KR940004077B1 - 재조합 인히빈 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

재조합 인히빈

[도면의 간단한 설명]

본 발명의 넓은 형태에 해당하는 위의 형태에도 불구하고, 본 발명의 바람직한 형태는 이에 따르는 실험적 방법론과 첨부된 도면을 참조하여 더 서술될 것이다.

제1도는 소의 과립막 세포 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드의 합성 계획을 나타낸다.

제2도는 소의 과립막 세포의 메신저 RNA로부터 cDNA 합성 산물의 폴리에틸렌이민 셀룰로스상의 박층 크로마토그래프이다.

제3도는 43kD (A) 소단위 및 15kD (B) 소단위 프로브의 서열을 나타낸다.

제4도는 일곱개의 인히빈 cDNA의 서열결정 계획 및 제한 효소 (Pst I) 지도를 나타낸다.

제5도는 소 인히빈 A 소단위 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 그의 예상된 아미노산 서열을 나타낸다.

선택된 제한 효소 위치는 DNA 서열위에 있다.

제6도는 소 인히빈 B 단위의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 예상된 아미노산 서열을 나타낸다.

제7도는 인간 인히빈 A 소단위 DNA의 뉴클레오티드 서열 및 예상된 아미노산 서열을 나타낸다.

제8도는 인간 인히빈 B 소단위 DNA의 뉴클레오티드 서열 및 예상된 아미노산 서열을 나타낸다.

제9도는 (A) SPS-PAGE 겔에 분자량 표준(S : kD로 나타낸 크기)과 비교한 58kD 인히빈(I) 및 31kD 인히빈(II)의 구조 및 (B) 환원되지 않은 SDS-PAGE 겔로부터 얇은 조각에서 방사능 측정에 의해 결정된 인간 폐경후의 혈청(PMS)과 숫송아지 혈청(SS)속에서 밤새 배양하여 얻은 58kD 원래 소 인히빈의 31kD 형태로의 전화늘을 나타낸다.

제10도는 소단위 A cDNA의 전체 길이를 얻기위한 계획을 나타낸다.

제11도는 A 및 B 소단위 cDNA의 발현에 사용된 링커를 나타낸다.

제12도는 플라스미드 ppBTA302, pBTA303 및 pBTA304의 지도를 나타낸다.

제13도는 대장균 균주에서 인히빈 소단위 융합 단백질 및 β-갈락토시다제의 발현을 나타낸다.

제14도는 전체 길이의 프리 프로 A(per-pro A) 소단위 cDNA의 제조 계획을 나타낸다.

제15도는 합성 펩티드로 면역된 토끼의 혈청 FSH 수준을 나타낸다. 화살표는 백신접종 시간을 표시한다.

제16도는 소의 A_N단편의 발현 벡터의 제조를 나타낸다.

제17도는 프리 프로 B 소단위 유전자의 제조를 나타낸다.

제18도는 pBTA418에서의 프리 프로 B 소단위 유전자를 구조를 나타낸다.

제19도는 제한 효소(Pst I) 지도와 pBTA306과 pBTA307의 서열결정 계획을 나타낸다.

제20도는 완전한 소 인히빈 프리 프로 B 소단위 cDNA의 뉴클레오티드 서열과 그의 예상된 아미노산 서열을 나타낸다.

제21도는 완전한 사람 인히빈 프리 프로 B 소단위 코딩 DNA의 뉴클레오티드 서열과 그의 예산된 아미노산 서열을 나타낸다.

제22도는 플라스미드 pBTA303, pBTA308, pBTA309 및 pBTA472에 의해 암호화된 인히빈 융합 단백질의 서열을 나타낸다. 합성 링커에 의해 제공되는 염기들은 하부에 나타나 있고 cDNA와 pBR322 DNA는 제12도에서와 같다.

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명의 무엇보다도 호르몬인 인히빈(Inhibin)의 일부 또는 전체를 암호화한 데옥시리보핵산(DNA) 서열을 포함하는 클로닝(cloning) 벡터, 및 그 백터를 포함하는 박테리아 균주와 같은 숙주세포, 및 인히빈의 일부, 전체 또는 전구체를 생산하는 박테리아 균준와 숙주세포의 제조에 관한 것이이다.

더하여, 본 발명은 상기 벡터와 균주의 발현산물의 생산 및 용도, 자연적으로 또는 합성에 의해 기원된 발현산물의 절편 및 벡터의 제조 및 용도에 관한 것이다.

[배경기술]

생식선이 뇌하수체 기능의 피드백 조절에 관여하는 인히빈이라 불리는 비스테로이드 인자를 생산한다는 사실은 1932년에 제안되었다. (McCullagh, D. R. (1932) Science 76, 19-20).

그후, 뇌하수체 전엽이, 생식선의 발생과 작용을 함께 조절하는 여포 자극 호르몬 즉 폴리트로핀(FSH)과 황체 형성호르몬 즉 루트로핀(LH)등 최소 두가지의 고나도트로핀을 생산하는 것이 알려졌다.

민감한 방사성면역분석시험은 각 호르몬의 정확한 독립적 측정을 가능케했으며, 생식선에 의한 이들 호르몬의 피드백 조절을 보여주었다. LH의 피드백 조절은 주로 스테로이드를 통해 일어나는 반면에 FSH에 피드백 조조은 스테로이드외에 단백질 또는 당단백질 또는 당단백질 인자인 인히빈을 통해서 일어난다.

현재 인히빈은 난소의 과립막 세포나 정소의 세틀톨리(Sertoli) 세포로부터 분비되는 단백직 또는 당단백질 호르몬으로 정의 되어 있다.

인히빈은 FSH에 대한 반응으로 분비되어 FSH 합성 빛 분비의 피드백 억제자로서 뇌하수체에 작용하나, LH의 기본적 합성 및 분비는 거의 원래대로 허용한다. 인히빈, 그 mRNA 또는 전구체가 다른 세포나 조직에서도 생산되는지의 여부는 아직 알려지지 않았다.

1970년대 초기부터 각종 생식선 공급원인 전소 및 난소의 둘다로부터 인히빈을 정제하기 위한 수많은 시도가 있어온 이래, 상반되는 결과(de Jong, F.H.(1979) Mol. Cell. Endocrinol. 13, 1-10)는 생체외 또는 생체내에서 뇌하수체 세포에서 FSH의 억제가 인히빈에 의한 것이라 여겨지고, 시험 재료의 비특이적 독성 효과에 대한 각종 검사가 항상 행해진 것은 아니라는 점으로 보아, 각종 생물검정 시스템의 이용에 부분적으로 기인하는 것으로 본다(Baker, H. W. G. 등(1981) Intragonadal of Vegulation of Reproducton(Franchimomt, P.와 Channing, C. P. Eds.), Academic Press, London pp 193-228 ; Barker H. W. G. 등, (1982) Ann. New York Acad. Sci, 383, 329-342).

최근에, 소의 여포액(bFF)으로부터 인히빈이 균질하게 정제되었다(국제 특허출원 PCT/AU85/00119 ; Robertson, D. M. 등 (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 126, 220-226).

이것은 측정되는 세포내의 FSH 함량을 낮추는 비특이적 독성 효과가 인히빈의 효과와 다른 것으로 확인 되도록 유두 이하 물질의 세포독성 효과를 견적하는 수단을 통합하는(Robertson, D. M. 등(1985), Mol. Cell. Endocrinl. 26 119-127), 엄격히 배양된 쥐 뇌하수체 세포 분석법 (Scott, R.S. 등(1980) Endocrinol. 107, 1536-1542)을 이용함으로써 달성된다.

위에 기재된 양의 정소 림프 샘플에 근거하여 임의 활성도가 1U/mg인 인히빈 활성도가 20U/ml인 소의 여포액 제제를 샘플로 사용하였다(Scott, R.S. 등(1980) Endocrinol. 107, 1536-1542).

bFF의 인히빈은 약 3500배 정제되어 특정 활성도가 200,000단위/mg 였으며 도데실황산 나트륨 존재하의 폴리아크릴아드겔(SDS-PAGE)에서의 전기이동으로 입증된 바와 같이, 각기 대략 43kD와 15kD인, 두디설파이드로 연결된 소단위 A 및 B로 이루어진 54kD 단백질이다.

각 소단위의 NH₂- 말단에 대한 아미노산 서열이 결정되었다.

이 정제된 물질은 일찌기 인히빈의 특성으로 정의된 생체외 생리적 특성을 지닌다. 즉 쥐의 뇌하수체 세포로부터의 내인성 FSH의 합성과 방출은 저해하는 반면에, LH, 프롤락틴 및 갑상선 자극 호르몬의 합성과 방출은 원래대로 방치한다.

FSH는 암컷의 배란 및 수컷의 정자형성의 속도의 빈도를 결정하는데에 있어서 매우 중요하므로, 인히빈, 인히빈의 유사체 또는 동족체 또는 인히빈에 대한 항체의 주로 가능한 이용은 사람이나 가축에 있어서 생식선 기능을 저해하거나 자극하는 것이며, 생식선 기능의 분석을 위한 진단수단으로 사용되는 것이다.

인히빈의 생리적 효과를 분석하는 시도에 있어서 많은 실험은 생체내에서 미정제 또는 부분적으로 분획된 생식선 추출물 또는 분비물을 이용하여 수행되어 왔다. 이들 실험에서 인히빈에 대한 항체와 인히빈에 기인하는 것으로 생각되는 효과는 다음과 같다.

1. 생식선 작용의 억제(Moudgal, N. R. 등, (1985) Gonadal Proteins and Peptides and their Biologocal Signficance(Sairam, M. R. and Atkinson, L. E., Eds) World Scientific Pubillshing Co., Singapore. pp 21-37)

2. 배란 속도의 증가(O'Shea, T. 등, (1982) Proc. Aust. Soc. ReP. Biol. 14, 85; O'Shea, T. 등, (1983) Proc. Aust. Soc. Rep Biol. 15, 22; Henderson, K. M. 등(1984) J. Endocrinol. 102, 305-309)

3. 발정기 개시의 촉진(Al-Obaidi, F. A. R. 등, (1983) Proc. Aust. Soc. Rep. Biol. 15, 80)

살아있는 동물에서 이들 특성 및 다른 생리적 연구의 상업적 이용은 본래 자연적으든 합성한 것이든 다량의 순수한 인히빈 또는 인히빈의 단편, 인히빈작용물질(agonist) 및 길항제를 필요로 한다.

그 정도의 양은 원료가 제한되고(예를 들면 사람의 여포액), bFF 50ml로 시작하는 전형적인 추출은 단지 5내지 10㎍의 정제된 물질을 산출하기 때문에 현존하는 정제 방법에 의해서만 얻을 수 없다.

본 발명은 특히 대장균과 같은 숙주속으로 인히빈을 암호화한 유전자 또는 유전자의 일부를 클로닝하기 위해 인히빈을 암호화한 유전자의 확인과 특성화, 및 소단위를 포함하여 인히빈 분자의 전체, 일부 또는 전구체를 합성할 수 있는 박테리아 균주와 같은 숙주를 제조하기 위해 클로닝된 유전자나 그 일부를 조작하는 것을 통해 위의 한계를 극복하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 설명]

첫째 구체예에서, 본 발명은 인히빈의 전체, 부분 또는 전구체의 아미노산 서열에 대한 코딩 서열로 작용하는 제1DNA 서열, 또는 상기 제1DNA 서열과 혼성화하는 DNA 서열을 제공하는바, 상기 서열은 자연적, 합성적 또는 반합성적 공급원을 포함하여 어떠한 공급원에서도 얻어지며, 변이와 관련된 서열을 포함하는 서열, 하나 또는 다수 염기의 치환, 결실, 삽입, 역위를 포함하여 돌연변이와 관련된 서열 및 발현을 위해 인히빈이거나 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 전부, 일부 또는 전구체 또는 동족체 및 유사체를 암호화한 DNA 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 서열은 이하 상세히 설명되고 첨부된 도면중 제5, 6, 7 및 8도에 묘사된 바와 같이 소 및 인간의 인히빈의 43kD 및 15kD(A 및 B) 소단위에 대응하는 폴리펩티드를 암호화한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, DNA는 이하에 기재된 인히빈의 20kD(Ac) 소단위를 암호화한다.

본 발명에 포함된, DNA 서열은 예를 들어 표준기술에 의해 척추동물 세포에서 전체 DNA를 추출하고 분리하므로서 척추동물 세포부터 제조할 수 있다. 선택적으로, DNA는 mRNA 주형을 사용하여 생체외에서 합성적으로 또는 생합성적으로 제조될 수 있다.

또한 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 전체, 일부 또는 전구체를 암호화한 DNA 또는 RNA 서열을 선별하는 방법도, 본 발명의 범위에 속하는 바, 이 방법은 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 서열을 제공하는 단계, 인히빈 또는 그 일부에 대한 항혈청을 제공하거나 또는 그와 같은 활성을 지닌 폴리펩티드의 전체, 일부 또는 전구체를 암호화한 것으로 알려진 DNA 또는 RNA 서열과 상기 서열의 혼성화를 결정하는 단계 및 인히빈의 일부 또는 전체를 발현하는 숙주-벡터 조합제를 확인하는 단계로 이루어진다.

위의 서열은 자연적 공급원으로부터 얻어질 수 있으며, RNA 서열, 합성서열, 재조합 DNA 분자로부터의 서열 및 그러한 서열의 조합체일 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에 있어서, 단백질 인히비의 적어도 일부를 암호화한 DNA를 확인하고 특성화하는데 이용하는 방법은 인히빈-생산 세포로부터 mRNA 종을 추출하는 단계, 이중 스트랜드 DNA(상보성 DNA 또는 cDNA)로 그들을 전환시키는 단계 및 플라스미드 같은 자발적 복제 인자에 삽입시키는 단계를 포함한다. 이어서 그 인자로 박테리아 균주등의 숙주세포를 형질전환시키고 다른 모든 세포 단백질과 대조적으로 인히빈을 암호화한 DNA를 포함하는 클론을 검출하기 위해 인히빈-유사 mRNA 또는 DNA서열에 상보적인 합성 DNA 프로브로 생산된 라이브러를 스크리닝한다.

그러므로 다른 면에 있어서 본 발명은 인히빈 -유사 mRNA 또는 DNA의 확인을 위한 합성 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공하는바, 프로브는 폴리뉴클레오티드 및 표지를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로부터 선택되는 서열을 갖는다 :

바람직하게 표지는 5' 말단에 붙어있는³²PO₄이거나, 또는 다른 표지이다.

다른 구체예에서 본 발명은 인히빈의 전체, 일부 또는 전구체의 아미노산 서열을 암호화한 제1DNA 서열 또는 상기 제1서열과 혼성화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 삽입체에 의해 특성화되는 재조합 DNA 분자를 제공하는바, 상기 서열은 자연적합성, 생합성한 또는 반합성 공급원을 포함아여 모든 공급원으로부터 유도된다. 서열은 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 전부, 일부 또는 전구체, 유사체 또는 동족체를 암호화한 서열을 포함하여, 하나 또는 다수의 염기 치환, 결실, 삽입 및 역위와 같은 돌연변이를 지닌 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 재조합 DNA 분자는 상기 DNA 삽입체에서 작용가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 형태에 있어서, 상기 DNA 삽입체는 대장균의 β-갈락토시다제 유전자에 작용가능하게 연결된다.

다른 바람직한 조절 시스템은 박테리오파지 λ(P_L)의 좌측 프로모터 및 tac와 같은 혼성 프리모터 또는 몰로니 (Moloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복체의 것과 같은 바이러스 프로모터와 트림토판(trp) 오폐론의 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 재조헙 DNA 분자는 위에 기술된 DNA 삽입체를 포함하는 플라스미드이다.

본 발명의 바람직한 플라스미드는 이후에 상세히 설명될 것이며 pBTA22, pBTA23, pBTA28, pBTA29, pBTA30, pBTA290, pBTA292-pBTA305, pBTA306,-pBTA310, pBTA472 및 pBTA415-pBTA418을 포함한다.

선택적으로, 언급한 재조합 DNA 분자는 박테리오파지 λ같은 적당한 박테리오파지의 DNA 또는 생체외진핵세포 또는 전체 유기체에서 복제가능한 바이러스의 DNA에 연결된 DNA 삽입체를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 발현을 위해 프로모터, 번역개시신호, 및 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 전체, 부분, 또는 전구체의 아미노산 서열을 암호화한 또는 그 대응하는 제1DNA 서열, 제1DNA 서열과 혼성화하는 서열 또는 제1DNA 서열에 있어서 하나 또는 다수의 염기 치환, 결실, 삽입, 역위의 돌연변이에 관련된 DNA 서열을 포함하는 융합 유전자를 제공한다.

본 발명의 바람직한 재조합 DNA 분자는 본 발명의 DNA를 포함하는 DNA 서열이 삽입된 플라스미드를 포함한다.

적합한 플라스미드는 pBR322, pUR290, pUR291,PUR 292, pBTA286, pUC7, pUC8, pUC9, pUC13, ptrL1, pWT111, pWT121, 또는 pWT131 및 유도체를 포함한다. 또한 pZIP Neo SV(X) 1과 같은 바이러스 벡터, 우두 바이러스, 바쿨로바이러스(baculovirus)와 이들의 유도체들을 포함한다.

또한 본발명의 범위에는 재조합 DNA 분자의 제조방법이 포함되며, 방법은 발현을 위해 인히빈이나 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체의 아미노산 서열을 암호화한 또는 그와 대응하는 제1DNA 서열, 상기 제1서열과 혼성화하는 DNA 서열 또는 상기 제1DNA 서열 또는 혼성화 서열에 대한 하나 또는 다수의 염기 치환, 결실, 삽입 또는 역위의 돌연변이가 관련된 서열을 포함하는 DNA 삽입체를 제공하는 단계; 상기 DNA 삽입체를 클로닝 운반체에 삽입하는 단계로 이루어진다.

바람직한 상기 DNA 서열은 올바른 위치에서 클로닝 운반체에 삽입되며 리딩프레임 (Reading frame)은 발현 조절 서열을 지닌다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 최소한 하나의 재조합 DNA 분자로 형질전환되어 폴리펩티드 인히빈 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드의 전체, 일부 또는 부분들 또는 전구체를 발현할 수 있는 숙주가 제공되어 있다.

적합한 숙주에는 인체 세포, 인체 조직 세포 또는 전체 진핵 유기체를 포함하여 박테리아 세포, 박테리오파지, 효모, 기타 균류, 척추동물 세포 또는 곤충 세포, 식물세포 등이 있다.

적합한 박테리아 숙주에는 배양균은 다른 장 유기체, 슈도모나스(Pseudomonas) 및 바실러스 (Bacillus) 등이 있다. 바람직한 숙주 배양균은 대장균 BTA545, BTA634, BTA637, BTA647 및 BTA652이고 숙주- 벡터 조합체는 ATCC67054-ATCC67059 및 BTA1361로 확인되었다.

또한 숙주를 제공하는 단계, 상기 숙주의 올바른 리딩 프레임에 본 발명의 재조합 DNA 분자를 삽입시키는 단계를 포함하는 숙주의 형질전환 방법도 본 발명의 범위내에 포함된다.

더 나아가서 본 발명은 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 특성을 갖는 폴리펩티드의 전체, 일부 또는 전구체를 포함하는 본 발명의 형질전환된 숙주의 발현 산물을 제공한다. 바람직하게도 이들 발현 산물은 실제적으로 순수한 형태로 제공되었다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 발현산물은 숙주에 유사한 제1폴리헵티드 및 인히빈 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 특성을 갖는 폴리펩티드의 전체, 일부 또는 전구체, 동족체 또는 유사체를 암호화된 아미노산 서열인 제2폴리펩티드 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 제 1 아미노산 서열은 β-갈락토시다제의 일부 또는 전체이며 숙주 세포는 대장균이다.

본 발명의 더 바람직한 모형에 있어서 제 1 서열은 발현 산물의 NH₂-말단기 서열이다.

본 발명의 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인히빈 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드의 전체, 일부 또는 전구체를 포함하는 폴리펩티드의 생합성 방법을 제공하는바, 이 방법은 인히빈과 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드의 전체, 일부 또는 전구체인 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 산물을 발현할 수 있도록 본 발명의 재조합 DNA 분자로 적합한 숙주를 형질전환시키는 단계; 상기 발현을 달성하기 위해 상기 숙주를 배양하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를 모으는 단계를 포함한다.

더 바람직한 형태에 있어서 발현 산물은 불용성 봉입체로 형성되고 가용성 세포 단백질로부터 원심분리에 의해 세포 추출물로부터 정제된다.

바람직한 정제 방법은 단백질가수분해 저해제 및 막 파괴제의 첨가 및 밀도구배 원심분리를 포함한다.

만약 필요하다면, 정제된 봉입체는 녹일 수 있고, 방출된 단백질은 선택적인 절단 및/또는 추가정제로 더 처리되어 불필요한 단백질성 물질이 제거된다.

더욱이, 본 발명은 플라스미드 pBTS28, pBTA29, pBTA292와 pBTA296-pBTA310, pBTA472 및 pBTA415-pBTA418로 형질전환된 박테리아에 의해 발현되는 인히빈-유사 단백질을 제공할 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 제제상으로 적합한 형태 또는 합성 등가물로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 발현된 산물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

다른 면에 있어서, 본 발명은 인히빈의 일부분으로서 인히빈 작용물질, 길항제이거나 항원 반응을 일으킬 수 있어 FSH 수준이나 생리적 생리현상에 영향을 미치는 합성 펩티드를 포함한다.

조성물은 경구투여나 주사가능한 형태가 적합하며 더 바람직하게는 제약적으로 허용되는 보조약도 포함한다.

또한, 지속적인 방출형태, 특히 척추동물에서 피하삽입 및 지속적 방출에 적합한 형태의 제약 조성물도 본 발명의 제약 조성물에 포함한다.

그와 같은 형태의 조성물은 생식선 작용에 영향을 주기위해 척추동물로 피하 삽입되며 원하는 결과가 얻어질 때 제거된다.

다른 면에 있어서 본 발명은 제약학적으로 적합한 형태로 하나 또는 그 이상의 발현된 단백질로 포함하는 백신을 제공한다.

본 발명은 또한 발명의 제약 조성물의 유효량을 척추동물에 투여함을 포함하는 상기 척추동물에서의 생식선 작용에 영향을 미치는 방법을 포함한다. 더 다른 형태에서 본 발명은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 발현 산물 또는 본 발명의 제약 조성물을 척추동물에 투여하여 면역학적 공격(Challenge)의 결과로서 제조된 항체 제제를 포함한다. 그와 같은 항체 제제는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제제를 포함한다.

본 명세서와 청구범위를 통하여 "인히빈" 용어의 사용은 비-종 특이성이며, 따라서 소, 인간, 양, 돼지, 닭 및 어류 그리고 특히 인간과 소의 인히빈과 같은 인히빈의 관련된 종을 포함한다. 또한, 그 용어는 비-글리코실화 및 글리코실화 인히빈 종들을 포함한다.

"척추동물"용어는 어류, 양서류, 파충류, 조류 및 인간을 포함한 포유류의 종을 포함한다.

[인히빈의 소단위 구조]

명세서를 통하여 지적된 바와 같이, 여포액 속으로 분비될 때 인히빈은 두개의 43kD 및 15kD 소단위(각각 A 및 B)를 포함하는 58kD 단백질이다. A 즉 43kD종은, 하나의 인히빈 종이 다른 인히빈 종으로 투여될 때 항원으로서 작용하는 것과 같은 어떤 차이를 지닌 종들 사이의 동족체 단백질이다. 이와 같은 방범으로 인히빈의 다른 종들은 이후에 서술될 방법으로 항인히빈 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다.

대조적으로, B 즉 15kD 소단위는 인간과 소의 종과 같이 많은 종 사이의 아미노산 서열에서 실제적으로 동일하다.

어떤 환경에서는 전체 단백질이 20kD와 15kD(각각 Ac 및 B)의 분자량을 가지는 두 소단위를 포함하는 31kD 형태로 분리된다. 31kD 형태는 인히빈 활성을 나타내고 본 발명의 일부를 이룬다. 58kD 형태의 31kD 형태로의 분리는 그 자체가 생식선 조절작용에서 중요한 역할을 할 수 있고 따라서 본 발명의 일부분인 A_N단편으로 언급된 폴리펩티드 단편을 유리시킨다.

본 발명의 수행하는 가장좋은 방법

더하여, 다음 용어는 그 본래 또는 글리코실화 상태와 관계없이 본문에서 정의되고 교환가능하게 사용된다:

A 소단위=43kD 소단위=58kD 인히빈의 큰 소단위=아미노산 His 1 내지 Ⅰle 300(제5도)=아미노산 His 1 내지 Ile 306(제7도).

Ac 소단위=20kD 소단위=31kD 인히빈의 큰 소단위=아미노산 Ser 167 내지 Ile 300(제5도)=아미노산 Ser 172 내지 Ⅰle 300(제7도).

An 단편=A 소단위의 NH₂-말단부분=아미노산 His 1 내지 Arg 166(제5도)=아미노산 His 1 내지 A g 171(제7도).

B 소단위=15kD 소단위=58kD 및 31kD 인히빈의 작은 소단위=아미노산 Gly 1 내지 Ser 116(제6도 및 8도).

"유사한 면역학적 활성을 갖는" 구문은 (1) 수령자의 면역체계는 본래 단백질에서와 같은 방식으로 작용하고 (2) 투여는 내인성 인히빈을 인식할 수 있는 단백질에 대한 항체를 생성하도록 인히빈 또는 그의 일부분에 충분히 유사한 단백질을 포함함을 의미한다.

또한, "인히빈의 일부" 용어는 인히빈의 소단위를 포함함을 이해해야 한다. 본 발명의 방법과 생성물은 아래에 자세히 서술되며, 본 발명의 넓은 형태안에 속하는 기술분야의 숙련자에게 유용한 선택적인 방법도 존재함을 이해해야 한다.

[실시예 1]

소의 과립막 세포로부터 메신저RNA(mRNA)의 분리

전체 정소와 난소, 또는 분리된 세르톨리 세포와 과립막 세포를 인히빈 mRNA의공급원으로 사용할 수 있다.

이 실시예에서는 분리된 과립막 세포를 사용하였다.

a. 과립막 세포의 수집

과립막 세포를 포함하는 소의 여포액(bFF)을 지방 도살장에서 신선한 소의 난소의 표면에 존재하는 큰 여포로부터 주사기와 바늘을 사용하여 수집하였다. 이 액을 모은 후에 곧 냉동시켜 실험실에 도착할 때까지 저장하였다. 70-100ml bFF에서 더은 세포를 5분간 500×G로 원심분리하고 본래 인히빈의 정제를 위하여 상징액을 제거하였다. 아래에 설명된 바와 같이 세포로부터 RNA를 추출하였다.

b. RNA의 추출과 정제

수거한 후 곧, 과립막 세포를 4.2M 구아니디늄 이소티오시아네이트 120mM/메르캅토에탄올/5％(v/v)사크로실 /10mM Tris-HCI pH 7.4 24ml을 첨가하여 용해시켰다(Chirgwin, J.M. 등(1979) Biochemistry 18; 5294-5299).

용해물을 30초간 소르발 옴니믹스(Sorvall Omnimix)에서 속도 4로 균질화하고, 이어서 세포 파편을 제거하기 위해 15분간 20,000×G로 원심분리하였다. 상징액에 2.5ml당 CsC1 1g을 첨가하였다.

이 혼합물을 5.7M CsC1/10mm/EDTA/50mm Tris-HC1 pH 7.8 9ml을 첨가하고 15℃에서 65시간동안 122,000×G로 원심분리하였다.

CsCl를 제거하기 위해 RNA 펠릿을 5ml의 70％ 에탄올 5ml/ TE 30％(EDTA 1mM/Tris-HC1 pH 7.5 10mM)로 여러번 세척하였다. 최종적으로 3M 아세트산 나트륨 pH 7.5 0.3ml와 에탄올 6ml의 첨가에 의해 TE 3ml로부터 침전시킨 후 -70℃ 로 냉동시키고 20,000×G로 10분간 원심분리하였다.

RNA 펠릿을 TE 1ml에 재용해시켜 필요할 때까지 -70℃에서 보관하였다.

c. mRNA의 분리

mRNA는 올리오 dT 셀룰로스에서 크로마토그래피에 의해 전체 RNA로부터 추출하였다 (Aviv. H. 및 Leder, P.(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69; 1408-1412).

RNA 용액은 1M NaC1/1mM EDTA/20mM Tris-HC1 pH 7.5로 만들었으며, 70℃로 2분간 가열하고 얼음물에서 순간적으로 냉각시켜 올리고 dT 셀룰로스(BRL)의 컬럼(건조 침상 무게 0.5g)에 넣었다.

분획을 통해 유동액을 가열하고, 냉각시켰으며 이것을 두번 반복하였다. 컬럼을 적재 완충액 5ml로 세척한 후 0.5M NaC1을 포함하는 같은 완충액 5ml로 세척하였다. mRNA는 60℃ TE에서 용출되었다.

분획(0.25ml)을 모으고 그들의 mRNA 내용물을 아세트산 나트륨, 상기 에탄올을 이용하여 침전시키고 팰릿을 진공에서 건조시켰다. mRNA를 TE 0.1ml에 재용해시키고 분취량(25μl)을 -70℃로 열렸다.

이 추출과 정제 단계로부터 얻은 RNA 분획의 상태는 아가로스-우레아겔에 표본 1-2㎍을 전기이동시켜 분석하였다(Locker, J. (1979) Anal. Biochem. 98, 353-367). 특별히 5M 우레아 및 트랭킹 염료 브로모페놀 블루와크실렌 시아놀 FF 각 0.01％(w/v)를 함유하는 TE10μl중의 RNA 샘플을 70℃에서 2분간 가열한 후, 5.6M 우레아/14mM 요오드아세테이트/1mM EDTA/36mM NaH₂PO₄/40mM Tris-NaOH pH 7.4를 포함하는 1.5％ 아가로스 겔에서 전기 이동하였다. 전기이동은 브로모페놀 블루 염료가 겔의 바닥에 도달했을 때 종결하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 RNA를 착색시킨뒤 자외선하에서 관찰하였다.

RNA의 농도는 260nm에서의 흡수도로 측정하였으며, 1㎝ 빛 통로 사용시 1.0으로 읽히는 A₂₆₀은 ml당 RNA 40㎍에 해당된다. 전형적으로 bFF 60-100ml은 펠릿의 과립막 세포 습윤 중량 1-3g을 제공하였으며 그로부터 전체 RNA 600-900㎍ 및 mRNA 20-60㎍이 추출되었다.

이 mRNA 부분은 인히빈, 인히빈의 소단위 또는 인히빈과 같은 폴리펩티드에 특이한 mRNA를 포함하나 mRNA 부분은 불필요한 대부분의 혼합물내에서 다른 함량으로 존재하는 많은 각종 mRNA종의 혼합물임을 이해하여햐 한다. 다음 단계인 cDNA 합성과 테일링(tailing)동안, 각각은 인히빈, 인히빈 소단위 또는 인히빈-유사 폴리펩티드에 특이한 mRNA 종류와 매우 유사하게 작용하고, 그들의 존재는 궁극적으로 불필요한 많은 클론을 생산하며, 옳은 클론 즉 인히빈의 일부나 전부 또는 소단위를 암호화한 cDNA 서열을 포함하는 클론을 확인하기 위해 스크리닝 절차를 필요로한다.

mRNA로부너 cDNA의 제조 계획과 pBR322 벡터내로 그것의 삽입은 제1도에 나타나 있고 실시예 2 및 3에 보다 자세히 설명되어 있으며 단지 예시를 위해서만 제시되었다.

[실시예 2]

mRNA로부터 복제 DNA(cDNA)의 합성

a. 제1 cDNA 스트랜드의 합성

dATP에 제한되는 반응 혼합물을 취하고, α^-32P dATP 삽입에 의해 cDNA 합성의 정도를 측정하기 위해 그것의 소량을 제거하였다. 완전한 제1스트랜드를 합성하기 위해 과량의 dATP를 주혼합반응물에 첨가하였다. 특히, mRNA 제제의 샘플(2㎍)을 물에 첨가하여 27μl 부피로 만들어 70℃에서 2분간 가열한후 얼음물 속에서 순간적으로 냉각시켰다. 올리고 dT_10-17프라이머(Boehringer) 500ng, dCTP, dTTP dGTP 각 50n몰, dATP 5n몰, DTT 100n몰, AMV 역전사효소 20단위(Life Science), KC1 2μ몰, MgC1₂40n몰, Tris-HC1 2.5μ몰(pH 8.5)을 포함한 혼합물 23.5μl를 첨가하여 반을 개시하였다.

혼합후 즉시 분석반응이 α^-32P ATP 0.5μl(1800 Ci/nmol ; 5μCi/μl)를 포함한 분리된 튜브에 샘플 2μl를 첨가하여 분석반응을 개시하고, 60nM dATP 0.5μl를 주반응물에 첨가하여 42℃에서 60분간 방치하였다. 이 분석반응물로부터, 0.5μl를 제거하여 순식간에 에탄올 드라이아이스 수조에서 냉동시켜 제로시간 대조표준으로 이용하였다. 반응잔존물을 42℃에서 60분간 방치한 후 0.5μl를 분석을 위해 더 취하였다.

방사성 표본 각각은 pH 3.5의 0.75M KH₂PO₄완충액중의 폴리에틸렌이민(PE) 셀룰로스(Merck) 상에서 박층 크로마토그래피를 하였다. 그 결과를 방사선 자동 사진법으로 제2도에 나타냈다. 이 방법에 의해 삽입되지 않은 뉴클레오티드는 근원에 남는 새로 합성된 제1 스트랜드(DNA-RNA 혼성체)로부터 제거된다. 각각의 점을 방사선 자동 사진법을 따라 절단하고, 삽입효율을 추정하기 위해 삽입된 방사선을 결정하였다. 총량의 10％의 삽입율(최대 삽입율은 30％) 또는 그 이상이 cDNA 합성의 제2스트랜드 진행시키는데 만족스러워서 취하였다. 그 방사성 물질의 잔존물은 2M 암모늄 아세테이드/67％ 에탄올로 두번 침전 시켰고 RNA와 DNA 스트랜드를 분리시키기 위해 상기의 적하 완충액에서 2분간 끓인 후에 아가로스-우레아 겔에서 전기이동하였다. 그후 겔을 후지 RX X-레이 필름상에서 방사선 자동 사진법으로 관찰하였다. 이 방법은 cDNA 생성물의 크기의 개산을 가능하게 하며 전형적으로 1000 염기 이상에서 200 범위를 이하의 염기 제공한다. 제1스트랜드 합성은 당업자에 공지된 다른 방법을 이용하여 달성될 수도 있다. 이 실시예에서, 올리고 dT는 폴리(A) 영역을 갖는 모든 mRNA 종들로부터 제1스트랜드 cDNA를 합성하기 위한 프라이머로 사용하였다. 또한 임의의 프라이머는 mRNA 종으로부터 cDNA 합성을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 인히빈 mRNA의 일부분에 상보적인 서열을 가지는 프라이머가 인히빈 cDNA의 특수 합성을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 올리고 dT 또는 인히빈 mRNA의 일부분에 대해 상보적인 서열을 가지는 다른 프라이머를 제1스트랜드 합성을 위한 프리머로 사용할 수 있다.

b. 제2스트랜드의 합성

제1스트랜드 cDNA 합성과 유사한 방법으로, 대량의 분석 반응물을 dATP가 결핍된 최초의 반응 혼합물로부터 유도하였다. 특히, 제1스트랜드 주 반응의 cDNA-RNA 혼성 분자는 pH 7.5의 3M 암모늄 아세테이트 50μl와 에탄올 200μl를 첨가하고 -70℃로 냉각시켜 15,00×G로 5분간 원심분리하여 침전시켰다. 펠릿을 TE 50μl에 재현탁하고, 재침전시킨 후 건조하여 마지막으로 TE 50μl에 넣는다.

여기에 dCTP, dTTP와 dGTP 각각 16n몰, dATP 1n몰, RNAase H(BRL)3.5단위, DNA 폴리머라제 I 92 단위(Boehringer), BSA 40㎍, β-NAD 6n몰, (NH₄)₂SO₄400n몰, KC1 4μ몰, MgC1₂200n몰 및 Tris-HC1 800n몰을 포함하는 pH 7.5의 용액 350μl를 첨가하였다 (Gubler, U. 및 Hoffman B. J. (1983) Gene 25 ; 263-269).

혼합한 후 곧, α^-32P dATP (1800 Ci/n몰 ; 5μCi/μl)를 포함하는 분리된 튜브에 샘플 2μl를 가하여 분석반응물을 만들고, 15℃에서 60분간 방치된 주 반응물에 10mM dATP 2μl를 첨가한후 22℃에서 60분간 방치하였다. 이 분석 반응으로부터, 표본 0.5μl를 취하여 제로 시간, 1시간 및 2시간에 에탄올 드라이 아이스 수조에서 순간적으로 냉동시켜 제1스트랜드 합성에 대해 서술한 바와 같이 박층 크로마토그래피로 분석하였다(제2도). 전체 카운트(count)의 최소 5％(최대 8％로 추정)의 삽입이 좋은 제2스트랜드 합성의 증거로 얻어졌다.

제2스트랜드 합성은 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 실시예를 아래에 제시하였다.

이 경우에, DNA/RNA 혼성체중의 RNA에 특이한 RNAase(즉 RNAase H)를 DNA 폴리머라제와 함께 사용하였다. 선택적으로, 제1스트랜드 합성으로부터 얻어진 DNA/RNA 혼성체중의 RNA를 화학적으로 또는 효소적으로 파괴하거나 DNA로부터 제거하면 DNA는 자기 프라임(prime)이 될 수 있다. 제2스트랜드 합성은 DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 이용하여 수행하였고 단일 스트랜드에 특이하게 작용하는 S1 뉴클레아제 등을 사용하여 잔류하는 머리핀 루프(hairpin loop)를 소화시켰다.

세번째 방법은 mRNA의 분해 또는 제거한후 제1스트랜드 DNA 생성물 의 3'-말에 올리고뉴클레오티드(즉, 올리고 dc)꼬리를 부가하는 것을 포함한다. 상보성 올리고뉴올레오티드(즉, 올리고 dG)는 꼬리에 연결되어 DNA 폴리머라제 또는 역전사효소에 의한 제2스트랜드 반응에 대한 프라이머로 작용한다. 또한 인히빈 cDNA에 유사하거나 동일하거나 상보적인 서열을 지니 단일 또는 이중 스트랜드 DNA는 클로닝을 위해서 화학적 합성으로 만들어질 수도 있다.

[실시예 3]

대장균에서 소의 과립막 세포 cDNA 라이브러리의 제조

a. cDNA의 테일링(Tailing) 및 어닐링(Annealing)

제2스트랜드 합성으로부터 얻은 이중 스트랜드 cDNA를 3M 아세트산 나트륨(pH 7.5) 40μl와 에탄올 80μl를 첨가하여 -70℃에서 냉각시킨후 5분간 20,000×G로 원심분리하여 침전시켰다. 펠릿을 TE 50μl에 재용해시키고, 동일 부피의 페놀(TE로 미리 평형화시킴)로 두차례 추출한 후 디에틸에테르(TE로 미리 평형화시킴) 100μl로 세차례 추출하고, 이어서 4M 암모늄 아세테이트 50μl와 에탄올 200μl를 첨가하고 -70℃로 냉각시켜 침전시켰다. 이전의 침전과 대조적으로, 찬 혼합물은 실온으로 하여 5분간 15,000×G로 원심분리하였다. 이 과정은 삽입되지 않은 뉴클레오티드를 제거하는 것을 돕는다. 펠릿을 TE 50μl에 녹이고 암모늄 아세테이트와 에탄올을 사용하여 재침전시켰다. 펠릿을 진공에서 건조시킨 후 TE 30μl에 재현탁하였다.

cDNA 15μl에 CoC1₂30n몰, DTT 3n몰, 카코딜레이트 칼륨 1.5μ몰 pH 7.2, 소의 혈청 알부민 5㎍, dCTP 30n몰 및 말단기 전이효소(BRL) 17u 단위를 포함하는 동량 부피의 완충액을 가하였다. 혼합물을 에탄올-드라이아이스 수조에서 얼리기전에 37℃에서 3-5분간 배양하고, 그후 65℃에서 5분간 가열하였다. 테일링된 DNA는 -20℃에서 사용에 필요할 때까지 저장하였다. cDNA 좋은 Pst I 제한 엔도뉴클레아제 (BRL Cat. No. 5355 SA) 위치의 돌출부 말단에 약 24dG 잔기를 포함하는 상업적으로 구입한 pBR322 플라스미드 분자(제1도 ; 표2)에 어닐링으로 알려진 과정을 통해 삽입시켰다. 이 어닐링 과정에 있어서 cDNA의 dC-꼬리는 플라스미드의 dG 꼬리와 안정한 혼성체를 형성하였다. PsT I 위치가 pBR322 β-락타마제 유전자 내에 위치하기 때문에, 얻어진 플라스미드는 암피실린에 민감하나 테트라실린에는 저항한다.

어닐링을 위해, dC-꼬리의 cDNA 2.5μl와 dG-꼬리의 pBR322 0.5㎍을 0.1M NaC1을 포함하는 TE 50μl에서 65℃로 5분간 가열하고, 57℃에서 2분간 배양하였다. 이어서 용액을 한시간에 걸쳐 서서히 실온으로 냉각시키고 더 사용하기 전까지 -20℃에서 빙결시켜 보관하였다.

cDNA 종의 벡터 분자내로의 삽입은 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 달성할 수 있다. 예를 들면, 어느 뉴클레오티드는 테이링으로 알려진 말단기 전이효소 반응에 의해 DNA 분자의 3' 말단에 첨가될 수 있다. 이들 분자는 상보적인 서열로 테일링된 벡터 DNA 분자와 어닐링될 수 있다. 선택적으로 cDNA 분자는 제한 효소에 의해 전달되는 경우, 클로닝에 편리한 서열을 제공하는 DNA 리가아제가 첨가된 합성 연결자를 가질 수 있다. 선택적으로 cDNA는 직접적인 클로닝을 위해 제한 효소나 DNAase에 의해 절단될 것이다. 블런트(Blunt) 말단 DNA 분자는 또한 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 및 다른 바이러스 등의 벡터속으로 직접 클로닝될 수 있다.

b. 재조합 플라스미드를 이용한 대장균 ED 8654의 형질전환

대장균 ED 8654(표2) D. Hanahan(1983; J. Mol. Biol. 160, 557-580)의 방법에 의해 컴피턴트(competent)로 만들었고, 컴피턴트 세포 2ml을 어닐링된 cDNA-pBE322 혼성체 10μl로 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 SOC(이스트 추출을 5g/1, 트립톤 20g/1, 10mM NaC1 2.5mM KC1, 20mM MgC1₂, 20mM MgSO₄, 20mM 글루코스) 2ml에서 2시간 동안 증식시킨후 2,000×G로 5분동안 원심분리하고, 0.85％ NaC1 0.5ml에 재현탁하여 pBR322 또는 재조합 플라스미드로 형질전환된 세포를 선별하기 위해 전체 현탁액을 테트라사이클린-HC1 10㎍/ml을 포함하는 280㎜ LB(이스트 추출물 5g/ 트립톤 10g/ 리터당 NaC1 5g)와 pBR322 또는 재조합 플라스미드로 형질전환된 세포를 선별하기 위하여 한천(리터당 한천 15g)플레이트 위에 플레이팅하였다. 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 이 방법에 의해 전형적인 형질전환은 재조합 pBR322 ㎍당 약 5×10³내지 5×10⁴또는 cDNA ㎍당 약 10⁴내지 10⁵콜로니를 산출하였다. 14 테트라사이클린-저항성 콜로니로부터 플라스미드의 무작위 스크리닝을 통해 결정한 결과 전형적으로 형질전환체의 78％ 이상은 재조합 플라스미드를 포함하였다.

c. 형질전환된 세포의 저장

각 플레이트로부터 콜로니를 긁어모아서 LB 10ml에 넣었다. 추정상 2,000의 독립된 형질전환 결과로부터 얻은 세포들을 함께 모아서 15,000×G로 5분간 원심분리시키고 LB 5ml(v/v)에 재현탁하고 DMSO 0.5ml을 첨가하였다. 일부(0.4ml)는 액체 질소에서 동결시켜 필요할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 그러한 다섯의 풀(pool)을 이 방법으로 만들었다.

각각의 고유한 형질전환체는 mRNA 분획에 존재하는 mRNA 종류중 하나의 부분적이거나 또는 전체적인 복제물로부터 유도되는 재조합 DNA 종들을 포함하기 때문에, 수집물 또는 풀을 라이브러리라고 부른다. 이 경우에는, 소의 과립막 세포 cDNA의 라이브러리를 대장균에서 제조하였다. 진핵세포는 1×10⁴-2×10⁴의 다른 단백질을 만들 수 있으므로 10⁴의 독립적인 형질전환체 수집물은 훨씬 더 풍부한 mRNA 종들로부터 유도된 일원을 포함할 것이다. 분형히 이들 라이브러리내의 대부분의 세포들은 직접적으로 중요하지 않은 cDNA를 포함하지만 일부는 인히빈 mRNA 종들의 전체적이거나 부분적인 복제물을 포함하고 있으며 다음의 방법들은 그들 콜로나를 확인하고 분리하기 위해 고안된 것이다.

[실시예 4]

인히빈 클론을 위한 라이브러리의 스크리닝

a. 스크리닝을 위한 라이브러리의 제조

시험관의 빙결된 세포를 녹이고 5×10⁵배로 희석시켜 테트라사이클린-HC1 10㎍/ml를 포함하는 280㎜ LB 한천 플레이트의 표면에 0.5ml을 바른후 밤새 37℃로 배양하였다. 플레이트당 약 10⁴콜로니가 출현하였으며 본래 라이브러리의 각 형질전환체는 1 내지 5배로 제공되었다. 이중 복제는 니트로셀룰로스(Schleicher와 Schuell) 필터로부터 얻었으며 인디안 잉크속을 묻힌 바늘을 한천속으로 찌름에 의해 방위표시를 만들었다. 마스터(master) 플레이트는 필요할 때까지 4℃에서 보관하였으며 복제 필터는 10㎍/ml의 테트라사이클린-HC1을 포함하는 신선한 LB 한천 플레이트 위에서 8시간동안 배양하였다. 그들을 50㎍/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트로 옮기고 재조합 플라스미드 세포마다 복제 숫자가 증가하도록 밤새 배양하였다(Clewell, D.B(1972) J. Bacteriol. 110; 667-676; Hanahan, D.와 Meselson, M. (1980), Gene 10; 63-67). 필터는 Grunstein, M. 과 Hogness, D. S.의 변형된 방법을 이용하여 처리하였다 (1975; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965). 필터는 세포의 용해 및 단일 스트랜드 DNA의 형성을 촉진시키기 위해 15분간 0.5M NaOH/1.5M NaC1에서 포화시킨 Whatman 3MM 여과지에 놓은 후, 이어서 1.5M NaC1/0.5M Tris-HC1 pH 7.5에서 포화된 여과지의 두번 교환으로 15분간 중화시켰다. 그것들을 공기건조하였으여 흡인여과기에 놓고 흡인시키기 전에 CHC1₃20ml로 포화시켰다. 필터를 진공 오븐 속에서 80℃로 2시간 동안 구웠다.

b. 계획

인히빈 cDNA 유전자 또는 그의 일부를 포함하는 클론을 확인하기 위해 방사능으로 표지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드(올릭뉴클레오티드) 프로브를 사용하였다. 그들은 43 kD와 15kD 소단위의 NH₂-말단의 아미노산 서열을 암호화한 mRNA 암호의 일부에 상보적이도록 고안되었다.(제3도, 프로브 1과 5). 43kD와 15kD 소단위의 NH₂-말단 서열은 본래의 58 kD 인히빈의 아미노산 서열 결정으로부터 기원되었고 그의 분리된 소단위의 및 첫 16 아미노산의 각각은 국제 특허 출원 PCT/AU 85/00119에 제시되어 있다. 이어서, 본래의 58 kD 인히빈의 아미노산 서열로부터 43 kD 소단위의 아미노산 서열을(pBTA22와 pBTA23의 cDNA 서열화로 결정됨, 실시예 6A참조) 뺌으로써 표1에 나타낸 15 kD 소단위의 본래의 분석을 정확히하고 확대하는 것이 가능하였다. 이 정제는 올리고뉴클레오티드 프로브를 만들기에 유용한 다른 분야를 지적하며, 프로브는 아미노산 20 내지 24를 포함하였다. 제3도는 만들어진 올리고뉴클레오티드 프로브(프로브 2)를 보여준다. 그것은 24 부분이 있는 축퇴된 14량체로써, pBTA293과 pBTA294를 분리시키는데 사용하였다. 각 아미노산(메티오닌과 트립토판을 제외하고)은 그것을 특정짖는 하나 이상의 DNA 코돈을 가지고 있으므로, 프로브 내에 모든 가능한 코돈의 조합을 통합시키는 것이 바람직하다. 따라서 인히빈의 큰 소단위를 위하여 선택된 대부분의 아미노산 서열을 암호화한 가능한 64 DNA 서열(제3도의 프로브 1)과, 인히빈의 작은 소단위를 위하여 선택된 대부분의 아미노산 서열을 암호화한 가능한 64DNA 서열(제3도의 프로브 1)과, 인히보 1의 작은 소단위로 위하여 선택된 대부분의 아미노산 서열을 양호화한 가능한 24 DNA 서열 (제3도의 프로브 2)이 있다. 이들 서열 각각의 대표적인 분자를 얻기위한 가능성을 최대로 하기 위하여 프로브 1은 5' 후미로부터 2와 6 위치에 dG와 dA, dT와 dA 또는 dG와 dG 또는 dT와 dG중 어느 것을 갖는 4개의 독립된 합성으로부터 모았다. 프로브 2는 하나의 배치(batch)로 합성하였다.

c. 올리고뉴클레오티드 합성과 정제

올리고뉴클레오티드 프로브는 자동 DNA 합성기 (Applied Biosystems Inc., Model 380A)를 이용하여 합성하였다. 그 기계는 본래 Matteucci, M. D.와 Caruthers, M. H. (1981)[J. Amer. Chem. soc. 103, 3185-3191]에 의해 개발된 방법에 따라 N, N-디이소프로필 포스포라미다이트 데옥시리보뉴클레오티드 유도체를 유도되고 조절된 소공 유리 지지체에 연속적으로 결합시키도록 계획된 것이다.

Applied Biosystems Inc. 가 제시한 방법을 이용하였다. 축퇴된 올리고뉴클레오티드는 유도된 단일 염기를 포스포라미다이를 데옥시지보뉴클레오티드를 치환하여 만들었다. 올리고뉴클레오티드는 20％(w/v) 아크릴아미드/1.0％(w/v) N, N-비스 아크릴아미드/EDTA 1ml/50 mM Tris(고체붕산을 사용하여 pH 8.3으로 조절)를 포함하는 겔(20㎝×20㎝×1.5㎜)에서 예비 전기이동에 의해 미리 종결된 올리고뉴클레오티드 부터 정제하였다. 전기이동은 500V 에서 1.5시간 동안 하며, 그후 올리고뉴클레오티드는 UV 광하에 검사하기 위해 Kieselgel F 254(Merck) 박층 크로마토그래피 플레이트 위에 겔을 놓음으로써 가시화하였다. 올리고뉴클레오티드는 검은 밴드로 나타난다. 그것들을 잘라내어 멸균수 0.8ml에서 밤새 겔로부터 용출시켰다. 용출된 올리고뉴클레오티드의 농도는 1㎝ 광로를 사용하여 260㎚에서 측정한 결과 A₂₆₀은 1.0이였으며, ml당 단일 스트랜드 DNA 35㎍으로 추정하였다.

d. 5' 말단 표지 반응

³²P-표지된 인산기를 정제된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 가하여 방사능을 지니도록 만들었다. 구체적으로, 올리고뉴클레오티드 40p몰과 γ-₃₂P ATP 40p몰 (200 Ci/m몰 ; 5μCi/μl )을 냉동건조시킨후 T₄폴리뉴클레오티드키나제/10mM MgC1₂/10mM DTT/1mM 스페르미딘 /50mM Tris-HC1 pH 7.5를 포함하는 20μl 완충액에 재용해하여 37℃로 90분간 배양하였다.

방사성 올리고뉴클레오티드를 위에 서술한 바와 같이 정제하고 후지 RX X-선 필름에서 5분간 방사성 자동 사진법에 의해 가시화하였다. 멸균수 0.8ml에서 밤새 용출시켰다. 함께 프로브 1(실시예 1b 참조)을 구성하는 4개의 올리고뉴클레오티드 풀의 각각은 이 단계까지 각각 독립적으로 처리하고 그후 합하였다.

[표 1]

58 kD 인히빈을 환원시키고, 알킬화시켰으며, SDS-PAGE 겔로부터 전기용출에 의해 독립된 소단위를 분리하였다. 58kD 인히빈(80 pmol), A 소단위(17 pmol) 및 B 소단위(6 pmol)를 기체상 시쿼네이터(sequenator)에서 Edman 분해를 시켰다.

(Xaa)-cDNA 서열로부터 결정한 아미노산.

Xaa*=58 kD 인히빈의 이중 서열로부터 A 소단위 서열을 빼고 확인한 아미노산.

올리고뉴클레오티드 프로브의 디자인에 이용한 부분은 밑줄친 곳이다.

e. 라이브러리 스크리닝에 있어서 프로브의 사용

방사성 프로브 각 세트는 5×SSC/10×Denhart 용액 40ml(20×SSC는 3M Nacl/0.3M 트리소디움 시트레이트 ph 7.0이고/50×Denhart 용액은 1％(w/v) Ficoll/1％(w/v) 폴리비닐피롤리돈/1％(w/v)소의 혈청 알부민)에 넣고 라이브러리를 나타내는 각각의 필터를 용액속에 담그어 밤새 서서히 교반하였다. 실온에서 1×SSC/0.1％ SDS(도데실 황산 나트륨)을 여러번 교대하여 필터를 세척하고, 후지 RX X-선 필름과 Dipont Cronex Hi Plus 증강 스크린을 사용하여 -70℃에서 3-5시간 동안 방사성 자동 사진법을 수행하였다. 필름을 현상하고, 필터를 다시 37℃의 1×SSC/0.1％ SDS에서 세척하여 밤새 방사성 자동 사진법을 수행하였다.

실온에서 세척한후 기본 바탕보다 더 강한 부분 또는 37°에서의 세척후 여전히 가식적인 부분, 및 마스터플레이트 위의 콜로니 위치에 대응하는 부분을 잠재적인 인히빈 클론으로 간주하였다.

앞의 실시예에는 인히빈이나 인히빈-유사 DNA 서열을 포함하는 세포를 얻을 수 있는 일부 수단 및 방법이 기재되어 있으나 선택적인 수단 또는 계획을 배제하는 것을 의미하지는 않는다. 예를 들면, 놈식 DNA를 출발 DNA로 사용하여 cDNA 합성의 필요성을 배제하는 것이 가능하다(실시예 8참조). 또한 클로닝 벡터는 클론된 DNA 단편의 발현이 달성되는 것일 수 있으며 스크리닝 방법은 항인히빈 항혈청의 이용 또는 인히빈이나 인히빈-유사 생물학적 활성의 직접적인 검출에 근거하고 있다(실시예 10참조). 그와 같은 방법은 당업자에게 잘 공지되어있다.

[실시예 5]

추정 클론의 특성화

a. 잠재적 인히빈 클론의 정제

방사성 자동사진 위의 검은 반점에 해당되는 부분을 골라서 10㎍/ml의 테트라사이클린-HC1을 포함하는 LB 플레이트에 하나의 콜로니를 스트리킹(streaking)하여 37℃에서 16시간동안 배양하였다. 이들 플레이트의 복제물은 필요할 때까지 4℃에서 보관하였다.

필터를 테트라사이클린 -HC1이 들어있는 LB 한천 위에서 3-6 시간동안 방치한 후 50㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천에서 16시간 방치하고, 상기와 같이 콜로니를 용해시켜 방사성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 다시 스크리닝하였다. 이들 필터로부터의 방사성 자동사진에서 가장 어두운 반점에 대응하는 단일 군락을 골라서 다시 스트리킹하여 분석하였다.

b. 플라스미드 DNA의 제한 지도작성

모든 추정 인히빈 클론중 최소한 하나의 분리된 것의 플라스미드 DNA 내용물을 추출하고 제한 엔드뉴클레아제 Pst I으로 소화하여 분석하였다. 이 효소는 플라스미드로부터 cDVA 삽입체를 방출시키며 또한 내부의 Pst I 위치에서 cDNA를 절단한다. 플라스미드 DNA 추출은 Birnboim과 Doly(1979; Nucl. Acids Res. 7 : 1513-1523)의 방법에 근거하여 수행하였다. LB 3ml에서 밤새 배양한 세포를 원심분리하고 0.2ml의 용액 완충액(5mM 글루로스/10mM EDTA/0.2％ 리소자임 /25mM Tris-HC1 pH 8.0)에 재현탁시켜, 0℃에서 10분간 배양하였다. 여기에, 알칼리성 SDS(0.2M MaOH/1％(w/v) SDS) 0.4ml를 첨가하고, 0℃에서 10분후에, 3M 아세트산 나트륨 pH 4.8 0.3ml을 가하였다. 0℃에서 15-30분 후에 생성된 흰침전을 원심분리로 제거하였다. 0.7ml의 이소플로필을 첨가하여, -70℃에서 냉각시키고 5분간 15,000×G로 원심분리하여 상징액 0.8ml중의 플라스미드 내용물을 제거하였다. 펠릿을 TE 0.4ml에 재용해시키고, 상기와 같이 pH 7.5의 3M 아세트산나트륨 40μl와 에탄올 0.8ml을 첨가하고, 냉각시킨후 원심분리하여 침전시켰다. 마지막 펠릿을 진공에서 건조시켜 TE 0.2ml에 다시 용해시켰다. 표본(20μl)을 10㎍/ml RNAase A을 포함하는 TA 완충액 최종부피(66mM 아세트산칼륨/10mM 아세트산 마그네슘/0.5mM DTT/BSA 0.1mg/ml/33mM Tris-아세테이트 pH 7.9) 40μl(최종부피)중의 Pst I (Boehringer) 20단위로 60℃에서 30분간 소화한 후 TBE 완충액(2.5mM EDTA/133mM Tris/89mM붕산)중의 폴리아크릴아미드 겔(10％ 아크릴아미드/0.27％ 비스 아크릴아미드)에서 전기이동하였다. Alu I (Boehringer)으로 소화한 pBR322 표본을 크기 표준으로 사용하였다. 최초로 확인된 클론을 표2에 열거하였다.

c. 서열결정 계획

적당한 제한 효소 단편(Pst I, Pvu Ⅱ, Sau 3AI 또는 Sma I 효소들의 하나 이상에 의해 절단된 단편)을 0.5M 아세트산 암모늄 /10mM 아세트산 마그네슘/0.1M EDTA/0.1％ SDS에서 밤새 37℃에서 폴리아크릴아미드 겔로부터 용리하여 에탄올로 침전시키고, TE에 재용해한후, 만능 프라이머(17량체 ; #1211 또는 #1212; New England Biolabs) 또는 cDNA 자체에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 Sanger F. 및 그 동료의 디데옥시 사슬종결 방법(1977 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467)으로 서열을 결정하기 위해 박테리오파지 M13 mp8과 M13 mp9의 복재 형태속으로 서브클로닝하였다.

후자는 겹치는 cDNA종들을 분리시키고, 겹치는 cDNA종들로부터 공지된 서열을 확장하고, 또는 dG/dC 후미로부터 cDNA의 중심으로 서열을 결정하는데 특히 유용하다. 모든 서열결정, 서브클로닝 및 및 발현연구(실시예 10 참조)에 있어서 제한 효소는 TA(실시예 5B)에서 사용하였고, T4 리가제(Boehringer)는 제조자의 지시에 따라 사용하였다.

[표 2a]

[표 2b]

(a) BiotechNology Austrailia pty. Ltd. Culture Collection의 코드번호.

(b) 주어진 크기는 Alu I으로 소화한 pBR322의 표준에 대한 폴리아크릴아미드 겔에서의 전기이동으로부터 추정한 bp이다. 이들 값은 DNA 서열결정에서 얻은 실제 크기와는 조금씩 다르다.

(c) Murray, N. K. 등, (1977), Mol. GEN. Genet. 150; 53-61

(d) Boliver, F. 등., (1977) Gene 2; 95-113

(e)BTA647=대장균 K12, hsdR_K, supE44, supF58, lac Y1, galT22, galK2, trpR55/F' lacl^q, △(lacZ)M15, lacY⁺A⁺, proA⁺B⁺tra⁺

(f) Ruther, U. 및 Muller-Hill, B. (1983) EMBO J. 2; 1791-1794

(g) BTA634= K12△(lac,pro), supE(glnV), thi, lon-1, Zaj : : Tn5/F' proA⁺B⁺, lacI^q, △(lacZ) M15, lacY⁺A⁺, traD36.

(h) pBTA 286은 암호 서열이 프레임속에 남는 것과 같이 lacZ의 암호 서열로부터 2355 염기쌍의 Hpa I-Ava I DNA 단편이 제거된 pUR291의 0 유도체이다.

(i) BTA652=대장균 K12(lac,pro). thi-, supE(glnV)44, hsdR_K17 endA1, gyrA96, relA1/F' proA⁺B⁺, lacI^q, △(lacZ)M15, lacY⁺A⁺traD36.

(j) Viera, J. Messing, J. (1982) Gene18, 259-268.

(k) BTA545=대장균 K12 thi-, △(lac,arg F), U169 △(lon)100, hfl150 : zje/zif : : Tn10, rpsL, hsdR_K/F' lacI^q, △(lacZ)MI5, lacY⁺A⁺, proA⁺b⁺, tra⁺

(l) BTA637=BTA652, lon-1 jaj : : Tn5.

(m) Cepko등(1984) Cell 37, 1053-1062.

[실시예 6]

인히빈 클론

a. A(43kD) 소단위 클론

43kD 소단위의 일부를 암호화한 pBTA22와 pBTA23의 두 플라스미드는 프로브 1(제3도)을 사용하여 최초로 얻었다.

cDNA의 서열 분석은, 특정 올리고뉴클레오티드 프로브가 pBTA22(프로브 3)로부터의 5'-와 pBTA23(프로브 4)로부터 3'를 확장시키는 cDNA를 분리시킬 수 있는 완전한 길이가 아님을 보여주었다. pBTA290은 프로브 3을 사용하여 분리한 반면에 pBTA30과 pBTA295는 프로브 4를 사용하여 분리하였다. Pst I 지도와 플라스미드의 cDNA 삽입체를 서열 결정하는 계획을 제4도에 나타냈고 소단위 A를 암호화한 합성 뉴클레오티드 서열은 제5도에 나타냈다.

이 서열은 pBTA290과 pBTA295 플라스미드의 cDNA내에 전적으로 포함되어 있다. pBTA30의 410bp 단편의 정지 코돈과 dG/dC 꼬리 전에 3'-번역부분의 다음 6염기를 포함한다. 소단위 A의 His1을 암호화한 CAG는 pBTA22, pBTA23과 pBTA290의 5'-Pst I cDNA 단편에 존재하나 pBTA30의 240 또는 300 염기쌍 Pst I cDNA 단편의 어디에도 존재하지 않는다.

이들 두 단편은 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 또는 다른 클론과 공통인 서열을 포함하지 않으며 스프라이싱되지 않은 인트론(unspliced intron)의 일부를 나타낼 것이다.

cDNA 서열은 염기 1 내지 1140의 오픈 리딩 프레임을 포함한다.

이 리딩 프레임에서, 첫 ATG는 염기 61(Met-60)에 존재하며 Met-60에 이어지는 아미노산 서열은 신호 펩티드의 표시이나 대부분의 신호 펩티드와는 대조적으로 소수성 루신의 줄앞에 아르기닌 또는 리신이 없다(Watson, M.E.E.(1984) Nucl. Ac. 12, 5154-5164).

이 신호 펩티드는 His-1을 선행하는 다소의 40 아미노산의 프로펩티드(pro-peptide)를 남기는 Gly-44와 Gly-41 사이에서 끝날 것으로 예상된다. 그러므로 인히빈의 소단위 A가 Met-60부터 Ile300까지 해당하는 38,810달톤의 프리-프로단백질로서 최초로 합성된다.

소단위 A는 전구체 단백질의 단백질 가수분해 과정에 대한 공통 신호인 쌍을 이룬 아르기닌 잔기 (-2, -1)에서의 절단에 의해 그의 전구체로부터 유도된다 (Steiner, D.F.등(1980) Ann: N. Y. Acad. Sci. 343, 1-16).

소단위 A 프로단백질 -6, -5, 8, 9와 165,166 위치에서 아르기닌 잔기의 다른 세쌍을 포함한다. 165,166 잔기에서 소단위 A의 절단은 여기에 명시된 A_N및 A_C와 유사한 크기의 두 단편을 형성한다. A_N단편은 31kDa 소히빈의 20-kDa 소단위를 구성한다(실시예 9 참조). 소단위 A는 11 시스테인 잔기를 지니며, 그중 Hisl로부터 Arg 166까지는 A_N단편속에 존재한다. 이 4잔기는 A_C소단위로부터 A_N단편의 제거에 따라 내부적으로 결합할 것으로 예상된다. 소단위 A_C는 7 시스테인을 포함하며 이들중 최소한 하나는 소단위 B와 디설피드(disulphide) 결합을 이룰 것으로 예상된다.

소단위 A는 인식서열은 ASn-X-Ser/Thr에 기초한 Asn80과 Asn202에 두개의 잠재적인 N-클리코실화부위를 가지며(Wagh, P. V. Bahl. O. P. (1981) CRC Crit, Rev. Biochem. 10, 307-377), Asn202는 소단위 A_C에 포함한다.

소단위 A와 A_C의 단백질 사슬의 예상한 분자량은 천연 인히빈(각 43-kD와 20-kD)을 SDS-PAGE에 의해 추정한 값보다 약 25％가 작은 32,298과 14,624였다. 이것은 그들의 분자량 및 몰부피를 모두 변화시킬 수 있는 천연분자의 탄수화물 함량에 일부 기인할 수 있다. 이들 차이로부터, A_N와 A_C두 부분은 아마도 Asn 80과 Asn 202에서 글리코시드화할 것으로 예상되며, 세린 및 트레오닌 잔기의 0-결합 글리코실레이션이 포함되는지는 알려지지 않았다. 당단백질 호르몬인 소의 LH 인간의 CG와 PMSG의 탄수화물 함량은 16중량％, 29-31중량％ 및 45중량％로 측정되며(Pierce J. G.와 Parsons, T. F. (1981) Ann. Rev. Biochem. 50 ; 465-495) 따라서 표면적인 분자량에 근거한 약 25％인 본 발명자들의 값은 이 범위의 하한을 나타낼 것이다.

cDNA 서열로 42염기의 mRNA에 존재하는 3'-비번역 부분을 예측할 수 있다. 이것은 폴리(A) 꼬리앞에 전형적인 폴리아데닐화 신호(AATAAA) 16염기를 포함한다 (Nevins, J.R.(1983) Ann. Rev. Biochem. 52, 441-466).

3'-비번역 부분은 코딩 서열(66.3％ G+C) 및 5'-비번역 부분(71.6％ G+C)와 비교할때 A+T가 풍부하다 (40.4％ G+C).

b. 소단위 B(15kD) 클론

다섯개의 독립적인 클론을 프로브 2로 검출하고 두개의 표본 pBTA 293과 pBTA 294로부터 완성된 소단위 B를 암호화한 cDNA를 제4도에 나타냈다.

다른 세개의 클론이 pBTA 293과 유사한 제한 패턴을 지니나 5'-Pst I 단편보다 짧은 cDNA를 포함하였다.

소단위 B cDNA(제6도)의 뉴클레오티드 서열은 pBTA293과 pBTA294 서열로부터 처음으로 유도되고 프로브 6(제3b도)을 이용하여 pBTA306과 pBTA307에 있는 중첩 cDNA(제19도)를 얻었다. 소단위 B는 425개의 아미노산의 프리단백질(제20도)로서 합성되며 소단위 A_C와 같이 그것은 각각의 프로단백질의 C-말단이다. 그것은 연속적으로 아르기닌 잔기 5에 의해 프로부분(pro-section) 부터 분리된다. 그것은 13,14와 102,103 위치에 리신 잔기 두 쌍을 포함하지만 그것은 프로세싱 부위는 아닌것 같다(Steiner, D.F.등(1980) 상기 참조). 거기엔 아홉개의 시스테인 잔기가 있고 홀수는 최소한 하나가 소단위 A_C와 교차결합하는데 유용함을 의미한다. cDNA 서열로부터 소단위 B의 단백질 사슬이 천연 소단위 B의 SDS-PAGE로부터 측정한 표면상 분자량 14,900에 가까운 12,977 달톤의 분자량을 갖는다. 완성된 소단위 B에는 명백한 N-글리코실화 서열은 없으나 프로단백질의 Asn-145는 글리코실화 될 수 있다. 신호 펩티드의 길이는 확실히는 알려져 있지 않지만 Gly-282는 신호 펩티드의 마지막 아미노산일 것이다.

이러한 펩티드의 생리학적 활성에 대한 잠재력을 나타내는 프로단백질내에 잠재적인, 단백질 분해에 의한 절단 부위가 다수 있다. 소단위 B의 3'-비번역 부분은 94 뉴클레오티드 길이이고 소단위 A를 암호화한 cDNA에 있어서와 같이 AATAAA 폴리아데닐레화 신호는 없다. 폴리(A) 꼬리앞의 3'-비번역 부분의 마지막 12 염기는 또한 AATAAA 서열을 갖지 않는 적혈구 단백질의 3'-비번역 cDNA(ACTGAAAC_CACC) 마지막 12 염기에 가깝게 짝을 이룬다(Jacobs, K. 등(1985) Nature 313, 806-810).

5'-비번역 지역의 G+C 함량은 50％이고 프리프로 소단위 B 코딩 부분의 G+C 함량은 56.8％이고 3'-비번역 부분의 함량은 소단위 A코딩 서열과 3'-비번역 부분에서 관찰되는 차이와 대조할때 유사하다 (55.3％).

[실시예 7]

게놈 DNA에 있어서 소 인히빈-유사 서열의 확인

소 인히빈의 큰 소단위(43kD) 및 작은 소단위(15kD)를 암호화한 유전자와 같거나 유사한 서열이 인간, 양, 돼지, 어류, 및 닭의 게놈 DNA에 있는 것이 확인되었다.

이것은 표준 서던 블로트(Southern Blot) 혼성화 기술(Maniatis T. 등(1982), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour)에 의해 본질적으로 달성된다.

근본적으로, 게놈 DNA는 제한 효소로 소화되고 얻어진 단편들은 한천 겔에서 전기이동에 의해 크기에 따라 분리된다. DNA는 함께 면밀히 조사되는 니트로셀룰로스 또는 다른 막에 절단된 후 43kD 또는 15kD 소 인히빈 소단위의 실제적인 부분을 암호화한 [³²P]-표지 cDNA로 엄밀히 분석된다.

이것을 통해 뉴클레오티드 서열과 유사하거나 동일한 게놈 DNA 단편을 검출할 수 있다. 구체적으로, 게놈 DNA는 인간 마크로파지 세포주 U937(ATCC CRL 1539) 또는 인간의 혈액, 돼지의 혈액 및 닭의 혈액 또는 소와 양의 연조직으로부터 제조하였다. Maniatis T. 등(상기 참조)에 서술된 바와 같이 연조직 및 인체 세포주로부터 얻었다.

혈액으로부터 DNA는 다음과 같이 제조하였다:

혈액 10-15ml를 (+0.625％ 시트르산염) 찬 10mM EDTA/pH 7.5의 10mM TriS-HC1, (TE 10-10)으로 희석하고, 얼음위에 5분간 놓아 혈액 세포를 용해시켰다. 4000×g로 5분간 원심분리한 후에 펠릿을 찬 TE 10-10 10ml에 재현탁하고, TE 10-10 40ml로 희석하여 3000×g로 5분간 원심분리하였다.

펠릿을 pH 7.5의 10mM Tris, 5mM EDTA(시작시 혈액 부피와 같은 부피임)에서 분산시켰다. 10％ SDS를 0.5％까지 첨가하며, 단백질효소 K를 50㎍/ml까지 첨가하고, 그 혼합물을 부드러운 교반하에 밤동안 37℃로 배양하였다.

pH 8.0의 0.1mM Tris-Hcl로 포화되고 0.1％ 8-히드록시퀴놀린을 포함하는 페놀 10ml를 첨가하여 실온에서 5-10분간 천천히 혼합하였다.

CHC1₃; 이소아밀 알코올(24 : 1) 10ml을 첨가하고 5-10분간 혼합한 후, 실온에서 8000×g로 10분간 원심분리하였다. 수성상을 15ml의 CHC1₃: 이소아밀 알코올 2회 이상 재추출하였다. 5M NaC1 1/20 부피와 에탄올 2부피를 실온에서 가하고 혼합하였다. DNA를 파스퇴르 피펫으로 제거하고 30-60초간 공기중에서 건조시킨 후, TE37℃의 4ml에서 3시간 동안 부드러운 교반에 의해 용해시켰다. DNA를 위와 같이 재침전시킨 후 TE 3ml에 재용해시켰다.

이 DNA 표본들(일반적으로 10㎍)을 500단위/ml의 효소를 이용하고 16시간 배양하여 40-50㎍/ml의 농도에서 제조자의 지시에 따라 다양한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하였다. 생성물을 동량의 페놀로 추출하여 단백질을 제거한 후 클로로포름으로 3회 추출하고 에탄올 2.5부피와 함께 0.2M NaC1에서 침전시켰다. DNA 펠릿을 물에 녹이고 TAE 완충제중의 11×14㎝ 1％ 한천 겔 위에서 전기이동(75v/4h)하여 크기별로 분류하였다.

DNA는 1.5M NaC1/0.5M NaOH의 용액에 45분간 겔을 침수시키고 3.0M NaC1/0.5M Tris-HC1 pH7에서 2×45분간 중화시킴에 의해 변성시켰다.

DNA를 모세관 작용으로 니트로셀룰로스 막(Schleicher Schuell)에 이동시킨 후 80℃ 진공에서 두시간 동안 구워서 고정시켰다. 필터를 50％ 포름아미드, 5×SSPE(Maniatis등, 상기문헌참조), 5×Denhardts와 25㎍/ml 음파 파쇄된 청어정자 DNA를 포함한 용액으로 2-4시간 동안 예비 혼성화하였다.

그 혼성화 프로브는 다음과 같다;

a) 790bp Sph I -pBTA23(제5도)의 소단위 A cDNA 유전자로부터 얻은 Sma I 단편.

b) 1109 bp sph I -소의 소단위 B 클론 pBTA293(제4도)으로부터 얻은 EcoR I 단편.

이것은 pBR322의 Pst I 부터 EcoR I 까지 부위의 751bp 단편 뿐만 아니라 염기 위치 361로부터 718까지(제6도) 소단위 B cDNA를 포함한다.

Feinberg, A.P. 및 Vogecstein, B(1984) Anal. Biochem. 137, 266-267의 방법을 이용하여 이들 절편을 전기이동시킨 후에 낮은 겔화 온도의 아가로스 겔로부터 분리하여 α^-32P dATP로 표지하였다.

약 30ng의 DNA를 2×10⁸내지 10⁹분당 카운트(CPM)/DNA ㎍의 특정 활성도로 표지시켜 3 내지 4×10⁶CPM의 프로브를 100℃로 가열한 후 1×Denhardrs/50％ 포름아미드/5×SSPE/1×Denhardts/10％ 덱스트란 설페이트 /25㎍/ml 초음파분쇄 청어 정자 DNA를 포함하는 용액과 혼합하였다.

42℃에서 20시간동안 필터를 혼성화시켰다. 필터를 실온에서 2×SSC, 0.1％ SDS로 헹군 후 50℃에서 2×SSC/0.1％ SDS, 이어서 1×SSC/0.1％ SDS, 이어서 0.2×SSC/0.1％ SDS로 각 30분 동안 세척하였다.

혼성화 조건은 혼성화되는 서열이 전체적으로 소 cDNA 서열과 적어도 70 내지 75％ 유사성을 가지도록 하였다. 후지 RX X-선 필름에 최소한 24시간 노출시킨 후, 공지된 크기의 표지 DNA 절편에 대한 혼성화 단편의 크기를 결정하였다.

소의 A 또는 B 소단위 유전자 프로브에 강하게 혼성화하는 인간, 소, 양, 돼지와 닭의 게놈 DNA의 단편이 근사크기(염소쌍에 있어서)는 다음과 같다.

[표 3]

각 종들로부터의 DNA는 크거나 작은 소의 인히빈 소단위 cDNA 프로브에 혼성화하는 한정된 수(일반적으로 하나이나, Pst I 과 함께 침지함에 있어서는 예외적으로 세개에 달함)의 단편을 소유하고 있는지 시험하였다.

큰 소단위 cDNA로 찾아낸 모든 종에 대해 공통인 약 480bp Pst I 단편이 특징을 나타낸다.

이들 혼성화 단편을 소의 인히빈 유전자와 유사하거나 같은 가축 이외의 종에도 존재하는 것이 입증되었다.

여기에서 선택된 프로브에는 포함되지 않는 인히빈 cDNA 서열이 표 3에 보이는 단편들의 그것보다는 다른 게놈 DNA에 혼성화하는 가능성이 배제되는 것은 아니다.

일련의 각 실험에서, 쥐 난소로부터 얻은 RNA에 존재하는 A 및 B 소단위 전구체 mRNA 종은 소의 소단위 cDNA를 프로브로 사용하여 검출하였다. 이들 mRNA 종은 PMSG로 처리된 쥐의 난소에서 더 다량이 발견되었고, 따라서 진단검사 프로브로서의 인히빈 DNA의 유용성이 입증되었다.

그러므로 소의 A 및 B 인히빈 소단위를 암호화한 cDNA 유전자를 이용하여 다른 종들의 게놈 및 조직에 존재하는 인히빈 분자를 암호화한 DNA 및 RNA를 확인할 수 있다.

이 때문에 그들이 암호화한 인히빈 분자는 소의 인히빈과 동일하며 유사한 방법으로 사용될 수 있다.

[실시예 8]

게놈 DNA로부터 인간 인히빈과 유사한 서열의 분리

소 인히빈의 소단위 A와 B를 암호화한 cDNA와 유사하거나 동일한 인간 DNA 서열을 분리하였다. 이것은 λ 박테리어파지속으로 클론된 DNA의 인간 게놈 라이브러리를 만들고 소의 인히빈의 A 또는 B 소단위를 암호화한 cDNA로부터 제조된 [³²P]-표지 DNA 단편으로 박테리오파지 플라크를 프로브로 검출하여 달성하였다.

양성 플라크의 파지 DNA를 분리하고, 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 인히빈-유사 DNA를 포함하는 단편(실실예 7의 기술 및 프로브를 사용하여 서던 블로트 혼성화로 결정)을 뉴클레오티드 서열 결정용 M13속으로 서브클로닝하였다.

더 구체적으로 인간 게놈 라이브러리는 Maniatis등의 상기 문헌에 서술된 방법에 기초를 둔 박테리오파지 λEMBL3로 제조하거나 또는 유사한 인간 게놈 라이브러리를 λL.47(Loenen, W. A. M.과 Brammar, W. J. 1980, Gene20, 249-259)로 제조하였다.

인간 게놈 DNA(실시예 7에 설명된 바와 같이 준비된)를 Sau3A로 부분 소화하여 약 5-30kbp 길이의 크기를 갖는 DNA를 만들었다.

이것을 TE와 NaC1 1M내에서 Cmix=15％, Cr=31.5, Vm=43.45와 aK=2.174의 구배로 2시간동안 50,000RPM으로 Beckman SW50.1로타 속에서 12.5㎍의 DNA를 이용하는 자당 구배 원심분리(McCarty, K. S. EMD, (1974) Anal. Biochem. 61 165-183)를 하여 크기별로 분리하였다.

약 15-25Kbp의 DNA를 이 구배로부터 모으고, 담체 5㎍의 tRNA를 이용하여 에탄올로 침전시킨 후, EMBL3 λ아암(arm)에 연결시켰다.

EMBL3 DNA(Promega Biotec, Madison WI, USA)를 엔도뉴클레아제 BamH I 과 EcoR I으로 소화하고, 페놀과 클로로포름을 이용하여 단백질을 제거한 후 0-4℃에서 0.3M 아세트산 나트륨의 존재하에 0.6 부피의 이소프로판올로 침전시켰다. 2.4㎍을 10mM Tris-HCL pH 7.5 10mM MgCI ₂, 1 mM ATP, 20mM 디티오트레이톨, T₄DNA 리가제 2단위(Boehringer Mannheim)의 총부피 40μΙ에서 15-25kbp 인간 DNA 1㎍과 혼합하여, 15℃에서 20시간 동안 배양하였다. 95μΙ의 파카진(Packagene)(Promega Biotec)을 첨가하여 22℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 혼합물을 제한 숙주 NM539(Promega Biotec 지침 참조)와 함께 직경 14㎝ 플레이트당 약 50,000 플라크의 밀도가 되도록 프레이팅하였다. 이상의 반응 혼합물로 그와 같은 플레이트를 8개 만들었다.

또한 박테리오파지 L47의 인간 라이브러리를 유사한 플라크 밀도로 NM539와 함께 플레이팅하였다.

인히빈 cDNA 프로브를 이용한 검출에 있어서, 플라크를 니트로셀룰로스 필터에 이동시켜, 위에 서술한 바와 같이(Maiatis 등의 (1982) 상기 문헌 참조) 플레이트 당 두번 복제하였다. 표지된 프로브는 다음과 같았다: 소의 인히빈 소단위 A에 대응하는 서열에 대해서는 790bp Sph I -Sma I 단편을 λ L47라이브러리에 대해 사용하였고, 소단위 A cDNa(표 2참조)를 포함하는 pBTA297로부터의 Bam HI-HindⅢ 단편을 EMBL3 라이브러리에 대하여 사용하였다. 작은 소단위에 대한 프로브는 실시예 7에 설명된 Sph I- Eco R I 단편이었다. 제조, 표지 및 혼성화 조선은 서던 블로트 혼성화에 대한 실시예 7에 서술된 바와 같다. 제 1 플라크 스크린에 있어서, 두 프로브를 하나의 혼성화용액에 포함시켰다.

잠재성 양성 플라크를 순수한 클론이 얻어질때가지 용출하고, 재-플레이팅하고 프로브를 검색하였다. 특히 흥미있는 두 클론은 L47 라이브러리부터 얻어지는 큰 소단위(A)에 혼성화하는 λ A₂및 EMBL3 라이브러리로부터 얻어지는 작은 소단위(B)에 혼성화하는 λ B₁이었다. λ A₂는 거의 11-12kbp의 인간 DNA의 삽입체를 운반하였다. Pst I을 이용한 소화는 것은 많은 단편을 제공하며, 그중 중요한 것은 소의 A유전자(상기와 같이)의 [³²P]-표지된 Shp I -Sma I 단편에 대해 혼성화한 세개였다.

Pvu Ⅱ 소화는 같은 소식자(표 4)에 혼성화하는 두개의 단편을 산출하였다.

[표 4]

1160과 480bp(Pst I 소화)와 800bp 단편(Pvu Ⅱ 소화)는 실시예 7에 나타낸 인간 게놈 DNA의 서던 블로트 분석에서 같은 프로브에 혼성화하는 Pst I 및 Pvu Ⅱ 단편과 크기가 유사하다.

pBTA295로부터 [³²P]-표지된 500bp Pst I 단편을 이용한 동일한 λ A2서던 블로트의 혼성화는 단지 λ A2의 Pst I 소화의 1160pb 단편만을 확인하였다. 그와 같은 형식의 혼성화는 클론된 인간 DNA 단편이 소의 인히빈 DNA와 같거나 유사한 서열을 지닌다는 가정과 일치하다. Pst I을 이용한 λ A2의 소화후에 낮은 겔화 온도의 한천 겔로부터 480, 1160과 2500bp 단편들의 절단, M13으로의 서브클로닝 및 뉴클레오티드 서열(실시예 5c 참조)의 결정을 통해 제 7 도에 나타낸 서열을 얻었다. 275와 276 염기 사이의 1.4-1.5kbp의 인트론의 DNA 서열은 생략하였다. 아미노산 서열로부터 유도된 것과 소의 인히빈 프리프로 소단 위 A로부터 유도된것 사이의 유사성은 그것이 동일한 단백질이라는 것을 보여주며 인간 인히빈 A와 Ac 소단위의 전구체를 나타낸다. 인간 인히빈의 A_N단편은 아미노산 Hisl 내지 Arg 171로, Ac 소단위는 아미노산 Ser 172 내지 Ile 306으로 확인되었다.

λ B1클론은 거의 21-26kbp의 DNA 삽입체를 지녔다. DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Pst I으로 절단하고, 1％ 한천 겔에서 전기이동으로 분리하여 니트로셀룰로스 필터를 이동시켰다. pBTA293(제 4 도)에서 정제한 510bp 인히빈 Pst I 단편([³²P]-표지) 또는 136bp를 이용한 혼성화에 있어서 보다 작은 프로브는 약 1300bp(1100 내지 1350bp 범위) 길이의 DNA단편에 결합한 반면 보다 큰 프로브는 약 800bp 길이의 단편 (740-840bp 범위)에 결합하였다. 800bp 단편의 부분적인 뉴클레오티드 서열은 Pst I 과 함께 λ B1으로 소화한 후, 낮은 겔화 온도 한천 겔에서 약 800bp의 Pst I 단편을 정제하여 M13mp9의 pst 1위치에 클로닝하고 뉴클레오티드 서열 결정으로서 열을 조사하였다. 서열결정을 위해 M13속으로 800bp 단편(Pst I -Sau 3A I ; Sau 3A I -Sau 3A I)의 더 작은 단편들을 서브클로닝하여 얻은 뉴클레오티드 서열을 제8도에 나타냈다.

DNA 서열의 번역으로부터 결정한 아미노산 서열은 DNA가 인히빈의 사슬 B의 전체를 암호화하고 Gly1부터 Ser 116까지의 인간 B사슬은 소위 B사슬과 동일함을 나타낸다. 이러한 λ클론으로부터 결정된 것과 같은 사람의 프리프로 B 소단위의 전체 코딩서열을 제21도에 나타냈다. 이 코딩 서열의 염기 388과 389 사이에는 인트론이 존재한다. 유사한 합성 단편 뿐만아니라 인간 인히빈 DNAλ서열을 지니는 이들 λ 클론의 단편은 인간 인히빈 또는 인히빈과 구조적으로 관련된 폴리펩티드(실시예 10 참조)의 제조를 의한 원핵 또는 진핵 발현 시스템으로 삽입될 수 있다. 게다가, λ클론 자체는 발현을 위해 적합한 진핵 세포주로 트랜스펙션될 수 있다. 아미노산의 광범위한 유사성을 알아보기 위해 프로브로 소위 cDNA를 사용한 다양한 척추동물 종에 있어서 인히빈 소단위 유전자의 검출 실시예 7 및 추후의 인간 인히빈 소단위 유전자의 클로닝 및 서열결정은 다른 척추동물 인히빈이 국제 특허출원 제 PCT/AU85/00119호에 정의된 소의 인히빈 단백질과 동일하지는 않더라도 유사함을 나타낸다. 제5 및 6도를 참조하라.

본 발명자들은 다른 많은 척추동물종으로부터의 여포액 또는 난소 추출물에서 인히빈 활성을 검출했고 (예를 들어 표 5참조), 인체 여포액과 양 여포액으로부터의 본래 인히빈을 실시예 9와 국제 특허출원 제 PCT/AU85/00119호의 방법에 의해 정제했으며, 소의 인히빈과 기능적으로 유사하고 소의 형태와 유사한 소단위 구조체와 함께 51 kD와 31 kD 형태를 가지는 두 종을 발견하였다.

또한 토끼, 소와 인간 인히빈을 정제된 38 kD 소 인히빈에 대응하여 국제 특허출원 제 PCT/AU85/00119호에 서술된 토끼의 항혈청에 의해 중화되었고, 또한 RIA에서 교차반응은 구조적 동일성이 매우 가깝다는 것을 나타냈다(표 5).

그럼에도 불구하고, 본래의 소의 인히빈이 토끼에서 면역 반응을 일으킬 수 있다는 사실은 이 방법으로 토끼의 면역 체계에 의해 이질물로 인식되는 소와 토끼의 인히빈에 차이가 있음을 나타내며, 한 종으로부터의 인히빈은 내인성 인히빈을 인식할 수 있는 다른 항체를 만드는 다른 항원으로 사용될 수 있다.

비록 표 5에 나타낸 모든 항체가 쥐의 뇌하수체 세포 배양균에서 활성을 나타내지만, 토끼에 의해 생산된 항체는 특정 에피토프(epitope) 대한 항혈청의 특이성을 나타내는 양 또는 쥐 인히빈과 교차반응을 하지 않으며, 그것은 뇌하수체 세포수용체와의 상호작용에 대한 구조적 유사성을 실증하는 것이다.

소단위 B는 매우 잘 보존되어 있고 대부분의 종에 있어서 동일한 것으로 추정되므로 내생의 인히빈의 소단위 B와 교차반응을 하는 항체를 만드는 항원으로의 돌연변이체 소단위 B 단백질의 용도는 넓은 응용성을 지니며 많은 종에서 효과적일 것이라는 것이 상기 토의로부터 또한 명백하다. 그와 같은 항원은 실시예 10에 서술된 바와 같이 생체외 돌연변이유발등의 기법 및 새로운 유전자의 발현을 통해, 또는 소단위 B 단백질의 화학적 변형 또는 제 6도와 8도에 서술한 것과 같지는 않으나 유사한 소단위 B를 종으로부터 소단위 B 유전자를 분리한 후, 실시예 10에 서술된 바와 같이 그 유전자를 발현시켜 제조할 수 있다.

[표 5]

* 실시예 16a 참조

ND=미결

[실시예 9]

인히빈의 58 kD 및 31 kD 형태사이의 관계

인히빈은 과립막 세포에서 만들어지고 여포액 속에서 방출된다. 거기에서 그것은 초기에 발견한 바와 같이 주로 58 kD 형태로 존재한다(국제 특허출원 제PCT/AU85/00119호). 인히빈의 작은 형태의 증거는 소여포액으로부터 인히빈의 정체의 효율을 증진시키는데 목적을 둔 연구로부터 얻어졌다. Robertson, D. M. 등의 정제방법(1985); Biochem. Biophys. Research Commun. 126,220-226 : 국제특허출원 제PCT/AU85/11009호)을 이용하여 pH 4.75 침전 단계를 초기의 중성과 산성의 완충제 겔 여과 크로마토그래피 단계사이에서 도입하였다. 이것은 산성 겔 여과단계를 이용하여 최초의 것으로부터 분리된 둘째의 생물학적으로 활성인 종을 산출하였다. 이 둘째 종의 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기이동과 역-상 HPLC에 따라 그것은 본래의 58 kD 물질과 유사한 생물학적 활성을 가지고 명백한 분자량 20,000과 15,000의 두 소단위로 구성된 명백한 분자량 31,000의 단백질로 밝혀졌다. 두 인히빈 종의 작은 소단위의 명백한 분자량은 매우 유사하며(거의 15 kD), 이는 두 인히빈 종의 명백한 분자량 차이는 주로 거의 20 kD로 줄여든 43 kD 소단위에서의 변화에 기인함을 시사한다. 게다가, 순수한 58 kD 인히빈은 수송아지 혈청(SS)이나 인간 폐경후 혈청(PMS)을 배양하는 동안 31 kD 형태로 변하게 된다. 이 분리는 bFF와의 유사한 배양에서는 일어나지 않는다(제 9 도). 그러므로, 인히빈의 더 작은 형태와(31 kD), 특히 더 큰 소단위(20 kD)는 국제 특허출원 제 PCT/AU85/00119호(Robertson, D. M. 등(1985); Biochem. Biophys. Res. Commun. 126,220-226)에 기술된 인히빈 58 kD 형태의 직접적인 유도체로 간주될 수 있고, 여기 기술된 소단위 유전자로부터 직접적으로 유도될 수도 있다.

또한, 천연 인히빈이 전혀 없는 혈청(SS와 PMS)은 재조합 인히빈 또는 그 소단위의 생체외 제조에 사용될 수 있고, 관련 효소는 이 반응을 수행하는 세포 유형으로부터 또는 혈청으로부터 정제될 수 있으며, 결과는 동일하다. 이 효소 활동도는 프로테아제 억제제와 관련하여 특정화된다. SS 또는 PMS의 존재하에서 17시간동안 30℃로 요오드화 58 kD 인히빈과 함께 혈청의 배양 후, 58 kD 인히빈의 31 kD 인히빈으로의 전환은 3mM 파라클로로머큐리 벤조산염이나 10mM EDTA의 함유에 의해 24％ 내지 4.5％로 된소된다. 바시트라신과 펩스타틴 A(각 0.3mM)는 효과가 없었다. 프로테아제 억제의 이 형태는 프로세싱(processing) 효소(Lazure, C. 등(1983) Can. J. Biochem. Cell Biol. 61,501-515)의 특징이고 이들 발견과 일치하며, 이 반응에 사용되는 소단위 A(제 5 도)에 있는 Ser 167의 앞에 있는 표준 선행위치 (Arg-Arg)가 있다.

혈청속으로 방출되는 인히빈의 절단은 인히빈의 31 kD 형태와 A_N단편(큰 소단위의 아미노산 1-166)의 두 분자를 만들었다. 31 kD형태는 뇌하수체 세포에 의한 FSH의 합성과 방출을 억제하는 것으로 알려졌고, 또한 하나 또는 두분자 모두 생식선으로 돌아가서 생식선 조절작용을 직접 조절하거나, 또는 인히빈 그 자체, 인히빈의 단편 또는 그의 전구체 분자, 예컨대 A_N은 FSH의 뇌하수체 조절이외의 생물학적 기능을 가지는 것으로 밝혀졌다. 펩티드 1에 의한 토끼 699의 면역화는 FSH 역가를 극적으로 0으로 떨어뜨린다는 사실이 제안되었다.(실시예 15참조).

인히빈의 두 소단위 모두 프리프로 분자로 형성되고 각 소단위의 프로펩티드는 세포의 생장 및 조절을 포함하여 그들 자체의 생물학적 활성을 가질 것이다. 인히빈 그 자체의 31 kD 형태는 형질전환 생장 인자 -β에 아주 유사한데(Derynck, R. 등(1985) Nature 316, 701-705), 이는 뇌하수체 세포에 의해 FSH 합성에 대한 주지된 효과외에 세포 조절의 천연분자에 대한 역할을 시사한다.

[실시예 10]

인히빈 cDNA의 발현

a. 43 kD와 20 kD소단위

클론 BAT405(표 2)가 인히빈의 큰 소단위를 암호화한 cDNA를 포함하다 할지라도, cDNA는 dC 말단이며(실시예 3a 참조) 서열에 리보솜 결합 부위 또는 개시 ATG(f-Met)가 존재하지 않으므로, 인히빈의 어떤 부분이 생성되리라고 기대되지 않는다. 인히빈 유전자의 일부를 발현을 시키기 위해, pBTA23에 있는 cDNA의 가장 큰(약 480bp) Pst I 단편 pUR292의 Pst I 위치에 클로닝하여 융합 펩티드를 만들었다. 올 바른 방향에서, 이것은 인히빈 소단위 43 kD의 아미노산 27 내지 183이 잇따르는 대장균 단백질 β-갈락토시다제 대부분으로 구성되는 단백질을 생산한다. 플라스미드 구조체를 대장균 BTA647(표 2)속으로 형질 전환시켰다. 그와 같은 클론을 확인하기 위하여 면역학적 스크리닝 방법을 이용하였다. 형질전환에 이어서, 형질전환체를 선별하기 위해 세포를 37℃에서 16시간 동안 암피실린 나트륨 50㎍/mΙ를 포함하는 LB한천에 플레이팅하였다. 군락들은 니트로셀룰로스 막(Schleicher와 Schell)으로 복제한 후, 먹 잉크에 적신 바늘을 한천속으로 막을 통과하여 찔러 방향 표지들을 만들었다. 마스터 플레이트는 필요할때까지 4℃에 저장하며, 복제 필터는 암피실린 나트륨 50㎍/mΙ를 포함하는 신선한 LB 한천 플레이트 위에서 세시간동안 배양하였다.37℃에서 2시간동안 0.5mM 이소프로필 B-D-티오칼락토시다제(IPTG)를 포함하는 LB 한천 플레이트 위에서 융합 단백질을 유도하였다. 필터를 0.2M NaOH/1％(W/V) SDS로 포화된 와트만지 3MM에 5분간 놓은 후, pH 7.5인 0.5M Tris-HCΙ로 포화된 종이 위에서 중화시켰다. 클로니로부터 방출된 단백질은 인시투에서 니트로셀룰로스에 결합한다. 니트로셀룰로오스에 잔존하는 모든 단백질 결합부위는 1시간 동안 Tween 20(0.5％(V/V)을 추가로 포함하는 TST(150mM NaCℓ /0.05％(V/V) Tween 20(Sigma)/10mM Tris-CHℓ pH 8.0)에서 부드러운 교반에 의한 필터의 침잠에 의해 봉쇄되었다. 필터를 TST에서 1 : 50으로 희석된, 토끼 항 -소-58 kD인히빈 항혈청(국제 특허출원 제PCT/AU85/00119호)을 포함하는 용액으로 실온에서 밤동안 처리한후 잔존 항체를 제거하기 위해 TST에서 여러번 세척하였다. 필터를 돼지 항-토끼 면역글로불린-서양고추냉이 과산화효소 접합체(Dakopatts)의 TST에서 1 : 200희석액으로 실온에서 1시간 동안 처리하고, TST로 세척하였다. 최종적으로, 그것들을 pH 7.5의 20mM Tris-CHℓ에서 세척하고, 0.5mg/mℓ 4-클로로나트톨 /0.03％(V/V) H₂O₂/20mM Tris-CHℓ pH 7.5를 포함하는 용액으로 착색시켰다.

융합 펩티드를 포함하는 클로니를 대조표준 균주 BTA647(pUR292)이 생장한 부분보다 더 강하게 착색이된 필터부분에서 확인하였다. 다른 콜로니의 다소의 기본 착색은 유도된 대장균 BTA647(pUR292)의론(lawn)이 성장하고 용해된 필터와 함께 희석된 항혈청을 예비 배양하여 토끼 항-인히빈 항혈청의 항-대장균 항체 역가를 감소시키는 시도에도 불구하고 가시화되었다.

세개의 그와 같은 콜로니를 정제하고, 그들의 플라스미드 내용물을 분석하였다. 모두 예기한 올바른 방향의 cDNA 단편을 지닌 pUR292를 포함하였으며 이들 균주 가운데 하나를 BTA 410으로, 플라스미드를 pBTA28(표 2)로 명시하였다. 융합 펩티드의 확인은 웨스턴 블로팅(Western blotting) 방법(Towbinn, H., 등(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4350-4354)으로 분석하였다. 이 경우 단백질을 도데실황산나트륨으로 변성시키고 폴리아크릴아미드 겔 전기이동에 의해 크기별로 분리한후 니트로셀룰로스로 이동시켰다. 이어서 니트로셀룰로스는 인히빈 항원 결정기를 포함하는 단백질 밴드를 결정하기 위해 상기과 같이 처리하였다. 그 단백질 표본은 다음과 같이 제조하였다. LB속에서 37℃로 밤동안 배양된 BTA647(pUR292) 및 BTA410의 배양균을 신선한 배지에서 1 : 100으로 희석하여 A₆₀₀0.4의 혼탁도가 얻어질때까지 배양하고, 0.5mM IPTG를 넣은 후, 2시간동안 배양하고 수거하였다. 세포 팰릿은 적재 완충제 0.1 부피에 직접적으로 재현탁하고 (30％(W/V)자당 1％(W/V)SDS/0.1M B-머캡토에탄올/0.1％브로모페놀 블루를 함유하는 전기이동 완충제), 끓는 물 수조에서 5분간 가열하였다. 표본(10-30㎕)을 폴리아크릴아미드 겔에 적용하고(Laemmli, U.K.(1970) Nature. 227,680-685 ; Mattick, J. S. 등, (1980) Eur. J. Biochem. 114, 643-651), 브로모페놀블루 염료가 겔의 바닥에 닿을 때까지 전기이동을 수행하였다. 측면 이동은 15.6mM Tris 염기/120mM 글리신에서 1시간동안 lamp로 Hoeffer Transblot 기구로 수행하였다.

항혈청이 있는 필터의 봉쇄와 처리를 위에 기술한 바와 같았다. 폴리아크릴아미드 겔내의 단백질의 직접적인 가시화를 위해, 게을 탈색용액(10％(V/V)메탄올 /5％(V/V)빙초산)에 30분간 침수시키고, 같은 용액에서 만들어진 0.5％(W/V) Coomassie Brillant Blue R250으로 1시간동안 착색시킨다. 겔을 탈색용액의 여러 차례 교환의 부드러운 교반에 의해 탈색하여, 단백질로 밴드를 웨스턴 블러팅 및 면역분석으로 발견한 것과 비교하였다. 균주 BTA410은 IPTG에 의해 유도된 전체세포 단백질의 5-10％를 나타낼 수 있는 최소한 두 단백질을 포함하는 것으로 나타났고, 항-인히빈 항혈청(제13도, 10열)으로 분석되었으며, 균주 BTA647(pUR292)(제13도, 11열)에는 존재하지 않는 것으로 나타났다. 그들은 천연 β-갈락토시다제(116kd)보다 크며(거의 130과 117kd), 따라서 β-갈락토시다제-인히빈 융합 단백질을 나타낸다. 융합 단백질 중 가장 큰 DNA분석으로부터 측정되는 것과 비교될 수 있다 (거의 132 kD).

비슷한 방법을 이용하여, pBTA30의 410bp Pst I 단편을 pUR291 에서 발현시켰다. 얻어진 플라스미드는 pBTA292(표 2)로 명시하고 다시 항인히빈 항혈청을 사용하여 융합단백질을 찾아냈다(제13도 9열). 완전한 소단위의 발현을 달성하기 위하여, pBTA290과 pBTA30의 cDNA를 이었고 이용된 계획을 제10도에 나타냈다. 간단하게 그것은 각 클론으로부터 Sau 3A I 단편들의 정제를 포함하며, 유일한 Rsa I 위치에서 그들을 분리시킨 후 다시 이었다. 리겐이션(ligation) 산출물의 혼합물은 Sau 3A I으로 절단하여 생성물을 pUR290에 연결시켰다. 클론을 프로브 3 및 4(제 3 도)로 스크리닝하여 pBTA290의 5'-Sau 3A I-Rsa I 단편과 pBTA 30의 3'-Rsa I-Sau 3A I 단편을 포함하는 클론을 확인하였다. pUR290이 Asp-10부터 Ile 300까지의 올바른 리딩 프레임을 제공하므로, 삽입체가 올바른 방향으로 있을때 β-갈락토시다제-인히빈 융합 단백질의 산출물은 확립된다. 480과 410bp Pst I 부분의 올바른 발현은 pBTA28과 pBTA292융합 생성물을 포함하는 컬럼으로부터 분리된 특정 항체를 사용하여 독립적으로 확인할 수 있다(실시예 9 참조). 얻어진 플라스미드를 pBTA296(표 2)이라고 명명하였다. 이 완전한 소단위 A 유전자는 Sau 3A I-Sau 3A I 단편으로서 pUC7의 Bam HI 위치로 클로닝 되었으며 얻어진 플라스미드(pBTA302 : 제12도)를 BTA 652에 전달시켜 BTA426(ATCC 67075)을 만들었다. Sau 3A I 위치의 Asp Pro서열은 단백질 상부로부터 융합 단백질의 인히빈 부분을 분리하기 위해 사용될 수 있는데, 왜냐하면, 이 서열은 포름산에서는 불안정하기 때문이다(Nilsson, B, 등(1985)Nucl. Ac. Res. 13,115-1162).

BTA419로부터의 β-갈락토시다제(아미노산 Asp-10 내지 Ile 300)에 결합된 43 kD 소단위의 전체 길이의 발현을 제13도로, 8열에 나타냈다. β-갈락토시다제-인히빈 단백질의 전체길이에 더하여, 산출물 전체 길이의 단백질 분해석 분리 도는 전사나 번역의 미숙한 종결을 나타내는 천연 β-갈락토시다제의 분자량에 거의 근접한 더 작은 크기인 최소한 세개의 다른 밴드가 있다. 결합 단백질의 덩어리는 가용성이다. 인히빈 DNA와 옆에 위치한 β-갈락토시다제 DNA는 Eco R I 제한 단편으로서 pBTA296을 절단하여 얻었고, pTBA297(표 2)을 생산하기 위해 pBTA286(표2 ; 제13도 4열) ; 속으로 삽입하고 pBTA286으로부터 짧아진 β-갈락토시다제 단백질의 C-말단에 위치한 인히빈 DNA를 발현하는 클론은 위에 서술한 바와 같이 콜로니 먼역혼성화 (immunohybridisation)로 선별하였다. 위상차 현미경 하에서 그러한 클론의 검사(즉, BTA420; 표2)는 세포 안에서 단백질분해의 파괴로부터 어느정도 보호하고 항원제조에 대한 정제를 매우 단순화 시키는, 봉입체라 명명된 불용성 산출물로서 융합단백질을 생산하는 것을 나타냈다(실시예 12와 13). 균주 BTA420은 ATCC67054로 명시되며, BTA420의 정제한 봉입체로부터의 단백질은 제13도 3열에 나타나 있다. BTA426내의 소단위 A의 발현은 제13도 14열에 나타나 있고, 다시 이 단백질은 봉입체로서 현저하게 생산된다. BTA420 내의 융합 단백질과 대비하여 BTA426 내의 가장 긴 융합 단백질은 가장 풍부하며 웨스턴 블로트 분석에 있어서 가장 반응성이 큰데 이는 인히빈과 같은 단백질의 제조에 있어서 우수한 숙주-벡터 조합체임을 가리킨다.

위의 서술에서 다른 제한 효소의 위치는 소단위 A의 발현에 있어서 유용할 수 있음이 명백하다. 우선적인 것은 His I에 대한 코돈을 지니는 유일한 Sph I 위치이며, 올리고뉴클레오티드 링커(linker)는 다양한 숙주와 벡터에 있어서 융합 단백질로서, 또는 새로운 f-Met 코돈이 His 1을 암호화한 CAG 바로앞에 도입되거나 또는 신호 펩티드가 His 1의 앞에 제공된 융합-독립 단백질로서 A_N단편 또는 A 소단의 발현을 허용하기 위해 고안될 수도 있다. 그러한 제조는 당업계의 숙련된자들에게 잘 공지되어 있으며 그 실시예가 제11도에 나타나있다.

이 발현 링커는 Cla I 부위를 이용하여 ptrpL1(Edaman, J. C.등(1981) Nature 291,503-506) 등의 trp 프리미스에 삽입되어 새로운 N-말단 메티오닌을 통해 43 kD 단백질 또는 A_N단편으로, Bam HI 위치를 이용하여 pUC7, pUC13 또는 pUR290에 삽입되어 β-갈락토시다제-인히빈 융합 단백질로, 및 pWT121(Tacon, W. 등(1980) Molec. Gen. Genet, 177,427-438)에 삽입되어 trp E-인히빈 결합 단백질로 발현되도록 만들어진다.

A_N단편을 발현하는 클론의 생산에 사용되는 방법은 제17도에 나타나 있다. 요약하면, pBTA297을 BAm HI과 sph I 으로 절단하고 제11ai도에 기재한 링커를 삽입하였다. 전체 A소단위 유전자를 Sau 3A I 단편으로 분리하고 제16도에 나타낸 것처럼 Hae II에 의해 부분적으로 소화되도록 하였다. 직렬 넌센스 코돈을 포함한 정지 링커를 Hae II위치에 삽입하고, 반응 생성물을 BamH I으로 절단하여 단편들을 pUC13에 삽입하였다.

재조합 플라스미드를 아미노산 128-130을 암호화한 Hae II 위치에 미치는 올리고뉴클레오티드 프로브 TCCTGGCGCTCCTGC를 사용하여 스크리닝하여 작은 Hae II 단편이 올바른 방향으로 존재함을 확인하였다. 양성클론을 수입하여 정제하고 그것들의 동일성을 확인하기 위해 그것들의 삽입체를 서열화하였다. 그러한 2개의 클론으로부터, 직각은 하나의 정확한 기원이 미확인된 또하나의 삽입물을 함유하였다. 정확한 삽입체를 정제하고 pUC13으로 재클로닝하고 대장균으로 전달하여 초기 발현을 위한 BTA1365(=BTA652 pBTA309)를 얻었다(제22도). 이 분자의 각각의 단부에 3개의 제한 위치가 있기 때문에 상기한 것처럼 다른 벡터로 서브클로닝할 수 있다.

BTA1365가 생산하는 재조합 단백질은 봉입체로 형성되고 외견 분자량이 23.5 kD 이고 BTA426과 BTA427로부터의 융합 단백질(제13도)과 유사하고 가장 큰 밴드는 혈청 474를 사용한 웨스턴 블로트 분석에서 가장 풍부하고 가시적이다. 프리 프로 소단위 A 유전자 전체 길이의 재구성에 사용되는 방법이 제14도에 나타나 있다. 근본적으로, 그것은 pBTA295로부터의 PvU II-Pvu II 단편의 분리와 첫 Pvu II 부위의 5'에 위치한 신호 펩티드(Met-60 내지 Gln-57)의 첫 4아미노산을 재구성하며 5'말단에 Bam HI 부위를 제공하는 제11 Aii도에 나타낸 링커(포스파타제를 처리하지 않음)의 첨가를 포함한다. 링커로 연결된 분자는 Sph I으로 절단되며, Bam HI 과 Sph I으로 절단된 pBTA297에 연결되어, pBTA305를 형성한다. 이것은 융합 단백질의 프리 프로 소단위 A의 발현을 중재한다. 인히빈 DNA 서열은 연속적인 조작에 대한 Hind Ⅲ-Hind Ⅲ 단편 또는 Eco R I-Eco R I 단편으로서 제거된다. 특별히, 이 Eco RI-Eco R I 단편을 pUC9 속으로 서브클로닝하고, 인히빈 cDNA 서열을 Bam H I-Bam H I 단편으로서 제거하여 벡터 pZIP Neo SV(X)1으로 재클론하므로서 (Cepko, C. L. (1984) Cell 37,1053-1062) pBta417을 만들었다.

그러므로 5'Pvu II, Sau 3A I 과 Sph I 부위 모두 43 kD 단백질의 발현에 관한 편리한 링커 부위를 제공한다. 염기 734에서 출발한 Hae II 부위는 아르기닌 165에서 출발한 소단위 A의 Ac 부분의 발현을 위해 편리한 점을 제공한다.

그것은 제11A iii도에 서술된 II부위 링커를 사용하여 pUR290, pBTA286과 pUC13 내에서 β-갈락토시다제 융합 산물을 발현하였다. 이것을 성취하기 위하여 필요한 pBTA30으로부터의 Hae II-Sau 3A I 단편을 정제하고 링커를 첨가하였다. 얻어진 구조체를 Sau 3A I 으로 절단한 후, DNA를 큰 DNA 단편을 첨가시키는데는 효과적이나 링커등의 작은 DNA 단편은 비효율적으로 침전시키는 이소프로판올로 두번 침전시켰다. 침전된 DNA를 TE 내에서 재용해시키고 pUR290에 연결하였다. 플로스미드를 BTA634로 형질전화시켰다. 얻어진 클론을 복제 필터에 복제한후 각 쌍의 한 필터를 [³²P]-표지 Hae II링커(제11A iii도에 나타낸 DNA 쌍의 맨 위 스트랜드)로 다른 것은 프로브 4(제 3 도)로 실시예에 서술된 바와 같이 스크리닝하였다. 두 프로브로 검출한 클론을 골라서, 웨스턴 블로트 분석으로 조사하였다. 그와 같은 클론 하나를 제13도 7열에 나타냈고 BTA421(표 2)로 명명하였다. 인히빈 소단위 Ac와 그의 측면에 있는 β-갈락토시다제 DNA 서열을 암호화한 DNA 단편을 EcO R I 단편으로서 절단하고, 분해로부터 보호하고 정제가 유리한 불용성 융합 단백질로서의 발현을 위하여 pBTA286에 연결하였다. 이 균주를 BTA422로 명명하였다 (ATCC67059, 표 2; 제13도 2열).

Ac 소단위를 암호화한 새로운 Bam II-Sau 3A I 단편을 pBTA298로부터 제거하고, 짧은 융합 단백질을 생산하기 위하여 pUC13속으로 서브클로닝하였다. 균주 BTA427(ATCC67056; 표 2)는 봉입체로서 이 단백질을 생산하고 겔 분석은 BTA426과 함께 그것을 다시 나타내며(제13도 15열), 가장 긴 결합 단백질은 가장 다량이며 웨스턴 블로트 분석에 있어서 가장 가시적인데 이는 BTA427이 인히빈과 같은 단백질의 제조를 위한 우수한 숙주-벡터 조합체임을 나타낸다.

pUC13에 있는 사람의 Ac 소단위 유전자는, 클론 λA2(색션 8)로부터 유도되고 λAc 소단위에 대한 코딩 부위를 함유한 사람의 게놈 DNA의 436p Pvu II-Bam H I 단편을 분리시킴으로서 발현시켰다.

Hga I로 절단한 후 링커

5' GAT CCG GCA TCG ATC ATG TCT A 3'

3' GC CGT AGC TAG TAC AGT TAG GGG G 5'(링커 1)을 가하고 결과의 생성물을 pUC13의 Bam H I 위치로 연결하기 전에 Bam H I으로 절단하였다. 플라미스드 생성물로 대장균 BTA652를 형질전환하시키고 융합 생성물로서 hAc 소단위를 발현하는 클론을 분리하였다. 이 클론은 BTA1367(=BTA652(pBTA472))이고 벡터 융합체의 서열은 제22도에 나타내었다. BTA427로부터의 소의 등가물과 마찬가지로 이 융합 단백질은 웨스턴 블로트에서 항혈청 474로 검출되고 가장 큰 밴드이며 가장 풍부하다.

제11도에 나타낸 링커와 상기 링커 1 각각의 뚜렷한 특징은 DNA가 Bam H I 부위로부터 올바르게 발현될 때, 아미노산 서열 Asp-Pro가 융합 단백질로 삽입된다. 위에 언급하였듯이, 이 서열은 포름산에 불안정하며, 단백질 소단위 A에서 Asp-Pro 서열이 없는 단백질 상부로부터 인히빈 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다 (Nilsson, B. 등(1985) Nucl. Ac. Res. 13; 1151-1162). 융합 단백질로부터 주어진 서열을 분리함에 의해 다른 것을 통합시키는 것이 가능하다. 실시예들은 프로테아제 인식 서열들 예를 들면 인자 Xa 인식 서열(Nagai, K.와 Thogerson, H. C. (1984) Nature 309,180-812) 또는 콜라겐아제 인식 서열(Sermino, J.와 Bastia, (1984) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 81,4692-2696)의 삽입을 포함하며, 짝지은 아르기닌 잔기들을 인지하는 효소를 사용하는 가능성은 위에 언급된 바 있다(실시예 9 참조). 위에서 인히빈 서열의 앞에 메티오닌을 삽입하여 β-갈락토시다제가 없는 인히빈 단편을 얻기위해 시아노겐 브로마이드와 함께 결합 산출물을 분리하는 것이 가능하다. 인히빈 서열내의 메티오닌 잔기는 생체외에서 cDNA의 생체외 돌연변이 유발에 의해 선택적인 아미노산으로 전환되고, 전체길이의 인히빈과 같은 단백질이 융합 단백질로 전구체로부터 자유롭게 되므로 시아노겐 브로마이드 분해기술의 유용성을 증가시킨다. 내부 메티오닌 잔기의 전환은 더 바람직한 항원 특성을 가진 분자와 인히빈과 같은 작용물질 또는 길항제의 특징을 지닌 분자를 만들 것이다.

b. 15 kD 소단위의 발현

pBTA293(제 4 도)의 510bp Pst I cDNA 단편을 pUR291의 Pst I 위치에 연결한 후, 플라스미드로 대자균 BTA634를 형질전환시켰다. 얻어진 클론은 pBTA293과 pBTA294(프로브 2, 제 3 도)를 분리하는데에 최초로 사용된 24배 축퇴 14량체 올리고뉴클레오티드를 사용하여 재조합 플라스미드의 존재에 대하여 스크리닝하였다. 이어서 제한효소 Hind II를 이용하여 여럿의 재조합 플라스미드의 유전지도를 작성하고 폴리아크릴아미드 겔상에서 올바른 위치의 삽입체를 포함하는 플라스미드의 발현에 대하여 분석하였다. 그와 같은 균주 하나를 BTA423으로 명명하였다(표 2).

pBTA293의 510bp Pst I cDNA 단편을 pBTA286의 Pst I 부위에 직접 클로닝하여, 융합 산물로 발현 시키기 위해 BTA634에 형질전환시켰다. pBTA286은 pUR291로부터 유도되며 pST I 부위를 가로지른 리딩 프레임은 이 직접적인 클로닝을 가능케한다. 얻어진 균주는 BTA424로 명명되고(ATCC670058; 표 2)봉입체로서 융합 산물을 생산한다. pBTA293의 510bp Pst I cDNA 단편을 pUC8의 Pst I 부위 속으로 클로닝한 후, 불용성의 짧은 융합 단백질을 발현하는 BTA637속으로 형질전환시켜 균주 BTA1360(ATCC67055; 표 2)을 만들었다.

BTA423 또는 BTA424 또는 BTA1360으로부터의 융합 단백질은 각 A와 Ac 소단위가 융합됨에 불구하고 토끼 항인히빈 항혈청에 의해 어느 것도 검출되지 않았다(제13도, 1, 6 및 16열). 이것은 15 kD 단백질에 대한 항체의 수준이 극히 낮거나 0이고, 인히빈에 대한 면역과 관계있는 생물학적 효과가 A 또는 Ac 소단위만 단독적으로 사용하여 달성할 수 있음을 시사한다(실시예 17-21 참조).

15 kD 서열의 발현은 15 kD 서열 및 아르기닌 -5 내지 -1을 더한 Hae II 단편의 분리 및 제11Aiii도에 서술된 Haae II 위치의 부가에 의해 성취될 수 있다. 위에 서술된 바와 같이 또한 제11B i도에 나타낸 얻어진 융합체의 암호는 Asp-Pro 서열에서 융합체의 포름산 분리에 대한 포텐샬과 함께 Bam HI 부위를 사용하는 pUR290/pUC7/pUC13내에서의 β-갈락토시다제 융합체의 발현에 대해 유용하다. 부가적으로 Cla I 부위는 prtpL1(Edman, J. C. 등 (1981) 상기 문헌 참조) 내에서의 발현에 대해 유용하며, ATG는 새로운 번역 개시위치로 작용한다. 발현에 대한 세번째 가능성은 유일한 Hind II 부위를 사용하는 것과 원하는 링커와 함께 1 내지 8 아미노산을 암호화한 DNA 서열과 제11B ii도에 나타낸 Met-1 서열을 합성하는 것이다.

따라서, Pst I, Hae II와 Hind II 부위는 모두 발현 링커의 부가에 대한 편리한 부위이다. 510bp Pst I 단편의 부분적인 Hae Ⅲ 소화후에, 아미노산 1 및 2에 걸치는 Hae Ⅲ 부위(GGCC)를 사용하는 것이 또한 가능하다. 다시, 발현 체계의 다양화하는 기술상의 숙련된 자들에게 잘 알려져 있으며, A와 Ac 소단위에 대해 위에 서술된 가능성은 소단위 B에도 또한 적용 가능하다. 그들의 기능을 연구하기 위하여 소단위 전구체의 부분들을 인히빈 Ac와 B 소단위 서열과 독립적으로 발현할 수 있음이 또한 명백하다. 예를 들면, A_N단편 DNA는 Sph I Hae II(부분적) 단편으로서 분리할 수 있고, Bam HI 부위에 대한 양쪽 끝을 변화시키기 위하여 제11A i와 11A iii도를 사용하여 pUC7 또는 pUC13을 발현할 수 있다.

더 나아가서 인히빈 단백질 또는 인히빈-유사 단백질 또는 펩티드의 발현은 위에 지적된 실시예들에 제한 될 필요는 없다.

기술상으로 숙련된 자들에게 잘 알려진 진핵세포와 원핵세포에 유용한 많은 다른 발현 체계가 있으며, 그것은 여기에 주어진 서열의 발현에 적합하다.

소와 인간 B 소단위의 아미노산 서열이 동일하므로, 소의 B 소단위를 암호화한 cDNA의 발현에 있어서, 그 산물은 인간 DNA 서열의 동일한 발현으로 얻은 것과 분명히 동일하다. 따라서 BTA423, BTA424와 BTA1360 균주들도 인간 인히빈의 소단위 B를 생산하는 것으로 여겨진다. 프리프로 A 소단위 B와 프로소단위 cDNA 둘다를 사용하는 것에 기초하여 프리프로 B 소단위를 구성하는 것이 제17도에 나타나 있다. 인히빈의 B 소단위는 510bp Pst I 단편으로서 pBTA293으로부터 분리하였다(제 4 도).

Pst I 단편을 HaeII로 절단한후 방출된 365bp HaeII 단편을 HaeII 위치 링커의 존재하에 연결하여 BaMH I 단편으로 변환시켰다(제IIBi도). 결과의 BamH I 단편을 pZipZeo SV(X)1의 BamH I 위치로 연결시키고 대장균으로 형질전환하여 BTA1419(=ED8654 pBTA416)을 얻었다. pZipNeo에서 합성 프리프로 B 유전자를 구성하기 위해 A 소단위의 부분 신호 서열을 pBTA305로부터 160bp BamH I-Sau 3A I 단편으로 분리시켰다. 이것을 하방 BamH I 위치로부터 삭제된 pBTA416의 유도체의 Bam H I 위치로 연결시켜 pBTA418로 지정된 합성 프리프로 B 벡터를 얻었다. 이 구조의 특징은 제18도에 나타내었다. 아미노산 -61로부터 -1까지의 서열에는 신호 펩티드에 단지 한개의 시스테인 잔기가 들어 있다. 따라서 진핵세포에서의 발현시에 B 소단위의 접힘은 정확한 디술파이드의 형성과 함께 일어나고 그의 합성 선구물질로부터 B 소단위를 프로세싱하는 것은 Gly1에 앞선 5개의 아르기닌 잔기에서 일어나리라고 예상된다.

완전한 믿을만한 프리프로 B 소단위 유전자는 진핵생물 발현 연구를 위해 pBTA306과 pBTA294 또는 pBTA306과 pBTA308로부터 세그먼트를 스플라이싱함으로써 재구성할 수 있고, 소단위 선구물질의 그 부분은 그들 각각의 기능을 연구하기 위해 인히빈 Ac와 B 소단위 서열에 관계없이 원핵생물 또는 진핵 생물에서 발현시킬 수 있다.

소와 사람 B 소단위의 아미노산 서열이 동일하기 때문에 소의 B 소단위를 암호화한 cDNA를 발현하는데 있어 생성물은 사람의 DNA 서열의 유사한 발현으로 얻어지는 것과 동일하다는 것은 명백하다. 따라서 균주 BTA423, BTA424 및 BTA1360은 사람 인히빈의 B 소단위를 생성시킨다고 간주할 수 있다. 전체 프리프로 B 소단위 mRNA를 암호화한 cDNA는 독특한 Sac I 위치(염기 767-770, 제20도)에서 플라스미드 pBTA294와 pBTA306으로부터 cDNA를 스플라이싱하여 제조하였다.

c. 진핵세포에서의 발현

벡터 pBTA417과 pBTA418을 하기의 방법으로 동시에 또는 별개로 NIH3T3 세포에 형질전환함으로써 진핵세포에서의 인히빈 소단위의 발현을 연구하였다. 약 2×10⁵개의 NIH3T3 세포를 트랜스펙션 하루전에 5ml의 배양액중의 T25 플라스크에 접종하였다. 약 100ng-1㎍의 DNA (레트로바이러스 또는 박테리오파아지 λDNA)를 파커(Parker B. A.)와 스타크(Stark, G. R.)(1979, J. Virol, 31, 360-369)에 의해 변형된 것처럼 그람(Graham, F. l.)과 반데르에브(Van der Eb, A. J.)(1979, Virol, 52, 456-467)의 인산칼슘법으로 트랜스펙션하는데 사용하였다. 4시간 후, 그것들은 글리세롤 쇼크되었다. 글리세롤 쇼크후 72시간이 지난후 세포를 ml당 G418 200㎍ 을 함유한 와전배지가 있는 T75 플라스크에 1/3씩 나누었다. 세포를 매 3-4일마다 G418 함유 배지로 세척하고 14-25일에 나누어 유합 생장을 달성하였다.

NIH3T3 세포를 10％(v/ v) 소의 태아 혈청, 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 채워진 둘베코 변형 이글 배지(완전배지)에서 유지하였다. 트랜스펙션된 세포와 상징액을 융합생장에 이르렀을때인, 스플리팅후 약 3일이 지난뒤 인히빈 발현에 대해 분석하였다. 트립신 처리된 약 2×10⁷개의 세포로부터 세포 용해물을 제조하고 10ml PBS에서 세척하고, 1ml의 5mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 재현탁시키고 -20℃에서 동결시켰다.

RNA 세포 (2×10⁷개)를 제조하기 위해 원심분리하여 거둬들이고 2ml의 2×NETS/페놀(2×NETS=200mM NaC1, 2mM EDTA, 20mM Tris-HC1 pH 7.5 1.0％ SDS)에서 95℃에 즉시 재현탁시켰다. 격렬하게 와동시킨 후, 이 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 원심분리로 층을 분리시켰다. 수성층을 페놀로 재추출하고 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨과 2부피의 에탄올을 가하여 최종 수성층으로부터 RNA를 침전시켰다. 드라이아이스에 10분동안 둔 후 RNA를 4℃에서 10분동안 11,000g로 원심분리하여 펠릿화하였다. RNA를 물에 용해시키고 LiC1를 2.5M로 가하여 DNA와 tRNA를 전체 핵산으로부터 분리시켰다. 용액을 4℃에서 밤새 방치하고 LiC1 침전된 RNA를 4℃에서 10분동안 11,000g에서 3M LiC1 쿠션을 통해 원심분리로 분리시켰다. 최종 RNA 펠릿을 물로부터 재침전시키고 70％ 에탄올로 씻고 건조시키고 무균의 증류수에 용해시켰다. 260nm에서의 흡광도로 농도를 측정한 후 RNA를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

벡터로부터 생겨나는 mRNA 전사체의 양 및 크기를 평가하기 위해 노던 블로트와 도트 블로트를 이용하였다. 토마스(Thomas, P. S.)가 지재한 것처럼(1980, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 77, 5201-5205)글리옥실화후 1％아가로스 겔에서 RNA(5㎍)를 분리하였다. RNA를 실온에서 하룻밤동안 20×SSC에서 니트로셀룰로스에 직접 전달시키고 진공하 80℃에서 2시간동안 구웠다. 필터를 50％ 포름아미드, 5×SSC, 10mM 인산나트륨 pH 6.5, 250㎍ ml^-1DNA, 0.02％ PVP 25, 0.02％ Ficoll 400에서 42℃로 4시간동안 예비혼성화하고, 10％ 까지의 덱스트란 술페이트와 2×10⁹cpm/㎍DNA 프로브의 10⁶-10⁷cpm 을 함유한 예비혼성화 완충액에 42℃에서 하룻밤동안 혼성화하였다. Ac 소단위용 프로브는 염기 788-1149(제 5 도)를 포함하는 362bp cDNA 단편이었고 B 소단위용 프로브는 염기 504-872(제 6 도)를 포함하는 369bp cDNA 단편이었다. 필터를 0.1×SSC, 0.1％ SDS로 65℃에서 세척하고 -80℃에서 오토라디오그래피하였다.

게놈 DNA를 제조하기 위해, 채취한 세포(2×10⁷개)를 TNE 완충액(10mM Tris HC1, 400mM NaC1, 2mM EDTA, pH 8.2)에 재현탁시키고 SDS를 가하여 최종농도가 0.5％가 되도록 하였다. 혼합후 프로테이나제 K를 20㎍ ml^-1로 가하여 37℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. DNA를 동부피의 페놀로 매번 15분동안 2회 추출하고 클로로포름 : 이소아밀알코올(24 : 1)로 1회 추출하였다. DNA를 에낱올 침전으로 최종수성층으로부터 회수하고 스풀링하고(spooled)TE(10mM Tris HC1, 1mM EDTA pH 7.5)에 재용해 시켰다.

열처리한 RNase를 40㎍ml^-1로 가하고 37℃에서 30분동안 배양한 후에 SDS를 0.5％로 가했다. 프로테이나제 K를 20㎍ml^-1로 가하고 2시간 더 인큐베이션 하였다. 2페놀과 1클로로포름 : 이소아밀알코올 처리후 에탄올 침전으로 DNA를 분리시켰다. 스풀링한 DNA를 TE에 용해시키고 사용할때까지 4℃로 저장하였다. 서던 블로트 분석은 벡터의 게놈으로의 삽입을 검출하는데 사용되었고 삽입된 카피의 수를 평가할 수 있는 가능성이 있다. DNA (10㎍)는 공급자가 통상 추천하는 조건하에서 하룻밤동안 37℃에서 DNA ㎍당 효소 8-10단위로 절단하였다.

샘플을 페놀추출하고 에탄올로 침전시키고 나서 40mM Tris 아세테이트를 함유한 0.7％ 아가로스 겔에서 전기이동하였다. UV하에서 시각화하고, 변성 및 중성화한 후 DNA를 서던이 기재한 것처럼(1975) 겔로부터 통상 20×SSC중의 니트로셀룰로스에 전달하였다. 하룻밤동안 전달한후 필터를 5×SSC로 간단히 세척하고 80℃에서 2시간동안 진공하에서 구웠다. 50％ 포름아미드, 1×덴하르츠(Denhardts), 25㎍ml^-1DNA, 0.5×SSPE(SSPE : 180mM NaH₂PO₄, 1mM EDTA)에 42℃에서 최초 4시간동안 예비 혼성화하고 나서 10％ 덱스트란 술페이트와 10⁶-10⁷cpm 프로브(비활성 2×10⁹cpm/㎍ DNA)가 들어있는 예비혼성화 완충액으로 42℃에서 하룻밤동안 혼성화하였다. 프로브는 상기한 것과 같았다. 필터를 0.1×SSC, 0.1％ SDS로 65℃에서 세척하고 -80℃에서 오토라디오그래피하였다. RIA는 I¹²⁵-표지 31 kD 소 인히빈을 트레이서로 사용한 맥라클란(McLachlan, R. I)등(1986; Mol. Cell, Endocrinol, 46, 175-185)에 기재한 것과 근본적으로 같았다. 이 분석은 형태상 정확한 인히빈 또는 변성된 소단위보다 훨씬 나은 소단위를 검출하였다. 사용된 표준은 B/I비가 0.1이라고 정의된 bFF와 대조적으로 B/I 비가 0.4인 HPLC 정제 31kD 인히빈이었다.

국제특허출원 공보 제 W086/00078호에 기재된 분산된 쥐 뇌하수체에 세포배양액을 양의 망상 고환 유체표본과 함께 사용하였다.

모든 경우에 정확한 DNA가 게놈에게 관찰되었고 이것은 형질전환 벡터의 삽입을 나타내며, mRNA를 이러한 세포들로 제조하였다. 그러나 삽입카피수, mRNA 수준 및 발현된 단백질간에 외견상 연관관계는 없었다.

신선한 세포 배양 배지는 생분석과 RIN 둘다에서 검출할 수 없을 정도의 인히빈을 제공한 반면 벡터 pBTA419로 형질전한된 세포로부터의 사용한 배지는 생분석에서는 낮은 수준의 FSH 억제를 나타냈지만 RIA에서는 인히빈 유사물질을 검출할 수없으므로, 이것은 비특이적 억제 효과인 것 같다(표 6). 반대로, pBTA417중의 A 소단위 유전자가 발현되고 단백질이 분비되어 생분석가 RIA 둘다에서 검출가능한 물질을 제공한다. 이것은 프리프로 A 소단위 유전자만으로부터의 단백질은 인히빈과 유사한 생물활성을 가지는 반면 이전에 단지 AB 또는 AcB 소단위 조합물만이 인히빈으로 분류되어 왔다. 제조되는 면역반응성 물질의 양은 성장배지중의 세포스[B 소단위 블로트]에 비례하였다. 형질전환 3으로부터의 샘플의 B/I비는 천연 인히빈의 B/1비에 가깝고 이 재조합체 물질이 피임약의 개발에서와 같이 생물 활성이 요구되는 곳에는 어디든지 천연 인히빈에 대한 강력한 대체물임을 나타낸다. 생물 활성 물질은 또한 pBTA417과 418로 코트랜스펙션된 세포로부터의 상징액 또는 인히빈의 재조립체를 제공하는 각 벡터로 별개로 트랜스펙션한후 혼합된 개체군의 상징액에서도 발견되었다.

[표 6]

데이타는 바이오어세이(B) 또는 RIA(I)에서 측정한 것처럼 단위/ml 배양 상징액으로 주어져 있다.

ND는 검출미만을 나타낸다.

*는 세포 콜로니를 정제하여 얻어지는 데이타를 나타내고 나머지는 세포의 혼합 개체군을 함유한 트랜스펙션 상징액으로 얻었다.

+는 각 벡터로 별개로 트랜스펙션하고 트랜스펙션후 혼합한 세포의 배양물을 나타낸다.

/는 각 벡터로 동시에 코트랜스펙션된 세포를 나타낸다.

인간, 소 및 기타 동물의 인히빈 유전자간의 관찰된 유사성(실시예 7)으로부터, 상기한 것과 유사한 구성이 사람을 포함하여 어떤 종을 선택하여서도 생물 활성 분자를 발현하는데 사용될 수 있음은 명백하다. 그러나 인히빈 단백질 또는 인히빈과 유사한 단백질 또는 펩티드의 발현은 상기한 실시예에 제한될 필요가 없음을 이해하여야 한다. 원핵세포 및 진핵세포에 유용하고 본 분야 전문가들에게 공지인 상이한 발현 시스템이 많이 있고, 그것들은 여기 주어진 서열의 발현에 적합하다.

[실시예 11]

항인히빈 항체의 분리

BTA410과 BTA415로부터의 β-갈락토시다제-인히빈 결합 단백질을 포함하는 단백질 단편을 카르보닐 디이미다졸 방법(Bethell, G. S. 등(1979) J. Biol. Chem. 254 ; 2572-2574)을 사용하여 세파로스 CL-6B에 연결시켜 유합 단백질 각각의 항체를 친화정제에 이해 토끼의 항인히빈 항혈청의 1ml로부터 분리하였다. 흡착된 항체를 3M MgCl₂와 함께 관으로부터 용리하고, 10mM Tris-HC1/150mM NaC1 pH 7.5에 대하여 투석하였다. 용리된 항체는 결합 단백질 각각의 웨스턴 블로팅 분석에 사용하였으며, 분리된 것에 대한 융합 단백질에만 결합하였다. 즉 교차 반응성은 없으며 항인히빈 항체에 비교되는 항 β-갈락토시다제 항체의 양은 무시할 수 있다. 유사한 실험을 균주 BTA 425, 420, 422와 424로부터의 연합 단백질로 수행하였다. 이들 실험은 재조합 인히빈 또는 폴리클로날 항체 제제의 스크리닝, 및 ELISA나 RIA와 같은 인히빈 분석 체계에서 표준으로서 사용될 수 있음을 실증한다.

[실시예 12]

합성 펩티드의 합성

진핵세포나 원핵세포에서 인히빈과 같은 단백질의 제조의 대체방법은 화학적으로 인히빈의 부분이나 전체를 합성하는 것이다. 그와 같은 합성펩테드는 인히빈의 유사체, 작용물질, 길항제로 사용되며, 실시예 10과 11에서 서술된 바와 같이 사용된다. 다음 제조방법을 합성 펩티드의 합성, 정제와 특성화에 적용하였다. 430A 펩티드 합성기(Applied Biosystems Inc.)를 사용하였다. 버젼 1.00 소프트웨어는 제작자로부터 변형하지 않은 채 사용하였다. 모든 시약은 Applied Biosystems에서 구입하였다. 반응용기에는 PAM 수지에 공유결합된 C말단 아미노산(0.5m몰)을 채웠다. 합성은 각 잔기가 짝지워진 후에 닌하이드린 반응으로 측정하였다. 펩티드에 결합한 수지의 총량은 전형적으로 75％였다.

수지로부터의 펩티드의 분리 및 탈보호는 0℃에서 1시간동안 스카벤져크레졸(0.5ml)과 티오크레졸(0.5ml)의 존재하에서 불화수소산(10Ml)으로 펩티드에 결합한 수지를 처리하여 달성하였다. 이 분리와 탈보호는 Teflon HF-Reaction Apparatus(Protein Research Foundation, Osaka, Japan)에서 수행하였다. 반응 생성물을 에테르(3×50ml)에서 연마하고 여과한후, 펩티드는 아세트산(10％)에 용해시키고 여과하여 여과물을 냉동건조기켰다. 나머지는 아세토니트릴(10％)을 포함하는 트리플루오로아세트산(0.1％)속에 용해시켰다. 펩티드는 역상 고압액체 크로마토그래피에 의해 균질하게 정제하였다. 트리플루오로아세트산(0.1％)을 사용하여 아세토니트릴의 퍼센트를 10부터 80까지 직선으로 증가시켜 구배를 발생시켰다. 알텍스 C₈컬럼을 분석 크로마토그래피에 사용하고, 용리액은 1ml/min의 유속에서 220nm로 지속적으로 측정하였다. 예비 RP-HPLC는 2-4ml/min으로 작동하는 Vydac 단백질과 펩티드 C₁₈컬럼(Cat, 제218TP 1010번)으로 수행하였다. 구배는 각 펩티드의 정제를 최적화시키기 위해 조절하였다. 정제된 펩티드는 아세토니트릴을 증류시켜 회수하고 그후 수용액상을 냉동건조시켰다. 합성 펩티드는 Waters Pico-Tag System을 사용하여 아미노산 분석을 하는데 사용하였다. 제작자에 의해 제공된 방법을 이용하고 PTC 아미노산으로 시스템의 눈금을 정하였다. 각 펩티드의 아미노산 조성은 각 아미노산에 대한 기대율과 일치하였다.

cDNA 서열로부터 유도된 아미노산 서열 소단위 A의 두 부분을 합성 펩티드 생산의 초기에 사용하였다. 첫째는 His 1부터 Ala 26까지 둘째는 Ser 167부터 Asp 195까지이므로, 인히빈의 소단위 43kD(A)와 20kD(Ac)의 N-말단을 보화하였다. 펩티드 1의 서열이 모두 아래에 주어져 있으며 번호는 제 5 도에 주어진 아미노산 서열에 대해 지정된 것들이다.

서열은 단일 아미노산 암호를 사용하여 (H₁-A₂₆)K로 단축될 수 있으며, 괄호속의 아미노산은 제 5 도에 열거된 바와 같이 인히빈 서열을 나타낸다. 펩티드 2는 r(H₁-A₂₆)K이다. 그것은 NH₂-말단 티로신의 부가에 의해 펩티드 1로부터 유도된다. 한가지 합성은 리신과 함께 착수된다. 수지의 일부분(75％)을 제거하고(펩티드 1), 티로신 잔기는 펩티드 2를 생산하기 위해 남아있는 펩티드 25％에 부가하였다. 리신 잔기는 합텐(hapten)의 제조를 촉진시키기 위해 통합되며, 티로신은 방사성 요오드화에 대한 위치를 제공하기 위해 부가하였다.

[실시예 13]

봉입체의 제조와 정제

균주 BTA420, BTA422 및 BTA424는 융합 단백질로서 인히빈과 같은 단백질을 생산한다. 모든 세 균주의 단백질은 봉입체의 불용물질로서 생체내에서 발견되며, 다음 과정에 의해 정제하였다. 밤 동안의 배양물을 2리터 배플 플래스크에서 2×1리터의 신선한 LB(리터당 10g 트립톤/5g 효모 추출물 /5g NaC1)속으로 1 : 50으로 희석하여, 배양밀도가 OD 0.3-0.4에 도달할때까지 37℃에서 교반하였다. 이소프로필-B-D-티오갈락토시다제(IPTG ; 0.1mM 최종 농도)를 첨가하고 2-7시간동안 배양하였다. 봉입체는 2시간후에 밝은 입자 상으로서 처음으로 나타났고, 측정결과 7시간 후에는 최대 크기와 수에 도달하였다.

세포를 수확하고, 80℃에서 밤동안 편리를 위해 펠릿을 얼렸다. 세포는 본래 배양액을 리터당 H₂O 20ml에 재현탁하고, French Press를 사용하여 부수었다. 현탁액을 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 0.1mM과 5％ 트리톤 X-100에서 만들어 1,200×G로 10분간 원심분리하였다. 상징액을 버리고 펠릿을 50ml의 1M NaC1/5％ 트리톤 X-100에서 초음파로 분쇄하여 재현탁시킨후 다시 원심분리하였다. 이 세척단계를 반복하고, 최종적으로 펠릿을 본래 배양액 리터당 2.5ml의 1M NaC1/5％ 트리톤 X-100에서 초음파를 사용하여 현탁하였다. 현탁액을 60％(w/ v) 자당 밀도 구배로 놓고 Beckman SW28 로터로 60분간 32,000×G로 원심분리하였다. 봉입체는 자당 쿠션을 통하여 펠릿화하고 세포 파편으로부터 분리하였다. 그들을 H₂0로 세척하여 폴리아크릴아미드 겔에서 보이는 바와 같이 단백질 프로필의 변화없이 -80℃에서 최소한 세달동안 얼린채로 보관할 수 있다.

[실시예 14]

항원의 제조

정제된 봉입체를 8M 우레아/0.1M DTT/의 0.1M Tris-HCl pH 8.0에 37℃에서 2시간동안 N₂하에 2mg/ml로 용해시켰다. 그 용액을 12,000rpm으로 15분간 원심분리하여, 상징액을 50mM NaH₂PO₄/150mM NaC1 pH 7.5(PBS)로 4℃에서 밤동안 최소한 2×5리터 변화하에 투석하였다. 투석자루의 단백질 내용물은 흰 플록(floc)을 형성하였으며, 더 정제하지 않고 사용하였다. 이 물질은 마우스의 복강에 1mg 주사시에 알려진 바와 같이 화농물질 또는 리포폴리사카라이드를 포함하지 않았다. 플록 현탁액을 동량의 지방 기저의 보조약인 Marcol 52 : Montanide 888(9 : 1)로 에멀션화시켜 ml당 항원 100-250㎍의 최종 농도로 만들었다. 합성 펩티드는 글루타르알데히드 방법(Briand, J. P. 등(1985) J. Immunol. Methods 78, 56-69)으로 키올 림펫 헤모시아닌(KLH)과 결합시키고, 공액물은 위에 서술된 바와 같이 에멀션화하였다.

항원 제조의 많은 선택적 방법과 면역화에의 많은 선택적인 수단이 있을 것으로 이해된다. 항원제조의 선택적인 방법은 Freund의 완전한 또는 불완전한 보조제에 있어서의 에멀션화, 알이드로겔 또는 사포닌에 있어서의 에멀션화, 또는 항원을 포함하는 폴리아크릴아미드 겔의 침연을 포함한다. 선택적으로, 항원은 보조제 없이 투여될 수 있다. 투여경로는 경구 투여와, 점액성 생체막, 근육내, 복강내와 피하 투여를 포함한다. 또한, 펩티드나 단백질의 자체간 가교결합, 다른 단백질에 대한 가교결합 및 잔기의 변형 또는 서열의 변화를 포함하여 펩티드 및 단백질의 항원성을 증가시키는 많은 선택적인 수단이 있다.

[실시예 15]

면역화 방법

첫 주사(0주)와 4주후 추가 접종을 다음과 같이 계산된 각 플록 항원의 분량으로 동물에 제공하였다.

토끼 100 ㎍/1회분

양 250 ㎍/1회분

돼지 200-250 ㎍/1회분

쥐 100 ㎍/1회분

부가하여, 키흘 림펫 헤모시아닌(KLH)에 결합한 합성 펩티드(펩티드 1; 실시예 10)를 1회분당 100㎍공액물로 쥐에 사용하였다.

[실시예 16]

항혈청 분석

정규적으로 혈액 표본을 얻었다; 전형적인 채혈 방법은 첫주사 전의 한번 출혈, 추가접종 전의 한번 이상의 채혈과 추가접종 후에는 1주일에 한번 채혈하는 것을 포함한다. 혈액을 밤새 4℃에서 응혈시키고, 혈청을 후속 원심분리로 제거하였다. 혈청을 분취량으로 나누고 항체 및 FSH 역가의 분석중에 -20℃에서 냉동 보존하였다. 혈청은 다른 세 실험에서 분석하였다.

a. 트레이서 결합-요오드화된 58kD와 31kD 인히빈에 결합하는 항체 능력을 결정하여, 항체가 천연 소의 인히빈을 인식하는지를 조사하였다. 트레이서 항체 복합체를 둘째 항체를 사용하여 침전시키고, 펠릿내의 방사성은 반응에서 전체 카운트의 퍼센트로 표시하였다. 요오드와 방법은 다음과 같다.

정제된 58kD 또는 31kD 인히빈(25㎕전기 용리 완충제(국제 특허출원 제 PCT/AU85/00119호)내의 1-2㎍)을 pH 7.2인 0.5M 인산염 완충제 25㎕에 가하였다. Na¹²⁵I(0.5mCi, 5㎕, Amersham, Bucks, UK)를 첨가하였다. 클로라민 T(40㎕)를 클로라민 T : 호르몬의 8 : 1 비율로 부가하였다. 실온에서 교반하면서 60초동안 반응을 진행시키고, 메타비설파이트 나트륨)(3mg/ml 20㎕로 종결시켰다.

반응 혼합물을 20mM 인산염 완충제/0.1％ BSA 또는 폴리펩(Polypep) pH 6.0에서 500㎕만들고, 겔은 유리¹²⁵I를 제거하기 위하여 세파덱스 G25 컬럼(PD 10, Pharmacia, Uppsala, Sweden)에서 여과하였다. 공극 분획을 모으고 20ml로 만들어 Matrex Red A(Amicon, Danvers, Mass., USA), 200㎕컬럼에 적용시킨후, 400mM KC1를 포함하는 인산염 완충제로 세척하고, 용리된 양은 버렸다.¹²⁵I-인히빈은 인산염 완충제에서 1M KC1/4M 우레아로 용리시켰다. 요오드화된 인히빈은 KCℓ/우레아를 제거하기 위해 적당한 RIA 완충제(아래를 참조)와 함께 세파덱스 G25 컬럼(PD10)에서 더 겔 여과하였다. 58kD 및 31kD 인히빈의 요오드화에 이어, 세파덱스 G25에서의 겔 크로마토그래피 후에 공극 부피 분획에서 6μCi와 25μCi를 각각 회수하였다. 거의 30％가 1M KC1/4M 우레아 완충제와 함께 용리되었다. SDS-PAGE에 그 분자량이 나타나 있듯이¹²⁵I-인히빈은 이 분획에서 발견되었다. 요오드화된 제제의 특정 활성도는 표준으로서 요오드화에 사용된 호르몬과 함께 자가-배치 방법 (Marana 등(1979)Acta Endocrinol(Kbh.) 92, 585-598)을 이용하여, 방사성면역분석으로 결정하였다.

¹²⁵I-58kD 인히빈에 대한 50-60μCi/㎍의 특정 활성도와¹²⁵I-31kD 인히빈에 대한 24μCi/㎍의 특정 활성도는 5-20％ 범위의 회수로 달성하였다. 천연 58kD 인히빈으로 면역된 토끼 474의 항인히빈 항혈청은 천연 인히빈 생물활성도를 중화시키고, 요오드와 58kD 및 31kD 인히빈에 가하게 결합되나, 각 인히빈의 분리된 소단위에 대해 약하게 결합하였다. 이는 요오드화가 분자내에서 주요한 구조적 변화를 야기시키지 않음을 가리킨다.

그러므로 항혈청의 요오드화된 인히빈에 대한 결합능력은 항혈청의 천연 인히빈에 대한 인식능력으로 간주된다.

b. 생체와 생물검정-앞서 서술된 생물검정(국제 특허출원 제 PCT 85/00119호)에 있어서 항혈청의 천연 인히빈 생물활성도에 대한 저해능력은 중화항체가 존재함을 가리킨다.

c. FSH-양의 FSH 혈청 수준을 토끼 양-양 혈청 및 트레이서로서 요오드화 양 FSH로 구성된 방사성 면역 분석시험으로 결정하였다. 토끼 FSH의 혈청 수준은 기니아 돼지 항-토끼 FSH 혈청 및 트레이서로서 요오드화 토끼 FSH로 구성된 방사성면역 분리시험으로 결정하였다. FSH 역가의 증가는 재조합 물질에 대해 증가한 항체의 순환으로부터 내생 인히빈을 제거에 의존하는 것으로 여겨진다.

[실시예 17]

양 실험

아홉가지 동물의 그룹(Corriedales ; 실험기간에 발정정지기에 있도록 선택된 품종)을 단독적으로 또는 표 7에 나타낸 짝지은 프로항체로 면역시키고, 혈청을 실시예 16에서와 같이 분석하였다.

a. 트레이서 결합 연구.

열아홉 동물들은 상당한 트레이서 결합 능력을 가진 혈청(추가접총 2주)을 생산하였다 (표 7). 이들 동물들은 모두 위약 대조표준(그룹 A) 이외의 그룹 및 pBTA301(그룹 C)로부터의 15kD 소단위 융합 단백질로 면역된 그룹에 속하였다.

가장 좋은 반응은 1 : 100 희석에서 31kD 트레이서에 대해 10％ 결합을 보이고 58kD 트레이서에 대해 3.1％ 결합을 보인 동물 673(그룹 D)이었다.

[표 7]

1％ 이하의 결합을 보이는 동물은 없다.

따라서, 재조합 인히빈 소단위는, 항원으로서 사용될때, 천연인히빈을 인식할 수 있는 양에서의 항혈청을 증가시키는 포텐샬을 가진다.

다음에 주의를 기울여야 한다.

ⅰ) 이들 실험은 항혈청에서 자유로운 항체를 추적하며, 양 인히빈에 대한 가장 큰 친화력을 지닌 항체는 양 인히빈과 결합하므로 이 분석에서는 추적될 수 없고, 및

ⅱ) 스크리닝은 더 약한 양성 혈청의 희석 역가를 초월한 1 : 100 희석에서 수행하였다.

b) 생체외 생물검정 데이타

혈청의 어느 것도 시험된 조건(2U 인히빈 당 1μΙ항혈청)하에서 뇌하수체 세포 배양물에서 인히빈 활성의 중화를 보이지 않았다.

c) FSH 역가

각 동물 그룹에 대한 혈청 FSH 수준은 표 8에 나타나 있다.

대조 표준그룹(A)에 대한 혈액간에는 현저한 차이가 없었으나, 시험 그룹 가운데 하나를 제외한 모두에 대해, 일시적이기는 하지만, 현저한 증가가 관찰되었다.

따라서 재조합 인히빈을 가축의 FSH 역가를 증가시키기 위한 항원으로 사용할 수 있다. FSH가 배란속도를 증가시키는 것으로 알려졌으므로, 재조합 인히빈에 대한 면역하는 배란속도를 증가시킬 것으로 기대되며, 생식 효율의 개선을 위한 다산성 약제로 사용할 수 있다.

따라서 그것은 생물활성인 재조합 인히빈의 투여가 FSH 수준을 억제하고, 암컷과 수컷 모두에 있어서 피임약으로 사용할 수 있는데 그 이유는 FSH가 수컷에서는 정자형성의 조절 및 암컷에서는 여포형성의 조절에 관여하기 때문이다.

[표 8]

결과는 그룹 평균 ± 표준편차로 나타냈다.

그룹들은 표 4에 나타낸 바와 같다. 통계적 비교는 같은 그룹 동물들간의 비교 t-검정으로 4주 값과 그 다음주 값의 비교로 행해진다.

* P<0.05

* * P<0.01

[실시예 18]

토끼 실험

천연 58kD 또는 31kD 인히빈이나, 플랏미드 pBTA297, 299나 301을 지닌 세포로부터의 융합 단백질이나, 합성 펩티드 1(실시예 10)을 포함하는 결합 단백질로 면역된 난소가 제거되지 않은 수컷 토끼의 항혈청을 트레이서 결합 체계에서 분석하였다. 그 결과는 표 9에 주어져 있다.

[표 9]

동물 474로부터의 혈청은 1 : 1200으로 희석하여 사용하고 반면에 나머지 동물은 1 : 1000으로 희석하여 사용하였다.

이들 데이타는 재조합 인히빈 소단위와 합성 펩티드가 천연 인히빈을 인식하고 결합할 수 있는 항체를 포함하는 항체 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. 반응은 동물마다 다양하며, 재조합 15kD 항원(BTA424로부터) 이 시험된 모든 토끼에서 주목할만한 반응을 유도하지 못한 것은 토끼 474(58kD 인히빈에 대해 생성된)의 혈청속에 존재하는 모든 항체가 이제까지 수행한 시험에서 43kD 소단위에 대해 유도된 것으로 나타나며 따라서 15kD 소단위는 토끼에서는 매우 빈약한 항원임을 의미하는 사실을 반영한다.

그것은 이 소단위가 다른 종에서는 유용하지 않을 것이라는 사실을 의미하지는 않는다. 이 결과들은 또한 15kD 소단위에 대한 주목할만한 항원 반응을 일으키기 위해서는 그의 구조나 서열 또는 제공에 다소의 변형이 필요함을 시사한다. 마탄가지로, 25kD 소단위도 토끼에 있어서 빈약한 항원이다. 토끼 699의 혈청 FSH 수준은 펩티드 1-KLH 결합항원(제15도)과 함께 추가접종 면역에 이어 0까지 급격한 감소를 나타내고 토끼 698의 것은 점차적으로 감소하였다. 각 동물의 반응은 58kD 트레이서에 대한 그의 항혈청의 역가와 상호관계한다.

더 나아가 합성 펩티드 자체 또는 그에 대한 항혈청은 생체외에서 쥐 뇌하수체 세포 생물검정에서 영향을 미치지 않았는데, 이는 그것들이 인히빈 수용체에 직접적으로 작용하지 않음을 가리킨다. 그러므로 펩티드와 그 유도체는 FSH가 정자형성과 여포형성에 관여되므로 암컷과 수컷에서 피임약으로 사용될 수 있는 잠재력을 가진다 (실시예 19 참조).

더욱이 이것은 A_N단편의 NH₂-말단이므로, A_N단편 자체 또는 소, 인간 또는 다른 척추동물로부터 유도된 다른 합성 펩티드도 관찰된 반응이 항체- 중재인 경우 유사한 용도로 사용될 수 있음이 당연하다.

또한 항원 이외의 수단으로 생물활성적 A_N단편 또는 그 일부의 투여는 FSH 수준을 증가시킬 것으로 예상되며, 따라서 생식 효율의 개선을 위한 다산 약제로서 작용할 수 있음이 당연하다(실시예 19 참조).

[실시예 19]

돼지 실험

이 실험의 원안은 위에 서술된 것과는 다르다.

선택된 어린 암퇘지들(약 22-23주된 것)을 BTA426로부터의 β-갈락토시다제프록 항원(동물 16마리, 대조표준 그룹), 또는 BTA422, BTA424 및 BTA426으로부터 각 소단위 프록 항원의 250㎍을 포함하는 혼합물(동물 16마리, 시험 그룹)로 면역시켰다. 유사한 추가접종을 25일에 주사하고, 첫 주사후 47일 되는 날에 다시 주사하였다.

혈청은 첫 주사후 60일 되는 날에 얻어졌으며 트레이서 결합 방법에 의해 항인빈 항체를 분석하였다.

그 어린 암퇘지의 발정징후를 관찰하였고 가장 초기에 교미시켰다.

15시험 그룹 동물의 혈청을 1 : 100 희석으로 트레이서 결합 능력을 시험하였고, 이들 가운데 10은 1.7-9.0％(X=4.9±2.5)의 범위내에서¹²⁵I-58kD 인히빈에 대한 결합을 보였다.¹²⁵I-58kD 인히빈에 대한 2.0％ 결합을 가진 혈청은 또한¹²⁵I-31kD 인히빈에 대한 6.4％ 결합도 보였다.

시험된 대조표준 혈청 6 가운데 어느것도 트레이서에 현저히 결합하지 않았는데 이는 재조합 인히빈 소단위가 천연 인히빈을 인식할 수 있는 항체를 야기시키는 돼지내에서의 항원 반응을 일으킬 수 있음을 실증한다.

돼지의 발정주기는 21일이므로 혈청이 얻어진 60일의 27일 후에 시험된 모든 동물은 발정신호가 나타날것으로 예상되었으므로 교미시켰다.

표 10은 대조표준 및 시험 그룹의 교배 데이타를 나타낸다.

X²분석은 교미되지 않은 많은 시험 그룹 동물들에 상당한 효과를 가지게 하기 위한 처리법을 알려준다.

[표 10]

이 데이타는 항 58kD 인히빈의 A_N절편에 대한 항원체의 기능을 반영하는데 그 이유는 1 : 100 희석액에서 항-58kD 인히빈 항체를 지닌 10혈청중 9개가 31kD 인히빈을 추적하는데에 실패하였기 때문이며 이는 항체의 대부분이 A_N에 특이적임을 나타낸다. 이 가정은 토끼에서 항원으로 펩티드 1의 투여가 FSH 수준의 감소를 일으킨 것(실시예 18)에 의해 지지되며 그 결과 암컷 척추동물에서 주기와 여포 형성은 정지될 것이다. 58kD 인히빈보다는 31kD 인히빈에 대해 더 큰 항체 역가를 지닌 혈청을 생산하는 동물은 이 기간동안 정상적으로 교미하였다.

다른 해석이 또한 가능한데 예를 들면, 43kD 항원은 프리프로 A 소단위의 아미노산 -10 내지-1을 포함하고, 이 서열이 그 효과와 관련이 있음을 추측할 수 있다.

그럼에도 불구하고, 이 모순된 결과는 생체내에서 얻어지며 그 데이타는 FSH와 생식적 생리현상과 그 과정의 조절자로서 인히빈의 역할을 강조하기 위해 제공되고, 그것은 암컷과 수컷의 피임제로서 암컷의 발정주기를 방해하는 분자로서, 재조합 인히빈에 대한 역할을 입증한다.

[실시예 20]

쥐 실험

쥐의 그룹은 양에 사용된 것과 유사한 양생법으로 면역화시켰다.

혈청을 1 : 500 희석액에서 요오드화된 트레이서 결합 분석으로 분석하고, 각 그룹에 대한 결합 ％는 평균 ± 표준편차로 표 11에 나타냈다.

(A-F) 그룹에 대하여 사용된 항원은 표 7에 나타냈다.

[표 11]

이 데이타는 그룹 A와 B 및 E 또는 D의 트레이서 결합 능력을 비교한 결과 A(43kD) 소단위가 Ac(20kD) 소단위보다 더 나은 항원임을 나타낸다. B 소단위는 트레이서 결합 연구에 의해 분석된 바에 의하면 항원으로서 비효과적이다. 이 결과들은 중화되지 않은 항체와 빈약한 항원반응이 쥐 461에서 관찰되고, 다른 두 쥐에서는 31kD 천연 인히빈으로 면역됨에 반하여, 58kD 천연 인히빈은 좋은 항체 반응과 쥐 474내의 중화 항체들을 산출한다는 주장을 더욱 실증한다. 재조합 인히빈 소단위로 면역화시킨 동물 가운데는 없는 다른 종(양, 토끼, 돼지)에서는 중화 항체는 발견되었다.

거기에다가, 모든 종에 있어서, 항원의 β-갈락토시다제 부분에 대한 큰 면역반응이 관찰되었다. 이들 관찰은 균형잡힌 배열과 에피토프(epitope)가 중요할 수 있으며, 융합체의 β-갈락토시다제 부분이 실제적으로 감소(제12도)하거나 부재하며, 실험이 형태 전환적 에피토프를 생산하고 또한 항원 존재를 증가시키기 위하여 받아들여질 수 있기 때문에 BTA426, BTA427과 BTA1360 또는 trp 벡터(실시예 10)로부터의 항원은 가치있을 것이다.

그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 동물시험은 재조합 인히빈, 소단위, 그의 단편과 합성 유사체 또는 동족체가 다음용도로 사용될 수 있음을 확립하였다.

1) 천연 인히빈을 인식하는 항체의 생산,

2) FSH 수준의 변화,

3) 다산성 약제 또는 피임제로서의 이용.

면역원으로서의 pUC-기제 융합 단백질의 제조 및 이용

pBTA303, pBTA308, pBTA309 및 pBTA472로부터의 짧은 pUC-기제 융합 생성물의 우수한 면역원 특성은 균주 BTA427에서 제조된 봉입체로부터의 소 Ac 생성물로 백신 접종한 양에서 중화 항체의 제조로 예시된다.

봉입체를 8M 우레아와 0.1M DTT를 함유한 pH 8.0의 0.1M Tris-HC1에 N₂하 37℃에서 2시간동안 용해시켜 단백질을 제조하였다.

빙초산을 가하여 용액의 pH를 3으로하고 원심분리로 맑게한후 농축시키고 0.1M 아세트산중의 세타덱스 G50 또는 G75 컬럼에서 크로마토그래피 하였다.

재조합 단백질을 함유한 분획을 DSD-PAGE로 확인하고, 모아서 Vydac 또는 C4 Dynamax Macro C18 역상 크로마토그래피 컬럼에서 크로마토그래피 하였다.

각 경우에 0.1％ TFA 중의 아세토니트릴의 구배를 이용하여 컬럼으로부터 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질을 다시 SDS-PAGE로 확인하고 필요한 부분을 푸울하고 1 내지 10mg/ml로 농축시키고 PBS로 투석시켰다. 단백질의 동일성은 NH₂-말단 서열화에 의해 확인하였다.

4마리의 양을 300㎍ KLH, 소의 Ac 융합 생성물 300㎍과의 동수 및 KLH에 연결된 Ac를 함유한(107 : 1 몰비) 포합체의 300㎍ Ac 등가물과의 동수로 글루타르알데히드법(Briand 등, 1985 ibid)으로 면역성을 주었다.

1차 면역감작은 0일에는 프로인트의 완전 보조약에서였고 추가면역은 21일과 50일째에 마르콜 52 : 몬타니드 888(9 : 1)에서 였다.

56일째의 혈청을 31kD 천연 소 트레이서를 인지하는 능력에 대해 RIA로 시험하였고, 결과는 표 12에 결합된 ％ 계수로 나타내었다.

[표 12]

정확한 인히빈을 형태적으로 인식하는 항체가 만들어졌음을 나타내는 천연 31kD 인히빈에 대한 중요한 결합이 이루어졌다.

더욱이 동물 6, 7, 8 및 10으로부터의 항체가 체외 생물검정으로 시험했을때 그것들은 인히빈 생물활성을 중화하였다. 동물 5-12를 93일에 비포합 면역원(Montanide 888 : Marcol 52 중의 100㎍ )으로 다시 추가 면역시키고 프로게스타겐 발정주기 동조 치료를 하고 배란속도반응을 조사하였다.

재조합 인히빈을 받는 이러한 그룹들은 KLH-면역 대조표준 또는 미처리 대조표준(C1-C5 표 13)의 군보다 훨씬더 높은 배란속도를 나타내었고, 짧은 융합단백질이 단독으로 또는 캐리어 분자에 결합되어 사용되었을때 면역원으로서의 성질이 우수함을 확인시켜주고 인히빈의 단일 소단위에 대한 항체가 생체내 및 체외에서 인히빈 생불활성을 중화할 수 있음을 나타내었다.

한마리의 동물(번호 9)이 복강경검사법에서 난소절제되었음을 발견하였다.

[표 13]

이러한 방법들은 인간과 돼지, 개, 말, 소, 양 및 거위와 같은 가축들에게 pBTA303, pBTA308, pBTA309 및 pBTA472로부터의 융합 단백질 생성물을 별개로 또는 함께 사용하여 적용할 수 있다.

[실시예 21]

인히빈 제조방법

인히빈 생산에 대한 유전 정보를 지니는 재조합 플라스미를 포함하는 숙주 세포는 제조 배양 수집기 내에서 냉동 건조된 바이알에 유지하였다.

저장 바이알로부터 세포들을 재구성하고, 선택적인 배양기에서 덮어, 이 배양기로부터의 세포들은 발효기 접종원을 제조하는 데에 사용하였다.

그 접종원은 적합한 성장 배양기를 포함하는 발효자를 파종하는데 사용하고, 발효는 인히빈 단백질의 제조에 대한 적당한 조건에서 진행하였다.

발효의 완숙기에 세포를 수확하고, 생성물은 세포로부터 분리시켜 정제하였다.

그 산출물은 분석과 특성 조절에 쓰고, 적당한 안정도를 유지하는 조건하에 보관시켰다. 산출물을 엄격한 위생 조건하에 다른 성분과 함께 조합하여 제제로 만들었다.

산업적 응용

인히빈의 이용

인히빈 또는 본 발명에 의해 생산된 그들의 일부분은 항원으로서 또는 생물 활성적인 화합물로서 사용될 수 있다; 한가지 사용방법에 기인하는 효과는 다른 사용방법에 의한 효과와는 반대될 것으로 예상된다.

한 형태에 있어서 인히빈 또는 본 발명에 의해 제조되거나 지속적으로 모형화된 그들중 일부는 항원으로서 사용되며 생식력에 영향을 미치기 위하여 사용된다. 인간을 포함하여 척추동물에 있어서의 배란 속도의 증가는 생식력을 증가시키며, 따라서 다산하게 하고, 생식 효과를 증진시킨다.

본 발명의 산출물은 배란 속도를 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 가축이나 인체에 있어서와 같이 생체외 수정 계획에 이용될 수 있다.

그것은 가축이 아닌 동물에서, 예를 들면 동물원에서 생식 계획을 촉진시키기 위해서도 사용될 수 있다.

무엇보다도, 본 발명의 산출물은 성적 성숙 또는 발정을 촉진시키고 동물에서 생식 주기를 증가시키기 위해 및/또는 교미와 분만 사이의 기간을 줄이기 위해 새끼를 낳을 동물내에 발정을 촉진시키고, 분만후 발정정지기를 감소시키기 위한 것이다. 수컷에 있어서, 본 발명의 산출물은 정자형성을 촉진시키는데 사용될 수 있다.

그러므로 젖소, 양, 돼지, 염소, 사슴, 말, 어류 및 닭과 같이 사육하는 종류의 산출물은 이들 인히빈의 이용에 유익할 것이다.

활성제로서 인히빈은 암컷에 있어서 배란을 조절하거나 수컷에 있어서 정자 형성을 억제하는 수단으로 사용될 수 있고, 피임제나 배란을 동시에 일어나게 하는데도 사용할 수 있다.

인히빈의 일부분 즉 합성 펩티드나 A_N단편은 FSH 수준을 억압하는 항원으로 사용될 수 있고, 따라서 피임제나 발정을 억제하는 분자로서 작용한다.

본 발명의 산출물이 항체를 야기시키는데 사용되고 또한 이들이 본 발명의 일부분을 형성함에 따라, 항인히빈 항체는 진단제로 사용될 수 있다.

예를 들면, 그와 같은 용도는 인간을 포함한 척추동물에 있어서 생식 주기의 상태를 조절하는 수단을 포함한다.

이와 같은 방법으로 배란 시간과 난자의 수효는 예기될 수 있고, 따라서 생식 주기에 영향을 미치는 치료 과정의 평가가 가능하다.

항체는 암컷에 있어서의 과립막 세포기능을 평가하기 위해, 수컷에 있어서 세르톨리씨 세포 기능에 대한 표지로서 및 좋은 생식자의 유전학적 선택에 대한 표지로서 사용될 수 있다.

따라서 앞서 기술된 단백질과 그들의 유도체 또는 동족체와 유사체는 다음을 포함하여 많은 용도를 가지고 있다.

1) 생체내 천연 인히빈 또는 그의 전구체에 기인하는 다소의 생리적 효과를 폐지하거나 저하 조절하기 위한 항원 또는 인히빈 길항물질로서의 용도.

2) 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생산하기 위한 항원으로서의 용도.

3) 생체내 또는 생체외 생물학적으로 활성인 재조합 인히빈의 제조를 위한 전구체로서의 용도.

4) 인히빈 방사성면역분석시험(RIA)과 효소-결합 면역흡착(ELISA) 분석 또는 화학 발광이나 형광과 같은 다른 추적체계를 사용하는 분석에 있어서 표준으로서 용도.

5) 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 제제의 스크리닝에 있어서의 용도.

6) 인히빈 또는 인히빈과 같은 아미노산 서열을 인식하는 항체의 정제에 있어서의 용도(실시예 9 참조).

7) 천연 인히빈 또는 생체내 그의 전구체에 기인하는 일부 또는 전부의 생리적 효과를 가능하게 하는 인히빈 작용물질로서의 용도.

생물활성적인 재조합 인히빈은 같은 세포에서 소단위 또는 그들의 전구체 모두를 공-발현함(Co-expressing)에 의해, 또는 생체외에서 개개 소단위, 또는 그의 전구체, 유사체 동족체 또는 유도체의 정확한 재접힘(refolding)에 의해 제조될 수 있다.

인히빈 cDNS 서열은 실시예를 통해 다음 여러 용도를 포함한다;

1) 원핵세포나 진핵세포에서 단백질 합성을 위한 cDNA 주형으로서의 용도 (실시예 8 참조).

2) 방사성표지 인히빈 cDNA 프로브의 제조를 위한 DNA 주형으로서의 용도.

이들 프로브는 인히빈이나 인히빈과 같은 펩티드를 만드는 세포의 mRNA내 또는 다양한 종의 게놈 DNA내에서 인히빈이나 인히빈과 같은 서열을 추적하고 분리하기 위해 사용될 수 있다(실시예 7 및 8 참조).

따라서 그들은 사람과 가축에서 인히빈 합성 및 조절의 결합에 대한 진단 및 인히빈 유전자의 클로닝과 조작에 대한 가능성을 가진다.

3) 위의 2)와 유사한 용도로 방사성표지 RNA 프로브의 제조에 대한 DNA 주형으로서의 용도.

4) 방사성표지 인히빈의 제조에 대한 DNA 주형으로서의 용도.

Claims (35)

1. 인히빈 또는 인히비과 유사한 번역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질의 전체, 일부 또는 전구체를 암호화한 RNA 또는 DNA 분자를 선별하는 방법에 있어서, 하나 또는 그 이상의 DNA 또는 RNA 분자를 제공하는 단계 및 상기 분자가 그와 같은 활성을 가지는 단백질의 전체, 일부 또는 전구체를 암호화한다고 알려진 DNA 또는 RNA 분자와 혼성화하는 가를 결정하는 단계; 또는 인히빈이나 그 일부에 항혈청을 제공하는 단계 및 인히빈의 일부 또는 전체를 발현하는 숙주-벡터 조합체를 확인하는단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 분자의 대다수가 소나 인간의 게놈 DNA인 것을 특징으로하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (1) 하나 또는 그 이상이 인히빈의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체를 포함하는 아미노산 서열 또는 인히빈의 활성과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화한 RNA 분자의 대다수를 제공하는 단계, (2) DNA 분자의 라이브러리를 제조하기 위해 상기 RNA 분자에 대응하는 DNA 분자를 합성하는 단계, (3) 재조합 클로닝 벡터를 제조하기 위해 자율적인 복제 클로닝 벡터 속으로 상기 DNA 분자를 삽입시키는 단계, (4) 단계(3)의 재조합 클로닝 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계, (5) 인히빈의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체나 인히빈의 활성과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화한 삽입된 DNA 분자로 형질전환된 숙주세포를 선별하는 단계, (6) 상기 단계(5)의 형질전환된 숙주의 클로닝 벡터내에 포함된 삽입된 DNA 분자를 확인하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 RNA 분자의 대다수는 인간이나 소의 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 본질적으로 실시예를 참고로 하여 이제까지 서술된 바와 같이 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질이 전체, 일부 또는 전구체를 암호화한 RNA 또는 DNA 분자를 선별하는 방법.
6. 제3항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 프로브가 단계(5)에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.

   

   
7. 재조합 DNA 분자의 제조방법에 있어서, 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드의 전체, 일부, 유사체 동족체 또는 전구체를 암호화한 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 분자를 제공하는 단계, 및 상기 DNA 분자를 벡터 DNA에 삽입하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 벡터 DNA는 박테리아 플라스미드, 박테리오파지 또는 생체외 진핵세포에서 또는 모든 유기체에서 복제할 수 있는 플라스미드나 바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 DNA 분자를 발현조절 서열을 지닌 올바른 리딩프레임에서 벡터 DNA에 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 DNA 분자를 대장균의 β-갈락토시다제 유전자에 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 인히빈의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체를 포함하는 폴리펩티드 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드의 생합성 방법에 있어서, 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체를 암호화한 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 삽입체에 의해 특정지어지는 재조합 DNA 분자를 제공하는 단계; 하기 숙주가 인히빈이거나 인히빈과 유사한 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체를 포함하는 단백질성 생성물을 발현할 수 있도록 상기 재조합 DNA 분자로 숙주를 형질전환시키는 단계; 상기 발현을 달성하기 위해 상기 숙주를 배양하는 단계; 및 상기 단백질성 생성물을 수집하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 단백질성 생성물은 봉입체로 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 단백질성 생성물은 소나 인간 인히빈의 43kD, 20kD, 또는 15kD 소단위와 그들의 실제적인 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 단백질성 생성물은 제5도의 -60 내지 166 아미노산 서열, 제5도의 -10 내지 166 아미노산 서열, 제7도의 1 내지166 아미노산 서열, 제7도의 -61 내지 171 아미노산 서열, 제7도의 -10 내지 171 아미노산 서열, 제7도의 1 내지 171 아미노산 서열 또는 그것의 생물학적등가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제3항에 있어서, 상기의 삽입되는 DNA 분자는 인히빈의 43kD 소단위를 암호화한 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제3항에 있어서, 상기의 삽입되는 DNA 분자는 인히빈의 20kD 소단위를 암호화한 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제3항에 있어서, 상기의 삽입되는 DNA 분자를 인히빈의 15kD 소단위를 암호화한 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제3항에 있어서, 상기의 삽입되는 DNA 분자는 제5도의 -60 내지 166 아미노산 서열, 제5도의 -10 내지 166 아미노산 서열, 제7도의 1 내지166 아미노산 서열, 제7도의 -61 내지 171 아미노산 서열, 제7도의 -10 내지 171 아미노산 서열, 제7도의 1 내지 171 아미노산 서열 또는 그것의 생물학적등가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제3항에 있어서, 상기의 삽입되는 DNA 분자는 본질적으로 제5, 6, 7 및 8도의 어느 하나를 참고하여 이제까지 기술한 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제6항에 있어서, 상기 프로브는 방사성동위원소로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제7항에 있어서, 상기 벡테는 pBTR322, pUR290, pUR291, pUR292, pBTA286, pUC7, pUC8, pUC9, pUC13, ptrpL1, pWT111, pWT121 또는 pWT131로부터 선택되는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제9항에 있어서, 상기의 발현조절 서열은 대장균의 β-갈락토시다제 유전자, trp오페론, 박테리오파지 λ의 좌측 프로모터 또는 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기의 발현조절 서열은 프로모터 및 번역개시신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 인히빈의 전체, 일부, 전구체, 유사체 또는 동족체, 또는 인히빈과 유사한 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 숙주를 형질전환시키는 방법에 있어서, 적절한 숙주를 제공하는 단계, 및 제7항 내지 제10항, 제21항 내지 제23항중의 어느 한항의 방법으로 제조된 재조합 DNA 분자를 상기 숙주에 삽입시키는 단계를 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 숙주는 박테리아 세포, 효모, 박테리오파지, 및 척추동물 세포 및 식물 세포를 포함하는 진핵세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제24항에 있어서, 형질전환된 숙주는 글리코실화되지 않은 형태로 인히빈의 43kD, 20kD 또는 15kD 소단위를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 인히빈의 43kD, 20kD 및 15kD 소단위는 인간 또는 소의 인히빈 형태와 서열이 일치하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제24항에 있어서, 형질전환된 숙주는 제5도의 -60 내지 166 아미노산 서열, 제5도의 -10 내지 166 아미노산 서열, 제7도의 1 내지 166 아미노산 서열, 제7도의 -61 내지 171 아미노산 서열, 제7도의 -10 내지 171 아미노산 서열, 제7도의 1 내지 171 아미노산 서열 또는 그것의 생물학적 등가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 생식선 기능 또는 생식적 생리기능에 영향을 미치는 방법에 있어서, 제11항 내지 제14항중의 어느 한항의 방법으로 제조된 발현 생성물을 인간을 제외한 척추동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
30. 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체에 대한 항체의 제조방법에 있어서, 인히빈이거나 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체로 척추동물을 면역학적으로 공격하는 단계, 및 그와 같이 생산된 항체를 분리하는 단계로 이루어지는 방법.
31. 인간을 제외한 척추동물의 다산성을 증가시키는 방법에 있어서, 제30항의 방법으로 제조된 항체를 인간을 제외한 척추동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
32. 인간을 제외한 척추동물의 다산성을 증가시키는 방법에 있어서, 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체로 인간을 제외한 척추동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
33. 인간을 제외한 척추동물에서 성적 성숙의 획득을 감소시키거나 주기적인 발정 정지기를 단축 또는 제거하는 방법에 있어서, 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체로 인간을 제외한 척추동물을 면역시키는 것을 포함하는 방법.
34. 인간을 제외한 척추동물에서 발정정지기 상태를 유도하는 방법에 있어서, 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체를 인간을 제외한 척추동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
35. FSH 수준을 감소기키거나 없애는 방법에 있어서, 인히빈이거나 또는 인히빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 단백질의 전체, 일부, 유사체, 동족체 또는 전구체를 인간을 제외한 척추동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.

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