CN115066256A - 用于动物绝育或阉割的重组蛋白及包含该重组蛋白的疫苗组合物 - Google Patents
用于动物绝育或阉割的重组蛋白及包含该重组蛋白的疫苗组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于动物绝育或阉割的疫苗组合物，其包含其中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和促性腺激素释放激素(GnRH)的重组蛋白。更具体地，提供了：用于动物绝育或阉割并用于诱导针对GnRH的抗体的重组蛋白；用于生产重组蛋白的重组载体；用于动物绝育或阉割的疫苗组合物，该疫苗组合物包含该重组蛋白；以及通过使用该疫苗组合物进行动物绝育或阉割的方法。根据本发明的疫苗组合物在个体中诱导针对GnRH的抗体，从而使其卵巢或睾丸萎缩。因此，本发明能够以低成本、高安全性和最小的副作用来替代用于绝育和阉割的外科手术，并有益地用于动物绝育或阉割。
Description
技术领域
本发明涉及用于动物绝育的疫苗组合物，更特别是涉及用于动物绝育以诱导抗促性腺激素释放激素(GnRH)抗体的重组蛋白、用于产生该重组蛋白的重组载体、用于动物绝育的包括该重组蛋白作为活性成分的疫苗组合物，以及使用该疫苗组合物的绝育方法。
本申请要求2020年3月24日提交的韩国专利申请号10-2020-0035898的优先权和权益，该韩国专利申请的公开内容并入说明书中，其附图通过引用以其整体并入本文。
背景技术
绝育是切除动物的性腺以消除生殖功能，并且是指通过切除雄性的睾丸或雌性的卵巢来使促性腺激素的分泌被切断，因而发生不孕不育并且第二性征不出现或退化的现象。绝育是为增加医学、生物学和畜牧业的研究和实用价值的目的而进行的。特别是在畜牧业中，主要对雄性进行绝育，不仅是为了治疗动物疾病，而且是为了增加其实用价值，这是因为卵巢切除极其困难且效果较差。已经受绝育的雄性动物性情温和温顺，由于失去繁殖能力能够将雄性和雌性动物一起饲养，肌肉纤维更细更软，从而提高肉质，并增加血肉与骨头的附着率，变得更薄，就像雌性动物一样。此外，绝育可降低公猪异味的产生，从而减少雄性气味。
绝育方法包括阴囊切开、精索静脉结扎、睾丸扭转、阴囊根部结扎、睾丸挤出、部分去势和无血去势(Burdizzo法)等手术方法，还包括对放射线的性腺施加一定量的放射线以使其失去能力的方法。然而，身体绝育在动物福利方面存在问题，因为它会给动物带来非常严重的疼痛和压力，因此瑞士、挪威、比利时和荷兰等欧洲国家在2009年左右决定禁止对动物进行身体绝育，韩国也在考虑采取与之类似的行动。
因此，最近，作为解决绝育手术问题的方法，正在积极研究使用疫苗的绝育方法。大多数使用疫苗的绝育方法是使用能够诱导对GnRH免疫反应的蛋白质进行的，这是因为从下丘脑分泌的GnRH刺激促卵泡激素释放激素(FSH)和促黄体激素(LH)从脑垂体的分泌。FSH促进卵泡成熟、雌激素分泌和精子发生，并且LH促进生殖器官的发育、睾酮分泌和排卵。此外，LH和FSH刺激雄性动物睾丸分泌雄烯酮，而雄烯酮在脂肪组织中积累，从而产生公猪异味。
作为迄今为止开发的绝育疫苗，有Improvac(辉瑞公司)，但它的缺点是不能诱导强烈的免疫反应。因此，本发明人在研究开发诱导比常规绝育疫苗更强的免疫反应的疫苗的同时，证实了本发明的CTB-GnRH重组蛋白具有优于常规已知绝育疫苗的抗原性，从而表现出优异的抗GnRH的抗体形成作用和由此产生的对动物性成熟的强抑制作用，从而完成了本发明。
发明内容
[技术问题]
提供本发明以解决上述常规技术问题，开发了一种疫苗，其包括与载体蛋白融合以人工提高促性腺激素释放激素(GnRH)的抗原性的用于动物绝育的重组蛋白，从而本发明完成。
因此，本发明旨在提供一种用于动物绝育的疫苗组合物，其包含重组蛋白作为活性成分，在该重组蛋白中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和n个拷贝的促性腺激素释放激素(GnRH)，其中n是从1到20的整数。
本发明还涉及提供一种动物绝育的方法，该方法包括将根据本发明的疫苗组合物给药到除人之外的动物中。
本发明还旨在提供一种用于动物绝育的重组载体，其包含由SEQ ID NO：3的碱基序列组成的GnRH基因和由SEQ ID NO：5的碱基序列组成的CTB基因。
本发明还涉及提供使用根据本发明的重组载体制备的用于动物绝育的重组蛋白。
本发明还涉及提供用根据本发明的重组载体转化的转化体。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域普通技术人员将通过以下描述充分理解本文未描述的其他问题。
[技术方案]
为实现上述本发明的目的，本发明提供一种用于动物绝育的疫苗组合物，其包含重组蛋白作为活性成分，在该重组蛋白中融合有CTB和n个拷贝的GnRH，其中n为从1到20的整数。
本发明还提供一种绝育方法，其包含将一种包括重组蛋白作为活性成分的疫苗组合物给药至除人之外的对象，在该重组蛋白中融合有CTB和n个拷贝的GnRH，其中n是1至20的整数。
本发明还提供了重组蛋白用于绝育的用途，在该重组蛋白中，融合有CTB和n个拷贝的GnRH并且n为1至20的整数。
此外，本发明提供了重组蛋白在制备用于绝育的疫苗中的用途，在该重组蛋白中融合有CTB和n个拷贝的GnRH并且n是1至20的整数。
在本发明的一个实施方案中，GnRH可以由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，CTB可以由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
在本发明的又一实施方案中，n可以为6，但本发明不限于此。
在本发明的又一个实施方案中，当n为6时，GnRH可以由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
在本发明的又一个实施方案中，当n为2或更大时，GnRH可以使用丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸接头相互连接，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中，在重组蛋白中，可以进一步融合猪Fc片段(pFc2)。
在本发明的另一个实施方案中，pFc2可以由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
在本发明的又一实施方案中，CTB可以在GnRH的N端方向融合，并且pFc2可以在GnRH的C端方向融合，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中，在重组蛋白中，可以进一步融合伴侣结合蛋白(BiP)。
在本发明的另一实施方案中，BiP可由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
在本发明的又一实施方案中，CTB可以在GnRH的N端方向融合，BiP可以在CTB的N端方向融合，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中，在重组蛋白中，His-Asp-Glu-Leu(HDEL)可以进一步融合。
在本发明的另一实施方案中，HDEL可以由SEQ ID NO：11的碱基序列编码，但本发明不限于此。
在本发明的又一实施方案中，CTB可以在GnRH的N端方向融合，并且HDEL可以在GnRH的C端方向融合，但本发明不限于此。
另外，在本发明的一个实施方式中，在重组蛋白中，BiP、CTB、GnRH、pFc2和HDEL可以依次融合，但本发明不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，重组蛋白可以由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中，疫苗组合物可以进一步包括佐剂。
在本发明的另一个实施方案中，佐剂可以是基于乳化剂的佐剂，但本发明不限于此。
此外，本发明提供一种动物绝育的方法，其包括将根据本发明的疫苗组合物给药到除人之外的动物中。
在本发明的一个实施方案中，动物可以是狗、鲸鱼、猫、大猩猩、鹅、豚鼠、野鸡、骆驼、獐鹿、骡子、鸡、驴、海豚、猪、美洲驼、马、水牛、鹿、家牛、驯鹿、羊驼、牦牛、绵羊、山羊、猩猩、鸭子、猴子、雪貂、大鼠、火鸡、鸵鸟或兔子，但本发明不限于此。
此外，本发明提供了一种用于动物绝育的重组载体，其包括由SEQ ID NO：3的碱基序列组成的GnRH基因和由SEQ ID NO：5的碱基序列组成的CTB基因。
在本发明的一个实施方案中，重组载体可以进一步包括编码由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的pFc2的多核苷酸，但本发明不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，重组载体可以进一步包括编码由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的BiP的多核苷酸，但本发明不限于此。
在本发明的又一个实施方案中，重组载体可以进一步包括由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的HDEL基因，但本发明不限于此。
在本发明的又一个实施方案中，重组载体可以包括编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多核苷酸或SEQ ID NO：13的碱基序列，但本发明不限于此。
此外，本发明提供了一种用于动物绝育的重组蛋白，其使用根据本发明的重组载体制备。
此外，本发明提供了一种转化体，其用根据本发明的重组载体进行转化。
[有利效果]
本发明涉及一种用于动物绝育的疫苗组合物，其包含其中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和促性腺激素释放激素(GnRH)的重组蛋白。包含GnRH多肽序列的重组蛋白用于在施用疫苗组合物的受试者中诱导抗GnRH的抗体，并由此证实了卵巢和睾丸萎缩作用。因此，本发明可以有效地用于动物绝育，成本低，安全性高，副作用小。
附图说明
图1示出了用于制备根据本发明一实施方案的重组GnRH蛋白的表达盒(BiP，伴侣结合蛋白；CTB，霍乱毒素B亚基；pFc2，猪Fc片段；HDEL，组氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸)。
图2为分离和纯化根据本发明一实施方案的重组GnRH蛋白的结果。
图3示出了将含有根据本发明一实施方案的重组GnRH蛋白的疫苗组合物给药至雄性大鼠的时间表。
图4示出了在将含有根据本发明一实施方案的重组GnRH蛋白的疫苗组合物给药至雄性大鼠3次后通过摘取睾丸进行的睾丸大小的比较。
图5示出了在将含有本发明一实施方案的重组GnRH蛋白的疫苗组合物给药至雄性大鼠3次后测量血液中的睾酮浓度的结果，上图和中图示出了标准，而下图示出了测量每个组的结果。
图6示出了将含有根据本发明一实施方案的重组GnRH蛋白的疫苗组合物给药至雌性大鼠的时间表。
图7和图8示出了根据本发明一实施方案，为了确认抗GnRH的抗体是否由根据本发明一实施方案的绝育疫苗产生而进行的血清抗原-抗体反应的结果，其中图7示出了施用含有CTB-GnRH的疫苗组合物的结果，并且图8示出了施用含有Fe-GnRH的疫苗组合物的结果。
图9示出了在将根据本发明一实施方案的含有重组GnRH蛋白的疫苗组合物给药至雌性大鼠3次之后通过摘取卵巢来比较卵巢的大小。
具体实施方式
发明人分析了将重组促性腺激素释放激素(GnRH)蛋白接种到4周大的雄性和雌性大鼠后睾丸或卵巢的大小和重量的变化以及血液中性激素浓度的变化。结果，通过确认接种了本发明的重组GnRH蛋白的组与对照组相比，睾丸或卵巢的大小和重量减少，血液性激素浓度降低，从而确认了包括根据本发明的重组GnRH蛋白的疫苗组合物具有绝育效果。这样，完成了本发明。
因此，本发明可以提供一种用于动物绝育的疫苗组合物，其包含重组蛋白作为活性成分，在该重组蛋白中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和n拷贝促性腺激素释放激素(GnRH)，其中n是从1到20的整数。
本文使用的术语“霍乱毒素B亚基(CTB)”是指对宿主细胞具有结合活性的多肽，优选由包括SEQ ID NO：5的碱基序列的多核苷酸编码，最优选由通过SEQ ID NO：5表示的多核苷酸编码。然而，多核苷酸由与SEQ ID NO：5的碱基序列具有80％或更多，更优选90％或更多，甚至更优选95％或更多的序列同源性的碱基序列编码。例如，多核苷酸具有与SEQ IDNO：5的碱基序列的例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。与多核苷酸的“％序列同源性”是通过比较两个优化排列的序列和一个比较区来鉴定的，以及该比较区的部分多核苷酸序列可具有与参考序列相比的添加或删除(即间隙)，以用于两个序列的最佳排列(不包括添加或删除)。霍乱毒素是A1和A2亚基以及五个B亚基的复合物，CTB与粘膜免疫系统的微褶皱细胞(M细胞)结合，以用于霍乱毒素的内化和激活。在此，CTB允许与CTB结合的A亚基或抗原蛋白在与细胞膜双层的GM1-神经节苷脂特异性结合后穿过细胞膜。CTB可用作有效的粘膜佐剂和载体分子，以通过增加穿过粘膜屏障的结合抗原的吸收和结合抗原的有效呈递来改善抗原的免疫原性，从而增强粘膜免疫。
本文使用的术语“多核苷酸”是指一种寡聚物或聚合物，其包括通常通过磷酸酯键连接的两个或更多个核苷酸或其衍生物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸还包括例如核苷酸类似物，以及具有除磷酸二酯键之外的“主链”键[例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)]的DNA和RNA衍生物。多核苷酸包括单链和/或双链多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及RNA和DNA中任一种的类似物。
本文使用的术语“GnRH”是指促性腺激素释放激素，优选为由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的GnRH，但可以使用任何可以诱导对GnRH的免疫反应的物质，而没有限制。此外，作为本发明的GnRH，SEQ ID NO：1的变体包括在本发明的范围内。具体地，肽可以包括与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有80％或更多、更优选90％或更多的序列同源性的氨基酸序列。GnRH由10个氨基酸组成，已知由所有动物体内的几乎相同的氨基酸组成。GnRH在下丘脑中产生并作用于脑垂体以促进性激素FSH和LH的产生，并且在以GnRH为抗原给动物接种后，形成识别GnRH的抗体，并且该抗体将存在于体内的GnRH去除，从而阻止雄性和雌性动物的性成熟并引起绝育作用。
本文使用的术语“重组蛋白”或“融合重组蛋白”是指呈两个或更多个人工连接的蛋白质形式的蛋白质，并且在本发明中，它是指CTB和GnRH连接形式的蛋白质。融合重组蛋白可以在确定每个伙伴蛋白后通过化学合成获得，或通过基因重组方法表达和纯化。优选地，它可以通过在细胞表达系统中表达融合基因来获得，在该融合基因中连接了编码CTB的多核苷酸和编码GnRH的多核苷酸。
在本发明的重组蛋白中使用的GnRH优选具有两个或多个拷贝而不是一个拷贝的GnRH氨基酸序列。由于当GnRH具有多个拷贝时可进一步增强针对GnRH的免疫原性，所以GnRH的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：1的氨基酸序列可以采用两个或多个多聚体的形式。GnRH拷贝数没有特别限制，只要它可以容纳在表达载体中即可。优选地，连接2至20个，更优选2至10个拷贝的GnRH以采取多聚体的形式，甚至更优选地，连接6个拷贝的GnRH以采取六聚体的形式。在本发明的一示例性实施方案中，重组蛋白是通过成排地重复六个GnRH蛋白来制备的。其中连接有六个GnRH的多肽可以由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
另外，在融合重组蛋白等中，CTB和GnRH可以直接连接，也可以通过接头等氨基酸连接体彼此连接。此外，即使包括多个GnRH拷贝，每个GnRH也可以直接连接，或通过诸如接头等的连接体彼此连接。当GnRH拷贝通过接头连接时，优选不降低由此引起的总体免疫原性。
本文使用的术语“接头”是指一种肽，其插入蛋白质之间，使得当通过连接CTB和GnRH形成重组蛋白时，或者当多个GnRH拷贝连接时，通过增强这些蛋白质的结构灵活性可以改善每种蛋白质的活性。只要接头可以使免疫反应最小化，对氨基酸的类型或数量就没有限制，但优选使用1至20个氨基酸，更优选使用1至5个氨基酸。在本发明的示例性实施方案中，为了将每种蛋白质彼此连接，使用载体的多克隆位点中的限制酶位点的序列，或丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(AGA)接头。
本文使用的术语“疫苗”是指含有在活体内引起免疫反应的抗原的生物制剂，并且是指一种免疫原，其通过注射或口服给药至动物来产生免疫以预防感染或诱导针对特定抗原的抗体。该动物是非人动物，下文将列出其示例。
本文使用的术语“疫苗组合物”可在按照常规方法制成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或气雾剂等口服制剂和无菌注射液后使用。在制剂的情况下，疫苗组合物可以与常规使用的稀释剂或赋形剂，例如填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂一起制备。用于口服给药的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，并且这种固体制剂可以通过将赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶)中的至少一种混合来制备。另外，除了单纯的赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁和滑石等润滑剂。作为用于口服给药的液体制剂，可以使用混悬剂、内服液体、乳剂或糖浆，以及常用的简单稀释剂(例如水或液体石蜡)，并且可以包括各种类型的赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂可以是无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂或栓剂。作为非水溶剂或混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油，或者油酸乙酯等注射用酯。
根据本发明的疫苗组合物的给药途径可以包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠给药。优选口服或肠胃外给药。本文使用的术语“肠胃外”意指皮下、静脉内、肌肉内、关节内、囊内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明的疫苗组合物可以以用于直肠给药的栓剂的形式给药，但不限于上文所列出的给药方法，并且活性物质可以通过任何能够将其递送至靶细胞的装置来给药。根据本发明的疫苗组合物可以诱导体液或任选的细胞介导的免疫反应和/或两种免疫反应的组合。
考虑到受试者的年龄、体重、性别和身体状况来选择根据本发明的疫苗组合物的剂量。在没有任何副作用的情况下在受试者中诱导免疫反应所需的量可以根据用作免疫原和赋形剂的任何重组蛋白的存在而变化。
同时，根据本发明的用于动物绝育的疫苗组合物可以由抗原、药学上可接受的载体、合适的佐剂和其他常规物质组成，并且以免疫学有效量给药。本文使用的术语“免疫有效量”是指足以在动物中产生绝育作用的量和足以不引起副作用或严重或过度免疫反应的量，并且确切的给药浓度可取决于待给药的特定的免疫原并且可以由本领域普通技术人员使用已知的测试免疫反应进展的方法来确定的。此外，给药浓度可根据剂型和途径、接受者的年龄、健康和体重、症状的特征和严重程度、当前治疗的类型和治疗次数而变化。
另外，在根据本发明的重组蛋白中，可以进一步融合猪Fc片段(pFc2)。pFc2可以在GnRH的C端方向融合，但本发明不限于此。
本文使用的术语“Fc片段”是指免疫球蛋白中的一部分，该部分具有仅通过S-S键连接的重链(H链)并且在被木瓜蛋白酶消化时没有抗原结合位点，该Fc片段优选为猪Fc片段，更优选由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的猪Fc片段，但它就没有限制，只要是在与重组蛋白融合时增加重组蛋白的表达水平和溶解度的Fc片段即可。此外，作为本发明的Fc片段，SEQ ID NO：6的变体包括在本发明的范围内。具体地，肽可以包括与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有90％或更多，更优选95％或更多，最优选98％或更多的序列同源性的氨基酸序列。
此外，在根据本发明的重组蛋白中，可以进一步融合伴侣结合蛋白(BiP)。BiP可以在GnRH或CTB的N端方向上融合，但本发明不限于此。
术语“伴侣结合蛋白(BiP)”用于将表达的重组蛋白移动至内质网，优选地，可以不受限制地使用由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的BiP，或当与重组蛋白融合时将重组蛋白移动至内质网的BiP。此外，作为本发明的BiP，SEQ ID NO：8的变体包括在本发明的范围内。具体地，肽可以包括与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有90％或更多，更优选95％或更多，最优选98％或更多的序列同源性的氨基酸序列。BiP可以在表达期间或之后被截短，以便仅保留部分肽。
此外，根据本发明的重组蛋白可以进一步与His-Asp-Glu-Leu(HDEL)融合。HDEL可以在GnRH或pFc2的C端方向融合，但本发明不限于此。
本文使用的术语“HDEL”是指由组氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸组成的靶肽序列，并且HDEL阻止重组蛋白从内质网分泌，或允许重组蛋白稳定维持在内质网中。HDEL可以由SEQ ID NO：11的碱基序列编码，但本发明不限于此。
此外，根据本发明的重组蛋白可以通过依次融合BiP、CTB、GnRH、pFc2和HDEL来制备，因此该重组蛋白可以由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成，但本发明不受融合序列或氨基酸序列的限制。
另外，根据本发明的疫苗组合物对狗或猫有优异的绝育效果。
此外，根据本发明的疫苗组合物可以包括一种或多种用于改善或增强免疫反应的佐剂。
本文使用的术语“佐剂”是指添加到疫苗或药物活性成分中以增加或影响免疫反应的材料或组合物。代表性地，佐剂通常意指用于免疫原和/或其他药物活性材料或组合物的载体或辅助材料。通常，术语“佐剂”应以广义解释，是指能够增强掺入或施用于佐剂的抗原的免疫原性的范围广泛的物质或策略。此外，佐剂可以包括但不限于分类为免疫增强剂、抗原递送系统及其组合。合适的佐剂的示例可以包括氢氧化铝、弗氏完全或不完全佐剂、DEAE葡聚糖、左旋咪唑、PCG和聚I:C或聚A:U。在本发明的一个实施方案中，作为基于Emulsigen的佐剂，使用了包括溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)的Emulsigen-D佐剂。
根据本发明的重组蛋白不仅包括具有野生型氨基酸序列的蛋白质，而且包括融合重组蛋白的变体。重组蛋白的变体意指由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而具有与正常氨基酸序列不同的序列的蛋白质。不会整体改变分子活性的在蛋白质或肽水平上的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath等人,1979)。此外，重组蛋白可以通过磷酸化、甲基化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化或法呢基化进行修饰。变体或修饰形式是表现出与天然蛋白质相同的生物活性的功能等价物，但如果需要，可以是其性质被修饰的蛋白质的变体或修饰形式。优选地，变体或修饰体是由氨基酸序列的变化和修饰引起的具有增强的耐热或pH结构稳定性或增强的活性的蛋白质。
根据本发明的重组GnRH蛋白可以化学合成或通过基因重组法产生，优选通过使用重组载体对宿主细胞转化而表达的蛋白质进行分离和纯化而产生。
因此，本发明的另一方面可以提供一种用于动物绝育的重组载体，其包括由SEQID NO：3的碱基序列组成的GnRH基因和由SEQ ID NO：5的碱基序列组成的CTB基因。
重组载体是插入有外源DNA片段的载体，一般是指双链DNA片段。本文使用的“外源DNA”意指来源于外来物种的DNA，或者当来源于同一物种时，指实质上由原始形式修饰而得的形式，外源基因是要转录的特异性靶核酸，其编码多肽。为了提高转化基因在宿主细胞中的表达水平，在重组载体中，相应的基因必须与转录和翻译表达调控序列有效连接，以在选定的表达宿主中发挥功能。重组载体是一种基因构建体，其包括可操作地连接以允许在受试者细胞中表达基因插入物的基本调节元件，并且为了制造这种基因构建体，可以使用标准的重组DNA技术。重组载体的类型不受特别限制，只要它用以在原核细胞、真核细胞等所有宿主细胞类型中表达靶基因和生产靶蛋白质即可，并且优选地是能够生产具有与自然状态相似的形式的大量外源蛋白同时确保有效的启动子和强大的表达能力的载体。优选地，重组载体至少包括启动子、起始密码子、编码靶蛋白的基因、终止密码子和终止子。此外，可以适当地包括编码信号肽、增强子序列、靶基因的5'末端和3'末端的非翻译区(UTR)、可选择的标记区或可复制单元的DNA。
在本发明一示例性实施方案中，通过将CTB基因片段插入包含6个拷贝的GnRH基因片段的pCAMBIA13000载体中而制备的重组载体被转化到烟草植物(Nicotianabenthamiana)中。该载体具有35S启动子和热激蛋白(HSP)终止子系统，是用于在烟草植物中大量生产蛋白质的有用载体。
本文使用的术语“载体”是指含有可操作地连接到能够在合适宿主中表达DNA的合适调节序列的DNA序列的DNA构建体。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单地是潜在基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以复制和发挥作用，而与宿主基因组无关，或者在某些情况下，可以整合到基因组本身中。由于质粒是最常用的载体类型，因此术语“质粒”和“载体”有时可以互换使用。然而，本发明包括具有本领域已知或将要已知的等效功能的其他类型的载体。
此外，在本发明中，重组载体可以进一步包括一种或多种序列，该序列选自由以下项组成的群组：编码由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的pFc2的多核苷酸、编码由SEQ IDNO：8的氨基酸组成的BiP的多核苷酸，以及由SEQ ID NO：11的碱基序列组成的HDEL基因。
本发明的另一方面提供了使用根据本发明的重组载体制备的用于动物绝育的重组蛋白。
本发明的又一方面提供了一种用根据本发明的重组载体进行转化的转化体。
本文使用的术语“转化”是通过引入的DNA改变生物体遗传特性的总称，“转基因生物或转化体”是通过分子遗传学方法注入外部基因而产生的生物，优选由本发明的重组载体转化的生物体。该生物体不受限制，只要其用于实现本发明的目的即可。
本发明的又一方面提供了一种动物绝育的方法，该方法包括将根据本发明的疫苗组合物给药到除人之外的动物中。
使用本发明的疫苗组合物的绝育方法可以适用于除人以外的所有动物，而与动物种类无关。动物优选为哺乳动物，例如，动物可以是狗、鲸鱼、猫、大猩猩、鹅、豚鼠、野鸡、骆驼、狍、骡子、鸡、驴、海豚、猪、美洲鸵、马、水牛、鹿、家牛、驯鹿、羊驼、牦牛、绵羊、山羊、猩猩、鸭子、猴子、雪貂、大鼠、火鸡、鸵鸟或兔子，但本发明不限于此。
在本发明的方法中，优选进行两次或多次给药。例如，在初始接种后，可以以1至10周的间隔进行1至4次加强注射，但这可以由本领域普通技术人员根据相应动物的类型进行适当修改。
说明书和权利要求书中使用的术语和词语不应被解释为仅限于一般或字典术语的含义，而应根据本发明人适当地定义术语的概念以便以最佳方式解释本发明的原理，按照本发明的技术思想的含义和概念进行解释。
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性示例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，而不是限制本发明。
实施例
实施例1：BiP-CTB-GnRH-pFc2-HDEL融合蛋白的表达和纯化
为了诱导针对GnRH的免疫原性，如图1所示，制备了用于表达重组GnRH的载体，在该重组GnRH中，CTB、pFc2、BiP和HDEL与GnRH融合。由10个氨基酸组成的六个GnRH各自由丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(AGA)接头连续连接。重复6次的GnRH的氨基酸序列和碱基序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。此外，CTB的氨基酸序列和碱基序列分别在SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中示出，pFc2的氨基酸序列和碱基序列分别在SEQ ID NO：6和SEQ ID NO:7中示出,BiP的氨基酸序列和碱基序列分别在SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中示出，HDEL的氨基酸序列和碱基序列分别在SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中示出，并且表达盒的总氨基酸序列和碱基序列分别在SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中示出。
通过用上述载体转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种烟草植物的叶子来诱导瞬时表达。在从植物叶子中提取总蛋白并离心后，使用配备有蛋白A-琼脂糖柱的AKTA prime(美国GE Healthcare)分离溶液中的可溶性蛋白，从而获得pFc2融合的GnRH蛋白。
实施例2：重组GnRH蛋白浓度的确认
为了确认和测定实施例1中分离且纯化的重组GnRH蛋白的浓度，以已知浓度的牛血清白蛋白(BSA)为标准，接着进行SDS-PAGE。分离且纯化的重组GnRH蛋白以1和2μl加载，并且分别加入0.5、1和2μg的BSA进行定量。凝胶通过考马斯蓝染色法染色，最终鉴定出条带。
结果，如图2所示，确认重组GnRH蛋白表达、分离且纯化良好，GnRH重组蛋白的浓度大约为2μg/μl。如上所述鉴定的重组GnRH蛋白用于实施例3和4的动物试验。
实施例3：重组GnRH蛋白雄性给药效果的确认
3.1.实验动物、给药条件和时间表
为了确认重组GnRH蛋白的绝育效果，在下表1中列出的给药条件下，根据图3所示的时间表将包含根据本发明的重组GnRH蛋白的疫苗组合物给药到4周龄雄性SpragueDawley(SD)大鼠中。作为对照，施用等量的磷酸盐缓冲液(PBS)，对实验组施用100μg/180μl的疫苗组合物和20μl的
佐剂(见下表1)。在将所提供的4周龄大鼠驯化大约4天后，以14或15天的间隔总共进行3次给药。给药前和实验结束时采血，在第3次给药后4周，摘取睾丸以测量重量和大小，并且测定血液中睾酮的浓度。
[表1]
3.2.睾丸的目测评价
在根据本发明的疫苗组合物的第三次给药后4周，摘取睾丸进行目测评价。结果示于下表2和图4中。
[表2]
参考表2和图4，与未接种的对照组相比，确认了在施用含有重组GnRH蛋白的疫苗组合物的接种组中睾丸的重量和长度显著减少。此外，从重量比率可以确认，在接种组中睾丸重量相对于受试者总体重的比率显著降低，接种组的平均睾丸长度也为与未接种疫苗组相比的64％到86％。
上述结果证实，通过施用包含根据本发明的重组GnRH蛋白的疫苗组合物成功地对动物进行了绝育。
3.3.针对睾酮的ELISA结果
在第三次施用根据本发明的疫苗组合物后4周，采集血液以测量血液中睾酮的浓度。根据制造商的方案，使用ELISA试剂盒(Elabscience)进行测量。具体地，将50μL的血清加入睾酮涂覆板中，并立即加入等量的生物素化检测抗体。将反应物于37℃反应45分钟，用350μL的洗涤缓冲液洗涤3次。随后，加入100μL的HRP偶联物溶液，然后于37℃孵育30分钟。以与上述相同的方式洗涤5次后，加入90μL的底物溶液并于37℃孵育15分钟。之后，加入50μL的反应终止液，通过ELISA机在450nm波长处测定OD值。为了量化血液中睾酮的实际量，通过包括0.1、0.4、1.6、5和20ng/ml的睾酮标准蛋白来进行反应。用如上获得的OD值制作标准曲线图，并通过代入上面获得的样本的OD值来量化睾酮。结果示于下表3和图5中。
[表3]
结果，如表3和图5所示，与未接种的对照相比，施用了包含重组GnRH蛋白的疫苗组合物的接种组显示出血液中的睾酮浓度的显著降低。
该结果与实施例3.2的结果一致，证实了通过施用包含根据本发明的重组GnRH蛋白的疫苗组合物成功地完成了绝育。
实施例4：重组GnRH蛋白雌性给药的效果确认
4.1.实验动物、给药条件和时间表
为了确认重组GnRH蛋白的绝育效果，在下表5中列出的给药条件下，根据图7所示的时间表将包含根据本发明的重组GnRH蛋白的疫苗组合物给药至4周龄雌性SpragueDawley(SD)大鼠。作为对照，施用相同量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而向对照组施用包含与Fe而非与CTB融合的蛋白质的100μg/180μl的疫苗组合物和20μl的
佐剂。向实验组施用100μg/180μl的根据本发明的疫苗组合物和20μl的
佐剂(见下表5)。以14天或7天的间隔将疫苗给药至4周龄的大鼠总共3次。给药前和实验结束时采血，在第3次给药后3周，摘取卵巢以测量体重和大小，并且测定血液中孕酮和雌二醇的浓度。
[表4]
4.2.通过GnRH确认抗体形成
为了确认根据本发明的绝育疫苗是否产生了针对GnRH的抗体，分别用50和25ng/孔的GnRH抗原涂覆96孔板。作为对照，使用从注射了相同量的PBS的大鼠获得的血清。
作为一抗，将施用了CTB-GnRH或Fe-GnRH的大鼠的血清以1:100的比率稀释，然后于37℃反应2小时。之后，处理抗大鼠二抗(1:5000)，然后处理显色物质3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
结果，如表5和6以及图7和8所示，CTB-GnRH和Fe-GnRH两者均显示出反应性，证实成功产生了针对GnRH的抗体。
[表5]
[表6]
4.3.卵巢的目测评价
在根据本发明的疫苗组合物第3次给药后3周，摘取卵巢以进行目视观察。结果示于下表7和图9中。
如表7和图9所示，与未接种的对照相比，确认了在施用了包含重组GnRH蛋白的疫苗组合物的接种组中，卵巢的重量和长度显著减少。即，从重量比率可以确认，在两个接种组中，卵巢的重量相对于受试者总体重的比率均显著降低，卵巢的长度也为与未接种组相比的67％到89％。
特别是与Fe-GnRH相比，CTB-GnRH显示出更好的卵巢萎缩效果。当施用了Fe-GnRH时，接种组的长度比率平均为83％，而当施用了CTB-GnRH时，接种组的长度比率平均为74.6％。当施用了Fe-GnRH时，重量比率平均为0.019％，而当施用了CTB-GnRH时，重量比率平均为0.013％。
上述结果证实，通过施用包含根据本发明的重组CTB-GnRH蛋白的疫苗组合物成功地进行了绝育，并且当融合CTB而不非Fe时效果更优异。
本领域普通技术人员应当理解，以上对本发明的描述是示例性的，在不脱离本发明的技术精神或本质特征的情况下，本文公开的示例性实施方案可以容易地修改为其他具体形式。因此，上述示例性实施方案应被解释为说明性的而不是在任何方面的限制。
工业适用性
本发明涉及一种用于动物绝育的疫苗组合物，其包括其中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和促性腺激素释放激素(GnRH)的重组蛋白，并且将针对GnRH的抗体诱导到施用了包括GnRH的多肽序列的受试者中，从而确认卵巢和睾丸萎缩。因此，本发明能够以低成本、高安全性和最小的副作用而有效地用于动物绝育，因而有望具有很大的工业实用性。
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<120> 用于动物绝育或阉割的重组蛋白及包含该重组蛋白的疫苗组合物
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GnRH的氨基酸序列
<400> 1
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6X GnRH的氨基酸序列
<400> 2
Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp
20 25 30
Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly
35 40 45
Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
65 70 75
<210> 3
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6X GnRH的DNA序列
<400> 3
gcaggagcag aacattggtc ttacggtctt agacctggag ctggagctga acattggagt 60
tatggtttaa gacctggagc tggagctgaa cattggtctt atggacttag accaggtgca 120
ggtgctgagc attggtcata tggattgaga ccaggagctg gtgctgagca ttggtcttat 180
ggtctaagac ctggagctgg agctgaacat tggtcttacg gactcagacc cggt 234
<210> 4
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTB的氨基酸序列
<400> 4
Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln
1 5 10 15
Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala
20 25 30
Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe
35 40 45
Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala
50 55 60
Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala
65 70 75 80
Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile
85 90 95
Ala Ala Ile Ser Met Ala
100
<210> 5
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTB的DNA序列
<400> 5
actcctcaga acataaccga tttgtgcgct gaataccata acactcaaat acacacactc 60
aacgataaga ttttctctta cactgaatca cttgctggaa agagagagat ggcaattatc 120
acctttaaaa acggagctac tttccaggtt gaagtgcctg gtagtcaaca tatcgattca 180
cagaagaaag caatagagag gatgaaggat acacttagga ttgcttattt gaccgaagca 240
aaagttgaga aactctgtgt gtggaataac aaaacccctc acgctatcgc tgctatctct 300
atggcc 306
<210> 6
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pFc2的氨基酸序列
<400> 6
Arg Ala Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro
1 5 10 15
Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
35 40 45
Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp Leu Lys Gly
85 90 95
Lys Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser
130 135 140
Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu
145 150 155 160
Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe Gln Cys Ala
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Val Ser
210 215 220
Lys Thr Gln Gly Lys
225
<210> 7
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pFc2的DNA序列
<400> 7
gttggaagac catgccctat atgtcctgct tgtgaaggtc caggtccctc tgcttttata 60
ttcccaccaa agccgaagga taccttgatg atttcacgta caccacaagt tacttgtgtt 120
gttgtggatg tttcacaaga aaatcctgag gtacaattca gctggtatgt tgatggggta 180
gaagtgcaca ctgcacagac tcgaccaaag gaggcccagt ttaactcgac ttatagagtt 240
gtttctgttc tcccaatcca acacgaagat tggctgaagg gcaaggaatt tgaatgcaag 300
gttaacaata aagatctacc agcaccaatt accaggatta tttctaaggc aaaaggaccc 360
tccagagagc cccaagttta cacattgtct ccttctgctg aggagcttag tagaagtaaa 420
gtgagcatta cctgcttagt gacgggattc taccctccag acatcgacgt cgaatggaaa 480
tctaatggtc aacctgagcc agaaggtaac tataggacta ctccaccaca acaggacgtc 540
gatggcacat actttcttta ttcaaaactt gctgtcgata aggcaagttg gcaaagagga 600
gatccatttc agtgtgctgt aatgcatgag gctttgcata atcattatac acagaaatca 660
gtttctaaaa cacaagggaa a 681
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BiP的氨基酸序列
<400> 8
Ile Glu Glu Ala Thr Lys Leu
1 5
<210> 9
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BiP的DNA序列
<400> 9
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDEL的氨基酸序列
<400> 10
His Asp Glu Leu
1
<210> 11
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HDEL的DNA序列
<400> 11
cacgatgagc tc 12
<210> 12
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1300-BiP:CTB:GnRH:pFc2:HDEL的全氨基酸序列
<400> 12
Ile Glu Glu Ala Thr Lys Leu Arg Ile Leu Thr Pro Gln Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp
20 25 30
Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala
35 40 45
Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly
50 55 60
Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp
65 70 75 80
Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys
85 90 95
Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala
100 105 110
Thr Ser Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala
115 120 125
Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu
130 135 140
His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu
165 170 175
Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
180 185 190
Ala Arg Ala Arg Ala Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys
195 200 205
Glu Gly Pro Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
210 215 220
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp
225 230 235 240
Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
245 250 255
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn
260 265 270
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp
275 280 285
Leu Lys Gly Lys Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
290 295 300
Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu
305 310 315 320
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser
325 330 335
Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
340 345 350
Asp Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr
355 360 365
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr
370 375 380
Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe
385 390 395 400
Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
405 410 415
Ser Val Ser Lys Thr Gln Gly Lys His Asp Glu Leu
420 425
<210> 13
<211> 1565
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1300-BiP:CTB:GnRH:pFc2:HDEL的全DNA序列
<400> 13
tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60
gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120
cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180
tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240
ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcaat agaagaggct acgaagttaa 300
ggatcctcac tcctcagaac ataaccgatt tgtgcgctga ataccataac actcaaatac 360
acacactcaa cgataagatt ttctcttaca ctgaatcact tgctggaaag agagagatgg 420
caattatcac ctttaaaaac ggagctactt tccaggttga agtgcctggt agtcaacata 480
tcgattcaca gaagaaagca atagagagga tgaaggatac acttaggatt gcttatttga 540
ccgaagcaaa agttgagaaa ctctgtgtgt ggaataacaa aacccctcac gctatcgctg 600
ctatctctat ggccactagt gcaggagcag aacattggtc ttacggtctt agacctggag 660
ctggagctga acattggagt tatggtttaa gacctggagc tggagctgaa cattggtctt 720
atggacttag accaggtgca ggtgctgagc attggtcata tggattgaga ccaggagctg 780
gtgctgagca ttggtcttat ggtctaagac ctggagctgg agctgaacat tggtcttacg 840
gactcagacc cggtgcccgg gcagttggaa gaccatgccc tatatgtcct gcttgtgaag 900
gtccaggtcc ctctgctttt atattcccac caaagccgaa ggataccttg atgatttcac 960
gtacaccaca agttacttgt gttgttgtgg atgtttcaca agaaaatcct gaggtacaat 1020
tcagctggta tgttgatggg gtagaagtgc acactgcaca gactcgacca aaggaggccc 1080
agtttaactc gacttataga gttgtttctg ttctcccaat ccaacacgaa gattggctga 1140
agggcaagga atttgaatgc aaggttaaca ataaagatct accagcacca attaccagga 1200
ttatttctaa ggcaaaagga ccctccagag agccccaagt ttacacattg tctccttctg 1260
ctgaggagct tagtagaagt aaagtgagca ttacctgctt agtgacggga ttctaccctc 1320
cagacatcga cgtcgaatgg aaatctaatg gtcaacctga gccagaaggt aactatagga 1380
ctactccacc acaacaggac gtcgatggca catactttct ttattcaaaa cttgctgtcg 1440
ataaggcaag ttggcaaaga ggagatccat ttcagtgtgc tgtaatgcat gaggctttgc 1500
ataatcatta tacacagaaa tcagtttcta aaacacaagg gaaacacgat gagctctagc 1560
tcgag 1565
Claims (31)
1.一种用于动物绝育的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：
作为活性成分的重组蛋白，其中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和n个拷贝的促性腺激素释放激素(GnRH)，
其中n是1到20的整数。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述GnRH由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述CTB由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中n为6。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述GnRH由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，当n为2或更大时，所述GnRH通过丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸接头相互连接。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中在所述重组蛋白中，进一步融合了猪Fc片段(pFc2)。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述pFc2由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述CTB在GnRH的N端方向融合，并且所述pFc2在GnRH的C端方向融合。
10.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中在所述重组蛋白中，进一步融合了伴侣结合蛋白(BiP)。
11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述BiP由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成。
12.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述CTB在GnRH的N端方向融合，并且所述BiP在CTB的N端方向融合。
13.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中在所述重组蛋白中，进一步融合了His-Asp-Glu-Leu(HDEL)。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述HDEL由SEQ ID NO：11的碱基序列编码。
15.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述CTB在GnRH的N端方向融合，并且所述HDEL在GnRH的C端方向融合。
16.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中在所述重组蛋白中，依次融合了BiP、CTB、GnRH、pFc2和HDEL。
17.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述重组蛋白由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的疫苗组合物，其进一步包含佐剂。
19.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是基于Emulsigen的佐剂。
20.一种动物绝育的方法，所述方法包含：
将如权利要求1至17中任一项所述的疫苗组合物给药到除人以外的动物中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述动物是狗、鲸鱼、猫、大猩猩、鹅、豚鼠、野鸡、骆驼、獐鹿、骡子、鸡、驴、海豚、猪、美洲驼、马、水牛、鹿、家牛、驯鹿、羊驼、牦牛、绵羊、山羊、猩猩、鸭子、猴子、雪貂、大鼠、火鸡、鸵鸟或兔子。
22.一种用于动物绝育的重组载体，所述重组载体包含：
由SEQ ID NO：3的碱基序列组成的GnRH基因和由SEQ ID NO：5的碱基序列组成的CTB基因。
23.根据权利要求22所述的重组载体，其进一步包含：
编码由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的pFc2的多核苷酸。
24.根据权利要求22或23所述的重组载体，其进一步包含：
编码由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的BiP的多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的重组载体，其进一步包含：
由SEQ ID NO：11的碱基序列组成的HDEL基因。
26.根据权利要求25所述的重组载体，其包含：
编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多核苷酸或SEQ ID NO：13的碱基序列。
27.使用如权利要求22所述的重组载体制备的用于动物绝育的重组蛋白。
28.用如权利要求22所述的重组载体转化的转化体。
29.一种绝育方法，其包含：
将包含重组蛋白作为活性成分的疫苗组合物给药到除人之外的受试者中，在所述重组蛋白中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和n个拷贝的促性腺激素释放激素(GnRH)，
其中n是1到20的整数。
30.其中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和n个拷贝的促性腺激素释放激素(GnRH)的重组蛋白在动物绝育中的用途，
其中n是1到20的整数。
31.其中融合有霍乱毒素B亚基(CTB)和n个拷贝的促性腺激素释放激素(GnRH)的重组蛋白在制备用于动物绝育的疫苗中的用途，
其中n是1到20的整数。
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