binden eines kleinen Liganden an eine räumlich definierte Stelle innerhalb der sieben Transmembransegmente erreicht wird. Angesichts des evolutionär konservierten grundlegenden Mechanismus der Rezeptoraktivierung ist es durchaus möglich, daß ausgewählte Am inosäurerest-Seitenketten der Gonadotropine die üblichen kleinen Liganden substituieren. In diesem Modell werden die aktivierenden Reste durch das Binden des Hormons an die extrazelluläre Domäne korrekt positioniert. In einer Variation dieses Modells können Reste der extrazellulären Domäne selbst beim Binden des Hormons wesentliche Stellen in den Transmembransegmenten kontaktieren.
  • Ein wichtiger Faktor bei der Betrachtung möglicher Mechanismen, durch welche das Binden von Glykoproteinhormonen an ihre jeweiligen Rezeptoren die Aktivierung des G&sub5;-Proteins bewirkt, ist die Rolle der Hormonkohlenhydratgruppen in diesem Aktivierungsprozeß (M.R. Sairam, FASEB J., 3: 1915-1926 (1989); M.M. Matzuk et al., J. Biol. Chem., 264: 2409-2414 (1989)). Obwohl sich deglykosylierte Glykoproteinhormone mit hoher Affinität an ihre Rezeptoren binden, verursachen sie eine geringe oder überhaupt keine Aktivierung der cAMP-Herstellung (M.M. Matzuk et al., oben). Der Begriff von Antihormonen wurde vorgeschlagen, um die FSH- antagonistischen Auswirkungen von natürlich vorkommenden Glykosylierungsvarianten von FSH zu beschreiben (K.D. Dahl et al., Science, 239: 72-74 (1988)).

Claims (9)

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge an Hormonrezeptor-Molekül enthält, worin das Hormonrezeptor-Molekül aus der aus dem LH/CG-Rezeptor, dem FSH-Rezeptor und dem TSH-Rezeptor bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Hormonrezeptor-Molekül eine extrazelluläre Domäne des Rezeptor-Moleküls enthält.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des LH/CG-Hormonrezeptor- Moleküls enthält.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das LH/CG- Hormonrezeptor-Molekül zumindest eine Sequenz enthält, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des FSH-Hormonrezeptor- Moleküls enthält.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge des TSH-Hormonrezeptor- Moleküls enthält.
7. Verwendung des LH/CG-Hormonrezeptor-Moleküls zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fruchtbarkeit, Brustkrebs, Prostatakrebs, gutartiger Prostatahypertrophie, vasomotorischer Instabilität, Osteoporose oder polyzystischer Ovarialerkrankung.
8. Verwendung des FSH-Hormonrezeptor-Moleküls zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fruchtbarkeit, Brustkrebs, Prostatakrebs, vasomotorischer Instabilität, Osteoporose oder polyzystischer Ovarialerkrankung.
9. Verwendung des TSH-Hormonrezeptor-Moleküls zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Graves'schen Krankheit, von gutartiger Prostatahypertrophie, Hypothyroidismus oder Schilddrüsenkrebs.
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