JPH05501952A

JPH05501952A - Ｔｓｈ受容体

Info

Publication number: JPH05501952A
Application number: JP51304090A
Authority: JP
Inventors: コーン，ロジャー
Original assignee: ニューイングランド・メディカル・センター・ホスピタルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-09-08
Filing date: 1990-09-07
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2016-07-03
Also published as: WO1991003483A1; CA2066263C; EP0493434A1; JP3181582B2; CA2066263A1; EP0493434A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＴＳＨ受容体発明の背景本発明は、１９８９年９月８日に提出されたコーン（Ｃａｎｅ）によるＴＳＨ受容体と題された米国特許第＋０４，０９号の一部継続出願であり、ここに参考として含める。

本発明は、哺乳類の甲状腺刺激ホルモンＣＴＳＨ１別名チロトロピン）受容体をコードする核酸、および精製された哺乳類ＴＳＨ受容体に関するものである。

ＴＳＨ受容体はグラビス病（Ｇｒａｖｅｓ’　ｄｉｓｅｘｓｅ）と呼ばれるヒトの自己免疫疾患に関与すると考えられているタンパク質である。この疾患の患者ではＴＳＨ受容体に対する抗体が作られていると考えられている。これらの自己抗体は現在のところ、放射性標識を施しｆ：ＴｓＨを与え、ＴＳＨ受容体を含むと考えられるブタの粗抽出膜へのＴＳＨの結合阻害を検出することによって検出される。

ロス・スミス（ｇｏｓｓ　Ｓｍ１ｔｈ）他（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　９：１０６．１９０）は、ＴＳＩ＋受容体の構造を報告し、このような受容体をコードするＤＮＡクローンは、ＴＳＩＩ受容体のアミノ酸配列を決定し、それを利用してオリゴヌクレオチドプローブを用いて遺伝子ライブラリ中のクローンを同定することによって単離できることを予測した。受容体はわずかに０．００１％の純度にしか精製されていない（すなわち、Ｉｇのタンノくり質中で１０ μｇのＴＳＨ受容体）。

発明の概要出願人は少なく七も２種類の哺乳類ＴＳＨ受容体をコードする核酸の単離、および精製されだ哺乳類ＴＳＨ受容体を大量に産生ずることを可能にする発現システムの構築に成功した。このような精製受容体は、競合的ラジオイムノア・ツセイやＥＬＩＳＡ試験などの簡単な抗体アッセイによって、グラビス病や他の甲状腺異常の患者の自己抗体の検出に有用である。

第１の局面において本発明は、哺乳類ＴＳＥＩ受容体の免疫学的あるいは生物学的活性を有するタンパク質をコードする精製された核酸に関するものである。精製核酸は精製ｃＤＮＡ、あるいは該核酸を含む精製ベクターで有り得る。関連した局面では、本発明は哺乳類ＴＳＨ受容体の免疫学的または生物学的活性を持つ、例えば組み換え体の、タンパク質に関するものである。

“免疫学的活性”とは、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体と免疫複合体を選択的に形成する能力を意味する。“精製されたでは、混入している核酸や、タンパク質や炭水化物などの他の細胞成分から核酸まＩ；はタンパク質が分離されており、それにより受容体をコードする天然の核酸が得られることを意味する。核酸がすべての細胞成分から分離された均質な溶液として与えられるか、調製液中１こ存在する主要な核酸であることが最も望ましい。本発明での使用に十分なＴＳＨ受容体を与えるように核酸からの発現を行わせるように細胞内に存在するベクター内で核酸が与えられることがより望ましい。１組み換え体”とは、組み換えＤＮＡ技術によってベクター内や、ゲノムの通常は生じない位置に連結された核酸からタンパク質が発現されることを意味する。精製されたタンパク質が、調製物中の全タンパク質の少なくとも１０％、あるいは５０％から９０％の純度で存在することが望ましい。

哺乳類ＴＳ［ｉ受容体の生物学的活性とは、哺乳類のＴＳＨ受容体に通常備わっている活性、すなわち、ＴＳＨを認識し、相互作用を行うタンパク質の能力である。本分野の技術者にはよく知られているように、アデニル酸／クラーゼを活性化するなどの、ＴＳＩＩ受容体の他の生物学的活性も含むことが望ましい。

望ましい態様においては、ＴＳＩＩ受容体はヒトに存在する受容体である：核酸配列は、天然の哺乳類ＴＳＩＩ受容体、最も望ましくはヒ）　ＴＳＨ受容体と同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する：あるいは、該核酸は、天然の哺乳類ＴＳＨ受容体と比較して保存されたアミノ酸置換しか含まないタンパク質をコードしている。このような保存されたアミノ酸置換は本分野の技術者にはよく知られており、たとえばバリンからグリシンあるいはロイシンへの置換、正の電荷を持つアミノ酸から正の電荷を持つ別のアミノ酸への置換、あるいは負の電荷を持つアミノ酸から別の負の電荷を持つアミノ酸への置換などを含む。このような置換はコードされているＴＳＩＩ受容体の生物学的活性に顕著に影響を与えない、すなわち、置換型の生物学的活性は天然型の少なくとも７５％の活性を持つ。

本発明のタンパク質は、患者の血清中に抗ＴＳＨ受容体抗体が存在することを確認するために使用可能である。本方法は、上述の精製ＴＳＨ受容体を与え、血清を受容体と接触させることによる。受容体と血清との反応は、該血清中に抗ＴＳＩＩ抗体が存在することを示唆する。本方法は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンプロット、あるいは競合結合アッセイなどの、免疫を検出するための既知の免疫学的方法をすべて含む。

本発明は、抗ＴＳＢ受容体抗体の存在に関する患者の検査を迅速に行うのに有用な哺乳類ＴＳＨ受容体を十分量与えるものである。本発明はまた、該タンパク質の配列の分析を可能にするために十分な量の受容体タンパク質を与えるものである。このような配列は、自己免疫抗体を阻害するような小さな相同ペプチドの考案を可能Ｉ：するだめの、タンパク質上の特異的エピトープの決定を補助するものとなるであろう。これらのペプチドは、グラビス病などの患者の甲状腺の過剰刺激を阻害するであろう。本発明はまた、哺乳類ＴＳＨ受容体に結合するＴＳＩＩのアゴニストまたはアンタゴニストの開発を可能にするのに必要な道具を与える。これらのアンタゴニストは、ＴＳＥｌのレベルが上昇することによる甲状腺機能高進症を防ぐのに有用であろう。

別の局面では、本発明は試料中のＴＳＨの存在を決定するための方法に関するものである。この方法は、生物学的に活性を持つＴＳＨ受容体をコードするＤＮＡを有する哺乳類細胞で、ア／セイ条件下でＤＮＡからＴＳ［Ｉ受容体を発現する細胞を与えること：該細胞と試料を接触させ、試料中のＴＳＢを細胞と接触させること：接触過程の前後に細胞内環状アデノノンｌリン酸のレベルを測定することを含む。接触過程前と比較して、接触過程後の環状アデノノン１リン酸のレベルが上昇していることは、細胞内にＴＳＨが存在することを示唆している。

本発明のその他の特徴および利点は、以下の望ましい態様、および請求の範囲から明らかになるであろう。

望ましい態様の説明図面について筒単に説明する。

盈匡第１図はランドＬＨ受容体グローブのヌクレオチド塩基配列を示す図である。

第２図は、ヒトＬＨ受容体ｃＤＮＡのヌクレオチド塩基配列および予想されるアミノ酸配列を示す図である。

第３図は、ヒトＬＨ受容体をコードする遺伝子の構造および、予想されるアミノ酸配列の模式図である。

第４図は、ヒトＬＨ受容体ＤＮＡ配列に基づいた縮重オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド塩基配列を示す図である。

第５図は、つ／およびヒトＴＳＨ受容体の部分的なヌクレオチド塩基配列を示す図である。枠で囲んだ配列は、塩基配列決定の際のコンブレツンヨンによる誤りの可能性がある領域を示す。

第６図は、ヒトＴＳＢ受容体ｃ　ＤＮＡのヌクレオチド塩基配列および予想されるアミノ酸配列を示す図である。

第７図は、ヒト甲状腺のヘマトキンリンおよびエオシン染色切片に重ねて、ヒトＴＳＨ受容体の放射性標識したアンチセンス転写産物によって得られたオートラジオグラ７フイーによる／グナル（明るい点）を示す暗視野顕微鏡写真（倍率７５ｘ）を示す。

第８図はｐＡＴＨ３−ｂＴｓＩｉＲ発現ベクターの模式図である０第９図は、インドール酢酸の非存在下（＝）および存在下（＋）におけるｕ上Ｅ−ＴＳＨ受容体融合タンパク質（小さな矢印）の発現を示すポリアクリルアミドゲルの写真である。

第１Ｏ図は、用いたホルモン濃度の函数として、細胞内環状アゾノン刈リン酸（ＣＡＭＰ）のレベルを示すグラフである。

ＴＳＨ受容体本発明で有用なＴＳＨ受容体は、哺乳類から単離されたこのようなすべての受容体、あるいはこのような受容体の生物学的活性を持つすべてのタンプ（り質を含む。このようなタンパク質は、上述のようにひとつ以上のアミノ酸が保存的ｔこ修飾されている、天然のＴＳ［Ｉ受容体に由来するタンパク質を含む。このような修飾は、例え１ｉ組み換えＤＮＡ技術などの標準的な方法によってなされる。

一般的にこのような受容体は、受容体をコードする遺伝子を単離し、受容体タンパク質全長を発現する引こ障害となり得るイントロンＤＮＡを除いたのちにその遺伝子を発現ベクターシこ連結するこ七による組み換えＤＮＡ技術によって発現される。このような発現ベクターは、本分野の技術者にはよく知られている方法で細菌、菌類、昆虫、あるいは哺乳類細胞内で発現される、細菌、菌類、昆虫、および哺乳類発現ベクターを含む。生成された哺乳類ＴＳＨ受容体も、上述の組み換え哺乳類ＴＳＨ受容体の一つに対する抗体を調製し、それを天然のＴＳＨ受容体のイムノアフィニティー精製に用しすることにより単離することができる。

一般に、ＴＳＩＩ受容体の収量が非常に少なしまため、このような方法は望ましくない。

目的のＴＳ［ｌ受容体タンパク質がクローニングされ、そのアミノ酸配列力；決定されると、受容体の生物学的活性を持つタンプくり質が標準的な方法によってデザインされ得る。例えば、標準的な方法によってオリゴヌクレオチドを合成し、標準的な発現ベクターに挿入して天然のＴＳＩＩ受容体の断片を発現させることができる。これらの断片は、受容体タンパク質が目的の生物学的活性を持つかどうかを決定するために、標準的な方法でスクリーニングすることができる。例えば、合成ペプチドがＴＳＨ受容体に対する抗体と結合できるかどうかをアフィニティークロマトグラフイー、ウェスタンプロット解析、あるいはその同等な解析法によって決定することが可能である。結合できる断片は本発明で有用である。同様に、発現されたＴＳ［Ｉ受容体、あるいは上述のように精製されたものを、トリプシンなどのアミノ酸配列を小断片に特異的に切断する酵素を用いて切断することができる。これらの断片が本発明の方法において有用であるかどうかを決定するために、合成ペプチド断片に対してと同様な方法で検査を行うことができる。

以下に述べるのは、哺乳類ＴＳ■受容体をコードする遺伝子、精製哺乳類ＴＳ［Ｉ受容体を供給するためのベクター中の該遺伝子の発現の一例を示すものである。この実施例は本発明に制限を与えるものではなく、多数の他の哺乳類ＴＳＨ受容体が同様な方法によって、あるいはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下参照）への寄託物として提供されたクローン化ＤＮＡを用いることによって単離され得ることは、本分野の技術者には理解されるであろう。これらの寄託物中のＤＮＡは哺乳類ＤＮＡの既存の、あるいは新しく構築されたライブラリのスクリーニングに用いられ、哺乳類ＴＳＨ受容体の一部または全部をコードするクローンの同定を行うことができる。このようなライブラリは哺乳類の甲状腺に存在するＲＮＡからｅＤＮＡライブラリとして構築することが望ましい。

実施例：ヒトおよびウシＴＳＩＩ受容体ラット黄体形成ホルモン（ＬＨ）受容体遺伝子の６２２ヌクレオチド断片を、生物学研究所（ホビュレーンヨン・カウンセノ呟ニューヨーク、ニューヨーク、＋００２１）のテホラ・セガロフ（Ｄｃｂｏｒｉｈ　５ｅ（ａｌｏｆｔ）、およびハイデルベルグ大学のビータ−・シーバーブ（Ｐｅｔｅｒ　５ｅｃｂｎｒｓ）から得た。このＤＮＡ断片をグラビス病患者の甲状腺から単離したＲＮＡから構築したλｇＮＩ　ｃＤＮＡライブラリのプローブとして用いた。このプローブのヌクレオチド塩基配列を第１図に示す。

ｃＤＮＡライブラリは一般に以下のように構築した。甲状腺のＲＩＩＡを標準的なグアニジウム／チオンアネート法を用いて単離し、ガブラー（Ｇｏｂｌｅｒ）とホフマン（Ｈｏｌｆｍｕ）の方法によって逆転写を行った。得られたｃＤＮＡをＧＳＧゲル濾過カラムを用いてサイ、（Ｊ択し、ｌｋｂ以上の長さのｃ　ＤＮＡを選択した。ｃＤＮＡｔｊ−ＥｃｏＲＩメチラーゼによってメチル化し、ＥｃｏＲＩリンカ−に連結し、ＥｃｏＨで消化した。得られたＤＩＩＡをＥＣ０ＲＩ処理したλ（ＮＩ　ＤＮＡに連結した。得られたλＤＮＡを大腸菌Ｉｎ２株で増幅した。

ラットＬＨ遺伝子断片を”Ｐ−ｄｃ丁Ｐで標識し、ニトロセルロースフィルター上で２ｇ（１１ライブラリを含むプレートを、３０％ホルムアミド、ＩＭ　ＮｌＣｌ、１２℃の低ストリンジエンシーでスクリーニングした。統いてフィルターを２ＸＳＳＣ，５０℃の低ストリンジエンシーで洗浄した。

２つのクラスのクローンが検出され、一方のクラスはプローブと強い反応を示し、他方のクラスは弱い反応を示した。強く反応するプラークを常法により３回精製し、制限酵素マツピングおよびＤＮＡ配列決定により、４つが同一の遺伝子のオーバーラツプする部分をコードすることが明らかになった。遺伝子の５°末端の６００ヌクレオチドがラットＬＥ受容体と高い相同性を示した。さらなる解析により、いくつかのイントロンを残して、ヒトＬＨ受容体タンベク質の全長をコードするｃＤＮＡを決定した。そのヌクレオチド塩基配列を第２図に示す。コー　ドされるタンパク質のアミノ酸配列、分子量、および等電点はこの配列から常法によって算出することができる。ｃＤＮＡはイントロンＤＮＡも含む。ＲＮＡ保護実験、ノザン分析、およびポリメラーゼチゴーインリアクノヨ／実験により、：のクローＺｌ：、コードされるｍＲＮＡが甲状腺、精巣、子宮、およびグラビス病の甲状腺、甲状腺細胞系で発現されていることが示された。ＲＮＡは甲状腺で発現されているが、不完全にスプライシングされている。したがって、このクローンは甲状腺発現特異的ＤＮＡをコードしているのではない。

ＴＳＨ受容体をコードするりＩ：Ｉ−ンを単離する！−めに、ふたつの縮重オリゴヌクレオチドグローブを合成シ１５、その一方は上述のクロー二〉・グされたヒトＬ１１受容体ＤＮＡの膜通過領域＋１１と相同性を持ち、他方はＬｌｌ受容体ＤＮＡの膜通過領域ＩＶと相同性を持つようにした。これらの領域およびプローブの位置を第３図に示す。これらの領域はｃＤＮＡ中で約４００ヌクレオチド離れている。オリゴヌクレオチドは常法で合成し、精製した：その配列を第４図に示す。

ヒトのグラビス病の甲状腺、およびラン甲状腺試料から全ＲＮＡを単離した。これら２つの試料由来の全ＲＮ＾ＩＧμｇを別々に七ロ二−マウス白血病ウィルス逆転写酵素（市販）を用いて逆転写した。第１のｃＤＮＡ鎖は５０＃１の反応液で合成し、得られたｃＤＮＡの５μｍを上述の合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼチェインリアクションに試用した。この反応は全体積１００Ｅ１で、５ｓ１のｅＤＮＡ、５００ピコモルの各オリゴヌクレオチド、およびシータス社（エメリービル、　ＣＡ）による標準緩衝液とヌクレオチドを含む。この反応液をＴ！Ｑ　ＤＮＡポリメラーゼの存在下で９じＣで１分、５０℃で２分、７２ ℃で３分処理した。この５０℃から９４°Ｃの加熱および冷却サイクルを３０回繰り返した。この時点で、増幅産物は検出されな力じた。得られた反応液のうち５μｍを取り、この方法を繰り返した。この時点で、ＤＮＡ産物が検出された。

骨肉腫、精巣、子宮、黒色腫、胎盤から単離した全ＲＮＡを用いた反応液ではこのような産物は見いだされなかった。しｔ：がって、このＤＮＡ産物は甲状腺特異的であることが示された。得られた産物を常法により沈殿させ、再懸濁し、ＨｉａｄｌｌｌとＥｃｏＲｌで消化した。

ＥｃａＲＩ　Ｈｉ口ｄｌ１１断片をベクターｐＢＳ−（ストラタジーン社、ラホラ、　ＣＡ）にサブクローニングし、大腸菌を形質転換した。得られたベクターにっ（゛て、サンガーのジデオキシ法により塩基配列決定を行った。ヒトおよびウシｅ　ＤＮＡの双方の塩基配列を決定し、約８４％の相同性のあるタンパク質をコードしていることが見いだされた。

これらの仮の配列を第５図に示す。これに対して、該ＤＮＡはラット、ブタ、およびヒト１、Ｅ［受容体との相同性は６８％にすぎない。

ポリメラーゼチェインリアクンヨンによって得られた断片をベクターから切り出し、！２Ｆで標識した。これらの断片をつぎに、上記のλ（ｋｌｌライブラリの高ストリ）′ジニン７−でのスクリーニングのためのプローブとして用いた。条件は、１ＭＮ５ｃｌの存在下で５０％ホルムアミド、４２℃で１５−２０時間、次にニトロセルロースフィルターを＋Ｘ５ＳＣ中テ２０−２５℃テｉｓ分、＋Ｘ５ＳＣ中テロ８℃テ１５分、０．ｌＸ５ＳＣ中テロ８℃テ４５分洗浄した。ＬＨ受容体クローンを検出した場合と比較して、強くハイブリダイズするプラークがより高頻度で検出された。これらのプラークのうち１２個を３回精製し、６個から精製ｆｌＮＡを単離し、ＥｃａＲＩ制限酵素分析を行った。これらのクローンのうち４つは約４．ｌｋｂのインサートを含んでいた。これらのインサートをｐＢｓ−ベクターに挿入しｊこ。

得られたクローンを用いたノザンプロット分析から、該ＤＮＡはグラビス病患者の甲状腺および冷結節試料中で発現されたＲＮＡにのみハイブリダイズし、精巣、子宮や他の組織の場合にはハイブリダイズしなかった。ＤＮＡは約４．２ｋｂのＲＮＡとハイブリダイズし、ヒトＴＳＨ受容体の全長クローンであることが示された。このＲＮＡは２から２Ｓｋｂの３″非非翻訳列を持ち、約ＳＯ塩基の５ ′非非翻訳列を持つ。一つのクローン、Ｔ２゜１２．６−１（ｈＴｓＨ受容体）は［ｌＮＡ配列が決定され、ヒトＴＳＨ受容体ｃＤＮＡ全長を含むことが示された（第６図）。

このクローンがヒトＴＳＨ受容体をコードしていることのさらなる証明は、ＴＳＨに反応することが知られている甲状腺濾胞細胞に、アンチセンスヒトＴＳＩＩ受容体プローブが特異的にハイブリダイズすることを示したｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ一ンヨン組織化学によって与えられた（第７図）。簡単に述べると、正常な甲状腺濾胞細胞の８μＩクリオスタント切片をｉｎ　５ｉｋｏハイブリダイゼーシヨン用に調製した。ヒトＴＳＨ受容体をコードするＩｋｂのｃ　ＤＮＡを１５５標識アンチセンス転写産物の調製に用いた。組織切片を界面活性剤とプロテアーゼで前処理し、報告されているように（ホーフラー（ＨｏｅＮｅｒ）他、ＨｉｉＬｏｃｈｅｍｊ−１８：５５９７．１９８６）３ＸｌＯ’ＣＰＩｌ（比活性約ＩＱ’ｃｐｍ＃ｒ）のプローブと、ハイブリダイゼーション緩衝液中で１６時間、４２°Ｃでインキュベートした。

上述のヒトおよびウシ、あるいは他の哺乳類由来のｅＤＮＡを常法によって発現させ、大量のＴＳＨ受容体を供給することが可能である。たとえば、上述のｃＤＮＡを、ｐＡＴＨ−１，２、または３などの＋ｒｐ　Ｅ融合プラスミドに挿入し、Ｔｒｐ　Ｅタンパク質との安定なハイブリッドタンパク質を形成させることができる。あるいは、サイトメガロウィルスや、レトロウィルスベクターなどの哺乳類発現系にｃＤＮＡを挿入することもできる。

以下に示すのは、ＴＳＩ！受容体を発現させる方法の一例である。Ｐｓｔ１部位（ヌクレオチド３４りからＨｉｎｄ１１１部位（ヌクレオチド２１３）までのヒトＴＳＩ！受容体のアーミノ末端コード配列をＰｓｊｌ／Ｈｉｎｄｌ１１で消化したｐＡＴＩｌ［３に連結した。得られたプラスミド、ｐＡＴＨ３−ｉｌＴｓＢＲ（第８図）は、２９ｋＤのヒトＴＳＨ受容体タンパク質のアミン末端に融合した約３７ｋＤの大腸菌Ｔｒｐ　Ｅタンパク質を含む６６ｋＤの融合タンパク質を発現する。ｐＡＴＨ３−ＨＴＳｌｌにで形質転換した大腸菌ＤＢ５を株を選択的Ｍ９培地で、Ｔｒｐ　Ｅ遺伝子のインデューサーであるインドール酢酸４０μｇ／βｌの非存在下あるいは存在下で２時間培養した。細菌ペレットをＳＤＳローディング緩衝液中で破砕し、その１／！Ｏを１０％ポリアクリルアミドラエムリゲルで電気泳動したく第９図）。

上述のように、ＴＳＥＩ受容体をコードする核酸は、多量のＴＳＩＩ受容体を発現させるために使用することができる。たとえば、高レベルの発現は、バキュロウィルスベクターｐＶＬ９１１、大腸菌ベクターｐＡＴＩｒ３Ｊ乳類ベクターｐＬＪなどでなされる。このようなタンパク質は、グラビス病で見いだされる自己抗体の検出に有用である。これによりこれらの患者の甲状腺の状態を決定することができ、患者の疾患の進行が示唆される。この検査は、たとえば計量棒アッセイなどのＥＬＩＳＡ型で行われる。この検査は放射性標識したＴＳＨおよびＴＳＨ受容体を用いた競合的結合アッセイ型でも行うことができる。このようなアッセイは非常に敏感であり、このような抗体を検出する既存の方法よりもより効果的に行われる。

発現されたタンパク質はグラビス病患者の抗体で認識されるエピトープを決定するのに有用である。この分析は、たとえばクローニングされたＤＮＡの一部を発現させてＴＳ、Ｈ受容体の部分的な断片を合成させるか、上述のように発現させた受容体タンパク質を断片化することなどの常法によって行うことができる。このような抗体に認識される領域が決定されたら、これらの断片をイムノアッセイ法に用いることができる。さらに、エピトープの決定は、タンパク質のひとつ以上のエピトープ部分を形成している可能性のあるひとつ以上のアミノ酸を置換あるいは欠失させたタンパク質を与えるような標準的な分子生物学的技術を用いてクローニングされた遺伝子を操作することによっても行える。

該タンパク質およびその一部は、グラビス病患者あるいはその他の甲状腺異常を持つ患者のひとつ以上の症状を軽減するために十分な投与量で、薬学的に使用可能な化合物として投与するという治療用としても有用である。一般に、このような投与は患者のキログラムあたり１から１０００マイクログラムの間の量で行われる。

自己抗体の活性を阻害して丁ＳＨのアゴニストとして働き、甲状腺の刺激を阻害するような小さなペプチドもデザインすることができる。他の小さなペプチドは、自己抗体を阻害してＴＳＩＩアンタゴニストとして機能するものとしてデザインすることも可能である。さらに、ＴＳＨがＴＳＨ受容体に結合することを阻害して甲状腺の高進した活性を阻害するようなＴＳＨのアンタゴニストも構築することができる。

丁Ｓｌｌアッセイ以下にＴＳ［ｌに関する二つのアッセイを述べる。第一のアッセイ法は、通常はＴＳＩＩ受容体を含まない細胞中でＴＳＨ受容体を発現させることに基づいている。この細胞はＴＳＨと接触すると環状アデノシン１リン酸の発現が増加し、試料中のＴＳ［Ｉ量の指標として検出することができる。

このアッセイでは、ヒトＴＳＨ受容体をコードするＤＮＡを哺乳類レトロウィルスベクターｐＬＪのＢ！ＩＨＩから５ｖ１１部位に挿入する。得られたベクターを次にヒト２９３細胞にトランスフェクトし、抗生物質Ｇ４１ｇの存在下で選択することにより、ベクターを含むクローン性細胞系を単離する。このようなトランスフェクションによす、細胞はＴＳｉｌに反応性となり、ＴＳＩＩＩ処理後にアゾニレ−トンクラーゼの活性化とｃＡＭＰの蓄積によって測定する。したがって、これらの細胞系はホルモンＴＳＨに関する非常に敏感なアッセイ系を与えるものである。培養液中の細胞あるいは細胞膜調製物をＴＳＨを含むと考えられる試料に接触させ、得られたアデニレートシクラーゼ活性を定量し、試料中のＴＳＨ濃度を算定するためにＴＳＩＩの標準希釈曲線のアデニレートシクラーゼ活性と比較する。１ｍｇ／ｌ、あるいはＯ，ｌｎｇ／ｍｌという低濃度でも本アッセイで検出可能である。本アッセイは、上述のｅＤＮＡにコードされたＴＳ［Ｉ受容体が生物学齢に活性を持ち、ＴＳＩＩに反応性ではなかった細胞系にＴＳ■特異的な反応性を付与することを示している。これらの細胞系は天然ＴＳＨだけではなく、組み換えＴＳＨにも反応性を示す。

特定的には、ｔｒ、１２　ｃＤＮＡ全長を含むレトロウィルス発現ベクターｐＬＪ（コーマン（Ｋｏｒｍｚｅ）他、Ｐｘｃ、　ＮＪ）１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾Ｈ：２１５０，１９Ｈ）をヒト２９３細胞にトランスフェクトし、ｈＣＧ、ｈＦｓｌｌ、またはｈＴｓＥｌで処理後、”Ｈ−ｅＡＭＰ置換アッセイにより６０時間後の細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定した。第１０図を参照すると、１１００ｎ／ｍｌのｂＦｓ［ＩまたはｈＣＧはほとんど効果がないのに対し、等量のｈＴｓＨｊこよって細胞内ｃＡＭＰが６倍以上上昇した。最大の１７２の細胞内ｃＡＭＰ濃度は約６０ピコモルのｈＴｓｌＩで得られた。いくつかの実験では、１０００ｎ／−１ｂＴｓＨの投与によって細胞内ｃＡＮＰが１５倍に上昇した。

ｂＴＳＨ−ｒインサートを含まない、レトロウィルスベクターのみでトランス７エクシミンした場合には、ｌｏｏ＋Ｂ／ｍｌ　ＴＳＨで細胞を処理しても、バックグラウンド以上には細胞内ｃＡＭＰは上昇しなかった。同様な方法を用いてヒトＬＨ／ＣＧ受容体の発現を試みたが、どの糖タンパク質ホルモンで処理してもｃＡＭＰの上昇は見られなかった。この原因としては、たとえば、ｔｒ、Ｉ３に見いプごされた欠失、あるいはおそらく非生殖腺２９３細胞系でＬＨ／ＣＧ−Ｈのイントロンの不十分な除去、などのあらゆる多数の問題が考えられる本発明のＴＳＨ受容体は、競合的結合アッセイによる丁ＳＩＩの測定に使用可能である。

本アッセイではＴＳＨ受容体、またはその一部はＴＳＨに結合可能であり、支持マトリックスに固定される。固定された受容体を、放射性または蛍光標識で印をつけた過剰のＴＳＨと、結合反応が平衡に達するのに十分な時間インキュベートする。結合していないＴＳＨを洗浄過程で除去し、受容体を検体試料とインキュベートする。この第２の結合過程が平衡に達したら、固定した受容体を再度洗浄する。検体試料中のＴＳＨによって置換された標識ＴＳＩＩを、検体試料中に存在するＴＳＩＩの指標として用いる。精製したＴＳＩＩ受容体を用いた、他のＴＳＨアッセイも、本分野の技術者によって開発され得る。

！胆以下のＤＮＡは、ブダペスト協定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ，Ｃ）（＋２１０１バークローンドライブ、ロックビル、メリーランド００５２）に１９８９年９月６日に寄託され、以下の受託番号を与えられている。

三艦隻　受託番号ｔｒ、１２．６−１　（ｈＴｓＨ受容体）　４０６５１ｔｒ、Ｎ、Ｌ３５（ｈＬＨ受容体）　４０６５２出願人の受託人、二ニー・イングランド・メディカル・センター・ホスピタル社は、ＡＴＣＣが寄託物の永続性を可能にする保管所であり、特許が認められた場合には公衆によって容易に入手されることを断言する。

寄託されたものへの公衆の入手可能性に関するすべての規制は、特許が認可されることにより不可逆的に取り険かれるであろう。３７　ＣＦＲ１，１４および３５　［ＩＳＣｍに従い、特許局長官によって決定されたものには、特許出願の継続中でも寄託物は入手可能となる。寄託された物質は、寄託された微生物試料の最も最近の供給要求があった後少なくとも５年間、およびどのような場合にも、寄託の日から最低３０年間、あるいは特許の有効期間のいずれか長いほうの期間は生きた、混入のない状態で保存される必要がある。出願人の受託人は、寄託物の状態により、試料を保管所が供給できなくなった場合には要求されれば寄託物を交換する義務があることを認める。

他の態様は以下の請求の範囲で述べられる。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類ＴＳＨ受容体の生物学的活性をもつタンパク質をコードする精製された核酸。
２．哺乳類ＴＳＨ受容体をコードする精製された核酸。
３．該哺乳類ＴＳＨ受容体がヒトＴＳＨ受容体である、請求の範囲第１項または第２項記載の精製された核酸。
４．哺乳類ＴＳＨ受容体の生物学的活性をもつタンパク質をコードする精製されたｃＤＮＡ。
５．哺乳類ＴＳＨ受容体の生物学的活性をもつタンパク質をコードする核酸を含む精製されたベクター。
６．哺乳類ＴＳＨ受容体の生物学的活性をもつタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む細胞。
７．哺乳類ＴＳＨ受容体の生物学的活性をもつ精製されたタンパク質。
８．患者の血清中の抗ＴＳＨ受容体抗体の存在を検出する方法であって、精製されたＴＳＨ受容体を与えること、該ＴＳＨ受容体を血清と接触させること、；および該ＴＳＨ受容体と該血清の反応を、血清中の抗体の存在を指標として検出することの過程を含む方法。
９．試料中のＴＳＨの存在を決定する方法であって、生物学的活性をもつＴＳＨ受容体をコードするＤＮムを含む哺乳類細胞を与えることであって、該細胞がアッセイ条件下で該ＤＨＡからＴＳＢ受容体を発現すること、該細胞を該試料と接触させ、該試料中のＴＳＨを該細胞と接触させること；および該接触過程の前後の細胞内環状アデノシン１リン酸レベルを測定すること；の過程を含む方法であって、ここで、該接触過程前と比較したときの該接触過程後の環状アデノシン１リン酸の上昇レベルは該細胞内のＴＳＨの存在の指標である。