JP3181582B2 - Ｔｓｈ受容体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、1989年９月８日に提出されたコーン（Con
e）によるTSH受容体と題された米国特許第404,899号の
一部継続出願であり、ここに参考として含める。

本発明は、哺乳類の甲状腺刺激ホルモン（TSH、別名
チロトロピン）受容体をコードする核酸、および精製さ
れた哺乳類TSH受容体に関するものである。

TSH受容体はグラビス病（Graves'disease）と呼ばれ
るヒトの自己免疫疾患に関与すると考えられているタン
パク質である。この疾患の患者ではTSH受容体に対する
抗体が作られていると考えられている。これらの自己抗
体は現在のところ、放射性標識を施したTSHを与え、TSH
受容体を含むと考えられるブタの粗抽出膜へのTSHの結
合阻害を検出することによって検出される。

ロス・スミス（Ross Smith）他（Endocrine Reviews
9:106,1988）は、TSH受容体の構造を報告し、このよう
な受容体をコードするDNAクローンは、TSH受容体のアミ
ノ酸配列を決定し、それを利用してオリゴヌクレオチド
プローブを用いて遺伝子ライブラリ中のクローンを同定
することによって単離できることを予測した。受容体は
わずかに0.001％の純度にしか精製されていない（すな
わち、1gのタンパク質中で10μｇのTSH受容体）。

発明の概要 出願人は少なくとも２種類の哺乳類TSH受容体をコー
ドする核酸の単離、および精製された哺乳類TSH受容体
を大量に産生することを可能にする発現システムの構築
に成功した。このような精製受容体は、競合的ラジオイ
ムノアッセイやELISA試験などの簡単な抗体アッセイに
よって、グラビス病や他の甲状腺異常の患者の自己抗体
の検出に有用である。

第１の局面において本発明は、哺乳類TSH受容体の免
疫学的あるいば生物学的活性を有するタンパク質をコー
ドする精製された核酸に関するものである。精製核酸は
精製cDNA、あるいは該核酸を含む精製ベクターで有り得
る。関連した局面では、本発明は哺乳類TSH受容体の免
疫学的または生物学的活性を持つ、例えば組み換え体
の、タンパク質に関するものである。

“免疫学的活性”とは、TSH受容体に対する自己抗体
と免疫複合体を選択的に形成する能力を意味する。“精
製された”とは、混入している核酸や、タンパク質や炭
水化物などの他の細胞成分から核酸またはタンパク質が
分離されており、それにより受容体をコードする天然の
核酸が得られることを意味する。核酸がすべての細胞成
分から分離された均質な溶液として与えられるか、調製
液中に存在する主要な核酸であることが最も望ましい。
本発明での使用に十分なTSH受容体を与えるように核酸
からの発現を起わせるように細胞内に存在するベクター
内で核酸が与えられることがより望ましい。“組み換え
体”とは、組み換えDNA技術によってベクター内や、ゲ
ノムの通常は生じない位置に連結された核酸からタンパ
ク質が発現されることを意味する。精製されたタンパク
質が、調製物中の全タンパク質の少なくとも10％、ある
いは50％から90％の純度で存在することが望ましい。

哺乳類TSH受容体の生物学的活性とは、哺乳類のTSH受
容体に通常備わっている活性、すなわち、TSHを認識
し、相互作用を行うタンパク質の能力である。本分野の
技術者にはよく知られているように、アデニル酸シクラ
ーゼを活性化するなどの、TSH受容体の他の生物学的活
性も含むことが望ましい。

望ましい態様においては、TSH受容体はヒトに存在す
る受容体である；核酸配列は、天然の哺乳類TSH受容
体、最も望ましくはヒトTSH受容体と同一のアミノ酸配
列をコードする核酸配列を有する；あるいは、該核酸
は、天然の哺乳類TSH受容体と比較して保存されたアミ
ノ酸置換しか含まないタンパク質をコードしている。こ
のような保存されたアミノ酸置換は本分野の技術者には
よく知られており、たとえばバリンからグリシンあるい
はロイシンへの置換、正の電荷を持つアミノ酸から正の
電荷を持つ別のアミノ酸への置換、あるいは負の電荷を
持つアミノ酸から別の負の電荷を持つアミノ酸への置換
などを含む。このような置換はコードされているTSH受
容体の生物学的活性に顕著に影響を与えない；すなわ
ち、置換型の生物学的活性は天然型の少なくとも75％の
活性を持つ。

本発明のタンパク質は、患者の血清中に抗TSH受容体
抗体が存在することを確認するために使用可能である。
本方法は、上述の精製TSH受容体を与え、血清を受容体
と接触させることによる。受容体と血清との反応は、該
血清中に抗TSH抗体が存在することを示唆する。本方法
は、ELISA、ウェスタンブロット、あるいは競合結合ア
ッセイなどの、免疫を検出するための既知の免疫学的方
法をすべて含む。

本発明は、抗TSH受容体抗体の存在に関する患者の検
査を迅速に行うのに有用な哺乳類TSH受容体を十分量与
えるものである。本発明はまた、該タンパク質の配列の
分析を可能にするために十分な量の受容体タンパク質を
与えるものである。このような配列は、自己免疫抗体を
阻害するような小さな相同ペプチドの考案を可能にする
ための、タンパク質上の特異的エピトープの決定を補助
するものとなるであろう。これらのペプチドは、グラビ
ス病などの患者の甲状腺の過剰刺激を阻害するであろ
う。本発明はまた、哺乳類TSH受容体に結合するTSHのア
ゴニストまたはアンタゴニストの開発を可能にするのに
必要な道具を与える。これらのアンタゴニストは、TSH
のレベルが上昇することによる甲状腺機能高進症を防ぐ
のに有用であろう。

別の局面では、本発明は試験中のTSHの存在を決定す
るための方法に関するものである。この方法は、生物学
的に活性を持つTSH受容体をコードするDNAを有する哺乳
類細胞で、アッセイ条件下でDNAからTSH受容体を発現す
る細胞を与えること；該細胞と試料を接触させ、試料中
のTSHを細胞と接触させること；接触過程の前後に細胞
内環状アデノシン１リン酸のレベルを測定することを含
む。接触過程前と比較して、接触過程後の環状アデノシ
ン１リン酸のレベルが上昇していることは、細胞内にTS
Hが存在することを示唆している。

本発明のその他の特徴および利点は、以下の望ましい
態様、および請求の範囲から明らかになるであろう。

望ましい態様の説明 図面について簡単に説明する。

図面 第１図はラットLH受容体プローブのヌクレオチド塩基
配列を示す図である。

第２図は、ヒトLH受容体cDNAのヌクレオチド塩基配列
および予想されるアミノ酸配列を示す図である。

第３図は、ヒトLH受容体をコードする遺伝子の構造お
よび、予想されるアミノ酸配列の模式図である。

第４図は、ヒトLH受容体DNA配列に基づいた縮重オリ
ゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド塩基配列を示す
図である。

第５図は、ウシおよびヒトTSH受容体の部分的なヌク
レオチド塩基配列を示す図である。枠で囲んだ配列は、
塩基配列決定の際のコンプレッションによる誤りの可能
性がある領域を示す。

第６図は、ヒトTSH受容体cDNAのヌクレオチド塩基配
列および予想されるアミノ酸配列を示す図である。

第７図は、ヒト甲状腺のヘマトキシリンおよびエオシ
ン染色切片に重ねて、ヒトTSH受容体の放射性標識した
アンチセンス転写産物によって得られたオートラジオグ
ラフフィーによるシグナル（明るい点）を示す暗視野顕
微鏡写真（倍率75X）を示す。

第８図はpATH3−hTSHR発現ベクターの模式図である。

第９図は、インドール酢酸の非存在下（−）および存
在下（＋）におけるtrp E−TSH受容体融合タンパク質
（小さな矢印）の発現を示すポリアクリルアミドゲルの
写真である。

第10図は、用いたホルモン濃度の函数として、細胞内
環状アデノシン１リン酸（cAMP）のレベルを示すグラフ
である。

TSH受容体 本発明で有用なTSH受容体は、哺乳類から単離された
このようなすべての受容体、あるいはこのような受容体
の生物学的活性を持つすべてのタンパク質を含む。この
ようなタンパク質は、上述のようにひとつ以上のアミノ
酸が保存的に修飾されている、天然のTSH受容体に由来
するタンパク質を含む。このような修飾は、例えば組み
換えDNA技術などの標準的な方法によってなされる。一
般的にこのような受容体は、受容体をコードする遺伝子
を単離し、受容体タンパク質全長を発現するのに障害と
なり得るイントロンDNAを除いたのちにその遺伝子を発
現ベクターに連結することによる組み換えDNA技術によ
って発現される。このような発現ベクターは、本分野の
技術者にはよく知られている方法で細菌、菌類、昆虫、
あるいは哺乳類細胞内で発現される、細菌、菌類、昆
虫、および哺乳類発現ベクターを含む。生成された哺乳
類TSH受容体も、上述の組み換え哺乳類TSH受容体の一つ
に対する抗体を調製し、それを天然のTSH受容体のイム
ノアフィニティー精製に用いることにより単離すること
ができる。一般に、TSH受容体の収量が非常に少ないた
め、このような方法は望ましくない。

目的のTSH受容体タンパク質がクローニングされ、そ
のアミノ酸配列が決定されると、受容体の生物学的活性
を持つタンパク質が標準的な方法によってデザインされ
得る。例えば、標準的な方法によってオリゴヌクレオチ
ドを合成し、標準的な発現ベクターに挿入して天然のTS
H受容体の断片を発現させることができる。これらの断
片は、受容体タンパク質が目的の生物学的活性を持つか
どうかを決定するために、標準的な方法でスクリーニン
グすることができる。例えば、合成ペプチドがTSH受容
体に対する抗体と結合できるかどうかをアフィニティー
クロマトグラフィー、ウェスタンブロット解析、あるい
はその同等な解析法によって決定することが可能であ
る。結合できる断片は本発明で有用である。同様に、発
現されたTSH受容体、あるいは上述のように精製された
ものを、トリプシンなどのアミノ酸配列を小断片に特異
的に切断する酸素を用いて切断することができる。これ
らの断片が本発明の方法において有用であるかどうかを
決定するために、合成ペプチド断片に対してと同様な方
法で検査を行うことができる。

以下に述べるのは、哺乳類TSH受容体をコードする遺
伝子、精製哺乳類TSH受容体を供給するためのベクター
中の該遺伝子の発現の一例を示すものである。この実施
例は本発明に制限を与えるものではなく、多数の他の哺
乳類TSH受容体が同様な方法によって、あるいなアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下参照）
への寄託物として提供されたクローン化DNAを用いるこ
とによって単離され得ることは、本分野の技術者には理
解されるであろう。これらの寄託物中のDNAは哺乳類DNA
の既存の、あるいは新しく構築されたライブラリのスク
リーニングに用いられ、哺乳類TSH受容体の一部または
全部をコードするクローンの同定を行うことができる。
このようなライブラリは哺乳類の甲状腺に存在するRNA
からcDNAライブラリとして構築することが望ましい。

実施例：ヒトおよびウシTSH受容体 ラット黄体形成ホルモン（LH）受容体遺伝子の622ヌ
クレオチド断片を、生物学研究所（ポピュレーション・
カウンセル、ニューヨーク、ニューヨーク、10021）の
デボラ・セガロフ（Deborah Segaloff）、およびハイデ
ルベルグ大学のピーター・シーバーグ（Peter Seebur
g）から得た。このDNA断片をグラビス病疾患の甲状腺か
ら単離したRNAから構築したλgt11 cDNAライブラリのプ
ローブとして用いた。このプローブのヌクレオチド塩基
配列を第１図に示す。

cDNAライブラリは一般に以下のように構築した。甲状
腺のRNAを標準的なグアニジウム／チオシアネート法を
用いて単離し、ガブラー（Gubler）とホフマン（Hoffma
n）の方法によって逆転写を行った。得られたcDNAをG50
ゲル濾過カラムを用いてサイズ選択し、1kb以上の長さ
のcDNAを選択した。cDNAをEcoR Iメチラーゼによってメ
チル化し、EcoR Iリンカーに連結し、EcoR Iで消化し
た。得られたDNAをEcoR I処理したλgt11 DNAに連結し
た。得られたλDNAを大腸菌1090株で増幅した。

ラットLH遺伝子断片を32P−dCTPで標識し、ニトロセ
ルロースフィルター上でλgt11ライブラリを含むプレー
トを、30％ホルムアミド、1M NaCl、42℃の低ストリン
ジェンシーでスクリーニングした。続いてフィルターを
２×SSC、50℃の低ストリンジェンシーで洗浄した。

２つのクラスのクローンが検出され、一方のクラスは
プローブと強い反応を示し、他方のクラスは弱い反応を
示した。強く反応するプラークを常法により３回精製
し、制限酵素マッピングおよびDNA配列決定により、４
つが同一の遺伝子のオーバーラップする部分をコードす
ることが明らかになった。遺伝子の５′末端の600ヌク
レオチドがラットLH受容体と高い相同性を示した。さら
なる解析により、いくつかのイントロンを残して、ヒト
LH受容体タンパク質の全長をコードするcDNAを決定し
た。そのヌクレオチド塩基配列を第２図に示す。コード
されるタンパク質のアミノ酸配列、分子量、および等電
点はこの配列から常法によって算出することができる。
cDNAはイントロンDNAも含む。RNA保護実験、ノザン分
析、およびポリメラーゼチェインリアクション実験によ
り、このクローンにコードされるmRNAが甲状腺、精巣、
子宮、およびグラビス病の甲状腺、甲状腺細胞系で発現
されていることが示された。RNAは甲状腺で発現されて
いるが、不完全にスプライシングされている。したがっ
て、このクローンは甲状腺発現特異的DNAをコードして
いるのではない。

TSH受容体をコードするクローンを単離するために、
ふたつの縮重オリゴヌクレオチドプローブを合成し、そ
の一方は上述のクローニングされたヒトLH受容体DNAの
膜通過領域IIIと相同性を持ち、他方はLH受容体DNAの膜
通過領域IVと相同性を持つようにした。これらの領域お
よびプローブの位置を第３図に示す。これらの領域はcD
NA中で約400ヌクレオチド離れている。オリゴヌクレオ
チドは常法で合成し、精製した；その配列を第４図に示
す。

ヒトのグラビス病の甲状腺、およびウシ甲状腺試料か
ら全RNAを単離した。これら２つの試料由来の全RNA10μ
ｇを別々にモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素
（市販）を用いて逆転写した。第１のcDNA鎖は50μｌの
反応液で合成し、得られたcDNAを５μｌを上述の合成オ
リゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼチェインリアク
ションに使用した。この反応は全体積100μｌで、５μ
ｌのcDNA、500ピコモルの各オリゴヌクレオチド、およ
びシータス社（エメリービル、CA）による標準緩衝液と
ヌクレオチドを含む。この反応液をTaq DNAポリメラー
ゼの存在下で94℃で１分、50℃で２分、72℃で３分処理
した。この50℃から94℃の加熱および冷却サイクルを30
回繰り返した。この時点で、増幅産物は検出されなかっ
た。得られた反応液のうち５μｌを取り、この方法を繰
り返した。この時点で、DNA産物が検出された。骨肉
腫、精巣、子宮、黒色腫、胎盤から単離した全RNAを用
いた反応液ではこのような産物は見いだされなかった。
したがって、このDNA産物は甲状腺特異的であることが
示された。得られた産物を常法により沈殿させ、再懸濁
し、Hind IIIとEcoR Iで消化した。

EcoR I Hind IIIをベクターpBS^-（ストラタジーン
社、ラホラ、CA）にサブクローニングし、大腸菌を形質
転換した。得られたベクターについて、サンガーのジデ
オキシ法により塩基配列決定を行った。ヒトおよびウシ
cDNAの双方の塩基配列を決定し、約84％の相同性のある
タンパク質をコードしていることが見いだされた。これ
らの仮の配列を第５図に示す。これに対して、該DNAは
ラット、ブタ、およびヒトLH受容体との相同性は68％に
すぎない。

ポリメラーゼチェインリアクションによって得られた
断片をベクターから切り出し、³²Pで標識した。これら
の断片をつぎに、上記のλgt11ライブラリの高ストリン
ジェンシーでのスクリーニングのためのプローブとして
用いた。条件は、1M NaClの存在下で50％ホルムアミ
ド、42℃で15−20時間、次にニトロセルロースフィルタ
ーを２×SSC中で20−25℃で15分、１×SSC中で68℃で45
分、0.1×SSC中で68℃で45分洗浄した。LH受容体クロー
ンを検出した場合と比較して、強くハイブリダイズする
プラークがより高頻度で検出された。これらのプラーク
のうち12個を３回精製し、６個から精製DNAを単離し、E
coR I制限酵素分析を行った。これらのクローンのうち
４つは約4.2kbのインサートを含んでいた。これらのイ
ンサートをpBS^-ベクターに挿入した。

得られたクローンを用いたノザンブロット分析から、
該DNAはグラビス病患者の甲状腺および冷結節試料中で
発現されたRNAにのみハイブリダイズし、精巣、子宮や
他の組織の場合にはハイブリダイズしなかった。DNAは
約4.2kbのRNAとハイブリダイズし、ヒトTSH受容体の全
長クローンであることが示された。このRNAは２から2.5
kbの３′非翻訳配列を持ち、約50塩基の５′非翻訳配列
を持つ。一つのクローン、TR.12.6−１（hTSH受容体）
はDNA配列が決定され、ヒトTSH受容体cDNA全長を含むこ
とが示された（第６図）。

このクローンがヒトTSH受容体をコードしていること
のさらなる証明は、TSHに反応することが知られている
甲状腺濾胞細胞に、アンチセンスヒトTSH受容体プロー
ブが特異的にハイブリダイズすることを示したin situ
ハイブリダイゼーション組織化学によって与えられた
（第７図）。簡単に述べると、正常な甲状腺濾胞細胞の
８μｍクリオスタット切片をin situハイブリダイゼー
ション用に調製した。ヒトTSH受容体をコードする1kbの
cDNAを、³⁵S標識アンチセンス転写産物の調製に用い
た。組織切片を界面活性剤とプロテアーゼで前処理し、
報告されているように（ホーフラー（Hoefler）他、His
tochem.J.18:5597,1986）３×10⁵CPM（比活性約10⁸cpm/
μｇ）のプローブと、ハイブリダイゼーション緩衝液中
で16時間、42℃でインキュベートした。

上述のヒトおよびウシ、あるいは他の哺乳類由来のcD
NAを常法によって発現させ、大量のTSH受容体を供給す
ることが可能である。たとえば、上述のcDNAを、pATH−
１、２、または３などのtrp E融合プラスミドに挿入
し、Trp Eタンパク質との安定なハイブリッドタンパク
質を形成させることができる。あるいは、サイトメガロ
ウイルスや、レトロウイルスベクターなどの哺乳類発現
系にcDNAを挿入することもできる。

以下に示すのは、TSH受容体を発現させる方法の一例
である。Pst I部位（ヌクレオチド346）からHind III部
位（ヌクレオチド1213）までのヒトTSH受容体のアミノ
末端コード配列をPst I/Hind IIIで消化したpATH3に連
結した。得られたプラスミド、pATH3−HTSHR（第８図）
は、20kDのヒトTSH受容体タンパク質のアミノ末端に融
合した約37kDの大腸菌Trp Eタンパク質を含む66kDの融
合タンパク質を発現する。pATH3−HTSHRで形質転換した
大腸菌DH5α株を選択的M9培地で、Trp E遺伝子のインデ
ューサーであるインドール酢酸40μg/μｌの非存在下あ
るいは存在下で２時間培養した。細菌ペレットをSDSロ
ーディング緩衝液中で破砕し、その1/10を10％ポリアク
リルアミド ラエムリゲルで電気泳動した（第９図）。

使用法 上述のように、TSH受容体をコードする核酸は、多量
のTSH受容体を発現させるために使用することができ
る。たとえば、高レベルの発現は、バキュロウイルスベ
クターpVL941、大腸菌ベクターpATH3、哺乳類ベクターp
LJなどでなされる。このようなタンパク質は、グラビス
病で見いだされる自己抗体の検出に有用である。これに
よりこれらの患者の甲状腺の状態を決定することがで
き、患者の疾患の進行が示唆される。この検査は、たと
えば計量棒アッセイなどのELISA型で行われる。この検
査は放射性標識したTSHおよびTSH受容体を用いた競合的
結合アッセイ型でも行うことができる。このようなアッ
セイは非常に敏感であり、このような抗体を検出する既
存の方法よりもより効果的に行われる。

発現されたタンパク質はグラビス病患者の抗体で認識
されるエピトープを決定するのに有用である。この分析
は、たとえばクローニングされたTSH受容体の一部を発
現させてTSH受容体の部分的な断片を合成させるか、上
述のように発現させた受容体タンパク質を断片化するこ
となどの常法によって行うことができる。このような抗
体に認識される領域が決定されたら、これらの断片をイ
ムノアッセイ法に用いることができる。さらに、エピト
ープの決定は、タンパク質のひとつ以上のエピトープ部
分を形成している可能性のあるひとつ以上のアミノ酸を
置換あるいは欠失させたタンパク質を与えるような標準
的な分子生物学的技術を用いてクローニングされた遺伝
子を操作することいよっても行える。

該タンパク質およびその一部は、グラビス病患者ある
いはその他の甲状腺異常を持つ患者のひとつ以上の症状
を軽減するために十分な投与量で、薬学的に使用可能な
化合物として投与するという治療用としても有用であ
る。一般に、このような投与は患者のキログラムあたり
１から1000マイクログラムの間の量で行われる。

自己抗体の活性を阻害してTSHのアゴニストとして働
き、甲状腺の刺激を阻害するような小さなペプチドもデ
ザインすることができる。他の小さなペプチドは、自己
抗体を阻害してTSHアンタゴニストとして機能するもの
としてデザインすることも可能である。さらに、TSHがT
SH受容体に結合することを阻害して甲状腺の高進した活
性を阻害するようなTSHのアンタゴニストも構築するこ
とができる。

TSHアッセイ 以下にTSHに関する二つのアッセイを述べる。第一の
アッセイ法は、通常はTSH受容体を含まない細胞中でTSH
受容体を発現させることに基づいている。この細胞はTS
Hと接触すると環状アデノシン１リン酸の発現が増加
し、試料中のTSH量の指標として検出することができ
る。

このアッセイでは、ヒトTSH受容体をコードするDNAを
哺乳類レトロウイルスベクターpLJのBamH IからSal I部
位に挿入する。得られたベクターを次にヒト293細胞に
トランスフェクトし、抗生物質G418の存在下で選択する
ことにより、ベクターを含むクローン性細胞系を単離す
る。このようなトランスフェクションにより、細胞はTS
Hに反応性となり、TSH処理後にアデニレートシクラーゼ
の活性化とcAMPの蓄積によって測定する。したがって、
これらの細胞系はホルモンTSHに関する非常に敏感なア
ッセイ系を与えるものである。培養液中の細胞あるいは
細胞膜調製物をTSHを含むと考えられる試料に接触さ
せ、得られたアデニレートシクラーゼ活性を定量し、試
料中のTSH濃度を算定するためにTSHの標準希釈曲線のア
デニレートシクラーゼ活性と比較する。1ng/ml、あるい
は0.1ng/mlという低濃度でも本アッセイで検出可能であ
る。本アッセイは、上述のcDNAにコードされたTSH受容
体が生物学的に活性を持ち、TSHに反応性ではなかった
細胞系にTSH特異的な反応性を付与することを示してい
る。これらの細胞系は天然TSHだけでなく、組み換えTSH
にも反応性を示す。

特定的には、tr.12 cDNA全長を含むレトロウイルス発
現ベクターpLJ（コーマン（Korman）他、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84:2150,1987）をヒト293細胞にトランスフ
ェクトし、hCG、hFSH、またはhTSHで処理後、³H−cAMP
置換アッセイにより60時間後の細胞内cAMP濃度を測定し
た。第10図を参照すると、100ng/mlのhFSHまたはhCGは
ほとんど効果がないのに対し、等量のhTSHによって細胞
内cAMPが６倍以上上昇した。最大の1/2の細胞内cAMP濃
度は約60ピコモルのhTSHで得られた。いくつかの実験で
は、100ng/mlのhTSHの投与によって細胞内cAMPが15倍に
上昇した。hTSH−ｒインサートを含まない、レトロウィ
ルスベクターのみでトランスフェクションした場合に
は、100ng/ml TSHで細胞を処理しても、バックグラウン
ド以上には細胞内cAMPは上昇しなかった。同様な方法を
用いてヒトLH/CG受容体の発現を試みたが、どの糖タン
パク質ホルモンで処理してもcAMPの上昇は見られなかっ
た。この原因としては、たとえば、tr.13に見いだされ
た欠失、あるいはおそらく非生殖腺293細胞系でLH/CG−
Ｒのイントロンの不十分な除去、などのあらゆる多数の
問題が考えられる。

本発明のTSH受容体は、競合的結合アッセイによるTSH
の測定に使用可能である。本アッセイではTSH受容体、
またはその一部はTSHに結合可能であり、支持マトリッ
クスに固定される。固定された受容体を、放射性または
蛍光標識で印をつけた過剰のTSHと、結合反応が平衡に
達するのに十分な時間インキュベートする。結合してい
ないTSHを洗浄過程で除去し、受容体を検体試料とイン
キュベートする。この第２の結合過程が平衡に達した
ら、固定した受容体を再度洗浄する。検体試料中のTSH
によって置換された標識TSHを、検体試料中に存在するT
SHの指標として用いる。精製したTSH受容体を用いた、
他のTSHアッセイも、本分野の技術者によって開発され
得る。

寄託 以下のDNAは、ブダペスト協定に従い、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（12301パ
ークローンドライブ、ロックビル、メリーランド2805
2）に1989年９月６日に寄託され、以下の寄託番号を与
えられている。

寄託物 受託番号 tr.12.6−１（hTSH受容体） 40651 tr.13.T35（hLH受容体） 40652 出願人の受託人、ニュー・イングランド・メディカル
・センター・ホスピタル社は、ATCCが寄託物の永続性を
可能にする保管所であり、特許が認めえられた場合には
公衆によって容易に入手されることを断言する。寄託さ
れたものへの公衆の入手可能性に関するすべの規制は、
特許が認可されることにより不可逆的に取り除かれるで
あろう。37 CFR 1.14および35 USC 122に従い、特許局
長官によって決定されたものには、特許出願の継続中で
も寄託物は入手可能となる。寄託された物質は、寄託さ
れた微生物試料の最も最近の供給要求があった後少なく
とも５年間、およびどのような場合にも、寄託の日から
最低30年間、あるいは特許の有効期間のいずれか長いほ
うの期間は生きた、混入のない状態で保存される必要が
ある。出願人の受託人は、寄託物の状態により、試料を
保管所が供給できなくなった場合には要求されれば寄託
物を交換する義務があることを認める。

他の態様は以下の請求の範囲で述べられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，（1987）Ｖｏｌ．330, ｐ．667−670 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ, （1982）Ｖｏｌ．110，Ｎｏ．４，ｐ. 1381−1391 Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ ｉｃａ，（1987）Ｖｏｌ．115，（ｓｕ ｐｐｌ．281）ｐ．166−172 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｃｔｉｏ ｎｓ ｏｆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ, （1985）Ｖｏｌ．12，ｐ．457−512 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/12 C07K 14/72 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)

Claims (29)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】図６に記載されたヌクレオチド配列： または図６に記載されたヌクレオチド配列に相補なヌク
   レオチド配列を含む、精製された核酸。
2. 【請求項２】請求項１記載の核酸を含むベクター。
3. 【請求項３】請求項１記載の核酸が導入された細胞。
4. 【請求項４】請求項２記載のベクターが導入された細
   胞。
5. 【請求項５】ストリンジェントな条件下で請求項１記載
   の核酸にハイブリダイズし、そして哺乳類の甲状腺刺激
   ホルモン（TSH）受容体の活性を有する蛋白質をコード
   する、精製された核酸。
6. 【請求項６】請求項５記載の核酸を含むベクター。
7. 【請求項７】請求項５記載の核酸が導入された細胞。
8. 【請求項８】請求項６記載のベクターが導入された細
   胞。
9. 【請求項９】ストリンジェントな条件が、50％ホルムア
   ミド中での42℃における1M NaCl存在下での15−20時間
   のインキュベーション、続く20℃から25℃における２×
   SSC中での15分間の洗浄、続く68℃における１×SSC中で
   の45分間の洗浄、続く68℃における0.1×SSC中での45分
   間の洗浄を含む、請求項５記載の精製された核酸。
10. 【請求項１０】核酸がcDNAである、請求項５記載の核
    酸。
11. 【請求項１１】図６に記載されたアミノ酸配列： を有する甲状腺刺激ホルモン（TSH）受容体タンパク質
    をコードする、精製された核酸。
12. 【請求項１２】請求項11記載の核酸を含むベクター。
13. 【請求項１３】請求項11記載の核酸が導入された細胞。
14. 【請求項１４】請求項12記載のベクターが導入された細
    胞。
15. 【請求項１５】核酸がcDNAである、請求項２記載の核
    酸。
16. 【請求項１６】天然に生じるヒトTSH受容体と結合する
    細胞成分を含まず、そして図６に記載されたアミノ酸配
    列： を有する、ヒトTSH受容体の生物学上活性な調製物。
17. 【請求項１７】受容体が86,738の分子量を有する、請求
    項16記載の調製物。
18. 【請求項１８】受容体が6.55の等電点を有する、請求項
    17記載の調製物。
19. 【請求項１９】受容体が6.55の等電点を有する、請求項
    16記載の調製物。
20. 【請求項２０】調製物が、ヒトTSH受容体をコードする
    外来DNAを導入した哺乳類細胞を含むことにより、該細
    胞が生物学上活性なTSH受容体を発現する、請求項17記
    載の調製物。
21. 【請求項２１】受容体が86,738の分子量を有する、請求
    項20記載の調製物。
22. 【請求項２２】受容体が6.55の等電点を有する、請求項
    21記載の調製物。
23. 【請求項２３】受容体が6.55の等電点を有する、請求項
    20記載の調製物。
24. 【請求項２４】患者の血清中の抗−ヒトTSH受容体抗体
    の存在を検出する方法であって、以下の工程： 天然に生じるヒトTSH受容体と結合する細胞成分を含ま
    ず、そして図６に記載されたアミノ酸配列： を有する、ヒトTSH受容体の生物学上活性な調製物を用
    意し、 ヒトTSH受容体調製物を血清と接触させ、そして 血清中の抗体の存在の指標として血清の反応を検出する
    ことからなる方法。
25. 【請求項２５】受容体が86,738の分子量を有する、請求
    項24記載の調製物。
26. 【請求項２６】受容体が6.55の等電点を有する、請求項
    25記載の調製物。
27. 【請求項２７】受容体が6.55の等電点を有する、請求項
    24記載の調製物。
28. 【請求項２８】試料中のヒトTSHの存在を検出する方法
    であって、以下の工程： 図６に記載されたアミノ酸配列： を有する生物学上活性なヒトTSH受容体をコードする外
    来DNAを含む哺乳類細胞を用意し、 細胞を試料と接触させることにより、試料中のTSHを細
    胞に接触させ、そして 上記接触工程の前後の細胞間の環状アデノシン１リン酸
    のレベルを測定するが、その際、接触工程後の環状アデ
    ノシン１リン酸のレベルの上昇が試料中のTSHの存在の
    指標であること からなる方法。
29. 【請求項２９】核酸のヌクレオチド配列が天然に生じる
    核酸のヌクレオチド配列に相当する、請求項５記載の精
    製された核酸。