JPH04505103A - 糖タンパク質ホルモン受容体分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 塘タンパク質ホルモン受容体分子 発明の分野 本発明は、黄体形成ホルモン、コリオゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、およ び甲状腺刺激ホルモンに対する細胞受容体（レセプター）分子の精製およびクロ ーン化に関する。本発明はさらに、精製された上記のホルモン受容体分子の使用 に関する。

発明の背景 １、　下垂体前葉のホルモン類 下垂体前葉（ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓ　ｉｓ）は、黄体形成ホルモン（ルト ロピンモシくは“ＬＨ”）、コリオゴナドトロピン（もしくは“ＣＧ″）、卵胞 刺激ホルモン（フォリトロピンもしくは“ＦＳＨ”）、および甲状腺刺激ホルモ ン（チロトロピンもしくは“ＴＳＨ″）を含むいくつもの主要な糖タンパク質ホ ルモン類の起源である。下垂体前葉のホルモン類は、ｌｌｏｒｍａｎ、＾、Ｗ等 、Ｈｏｒｍｏｎｅｓ、　Ａｃａｄ　Ｐｒｅｓｓ、米国、ニーーヨーク州、１９８ ７年に総括されている。これらのホルモン類は道化して高度に保護されており、 うｙ）などの動物のＬＨＳＣＧおよびＴＳＨホルモンの主要なアミノ酸の配列は ヒトのものと非常に類似している（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ、　Ｔ、Ｗ、等、　Ｌ ｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｅｐｔ ｏｒｓ、　Ａｓｃｏｌｉ　Ｍ、編集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、米国、フロリダ州。

ポカ・ラドン、１９８５年）。

黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ヒトコリオゴナドトロピン（ｈＣＧ）お よび甲状腺刺激ホルモンは多くの共通の特性を共有しているので１系統の糖タン パク質ホルモンのメンバーと考えられている。これらのホルモンはすべて約２０ ０〜２５０アミノ酸残基を含有し、共通のαサブユニット（約１３〜１５ｋＤａ の分子量を有する）および特有のβサブユニット　（約１３〜２２ｋＤａの分子 量を有する）で構成されている。ＬＨ，ＦＳＨおよびＴＳＨのαサブユニットは 同一であるが、ＣＧのごサブユニットは他のホルモンのものとわずかに異なると 報告されている（Ｇａｎｏｎｇ、　Ｗ、Ｆ、、　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　９版、　Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕ ｂ、米国、カリフォルニア州、ロス・アルトス、　１９７ｆｆ：）。

これらのホルモン類は、標的細胞の表面に存在する受容体分子に結合することに よってその生物活性を伝達する。ホルモン類の、αサブユニットとホルモン特異 βサブユニットとの相互作用か、ホルモンの結合特異性を与える原因である。こ れらホルモン類は、細胞のアデニル酸シクラーゼを活性化して細胞内ｃＡＭＰレ ベルを増加させることによって作用する。（ｄｅ　ｌａ　Ｌｌｏｓｅ−Ｈｅｒｍ ｉｅｒ等、　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　１１８巻、　３９９〜４０ ６頁、　１９８８年）。

黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモンはともにゴナドトロピン類である（Ａｓｃ ｏｌｉ　Ｍ、編、　Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ａｃｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ。

ＣＲＣＰｒｅｓｓ、米国、フロリダ州ポカ・ラドン、　１９８５年）、ＬＨは、 ライデイッヒ（間質）細胞の表面に発現される受容体と結合する（Ａｓｃｏｌｉ 、　Ｍ、、　Ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｃｏｎｎ、　Ｐ、Ｍ、編、２巻、 ３６８頁、　１９８５年）。男性のヒトにおいて、ＬＨが結合すると、ライディ ノヒ細胞のテストステロンの合成を増大させる。女性のヒトにおいて、上記の結 合があると、顆粒層、膜、腸管および黄体の細胞の、アンドロゲン類、ニステロ ゲン類、およびプロゲスチン類、特にプロゲステロンのａ度を増大させる。

卵胞刺激ホルモンは配偶子類の発生を調節する。ヒトの男性では、ＦＳＨはセル トリ細胞の表面に存在する受容体と結合して、成熟精子を産生させる発生過程を 補助する。ヒトの女性ではこのホルモンは卵巣の顆粒層細胞の表面に存在する受 容体と結合する。このホルモンは、エストロゲンおよびＬＨと協動して作用し卵 胞の発生を刺激すると考えられる。ＦＳＨは、卵母細胞の発生におけるその役割 を反映して雌性生殖サイクルにおける排卵期に最大に発現される。

そのためＦＳＨの検定は、排卵発生の検出および予測に利用できる。

またＦＳＨは、顆粒層細胞がＬＨ／ＣＧ受容体を発現するのを刺激する。

コリオゴナドトロピンは、胎盤の栄養芽層細胞が産生ずるゴナドトロピンである 。このホルモンは、プロゲステロンの産生を刺激することによって、卵巣内の黄 体の成長と発生を刺激する作用を行う。

コリオゴナドトロピンは、妊娠に対する母性代謝をととのえる役割をもっている ６ＣＧの発現は受胎後に急速に増大するので、妊娠の検定法として利用できる。

ＬＨＳＦＳＨもしくはＣＧを投与することによって雌に排卵を誘発させることが できる。これらのホルモンは不妊症の治療に使用できる。

ＴＳＨの基本的な作用は、甲状腺の分泌と成長を刺激する作用である。ＴＳＨは 、甲状腺細胞の表面に発現される受容体分子と結合する。ＴＳＨ受容体と結合で きるモノクローナル抗体が開発されている。グレーゲス病にかかった個体は、Ｔ ＳＨ受容体分子と結合できる自己抗体を産生ずる。抗ＴＳＨ受容体モノクローナ ル抗体とは異なり、上記自己抗体が結合することはＴＳＨと似ているので、甲状 腺活性の刺激物質として作用する（Ｆｕｒｍａｎｉａｋ、　Ｊ、等、　Ａｃｔａ 　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　（Ｓｕｐｐｌ）　２８１巻、　１５７〜１６５頁、 　１９８７年）。グレーゲス病の臨床症状は、甲状腺機能亢進が特徴である。

＋＋、下垂体前葉の糖タンパク質ホルモン類（ｈＣＧを含む）の受容体黄体形成 ホルモンとコリオ（絨毛）ゴナドトロピンが同じ細胞受容体分子を共有している ことが研究の結果明らかになった（Ａｓｃｏｌｉ。

Ｍ、　ｌｉ、Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　Ｈｏｒｔａｏｎｅ　Ａｃｔｉｏｎ　ａｎ ｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ。

米国、フロリダ州ポカ・ラドン、　１９８５年）。化学的光親和性架橋剤を使用 することによって、研究者は、受容体のホルモン結合部を研究できるようになっ た［Ｊｉ、１．等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　（Ｕ、Ｓ 。

Ａ、）、　７７巻、　７１６７頁、　１９８０年；　Ｒｅｂｏｉｓ、　ＲＪ、等 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　７８巻、　２０８６頁、１９８１年；　Ｍｅｔ ｓｉｋｋｏ、　１１等、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　２０８巻、３０９頁、　１９ ８２年〕。しかしこれらの研究は、受容体分子の構造の解明にまで至らなかった 。これらの研究に基づいて、いくつもの研究グループは、受容体は約７０〜１０ ５ｋＤａの単一ポリペプチドであると結論している［Ａｓｃｏｌｉ、　Ｍ、等、 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ。

２６１頁、　３８０７頁、　１９８８年；　Ｒｅｂｏｉｓ、　Ｒ，Ｖ、等、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　７８巻、 　２０８６頁、　１９８１年；　Ｋｅｌｌｏｋｕａ＋ｐｕ、　Ｓ、等、　Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌ、、　１１６巻、７０７頁、　１９８５年］。しかし他の研究者 は、類似の研究によって、受容体がいくつものポリペプチドのサブユニットで構 成されていると結論した［Ｊｉ、１．等、　Ｐｒｏｃ、、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ。

Ｓ、＾、）、　７７巻、　７１６７頁、　１９８０年；Ｊｉ、Ｉ等、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　７８巻、　５４６５頁、　１９８１年ＨＨｗａｎｇ、　Ｊ 、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ、　２５９巻、　１９７８年、１９８４年 ；　Ｈｗａｎｇ、　Ｊ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（ｔ！、Ｓ、Ａ、）、　８１巻、　４６６７頁、　１９８４年］。こ れらの研究者が到達した異なる結論は調停の見込みがない。

ＬＨ／ＣＧ受容体の精製についてはいくつもの研究グループによって報告されて いる（Ｄｕｆａｕ、　Ｍ、　Ｌ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５ ０巻、　４８２２頁、　１９７５年；　Ｋｕｓｕｄａ＋　Ｓ、等、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｉ、、　２６１巻、　６１６１頁、１９８６年；　Ｂｒｕｃ ｈ、　Ｒ，Ｃ，等、　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｆｆｌ、、　２６１巻、　９４ ５０頁、　１９８６年；　Ｍｉｎｅｇｉｓｈｉ、　Ｔ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　ＣｈｅＩｌ、、　２６２巻、　１７１３８頁、　１９８７年；　Ｗｉｍａｌａ ｓｅｎａ、　Ｊ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔａ、、　２６０巻、　１０ ６ｇ９頁、　１９８５年；　Ｋｅｉｎａｎａｎ、　Ｋ、Ｐ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２６２巻、　７９２０頁、　１９８７年；Ｄａｔｔａ ｔｒｅｙａｍｕｒｔｙ、　Ｂ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５８ 巻、　３１４０頁、　１９８３年）。しかし精製タンパク質の報告された特性が 非常に異なっているので、ＬＨ／ＲＨ受容体の性質またはこの受容体が含有して いるサブユニットの数について、結論を得るに至らなかった。

またＦＳＨ受容体も充分に特性が決定されていない。光親和性法を用いて、研究 書違は、ＦＳＨ受容体が３つのサブユニットで構成されていると結論した（Ｓｈ ｉｈ、　Ｊ、等、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ、　２６０巻、　１２８２２頁、　１ ９８５年：　５ｈｉｈ、　Ｊ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６０ 巻、　１２８２ｇ頁。

１９８５年；　５ｈｉｈ、　Ｊ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　 ２６０巻、　１４０２０頁、　１９８５年；　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｒ，Ａ、等、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６０巻、　１４２９７頁、　１９８５年；　 Ｓｍ１ｔｈ、　Ｒ，Ａ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、、　２６０巻、 　１４２９７頁、　１９８５年）。

ＴＳＨ受容体は約３００　ｋＤａのタンパク質であり、そのタンパク質は切断さ れて少なくとも２つの７０　ｋＤａのタンパク質を生成すると報告されている。

その７０　ｋＤａのタンパク質はそれ自体切断して５０　ｋＤａと２０　ｋＤａ のタンパク質を生成する（　Ｃｈ　ａ　ｎ　＋　Ｊ、等、　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌ。

（Ｓｕｐｐｌ、）、　２８１巻、１６６頁、　１９８７年：　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｒ ，Ａ、等＋　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

Ｒｅｖ、、　９巻、８８頁、　１９１１１８年）。

要約すると、下垂体前葉の糖タンパク質ホルモンと胎盤で作られるコリオゴナド トロピンとは、標的細胞の表面に存在する細胞受容体分子との相互作用によって その生物活性を伝達することが見出された。精力的な努力にもかかわらず、これ ら受容体分子の性質と構成は、まだ解明されていない。

これらのホルモン受容体分子は、診断と治療の両方の目的に利用することができ る。また受容体分子は、合成ホルモン類もしくはホルモン拮抗体を設計するのに も利用できる。したがって精製ホルモン受容体分子を製造する技術が大いに要望 されている。

発明の要約 本発明は、黄体形成ホルモン、コリオゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、およ び甲状腺刺激ホルモンに対する受容体の精製およびクローン化に関する。本発明 は、さらに、上記の分子の、ヒトの症状に対する診断と治療での使用に関する。

詳しくは、本発明は、ＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体およびＴＳＨ受容体から なる群から選択されるホルモン受容体の分子の治療上有効な量を含有する医薬組 成物に関する。

また本発明は、ＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体およびＴＳＨ受容体からなる群 から選択されるホルモン受容体分子をコードする遺伝子配列を有する組換えＤＮ Ａ分子に関する。

また本発明は、ＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体およびＴＳＨ受容体からなる群 から選択されるホルモン受容体分子の治療上有効な量を含有する医薬組成物の治 療上有効な量をヒトに投与することからなる動物もしくはヒトの症状を治療する 方法に関する。

また本発明は、ホルモンを含有していると考えられる試料中のホルモンを検出す る方法であって：下記工程。

（ａ）ホルモンに対する受容体の存在下、受容体が、試料中に存在するいずれか のホルモンと結合し検出可能な変化を受けることができる充分な条件下で、試料 をインキコベートし、次いで、（ｂ）いずれかの受容体が、黄体形成ホルモン、 コリオゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモンおよび甲状腺刺激ホルモンからなる群 から選択されるホルモンの分子と結合して検出可能な変化を受けたか否かを決定 することによってホルモンを検出する、工程からなるホルモンの検出方法に関す る。

また本発明は、ホルモン受容体の製造方法であって、下記工程：（ａ）ホルモン 受容体をフードする遺伝子配列を含有するベクターを構築し、 （ｂ）得られたベクターで宿主細胞を形質転換し、（ｃ）形質転換された細胞を 、その細胞が上記遺伝子配列を発現するのに充分な条件下で、培養培地中で培養 し、次（Ｘで（ｄ）発現されたホルモン受容体を回収すること力・らなり、ホル モン受容体がＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体、およびＴＳＨ受容体からなる群 から選択される、ホルモン受容体の製造方法に関する。

また本発明は、ＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体、およ、びＴＳＨ受容体からな る群から選択されるホルモン受容体と結合できる、天然の汚染物を実質的に含有 していない、抗体もしくζよその抗原結合性断片に関する。

図面の簡単な説明 図１は、ラットの卵巣のＬＨ／ＣＧＲのｃＤＮＡと推定のアミノ酸配列を示す。

図１では化学的に決定されたペプチド配７１１　ｉよ対応する配列の上の黒バー 印で示され、予測されるのと異なる残基は白のバー印で示されている。アミノ酸 の番号付けは成熟した無傷の受容体について見出されたＮ末端配列から始まって いる。負の番号はコードされているシグナル配列に対する番号である。推定の細 胞外Ｎ一連結グリコシル化部位には逆三角形中をつけてあり、提案される膜スパ ン（膜貫通）の疎水性配列は四角枠で囲んである。上に線をひいた残基は大豆の レクチンに類似した場所を示す［し、０．　Ｖｏｄｋｉｎ等。

Ｃｅ１ｌ、　３４巻、　１０２３頁、　１９８３年；　Ｄ、Ｊ、　５ｃｈｎｅ１ １等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ−＋２６２巻、　７２２０頁、　１９ ８７年（Ｄｉ　ｒ　１ｏｒｕｓ）］。

図２はＬＨ／ＣＧ−Ｈのトランスメンブラン領域（膜貫通領域）の配列を示す。

選択されたＧタンパク質が連結した受容体のトランスメンブラン領域は、Ｆａｓ ｔｐ　（Ｄ、Ｊ、　Ｌｉｐｍａｎ等、　５ｉｅｎｃｅ、　２２７巻、　１４３５ 頁、　１９８５年）とｈｏｗ、　ｇｌｏｂａｌ　（Ｗ、Ｍ、　Ｐｉｔｃｈ等、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０巻、　１３８２頁、　１９８３年）のコンピュータプ ログラムを用い、最終的に手動で調節して、位置の同定を最少挿入断片で最大に して位置合わせを行った。数字は残基の番号を示し、（）内の数字は５〜６ルー プ領域で削除された残基の数を示す。四角枠の領域は、各位置における３つ以上 の残基が対になったところを示す。番号をつけたバー印は推定のトランスメンプ ラン（ＴＭ）領域の位置を示す。

ＲＨＯはウンロドブンン、　ＳＫＲはサブスタンスに受容体：β−２ＡＲはβ− ２アドレナリン受容体；　５ＨＴ−２Ｒは５１１Ｔ−２（セロトニン）受容体（ ロドプシン：　Ｊ、　Ｎａｔｈａｎｓ等、　Ｃｅ１ｌ、　３４巻、８０７頁、　 １９８３年：　ＳＫＲ；　Ｙ、　Ｍａｇｕ等、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２９巻、　 ８３６−８３８頁、　１９８７年；β−２ＡＲ：　Ｒ，Ａ、Ｆ、　ＤｉｘＯｎ等 、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１巻、７５頁、１９８６年；　Ｐ、Ｒ，５ｃｈｏｆｉ ｅｌｄ等、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１５巻、　３６３６頁、　１９８７年；　５ＨＴ−２： 　Ｄ、Ｂ、　Ｐｒ１ｔｃｈｅｔｔ等、　。

ＥＭＢＯＪ、、　７巻、　４１３５頁、　１９８８年）。

図３は、ＬＨ／ＣＧ−Ｈの細胞外ドメインにおける反復モチーフの構造を示す。

パネルＡは１４の不完全な反復構造の配列を示す。セグメント　〜　中の同一も しくは保護された残基は四角枠をほどこした。ダッシュ印は周期性を最適化する ためのギャップの位置を示す。パネルＢは、ヒト血清中のロイシン−リッチα− ２−糖タンパク’Ｊｔ（ＬＧＲ）　、ヒト血小板糖タンパク質１ｂ　（ＧＰＩＢ ）のα鎖、ショウジヨウバエのＴａ１ｌ遺伝子（Ｔｏｌｌ）、および酵母アデニ ル酸シクラーゼ（＾ＣＹ）中に観察されたロイシン−リッチの反復モチーフに対 する共通配列を示す［Ｎ、　Ｔａｋａｂａｓｈｉ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２巻。

１９０６頁、１９８５年（ＬＲＧ）；　Ｊ、　Ｌｏｐｅｚ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８４巻、　５６１５頁、１９８７年（ＧＰｌｂ）；　Ｃ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等 、　Ｃｅ１ｌ、　５２巻、２６９頁、１９８８年（Ｔｏｌｌ）；　Ｔ、　Ｋａｔ ａｏｋａ等、　Ｃｅ１ｌ、　４３巻、４９３頁、１９８５年（アデニル酸シクラ ーゼ、酵母）；　Ｔ、　Ｋｒｕｓｉｕｓ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３巻、　７６８３頁、　１９８６年（ＰＧ Ａ１）］。′ａ″は３つの脂肪族アミノ酸のうちの１つ、すなわちバリン、ロイ シンもしくはイソロイシンを示す。′Ｘ″はいずれかのアミノ酸を示す。

図４はＬＨ／ＣＧ−ＲｃＤＮＡの機能発現を示す。発現ベクターｐＣＬＨＲで過 渡的にトランスフェクトされているか（黒丸印）またはトランスフェクトされて いない（白丸印＞　ＣＯＳ細胞中の特異的１　＊　’ｓ　１−ＣＧ結合量（Ａ） とＣＧ刺激ｃＡＭＰの蓄積量（Ｂ）を示す。

図５は、各種組織中でのＬ　Ｈ／ＣＧ−ＲｃＤ　Ｎ　Ａの雑種形成（ハイブリダ イゼーション）のノーザン分析の結果を示す。各レーンはｌ（１μｇの全ＲＮ＾ を含有していた。左側の数字は、ＤＮＡ　サイズマーカーから決定したｋｂを示 す。示した試料は、偽妊娠ラットの卵巣（レーンａ）、成熟うｙ）の卵巣（レー ンｂ）、同畢丸（レーンＣ）％開腔（レーンｄ）、同腎臓（レーンｅ）、同肝臓 （レーンｆ）由来のものである。

パネルＡとＢはそれぞれ、同じプロットを６時間と一夜露出したものを示す。

図６ａと図６ｂはラット精巣性ＦＳＨ−ＲのｃＤＮＡと予測アミノ酸の配列を示 す。アミノ酸の番号付けは、予測成熟レセプタータンパク質に対するＮ末端配列 から始まる。負の番号はシグナル配列を示す。

図７は、ゴナドトロピン受容体間の構造の比較を示す。Ａ）受容体ドメインの配 列の類似性。細胞外ドメインを示すＮ末端の１／２は、各々約２０の残基の１４ の不完全な重複ユニットに細分され、Ｃ末端の１／２　は７つのトランスメンプ ランセグメントを示している。潜在グリコジル化部位は黒画角印で示しである。

異なるグレー色は、各種受容体領域における配列保護の程度を示す。Ｂ）ワンレ ターコードにおける受容体の配列比較。ＦＳＨ−Ｒ配列は下方の配列として示し てあり、ＬＨ／ＣＧ−Ｒにおける差異と置換は上方に示しである。点印は、最適 配列に対して導入された挿入断片を示す。細胞外反復には番号をつけ垂直の線で 境界を示した。細胞外ドメイン中の保護されたシスティン残基は黒卵形印で示し である。

トランスメンプラン領域ＴＭＩ−ＴＭＶＩ＋は四角枠で示しである。小さな矢印 は、受容体の第２と第３の細胞外ループ中の保護されたシスティン残基を示す。

図８は、ＦＳＨ−Ｒの細胞外ドメイン中の反復モチーフの配列を示し、かつ反復 部分間の配列保護の各種の程度を示している。Ｎ一連結グリコシル化部位は、ハ ツチをほどこした丸印で示す。配列と番号付けはＬＨ／ＣＧ−Ｒの場合にしたが って行った。

図９は、ＦＳＨ−Ｈの機能発現を示す。発現プラスミドｐＣＦＳＨ−Ｒで過７１ １ｆ的にトランスフェクトされた２９３の細胞中の、ＦＳＨで刺激されたｃＡＭ Ｐの蓄積量。細胞内ｃ−ＡＭＰはホルモン濃度の関数として測定した。各データ の点は、２回測定値の平均値上範囲を示す。

好ましい実施態様の説明 １．黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、および甲状腺刺激ホルモン 本発明は、黄体形成ホルモン、コリオゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモンおよ び卵胞刺激ホルモンに対する生物学的受容体の精製、クローン化および使用に関 する。

上記のように、黄体形成ホルモン（ＬＨ）とヒトコリオゴナドトロピン（ＣＧ） は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）と卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）も含む進化し て保護された系統の糖タンパク質ホルモンのメンバーである。４つともすべて、 ２８〜３８ｋＤａのへテロニ量体糖タンパク質であり、各々、受容体の特異性を 与える異なるβサブユニ、。

トと連結された共通のαサブユニットで構成されている（Ｐｉｅｒｃｅ等、Ａｎ ｎｕａｌ　Ｒｅｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５０巻、４６６頁、　１９８１年） 。ＬＨとＣＧのβサブユニットは配列が非常に類似しており、これらの２つのホ ルモンは同じ受容体に結合し、同一の生体反応を誘発する（Ｐｉｅｒｃｅ等の前 記文献）。椋的細胞の、ＬＨとＣＧの結合に対する急性応答は、細胞内のメンプ ラン関連Ｇタンパク質によって伝達されるアデニル酸シクラーゼ活性の増加であ る。得られた、増大したレベルのｃＡＭＰは、最終的に、ステロイドの合成と分 泌をもたらす（Ｍ、■ｕｎｚｉｃｋｅｒ−Ｄｕｎｎ等、　Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎ ｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｍ、　Ａ ｓｃｏｌｉ　１ｍ集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ポカ・ラドン、５７〜１３４頁、　 １９８５年）。これらのホルモンの炭水化物の部分は、シグナル形質導入に重要 な役割をはたすようである（Ｓａｉｒａｍ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌｌ、 、　２６４巻、　２４０９頁、　１９８９年）。これらのホルモンの炭水化物の 部分も、これらのホルモンが代謝によって失われる速度を低下させることによっ て、その効力を増大する。

最近、１系統のＧタンパク質連結受容体が同定された。そのメンバーは７つのト ランスメンブランドメインをもっているという共通の構造の特色をもっているこ とが特徴である（Ｒ，Ｊ、　Ｌｅｆｋｏｖｉｔｚ等。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、、　２６３巻、　４９９３頁、１９８８年で 総説されている）。これらホルモンの受容体はこの系統のメンバーと考えられる 。

動物のＬＨ，ＦＳＨおよびＴＳＨのホルモンの結合ドメインをヒトのこれらホル モンの結合ドメインと比べて非常によく似ているのでこれらのホルモンの細胞受 容体分子はヒトのホルモンと結合できるという結論を支持している。したがって このような動物の受容体分子はヒトの受容体分子と同じ仕方で使用できる。

黄体形成ホルモン／コリオゴナドトロピンホルモン受容体（ＬＨ／ＣＧ−Ｒ）は 、畢丸のライディヒ細胞、卵巣膜細胞、顆粒層細胞、黄体細胞、および間質細胞 に存在している。ＬＨ／ＣＧ受容体は生殖生理に重要な役割を演じている。男性 と非妊娠の女性において、ＬＨ／ＣＧ−Ｒは、下垂体前葉が産生じ分泌する黄体 形成ホルモン（ＬＨ）にのみ露出される。しかし妊娠中は、卵巣のＬＨ／ＣＧ− Ｒも、胎盤で作られるコリオゴナドトロピン（ＣＧ）に露出される。

ＬＨ／ＣＧ−Ｒの構造の解明の進行が、この受容体の量が少ないことと分解しや すいということによって妨げられている（Ｍ、　Ａｓｃａｌｉ等、　Ｅｎｄｏｃ ｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、、　１０巻、２７頁、　１９８９年）。ラットのＬＨ／ＣＧ 受容体が最近、偽妊娠のラットの卵巣から精製されたが（１，Ｒｏｓｅ＠ｂｌｉ ｔ等、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２３巻、　２２８４頁、　１！１１ ８８年）、また豚の畢丸から精製されたという報告がある（Ｊａｌｌａｌ、　Ｂ 、等、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｎｕｔｒ。

Ｄｅｖ、、　２８巻、　１１７７頁、１９８８年）。

精製されたラソ）ＬＨ／ＣＧ受容体は、分子量が９３ＫＤａの単一の糖タンパク 質であることが見出された（Ｎ、　Ｒｏｓｅｍｂｌｉｔ等、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌｏｇｙ、　１２３巻、　２２８４頁、　１９８８年；　［、−Ｃ，Ｋｉｍ等 、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、。

２６１巻、　３８０７頁、　１９８６年；　Ｍ、　Ａｓｃｏｌｉ等、　Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、、　１０巻。

２７頁、　１９８９年）。しかしその他の報告は、ＬＨ／ＣＧ−Ｒが複合サブユ ニットで構成されていることを示唆している（Ｍ、Ａｓｃｏｌｉ等。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、、　１０巻、２７頁、１９８９年で総説）。

１１、ホルモン受容体分子の精製 以下に提示する方法と実施例は、ＬＨ／ＣＧ受容体（ＬＨ／ＣＧ受容体″）の単 離とｃＤＮＡのクローン化とによって説明する。しかしこのような説明は、本発 明の教示事項から逸脱することなく、ＬＨ／ＣＧ受容体のみならず、ＦＳＨとＴ ＳＨの受容体の単離とクローン化ができるように適合させることができるという ことは理解すべきである。

本発明のホルモン受容体は、各種の方法を常法通り適合させて精製することがで きる。Ｒｏｓｅｔｘｂｌｉｔ　Ｎ、等の方法ＣＥｎｄｏｃｔ’ｒｎｏ１．．１２ ３巻。

２２８４〜２２８９頁、　１９８８年）を採用するのが好ましい。受容体は、こ の方法にしたがい、アフィニティクロマトグラフィー、レクチン結合法および５ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を組み合わせることによって単離され る。

回収を容易にするために、受容体の量が多い細胞源を使用する。

ＬＨ／ＣＧ受容体の好ましい供給源はラットの黄体細胞である。ＦＳＨ受容体の 好ましい供給源はセルトーソ細胞である。ＴＳＨ受容体の好ましい供給源は甲状 腺の組織である。

組織の試料を得るには、動物を殺すかまたは手術によって所望の組織を入手する 。受容体を含有する組織を動物から取出した後、その組織を、１５０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，２０＠Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，４を含有する緩衝液（“緩衝液Ａ”） の中に入れるのが好ましい。組織は４°Ｃに保持するのが好ましい。このタンパ ク質はタンパク質分解反応に対して極めて敏感なので、使用する緩衝液には、タ ンパク質分解反応を阻害するために、５ｍＭＮ−エチルマレイミド、１０ｄフエ ニルメチルスルホニルフルオリドおよび１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有させるのが好 ましい（Ｋｅｌｌｏｋｕｍｐｕ、　Ｓ　等、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　１１ ６巻、７０７頁、　１９８５年）。

組織の試料を、組織破砕器を用いて、１０倍容積の緩衝液Ａに分散させ、次いで ホモジナイズする（１！動機駆動のテフロン乳棒を使うのが好ましい）。分散さ せた細胞製剤を遠心分離しく例えば２０，０００×ｇで３０分間）、２０％グリ セリン（“緩衝液Ｂ”）と１％ＮＰ−４０（受容体の結合活性を安定化する試薬 ）を補充した５倍容積の緩衝液Ａに再懸濁させる。得られた製剤を、次に高速遠 心分離にかける（ｘｏｏ、ｏｏｏｘｇ　、　１時間）。受容体はこの遠心分離で 生じた上澄液中に見出され、−７０℃で保存できる。

好ましい態様として、受容体分子は、さらに、リガンドとして精製ホルモンを用 いるアフィニティークロマトグラフィで精製してもよい。高度に精製されたホル モンの製剤は市販されている。このような製剤由来のホルモンは、（好ましくは ）当該技術分野の公知の方法によって、＾ｆｆ１−Ｇｅｌ　１０（米国、カリフ ォルニア州、リソチモンド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）などのような固定化樹脂に結合 させる。その樹脂を、上記緩衝液（０，５％ＮＰ−４０と２０％グリセリンを補 充したものが好ましい）中で平衡化させ、受容体分子の製剤をその中に入れて接 触させる。樹脂を適切な緩衝？＆（０，５％ＭＰ−４０を含有する緩衝液Ｂ、０ ．５Ｍ　ＮａＣ１と０．１％ＮＰ−４０を含有する緩衝液Ｂ；０．１％デオキシ コレートを含有する緩衝液Ｂ；０．１％ＮＰ−４０を含有する緩衝液Ｂ；　およ び０．１％ＮＰ−４０，２０％グリセリンおよび５ｈＭグリシンｐＨ３を含有す る溶液）で連続的に洗浄した後、好ましくは、５０ｍＭグリシンｐＨ３，０，１ ％ＮＰ−４０，２０％グリセリンおよび１００＋ａＭ　！１ａｃ１の緩衝液で受 容体分子を溶出する。

溶出された物質を受容体分子について検定するために、試料の一部を、過剰の標 識ホルモン分子の存在下でインキユベートする。放射性ヨウ素が好ましい標識で ある。好ましい受容体検定法はＲｏｃｈｅ。

Ｐ、　Ｃ，等、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　１１７巻、７９０頁、　１９８５ 年に記載されている。

検定した後、例えば、Ｂｕｅｔｔｎｅｒ、　Ｋ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、、　２５９巻。

１５０７８頁、　１９８４年の方法を用いて濾過を行うことが好ましい。受容体 分子を含有することが分かった試料画分のｐＨはトリスで中和することが好まし い。

受容体分子をさらに精製するために、コムギ胚芽凝集素による精製を行う。この 精製は、集めた受容体を含有するアフィニティ精製画分を、コムギ胚芽凝集素− アガロース（米国、カリフォルニア州、バーリントン、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ社）の存在下で培養することによって筒便に行うことができる 。吸着をおこさせた後、ゲルを洗浄して不純物を除去する。次に受容体をゲルか ら溶出しく例えば０゜１％ＮＰ−４０を含有する緩衝液Ｂなどの緩衝液中の０． ３２１　Ｎ−アセチルグリコサミンを用いる）、上記の方法で検定する。

分析ゲル電気泳動法もしくは分取ゲル電気泳動法を用いて、さらに精製すること ができる。適切な電気泳動法、例えばＫｉｍ、　１．−Ｃ，等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ、、　２６２巻、４７０頁、　１９８７年）またはＬａｅｍｍｌｉ 、　Ｕ、Ｋ。

ＣＷａｔｕｒｅ、　２２７巻、６８０頁、　１９７０年）を用いることができる 。電気泳動を行った物質の観察は銀染色法（ｔｒａｙ、　Ｗ、等、　Ａｎａｌ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１８巻、　１９７　頁、　１９８１年）などの方法で行 うことができる。分取ゲル電気泳動法にかける物質は、この方法にかける前に、 Ｈｏ１ｌｏｖａｙ、　Ｐ。

Ｗ、が報告した方法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、、　５３巻、３０４頁、 　１９７３年）で濃縮することが好ましい。

受容体タンパク質は、例えばＣｅｎｔｒｒｃａｎフィルター濃縮器を用いて濾過 ／濃縮を行うことによって精製することができる。試料はアセトンで沈澱させ次 にゲル電気泳動させてさらに精製することができる。このような電気泳動法で得 たバンドは電気溶離を行い、タンパク質のアミ７末端のアミノ酸配列を決定する のに利用できる。

あるいは、電気溶離を行った受容体タンパク質を、メタノール／クロロホルムを 用いてさらに沈澱させ、エンドペプチダーゼで消化して一組のペプチダーゼの断 片を得ることができる。次にこれらの断片の配列を決定して、そのアミノ酸配列 を明らかにすることができる。

あるいは、電気溶離を行った受容体分子をアセトンで再沈澱させ、緩衝液（例え ばトリス、ｐＨ８，５）に再懸濁させ、次いで牛酸／ＣＮ　Ｂ　ｒで切断するこ とができる。その切断生成物は、凍結乾燥し、トリシンゲル上で分離して配列を 決定することができる。高度に精製されたホルモン受容体分子（黄体形成ホルモ ン、コリオゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモンまたは甲状腺刺激ホルモンの受容 体のいずれか）を含有する製品を同定することによって、受容体分子のアミノ酸 配列を決定することができ、さらに、組換えＤＮＡ技術を適用して受容体分子を 製造することができる。

したがって、本発明には、高度に精製されたホルモン受容体分子とその使用法が 含まれるだけでなく、これら受容体分子のアミノ酸配列、これらの受容体分子を コードする遺伝子配列、このような遺伝子配列を含有するビヒクル、そのビヒク ルで形質転換された宿主、および形質転換された宿主の発現によって産生される ホルモン受容体分子も含まれる。

ホルモン受容体のアミノ酸配列を得るため、高度に精製された画分中の受容体分 子を適切な方法で回収する。このような回収は次の方法で行うことが最も好まし い。すなわち、Ｎ、　Ｒｏｓｅｍｂｌｉｔ等（Ｅｎｄ。

ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２３巻、　２２８４頁、　１４１１１１８年）に一般 的に記載されているレクチンとホルモンのアフィニティークロマトグラフィーを 行い、次にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａ＋５ｉｃｏｎ）を用いて試料を濃縮し 、次いでゲル電気泳動法で分離する方法である。回収した分子を、好ましくは自 動配列決定器を用いて配列を決定して、分子のアミノ酸配列を決定する。

いかなる適切な方法もホルモン受容体分子の配列を決定するのに用いることがで きるが、配列の決定は、Ｒｏｄｒｉｎｇｕｅｚの微小配列決定法（Ｊ、　Ｃｈｒ ｏｏ＋ａｔｏｇ、、　３５０巻、２Ｉ７頁、　１９８５年）を使用して行うのが 好ましい。あるいは、ホルモン受容体分子は、電気泳動法で精製し、電気溶離を 行った後、臭化シアンまたはリシル−Ｃ−エンドペプチダーゼによって切断する ことができる。次に、得られた断片を好ましくはＨＰＬＣもしくはトリシンゲル 法にかけ（Ｈ，Ｓｈｉｇｇｅｒ等、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｔ、　１６６巻、３６８頁、　１９８７年）、次に電気プロット法 と気相微小配列決定法に付して分離できる。次に完全分子の配列を決定すること ができる。

ＩＩ＋、ホルモン受容体分子のクローン化ホルモン受容体分子の全配列が解明さ れると受容体分子を合成できるが（例えばＭｅｒｒｉｒ　１ｅｌｄ合成法などに よって）、受容体分子をコードする遺伝子配列から組換えＤＮＡ法によって受容 体分子を製造する方が好ましい。

この目的を達成するため、その遺伝コードを用い（ＩＩａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ 、　。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第３版、　Ｗ 、Ａ、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｉｎｃ。

米国、カリフォルニア州メンロ・パーク、　１９７ｆｆ：、　３５６〜３５７　 ＪＮ）、ホルモン受容体分子の完全アミノ酸配列から、その分子をコードし発現 できるＤＮＡ分子の配列を予測することができる。

好ましい態様において、ホルモン受容体分子のペプチド断片のアミノ酸配列が解 明されると、これを用いて、全受容体タンパク質をコードできる遺伝子配列を分 離できる。この態様において、受容体分子のアミノ酸配列は、受容体分子をコー ドする遺伝子のＤＮＡもしくはより好ましくはｃＤＮＡの配列の分析によって決 定される（ｃＤＮＡの方が好ましいのは、ｃＤＮＡが、真核ゲノム配列中に存在 し原核宿主中では正しく発現できない介在配列すなわち“イントロン”を含有し ないからである）。これらの核酸配列を得るために、ホルモン受容体分子の遺伝 子もしくはｃＤＮＡの配列を含有する供Ｍ源を、ホルモン受容体分子の断片をコ ードするオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする。

このオリゴヌクレオチドプローブを製造するために、高度に精製サレタホルモン 受容体分子を回収し、臭化シアンまたはパパイン、キモトリプシン、トリプシン 、リシル−Ｃ−エンドペプチダーゼなどのようなプロテアーゼで断片にする（Ｏ ｉｋｅ、　Ｙ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ。

２５７巻、　９７５１〜９７５８頁、　１９８２年；　Ｌｉｕ、　Ｃ，等、　Ｉ ｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒ。

ｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　２１巻、　２０９−２１５頁、　１９８３年）。得られ たペプチドを、好ましくはＨＰＬＣにより、またはトリシンゲル上で分離しＰＶ ＤＦ膜に電気プロットすることによって分離し、次いでアミノ酸配列を決定する 。この作業を行うには、ペプチドは自動配列決定器で分析するのが好ましい。

１つ以上の適切なペプチド断片の配列が決定されると、そのペプチドをコードし 得るＤＮＡ配列を試験する。ペプチドが６アミノ酸長さより長ければ、この配列 の情報は、本発明のホルモン受容体分子をコードし得る遺伝子配列のクローン化 を可能ならしめるに充分な情報である。しかし、その遺伝コードは縮重している ので、１つ以上のコドンを使って特定のアミノ酸をコードさせることができる（ Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｇｅｎｅ、第３版、Ｗ、Ａ。

Ｂｅｎｊａ＋＋＋ｉｎ、ｌｉｅ、米国カリフｔルニア州メンロ・パーク、　１９ ７７年。

３５６〜３５７頁）。したがって、特定のホルモン受容体分子ペプチド断片をコ ードすることができる１つ以上のオリゴヌクレオチドの配・　列をおそらく同定 できるであろう。

特定のオリゴヌクレオチドが実際に、実際のホルモン受容体分子断片をコードす る配列を構成する確率は、異常な塩基対の関係と、特定のコドンが（特定のアミ ノ酸をコードするために）真核細胞内で実際に用いられる頻度を考慮して推定す ることができる。このような“コドン使用規則”はＬａｔｈｅ、　Ｒ，等、　Ｊ 、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、　１８３巻。

１〜１２頁、　１９８５年に開示されている。Ｌａｔｈｅの“コドン使用規則” を用いて、受容体分子断片のペプチドの配列をコードできる理論的に“最も確率 の高い”ヌクレオチド配列を含有する単一のオリゴヌクレオチドもしくは１組の オリゴヌクレオチドが同定され合成される。

上記のように、遺伝コードの縮重によって、その各メンバーが特定のペプチド断 片と雑種形成できる１セツトのいくつかのオリゴヌクレオチドを合成できるであ ろう。重要なことであるが、このオリゴヌクレオチドのセットのメンバーはすべ てペプチド断片をコードできるオリゴヌクレオチドを含有しているがそのセ、２ トの１つのメンバーだけが遺伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列 を含有している。このメンバーはそのセットの中に存在し、そのセ・ットの他の メンバーの存在下でもＤＮＡ　と雑種形成できるから、ペプチドをコードする遺 伝子をクローン化するために単一オリゴヌクレオチドを利用するのと同じ方法で 、オリゴヌクレオチドの未分画のセットを利用できる。

ホルモン受容体分子断片ペプチドをコードすることができる理論的に“最も確率 の高い”配列を含有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット は、“最も確率の高い”配列または配列のセットと雑種形成できる、相補オリゴ ヌクレオチドまたは相補オリゴヌクレオチドのセットの配列を同定するのに使用 される。このような相補配列を含有するオリゴヌクレオチドは、プローブとして 利用して、受容体分子をコードする遺伝子配列を同定し単離することができる（ Ｍａｎｉａｔｉｇ、　Ｔ、等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｋｌａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂａｒｂ ｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、米国、二ニーヨーク州、コールドスプリングハーバ−、１９ ８２年）。

ＤＮＡプローブは検出可能な基で標識をつけてもよい。このような検出可能な基 は、検出可能な物理的もしくは化学的特性を有する物質であればよい。このよう な物質は免疫検定法の分野でよく開発されているが、このような方法で一般に最 も有用な標識を本発明に適用できる。特に有用なものは酵素的に活性な基であり 、例えば酵素類（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅａ＋、、　２２巻、　１２４３頁、　１９ ７６年参照）：　酵素基質類（英国特許第１，５４８．７４１号明細書参照）； 　補酵素類（米国特許第４．２３０゜７９７号および同第４，２３８．５６５号 参照）：　酵素阻害剤類（米国特許第４．１３４．７９２号参照）；　発蛍光剤 類（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、、　２５巻、３５３頁、１９７９年参照）：　発色 団類；発光剤類［例えば、化学的発光剤および生物発光剤（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅ ｗ、、　２５巻、５１２頁、　１９７９年参照）：　特異的に結合可能なリガン ド、近位の相互作用対：ならびに放射性同位元素例えば３１．　３５５．　３２ ｐ、ｌｔＪおよび１４Ｃがある。二のような標識と標識化対は、それ自体の物理 特性（例えば発蛍光剤、発色団および放射性同位元素）またはその反応特性もし くは結合特性（例えば酵素、基質、補酵素および阻害剤）に基づいて検出される 。例えば補因子で標識をつけたプローブは、その標識が補因子である酵素および その酵素の基質を添加することによって検出できる。例えば、基質に作用して測 定可能な物質特性を有する生成物を生成する酵素を利用できる。この酵素の例と しては、特に限定はないが、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよ びペルオキシダーゼがある。

ホルモン受容体分子をコードする遺伝子配列の断片をコードできる適切なオリゴ ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドのセット（またはこのようなオリゴヌ クレオチドもしくはオリゴヌクレオチドのセットに対して相補性のオリゴヌクレ オチドもしくはオリゴヌクレオチドの七ノド）は、同定され（上記方法を用いて ）、合成され、当該技術分野で公知の方法によって、受容体分子を発現すること ができる細胞由来のＤＮＡ　もしくはより好ましくはｃＤＮＡの製品と雑種形成 させる。

“最も確率が高い”ホルモン受容体分子ペプチドをコードする配列に相補性の一 本鎖オリゴヌクレオチド分子は、当該技術分野の通常の技術者に公知の方法（Ｂ ｅｌａｇａｊｅ　Ｒ，等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５４巻。

５７６５〜５７８０頁、　１９７９年；　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等、　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉ＋ｖｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｒ　 Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　Ｎ１ｅｒｌｉｃｈ、　Ｄ、Ｐ、等＠、　Ａ ｃａｄ。

Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７６年；　Ｗｕ、　Ｒ，等、　Ｐｒｏｇ、　Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄＲｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、　２１巻、　１０１ −１４１頁、’１９７８年；　Ｋｈｏｒａｎａ、　Ｒ，Ｇ、＋５ｃｉｅｎｃｅ、 　２０３巻、　１ｉ１４−８２５頁、１９７９年）を用いて合成することができ る。さらにＤＮＡの合成は自動合成器を用いて実施できる。

核酸雑種形成法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ＋　ニューヨーク、１９８２年）とＨａｙｍｅｓ、　Ｂ、Ｄ、等、　（ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、米国、ワシントンＤＣ，１９ ８５年）が開示している。ホルモン受容体分子をコードするＤＮＡ配列は各種の ソースから誘導することができる。これらの受容体分子のいずれかをコードする １ＩＩＲＮＡは、受容体分子を産生ずるいずれかの種の組織から単離され、ノー インプロット法（Ａｌｔｉｎｓ等、　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８巻 、　２２０〜２４２頁、　１９７９年）と標識をつけたオリゴヌクレオチドプロ ーブを用いて同定することができる。このような細胞のａ＋ＲＮＡを、次に、当 該技術分野の熟練者に公知の方法でｃＤＮＡに変換する。あるいはゲノムＤＮＡ を単離して使用してもよい。使用するＤＮＡ　もしくはｃＤＮＡの供給源は、受 容体分子をフードする遺伝子配列の量を高めたものが好ましい。このような量を 高めたものは、受容体分子を高濃度で産生ずる細胞からＲＮＡを抽出することに より得られるｃＤＮＡから最も容易に得ることができる。ＬＨ，ＣＧについてこ のような細胞は黄体細胞である。ＴＳＨについてこのような細胞は甲状腺細胞が ある。ＦＳＨについて好ましい細胞源はセルｈ−ＩＪ細胞もしくは未熟の顆粒層 細胞である。

本発明のホルモン受容体分子をコードする遺伝子配列をクローン化するのに、各 種の方法を使用することができる。このような方法の１つでは、受容体分子をコ ードできる遺伝子配列を含有する挿入断片の存在について、ｃＤＮＡ挿入断片の シャトルベクターライブラリー（所望の受容体分子を発現する細胞由来）を分析 する必要がある。このような分析は細胞をベクターでトランスフェクトし、次い で受容体分子の発現を検定することによって行うことができる。

本発明の受容体分子のいずれかをコードすることができる遺伝子配列を同定して クローン化するために、ＤＮＡ　もしくはより好ましくはｃＤＮＡのライブラリ ィを、上記のオリゴヌクレオチドプローブと雑種形成する性能についてスクリー ニングする。適切なりＮＡ製剤（例えばヒトのゲノムＤＮＡ）は酵素によって切 断するかまたランダムにせん断し、組換えベクターに連結する。次に、これらの 組換えベクターの前記オリゴヌクレオチドプローブと雑種形成する性能を測定す る。前記の雑種形成を行えることが分かったベクターを、次に分析し、ベクター が含有している受容体分子の配列の程度と性質を決定する。純粋に統計的な考察 に基づいて、本発明のホルモン受容体分子のいずれかをコードできる遺伝子は、 唯１８個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、（雑種 形成スクリーニング法によって）明確に同定することができる。

本発明の受容体分子をコードする遺伝子配列をクローン化する別の方法では、発 現ベクターのライブラリーを、ＤＮＡ　もしくはより好ましくはｃＤＮＡ　（受 容体分子を発現することができる細胞由来）を発現ベクターにクローン化するこ とによって調製する。次にそのライブラリーを、ホルモン受容体分子特異的抗体 と結合し、受容体分子またはその断片と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド をコードできるヌクレオチド配列を有するタンパク質を発現できるメンバーにつ いてスクリーニングされる。この態様において、ＤＮＡ　もしくはより好ましく はｃＤＮＡは、受容体分子を発現できる細胞から分離、精製される。精製された ｃＤＮＡを断片化しくせん断、エンドヌクレアーゼによる消化などによって）、 ＤＮＡ　もしくはＣＤＮＡの断片のプールを作る。次にこのプールからのＤＮＡ 　もしくはｃＤＮＡの断片を発現ベクターにクローン化し、各メンバーが特有の クローン化ＤＮＡ　もしくはｃＤＮＡの断片を含有している発現ベクターのゲノ ムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを調製する。

したがって、結局、ホルモン受容体分子の実質的に純粋な製品を製造すれば、受 容体のペプチド断片の配列を決定することができる。

この情報を用いて、これらの受容体分子のペプチド配列をコードできる理論的に “最も可能性のある”ＤＮＡ配列もしくはそのような配列のセットの配列を得る ことができる。この理論的な配列に相補性のオリゴヌクレオチドを構築すること によって（または“最も可能性の高い”オリゴヌクレオチドのセットに相補性の オリゴヌクレオチドのセットを構築することによって）、本発明の受容体分子の いずれかをコードすることができる遺伝子配列を同定し単離するプローブとして 機能しうるＤＮＡ分子（またはＤＮＡ分子のセット）が得られる。

上記の方法のような方法またはこれに類似の方法によって、次のものをコードす る遺伝子をクローン化することに成功している。すなわちヒトアルデヒドデヒド ロゲナーゼ（Ｈｓｕ、　Ｌ、Ｃ，等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８２巻、　３７７１〜３７７５頁、　１９８５ 等）、フィブロネクチン（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｓ、等、　Ｅｕｒ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ、　Ｏｒｇａｎ、　Ｊ、、　４巻、　２５１９〜２５２４頁、　１９８５ 年）、ヒトエストロゲン受容体遺伝子（買ａｌｔｅｒ、　Ｐ、等。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２巻、　７８８ ９〜７８９３頁、　１９８５年）、組構形ブラスミ／−ゲン活性化物質（Ｐｅｎ ｎｉｃａ、　Ｄ、等、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０１巻。

２１４〜２２１頁、　１９８３年）、およびヒトターム胎盤アルカリホスファタ ーゼ相補Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｋａｍ、　Ｗ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２巻、　８７１５〜８７１９頁、　１９８５年） をコードする遺伝子のクローン化に成功している。

ラットＬＨ／ＣＧ受容体分子を精製し、ラフ１−ＬＨ／ＣＧ受容体をコードでき る遺伝子配列を得るのに使用したのと同じ方法で、ラットのＦＳＨもしくはＴＳ Ｈの受容体を精製することができる。

ＬＨ／ＣＧ　、ＦＳＨおよびＴＳＨホルモンおよびそれらそれぞれの受容体の構 造と配列は哺乳類中に高度に保存されている。したがって例えば、ラッ）ＬＨ／ ＣＧの受容体は、ヒトなどの哺乳類のＬＨとＣＧに結合することができる。同様 にラットのＦＳＨとＴＳＨの受容体は（それぞれ）、ヒトなどの哺乳類のＦＳＨ とＴＳＨを捕捉することができる。これらのことから、これらのホルモンとそれ ぞれの受容体に関連する動物と特にヒトの疾患を治療するのにラットのＬＨ／Ｃ Ｇ　、ＦＳＨおよびＴＳＨの受容体を使用することかできる。

哺乳類ＬＨ／ＣＧ　、ＦＳＨおよびＴＳＨの受容体の保存された構造と配列と、 うｙトＬＨ／ＣＧ受容体をコードするｃＤＮＡ配列の解明によって、ＬＨ／ＣＧ 　、ＦＳＨまたはＴＳＨの受容体をコードする他の哺乳類からの遺伝子配列をク ローン化することができるようになる。本発明にとって特に重要なのは、上記の ラットＬＨ／ＣＧ受容体をコードする遺伝子配列を使ってヒトのＬＨ／ＣＧ、Ｆ ＳＨおよびＴＳＨの受容体分子をクローン化する性能である。

本発明の好ましい態様において、ラットのＦＳＨもしくはＴＳＨの受容体、また は他の動物（特にヒト）のＬＨ／ＣＧ　、ＦＳＨもしくはＴＳＨの受容体をコー ドする遺伝子を得る第１段階は、このような遺伝子配列を含有する細胞からＤＮ Ａ　を得る段階である（または、より好ましくはｃＤＮＡをこのような受容体を 発現する細胞から得る）。このＤＮＡ　はゲノム（もしくはより好ましくはｃＤ ＮＡ）ライブラリィを作製するのに使用される。このようなライブラリィの製造 方法はＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等が発表している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８２年）。

所望の遺伝子配列を同定し単離するために、次に上記ライブラリィを、上記配列 をコードする全う、１−ＬＨ／ＣＧ受容体、このような受容体をコードする配列 に相補性の配列、またはこのような配列のいずれかの断片のプローブ配列と雑種 形成する遺伝子配列についてスクリーニングする。したがって、例えば、ヒトＦ ＳＨ（もしくはＴＳＨ）の受容体をコードできるＤＮＡ分子を単離するために、 ヒトのＦＳＨ（またはＴＳＨ）の受容体を発現する細胞を利用してＤＮＡ（もし くはｃＤＮＡ）ライブラリィを製造する。Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等が発表し た方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　１９ｇ２年）ま たはＨａｙａ＋ｅｓ、　Ｂ、Ｄ、等が発表した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ 　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ。

Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、米国ワンント ンＤＣ，１９８５年）のような方法を利用して、上記ライブラリィのメンバーが 、上記のうｙ）ＬＨ／ＣＧ　プローブ配列を雑種形成する性能についてスクリー ニングする。

このような雑種形成は、一般に当該技術者にとって公知なので、非常に類似した 配列（高い緊縮性（ストリンジエンシー））を有する２つの遺伝子配列間にのみ 安定なハイブリッドを形成することができるように、または、このようなハイブ リッドをより分岐した配列（低い緊縮性）を有する２つの遺伝子間に形成するこ とができるように、各種のストリンジエンシー条件下で行うことができる。高緊 縮性の条件は、高温（例えば５０〜６５°Ｃ）と高濃度のホルムアミドのような 試薬（例えば５０％ホルムアミド）とを採用する。低緊縮性の条件は、低温（約 ４２°Ｃ）と低濃度のホルムアミドのような溶剤（例えば２０〜４０％ホルムア ミド）とを利用する（Ｌａｗｌｅｒ、　Ｍ、等＋　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔ ｒａｎｓｐｌ、、　３巻、４７３頁、　１９８８年；　Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙ ａ、　Ｓ、等、　Ｉｎｄ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｒｅｓ、、　８７巻、１４４頁、 　１９８８年；　Ａｒ１ｆ、　Ｂ、Ｍ、等＋　ＶｉｒｕｓＲｅｓ、、　２巻、８ ５頁、　１９８５年；　５ａｉｔｈ、　Ｇ、Ｅ、等、　Ｖｉｒｏｌ、、　１２３ 巻、３９３頁、　１９８２年；　Ｐｒ１ｅｓｔｌｙ、　Ｊ、Ｖ等、旧５ｔｏｃｈ ｅｔ、　８９巻、４６７頁、１９８８年；　Ｒｏｈｒｍａｎｎ、　Ｇ、Ｆ等、　 Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６２巻、１３７頁、　１９８２年）。４２° Ｃと２０％ホルムアミドの雑種形成条件を利用すると、約１０％の相同性を有す る２つの遺伝子配列は安定なハイブリッドを生成することができる（Ｒｏｈｒｍ ａｎｎ、　Ｇ、Ｆ、等、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６２巻、１３７頁 、　１９８２年）。

プローブと雑種形成することができるライブラリィのメンバーが同定されると、 それがＬＨ／ＣＧ　、ＦＳＨもしくはＴＳＨの受容体分子（またはその断片）を コードするか否かを決定する必要がある。このような特性決定は、いくつかの方 法のどれかで簡便に実施することができる。好ましくは、その遺伝子配列を、適 切な宿主細胞に導入し、発現させ、発現した受容体をＬＨ，ＣＧ、ＦＳＨまたは ＴＳＨと結合する性能について試験する。ＬＨ，ＣＧＳＦＳＨもしくはＴＳＨと 結合できる受容体を発現する遺伝子配列は、それぞれ、ＬＨ，ＣＧ、ＦＳＨもし くはＴＳＨの受容体をコードする。あるいは発現された分子と、ＬＨ／ＣＧ　、 ＦＳＨもしくはＴＳＨの受容体に対して反応性の抗体（後記のようにして製造さ れる）と結合する性質について試験することができる。グレーヴ；病にかかって いる、史書が産生ずる自己抗体は、発現された受容体ズＴＳＨ受容体なのか否か を決定するのに利用できる。

発現された分子がＬＨ，ＣＧ、ＦＳＨまたはＴＳＨと結合で−ない場合は、単離 された配列が所望の遺伝子配列の断片だけをコードすると結論することができる 。したがって、単離された遺伝子６列は、所望の遺伝子配列の欠いている断片を 同定し単離するのに月いられる（Ｂｅｎｄｅｒ、　Ｗ、等、　Ｊ、　Ｓｕｐｒａ ｍｏｌｅｃ、　５ｔｒｕｃ、、　ｔｏ　（Ｓｕｐｐｌ）。

２頁、　１９７９年；　Ｃｈｉｎａｕｌｔ、　Ａ、Ｃ，等、　Ｇｅｎｅ、　５巻 、１１１頁、　１９７９年：Ｃ１ａｒｋｅ、　Ｌ、等、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８ ７巻、５０４頁、　１９８０年）。このような６列が同定され単離されると、組 換えＤＮＡ技術の公知の方法を用いて所望の全受容体分子をコードできる単一の 遺伝子配列を構築することができる。

本発明のホルモン受容体分子の共有結合による修飾法は本発明９範囲に含まれる 。約１００までの残基を有する変異体ホルモン受容付分子の断片は、インビトｏ 合成法で簡便に製造することができる。

ズ　このような修飾は、精製または粗製のタンパク質の標的アミノ酸残が　基を 、選択された側鎖もしくは末端の残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させ ることによって、分子に導入することができる。

き　得られた共有結合誘導体は、生物活性に対して重要な残基を同定す−ること を目的とするプログラムに有用である。

配　システイニル（システィン）残基は、ごく普通に、クロロ酢酸も用　しくは クロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート類（および３　対応するアミン 類）と反応し、カルボキシメチル誘導体もしくはカニ　ルボキシアミドメチル誘 導体を生成する。またシステイニル残基は、記　プロモトリフルオロアセトン、 α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）Ｉ　プロピオン酸、クロロアセチルリン 酸、Ｎ−アルキルマレイミド類、Ｃ３−二トロー２−ピリジルジスルフィド、メ チル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクソ安息香酸、２〜クロロメル クリ−４−二トロフより　ノール、またはクロロづ一ニトロベンゾー２−オキサ ー１．３−ジアゾ一本　ルと反応させて誘導体化される。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５，５〜７．０にてジエチルプロカルボネートと反応し て誘導化される。というのは、この試薬は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異 的だからである。ｐ−プロモフェナンルブロミドも有用であるが、その反応は、 ｐＨ６，０にて０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で実施するのが好ましい。

リシニル残基とアミノ末端残基は、コハク酸などのカルボン酸の無水物と反応す る。これらの試薬による誘導体化は、ソシニル残基の電荷を逆にする作用がある 。α−アミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬には、メチルビコリンイミ ダート、のごときイミドエステル類、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、 クロロボロノーイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、０−メチルイソ尿 素：２．４ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触 媒反応がある。

アルギニル残基は、１つもしくはいくつかの通常の試薬、とりわけフェニルグリ オキサール、２，３−ブタンジオン、ｌ、２−シクロヘキサンジオン、およびニ ンヒドリンとの反応で修飾される。アルギニン残基を誘導体化するには、そのグ アニジノ官能基のｐＫａ値が高いためにアルカリ条件で反応を行う必要がある。

さらにこれらの試薬は、す／ンの基およびアルギニンのε−アミノ基と反応する 。

チロシル残基自体の特異的な修飾は広く研究されているが、芳香族ジアゾニウム 化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロノル残基にスペクトルラ ベルを導入することに特別の関心が集まっている。Ｎ−アセチルイミダゾールと テトラニトロメタンそれぞれを、０−アセチルチロシル種と３−二トロ誘導体を 生成させるのに使用するのが最も普通である。チロシル残基は、　′Ｉ−もしく は＋３１１を用いてヨウ素化されて、ラジオイムノアッセイに用いる標識タンパ ク質が生成されるが、上記のクロルアミンＴ法が適切である。

カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル− ３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３ （４アゾニア４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミ ド類（Ｒ″−Ｎ−Ｃ−トＲ’）との反応が選択的に修飾される。さらにアスパル チル残基とグルタミル残基は、アンモニウムイオン類との反応によって、アスパ ラギニル残基とグルタミニル残基に変換される。

二価性試薬による誘導体化は、ホルモン受容体分子融合ポリペプチドを切断して 、切断されたポリペプチドを放出し回収する方法に使用するため、ホルモン受容 体分子を水不溶性支持体のマトリックもしくは表面に架橋するのに有用である。

通常用いられる架橋剤には、例えば１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェ ニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、 例えば、４−アゾ−サリチル酸とのエステル、３．３”−ジチオビス（スクシン イミジルプロピオネート）のようなスクシンイミジルエステル類を含むホモ二価 性イミドエステル類、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような 二価性マレイミド類が含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ ］プロビオイミダートのような誘導化試薬は、光の存在下で架橋を作ることがで きる光活性化性中間体を生成する。あるいは、臭化ソアンで活性化される炭水化 物のような反応性の水に不溶のマトリックス、および米国特許第３．９６９．２ ８７号、同第３．６９１．０１６号、同第４．１９５．１２８号、同第４．２４ ７．６４２号、同第４，２２９、５３７号、および同第４．３３０．４４０号に 記載されている反応性基質が、タンパク質の同定化に用いられる。

グルタミニル残基とアスパラギニル残基は、脱アミド化されて、対応するグルタ ミル残基とアスパルチル基とすることが多い。あるいは、これらの残基は弱酸性 条件下で脱アミドされる。いずれの形態のこれらの残基も本発明の範囲に含まれ る。他の修飾としては、プロリンとリシンのヒドロ牛ンル化、セリルもしくはチ オニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン の側鎖のα−アミ７基のメチル化（Ｔ、Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔ ｉｅｓ、　ＬＬ　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、米国サンフランシスコ、７９〜 ８６頁、　１９８３年）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびいくつかの例での Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

またホルモン受容体分子のアミノ酸配列変異体はＤＮＡの突然変異によって製造 することができる。このような変異には、例えば図１に示すアミノ酸配列内の残 基からの欠失、またはこの配列への挿入もしくは置換が含まれる。欠失、挿入お よび置換の組合せは、最終構築物が所望の活性をもっている限り、最終構築物を 得るために実施してもよい。変異体をフードするＤＮＡ　に行われる突然変異に よって、変異配列を読み枠辺外の部位に置いてはならず、かつ２次のｍＲＮＡ構 造を生成することがある相補領域を作らない方が好ましいことは明らかである（ ヨーロッパ特許願公開第７５．４４４号参照）。

遺伝レベルで、これらの変異体は通常、ホルモン受容体分子をコードするＤＮＡ のヌクレオチドに部位特異的突然変異を誘発させ、変異体をコードするＤＮＡ　 を生成させ、次いでそのＤＮＡ　を組換え細胞培養で発現させることによって製 造される。その変異体は、一般に、天然に生成する類似体と同じ性質の生物活性 を示す。

アミノ酸配列の変異を導入する部位は予め決めであるが、突然変異自体は予め決 める必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の実施を最適化するために、 ランダム突然変異誘発を標的のコドンもしくは領域で実施し、次いで発現された 変異体を、所望の活性の最適の組合せについてスクリーニングする。公知の配列 を有するＤＮＡ内の予め決められた部位に置換による突然変異を行う方法は公知 の例えば部位特異的突然誘発法である。本発明によるホルモン受容体分子の変異 体の製造は、そのタンパク質の初期に製造された変異体もしくは非変異体をコー ドするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法で行うのが好ましい。部位特異的突然 変異誘発法によれば、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌ クレオチド配列と充分な数の隣接するヌクレオチドを用いてホルモン受容体分子 の変異体を製造することができ、充分な大きさと配列の複雑性を有するプライマ ー配列が提供され、欠失接合部の両側にわたって横断する安定な二本鎖体が形成 される。一般に長さが約２０〜２５ヌクレオチドのプライマーが好ましく、変え られる配列の結合部の両側約５〜１０の残基を持つ。一般に部位特異的突然変異 誘発法は当該技術分野では公知であり、例えばＡｄｅｌｍａｎ等、ＤＮＡ、２巻 、１８３頁、　１９８３年のような刊行物がある。知られているように、部位特 異的突然変異誘発法は一般に、一本鎖形と二本鎖形の両方で存在するファージベ クターを利用する。部位特異的突然変異誘発法に有用な代表的なベクターには、 例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇ等、　Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓ ｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ ｔ　ＤＮＡ、編者Ａ、　Ｗａｌｔｏｎ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　アムステルダム 、　１９８１年に発表されているＭ１３ファージのようなベクターが含まれる。

これらのファージは、容易に購入することができ、その使用は当該分野の技術者 には周知のことである。あるいは、一本鎖ファージの複製開始点を含有するプラ スミド（Ｖｅｉｒａ等、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５３巻、３頁、　 １９８７年）を利用して一本鎖ＤＮＡ　を得ることができる。

一般に、本発明による部位特異的突然変異誘発法では、まず、関連のタンパク質 をコードするＤＮＡ配列を配列内に有する一本鎖ベクターを得る。所望の変異配 列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成法で、例えばＣｒｅａ 等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、７５巻、 　５７６５頁、　１９７８年の方法で製造される。次にこのプライマーを、一本 鎖タンパク質配列を含有するベクターとともにアニーリングに付し、イー・コリ （大腸菌）ポリメラーゼ■クレノー断片のようなりＮＡ重合（ポリメライジング ）酵素に暴露して、突然変異を有する鎖の合成反応を完成する。したがって突然 変異がなされた配列と第２の鎖は所望の突然変異部をもっている。次にこのヘテ ロ二本鎖ベクターを用いてＪＭ　１０１細胞のような適当な細胞を形質転換し、 突然変異がなされた配列の配置をもつ組換えベクターを含有するクローンを選択 する。

このようなりローンを選択した後、突然変異がなされたタンパク質領域を取出し 、タンパク質産生用の適切なベクター内に、一般に、適当な宿主の形質転換に用 いることができる種類の発現ベクター内に配置する。

アミノ酸配列の欠失は一般に約１〜３０の残基でより好ましくは１〜１０の残基 であり、一般に隣接している。

アミノ酸配列の挿入には、１つの残基ないし特に制限なしの長さのポリペプチド のアミノ末端および／またはカルボキシル末端への融合と、単一もしくは多数の アミノ酸残基の配列内挿入がある。配列内挿入（すなわち、完全なホルモン受容 体配列内への挿入）は一般に約１〜ｌＯの残基の範囲であり、より好ましくは１ 〜５の残基である。末端挿入の例には、宿主細胞と相同か非相同かにかかわらず 、ホルモン受容体分子のＮ末端にシグナル配列を融合することが含まれ、この融 合によって、組換え宿主からの成熟ホルモン受容体分子の分泌が容易になる。

第３グループの変異体は、ホルモン受容体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残 基、好ましくは１つだけのアミノ酸残基が除かれ、異なる残基がその場所に挿入 された変異体である。このような置換は、ホルモン受容体分子の特性をうまく調 節したい場合、下記の表１にしたがって行うのが好ましい。

表１ 元の残基　代表的な置換基 Ａ　ｌａ　ｇｌｙ；ｓｅｔ Ａｒｇ　１ｙｓ Ａｓｎ　ｇｌｎ；ｈｉｓ Ａｓｐ　ｇｌｕ Ｇ　Ｉｙ　ａｌａ；ｐｒ。

）（ｉ５　ａｓｎ；ｇｉｎ ｌ　１ｅ　ｌｅｕ；ｖａｌ Ｌｅｕ　ｉｌｅ；ｖａｌ Ｌ　ｙｓ　ａｒｇ；ｇｉｎ：ｇｌｕ Ｍｅｔ　ｌｅｕ；ｔｙｒ；１ｌｅ Ｐｈｅ　ｍｅｔ；ｌｅｕ；ｔｙｒ Ｔｙｒ　ｔｒｐ、ｐｈｅ Ｖ　ａｌ　ｉ　ｌｅ；ｌｅｕ 機能もしくは免疫学的特性の実質的変更は、表１の基よりも保存性が低い置換基 を選択することによりなされるが、すなわち、（ａ）例えばシート状もしくはら せん状形態の、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位にお ける分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持する作用にお いてより有意に異なる残基を選ぶことによって行われる。この置換は一般に次の 置換と考えられる。すなわち、（ａ）グリシンおよび／またはプロリンが他のア ミノ酸によって置換されるかまたは欠失されるかまたは挿入され、（ｂ）親水性 残基の例えばセリルもしくはトレオニルが、疎水性残Ｌ　例えばロイシル、イソ ロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルの代わりに用いられるかも しくはこの疎水性残基で置換され；　（ｃ）　／スティン残基が、他の残基の代 わりに用いられるかもしくは他の残基で置換され；（ｄ）電気的陽性の側鎖を有 する残基、例えばゾシル、アルギニルもしくはヒスチジルが、電気的陰性の電荷 を有する残基の例えばグルタミルもしくはアスパルチルの代わりに用いられるか または上記の電気的陰性の電荷を育する残基で置換され；または（ｅ）かさ高い 側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、このような側鎖をもっていない 残基例えばグリシンの代わりに用いられるかまたは後者の基で置換される、置換 である。

はとんどの欠失、挿入および特に置換によって分子の特性が急激に変化するとは 考えられない。しかし、置換、欠失または挿入を行う前にその正確な作用を予測 することか困難な場合、当該技術分野の技術者は、その作用が日常のスクリーニ ング検定法で評価されることを知っているであろう。例えば、変異体は、一般に 、未変性のホルモン受容体分子をコードする核酸に部位特異的突然変異を起こさ せ、得られた変異体の核酸を組換え細胞培養で発現させ、次いで、例えば、ポリ クローナル抗ホルモン受容体分子カラムに免疫アフィニティ吸着させて（変異体 を少なくとも１つの残留免疫エピトープに結合させて吸着させるため）、細胞培 養物から任意に精製することによって製造される。

次に細胞溶解物または精製されたホルモン受容体分子変異体の活性を、所望の特 性についての適切なスクリーニング検定法でスクリーニングする。例えばホルモ ン受容体分子の免疫学的特性の変化、例えば所定の抗体に対する親和性の変化は 、競合形の免疫検定法で測定される。免疫調節活性の変化は適当な検定法で測定 される。酸化還元に対する安定性もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質分解反 応に対する感受性、または担体によって凝集したりもしくは多量体になる傾同の ごとき、タンパク質の特性の修飾は、当該技術分野の熟練者にとって公知の方法 で検定される。

■、ホルモン受容体分子の発現 ＬＨ，ＣＧ、ＦＳＨまたはＴＳＨに対するホルモン受容体分子をコードするＤＮ Ａ　もしくはｃＤＮＡ分子は作動可能（機能的）に発現ベクターに連結され、次 に宿主細胞に導入され、該細胞によって受容体分子を発現させることができる。

２つのＤＮＡ配列（例えばプロモーター領域の配列および所望の受容体分子をコ ードする配列）は、これらの配列の連結部の性質が、（１）フレームシフト変異 を導入していないか、（２）所望の受容体分子をコードする遺伝子配列の転写を 指令するブローモーター領域の配列の性能を妨害しないか、または（３）プロモ ーター領域の配列で転写されるべき所望の受容体分子の遺伝子配列の性能を妨害 しないならば、作動可能に連結されているといえる。

ホルモン受容体分子をコードするＤＮＡ配列は、連結するための平滑末端化もし くはスタガー末端化、受容体分子に適切な末端を与える制限消化、適切な付着末 端の充填、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼによる処理 、および適切なりガーゼによる連結（リゲーション）を含む通常の方法にしたが って、ベクターＤＮＡ　によって組換えることができる。

本発明には、原核細胞もしくは真核細胞内での所望の受容体分子の発現が含まれ る。好ましい真核宿主としては、生体内もしくは組織培養での酵母　［特にサツ カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　ＦＥのもの］、真ｍ［特にアスペ ルギルスＣＡｓｐｅｒｇｉ　１１１１５）属のものＦ　、Ｉｌｉ乳類の細胞（例 えばヒトもしくは霊長類の細胞）が挙げられる。

酵母と哺乳類の細胞は本発明の好ましい宿主である。このような宿主を使うと、 グリコジル化を含む翻訳後のペプチドの修飾を実施できるという大きな利点があ る。これらの宿主で所望のタンパク質を産生させるのに利用できる強力なプロモ ーター配列と高コピー数のプラスミドを利用する多数の組換えＤＮＡ法がある。

酵母は、クローン化された哺乳類遺伝子の生成物上のリーダー配列を認識して、 リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳類の 細胞は、正しい部位における正しい折りたたみもしくはグリコリル化を含む、タ ンパク質分子に対する翻訳後の修飾を行う。

宿主として有用な哺乳類の細胞には、ＶＥＲＯもしくはＣＨＯ−Ｋｌおよびその 誘導体のような繊維芽細胞起源の細胞が含まれる。哺乳類の宿主用には所望の受 容体分子を発現させるためのいくつもの可能性のあるベクター系を人手できる。

広範囲の転写調節配列と翻訳調節配列が、宿主の種類に応じて採用される。転写 調節シグナルと翻訳調節シグナルは、ウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシ 乳頭腫ウィルス、７ミアンウイルスなどから誘導され、この場合には、調節シグ ナルが、高レベルの発現性を有する特定の遺伝子に連結されている。あるいはア クチン、コラーゲン、ミオシンなどのような哺乳類の発現産物からのプロモータ ーが利用される。抑制もしくは活性化を行う転写開始調節シグナルを選択して遺 伝子の発現を調節することができる。温度感受性であるために温度を変えるこ七 によって発現を抑制もしくは開始できる調節シグナル、または化学的調節を受け 易い調節シグナル、例えば代謝生成物は重要である。

所望の受容体分子を真核宿主に発現させるには、真核調節領域を使用する必要が ある。このような領域は一般に、ＲＮＡの合成の開始を指令するのに充分なプロ モーター領域を含有している。好ましい真核プロモーターは、マウスメタロチオ ネイン遺伝子（Ｒａｗｅｒ、　Ｄ、等。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、、　１巻、　２７３〜２８ｇ頁、　１９ ８２年）；ヘルペスウィルスのＴＫプロモータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、、　 Ｃｅ１ｌ、　３１巻、　３５５〜３６５頁。

１９８２年）；　ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，等、　Ｎ ａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ。

ｎ）、　２９０巻、　３０４〜３１０頁、　１９１１１１年）；　酵母ｇａ１４ 遺伝子プロモーター　（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｓ、Ａ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７９巻、６９７１〜６９７５頁 、１９８２年；　５ｉｌｖｅｒ、　Ｐ、Ａ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、（［ｌ５Ａ）、　８１巻、　５９５１〜５９５５頁、　１９ ８４年）を含有している。

をコードするコドンで開始される。このため、真核プロモーターと、所望の受容 体分子をコードするＤＮＡ配列との連結部分は、メチオニンをコードできる介在 コドン（すなわちＡＵＧ）を含有していないことが保証されていることが好まし い。このようなコドンが存在すると、融合タンパク質が生成したり（ＡＵＧコド ンが、所望の受容体分子をコードするＤＮＡ配列と同じ読み枠内にある場合）、 またはフレームシフト変異を起こしたりする（＾ＵＧコドンが、所望の受容体分 子をフードする配列と同じ読み枠内にない場合）。

ホルモン受容体分子の発現は、原核細胞でも実施することができる。好ましい原 核宿主には、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、バシラス（堕コリである。特に 重要な細菌宿主には、イー・フリに１２菌株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）、 イー・コリＸ１７７６　（ＡＴＣＣ３１５３７）、イー−）り買３１１０　（Ｆ −９λ〜および原栄養性（ＡＴＣＣ２７３２５））および他の腸内細胞［例えば サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ＋ ＋＋）またはセラチア・マルセｙセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅ ｎｓ）　、ならびに各種のシュードモナス属の種が含まれる。原核宿主は、発現 プラスミド中のレプリコンと制御配列と適合しなければならない。

所望の受容体分子を原核細胞［例えばイー・コリ、ビー・サチリス（Ｂ、　５ｕ ｂｔｉｌｌｉｓ）、シュードモナス属、ストレプトマイセス属などコ中で発現さ せるには、所望の受容体分子をフードする配列を機能性原核プロモーターに作動 可能に連結する必要がある。このようなプロモーターは、構成プロモーターであ ってもよく、より好ましくは調節可能なプロモーター（すなわち誘発可能もしく は抑制解除可能なプロモーター）である。構成プロモーターの例には、バクテリ オファージλのｉｎｔプロモーター、およびｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺 伝子のｂａａプロモーターなどが含まれる。誘発可能な原核プロモーターの例に は、バクテリオファージλの大きな左と右のプロモーター（ＰＬとＰＲ）、イー ・コリのｔｒｐ、　ｒｅｃＡ、１ａｃＺ、１ａｃｌ、　ｇａｌおよびｔａｃのプ ロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ、１．等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、、１６２巻、１７６〜１８２頁、１９８５年）、ビー・サチリスのσ− ２８−特異的プロモーター（Ｇ　ｉ　Ｉｍａｎ、　Ｍ、　Ｚ、等、　Ｇｅｎｅ、 　３２巻、１１〜２０．１９８４年）　、バシラス属のバクテリロファージのプ ロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ。

Ｔ、　Ｊ、、　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ｂａｃｉｌｌｉ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＩｎｃ、　＋　米国ニューヨ ーク、１９８２年）、およびストレプトマイセス属のプロモーター（Ｗａｒｄ、 　Ｊ、Ｍ、等、　Ｉｉ！ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０３．４６８〜４ ７８頁、　１９８６頁）が含まれる。原核プロモーターについては次のような総 説がある。すなわち、Ｇ１１ｃｋ、　Ｂ、Ｒ，、Ｊ、ｌｎｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、　１巻、　２７７〜２ｇ２頁、　１９８７年；　Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、 　Ｙ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、　６８巻。

５０５〜５１６頁、　１９８６年：およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、　Ｓ、、　Ａｎ ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、。

１８巻、４１５〜４４２頁、１９８４年である。

原核細胞内で適切な発現を行うには、遺伝子をコードする配列の上流にリポソー ム結合部位が存在する必要がある。このようなリポソーム結合部位は、例えばＧ ｏｌｄ　Ｌ、等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３５巻、３ ６５〜４０４頁、１９８１年に報告されている。

所望の受容体分子をコードする配列と作動可能に連結されたプロモーターは、非 複製性のＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）分子として（これらは線状分子であってもよ くまたはより好ましくは閉じた共有結合の円形分子である）宿主の原核細胞もし くは真核細胞に導入できる。

このような分子は自己複製を行えないので、所望の受容体分子の発現を、導入さ れた配列の一過性の発現によって起こしてもよい。あるいは、永久発現を、導入 された配列を宿主の染色体に取込ませることによって起こしてもよい。

１つの態様では、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に組込むことができるベ クターが用いられる。導入されたＤＮＡをその染色体に安定に組込まれた細胞は 、発現ベクターを含有する宿主細胞を選択できる１つ以上のマーカーを導入する ことによって選択することができる。マーカーは、宿主の栄養素要求性（共通の 酵母栄養素要求性マーカーである１ｅｕ２もしくはｕｒａ３のような）、殺生物 剤、例えば抗生物質、または銅などの重金属に対する抵抗性を補足する。

選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結するか、 または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入するとよい。

好ましい態様では、導入された配列は、受容宿主中で自己複製ができるプラスミ ドもしくはウィルスのベクターに組込まれる。広範囲のベクターのいずれかがこ の目的に使用できる。特定のプラスミドもしくはウィルスのベクターを選択する 際に重要な因子としては次のものが挙げられる。すなわち、そのベクターを含有 している受領細胞が、そのベクターを含有していない受領細胞から識別されて選 択される容易さ、特定の宿主に望まれるベクターのコピー数；およびそのベクタ ーが異なる種の宿主細胞間をシャトルすることが望ましいか否かである。

一連の酵母遺伝子発現系を利用することができる。このような発現ベクターの例 には、酵母（２μｍ円形）、発現プラスミドのＹＥＰ１３、ＹＣＰおよびＹＲＰ など、またはその誘導体が含まれる。このようなプラスミドは当該技術分野では 公知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、等、　Ｍｉａｍｉｆｎｔｒ、　Ｓｙｍｐ 、、　１９巻、　２６５〜２７４頁、　１９８２年；　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ ，、、ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ 　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄＩｎｈｅｒｉ ｔａｎｃｅ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、米国、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ−、４４５〜４７０頁、　 １９８１年、Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，、Ｃｅ１１．、２８巻、　２０３〜２０ ４頁、　１９８２年）。

哺乳類の宿主については、発現用に可能性があるベクター系を人手できる。第１ のクラスのベクターは、ウシパピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノ ウィルスもしくはＳＶ４０ウィルスのような動物ウィルス由来の自己複製する染 色体外プラスミドを与えるＤＮＡ要素を利用するものである。第２のクラスのベ クターは、所望の遺伝子配列の宿主染色体への組込みに依存している。導入され たＤＮＡを染色体に安定に組込んだ細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞を 選択できる１つ以上のマーカーを導入することによって選択される。そのマーカ ーは、栄養素要求性宿主のプロトトロビイ性、殺生物剤耐性、例えば抗生物質、 または銅などの重金属への耐性を提供する。選択可能なマーカー遺伝子は、発現 すべきＤＮＡ配列に直接連結するか、または同時形質転換によって同じ細胞に導 入することができる。またｍＲＮＡの最適の合成を行うには追加の要素が必要で ある。これらの要素には、転写プロモーター、エンハンサ−および終止／グナル のみならずスプライスシグナルが含まれる。

このような要素を組込むｃＤＮＡ発現ベクターには、０ｋａｙａｔａａ、　Ｈ， 。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．、　Ｂｉｏｌ、、　３巻、２８０頁、１９８３年などに記 載されているベクターが含まれる。

好ましい原核ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅｌ、ｐｓｃｌｏｌ、 ｐＡＣＹＣｔｇ４、ｒｒＶＸのようなイー・コリ中で複製できるプラスミドのご ときプラスミドである。このようなプラスミドは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、 　Ｔ、等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｊ ｆａｒ＋ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、米国 、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ−、１９８２年）に発表されてい る。バシラス属細菌のプラスミドには、ｐｃ１９４　、ｐｃ２２１　、ｐＴ１２ ７などがある。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、、　Ｔｈｅ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、　Ａｃ ａｄｅｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク、　３０７〜３２９頁、１９８２ 年に開示されている。適切なストレプトマイセス属の細菌のプラスミドには、ｐ ｌＪＩＯＩ　（Ｋｅｎｄａｌｌ、　Ｋ、Ｊ、等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、１６９巻、　４１７７〜４１８３頁。

１９８７年）、およびｆｃ３１のようなストレプトマイセス属の細菌のバクテリ オファージ（Ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ、Ｆ、等、　５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｇｉｕ＃　０＋１　ＡｃｔｒｎｏｍｙｃｅｔａＩｅｓ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、　Ａｋａｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ、ハンガリー、ブタベスト、 ４５〜５４頁、１９８６年）が含まれる。シュードモナス属のプラスミドは、Ｊ ｏｈｎ、　Ｊ、　Ｆ等、　Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　８巻、　６９３ 〜７０４頁、　１９８６年と、Ｉｚａｋｉ＋　Ｋ、、　Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、、　３３巻、　７２９〜７４２頁、　１９７ｇ年の総説がある。

構築物を含有するベクターもしくはＤＮＡ配列が発現用に製造されると、そのＤ ＮＡ構造物は適切な宿主中に導入される。例えば原形質体融合法、リン酸カルシ ウムによる沈澱法、電気穿孔法、またはその他の通常の方法のような各種の方法 が利用される。融合した後、細胞を培地内で増殖させ、適当な活性についてスク リーニングする。配列が発現されると、ホルモン受容体分子が産生される。

本発明のホルモン受容体分子は、通常の方法、例えば、抽出法、沈澱法、クロマ トグラフィ、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などにしたがって 上記の組換え分子から単離して精製することができる。

■１本発明の分子類 本発明は、黄体形成ホルモン、コリオゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモンおよび 甲状腺刺激ホルモンの受容体に関する。本願で用いる“ホルモン受容体”という 用語には、膜結合受容体分子のみならず、可溶性の（すなわち膜結合性ではない ）全受容体分子（すなわち、ホルモン受容体の完全なアミノ酸配列をもっている ）も含まれる。“ホルモン受容体”という用語には、さらに、このような分子の 機能性誘導体が含まれる。また“ホルモン受容体”という用語には、さらに前記 分子のグルコシル化形と非グリコジル化形の両方が含まれる。

本願で用いられる、分子の“機能性誘導体”という用語はその分子の生物活性と 実質的に同じ生物活性を（機能性もしくは構造性の）もっている化合物を意味す る。“機能性誘導体”という用語には、分子の、“断片”、”変異体”、“類似 体”または“化学的誘導体”が含まれる。“断片”という用語は、分子のポリペ プチドのサブセットを意味する。ＬＨＳＣＧＳＦＳＨもしくはＴＳＨをそれぞれ 特異的に捕捉することができるＬＨ，ＣＧ、ＦＳＧもしくはＴＳＨの受容体の断 片は、本発明にとって特に重要である。“変異体“という用語は、構造と機能が 、全分子もしくはその断片と実質的に同じ分子を意味する。２つの分子が実質的 に同じ構造をもっている場合、または２つの分子が同じ生物活性をもっている場 合、一方の分子は他方の分子に対して“実質的に同じ７といわれる。したがって 、２つの分子が同じ活性をもっているならば、一方の分子の構造が他方の分子に 見られなくてももしくはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、その用語は本願 で用いられるように、両者の分子は変異体と考えられる。“類似体”という用語 は、機能が、全分子もしくはその断片と実質的に同じ分子を意味する。本願では 、ある分子が通常もっている部分でははない別の化学的部分をもっている場合は 、もとの分子の“化学的誘導体”といわれる。このような化学的部分は、分子の 溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改良する。

あるいはこのような部分は、分子の毒性を減らし、分子の望ましくない副作用な どを除くかまたは軽減する。上記の作用を仲介できる部分はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８０年）に開 示されている。“毒素誘導体化（ｔｏｘｉｎｄｅｒｉｖａｔ　１ｚｅｄ）”分子 は特定のクラスの“化学誘導体”を構成している。“毒素誘導体化”分子は、毒 素部分を含有する分子である。このような分子を細胞に結合すると、毒素部分が 細胞にきわめて接近するので、細胞の死亡が促進される。

適切な毒素部分を利用することができるが、例えばりシン毒素、ジフテリア毒素 、放射性同位体の毒素、メンブラン−チャネル形成毒素などのような毒素を使う のが好ましい。このような部分を分子に結合する方法は、当該技術分野では、公 知である。

さらに本発明は、受容体分子に結合するホルモンの作用物質（アゴニスト）と拮 抗物質（アンタゴニスト）、およびこのような作用物質と拮抗物質の機能性誘導 体に関する。本発明の作用物質と拮抗物質は、ペプチド類、タンパク質類であり 、または非タンパク質性有機分子である。上記の分子はすべて本発明の分子に含 まれる。

本願で用いる“ホルモン作用物質”という用語は、ホルモン受容体と結合するこ とができる非免疫グロブリン分子を意味し、この作用物質がホルモン受容体に結 合すると、（１）受容体に結合して生理学的に有意な（すなわち検出可能な）作 用を仲介する他の分子の能力を模して作用するか、または（２）受容体に結合し 生理学的に有意な作用を仲介する他の分子の能力を増大する。ホルモン作用物質 の例は、黄体形成ホルモンの活性を示す有機分子またはＬＨ以外のタンパク質で ある。

本願で用いる“ホルモン拮抗物質”という用語は、ホルモン受容体と結合できる 非免疫グロブリン分子を意味し、この拮抗物質がホルモン受容体と結合すると、 受容体と結合して生理学的に有意な（すなわち検出可能な）作用を仲介する他の 分子の性能を阻害もしくは弱める。

■１本発明の分子の用途 Ａ、　ホルモンの精製 本発明の分子は、各種の生化学、診断および治療の目的に用いることができる。

本発明の精製受容体分子の１つの大きな用途は、ホルモンの製造と精製における 用途である。本発明の受容体分子にはホルモンと結合する能力があるので、ホル モンの親和性精製法に利用することができる。

したがって、例えばＬＨ／ＣＧ受容体は、ＬＨもしくはＣＧの精製を促進するの に使用できる。これらのホルモンは、排卵の誘発、不妊症の治療などに利用でき る。甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨ受容体″）はＴＳＨの精製に使うことが できる。ＴＳＨは甲状腺機能不全症の治療、または（毒素誘導体化された場合） 甲状腺癌の治療に用いることができる。卵胞刺激ホルモン受容体は、同様に、不 妊症の治療などに用いるＦＳＨの精製に利用できる。さらに、ＧＰホルモン類は グリコジル化に基づいた各種の活性を示すことが分かってきたので、これらのホ ルモンの受容体は、最も高い生物活性の形態のＧＰホルモンを選択するのに使う ことができる。

Ｂ、　抗受容体抗体 本発明のホルモン受容体分子は、抗ホルモン受容体抗体の生成を誘発するのに利 用できる。このような抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、ま たはこのような抗体の抗原が結合する断片（例えばＦ（ＡＢ）断片もしくはＦ（ ＡＢ）、断片）である。本発明で特に重要なのは、ホルモン受容体分子の細胞外 ドメインに結合する抗体（および抗体の抗原結合性断片）である。最も好ましい 抗ホルモン受容体抗体（およびその抗原結合性断片）は、そのホルモンがそのホ ルモン受容体と結合するのを防止するかもしくは阻害することができる抗体であ る。

適切なポリクローナル抗体は、受容体分子の免疫原性量で（好ましくはフロイン ドアジュバントのようなアジュノマントとともに）、動物もしくはヒトを免疫化 することによって得ることができる。このような免疫化の代わりに、天然に抗受 容体抗体を産生ずる患者（例えば抗ＴＳＨ受容体抗体を産生ずるグレーグズ病の 患者）を同定するために、患者をスクリーニングしてもよい。

あるいは、モノクローナル抗体は、例えば、肺臓細胞を特定の受容体で免疫化し 、次いで免疫化した細胞をメロノー７細胞と融合させて（Ｋｏｈｌｅｒ等、　Ｎ ａｔｕｒｅ、　２５６巻、４９５頁、　１９７５年；　Ｋｏｈｌｅｒ等、　Ｅｕ ｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６巻、　５１１　ａ、１９７６年；　Ｋｏｈｌｅｒ 等、　Ｅｕｒ、Ｊ、１ｍｍｕｎ。

ｌ　６巻、２９２頁、　１９７６年；　Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ等、　Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、米国ニューヨーク、　５６３〜６８１頁、　１９８１ 年）、抗受容体モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を得ることが できる。

本発明にとって特に重要なのは、人体内で産生される抗体か、または人体内では 抗原性ではないかもしくは受領者の循環血清中に長期間保持されるように、組換 え技術などの方法で“人体に適合させた（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）″（すなわち人 体内では非免疫原性である）抗体である。

人体に適合させた抗体は、例えば抗体の免疫原性部分を、対応する非免疫原性部 分　で置換することによって作ることができる（すなわちキメラ抗体）（Ｒｏｂ ｉｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｒ，等２国際特許願公開ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２２６９号： 　Ａｋｉｒａ、　Ｋ、等、ヨーロッパ特許願第１８４．１８７号：　Ｔａｎｉｇ ｕｃｈｉ、　Ｍ、　：３−Ｃ１，、／パ特許願第１７１．４９６号；　Ｍｏｒｉ ｓｓｏｎ　Ｓ、Ｌ、等、ヨーロッパ特許願第１７３．４９４号；　Ｎｅｕｂｅｒ ｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、等、　ＰＣＴ特許願公開第ＷＯ３６１０１５３３号；　Ｃａ ｂｉｌｌｙＳｏ等、：！　−Ｏツバ特許願第１２５．０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ、 　Ｍ、等、　５ｃＩｅｎｃｅ、　２４０巻、　１０４１〜１０４３頁、　１９８ ８年；　Ｌｉｕ、　Ａ、Ｙ。

等、　Ｐｒｏｃ、　ｌ１ａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４巻、 　３４３９〜３４４３頁、　１９１１１７年：Ｌｉｕ、　Ａ、　Ｙ、等、　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３９巻、　３５２１〜３５２６頁、　１９８７年；　Ｓ ｕｎ。

Ｌ、　Ｋ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８ ４巻、　２１４〜２１ｇ頁、１９８７年；　ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ、　Ｙ、等、　 Ｃａｎｅ、　Ｒｅｓ、　４７巻、　９９９〜１００５頁、　１９８７年；　Ｔｏ ａｄ、　Ｃ，Ｒ，等、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１４巻、　４４６〜４４９頁、　１ ９８５年：　Ｓｈａｍ等、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　 ８０巻、　１５５３〜１５５！］頁、　１９８９年）。１人体に適合させた”キ メラ抗体の総説は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、、　５ｃｉｎｅｎＣ８，２２ ９巻、　１２０２〜１２０７頁、　１９１１５年とＯｉ、　Ｖ、Ｔ、等、　Ｂｉ ｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

４巻、２１４頁、　１９８６年に記載されている。

適切な“人体に適合させた”抗体は、あるいは、ＣＤＲもしくはＣＥＡ置換法（ Ｊｏｎｅｓ、　Ｐ、　Ｔ、等、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１巻、　５５２〜５２５ 頁。

１９８６年；　Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９巻、　１５ ３４頁、　１９８８年：　Ｂｅ１ｄｌｅｒ、　Ｃ，Ｂ、等、　Ｊ、ｌ＋＋ｍｕｎ ｏ１．、　１４１巻、　４０５３〜４０６０頁、１９８８年）、または米国特許 第４．８１６．３９７号および同第４．８１６．５６７号に開示されている方法 で製造することができる。

Ｃ１診断の用途 本発明の受容体分子は、ホルモン精製における用途に加えて、ホルモン活性の検 定の基準として用いられる。重要なことには、このような検定は生理学的に有意 な結合反応［すなわ、ち、ホルモンがその受容体と結合し検出可能な変化（例え ばリン酸化、開裂、化学的修飾など）を受ける］を測定するので、免疫検定法（ イムノアッセイ）（ホルモンの抗ホルモン抗体との生理学的に無意味な結合を検 出する）免疫検定法により、感度が高くより正確なようである。さらに、ＬＨ／ ＣＧ　５ＦＳＨおよびＴＳＨの受容体分子は、それぞれのホルモンを、他のホル モンから、抗体（構造が類似している分子と交差反応する）より大きい特異性で 識別することができる。

本発明の受容体分子は、抗体より感受性が高く、より正確であるが、抗体を使用 するのと同じ方法で試料中のホルモンの濃度を検定するのに使用することができ る。

また、本発明の抗受容体抗体は、患者のホルモン受容体の発現と機能を測定する ような診断の目的に使用できる。また抗受容体抗体は、組織の特性を決定したり 、または転移した受容体発現細胞の存在と部位を明らかにするための映像化に利 用できる。

診断の目的には、受容体と抗受容体抗体を免疫検定法にしたがって使用できる。

免疫検定法の例は、Ｒａｄｉｏｉｍｉｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　１ｌｅｔｈｏｄ：　 ＫｉｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒ編、　Ｅ、　＆　Ｓ、英国、ニブインバラ、 リビングストン、１９７０年の１９９〜２０６頁にＷｉｄｅ等が記載している。

したがって第１の態様では、受容体分子に検出可能に標識をつけて、試料ととも にインキユベートし、次いで試料と結合した受容体分子の量を確認することがで きる。第２の態様では、受容体またはホルモンに対する抗体を、“偽サンドイッ チ免疫検定法”を実施することに利用する。このような検定法（“正”検定法） ではホルモンを含有している疑いのある試料を、固定化抗ホルモン抗体の存在下 でインキュベートする。可溶化され、検出可能に標識をつけたホルモン受容体分 子をその反応混合物に添加し、結合した受容体の量を測定することによって、ホ ルモンの量が決定される。

通常の技術者にとっては明らかなことであるが、別の各種の方法を考案すること ができる。この検定法は、ホルモンが存在するが否か（妊娠を決定するためのｄ ａの検定のように）を決定する単純なイエス／ノーの検定法になるし、または標 識をつけた分子の測定値を、既知量のホルモンを含有する標準試料について得ら れた測定値と比較して、定量試験を行うことができる。

本発明の抗原に対して、有用である他の種類の検定法において、“同時”検定法 と“逆”検定法が用いられる。同時検定法は、固体支持体に結合させた抗体（も しくは受容体）と標識をつけた受容体（もしくは抗体）とをともに、同時に、試 験される試料に添加させるので１回のインキュベーション工程で行われる。イン キュベーションが完了した後、固体支持体を洗浄して液体試料の残渣と複合体を 形成しなかった標識抗体を除去する。次に固体支持体と結合した標識分子の存在 を、そのまま通常のサンドイッチ検定法で測定する。

“逆検定法”では、第一に標識分子（受容体もしくは抗体）の溶液を液体試料に 添加し、次に適切なインキュベション期間が経過した後、固体支持体に結合させ た非標識分子（抗体もしくは受容体）を添加する。第２インキユベーシヨンの後 、固相を通常の方法で洗浄し、被検試料の残渣と未反応標識抗体の溶液を除去す る。次に固体支持体と結合した標識抗体の測定を、同時検定法と正検定法で行っ たようにして行う。

上記のように、本発明のホルモン検定法では、少なくとも１つの分子が“リポー タ−分子”で標識されていることが必要である。本発明で用いることができる標 識の種類の例には、限定はないが、酵素標識、放射同位元素の標識、非放射性同 位元素の標識、蛍光標識、毒素標識、および化学発光標識がある。

適切な酵素標識の例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ状球菌ヌクレアー ゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α− グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオ キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダ ーゼ、β−ガラクトンダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グ ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエ ステラーゼなどが含まれる。

適切な放射性同位元素の標識の例としては、”　Ｈ、ｌ　ｌ　ｌ　Ｉｎ、１２５ １１３１１　、３！ｐ　、　３５Ｓ、　１４ｃ　、　ＳＩＣ，！７７０、Ｓ　ａ 　Ｃｏ、５８ｐｅ、　？ＳＳｅ。

１ｓｆｆＥｕ、・’　ｙ　ｓ　”　’　ｃ　ｕ　ｓ　”　”　ＣＩ　％　意１１ Ａｔ、　４？３Ｃ，寡ｏ＊ｐｄなどがある。

適切な非放射性同位元素の標識の例には、＋５７（Ｈ４，１１５Ｍｎ、ｌ１ｌＤ ｙ、”Ｔｒｓ　”Ｆｅなどがある。

適切な蛍光標識の例としては、　Ｉｓ！Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、インチ オシアナート標識、ローダミン標識、フイコエリトリン標識、フィコシアニンｍ Ｌアロフィコシアニン標識、０−フタルアルデヒド標識、フルオレサミン標識な どがある。

適切な毒素ラベルの例としては、ジフテリア毒素、リジン、コレラ毒素がある。

化学発光標識の例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジ ニウムエステル標識、イミダゾールラベル、アクリジニウム塩ラベル、シュウ酸 エステル標識、ルシフヱリン標識、ルシフェリナーゼ標識、エクオリン標識など がある。

当業者は、本発明に用いることができるその他の標識をよく知っているであろう 。これらの標識の抗体もしくはその断片への結合は、当業者が普通知っている標 準の方法を用いて実施することができる。

代表的な方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙ、　Ｊ、　Ｈ，等、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｎ、 　Ａｃｔａ、　７０巻、１〜３１頁、　１９７６年、および５ｃｈｕｒｓ、　Ａ 、Ｈ，Ｗ、Ｍ、等、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｓ、　Ａｃｔａ。

８１巻、１〜４０頁、　１９７７年に記載されている。後者の文献に記載されて いる連結方法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、シマレイミド法、ｍ− マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法である。

本発明を実施する際には、酵素標識が好ましい態様である。単一の酵素が、考え られるすべての検定法の標識として使用するのに理想的なわけではない。したが って、どの酵素が特定の検定法系に適しているかを決定しなければならない。酵 素を選択するのに重要な基準は、純品の酵素の代謝回転数（単位時間当り、酵素 部位に対して生成物に変換される基質分子の数）、酸素製剤の純度、その生成物 を検出する感度、酵素反応検出の容易さと速度、試験液中に妨害因子もしくは酵 素様活性がないこと、酵素およびその接合体の安定性、酵素およびその接合体の 入手可能性と費用などである。本発明の免疫検定法で好ましい標識として用いら れる酵素には、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダ ーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコアミダーゼ、リンゴ酸デヒ ロゲナーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。とりわ けウレアーゼが一層好ましい酵素標識である。その理由は、特にウレアーゼがそ の活性を肉眼に対して容易に目視可能にするクロモゲンｐＨ指示薬だからである 。

ホルモン受容体分子（またはその断片）をコードする核酸分子は、患者の細胞中 でのホルモン受容体の発現の程度と速度を決定するのに用いることができる。こ のような検定を実施するには、患者の細胞の試料を１ｎｓｉｔｕ（系中）雑種形 成法か、または他の適切な方法によって処理し、次に分析して、試料が、核酸分 子と雑種を形成することができるｍＲＮＡ分子を含有しているか否かを決定する 。

Ｄ、　治療用途 １、ＬＨ／ＣＧ／ＦＳＨ受容体の用途 ａ、受精能力の治療 黄体形成ホルモン、コリオゴナドトロピンと卵胞刺激ホルモンはヒトと動物の受 精能力に関与している。本発明の受容体は、これらのホルモンに結合できるので 、これらのホルモンが、標的細胞の表面に存在する受容体と結合する可能性を低 下させる。

したがって、本発明のＦＳＨとＬＨ／ＣＧ受容体の分子は、女性の卵母細胞の発 生、排卵もしくは妊娠を防止する避妊薬として用いることができる。ＦＳＨとＬ Ｈは精子を形成するのに必要であるから、ＬＨとＦＳＨの受容体を男性に投与す ると不妊になる。したかって本発明のＬＨとＦＳＨの受容体は、男性と女性のど ちら（こも、妊娠を防止するのに使用することができる。重要なのは、これらの 薬剤の避妊作用は、可逆的なことである（すなわち治療を中止すれば、患者は生 殖能力のある状態に戻る）。またこれら受容体ｌよ、女性の排卵を刺激すること ができる作用物質を同定するの↓こ利用できる。

全受容体分子は避妊薬として利用できるが、受容体分子の細胞外ドメインを含有 する全受容体分子の可溶性断片を用（するの力く好ましい。以下で考察するよう に、受容体分子の生物学的半減期を増大させるために、前記の断片を非タン／く り質分解性ポリマーζこ結合させることが好ましい。

避妊は、ＬＨ／ＣＧの受容体またはＦＳＨの受容体を、男性と女性の受用者に与 えることによって達成できるが、これらの受容体分子（またはその誘導体）の両 方を受用者に与えることによって増大した避妊効力を得ることができる。同様に 、このような分子のいずれか（また両者）をエストロゲン、プロゲステロンまた はその他のステロイドホルモンと組合わせて与えることによって避妊効力を増大 させることができる。また、避妊作用をもっているインヒビンのような他のタン パク質ホルモンを受用者に与えることによって避妊効力を強化することができる 。

受容体分子をコードする組換え分子を利用することによって、ホルモンをよりし っかりと捕捉するか、または生物活性もしくは半減期を増大された変異体（突然 変異誘発法などの方法による）を単離することができる。同様にこのような分子 は、ＦＳＨとＬＨ／ＣＧの両者を捕捉することができるハイブリ・ノド受容体分 子を構築するのに使用することができる。

本発明の避妊薬は、以下に詳細に述べるが、受用者には各種の仕方で与えること ができる。これらの薬剤は、結合形もしくは非結合形（すなわち可溶性）のいず れでも与えることができる。

ＬＨ／ＣＧ　とＦＳ）Ｉ　の受容体の上記の避妊性能に加えて、これら受容体は 、その容量によって、不妊状態を延長させて、患者内で免疫原として作用するこ とかできる。したがってこれらホルモン受容体分子は、免疫原性の形態で患者に 与えることができ、その結果、患者に、受容体分子に対する抗体を産生させる。

患者の血清中にこのような抗体が存在すると、患者を不妊にする。天然のタンパ ク質の免疫原性を増大させる各種の方法が開発されており、このような抗体を製 造するために利用することができる（Ｎ、　Ｒｏｓｅｔｍｂｌｉｔ等、Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　％　１２３巻、２２８４頁、１９８８年；　Ｃｏｐｐｉｎ ｇ、　Ｓ、等、Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ９．１０４巻、７８頁、１９８５年 ；　Ｐａ１ａ、　Ａ、等、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔ ａｂ、　、６７巻、１１９０頁、１９８８年）。

受容体の投与は、注射によって行われるが、周期的なブースター注射によって補 充するのか好ましい（注射の間隔は約１〜４ケ月、好ましくは３ケ月間）。

本発明は、特に、ＦＳＨがＦＳＨ受容体分子と結合するのを防止することができ る抗ＦＳＨ受容体抗体を誘発する方法として、ＦＳＨ受容体を動物とヒトに投与 する方法に関する。このような抗体を男性内に産生させると、精子の形成を阻害 する作用をし、そのため避妊薬として作用する。このような抗体を女性内に産生 させると卵胞の生成を阻害する作用をし、そのため避妊薬として作用する。した がってこれら受容体の投与は、避妊ワクチンを製造するのに利用される。

ｂ、　乳癌の治療 乳癌は欧米世界の大きな衆知の健康問題である。乳癌（８３５〜４５歳の女性が 死亡する主な原因の一つである。年齢、月経と出産の経過腫瘍の大きさ、陽性の 腋窩リンパ節の存在と数などの多（の因子がこの疾患の予後に影響する。

特に、エストロゲン受容体くＥＲ”）タンパク質が存在しているか存在していな いかがこの疾患の予後を決定するのにとりわけ重要であると考えられている。Ｅ Ｒのレベルが高い女性は、ＥＲのレベルが中間もしくは低い女性よりも予後が有 利である。この知見から、乳癌の患者には、エストロゲンまたはエストロゲンの 前駆物質をなくすためにエストロゲン類似体が投与される。より重篤な症例では 、副腎摘出法および／またはハイホセクトミイ　（ｈｙｐｈｏｓｅｃｔｏｍｙ） が行われる。

個体にＦＳＨ受容体を投与することによって個体のＦＳＨ分子を捕捉して、卵巣 細胞にエストロゲンを産生させるＦＳＨ分子の性質を阻害もしくは弱めることが できる。したがってこのような投与を行うとエストロゲン受容体分子が誘発され る。本発明の別の態様について以下に述べるように、この目的を達成するために 、上記の抗ＦＳＨ受容体抗体もしくは抗ＬＨ受容体抗体を投与してもよい。した がって本発明は上記の従来の治療法の代替法を提供するものである。

Ｃ１前立腺癌の治療 前立腺癌は、男性の最も普通の悪性腫瘍の１つで、癌で死亡する一般的な原因で ある。この疾患の治療法には、前立腺の外科的除去、化学療法および放射線治療 法がある。前立腺の成長が畢丸アンドロゲン類に依存していることから、前立腺 癌に対して別の治療法が提供されている。畢丸アンドロゲンのレベルは去勢もし くはエストロゲン療法によって低下させている。

本発明はこの疾患に対して別の治療法を提供するものである。先に考察したよう に、男性におけるＬＨの主な作用は、ライディヒ細胞にテストステロンを産生さ せることである。したがって、個体にＬＨ／ＣＧ受容体および／またはＦＳＨ受 容体を投与することによって、テストステロンの生合成を誘発するのに利用でき る、血清中のＬＨの量を減少させることができる。したがって、受容体を投与す るとテストステロンの合成が減少し、前立腺の成長速度を低下させる。このよう な治療法は、腫瘍の後退もしくは腫瘍の成長の停止を起こさせるには不充分であ っても、疾患の進行した段階を示すほとんどの患者の症状である骨の痛みを軽減 するのに有用である。

別の態様において、この目的を達成するために、上記の抗り、Ｈ受容体抗体を個 体に投与することができる。

ｄ、　骨粗髪症の治療 月経閉止期の多くの徴候は、女性の一生の月経閉止期間中、女性に存在するＦＳ ＨとＬＨの循環レベルが増大しているのが原因である。月経閉止期の共通の徴候 には、血管運動の不安定性（“のぼせ“）、尿性器上圧と皮膚の萎縮性、乳房の 大きさの減少および骨粗３症がある。

女性の生殖期のＦＳＨとＬＨのレベルは、月経閉止期の女性に見られるレベルよ り著しく低い。すなわちＦＳＨのレベルは約８倍に増大し、ＬＨのレベルは約６ ，５倍に増大する（Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ、　Ｒ。

Ｇ５等編集、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒ ｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　第１０版、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ　％米国、ニュ ーヨーク、１９８３年、７０４〜７０５頁）。

このホルモンの循環ｌノベルの増大は、ＦＳＨ受容体および／またはＬＨ／ＣＧ 受容体を女性に投与することによって阻止することができる。

骨粗に症という用語は、十分な骨格支持を与えるのに不充分なレベルにまで単位 容積当りの骨の質量が減少することを特徴とする多様な疾病群を述べるのに用い られる用語である。本発明は、ＬＨおよび／またはＦＳＨのレベルを低下させる ことによって骨粗髭症を（予防的もしくは治療的に）治療する方法を提供するも のである。

このような治療法で、女性はＦＳＨ受容体および／またはＬＨ／ＣＧ受容体の治 療上有効な量を投与され、ＦＳＨおよび／ＬＨの血清中のレベルを低下させるこ とができる。

ｅ、　月経閉止期間中の血管運動の不安定性の治療光に述べたように、月経閉止 期の多くの徴候は、この期間に特徴的な、ＦＳＨとＬＨの循環レベルの増大が原 因である。研究の結果、血管運動の不安定性（“のぼせ”）はＬＨレベルの上昇 に関連があることが分かった。したがって、ＦＳＨおよび／またはＬＨ／ＣＧ受 容体の投与は、骨粗髪症を治療する上記の性能に加えて、血管運動の不安定性を 治療する（すなわちこの症状を防止もしくは改善する）のに利用することができ る。

ｆ、　多嚢胞性卵巣症の治療 正常の女性では、エストロゲンのレベルは生殖周期と厳密に同調している。エス トロゲンの非同調の産生は、不妊症、多毛症、肥満症および無月経もしくは希発 月経を特徴としている。この症状は、多嚢胞性卵巣症（“ＰＣＯＤ″）と呼ばれ ている（Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ、　Ｒ，Ｇ、等編集、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐ ｒ１ｎｃｉｐｌｅＳｏｒＩｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１０版、Ｍｃ Ｇｒａｙ−旧１１．米国、ニューヨーク、１９８３年、７１０頁）。この症状は 高ＬＨレベルと低ＦＳＨレベルが特徴である。

ＰＣＯＤの治療は、エストロゲンの産生を阻止することを目的としている。この 治療は、卵巣アンドロゲンの分泌を減少させる薬剤またはＦＳＨ分泌を促進する ことによって達成することができる。

本発明は、この疾患の新規な治療法を提供するものである。ＦＳＨ受容体分子の 短期間投与は、ＦＳＨの生合成を増大させる働きがあり、そのためこの投与を中 止するとＦＳＨのレベルが増加する。ＬＨ／ＣＧ受容体を投与すると、卵巣細胞 のＬＨ／ＣＧ受容体と結合するのに利用できるＬＨの量を減少させる作用がある ので、アンドロゲンの合成量が減少する。

２、ＴＳＨ受容体の用途 先に述べたように、グレーグズ病は、ＴＳＨ受容体と結合できる免疫グロブリン の産生によって起こる（したがってＴＳＨの作用に似ている）甲状腺機能亢進症 である。この疾病は、患者に抗甲状腺薬剤を放射性ヨウ素とともに投与するか、 または甲状腺を外科で切除することによって治療される。すべての症例で、治療 の方法は、甲状腺によって産生できる甲状腺ホルモンの量を制限する方法である 。

本発明によれば、ＴＳＨ受容体の治療上の有効量を患者に投与することによって グレーヴズ病を治療することができる。投与されたＴＳＨ受容体は、グレーグズ 病を起こす免疫グロブリンと結合することができる。したがって、受容体を投与 すると、甲状腺細胞の表面上のＴＳＨ受容体と結合できる免疫グロブリンの量を 減らす働きがある。したがってＴＳＨ受容体の投与は、正常で健康な甲状腺の組 織の破壊を伴わないグレーグズ病の治療法を提供するものである。また、受容体 は、疾病が重篤なために外科手術が選択された場合、特に手術の準備中に、患者 に起こる甲状腺機能亢進症の身体に対する作用を減少させるのに使用できる。あ るいは、固体の支持マトリックスに結合させたＴＳＨ受容体は、選択的血漿搬出 法で体外循環させて甲状腺刺激免疫グロブリンを除去するのに使用することがで きる。

ＴＳＨ受容体は、さらに、良性の前立腺肥大症を治療するのに使用できる。

３、　ホルモンの拮抗物質と作用物質の固定ＬＨ／ＣＧ　、ＦＳＨおよびＴＳＨ の受容体は、その有効なことから、それぞれのホルモンの作用物質と拮抗物質の スクリーニング、同定および特性決定に利用できる。

先に述べたように、ホルモンの作用物質は、ホルモンとその受容体の相互作用に よって起こる生理作用を増加させる分子か、または、それ自体が、ホルモンとそ の受容体の相互作用からもたらされる生理作用を仲介することができる分子であ る。

ホルモンの作用を増大する作用物質（アゴニスト）を同定するには、ホルモンが 受容体と結合する能力を増大させる性能について推定上の作用物質の容量が検定 される。ホルモンの活性に似ている作用物質は、受容体分子と結合する能力と、 ホルモンとその受容体との相互作用の特徴である生理学的に重要な作用を仲介す る能力とによって同定することができる。ホルモン作用物質は、個体内のホルモ ンのレベルもしくは有効性を増大させるのに利用できる。そのため、ホルモン作 用物質は、ホルモンの産生が不充分な個体を治療するのに使用できる。

また受容体分子の作用により、ホルモンの拮抗物質を同定することができる。先 に述べたように、このような分子は、ホルモンがその受容体と相互作用する性能 を阻害もしくは弱めるので１．生理学的に有意なくすなわち検出可能な）作用を 仲介する。このような分子は、ホルモンと受容体分子との結合を阻害もしくは弱 める性能によって同定することができる。ホルモンの拮抗物質は、個体内のホル モンのレベルもしくは有効性を低下させるのに使用することができる。

それ故にホルモンの拮抗物質は、特定のホルモンの過剰産生から起こる症状を治 療するのに使用することができる。

本発明に特に関連する一群の作用物質と拮抗物質は、免疫グロブリンの作用物質 もしくは拮抗物質である。上記の抗受容体抗体は、この抗体の受容体に対する結 合性が、受容体がその未変性のリガンドと結合する能力を与えるかまたは阻害す るかを決定するために試験される。このような能力を有する抗体は、ホルモンの 拮抗物質であるので、ホルモンの受容体分子と同じしかたで、ホルモンの過剰産 生もしくは過剰作用にみまわれている個体を治療するのに使用することができる 。例えば、ＬＨの拮抗物質である抗体は血管運動不安定症などの治療に使用でき る。同様にＴＳＨの拮抗物質である抗体は、ＴＳＨ受容体と結合させるのに使用 し、甲状腺機能亢進症を治療することができる。

同様に、上記の抗受容体抗体は、その受容体との結合性が、ホルモンのその受容 体との結合性と類似しているか否かを決定するために試験される。このような能 力をもっている抗体はホルモンの作用物質であるので、ホルモン産生が不足して いる個体を治療するのに用いられる。例えば、ＦＳＨの作用物質である抗体は、 ＦＳＨ受容体と結合させて排卵を刺激するのに利用できる。同様に、ＴＳＨの作 用物質である抗体は、Ｔ　Ｓ　、Ｈ受容体と結合させて甲状腺機能亢進症を治療 するのに使用できる。

ホルモンの作用物質と拮抗物質は、毒素で標識をつけて癌の治療に用いることが できる。したがって例えば毒素で誘導体化した、ＴＳＨの作用物質と拮抗物質は 、悪性の甲状腺細胞（またはＴＳＨ受容体を発現する細胞）上のＴＳＨ受容体と 結合できるので、このような細胞を殺す手段を提供する。同様に、毒素で誘導体 化したＦＳＨ、ＣＧもしくはＬＨの作用物質もしくは拮抗物質は、ＦＳＨもしく はＬＨ／ＣＧの受容体を発現する腫瘍性細胞を殺すのに使用できる。

ＴＳＨ、ＦＳＨおよびＬＨ／ＣＧの受容体を通常発現する細胞の種類は限定され ないが、これらの分子をコードする遺伝子配列が利用できて、組織に特異的なプ ロモーターが存在すれば、多様な別の組織での受容体の発現を仲介できる組換え ベクターを作ることができる。したがって、本発明の方法は、池の組織の悪性腫 瘍の治療に利用することができる。

■１本発明の薬剤の投与 本発明のホルモン受容体分子、またはホルモン作用物質もしくはホルモン拮抗物 質の分子の治療効果は、全分子またはその治療上活性なペプチド断片を患者に投 与することによって得ることができる。

特に重要なのは、可溶性（すなわち膜結合性でない）の治療上活性なペプチドの 断片である。好ましい断片は、ホルモン受容体の細胞外ドメインをもっている断 片である。

上記の分子とその機能性誘導体は、組換えＤＮＡ法、またはタンパク質分解法、 またはこれらの方法を組合わせて用いて、合成によって製造することができる。

このような分子の治療上の利点は、担体との結合を促進したりまたは分子の活性 を増大するために付加された追加のアミノ酸残基を有する機能性誘導体を使用す ることによって、増やすことができる。ある種のアミノ酸残基を欠いているかま たは別のアミノ酸残基を含有する、このような分子の機能性誘導体は、本発明の ホルモン受容体分子またはホルモン作用物質もしくはホルモン拮抗物質の分子が もっている（もしくは作用を及ぼす）生物活性もしくは医薬活性をもっている（ もしくは作用を及ぼす）限り、本発明の範囲に含まれる。

本発明のホルモン受容体分子、およびホルモン作用物質もしくはホルモン拮抗物 質の分子は、それを含有する製剤が、これらの生成物が通常天然にともに見出さ れる物質を実質的に含有していないならば、“天然の異物を実質的に含有してい ない”といわれる。

本発明の分子は、公知の方法で配合し、これらの物質もしくはその機能性誘導体 は医薬として許容される担体ビヒクルと混合されて、医薬として有用な組成物を 製造することができる。他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む 適切なビヒクルとその配合物は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（第１６版、０８ｏ１．＾９編集、Ｍａ ｃｋ、米国、ペンシルバニア州、イーストン、１９８０年）に記載されている。

有効な投与に適した、医薬として許容される組成物を作るために、このような組 成物は、本発明の分子の少なくとも１つの有効量を、担体ビヒクルの適切な量と ともに含有している。

別の製薬法が作用期間を制御するのに利用される。放出制御製剤は、本発明の分 子と複合するか、本発明の分子を吸収するポリマーを使用することによって得ら れる。特に好ましい製剤は、本発明の分子を、非タンパク質のポリマーと接合さ せて、水溶性で他の望ましい特性を示す誘導体分子を製造することによって得ら れる。非タンパク質のポリマーは、通常親水性の合成ポリマーであり、他の方法 では天然には見られないポリマーである。しかし、天然に存在し、組換え法もし くは生体外法で製造されるポリマーは、天然物から単離されるポリマーと同様に 有用である。親水性のポリビニルポリマーは本発明の範囲に含まれ、例えばポリ ビニルアルコールとポリビニルピロリドンである。特に有用なのは、ポリアルキ レンエーテル類、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、 ポリオキシエチンエステル類もしくはメトキシポリエチレングリコール：ポリオ キシアルキレン類、例えばポリオキシエチレン、ポリオ牛ジプロピレン、および ポリオキシエチレンとボ１Ｊオ牛ジプロピレンのブロノクコポワマー（プルロニ ック類）；　ポリメタクリレート類：カルボマー類（ｃａｒｂｏｍｅｒｓ）　： 次のような糖モノマー類すなわチロ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース 、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロ ン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロ ン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコ ースおよび／イラミン酸、および次のようなホモ多糖類とへテロ多糖類例えばラ クトース、アミロペクチン、澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、アミロース、デキス トラン硫酸、デキストラン、デキストリン類、グリコーゲンもしくは酸性ムコ多 糖類、例えばヒアルロン酸の多糖サブユニットを含む分枝もしくは非分岐の多糖 類；ポリソルビトールおよびポリマンニトールのような糖アルコール類のポリマ ー：ヘパリン；ならびにポリセリンもしくはポリアラニンのようなポリアミド類 である。その多糖が、本発明の分子の組換え発現体固有のグコシル化部もしくは グリコジル化付随部である場合、その置換部位は通常、このような分子のＮ−も しくは〇一連結グリコシル化部位以外のところに位置しているか、または使用さ れる分子が、付加もしくは置換のＮ−もしくは〇一連結部位が分子内に導入され たアミノ酸配列の変異体である場合である。

ポリマーの混合物を使用しても、またはそのポリマーは同一種のものであっても よい。架橋させる前のポリマーは水溶性である必要はないがその方が好ましい。

しかし最終の接合体（コンジュゲート）は水溶性でなければならない。ざらにポ リマーは、本発明の分子に接合されたときに免疫原性が高（ではいけないＬ７、 または静脈がらの注入もしくは注射で投与しようとしたときこれらの投与法に適 合しない粘度であってはいけない。

ポリマーは、本発明の分子と反応性の基を１つだけもっているのが好ましい。こ のことは、分子の架橋結合を回避するのに役立つ。

しかし、反応条件を最適化して架橋反応を少なくすること、または反応生成物を ゲル濾過法またはクロマトグラフふるいで精製して実質的に均一な誘導体を回収 することは本発明の範囲に含まれる。

ポリマーの分子量は、約１００〜５００．０００の範囲にあり、好ましくは約１ ．０００〜２０．０００である。選択される分子量は、ポリマーの種類と置換度 によって決まる。一般に、ポリマーの親水性が大きくかつ置換度が大きい程、利 用できる分子量が小さい。最適の分子量は日常の試験で決定される。通常、本発 明のポリマー接合体の分子量は約７０．０００を超えるが、これより小さい分子 量の分子も適切なものである。

ポリマーは、多官能架橋剤によって、本発明の分子と、共有結合で架橋されるが 、この架橋剤は、ポリマー、および分子の１つ以上のアミノ酸もしくは糖の残基 と反応する。しかし、誘導体化したポリマーと分子を反応させるか、もしくはそ の逆の反応によって、ポリマーとこのような分子を直接架橋結合させることは本 発明に含まれる。また、本発明の分子とポリマーの非共有結合の会合複合体も本 発明に含まれる。このような複合体は、分子と、負の電荷を有するポリマー例え ばデキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、コンドロイチン硫酸などのグリコサ ミノグリカン類、または負の電荷をもったドメインを有する両性ポリマー類とを 非共有結合的に会合させることによって最も簡便に製造される。アルカリ性ｐｌ によってこれら複合体の生成か容易になり、これらの腹合体は、ポリマーの溶液 もしくは懸濁液を分子と混合し、次いで塩を取出すかまたはポリマーと分子との 会合を加速するために乾燥することによって製造される。

本発明の分子は、ポリマーと共有結合で架橋結合されているのが好ましい。本発 明の分子の共有結合で架橋結合される好ましい部位は、Ｎ末端アミ７基とりシン 残基に見られるε−アミ７基であるが、その外のアミノ、イミノ、カルボキシル 、スルフヒドリル、ヒドロキシルなどの親水性基は分子の有用な置換部位として 働く。ポリマーは、多官能（通常三官能）架橋剤を用いずに、分子に直接共有結 合で連結させてもよい。このような架橋剤の例としては、１，１−ビス（ジアゾ アセチル）−２−フェルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドエステル類、例えば、４〜アジドサリチル酸とのエステル類、３．３″− ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオネート）のようなジスクシンイミジル エステル類を含むホモ２官能イミドエステル類、およびビス−Ｎ−マレイミド− １，８〜オクタンのような２官能マレイミド類が含まれる。メチル−３−［（ｐ −アジド−フェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化薬剤は、光 の存在下で架橋を形成することができる光活性化しつる中間体を生成する。ある いは、臭化シアンで活性化された炭水化物のような反応性で水溶性のマトリック ス、および米国特許第３．９５９．０８０号、同第３゜９６９、２８７号、同第 ３．６９１．０６１号、同第４．１９５．　Ｌ２ｇ号、同第４．２４７．６４２ 号、同第４．２２９．５３７号、同第４．０５５．６３５号および同第４．３３ ０．４４０号に記載されているシステムを、ポリマーと分子を架橋するために適 切に改変する。本発明の分子のアミン基に対する共有結合は、塩化シアヌル、カ ルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモア セトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ　＋　ＤＭＳＯと無水酢酸、また は塩化ＰＥＧ　＋　４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシト）、スクシ ンイミジル活性エステル類、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ　、２，４．５− トワクロロフェニルクロロホーメートもしくはｐ−ニトロフェニルクロロホーメ ートで活性化されＰＥＧに基づいた公知の化学的方法で実施される。カルボキシ ル基は、カルボジイミドを用いて、ＰＥＧ　アミンを結合させることによって誘 導体化される。ポリマーは次のような方法でオリゴ糖の置換基と接合される。す なわち化学酸化（例えばメタ過ヨウ素酸塩）または酵素による酸化（例えばグル コースオキシダーゼもしくはガラクトースオキシダーゼ）（炭水化物のアルデヒ ド誘導体を製造するため）を行い、次いでオリゴ糖をビオチンもしくはアビジン で標識をつけるために、Ｈｅｉｔｚｍａｎｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７１巻、３５３７〜３５６１頁、　１９７４年もし くはＢａＹｅｒ等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｔａｏｌｏｇＹ、　６２ 巻、３１Ｇ頁、　１９７９年に記載しているのと同じ方法で、ヒドラジドもしく はアミノ誘導体化ポリマーと反応させる。さらに、オリゴ糖とポリマーを連結す るために従来用いられてきた他の化学的方法もしくは酵素ｎによる方法も適切な 方法である。炭水化物の置換基が細胞外ドメインのＣ末端領域に位置し、ホルモ ンとの結合に関与しない置換オリゴ糖は、本発明の分子に対して特に有利である 。このことは、本発明の他の目的を達成しながらホルモン結合活性の保持を助け る。誘導体化のためのアミノ酸部位よりも置換基は少ないのでオリゴ糖生成物は 一般に一層均質である。分子のオリゴ糖置換基は、例えばポリマーの誘導体化の 前に、ノイラミニダーゼで、酵素によって修飾して糖類を除去することができる 。

上記以外の糖タンパク質のオリゴ糖が、その糖タンパク質の治療用途についての 本発明の目的を達成するために、上記したのと同じ方法で、好ましくはＰＥＧで 共有結合にて置換される。

ポリマーは、本発明の分子のアミノ酸側鎖もしくはＮ−もしくはＣ−末端と直接 反応性であるか、または多官能性架橋剤と反応性の基をもっている。一般に、こ のような反応性の基をもっているポリマーは、固定化タンパク質の製造用として 知られている。このような化学反応を使うためには、従来タンパク質の固定化に 用いられてきた不溶性のポリマーと同じしかたで誘導体化された異なる水溶性ポ リマーを使用しなければならない。臭化７アンの活性化反応は、多糖類を本発明 の分子に架橋結合するのに用いる特に有用な方法である。

接合体について“水溶性”ということは、接合体が、治療上有効な濃度を得るの に充分な量で、血液のような生理学的液体に可溶性であることを意味する。した がって、これは、ホルモン精製のためにアフィニティクロマトグラフィに用いら れるマトリックスで不溶化された分子を除外する。

出発ポリマーについて“水溶性”ということは、接合に用いられるポリマーもし くはその反応性中間体が、本発明の分子との誘導体化反応に関与するのに充分に 水溶性であることを意味する。

本発明の分子の置換度は、そのタンパク質の反応性部位の数、分子全体かまたは 断片が使われているか否か、分子が本発明の分子に非相同のタンパク質との融合 体であるか否か、ポリマーの分子量、親水性などの特性、および選択された特定 の部位によって変化する。

一般に接合体の分子のドメインは、約１〜１０のポリマー分子で置換され、一方 分子に融合されている非相同の配列は、その部分の活性が有意に不利な影響を受 けない限り、特に限定されない数のポリマー分子で置換されてもよい。最適の架 橋度は、時間、温度および他の反応条件を変えて架橋度を変化させ、次いでホル モンを捕捉する接合体の性能を測定する実験マトリックスによって容易に決定す ることができる。

好ましい態様において、ＰＥＧは、本発明の分子と、リシン残基とＮ末端アミノ 基によって架橋される。

接合されるポリマー例えばＰＥＧの分子量は、約５００〜１００．０００の範囲 にある。２，０００．５，０００もしくは２０．０００の分子量が一般的である 。ポリマー例えばＰＥＧは、それ自体公知の各種の方法で本発明の分子に架橋結 合され、タンパク質がＰＥＧのような非タンパク質で共有結合で修飾される。し かしこれらの方法のある方法は、本願の目的に対しては好ましくない。塩化シア ヌルの化学的性質は、タンパク質の架橋反応を含めて多くの副反応をもたらす。

さらに、塩化シアヌルは特にスルフヒドリル基を有するタンパク質の不活性化を もたらすようである。タンパク質を不活化することができるカルボニルジイダゾ ールの化学的性質（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ等、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、。

１３１巻、２５〜３３頁、　１９８３年）は、高いｐｔ（０８，５）を必要とす る。

さらに“活性化されたＰＥＧ”中間体は水と反応するので、タンパク質をこえる 大過剰モルの“活性化されたＰＥＧ”が必要である。

カルボニルジイミダゾールの化学的性質のために必要な高濃度のＰＥＧによって 精製に対して問題が生じる。というのは、ゲル濾過クロマトグラフィーと疎水性 相互作用クロマトグラフィが不利な影響を受けるからである。一方アルデヒドの 化学的性質（Ｒｏｙｅｒ、米国特許第４．００２．５３１号）は−扇動率的であ る。というのは、アルデヒドは、ＰＥＧの４０倍過剰モルと１〜２時間のインキ ュベーションしか必要としないからである。しかしＰＥＧ　アルデヒドを製造す るのにＲｏｙｅｒが示唆した二酸化マンガンは問題である。“というのは、ＰＥ Ｇアルデヒドには金属ベースの酸化剤と複合体を形成する強い傾向があるからで ある”（）Ｉａｒｒｉｓ等、　Ｊ、　Ｐｏｌｙｍ、　Ｓｃｉ、　Ｐｏｌｙｍ、　 Ｃｈｅｍ、　Ｅｄ、、　２２巻、３４１〜３５２頁、　１９８４年）。ＤＭＳＯ と無水酢酸を利用するモファノト酸化法を用いるとこの問題が除かれる。さらに 、Ｒｏｙｅｒが示唆した水素化ホウ素ナトリウムは、高ｐＨ下で用いねばならず 、ジスルフィド結合を還元する有意な傾向がある。−力水素化シアノホウ素ナト リウムを使うと、これは中性ｐｔ＋で有効であるが、ジスルフィド結合を還元す る傾向はほとんどない。

本発明の接合体は、未反応の出発物質から、ゲル濾過法で分離することが好まし い。受容体分子は、例えば、抗体容体抗体（好ましくはモノクローナル抗体）も しくはホルモンを用いて吸着法でさらに精製してもよいが、この両者はマトリッ クスに固定化する方が好ましい。ホルモンを用いる精製法は、ホルモンが接合体 を捕捉するだけで、接合体の置換度もしくは置換の部位がホルモンの結合性を不 活性化しないという利点がある。ＰＥＧで置換した分子は、疎水性相互作用クロ マトグラフィでさらに精製することができる。接合体は、減少する塩の分配液を 使用して、疎水性のクロマトグラフィの媒体、例えばアルキルセファロースから 、最も簡便に溶出される。

この方法と上記のゲル濾過法は、置換度に基づいて接合体を分割するので、ＰＥ Ｇによるモル置換度が実質的に均一な接合体の製剤を得ることができ、例えば、 特にジ置換分子を特に含有しないモノ置換分子またモノ置換分子を特に含有しな いジ置換分子が得られる。

またこの分子の誘導体は、はとんどの場合イオン交換クロマトグラフィ　（分子 をカチオンもしくはアニオンのイオン交換樹脂に吸着させ次いで溶出するか、ま たは汚染物をアニオン、もしくはカチオンのイオン交換樹脂に吸着させる）で精 製することができる。

本発明の接合体は、生理学的に許容される担体に配合し、治療用途向けに滅菌濾 過される。組成物は、受用者の患者がその投与に耐えられるならば、“薬理学的 に許容される”といわれる。このような薬剤は、投与量が生理学的に有意である 場合、“治療上有効な量”で投与されているといわれる。薬剤は、それが存在す ると、受用者の患者の生理に検出可能な変化がもたらされる場合、生理学的に有 意である。

治療用製剤中の本発明の分子の濃度は、厳密なものではないが、一般に約１μｇ ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌである。接合体は、ツイーン２０もしくは８０のような 非イオン界面活性剤、塩類、緩衝液およびその外の賦形剤を任意に含有している 。接合体は水溶液として保管されるかまたは凍結乾燥される。

接合体は、皮下、筋肉内、静脈内もしくは脳を髄への注射、肺内もしくは鼻腔内 へのエヤロゾル、皮膚バッチ、脈管内注入などによって投与される。注射で投与 される場合、その投与は、連続の注入または単一もしくは多数の大型火剤で投与 してもよい。

投与量は、臨床の慣行にしたがって決定され、患者の年齢、体重、身長、性別、 一般の医療条件、以前の医療経過などのような要因によって変化する。一般に、 受用者に、−週間に１〜３回、約ｌＯ〜約３００μｇ／ｋｇ　（患者の体重）を 始めの投与量として与えるのが好ましいが、これより高いかまたは低い投与量を 投与してもよい。本発明の接合体の利点は、再々投与しなくてもよく、生体内の 治療投与量を保持するために連続的に注入する必要がないということである。

このような化合物の投与は、“予防”もしくは“治療”を目的とするものである 。予防目的で投与されるときは、疾患の徴候もしくは症状の徴候が現れる前に化 合物が与えられる。化合物の予防的な投与は、その後の疾患もしくは症状を防止 もしくは軽減するのに役立つ。治療を目的として投与する場合、化合物は、既存 の疾患の徴候が始まった時、または既存の症状の徴候を検出するとき（少し遅れ て）に投与される。化合物の治療を目的とする投与は、徴候、または疾患もしく は症状を軽減するのに役立つ。

放出を制御した製剤によって、作用期間を制御する他の可能性のある方法は、ポ リエステル類、ボリアミオ酸類、ヒドロゲル類、ポリ（乳酸）またエチレン−酢 酸ビニルコポリマーのような高分子物質の粒子に、本発明の分子を混合する方法 である。あるいは、これらの薬剤をポリマー粒子に混合する代わりに、例えば、 コアセルベーション法で作製したマイクロカプセル例えばヒドロキシメチルセル ロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル、もしくは界面重合法で作製した例 えばポリ　（メチルメタアクリレート）のマイクロカプセル、または、例えばリ ポソーム類、アルブミン微小球類、マイクロエマルジョン類、ナノ粒子類、およ びナノカプセル類、またはマクロエマルジョン類のようなコロイド状医薬分配シ ステムに、封入することができる。このような方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　 Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８０年）に開示され ている。

本発明について一般的に述べてきたが、本発明は下記の実施例を参照して容易に 理解されるであろう。そしてこの実施例は説明のために提供するものであり、特 にことわらない限り、本発明を限定するものではない。

実施例１　ラット黄体ＬＨ／ＣＧ受容体の精製フィーの前に小麦胚凝集クロマト グラフィーを行う外はロセンブリ。

トら（Ｒｏｓｅｓｂｌ　ｉｔ、　Ｎ、　）の方法（Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ、１２３ ：　２２８４−２２８９　（１９８８））に従い、ラットＬ　Ｈ／ＣＧレセプタ ー（受容体）を精製した。このようにして得られたＬＨ／ＣＧ−Ｒをレクチンお よびＣＧアフィニティークロマトグラフィーで精製し、次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃ ｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮しな。

レセプタータンパク質をさらに５倍容量のアセトン中、−２０℃で１０分間イン キュベーション（インキュベート）することにより沈降させて精製した。沈殿を 遠心（１２，ＯＯＯｘｇ、１０分間）し、レムリ（Ｌａｅｍ＠ｌｉ）ゲルサンプ ルバフファーに溶解し、ゲル電気泳動で分離した［レムリ（Ｌａｅｍａ＋ｌｉ、 　Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７７：　６８０　（１９７０）］。

精製物質の銀染色により９３　ｋＤａタンパク質に相当する優勢なノインドと、 数本のより低分子量の弱く染色されたノ＜ンドが明らかになつた。したがって、 レセプターは分子量約９３　ｋＤａの単一のポリペプチドで構成されていること が分かった。

アフィニティーカラムを用いる前に小麦胚カラムを用いると、レセプターの精製 が幾分良好であるとの結果を得た（ＳＤＳゲルから判明）。この方法による９３ ｋＤａタンパク質の精製は、本発明者らが先に得た、該レセプターの構造に関す る結果と一致した。しかしながら、Ｐｉ　製９３　ｋＤａタンパク質がＬＨ／Ｃ Ｇレセプターであることのさらなる立証は、２つの追加実験により得られた。す なわち、１つはＬ　Ｈ／ＣＧレセプターがダウンレギュレーションされている偽 妊娠ラットの卵巣からのレセプターの精製である。予測されたように、９３ｋＤ ａタンパク質は、この供給源から精製された物質のＳＤＳゲルの銀染色では観察 されなかった。もう１つの実験は、Ｉｔｓｌ−ＣＧを最初の界面活性剤抽出およ び精製レセプターのＳＤＳゲルから調製したウェスタンプロットと一緒にインキ ュベーシゴンすることであった。いずれの場合にも、９３ｋＤａタンノ（り質に 特異的な結合が観察された。すなわち、本発明者らが精製した９　３　ｋＤａ夕 ンバク質は、真にＬＨ／ＣＧレセプターであると結論された。

重要なことは、精製ＬＨ／ＣＧレセプターは、還元剤の存在下、非存在下のいず れの場合でも、ＳＤＳゲル上で単一の９３　ｋＤａバンドとして現れることであ る。すなわち、これらのデータもＬ　Ｈ／ＣＧレセプターが単一のポリペプチド であることを示している。

精製Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプター製品を用いてレセプター対する抗体を得た。そのた めに、レセプターを含有する試料をフロイントの完全アジュバントに希釈し、ニ ューシーラント種の雌性白兎の背中に皮下注射した。６週間後から、５力月間、 毎週、兎から採血した。兎血清はＬＨ／ＣＧレセプターに特異的なポリクローナ ル抗体を含有していた［ロセンブリノトら（Ｒｏｓｅｍｂｌｉｔ、Ｎ、）、Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌ、１２３：２２８４−２２８９　（１９８ｇ）］。しかしなが ら、この抗体はＬＨまたはＣＧのレセプターへの結合を阻止する能力をもってい なかった。しかし、上記の方法で、ＣＧのレセプターへの結合を阻止する第２の ポリクローナル抗体標品を得た。ＣＧの細胞外ドメインの配列に対応する合成ペ プチドと特異的に結合する第３のポリクローナル抗体製品を得た。

上記のＬＨ／ＣＧレセプタータンパク質標品を配列決定のためにさらに精製した 。

Ｎ末端アミノ酸の配列を得るために、分離した９　３　ｋＤａレセプターをＰＶ ＤＦメンプランに電気ブロッティングし［マツダイラ（Ｐ。

内部ペプチドフラグメントの配列決定には２つの異なるプロトコルを用いた。電 気溶出（溶離）したレセプタータンパク質をメタノール／クロロホルムで沈殿さ せてペプチドフラグメント１ｂｒ２６とｔｈｒ２Ｂを調製した。タンパク質を２ ０ｍＭ　ＴｒｉｓＳｐＨ８，５，０゜１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　１Ｍ溶解し、Ｌ　ｙｓｙ ｌｃエンドペプチダーゼで消化した。

この消化で得たフラグメントをさらにＨＰＬＣで分離し、配列決定した。

内部ペプチドフラグメント１ｈｒ４．１ｈｒｋ、　１ｈｒｃおよび１ｈｒｒの配 列は、９３ｋＤａレセプターを電気溶出し、得られたタンノくり質を５倍容量の アセトンで沈殿させることにより決定した。沈殿を２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８， ５に溶解し、ギ酸／　ＣＮ　Ｂ　ｒで処理してタンパク質を開裂した。開裂産物 を３回凍結乾燥し、トリシンゲル電気泳動しシエッガーら（Ｈ，Ｓｈａｅｇｇｅ ｒ）、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１６６　：３６ｇ　（１９８７）］のた めにサンプルバッファーに再溶解した後、電気プロ・ノテイング、気相マイクロ シーケンシングに付した。

これらの分析により、異なる長さの上記内部ペプチドフラグメントを得、配列決 定した（図１）。これらポリペプチドフラグメントの配列は図１の下方に挿入し た箱内に記載されている（ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に用いたブラーマー配 列には下線を施した）。

遺伝コード［ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、）、Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、３ｒｄ、Ｅｄ、、Ｙ、Ａ、Ｂｅｎ ｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ、、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、Ｃ＾（１９７７）、　Ｉ）Ｉ） 、　３５６−３５７　］を用い、配列決定したフラグメントをコードし得るオリ ゴヌクレオチドプローブを製造した、遺伝コードの縮重により、種々のコドンを 用いて複数のプローブを調製した。これらのペプチド配列から構築したオリゴヌ クレオチドを表２に示す（コドンの相違で異なるヌクレオチドをオリゴヌクレオ チド配列の相当する位置の下方に示す）。

（ＡＴ）　（ＧＡＩ　（Ｃ） ｋｓ、　ｒｓｒｃおよびｆｓｒｃの各オリゴヌクレオチド（それぞれ５００　ｎ ｇ）の混合物を、偽妊娠ラットの卵巣ｐｏｌｙ（Ａ）　’黄体ＲＮＡ　［コムチ ンスから合成したｃＤＮＡ（２５ｎｇ）を鋳型に用いるポリメラーゼ鎖反応（Ｐ ＣＲ）［フォルクスら（Ｄ、Ｍ、Ｆｏｗｌｋｅｓ）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔｓ）およびＤＮＡサーマルサイクラ−（Ｔｅｃｈｎｅ）を用いて、１０ ０μｌ中で行った（６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，３，６，７ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１．６．ｍＭ 　硫酸アンモニウム）。蒸発を避けるために鉱油（６０μｍ）を加えた。反応サ イクル（２５）は、インキ二ベーシ１ンを９５℃で１．３分間；４５℃で２分間 ；および７２℃で５分間からなる。ＤＮＡ産物を１％アガロースゲル上で分析し た。主要なりＮＡ断片を切除してゲルから溶離し、Ｍ１３ベクターｍｐ１９［ビ エイラら（Ｊ、Ｙｉｅｉｒａ）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 　１５３：３　（１９８７）］のＳ　ｌ１ｌａ　１部位に挿入した。

明瞭な、優勢なりＮＡ産物がポリメラーゼ鎖反応合成によって生成した。配列決 定［サンが−（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ、　７４：５４６３　（１９７７）］で、このＤＮＡ産物は６２２塩 基対を含んでいることが分かった。ＤＮＡ産物はｉｈｒ、　１ｈｒ２６およびｔ ｈｒ２８ペプチドの配列を含めて、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターの暗号配列の１部を 含有していることが分かった（図１および表２参照）。

このＰＣＲ産物をラット黄体ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのプ ローブとして用いた［マニアテイスら（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ １ｄ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９ｇ ２）］　ｏこのフラグメントを、偽妊娠う’ｙトの卵巣ＲＮＡからλｇｔｌｏ　 ［ヤングら（Ｒ，Ｄ、Ｙｏｕｎｇ）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：　７８ｇ（１ ９８３）］を用いて構築したｃＤＮＡライブラリー（１０８組換えファージ）の プローブとして用いた。２０個のハイブリダイゼーションするファージの内、１ ２個のＤＮＡ配列をさらに解析しＬＨ／ＣＧｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定 に用いた。

ラットＬＨ／ＣＧ−ＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を 、その５゛　フランキング領域の４３ヌクレオチドと３°　フランキング領域の ７５９ヌクレオチドと共に図１に示す。１位の翻訳開始コドンはそれぞれ独立に 決定されたペプチド配列の全てをコードする２１００ヌクレオチド長さのオーブ ンリーディングフレームの開始点を示す。推定のＮ−末端アミノ酸配列は２６残 基ノシグナルヘプチドからなる［）＼イネ（Ｇ、ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ）、　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１４°４６８３（１９８６）］　、シシグナ ル配列ドに続く配列は開裂されていないＬ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒポリペプチドから決 定したペプチドに対応している。したがって、成熟ＬＨ／ＣＧ−ＲはＡｒｇから 始まる要約すると、ラット黄体ｃＤＮＡのブライミングにＮ末端配列と内部配列 の１つに基づくオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ鎖反応を行った。得ら れた６２４ヌクレオチドのｃＤＮＡは１端にＮ−末端アミノ酸端を、他端に用い た内部配列をコードして％Ｘだ。

偶然にも、レセプターから決定された余分の内部アミノ酸配列データをもコード していた。すなわち、このｃＤＮＡはう・ノド黄体ＬＨ／ＣＧレセプターの部分 ｃＤＮＡを表していると結論された。このことから、レセプターの完全な暗号配 列を含有するｃＤＮＡが得られたことになる。

このｃＤＮＡのオープンリーブイブフレームは２１００ヌクレオチドであり、７ ００アミノ酸からなるタンパク質をコードしている。

無傷のタンパク質から得たＮ−末端配列がその後に続くことから、最初の２６ア ミノ酸はシグナル配列を表す。成熟タンノ（り質の分子量計算値は７５，０００ である。本発明者らは、これと精製レセプターの分子ｊｌ（９３，０００）の相 異はレセプターの糖タンノくり性に帰属できると結論した。

Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターはＧｓタンパク質と結合するので、該レセプターが、既 にクローン化され、特性化されている他のＧプロティン結合（カップリング）性 レセプターとなんらかの構造上の類似性を有するか否かに、当面の興味があった 。これらの他のレセプター（例えば、ロドプシン、およびアドレナリン作動性、 ムスカリン様アセチルコリン、セロトニン、およびサブスタンスにレセプター） の全ては相互に有意なアミノ酸の同一性を有し、細胞膜に７箇所で７．／ｆニン グするという共通点を有している［レフコビッッラ（（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｚ、Ｒ ，Ｊ、）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：　４９９３　（１９８ｇ）コ。

しかしながら、これらのレセプターはまた、Ｌ　Ｈ／Ｃ（：、レセプターと異な り、比較的小さいリガンドにも結合する点が注目される。Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプタ ーのヒトロバシープロット分析により、事実、タンパク質のＣ−末端側の半分に ７つの膜スパニングドメインの存在することが示された。Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプタ ーのこの領域のアミノ酸配列を他のＧタンパク質結合性レセプターのアミノ酸配 列と比較すると、１８−２２％の同一性があり、このことは、同類のものに認め られる値と同様である。しかしながら、これら他のレセプターとの著しい対比点 は、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターが、比較的大きい（約３４０アミノ酸長さ）親水性 のＮ末端ドメインを有していることである。

これらのデータから、ＬＨ／ＣＧレセプターは細胞膜を７回横断する領域に連結 した大きいＮ末端細胞外ドメイ、ンを有し、小さいＣ末端細胞質内テイルで終了 する推測される。

細胞外ドメインは大きい糖タンパク質ホルモンＣＧおよびＬＨとの結合に関与し ていると思われる。この帰属はＬ　Ｈ／ＣＧレセプターの６４ｋＤａ水溶性断片 がＣＧと結合することができるという生化学的データ［ケイナネン（Ｋｅｉｎａ ｎｅｎ、に、Ｐ、）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２３９＋　８３（１９８６）　 ］およびコラゲナーゼ処理細胞に関するデータと一致する。

レセプターの細胞外領域は多（の注目すべき特徴を有する。まず第１に、６個の Ｎ−末端グリコシル化可能部位がある。予備的なデータではこれら部位の大多数 はグリコジル化されているらしい。第、２に、大豆レクチンのある領域と同じ１ ０アミノ酸からなる部位があるＵシネルら（Ｓｃｈｎｅｌｌ、に、Ｊ、）、　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２ニア２Ｑ　（１９８７）コ。脱グリフシル化形の ＣＧおよびＬＨはＬ　Ｈ／ＣＧレセプターと結合するが、生物活性を殆んどまた は全（発揮しないことはよ（知られている。従って、ＬＨ／ＣＧレセプターのこ の部位がホルモンの炭水化物路の認識に関与しているか否かを調べることは興味 深い。

第３に、細胞外ドメインはほぼ２５アミノ酸の１４回の不完全な繰り返しく反復 ）モチーフに配列され得る。このロイシン−リッチモチーフ構成は多くの他のタ ンパク質に共通する。これらには、酵母アデニレートシクラーゼ（アデニル酸シ クラーゼ）［カタオカら（Ｋａｔａｏｋａ、ＴＩ　Ｃｅ１ｌ　４３：　４９３− ５０５　（１９８５）コ；ドロソフイラ（Ｄｒｏｓ。

ｐｈｉ　ｌａ）のＴｏｌｌデベロ、ブメント遺伝子（Ｔｏｌｌ　ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔａｌ　ｇｅｎｅ）［ハシモトら（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｃ，）　Ｃｅ １ｌ　４２：　２６９　（１９８ｇ）］　；ヒト血清アルファ２糖タンパク質［ タカハシら（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｎ、）　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、人ｃａ ｄ、ｓｅｉ、　ＵＳＡ　８３：１９０６　（１９８５）コ；フオンウイルブラン ド（ｙｏｎ　Ｗｉｌｌｂｒａｎｄ）因子およびトロンビンのための血小板１ｂレ セプター［ロベツら（Ｌｏｐｅｔｚ、　Ｊ、＾、）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４：５６１５　（１９８７）］、および細胞 外マトリックスプロテオグリカンＰＧ４０［クルジウス（Ｋｒｕｓｉｕｓ、Ｔ、 ）　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：５６１５（ １９８Ｂ）］など、広範な異種（または未知）機能のタンパク質が含まれる。こ れらのタンパク質の内、唯−ＰＧ４０のみがＬＨ／ＣＧレセプターの細胞外領域 と全アミノ酸の同質性（ホモロジー）を共有するらしいことが指摘される。実際 、このロイシンに富む反復構造の生物学的意義は、未だ知られていない。それに より両親媒性のへリノクス構造が形成され、その結果、水性環境と細胞質膜の両 者と相互作用し得るということに関与しているのではないかと示唆されている。

これは、ＣＧまたはＬＨがＬＨ／ＣＧレセプターの細胞外ドメインに結合した際 に、レセプターの膜スバニング領域と相互作用し得ることを示すものである。

上記のごと（、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターの膜スバニング領域はＧタンパク質と結 合するレセプター群と関連性を有すると思われる。既にクローニングされた他の Ｇタンパク質結合レセプターの内、ベータアドレナリン作動性レセプターのみが Ｇｓタンパク質と結合する。

しかしながら、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターの膜貫通の半分は、Ｇｓ結合に関与して いる領域（即ち、第３の細胞質ループのＣ末端および細胞質テイルのＮ末端）に おいてさえ、他のＧタンパク質と結合するレセプターとの相同性以上に、ベータ アドレナリン作動性レセプターのアミノ酸と相同性を示しているわけではない。

Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターのＣ末端細胞質テイルを検査して、多（のりん酸化可能 部位（即ち、セリン、スレオニン、およびチロシン）が明らかになった。Ｌ　Ｈ ／ＣＧレセプターの濃度および／または機能はりん酸化によって調節されている のかもしれない。Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターのこの領域の他の特徴は、隣接する２ 個の塩基性アミノ酸クラスターを有する点にある。これは成熟タンパク質がこれ らのその各々のリガンドは、これらのレセプターと、膜内挿入（インターカレー ション）、およびトランスメンプランへり、クスとの相互作用、によって結合す ることが、ロドプシンおよびベータアドレおいて、これら複数の膜スバニング構 造のモチーフはリガンドの結合およびＧタンパク質との結合（カップリング）の 両面で重要である。Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターは、さらに、大きい細胞外ホルモン 結合ドメインを宵し、これにより他のレセプターと明確に区別されるが、それは 、１）Ｔｉｌｌの膜貫通構造はＧタンパク質とのカップリングに絶対に必要であ り、２）ＬＨ／ＣＧレセプター中のＧタンパク質カップリングに結合するりガン トの翻訳は、他のＧタンパク質とカップリングするレセプターにおけるそれ（リ ガンドは膜内部にインターカレーシラン（挿入）される）と本質的に異なってお り、３）可溶性結合タンパク質の遺伝子とＧタンパク質とカップリングしたレセ プター遺伝子との間の天然の組換えでＬＨ／ＣＧレセプターが生じた、というこ とを示唆している。

本発明者らが単離したｃＤＮＡは組織および細胞特異性のｍＲＮＡとハイブリダ イゼーションし、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターのｃＤＮＡであると予測された。即ち 、偽妊娠ラットの卵巣から得たトータルＲＮＡ、および成熟ラットの卵巣、皐丸 、肺、肝臓および腎臓のトータルＲＮＡから調製したノーザンプロットは性腺組 織内でのみ、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターとハイブリダイゼーションした。これらの 内、黄体組織とのハイブリダイゼーションが最強であった。４．５ｋｂＲＮＡと のハイブリダイゼーションが最も優勢であり、それより小さい幾つかのＲＮＡと より弱くハイブリダイゼーションした。妊娠９日目のラットから得た切片を用い る系中ノーイブリダイゼーションを行うと、黄体との強力なハイブリダイゼーシ ョンと、抱腹および間質細胞との幾つかのハイブリダイゼーションとが認められ た。

ヒト腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３）をサイトメガロウィルスプロ モーターの転写コントロール下にＬ　Ｈ／ＣＧレセプター遺伝子Ａを含有する発 現ベクターで一時的に形質転換することで、単離したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが完全に活 性なＬ　Ｈ／ＣＧレセプターをコードしていることが分かった。これらの細胞は （モック形質転換された２９３細胞に対し）Ｉ霊’Ｉ−ＣＧと高度の親和性（Ｋ ｄ８０−１６０ｐＭ）をもって特異的に結合し、ＣＧに応答して多量のｃＡＭＰ を生産した（ＥＣ，。４０４０−８Ｏ９゜これらの応答が現れるのに必要なＣＧ 濃度は正常なＬ　Ｈ／ＣＧレセプター含有細胞での観察に匹敵する。さらに、こ のｃＤＮＡによってフードされているレセプターは予測される糖タンパク質ホル モンとの結合特異性を示し、ＣＧまたはＬＨ，ｈＴＳＨまたはｈＦＳＨでなく、 が高い親和性で結合し、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ産生を刺激する。このｃＤＮＡによって 発現されたＬＨ／ＣＧレセプターのより完全な特徴づけは現在進行中である。

これらの結果は、本発明者らがクローニングしたｃＤＮＡが明らかにＬ　Ｈ／Ｃ Ｇレセプターをコードしていることを証明するものである。さらに、結論として 、これらのデータから、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターが単一のポリペプチドであり、 ホルモンと結合することができると同時に結合すればｃＡＭＰを刺激することが 証明された。

最初、細胞表面Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターの細胞表面のサイズおよび構成の推定は ″’Ｉ−ＣＧの標的細胞へのケミカルクロスワンキングによる生産物の分析でな された［ロンシェら（Ｒｏｃｈｅ、　Ｐ、　）、　Ｊ、　Ｂｉ。

１、ｃｈｅｔ　２６４：　４６３６　（１９８９）］　。この試みでは、ＭＡ− １０レイデイツヒ腫瘍細胞（Ｌｅｙｄｉｇ）またはブタ顆粒層細胞の１次培養の いずれかと、１！５ｉ　ＣＧ標識とをアルファまたはベータサブユニットのいず れかのみの中で培養した。未反応ホルモンを洗浄して除去した後、結合したｌｔ Ｊ　（：、Ｑを２機能性スクシンイミジルエステルを用い、細胞表面ホルモン− 結合成分（類）にクロスワンキングさせ、放射性標識されたクロスワンキング生 産物を還元剤の存在下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。

ホルモンがアルファサブユニット内で放射性標識されている場合には、１０７ｋ Ｄａおよび１３２ｋＤａに相当する分子量のポルモンーレセブター複合体が観察 された。ベータサブユニット内で放射性標識されたホルモンを用いて１１７ｋＤ ａおよび１３２ｋＤａに等しい複合体を観察した。１３２ｋＤａＳ　１１７ｋＤ ａおよび１０７ｋＤａの複合体は、それぞれ、８３ｋＤａの同一の細胞成分とク ロスリンキングした、無傷のホルモン（５３ｋＤａ）　、ベータサフユニット（ ３３ｋ　Ｄ　ａ）およびアルファサブユニット（２２ｋＤａ）を表していると結 論された。即ち、これらの研究はＬ　Ｈ／ＣＧレセプターが、ネズミおよびレイ ディノヒ腫瘍細胞、およびブタ顆粒層細胞の両者に含有されている分子ＩＭｒ＝ ８３，０００の単一のポリペプチドで構成されていることを示唆するものである 。

また、いずれかの細胞型をＣＧ結合およびクロスワンキングの前にＩ型コラゲナ ーゼ（通常、分散組織を用いて調製する）で処理するとＬ　Ｈ／ＣＧレセプター の部分分解が起こることも分かった。即ち、コラゲナーゼ処理細胞は通常の親和 性でＣＧと結合し、正常なステロイド生産の増大反応を示した。しかしながら、 コラゲナーゼ処理細胞に１１５１　ＱＧをクロスリンキングさせ、生産物を還元 剤の存在下、ＳＤＳゲルで分離すると、より低い分子量のクロスワンキング生産 物（９５ｋＤａ、７５ｋＤａおよび６３ｋＤａ）が観察された。これら低分子量 バンドの出現はコラゲナーゼ処理濃度と時間に依存している。高純度のコラゲナ ーゼはタンパク質分解作用を示さないことから、コラゲナーゼによるレセプター の分解は、実は、フラゲナーゼ製品中の不純物によるものである。興味深１．Ｘ ことには、コラゲナーゼ処理細胞を”’Ｉ−ＣＧとクロスリンキングさせ、生産 物を還元剤の不在下でＳＤＳゲル分離に付すとレセプターは無傷のようであった 。これらの結果は、コラゲナーゼによりレセプターがニック（切断）されてもレ セプターの全構造（および結合活性）は分子内ジスルフィド結合によって維持さ れていることを示唆している。

１５１　ＱＧのコラゲナーゼ処理細胞をクロスワンキングし、生産物を還元剤の 存在下で分析することによりレセプターのペプチドマツプを得ることができる。

ＭＡ−１ｏ細胞およびブタ顆粒層細胞のフラゲナーゼ処理によって同じレセプタ ー生産物が得られたことから、これら２種の異なる種（ネズミ対ブタ）の２つの 細胞型（レイデッヒ対顆粒層）のＬ　Ｈ／ＣＧレセプターの全構造は同じである 。

Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターの全構造の査定に用いた第２の方法は、生物合成的に標 識されたレセプターをＭＡ−１０細胞から特異的に免疫沈降させことであった［ キムら（ＫｉＩＩＩ、　１．−Ｃ）＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２：４ ７０　（１９ｇ？）］。免疫沈降はＣＧに対する抗体を用いてホルモン−レセプ ター複合体を“関節的”に免疫沈降させて行った。

即ち、ＭＡ−１０細胞を生物合成的に３５３−システィンで標識し、未標識ＣＧ とインキュベーションした。細胞を洗浄して未結合ホルモンを除去し、ホルモン −レセプター複合体を界面活性剤で可溶化した。注意すべきは、ＣＧは温度４° Ｃで中性という条件が維持されている限り殆どまたは全くレセプターから外れな いので、ホルモンと結合したレセプターを脱離させずに界面活性剤で可溶化でき ることである。ホルモン−レセプター複合体を小麦胚アグルチニン樹脂で部分精 製した後、抗ＣＧおよびプロティンＡセファローズで沈澱させた。この時点で、 ｐＨ３バツフアーで簡単に処理して放射能標識レセプターを免疫沈降物から特異 的に溶出させ、ＳＤＳゲル上で分離し、蛍光光度計で観測することができた。し たがって、上記の化学クロスリンキング法とは対照的に、この方法は遊離のレセ プター（ホルモン−レセプター複合体でな（）をＳＤＳゲル上で直接観測するこ とができるという利点を有する。

酸−溶出レセプターがほぼ１５，０００倍精製されたことが計算された。９３ｋ Ｄａに相当するバンドは同時に行った３つの独立した負対照には観察されなかっ た。このように、Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプターが細胞内でダウンレギュレーションさ れているとき、ＣＧが結合インキュベーションから除外されているとき、または 免疫前のＩｇＧで免疫抗ＣＧを置換した場合、９３ｋＤａタンパク質は観察され なかった。

免疫沈降したＬ　Ｈ／ＣＧレセプターは、還元剤の存在下または非存在下のいず れで分析しても９３ｋＤａの単一のタンパク質として現れたで、レセプターを単 一のポリペプチドと結論した。これらの結果は化学クロスワンキングにおける推 定の分子量が８３ｋＤａであったことを除き、該クロスリンキングで観察された 結果と一致する。２つの推定の内、関節的な免疫沈降でめた９３ｋＤａの方が、 遊離のレセプター（ホルモン−レセプター複合体でなく）をＳＤＳゲル上で直接 求めているので、より正確と思われる。

この結論をさらに支持するものとして、ＣＧ結合に先立ってコラゲナーゼで処理 した３５Ｓ−システィン標識細胞からＬ　Ｈ／ＣＧレセプターを関節的に免疫沈 降させると、無傷の９３ｋＤａレセプター濃度が減少（対照細胞に比較して）し 、６６ｋＤａ、５０ｋＤａおよび３２ｋＤａの数個の小さいレセプターフラグメ ントが現れたということがある。

実施例７　ＬＨ／ＣＧ−Ｒのドメイン構造ポリペプチド鎖（残基１−３４１）の Ｎ末端側半分は細胞外ドメインを構成すると推測される（図１）。Ｌ　Ｈ／ＣＧ レセプターの糖タンパク質性と一致して、このドメインに、６個のＮ−結合グリ コシル化部位がある。予備的な証拠は、これらの部位の大多数が実際にグリコジ ル化されており、これが天然ＬＨ／ＣＧ−Ｒ（分子量＝約９３ｋＤａ）と末グリ コジル化ポリペプチド（分子量＝約７５ｋＤａ）との分子量の相違の原因である と考えられる。実際、ゲル電気泳動でめたＣＮＢ　ｒ断片の分子量はオリゴ糖側 鎖によるグリコジル化は部位あたり平均、５−６ｋＤａの寄与をしているという ことに一致する。

ポリペプチドのＣ−末端側半分（残基３４２−６７４）は膜−スパニング（貫通 ）長さの７個の疎水性セグメントを含み、Ｇタンパク質と結合するレセプター群 の全メンバーと相同な配列を示す。膜貫通トポロジーがロドプシンにおける示唆 ［ナサンスら（Ｊ、　Ｎａｔｈａｎｓ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１：　４８５１　（＋９８４）：　ヘンダーソンら （Ｒ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５７：　２ｇ（１９７５ ）；オチニコフら（Ｙ。

＾、０ｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ）　、　ＦＥＢＳ、Ｌｅｔｔ、１４８：　１７９（ １９８２）つと同一と仮定すると、ＬＨ／ＣＧ−ＲのＣ末端６８残基は細胞内に 位置する。このＣ末端ドメインはりん酸化可能な部位（セゾン、スレオニン、お よびチロシン残基）であって、レセプター活性の細胞コントロールの起こる部位 を含有する［シブレーら（Ｄ、Ｒ，５ｉｂｌｅｙ）、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒ ｅｖ、。

！：３８　（１９８号）］。このドメインにはまた、塩基性アミノ酸の２個のク ラスター（６２３−６２５と６３０−６３２の位置）があり、成熟レセプターが 翻訳後の開裂を受け、これらの位置のどれか１つで終了する可能性を示している （ＫＲＲにおける翻訳後開裂）。

実施例８　Ｇタンパク質と結合するレセプターの相同性Ｌ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒが急 速に増殖するＧタンパク質とカップリングする（Ｇタンパク質結合性）レセプタ ーのメンバーであることはＬＨおよびＣＧがＧタンパク質を介する活性なアデニ レートシクラーゼであるとの見解と一致するしフンジノカー−ダンら（Ｍ、　Ｈ ｕｎｚｋｋｅｒ−Ｄｕｎｎ）、ｉｎ　Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ 　Ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｍ、Ａｓｃｏｌｉ。

ｅｄ、、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、１９８５．　ｐｐ、５ ７−１３４］　。このレセプター群の他のメンバーとＬＨ／ＣＧ−Ｒとの相同性 は、表面上、ヒトロバシープロットから明らかであり、詳細には幾つかのこの群 のメンバーが７個の推定の膜貫通領域を有するという共通点で示される（図２） 。ＬＨ／ＣＧ−Ｒのこのドメインは全体に低いが、他のメンバーとの間に有意な 配列同一性を示している。同一性はロドプシンおよびサブスタンスにレセプター で高く（２２％）、古典的な神経伝達物質、例えば、ムスカリン様アセチルコリ ンおよびセロトニンで低い（１Ｂ−２０％）［口ドプシン：ナサンスら（Ｊ、　 Ｎａｔｈａｎｓ）。

３６−８３８　（１９８７）；β−２ＡＲ：　ディキソンら（Ｒ，Ａ、Ｆ、Ｄｉ ｘｏｎ）　Ｎａｔｕｒ多くの短い配列がこれら全インバーで良く保存されており 、それが推定の膜貫通へリノクスおよび細胞内ループ領域で起きていることが分 かった。保存部位の１つは第３の細胞質ループのＣ末端の６−７残基にわたって 位置していた。このループはレセプター毎に長さがかなり異なっており、Ｌ　Ｈ ／ＣＧ　−Ｒで最短であった。変異およびキメラレセプターの分析に基づいて、 このループのＣ末端領域はＧタンパク質のカップリングに関連あることが示され た［ドウードら（Ｂ、　Ｆ、　Ｄｏｖｄ）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ、 　２６３：１５９８５　（１９８ｇ）　：　コビルカら（Ｂ、　Ｋ。

と他のＧｓと結合性のレセプター類との間において、その他のＧタンパク質と相 互作用する既知のレセプター間でのそれに比較して大きい訳ではない。

実施例９　細胞外ドメイン 細胞外の推定のホルモン結合ドメインは幾つかの有意な配列特徴を表す。これら の内、最も衝撃的なのは、１４回の約２５残基からなる不完全な反復配列モチー フ、Ｃ末端の６回の繰り返しは長さおよび配列において保存性が低い、である（ 図３ａ）。同様の構造は他の様々なタンパク質でも認められ、ロイシン豊富反復 と言われる［タカハシら（Ｎ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：１９０６（１９８５）（ＬＰＧ）；　Ｏペ ラら（Ｊ、　Ｌｏｐｅｚ）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８４：５６１５　（１９８７ＸＧＰ　ｌｂ）；　／’シモトら（Ｃ，Ｈ ａｓｈｉａｏｔｏ）　ＣｅＩＩ　５２：２６９　（１１８ｇ）（Ｔｏｌｌ）：カ タオカら（Ｔ、Ｋａｔａｏｋａ）　Ｃｅ１ｌ　４３：４９３　（１９８５）（Ａ ｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ、　ｙｅａｓｔ）；　クルジウスら（Ｔ、　 Ｋｒｕｓｉｕｓ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕミ人一 旦旦：７６８３　（１９８６）（ＰＧＡ１）コ　。

細胞外ドメインが最も類似しているタンパク質は結合組織の細胞外マトリクスに 多量に存在するプロテオグリカン、ＰＧＡ１である。

同様の繰り返しを有する他のタンパク質は血小板糖タンパク１ｂであって、これ は２個のグリコジル化ポリペプチド（フォンウィルブランド（ｖｏｎ　１ｌｉｌ ｌｅｂｒａｎｄ）因子およびトクンビン）と結合することが知られているグリコ ジル化膜タンパク質である。他の例は酵母アデニレートシクラーゼのような広範 な種々のポリペプチド、およびＤｏｒｓｏｐｈｉｌａ　（ショウジヨウバエ）デ ベロップメント遺伝子産物（Ｔｏｌｌ）である。

そのようなロイシンに富む（ロイシンリッチ）反復配列を有するタンパク質に共 通の機能は知られていないが、この群のメンバーはおそらく反復構造により形成 された両親媒性により、疎水性および親水性の両表面と相互作用するであろう。

ＬＨ／ＣＧ−Ｈの細胞外ドメインはホルモンの結合、および膜貫通領域との相互 作用によるシグナルトランスダクシヲンの両者に関与しているであろう。

細胞外ドメインに認められる他の特徴は大豆レシチンの配列と同一の１０残基で 示される部位である［ボドキンら（Ｌ、Ｏ，Ｖｏｄｋｉｎ）　ＣｅＩＩ　３４： １９２３　（１９８３）；　シネルら（Ｄ、Ｊ、５ｈｎｅｌｌ）　Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅａ＋、２６２ニア２２０　（１９ｇ？）（Ｄｉｆｌｏｒｕｓ）（Ｆｉｇ 、　ｌ参照）コ。この部位はグリコジル化ホルモンの認識とレセプターのＧｓへ の機能的なカップリング（これはグリコジル化された形のＬＨおよびＣＧとの間 で最大に達成される）に関与しているのであろうしサイラムら（Ｓａｉｒａｍ） 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：２４０９　（１９８９）］。脱グリコジ ル化されたホルモンも高い親和性でホルモンと結合するが、この相互作用では殆 どまたは全くアデニレートシクラーゼの活性化が起きない。

実施例１０　ＬＨ／ＣＧ−Ｒの機能的な発現クロンーン化ｃＤＮＡが実際にＬＨ ／ＣＧ−Ｒをフードしているかを確認するために、推定のレセプターをコードす る配列をサイトメガロウィルスのプロモーター［イートンら（Ｄ、　Ｌ、　Ｅａ ｔｏｎ）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：８３４３　（１９８６）］のコン トロール下に含有する発現ベクター（ｐＣＬＨＲ）を構築した。

詳しくは、クロンーン化ｃＤＮＡの全暗号領域とＥｃｏＲ１断片に含有されてい る付加的なフランキング領域（ヌクレオチド−４３−２５５９、図１参照）とを ｐｃｒｓベクター［イートンら（Ｄ、　Ｌ、　Ｅａｔｏｎ）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　２５：８３４３　（１９８６）］に導入することにより、発現ベクタ ーｐＣＬＨＲを構築した。

指数的に増殖する２９３細胞をｐＣＬＨＲで１時的に形質転換した［チェノら（ Ｄ、　Ｌ、　Ｃｈｅｎ）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、７：２７４５　（ １９８７）］。トランスフェクションの４２時間後、無傷の細胞を”’Ｉ−ＣＧ 結合（図４Ａ）またはＣＧ−刺激ｃＡＭＰ生産（図４Ｂ）について分析した。

１１５■ＱＱ結合の分析（図４Ａ）のために、各国を炭酸ナトリウムヲ含まず、 ２０５Ｍ　Ｈｅｐｅｓと１　ｍｇ／ａ＋１のウシ血清アルブミンを含有する温Ｗ ａｙｍｏｕｔｈ　ＭＢ７５２１／ｌ培地３＋ａｌで４回洗浄し、同じ培地２ｍｌ 内に置いた。４℃で２時間後、キムら［（＋、−Ｃ，Ｋｉｍ）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、　２６１：３８０７（１９８６）］の方法でヨウ素化した、高精製 度のＣＧ（ＣＲ−１２３，１２，７８０ＩＵ／ＩＩ１ｇ）ノ一部を、単独テマタ ハ５ＩＵの粗ＣＧと一緒に加えた（非特異的結合の測定のために）。

４℃で２４時間後、結合培地と細胞を水上のプラスチック管に入れた。細胞を遠 心し、ウシ血清アルブミン１　ａ＋ｇ／園ｌを含有スる冷１５０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ １，２０ｆｆｉＭ　Ｈｅｐｅｓ２ａ＋１によって１回洗浄し、遠心した。細胞ペ レットをガンマカウンターで計数した。

ＣＧ刺激ｃＡＭＰ生産（図４Ｂ）の測定のために、各国を１　＋ａｇ／ｅｌのウ シ血清アルブミンを含有する温Ｗａｙ＋１ｏｕｔｈ　ＭＢ７５２１／１培地３＋ ｓｌで４回洗浄し、０．５＋Ｍ　３−インブチル−１−メチルキサンチンを含有 する同じ培地２＋ａｌ内に置いた。３７℃で１５分間予備インキュベーションし た後、高精製度のＣＧの一部を加えた後３７℃で３０分間インキュベーションを 続けた。分析培地を除去した後、細胞を１　ｍｇ／ｍｌのテオフィリンを含有す る冷ＩＮ過塩素酸１．５ｍｌ中に取った。細胞を急速凍結乾燥および解凍によっ て溶解し遠心した。上清を中和し、既述のごと＜ｃＡＭＰについて分析した［セ ガトフら（Ｄ、Ｌ、Ｓｅｇａｌｏｆｆ）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６： １１４２０　（１９８１）］。

図４Ａに示すように、無傷の形質転換細胞は、漸増量の＋ｔｓＩ−ＣＧに暴露さ れる（４℃、−夜）と、ホルモンと濃度依存的な関係で特異的に飽和結合した。

形質転換されていない細胞はいかなる濃度の”’［−ＣＧとの特異的な結合も観 察されなかった。一連の細胞群をホスホジエステルインヒビター３−インブチル −１−メチルキサンチンの存在下、種々濃度のＣＧと３７°Ｃで３０分間インキ ュベーションした。結果は非特異的結合について補正してあり、２回の測定の平 均＋／−で示されている。

図４Ｂに示すように、ＣＧに対するｃＡＭＰ増大反応を示さない非形質転換細胞 と対照的に、形質転換された細胞は、ＣＧに暴露された際、細胞内ｃＡＭＰの濃 度依存性かつ飽和的な増大を示した。

結果は２回の測定の平均＋／−で示されている。

ｐＣＬＨＲで形質転換された細胞内でのＣＧ結合とｃＡＭＰ蓄積に必要なＣＧ濃 度は、Ｌ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒを担持する性腺細胞でそれらの応答を惹起する濃度に 匹敵することが分かった［ベレイラら（Ｍ、　Ｅ。

クローン化ｃＤＮＡが無傷の機能的なＬ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒをコードしていること を証明するものである。

実施例１１　ＬＨ／’ＣＧ−ＲｍＲＮＡの組織および細胞特異的発現様々なラッ ト組織のＲＮＡから調製したノーザンブロノトでＬＨ／　ＣＧ　−Ｒｍ　ＲＮ　 Ａ発現の組織特異性が証明された（図５）。

詳しくは、偽妊娠させた未成熟ラットの卵巣［ロセンブリットらからトータルＲ ＮＡを調製した。ＲＮＡをホルムアルデヒド含有１％アガロースゲルで分離し、 ナイロンメンプラン（ＩＣＮ）にプロットした。業者の指示にしたがい、メンプ ランをプレハイブリダイゼーションした後、ＰＣＲで生成したＬＨ／ＣＧ−ＲＤ ＮＡを含有する、ニックトランスレーションした”Ｐ−４１ｍｐＣＧＥＭ−３２ ベクター（プロメガ）を用いて４２℃で一夜ハイブリダイゼーションした。プロ ットを、室温で４回、２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで４回洗浄した（５分／ 洗浄）。得られたプロ・ノドを６時間（図５、パネルＡ）または−夜（図５、パ ネルＢ）強化スクリーンを用いてＸ線フィルム（−７０”Ｃ）に露出した。

４．４ｋｂｍＲＮＡに相当する独立したバンドが偽妊娠う、トの卵巣並びに成熟 ラットの畢丸から調製したＲＮＡに認められた。４゜４　ｋｂ　ｍ　ＲＮ　Ａ種 の相対的な量は非妊娠成熟雌性ラットの卵巣または成熟ラット畢丸におけるより も、偽妊娠うｙｈの卵巣内において有意に大きい。この発見はこれの組織で認め られた”’Ｉ−ＣＧ結合と一致していた［アスコリら（Ｍ、　ａｓｃｏｌｊ）　 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、　１０：２７（１９８９）］。ラット肺、肝臓ま たは腎臓から調製されたＲＮＡにはＬＨ／　ＣＧ　ｍ　ＲＮ　Ａを認めながった 。

Ｌ　Ｈ／　ＣＧ　−Ｒｍ　ＲＮ　Ａの細胞特異的な発現を調べるために、９日令 の妊娠ラットの卵巣から調製した組織切片へのＬＨ／ＣＧ−ＲｃＤＮＡの系中ハ イブリダイゼーションを行った。

詳細には、ウィルコックス［Ｊ、Ｎ、Ｗｉｌｃｏｘ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅ ｓｔ、　８２：１１３４　（１９８ｇ）］の方法に以下の改良を加えて組織固定 および系中ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションに先立ち 、切片を４％バラホルムアルデヒド（１０分間）とプロティナーゼＫ（５−１０ ｇｇ／ｉｔ）で５〜１０分間処理した。プレバイブｌ／　タイｌ　セ−’ｉ　ａ 　７１ｔ、５０％ホルムアルデヒド、０．１Ｍ　ＮａＣＬ　２０ｉｌＴｒｉｓ− ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　、５ｎＭ　ＥＤＴＡ、ｌｘデンハート溶液、１０％硫酸 デキストランおよびｌｏｍＭ　ＤＴＴを含有するハイブリダイゼーションバッフ ァー１００μｌ中、４２°Ｃで１時間行った。ハイブリダイゼーションは、バッ ファー２０ｍ１中に標識ブロー１　ブＢｏｏ、０ＯＯｃｐａを加えて開始し、５ ５℃で１夜行った。ｐＧＥＭ−３Ｚベクター（Ｐ　ｒｏｍｅｇａ）でクローニン グしたＰＣＲ−生成ＬＨ／ＣＧ−ＲＤＮＡから、”Ｓ−標識センスおよびアンチ センスプローブを得た。プローブの比活性はおよそ１００　Ｃｉ　／ｉｍｏｌで あった。暴露時間は１−３週間である（示したマイクログラフは暴露２週間）。

放射性標識アンチセンス鎖への優勢なハイブリダイゼーションが黄体に対して、 および胸膜および間質細胞に対して、観察された。

顆粒層細胞についてはハイブリダイゼーションが認められず、非黄体形成卵胞の 未熟な状態と一致していた。ハイブリダイズするｍＲＮＡの相対強度および分布 の観察（即ち、黄体は強度に染色され、胸膜および間質細胞は弱い強度で染色） は以前に報告されたラット卵巣の１１５■　ＱＧオートラジオグラフィー［ズレ ニックら（Ａ、Ｊ、　ＺｅＩｅｚｎｉｋ）、εｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　９５ ：１１ｇ　（１９７４）］と一致した。これらの所見はクローン化ｃＤＮＡが卵 巣細胞の特異的サブセットで発現された機能的なＬＨ／ＣＧ−Ｒをコードしてい ることの別の証拠である。

実施例１２　レセプターの構造特徴 要約すると、ラット黄体Ｌ　Ｈ／ＣＧ−レセプター（ＬＨ／ＣＧ−Ｒ）をコード するｃＤＮＡを、精製レセプタータンパク質のペプチド配列に基づ（プライマー を用いるポリメラーゼ鎖反応で精製したＤＮＡプローブを用いて単離した。ｃＤ ＮＡ配列から予測されたように、ＬＨ／ＣＧ−レセプターは２６残基のシグナル ペプチド、ロイシンに富む糖タンパク質（ＬＰＧ）群のメンバーに特徴的な内部 反復構造を示す３４１残基の細胞外ドメイン、７個の膜貫通セグメントを含有す る３３３残基の領域を含む。後者の領域はＧタンパク質と力・ノブリングするロ ドプシン／ｂアドレナリン作動性レセプター群の全メンバーと配列類似性を示し た。従って、Ｌ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒ遺伝子はＬＰＧ遺伝子とＧタンパク質結合レセ プター遺伝子との組換えで生成したのかもしれない。ＬＨ／ＣＧ−ＲｃＤＮＡを 発現するように操作された細胞は高度の親和性でＣＧと結合し、ホルモンに暴露 されたとき、高いｃＡＭＰを示す。ノーザン分析および系中ハイブリダイゼーシ ョンで明らかにされたように、４．４ｋｂの同起源の（ｃｏｇｎａｔｅ）　ｍＲ Ｎ　Ａはラット卵巣に優勢に存在する。

このように、ラット黄体ＬＨ／ＣＧ−Ｈの完全長さのｃＤＮＡの分子クローニン グおよび発現が達成された。このｃＤＮＡはホルモンと結合しアデニレートシク ラーゼを刺激する単一ポリペプチドをコードしている。卵巣におけるレセプター ｍＲＮＡの位置はホルモン結合に対応している。推定のアミノ酸配列は、７個の 膜貫通領域の存在から、ＬＨ／ＣＧ−Ｒが他のＧタンパク質カップリングレセプ ターと進化論的に関連していることを示唆している。しかしながら、他のそれら レセプターと異なり、ＬＨ／ＣＧ−Ｒはおそらくすガント結合に関与すると思わ れる大きい細胞外ドメインを有する。

機能的および形態学的証拠はクローン化ｃＤＮＡによってコードされているタン パク質配列がラット卵巣ＬＨ／ＣＧ−Ｒを表していることを示している。このタ ンパク質はロイシンに富むプロテオグリカン（細胞外ドメイン）およびＧタンパ ク質結合レセプターの両者の構造上の特徴を示す。Ｇタンパク質結合レセプター 群の他のメンバーは小さいリガンドと結合する（即ち、セロトニンまたはアセチ ルコリン）。他方、そのようなリガンドの結合は７個の膜貫通へす１クスの集合 によって形成された部位で起こり［フリールら（Ｔ、　Ｆ胞外部分と結合すると 考えられている［カイナネンら（Ｋ、Ｐ、Ｋｅｉｎａｅｓ、　２６１：３８０７ 　（１９８６）］　、このように、大きい細胞外ドメインおよびホルモン仲介シ グナルトランスダクションの特異的な機構によりＬ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒは他のＧタ ンパク質結合レセプターと区別される。

このレセプターはホルモン結合糖タンパク質および７個の膜貫通プロトレセプタ ーをコードする遺伝子の組換えに起源するのかもしれない。

実施例１３　ＦＳＨ−レセプター（ＦＳＨ−Ｒ）ｃＤＮＡの単離ラットＩ！丸セ ルトリ細胞から単離したポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素の鋳型として用いた 。得られたｃＤＮＡを用いてλｇｔｌＯでライブラリーを構築した。その１部（ １ｘｌＯ”）をＬ　Ｈ／ＣＧ−ＲｃＤＮＡから導いた２個のプローブ（ヌクレオ チド１−４８３および１４９９−２６０４）との配列類似性に関してスクリーニ ングした。幾つかの陽性クローンを単離し、クローン化ｃＤＮＡをＭ１３ベクタ ー［ドメインら（Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）　Ｍｅｔｈ 　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３：３−１１　（１９８７）］にサブクローニングした 後、既述のごとく配列決定した［サンガーら（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ）　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７　 （１９７７）］。このレセプターのヌクレオチド配列ｊおよび推定のアミノ酸配 列を図６に示す。

１位の翻訳開始コドンは２０７６ヌクレオチドのオープン１ノーデイングフレー ム、特に、Ｎ末端の１７残基のシグナル配ツ１１と、それシこ続いて細胞外に位 置すると予測される３４８残基の大き（Ａ親水性ドメインとを示している。この ドメイン（ま３つのＮ−結合グ１ノコシル化部位を含有する。さらに、７つの膜 貫通セグメントを有する２６ターの印である。そのような他のレセプターと同様 １ｎ、ＦＳＦ−Ｒの６３残基Ｃ−末端は細胞内に位置するとされ、そのりん酸イ ヒカ（レセプター活性を制御すると思われる幾つ力）のアミノ酸（Ｓｅｔ、Ｔｈ ｒ、　Ｔｙｒ）を含有しているしノでルツエスキーら（Ｌ　Ｐａｌｃｚｅｗｓｋ ｉ）里匹堕１セプターのような、フンセンサスりん酸化部位の１部で６士な（１ ゜成熟ＦＳＦ−Ｒは６７５アミノ酸（分子量７５Ｋ）ｈＡらなり、完全な膜糖タ ンパクを構成している。

ＦＳＦ−ＲとＬＨ／ＣＧ−Ｒとの比較 ゴナドトロピンレセプター類ＦＳＦ−ＲおよびＬ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒの比較に際し 、提案された機能類似性を考慮する（図７）。両分子とも同様の大きさであり構 造上の設計は同じである。１次構造のレベルでは、細胞外ドメインは約５０％の 配列類似性を、７個の膜貫通セグメントで定義されるドメインは８０％の配列同 一性を有する。

配列の相違が最高の部分は最初の膜貫通セグメントに先行するＮ末端の４０残基 と、Ｃ末端を取り囲む３０残基である。

Ｌ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒの細胞外ドメインについて既述したように、ＦＳＦ−Ｒ内の ホモローガスなドメインは、それぞれ約２０残基の１４の不完全反復単位として 認められる（図８）。この反復を含むモチーフは他のタンパク質にも認められ、 ロイシンリ・ノチ反復として知られている［パラティ（Ｌ、Ｐｉｔｔｈｙ）　Ｊ 、Ｍｏ１．８ｉｏ１．１９８：５６７−５７７　（１９８７）］。ロイシンリッ チ反復ファミリーのメンバーの特徴は親水性および疎水性タンパク質のいずれの 表面とも相互作用する傾向を持つことである［ロベッら（Ｊ、＾、　Ｌｏｐｅｚ ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：５６１ ５−５６１９　（１９ｇ？）］。この性質はゴナドトロピンレセプターの細胞外 ドメインの機能にとって重要な性質であろう。

両レセプターの細胞外ドメインの比較（図７）は、最高の配列の相違を伴う反復 （反？Ｎ１２および１３）がまた、基礎にるモチーフと比較して最も保存されて いないことを示している。注目すべきは、この領域はゴナドトロピンレセプター 類および最近特性化されたＴＳＨレセプターの相互間で長さが異なり［バーメン テイエら（Ｍ、　Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１６２０ −１６２２（１１８９）：　リベートら（Ｆ、Ｌｉｂｅｒｔ）　ｊ３　。

１ｏｃｈｅＩ＋＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、　５：１２５０−１ ２５５　（１９８９）；ナガヤマら（Ｙ、　Ｎａｇａｙａｍａ）　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｏ＋、　１６５：１１８４　（１９８９） ］　、様々な種の糖タンパク質ホルモンレセプター間で配列が変化している（リ ベートら、前掲）ことである。これは該領域がホルモンの認識に関与していない らしいことを示唆するものである。配列の比較はさらに８つの保存されたシステ ィン残基、その内２個は隣接する、を明らかにした。興味深いことには、これら の残基の幾つかは１３および１５の連続したアミノ酸からなるよく保存された領 域に見いだされた。これらシスティンはまた、ＴＳＨ−Ｒでも保存されている（ パーメンテイエら、前掲；リベートら、前掲；ナガヤマら、前掲）ので、ジスル フィド結合の形成は糖タンパク質ホルモンレセプターの細胞外ドメインの立体配 座の完全さに重要と思われる。

７つの膜貫通セグメントにも異なった形の配列保存性が認められる。ＴＭＩＩ！ およびＴＩＩＩＶＩＩは高度に保存されているがＴＭＩＶおよびＴＩＩＩＶは多 くの置換を有する。しかし、他のＧタンパク質結合レセプターと・　の全配列類 似性は低い［マツクファーランドら（Ｋ、Ｃ，ＭｃＦａｒｌａｎｄ）　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２４５：４９４−４９９　（２９ｇ９）］が、ＴＭＩＩ内のアスパラギ ン醇残基とＴＭＶＩＩ内のアスパラギン残基はＧタンパク質結合レセプター内で 保存されている２残基であり［マノクファーランドら、前掲；ストレーダら（Ｃ ，Ｄ、５ｔｒａｄｅｒ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 ８４：４３８４−４３８８　（１９８７）］　、２つのゴナドトロピンレセプタ ーにも存在する。ＴＭＩＶ、　ＶＴＩＩＶＩおよびＴＭＶＩＩ内のプロリン残基 同様、２個のシスティン残基もも多くのＧ９ンバク質結合レセプター内で第２お よび第３の細胞外ループ間にジスルフィド架橋を形成すると考えられている。

ゴナドトロピンレセプター内では、ＴＭｖおよびＴＭＶ　ｌで挟まれた第３の細 胞内ループは短く、全く異なっている。この領域の配列類似性が低いことは他の Ｇタンパク質結合レセプターのサブタイプにも見られる［ペラルタら（Ｅ、Ｇ、 Ｐｅｒａｌｔａ）　ＥＭＢＯＪ、６：３９２３−３９２９　（１９８ｇ）］。こ れらレセプターの幾つかではＴＭＶおよびＴＭＶ　Ｉで囲まれ、かつその１部を 構成する領域はＧタンパク質との結合に関与しているらしい［コビルカら（Ｂ、 　Ｋ、　Ｋｏｂｉｌｋａ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１３１０　（１９８Ｊｌ ）　；ディキソン（Ｒ，Ａ、ｆ、Ｄｉｘｏｎ）　Ｎａｔｕｒｅ　３２６：７３− ７７（１９８７）］−この細胞内ループのＣ末端の８アミノ酸配列は両ゴナドト ロピンレセプターで良（保存されている（ディキソンら、前掲）。Ｇ、に結合す ることが示された同様の配列がβアドレナリン作動性レセプターに見いだされる （ディキソンら、前掲）。Ｇタンパク質との相互作用はこのペプチド配列によっ て形成される両親媒性αヘリックス構造を介して起きるらしい［ストラーダら（ Ｃ，Ｄ、５ｔｒａｄｅｒ）　ＥＭＢＯＪ、　３：１ｇ２５−１８３２　（１９８ ９）コ。ＦＳＨレセプターおよびＬ　Ｈ／ＣＧレセプターで保存されている８残 基配列についてヘリックス回転を分析し、α２およびβ２アドレナリン作動性レ セプターの相同な領域（ストラーダら、前掲）と同様、荷電した側鎖はへワック スの一側面に存在し、疎水性の鎖は反対側に存在していることが分かった。

／ｍｇ）　、ｈＣＧ　（ＣＲ−４２３；　１２，７８０　１Ｕ／ｍｇ）およびｈ ＴＳＨ（Ｎ　Ｉ　ＤＤＫ−ｈＴＳＨ−１−６；　１７　Ｉ　Ｕ／ｉｇ）をＮＩＤ ＤＫ　（Ｎ、１．　Ｈ，）のナショナル・ホルモン・アンド・ピツィタリ・プロ グラム（国立ホルモンおよび脳下垂体プログラム）の好意で入手した。

ＥｃｏＲＩ−Ｂａｏ＋Ｈ１断片（ヌクレオチド−７７から２０９５）に含まれる クローン化ｃＤＮＡの全暗号領域をｐｃＩｓベクター［ゴーマンら（Ｃ，Ｍ、Ｇ ｏｒｍａｎ）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１７１：３７７−３８５（１９ｇ９）Ｊに 導入して発現ベクターｐＣＦＳＨ−Ｒを構築した。指数的に増殖するヒト胚腎細 胞２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）を３４ｍｍの皿内でこの発現ベクターでト ランスフェクション（形質転換）した［チェノ（Ｃ，Ｃｈｅｎ）およびオカヤ７ （Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７：２７４５−２７ ５１（１９８７）］。４４２時間後無傷の細胞をホルモン誘導ｃＡＭＰ生産につ いて分析した。合冊を１０％０％ラン血清を含有する温ＤＭＥＭ培地３１で１回 洗浄し、０．１ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有する２５ｍＭ 　ＨＥＰＥＳ、ｌＨ７，４で緩衝化した血清不含ＤＭＥＭ培地１培地１姉ｌ内た 。３７℃で１５分間インキュベーションした後、高精製度の糖タンパク質ホルモ ン（ｏＦＳＨ。

ｈＴＳＨまたはｈｃｃ）を加え、３７℃で３０分間インキュベーションを続けた 。細胞を液体窒素中で急速凍結乾燥および解凍してア、７セイを終了した後、合 冊に冷エタノール１．２ａ＋１を加えた。細胞デブリスおよび沈澱したタンパク 質を遠心除去しく１３．ＯＯＯｘｇ；１０分間）、上清５０μｌの内５μｌをア マージャム社のキットを用いてｃＡＭＰに関して分析した。図９および表３に示 すように、クローン化レセプターを発現する細胞は細胞内ｃＡＭＰのＦＳＨ依存 性および飽和的な増大を示した。形質転換されなかった細胞およびモックトラン スフェクシゴン（■ｏａｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）された細胞はこの応答を 示さなかった。

表３ Ｆ　Ｓ　Ｈ−Ｒ発現細胞内でのアデニリルシクラーゼ誘導ホルモン（２５ｎＭ） 　ｃＡＭＰ（ｐｍｏｌｅ／１０”細胞）なし　９．０ ｏＦＳＨ７００，０ 表３の説明：　ｐＣＦＳＨ−Ｒ発現構築物を用いて２９３細胞を１時的に形質転 換し２６ｎＭの数個の糖タンパク質ホルモンの存在下でインキュベーシヨンした 。ホルモン刺激３０分間の間に蓄積したｃＡＭＰはＦＳＨ−Ｒの、その天然のリ ガンドに対する特異性を反映している。

この応答の１７２最大誘導を引き起こすのに必要？ｔ　Ｆ　Ｓ　Ｈ濃度（２−３ ｎｇ／＋１．　−８０　ｐＭ）はｈＣＧとそのレセプターに関して認められた値 に匹敵しくマノクファーランドら、前掲）、十分に、ＦＳＨレセプターについて 報告された値［アボウーイノサ（Ａｂｏｕ−１ｓｓａ）およびレイチャート（Ｌ 、Ｅ、Ｒｅ１ｃｈｅｒｔ、Ｊｒ、）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５１：３３２ ６−３３３７（１９７６）］の範囲内に収まっている。対照的に、ｈＣＧは２５ ｎＭという濃度でもＦＳＨ−Ｒ発現細胞内でのｃＡＭＰ応答を起こさなかった（ 表３）。組換え法で産生されたＦＳＨおよびＬＨによるデータは無いが、様々な ゴナドトロピンのレセプター認識は選択的であると結論した。

考察 ＦＳＨ−ＲはＬ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒとの構造類似性を示す。Ｌ　Ｈ／ＣＧレセプタ ーとＦＳＨレセプターは複数のサブユニットからなるという研究もある［レイチ ャート（Ｌ、　Ｅ、　Ｒｅ１ｃｈｅｒｔ、　Ｊｒ、　）およびダットレイアマー テ４　（Ｂ、Ｄａｔｔａｔｒｅｙａｍｕｒｔｙ）　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　４０：１３−２６　（１９８９）；　シン（Ｊ、　５ ｈｉｎ）およびジ（Ｔ、Ｈ，Ｊｉ）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６０： １２８２２−１２８２７　（１９８５）；　スミスら（Ｒ，Ａ、Ｓｍ１ｔｈ）、 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、、　２６０：１４２９２−１４３０３　（１９８５ ）；　シン（Ｊ、　５ｈｉｎ）およびジ（Ｔ、Ｈ，Ｊｉ）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｅｔ、　２６１：９８５０−９８５３　（１９８６）；シン（Ｊ、　５ｈｉｎ） およびジ（Ｔ、Ｈ，Ｊｉ）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、　２６０：１２８２ ８−１２８３１　（１９８５）、アスコリ（Ｍ、　Ａｓｃｏｌｉ）およびセガロ フ（Ｄ、　’Ｌ、　Ｓｅｇａｌｏｆ　ｆ）の総論　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ 、、　１０：２７−４４　（１９８９）］が、Ｌ　Ｈ／ＣＧ　−Ｒの生物化学的 研究により、それは、ジスルフィド還元剤の存在下または非存在下でＳＤＳゲル 上で分析したとき分子量９２にの単一のポリペプチドであることが分かった［ロ ゼンブリノトら、Ｅｎｄｏｃｅｉｎｏｌｏｇｙ、　１２３：２２８４−２２８９ （１９８９）］　、　Ｌ　Ｈ／　ＣＧ　−Ｒは分解されて小サイズのフラグメン トにされ易い（アスコリおよびセガロフ、前掲の総論参照）ので、ＦＳＨ−Ｒも 当然、同様に分解され易いと考えられ、これが、該物質の構造に関する報告の不 一致の原因と思われる。ＬＨ／ＣＧ−Ｒ（マツクファーランドら、前掲）とＦ　 Ｓ　Ｈ−ＲのｃＤＮＡの分子クローニングと機能的な発現は、ゴナドトロピンレ セプターが正に単一のポリペプチドであることを証明している。

レセプター活性化に特有の機構を反映し、Ｆ　Ｓ　Ｈ−ＲおよびＬＨ／ＣＧ−Ｈ の両者は、推定の細胞外ドメインの大きいグリコジル化領域であって、７つの膜 貫通セグメントを含有し、Ｇタンパク質結合レセプターとの相同性を示す領域に 続がるドメインを有することを特徴としてる。同じ構造は、糖タンパク質ホルモ ンの他のメンバーであるＴＳＨ−Ｒの特徴でもある（パルメンテイエら、前掲、 リベートら、前掲、ナガヤマら、前掲）。他のＧタンパク質結合レセプターと比 較すると、この特有の設計は細胞外ドメインが二量体ホルモンの認識および結合 に重要であることを示唆している。

糖９ンパク質ホルモンレセプターの細胞外ドメインの内部反１ｉ造の機能的な意 義はただ憶測にすぎない。反復の両親媒性はホルモンとの相互作用と膜貫通ドメ インとしての２面性を与えているらしい。そのような相互作用はレセプターの活 性化にとって重要と思われ、その活性化は大多数の他のＧタンパク質結合レセプ ターでは、小さいリガンドが、７つの膜貫通セグメントの特定の部位に結合する ことで達成されている。進化論的に保存された基本的なレセプター活性化機構を 考慮すると、ゴナドトロピンの選択されたアミノ酸残基側鎖が普通の小リガンド に置き換った可能性もまったくあり得る。このモデルでは、ホルモンが細胞外ド メインに結合することによって活性化残基が正しい位置にくる。このモデルの変 形では、細胞外ドメインの残基そのものが、ホルモンと結合することにより膜貫 通セグメントの必須部位に接触する。

Ｇ、プロティンの活性化をもたらす糖タンパク質ホルモンと、それぞれのレセプ ターとの結合のメカニズムを考察する上で重要な因子の１つはこの活性化プロセ スにおけるホルモンの炭水化物部分の役割である［セイラム（Ｍ、Ｒ，Ｓａｉｒ ａｍ）、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、、　３：１９１５−１９２６　（１９ｇ９）；ｖツ ノクら（Ｍ、Ｍ、ｋｌａｔｚｕｋ）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ、　２６４：２４ ０９−２４１４　（１９８９）］。脱グリフシル化糖タンパク質ホルモンは高度 の親和性でそれらのレセプターと結合するが、それらはｃＡＭＰ産生を殆どまた は全く活性化しない（マツツクら、前掲）。天然に存在するＦＳＨのグリコジル 化変異体のＦＳＨ拮抗作用を説明するために抗ホルモン概念が提示された［ダー ルら（Ｋ、Ｄ、Ｄａｈｌ）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９ニア２−７４（１９８８ ）］。

以上、本発明をその特定の態様について述べたが、さらに改良を加えることが可 能であることが理解されるであろうし、また本出願が総じて本発明の原理に従っ ており、本発明のあらゆる変化、使用または応用を包含し、本発明の属する技術 分野で知られ、または日常的に実施されるようになる、そして上記のまた後述の 特許請求の範囲に記載の必須要件に適用されるような、本明細書の開示から派生 するものすべてを包含することを意図していることを理解されるであろう。

マ！ｏｏΦ　Ｆ１１５〜〜〜　０噴■〜−ａｎ　ｅ　ａｏ　ａ　Ｏｆ　ＰＩ　（ ％ｌ　ｅｌｌ　ｃｍ　ｗ　ψト・ト■ｈＣＧ　（ｎｇ／ｍす ｅ　−−８絆と　−壱炸　、　・ ｏＦＳＨ（ｎＭ） 国際調査報告 −慴陶＊１１　ＡＭ”ｃｊｌｓ”　ＩＩｓ、ｐσ／υｓ　９０１０２４８８国際 調査報告

Claims (59)

【特許請求の範囲】
1. １．治療有効量のホルモン受容体分子を含有する医薬組成物であって、該ホルモ ン受容体分子がＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体およびＴＳＨ受容体からなる群 から選択されるものである医薬組成物。
2. ２．該ホルモン受容体分子が該受容体分子の細胞外ドメインを含有している請求 項１の医薬組成物。
3. ３．治療有効量のＬＨ／ＣＧホルモン受容体を含有する請求項１の医薬組成物。
4. ４．該ＬＨ／ＣＧホルモン受容体分子が下記の配列群から選択される少なくとも １つの配列を含有する請求項２の医薬組成物。 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 （ｇ）【配列があります】 （ｈ）【配列があります】 （ｉ）【配列があります】 （ｊ）【配列があります】 （ｋ）【配列があります】
5. ５．治療有効量のＦＳＨホルモン受容体分子を含有する請求項１の医薬組成物。
6. ６．治療有効量のＴＳＨホルモン受容体分子を含有する請求項１の医薬組成物。
7. ７．ＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体およびＴＳＨ受容体からなる群から選択さ れるホルモン受容体分子をコードする遺伝子配列を有する組換えＤＮＡ分子。
8. ８．該分子が複製可能なベクターである請求項７の組換え分子。
9. ９．核酸分子がイントロンを含まないＤＮＡである請求項８のベクター。
10. １０．該核酸分子が２０％ホルムアミド中、４２℃で図１に示すＬＨ／ＣＧ受容 体をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションし得るものである請求項８ のベクター。
11. １１．該核酸分子が２０％ホルムアミド中、４２℃で図１に示す完全なＬＨ／Ｃ Ｇ受容体の一部をコードする少なくとも１０塩基のＤＮＡ配列とハイブリダイゼ ーションし得るものである請求項８のべクター。
12. １２．請求項１０のベクターを含有する宿主細胞。
13. １３．請求項１１のベクターを含有する宿主細胞。
14. １４．真核性細胞である請求項１２の宿主細胞。
15. １５．細菌性細胞である請求項１２の宿主細胞。
16. １６．宿主細胞内に存在するとき、いずれかの該ホルモン受容体分子を発現する 請求項８の組換え分子。
17. １７．該宿主細胞が真核性細胞である請求項１６の組換え分子。
18. １８．該真核性細胞が酵母または哺乳類細胞である請求項１７の組換え分子。
19. １９．該宿主細胞が原核性細胞である請求項１６の組換え分子。
20. ２０．該原核性細胞が大腸菌細胞である請求項１９の組換え分子。
21. ２１．該遺伝子配列がＬＨ／ＣＧホルモン受容体分子をコードしている請求項７ の組換え分子。
22. ２２．該ＬＨ／ＣＧホルモン受容体分子が下記の配列群から選択される少なくと も１つの配列を含有する請求項２１の組換え分子。 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 （ｇ）【配列があります】 （ｈ）【配列があります】 （ｉ）【配列があります】 （ｊ）【配列があります】 （ｋ）【配列があります】
23. ２３．該遺伝子配列が２０％ホルムアミド中、４２℃で、図１に示すＬＨ／ＣＧ 受容体をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションし得るものである請求 項７の組換え分子。
24. ２４．該分子が少なくとも１０ヌクレオチドを含有する請求項２３の組換え分子 。
25. ２５．該分子が少なくとも２０ヌクレオチドを含有する請求項２４の組換え分子 。
26. ２６．該遺伝子配列が２０％ホルムアミド中、４２℃で、図１に示す完全なＬＨ ／ＣＧ受容体の１部をコードする少なくとも１０塩基のＤＮＡ配列とハイブリダ イゼーションし得るものである請求項７の組換え分子。
27. ２７．該分子が下記の配列群から選択される少なくとも１０ヌクレオチドを含有 する請求項９の組換え分子。 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 （ｇ）【配列があります】 （ｈ）【配列があります】 （ｉ）【配列があります】 （ｊ）【配列があります】 （ｋ）【配列があります】
28. ２８．該遺伝子配列がＦＳＨホルモン受容体分子をコードしている請求項７の組 換え分子。
29. ２９．該遺伝子配列がＴＳＨホルモン受容体分子をコードしている請求項７の組 換え分子。
30. ３０．動物またはヒトの症状を治療する方法であって、ＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳ Ｈ受容体およびＴＳＨ受容体からなる群から選択されるホルモン受容体分子を治 療有効量含有する医薬組成物の治療有効量を該ヒトに投与することからなる方法 。
31. ３１．該組成物が生理学的に有効な量のＬＨ／ＣＧホルモン受容体分子を含有し ている請求項３０の方法。
32. ３２．該症状が受精、乳癌、前立腺癌、良性前立腺肥大症、血管運動不安定、骨 粗鬆症、多嚢胞性卵巣症からなる群から選択される請求項３１の方法。
33. ３３．該組成物が生理学的に有効な量のＦＳＨホルモン受容体分子を含有する請 求項３０の方法。
34. ３４．該症状が受精能、乳癌、前立腺癌、血管運動不安定、骨粗鬆症、および多 嚢胞性卵巣症からなる群から選択される請求項３３の方法。
35. ３５．該組成物が生理学的に有効な量のＴＳＨホルモン受容体分子を含有する請 求項３０の方法。
36. ３６．該症状がグレーヴズ病、良性前立腺肥大症、甲状腺機能低下症または甲状 腺症からなる群から選択される請求項３５の方法。
37. ３７．ホルモンを含有すると思われる試料中の該ホルモンを検出する方法であっ て、 （ａ）該試料を該ホルモンの受容体と共に、該受容体が該試料中に存在するなん らかのホルモンと結合し、検出可能な変化を受けるに十分な条件下でインキュベ ーションし、（ｂ）該受容体がホルモン分子と結合し、かつ該ホルモン分子によ って検出可能な変化を受けたか否かを測定することにより該ホルモンを検出する ことからなり、ここに、該ホルモンは黄体形成ホルモン、コリオゴナドトロピン 、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモンからなる群から選択される。
38. ３８．該ホルモンがＣＧであり、該ホルモン受容体がＬＨ／ＣＧ受容体である請 求項３７の方法。
39. ３９．該ホルモンがＬＨであり該ホルモン受容体がＬＨ／ＣＧ受容体である請求 項３７の方法。
40. ４０．該ホルモンがＦＳＨであり該ホルモン受容体がＦＳＨ受容体である請求項 ３７の方法。
41. ４１．該ホルモンがＴＳＨであり該ホルモン受容体がＴＳＨ受容体である請求項 ３７の方法。
42. ４２．ホルモン受容体の製造方法であって、（ａ）該ホルモン受容体をコードす る遺伝子配列を含有するベクターを構築し、 （ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換し、（ｃ）該形質転換された細胞を、該 細胞が該遺伝子配列を発現するに十分な条件下で培養し、 （ｄ）該発現されたホルモン受容体を回収することからなり、ここに該ホルモン 受容体はＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体およびＴＳＨ受容体からなる群から選 択されるものである。
43. ４３．該発現されたホルモン受容体が該形質転換された細胞によって該培養培地 に分泌され、該発現されたホルモン受容体が該培養培地から回収される請求項４ ２の方法。
44. ４４．該ホルモン受容体がＬＨ／ＣＧ受容体である請求項４２の方法。
45. ４５．該ホルモン受容体がＦＳＨ受容体である請求項４２の方法。
46. ４６．該ホルモン受容体がＴＳＨ受容体である請求項４２の方法。
47. ４７．該形質転換された細胞が真核性細胞である請求項４２の方法。
48. ４８．該形質転換された細胞が原核性細胞である請求項４２の方法。
49. ４９．実質上、天然の不純物を含有せず、ＬＨ／ＣＧ受容体、ＦＳＨ受容体およ びＴＳＨ受容体からなる群から選択されるホルモン受容体と結合し得る抗体また はその抗原結合性フラグメント。
50. ５０．ＬＨ、ＣＧ、ＦＳＨおよびＴＳＨからなる群から選択されるホルモン活性 のアゴニストである請求項４９の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
51. ５１．ＬＨ、ＣＧ、ＦＳＨおよびＴＳＨからなる群から選択されるホルモン活性 のアンタゴニストである請求項４９の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
52. ５２．該分子が複製可能なベクターを含有する請求項２８の組換え分子。
53. ５３．該分子がイントロンを含有しないＤＮＡである請求項５２のベクター。
54. ５４．該分子が図６ａおよび６ｂに示したＦＳＨ受容体をコードするＤＮＡ配列 と、２０％ホルムアミド中、４２℃でハイブリダイゼーションし得るものである 請求項５３のベクター。
55. ５５．該分子が図６ａおよび６ｂに示したＦＳＨ受容体をコードするＤＮＡ配列 である請求項５４のベクター。
56. ５６．請求項５４のベクターを含有する宿主細胞。
57. ５７．請求項５５のベクターを含有する宿主細胞。
58. ５８．真核性細胞である請求項５６の宿主細胞。
59. ５９．原核性細胞である請求項５６の宿主細胞。