DE69637375T2

DE69637375T2 - Glycoprotein hormone (tsh) superagonists

Info

Publication number: DE69637375T2
Application number: DE69637375T
Authority: DE
Inventors: Mariusz W. Potomac SZKUDLINSKI; Bruce D. Rockville WEINTRAUB; Mathis Rockville GROSSMAN
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1996-05-08
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2016-05-09
Also published as: EP0954578B1; DE69637375D1; EP0954578A1; KR20040039320A; EP1947117A2; ATE381617T1; WO1997042322A1; CA2253441A1; JP3981413B2; AU5854996A; EP1947117B1; CA2253441C; JP2000509603A; AU714635B2; EP1947117A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen modifizierte Glykoproteinhormone. Spezifisch betrifft diese Erfindung Modifikationen an einem humanen Glykoprotein, die superagonistische Aktivität erzeugen.
STAND DER TECHNIK
Thyreotropin (Thyreoidea-stimulierendes Hormon, TSH) und die Gonadotropine Choriongonadotropin (CG), Lutropin (Luteinisierungshormon LH) und Follitropin (follikelstimulierendes Hormon FSH) umfassen die Familie der Glykoproteinhormone.
Jedes Hormon ist ein Heterodimer aus zwei nicht kovalent verbundenen Untereinheiten: α und β. Innerhalb der gleichen Spezies ist die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit in allen Hormonen identisch, während die Sequenz der β-Untereinheit hormonspezifisch ist. (Pierce, J. G. and Parsons, T. F. "Glycoprotein hormones: structure and function." Ann. Rev. Biochem. 50: 465–495 (1981)). Die Tatsache, dass die Sequenzen der Untereinheiten vom Fisch zu Säugetieren weitgehend erhalten sind, impliziert, dass dies Hormone sich aus einem gemeinsamen Stammprotein entwickelt haben (Fontaine Y-A. and Burzawa-Gerard, E. "Esquisse de l'evolution des hormones gonadotopes et thyreotropes des vertebres." Gen. Comp. Endocrinol. 32: 341–347 (1977)). Evolutionäre Veränderungen dieser Hormone führten in bestimmten Fällen zur Modifikation der biologischen Aktivität (Licht, P. et al. "Evolution of gonadotropin structure and function." Rec. Progr. Horm. Res., 33: 169–248 (1977) und Combarnous, Y. "Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors." Endocrine Rev. 13: 670–691 (1992)), wenngleich keine spezifischen strukturellen Determinanten, die die Biopotenz modulieren, ermittelt wurden. Zum Beispiel teilen sich das humane Thyreoidea- stimulierende Hormon (hTSH) und das bovine Thyreoidea-stimulierende Hormon (bTSH) eine hohe Homologie in der α-(70%) und β-(89%)Untereinheitssequenz, aber das bTSH ist 6 bis 10 Mal potenter als das hTSH (Yamazaki, K. et al. "Potent thyrotropic activity of human chorionic gonadotropin variants in terms of ¹²⁵I incorporation and de novo synthesized thyroid hormone release in human thyroid follicles." J. Clin. Endocrinol. Metab. 80: 473–479 (1995)).
Glykoproteinhormone sind in bestimmten Therapien entscheidend, wie etwa bei der Behandlung von Patienten mit Schilddrüsenkarzinom. (Vgl. zum Beispiel Meier, C. A., et al., "Diagnostic use of Recombinant Human Thyrotropin in Patients with Thyroid Carcinoma (Phase I/II Study)." J. Clin. Endocrinol. Metabol. 78: 22 (1994)). Die potentielle Verwendung des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons (TSH) bei der Behandlung dieser Krankheit wurde aufgrund der potentiellen Übertragung der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit aufgegeben. Eine Alternative zur Verwendung von humanem TSH ist die Verwendung von bovinem TSH, aber dieser Ansatz ist sehr begrenzt, da dieses Hormon Nebenwirkungen, wie etwa Übelkeit, Erbrechen, lokale Induration, Urtikaria verursacht und eine relativ hohe Gefahr eines anaphylaktischen Schocks besteht (Meier, C. A., et al.). Die fehlende Biokonsistenz des Urin-Gonadotropins und die begrenzte Wirksamkeit rekombinanter Glykoproteinhormone rechtfertigen deren künftigen Ersatz mit wirksameren rekombinanten Analoga. Es gibt daher einen Bedarf an vom Menschen abgeleiteten Glykoproteinhormonen sowie an Agonisten dieser Hormone.
Zum Beispiel wird die Verabreichung eines Agonisten des Thyreoidea-stimulierenden Hormons in einer bestimmten klinischen Situation, wie etwa einem Schilddrüsenkarzinom, die Aufnahme von Radioiod in das Karzinom zur Behandlung der Krankheit verbessern. Durch die Agonisten des Thyreoidea-stimulierenden Hormons wird eine größere Menge von Radioiod auf das Karzinom gerichtet, was zu einer wirksameren Behandlung führt. Alternativ können Glykoproteinhormone, die verwendet werden, um einen Follikelsprung zu anzuregen, durch Superagonisten ersetzt werden. Dies wird die erforderliche Hormondosis senken, die derzeit ein medizinisches Hauptproblem bei der Fruchtbarkeitsbehandlung ist. (Ben-Rafael, Z., et al. "Pharmacokinetics of follicle-stimulating hormone: clinical significance." Fertility and Sterility 63: 689 (1995)). Dort, wo die Verwendung eines follikelstimulierendem Wildtyp-Hormons zur Hyperstimulation und höheren Raten an Mehrfachschwangerschaften und Aborten geführt hat, offenbar durch eine hohe Anzahl an Hormonmolekülen, die viele Follikel stimulieren, kann ein Superagonist des follikelstimulierenden Hormons verabreicht werden, um die Unfruchtbarkeit zu behandeln. Die Verwendung eines Agonisten dieses modifizierten Hormons kann zu einer niedrigeren Stimulationsfrequenz von mehrfachen Follikeln führen, da eine niedrigere Anzahl an Hormonmolekülen verabreicht werden kann, um das gewünschte Ergebnis zu erreichen.
In WO90/02812 wird ein Verfahren zur Produktion von Superagonist-Hormonen beschrieben, die die gemeinsame alpha Untereinheit des Gonadotropins haben.
Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal spezifische Aminosäuresubstitutionen in humanen Glykoproteinhormonen bereit, die zu humanen Glykoproteinhormonanaloga führen, die einen starken Anstieg der Bioaktivität sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein modifiziertes humanes Thyreoidea-stimulierendes Hormon (TSH) bereit, wie in Anspruch 1 angeführt.
In Übereinstimmung mit dem (den) Ziel(en) dieser Erfindung, die hier ausgeführt und umfassend beschrieben werden, stellt diese Erfindung in einem Aspekt ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das mindestens drei basische Aminosäuren in der α-Untereinheit an den Positionen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 ausgewählt werden.
Die Erfindung stellt ferner ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das mindestens eine basische Aminosäure in der α-Untereinheit an den Positionen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 ausgewählt werden.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein modifiziertes humanes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das gegenüber einem humanen Wildtyp-Glykoprotein eine erhöhte Aktivität aufweist, wobei das modifizierte humane Hormon eine basische Aminosäure umfasst, die an einer Position substituiert ist, die der gleichen Aminosäureposition in einem nicht humanen Glykoproteinhormon entspricht, das gegenüber dem humanen Wildtyp-Glykoprotein eine erhöhte Aktivität aufweist.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Behandlung eines mit einer Glykoproteinhormonaktivität in einem Subjekt assoziierten Leidens offenbart, das die Verabreichung einer therapeutischen Menge des Glykoproteinhormons der vorliegenden Erfindung an den Patienten umfasst.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Konstruktion superaktiver nicht-chimärischer Analoga humaner Hormone offenbart, das das Vergleichen der Aminosäuresequenz eines aktiveren Homologs einer anderen Spezies mit den humanen Hormonen, das Substutuieren der Aminosäuren des humanen Hormons durch die entsprechenden Aminosäuren aus den anderen Spezies, das Bestimmen der Aktivität des substituierten humanen Hormons und das Auswählen superaktiver Analoga aus den substituierten humanen Hormonen umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren bereit, die die modifizierten Glykoproteinhormone, TSH, kodieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Vergleich der relevanten Primärsequenzen der α-Untereinheit von 27 verschiedenen Spezies (a). Es erfolgte das Alignment der Untereinheit-Sequenzen, die aus dem Sequenzieren des PCR-amplifizierten Fragments genomischer DNA von Schimpanse, Orang-Utan, Gibbon und Pavian (unterstrichen) erhalten wurden, die von GeneBank, SWISS-PROT und PDB-Datenbank bezogen wurden. Die Nummerierung der Sequenzen entspricht der der humanen α-Untereinheitsequenz. Bindestriche (---) geben Aminosäurereste an, die mit denen der humanen α-Untereinheit identisch sind. Unter verschiedenen Spezies konservierte Lysinreste sind fettgedruckt. Die Primatensequenzen, die in dieser Untersuchung bestimmt werden, sind unterstrichen. Die α-Untereinheitsequenzen von Mensch, Schimpanse und Orang-Utan sind die einzigen Sequenzen ohne basische Aminosäuren in dieser Region, trotz des relativ hohen Ähnlichkeitsgrads bei diversen Wirbeltierspezies.
(b) Mutationen der humanen Sequenz, die in dieser Region vorgenommen wurden, beinhalteten die Einführung von einzelnen und mehrfachen Lys-Resten, die in allen nicht humanen Säugetiersequenzen vorhanden sind. Zusätzlich wurde Alaninmutagenese der Reste 13, 16 und 20 verwendet, um die Rolle von Gln13, Pro16 und Gln20 zu untersuchen.
2 zeigt die Bioaktivitäten und Rezeptorbindungsaktivitäten der potentesten hTSH-Analoga: (a, b) cAMP-Stimulation in CHO-JP09-Zellen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardfehler von dreifachen Bestimmungen aus einem repräsentativen Versuch dar, der drei (a) und zwei (b) Mal wiederholt wurde. (c, d) Rezeptorbindungsaktivitäten in CHO-JP09-Zellen. Es wurden die gleichen Mutanten gestestet wie in 2a bzw. 2b. Die Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler von vierfachen Bestimmungen aus einem Versuch, der zwei Mal wiederholt wurde. (e) Thymidin-Aufnahmestimulation in FRTL-5-Zellen. Die Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler von vierfachen Bestimmungen aus einem Versuch, der zwei Mal wiederholt wurde. (f) Stimulation der T4-Sekretion bei Mäusen. Jeder Datenpunkt steht für den Mittelwert ± Standardfehler der Werte von 4 bis 5 Tieren eines repräsentativen Versuchs, der zwei Mal wiederholt wurde. (g) cAMP-Stimulation in CHO-hTSH-Zellen. Die Daten stehen für den Mittelwert ± Standardfehler von 3 bis 4 Bestimmungen aus einem repräsentativen Versuch, der 3 Mal wiederholt wurde. (h) Rezeptorbindungsaktivitäten an CHO-JP09-Zellen. Die Daten stehen für den Mittelwert ± Standardfehler von 3 bis 4 Bestimmungen aus einem repräsentativen Versuch, der 3 Mal wiederholt wurde. (i) Stimulation der T4-Sekretion bei Mäusen. Jeder Datenpunkt steht für den Mittelwert ± Standardfehler der Werte von 4 bis 5 Tieren eines repräsentativen Versuchs, der zwei Mal wiederholt wurde.
3 zeigt die Bioaktivitäten und Rezeptorbindungsaktivitäten der potentesten hCG-Analoga. Progesteronproduktionsstimulation (a) und Rezeptorbindungsassay (b) in MA-10-Zellen. Die Daten stehen für den Mittelwert ± Standardfehler von dreifachen Bestimmungen aus einem repräsentativen Versuch, der drei Mal wiederholt wurde. Die relativen maximalen Produktionslevel von Progesteron sind in Tabelle II, als %, der mit WT-hCG erhalten wurde, dargestellt. cAMP-Stimulation (c) und Rezeptorbindungsassay (d) in COS-7-Zellen, die hLH-Rezeptor exprimieren. Die Daten stehen für den Mittelwert ± Standardfehler von dreifachen Bestimmungen aus einem repräsentativen Versuch, der zwei Mal wiederholt wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und der Beispiele, die darin enthalten sind, und der Figuren und deren vorausgehender und nachfolgender Beschreibung leichter verstanden werden.
Bevor die vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren offenbart und beschrieben werden, sollte verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf spezifische Subjekte, d. h. Menschen sowie nicht menschliche Säugetiere, spezifische Aminosäuren, spezifische klinische Leiden, spezifische Analoga oder spezifische Verfahren beschränkt ist, da solche natürlich variieren können und die darin enthaltenen zahlreichen Modifikationen und Variationen werden für den Fachmann offensichtlich sein. Es sollte auch verstanden werden, dass die hier verwendete Terminologie nur das Ziel hat, besondere Ausführungsformen zu beschreiben und nicht beschränkend wirken soll.
Wie in der Spezifikation und in den Ansprüchen verwendet, kann "ein", abhängig vom Kontext, in dem es verwendet wird, ein oder mehrere bedeuten. Somit bedeutet zum Beispiel die Bezugnahme auf "ein humanes Glykoproteinhormon", dass mindestens ein humanes Glykoproteinhormon benutzt wird.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das mindestens drei basische Aminosäuren in der α-Untereinheit an den Positionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20.
Die Erfindung stellt ferner ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das mindestens eine basische Aminosäure in der α-Untereinheit an den Positionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein modifiziertes humanes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das gegenüber einem humanen Wildtyp-Glykoprotein eine erhöhte Aktivität aufweist, wobei das modifizierte humane Hormon eine basische Aminosäure umfasst, die an einer Position substituiert ist, die der gleichen Aminosäureposition in einem nicht humanen Glykoproteinhormon entspricht, das gegenüber dem humanen Wildtyp-Glykoprotein eine erhöhte Aktivität aufweist.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Behandlung eines Leidens offenbart, das mit einer Glykoproteinhormonaktivität in einem Subjekt assoziiert ist, das die Verabreichung einer therapeutischen Menge des Glykoproteinhormons der vorliegenden Erfindung an den Patienten umfasst.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren offenbart, das die Reproduktion in einem Subjekt unterstützt, das das Verabreichen einer unterstützenden Menge des Glykoproteinhormons der vorliegenden Erfindung umfasst.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Konstruktion superaktiver nicht chimärischer Analoga humaner Hormone offenbart, das das Vergleichen der Aminosäuresequenz eines aktiveren Homologs einer anderen Spezies mit den humanen hormonsubstituierenden Aminosäuren in dem humanen Hormon mit den entsprechenden Aminosäuren aus den anderen Spezies, das Bestimmen der Aktivität des substituierten humanen Hormons und das Auswählen superaktiver Analoga aus den substituierten humanen Hormonen umfasst.
Mit "humanem" Glykoproteinhormon ist gemeint, dass die Anzahl an Aminosäuresubstitutionen, die in der Wildtypsequenz gemacht wurden, die Hälfte der Anzahl an Aminosäuredifferenzen an den entsprechenden Positionen in den entsprechenden Polypeptidhormonen zwischen humanen und anderen Spezies nicht übersteigt. Somit würde das modifizierte Polypeptidhormon mehr als das Wildtyppolypeptidhormon des Menschen erachtet denn als das entsprechende Polypeptidhormon aus der nicht humanen Spezies, aus dem die Aminosäuresubstitutionen abgeleitet sind, basierend auf der die Aminosäure kodierenden Sequenz. Wenn es zum Beispiel eine Gesamtzahl an 20 Aminosäuredifferenzen an den entsprechenden Positionen in den entsprechenden Glykoproteinhormonen zwischen einem humanen Glykoprotein- und einem bovinen Glykoproteinhormon gibt, würde ein "humanes" Glykoproteinhormon ein modifiziertes humanes Wildtyphormon sein, das 10 oder weniger Aminosäuresubstitutionen innerhalb seiner Aminosäuresequenz enthält, die homolog zu den entsprechenden Aminosäuren in der bovinen Aminosäuresequenz sind. Spezifischer würde das Thyreoidea-stimulierende Hormon, wie in den hier enthaltenen Beispielen offenbart, als "human" erachtet, wenn 20 oder mehr der insgesamt 40 Aminosäuredifferenzen zwischen den α- und β-Untereinheiten der humanen und der bovinen Homologa zu der Aminosäure an der entsprechenden Position in dem humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormon homolog sind.
Aufgrund des Risikos einer adversen Immunantwort auf die Verabreichung des modifizierten Glykoproteinhormons, wenn der Empfänger ein Mensch ist, ist natürlich das modifizierte Glykoproteinhormon bevorzugt in größtmöglichem Umfang homolog zur humanen Aminosäuresequenz, ohne inakzeptablen Verlust an superagonistischer Aktivität. Wenn das Subjekt, dem das modifizierte Glykoprotein verabreicht wird, andererseits nicht human ist, ist das modifizierte Glykoproteinhormon bevorzugt in größtmöglichem Umfang homolog zur spezifischen nicht humanen Aminosäuresequenz ohne inakzeptablem Verlust an superagonistischer Aktivität. Durch Modifizierung eines Wildtyp-Glykoproteins, um ein modifiziertes Glykoprotein mit einer superagonistischen Aktivität zu konstruieren, indem spezifische Aminosäuren substituiert werden, zählen daher in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die substituierten Aminosäuren, die die agonistische Aktivität nicht erhöhen, 10 oder weniger, insbesondere 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 und 2 oder null.
Ebenso ist mit "nicht chimärisch" gemeint, dass die Anzahl an Aminosubstitutionen die Hälfte der Anzahl an Aminosäuredifferenzen an entsprechenden Positionen in den entsprechenden Polypeptidhormonen zwischen den Spezies nicht übersteigt, so dass das modifizierte Polypeptidhormon eher als das modifizierte Wildtyp-Polypeptidhormon der Spezies erachtet würde als das entsprechende Polypeptidhormon der Spezies, aus der die Aminosäuresubstitutionen abgeleitet sind, basierend auf der die Aminosäure kodierenden Sequenz.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren bereit, die die modifizierten Glykoproteinhormone kodieren.
Glykoproteinhormone umfassen eine Familie von Hormonen, die strukturell verwandte Heterodimere sind, die aus einer der Spezies gemeinsamen α-Untereinheit und einer verschiedenartigen β-Untereinheit besteht, die jedem Hormon biologische Spezifität verleiht. Für einen allgemeinen Überblick über die Glykoproteinhormone vgl. Pierce, J. G. et al., "Glycoprotein hormones: structure and function." Ann. Rev. Biochem. 50: 465–495 (1981), vgl. auch Combarnous, Y. "Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors." Endocrine Rev. 13: 670–691 (1992). Diese Hormonfamilie beinhaltet Choriongonadotropin (CG), Lutropin (Luteinisierungshormon LH), Follitropin (follikelstimulierendes Hormon FSH) und Thyreotropin (Thyreoidea-stimulierendes Hormon, TSH). Jedes dieser Glykoproteinhormone mit mindestens einer basischen Aminosäure in der α-Untereinheit an den Positionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 wird von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Basische Aminosäuren umfassen die Aminosäuren Lysin, Arginin und Histidin und jede andere basische Aminosäure, die eine Modifikation zu jeder dieser drei Aminosäuren sein kann, synthetische basische Aminosäuren, die normalerweise nicht in der Natur zu finden sind, oder jede andere Aminosäure, die bei neutralem pH-Wert positiv geladen ist.
Die Glykoproteinhormone, die für die vorliegende Erfindung bereitgestellt werde, können auf beliebige Weise erhalten werden. Zum Beispiel kann ein DNA-Molekül, das ein Glykoproteinhormon kodiert, aus dem Organismus isoliert werden, in dem es normalerweise zu finden ist. Zum Beispiel kann eine genomische DNA- oder cDNA-Bank konstruiert und auf die Gegenwart der interessierenden Nukleinsäure gescreent werden. Verfahren zur Konstruktion und zum Screenen solcher Banken sind dem Fachmann gut bekannt, und Kits zum Durchführen der Konstruktions- und Screeningschritte sind im Handel erhältlich (zum Beispiel Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Sobald sie isoliert wurde, kann die Nukleinsäure direkt in einen geeigneten Vektor kloniert, oder gegebenenfalls modifiziert werden, um die nachfolgenden Klonierungsschritte zu erleichtern. Solche Modifizierungsschritte sind Routine, wofür ein Beispiel die Zugabe von Oligonukleotidlinkern ist, die Restriktionsorte für die Termini von Nukleinsäuren enthalten. Allgemeine Verfahren werden offenbart in Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Sobald die Nukleinsäuresequenz des gewünschten Glykoproteinhormons erhalten wurde, können basische Aminosäuren an allen besonderen Aminosäurepositionen mit Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, positioniert werden. Zum Beispiel können PCR-Primer entworfen werden, die die Aminosäureposition oder die Aminosäurepositionen umspannen und die eine basische Aminosäure mit einer nicht basischen Aminosäure substituieren können. Dann kann eine Nukleinsäure amplifiziert werden und in das das Wildtyp-Glykoproteinhormon kodierende Sequenz inseriert werden, um eine beliebige Anzahl möglicher Kombinationen an basischen Aminosäuren an jeder Position des Glykoproteinhormons zu erhalten. Alternativ kann ein Fachmann spezifische Mutationen an jedem Punkt einer besonderen Nukleinsäuresequenz durch Techniken zur Punktmutagenese einführen. Allgemeine Verfahren werden offenbart in Smith, M. "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Gen., 19: 423–462 (1985) und Zoller, M. J. "New molecular biology methods for Protein engineering" Curr. Opin. Struct. Biol., 1: 605–610 (1991).
Ein anderes Beispiel für ein Verfahren zum Erhalten eines DNA-Moleküls, das ein spezifisches Glykoproteinhormon kodiert, ist, ein rekombinantes DNA-Molekül zu synthetisieren, das das Glykoproteinhormon kodiert. Zum Beispiel sind Oligonukleotidsyntheseprozeduren für den Fachmann Routine und Oligonukleotide, die für eine besondere Proteinregion kodieren, sind leicht durch automatisierte DNA-Synthese zu erhalten. Eine Nukleinsäure für einen Strang eines doppelsträngigen Moleküls kann zu deren komplementärem Strang synthetisiert und hybridisiert werden. Diese Oligonukleotide können derart entworfen werden, dass das resultierende doppelsträngige Molekül entweder interne Restriktionsorte oder geeignete 5'- oder 3'-Überhänge an den Termini zum Klonieren in einen geeigneten Vektor aufweist. Doppelsträngige Moleküle, die für relativ große Proteine kodieren, können leicht synthetisiert werden, indem zuerst mehrere unterschiedliche doppelsträngige Moleküle konstruiert werden, die für besondere Regionen des Proteins kodieren, gefolgt von der Ligation dieser DNA-Moleküle. Zum Beispiel haben Cunningham, et al., "Receptor and Antibody Epitopes in Human Growth Hormone Identified by Homolog-Scanning Mutagenesis," Science, 243: 1330–1336 (1989), ein synthetisches Gen konstruiert, das das humane Wachstumshormongen kodiert, indem sie zuerst überlappende und komplementäre synthetische Oligonukleotide konstruiert, und diese Fragmente ligiert haben. Vgl. auch Ferretti, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 599–603 (1986), worin die Synthese eines synthetischen bovinen Rhodopsingens mit 1057 Basenpaaren aus synthetischen Oligonukleotiden offenbart wird. Wenn ein Glykoproteinhormon auf diese Weise konstruiert wird, kann ein Fachmann leicht jedes besondere Glykoproteinhormon mit basischen Aminosäuren an jeder besonderen Position oder Positionen entweder der α-Untereinheit, der β-Untereinheit oder beider erhalten. Vgl. auch die US-Patentschrift Nr. 5,503,995 , die ein Enzym-Template-Reaktionsverfahren zum Erstellen synthetischer Gene beschreibt. Techniken wie diese sind für den Fachmann Routine und gut dokumentiert. DNA-Fragmente, die Glykoproteinhormone kodieren, können dann in vivo oder in vitro exprimiert werden, wie nachfolgend diskutiert.
Sobald eine Nukleinsäure konstruiert, modifiziert oder isoliert wurde, die ein besonderes, interessantes Glykoproteinhormon, oder eine Region dieser Nukleinsäure kodiert, kann diese Nukleinsäure dann in einen geeigneten Vektor kloniert werden, der die In-vivo- oder In-vitro-Synthese dieses Wildtyp- und/oder modifizierten Glykoproteinhormons steuern kann. Der Vektor ist so konzipiert, dass er die notwendigen funktionellen Elemente aufweist, die die Transkription des inserierten Gens oder Hybridgens steuern und regulieren können. Diese funktionellen Elemente beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf einen Promoter, Regionen upstream oder downstream des Promoters (wie etwa Enhancer, die die Transkriptionsaktivität des Promoters regulieren können), einen Replikationsursprung, geeignete Restriktionsorte (um das Klonieren von Inserts, die benachbart zu dem Promoter liegen, zu erleichtern), antibiotische Resistenzgene oder andere Marker (die dazu dienen können, nach Zellen zu selektieren, die den Vektor enthalten oder den Vektor, der das Insert, RNA-Spleißstellen, eine Transkriptionsterminationsregion oder jede andere Region enthält, die dazu dienen kann, die Expression des inserierten Gens oder Hybridgens zu erleichtern). (Vgl. allgemein, Sambrook et al.).
Es gibt zahlreiche E. coli (Escherichia coli) Expressionsvektoren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, die für die Expression des Nukleinsäureinserts nützlich sind. Andere mikrobielle Wirte, die sich für die Verwendung eignen, beinhalten Bazillen, wie etwa Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, wie etwa Salmonella, Serratia und verschiedene Pseudomonas-Spezies. In diesen prokaryotischen Wirten können auch Expressionsvektoren erstellt werden, die typischerweise Expressionskontrollsequenzen enthalten werden, die mit der Wirtszelle kompatibel sind (z. B. einen Replikationsursprung). Außerdem wird jede Anzahl einer Vielzahl von gut bekannten Promotern vorhanden sein, wie etwa das Lactose-Promotersystem, ein Tryptophan(Trp)-Promotersystem, ein beta-Lactamasepromotersystem oder ein Promotersystem aus dem Lambda-Phagen. Die Promoter werden typischerweise die Expression kontrollieren, optional mit einer Operatorsequenz, und Ribosom-Bindungsstellen zum Beispiel zum Initiieren und Abschließen der Transkription und Translation aufweisen. Gegebenenfalls kann ein aminoterminales Methionin durch Insertion eines In-frame- und 5'-Met-Codons mit dem downstream Nukleinsäureinsert bereitgestellt werden. Die carboxyterminale Extension des Nukleinsäureinserts kann ebenfalls unter Verwendung von Standard-Oligonukleotidmutagenese-Prozeduren entfernt werden.
Außerdem kann die Hefeexpression verwendet werden. Hefeexpressionssysteme haben mehrere Vorteile. Erstens gibt es den Nachweis, dass Proteine, die in Hefesekretionssystemen produziert wurden, die korrekte Disulfidpaarung aufweisen. Zweitens wird die posttranslationale Glykosylierung durch die Hefesekretionssysteme wirksam ausgeführt. Die pre-pro-alpha-factor-Leaderregion von Saccharomyces cerevisiae (kodiert durch das MF''-I-Gen) wird routinemäßig verwendet, um die Proteinsekretion aus Hefe zu steuern. (Brake, et al., "α-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae." Proc. Nat. Acad. Sci., 81: 4642–4646 (1984)). Die Leaderregion des Pre-pro-alpha-factors enthält ein Signalpeptid und ein Pro-Segment, das eine Erkennungssequenz für eine Hefeprotease beinhaltet, die durch das KEX2-Gen kodiert wird: Dieses Enzym spaltet das Vorläuferprotein auf der Carboxylseite der Lys-Arg-Dipeptid-Spaltungssignalsequenz. Die die Nukleinsäure kodierende Sequenz kann in-frame mit der Pre-pro-alpha-factor-Leaderregion verschmolzen werden. Dieses Konstrukt wird dann unter die Kontrolle eines starken Transkriptionspromoters gestellt, wie etwa dem Alkoholdehydrogenase-I-Promoter oder einem glykolytischen Promoter. Auf die die Nukleinsäure kodierende Sequenz folgt ein Translationsterminationscodon, auf den Transkriptionsterminationssignale folgen. Alternativ können die Nukleinsäure kodierenden Sequenzen mit einer zweiten Protein kodierenden Sequenz verschmolzen werden, wie etwa Sj26 oder β-Galactosidase, die üblicherweise die Reinigung des Fusionsproteins durch Affinitätschromatographie erleichtern. Die Insertion von Proteasespaltungsstellen, um die Bestandteile des Fusionsproteins zu trennen, ist auf Konstrukte anwendbar, die für die Expression in Hefe verwendet werden. Eine wirksame posttranslationale Glykosylierung und Expression rekombinanter Proteine kann auch in Baculovirus-Systemen erreicht werden.
Säugetierzellen erlauben die Expression von Proteinen in einer Umgebung, die große posttranslationale Modifikationen begünstigt, wie etwa Falten und Cysteinpaarung, die Zugabe komplexer Kohlenhydratstrukturen und die Sekretion von aktivem Protein. Vektoren, die für die Expression von aktiven Proteinen in Säugetierzellen nützlich sind, sind durch die Insertion der das Protein kodierenden Sequenz zwischen einem starken viralen Promoter und einem Polyadenylierungssignal gekennzeichnet. Die Vektoren können Gene enthalten, die Hygromycinresistenz, Gentamicinresistenz verleihen, oder andere Gene oder Phenotypen, die sich für die Verwendung als selektierbare Marker eignen, oder Methotrexatresistenz für die Genamplifikation. Die das chimärische Protein kodierende Sequenz kann in eine Eizelllinie vom Chinesischen Hamster (Chinese Hamster ovary – CHO) unter Verwendung eines Methotrexatresistenz-kodierenden Vektors, oder anderer Zelllinien, die geeignete Selektionsmarker verwenden, eingeführt werden. Die Gegenwart der Vektor-DNA in den transformierten Zellen kann durch Southern-Blot-Analyse bestätigt werden. Die Produktion von RNA, die der das Insert kodierenden Sequenz entspricht, kann durch Northern-Blot-Analyse bestätigt werden. Eine Anzahl anderer geeigneter Wirtszelllinien, die in der Lage sind, intakte humane Proteine zu sekretieren, wurden auf diesem Gebiet entwickelt, und beinhalten CHO-Zelllinien, HeLa-Zellen, Myelomzelllinien, Jurkat-Zellen usw. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen beinhalten, wie etwa einen Replikationsursprung, einen Promoter, einen Enhancer und Stellen, die notwendige Informationen verarbeiten, wie etwa Ribosom-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminatorsequenzen. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Promoter, die von Immunoglobulingenen, SV40, Adenovirus, Bovinem Papillomavirus usw. abgeleitet sind. Die Vektoren, die die Nukleinsäuresegmente von Belang enthalten, können durch gut bekannte Verfahren in die Wirtszelle übertragen werden, die abhängig von der Art des zellulären Wirts variieren. Zum Beispiel wird die Calciumchloridtransformation üblicherweise für prokaryotische Zellen benutzt, während Calciumphosphat-, DEAE-Dextran- oder Lipofectin-vermittelte Transfektion oder Elektroporation für andere zelluläre Wirte verwendet werden kann.
Alternative Vektoren für die Expression von Genen in Säugetierzellen, ähnlich jenen, die für die Expression von humanem gamma-Interferon, Gewebeplasminogenaktivator, Gerinnungsfaktor-VIII, Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen, Protease Nexinl und eosinophilem Major Basic Protein entwickelt wurden, können benutzt werden. Ferner kann der Vektor CMV-Promotersequenzen und ein Polyadenylierungssignal beinhalten, das für die Expression von inserierten Nukleinsäuren in Säugetierzellen verfügbar ist (wie etwa COS-7).
Die Expression des Gens oder des Hybridgens kann entweder in vivo oder in vitro erfolgen. Die In-vivo-Synthese umfasst das transformieren prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen, die als Wirtszellen für den Vektor dienen können. Ein Beispiel für modifizierte Glykoproteinhormone, die in einen prokaryotischen Expressionsvektor inseriert wurden, ist im Beispielabschnitt zu finden, der hier enthalten ist.
Alternativ kann die Expression des Gens in einem In-vitro-Expressionssystems stattfinden. Zum Beispiel sind im Handel In-vitro-Transkriptionssysteme erhältlich, die routinemäßig verwendet werden, um relativ große Mengen an mRNA zu synthetisieren. In solchen In-vitro-Transkriptionssystemen würde das die Nukleinsäure kodierende Glykoproteinhormon in einen Expressionsvektor benachbart zu einem Transkriptionspromoter kloniert. Zum Beispiel enthalten die Bluescript-II-Klonierungs- und Expressionsvektoren mehrfache Klonierungsstellen, die von starken prokaryotischen Transkriptionspromotern flankiert sind. (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Es sind Kits erhältlich, die alle notwendigen Recktanten für die In-vitro-Synthese einer RNA aus einem DNA-Template enthalten, wie etwa Bluescript-Vektoren. (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Die mit einem System wie diesem in vitro produzierte RNA kann dann in vitro translatiert werden, um das gewünschte Glykoproteinhormon herzustellen. (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).
Ein anderes Verfahren zur Produktion eines Glykoproteinhormons besteht darin, zwei Peptide oder Polypeptide durch Proteinchemie-Techniken miteinander zu verbinden. Zum Beispiel können Peptide oder Polypeptide unter Verwendung derzeit verfügbarer Laborausstattung unter Verwendung von entweder Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)- oder Boc(tert-Butyloxycarbonoyl)-Chemie chemisch synthetisiert werden. (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Ein Fachmann kann leicht einschätzen, dass ein Peptid oder Polypeptid, das einem hybriden Glykoproteinhormon entspricht, durch chemische Standardreaktionen synthetisiert werden kann. Zum Beispiel kann ein Peptid oder Polypeptid aus dessen Syntheseharz synthetisiert und nicht gespalten werden, während das andere Fragment eines hybriden Peptids synthetisiert und anschließend aus dem Harz gespalten werden kann, wodurch eine terminale Gruppe exponiert wird, die auf dem anderen Fragment funktionell blockiert ist. Durch Peptidkondensationsreaktionen können diese beiden Fragmente kovalent über eine Peptidbindung an ihren Carboxyl- bzw. Aminotermini verknüpft werden, um ein hybrides Peptid zu bilden. (Grant, G. A., „Synthetic Peptides: A User Guide," W. H. Freeman and Co. N. Y. (1992) und Bodansky, M. and Trost, B., Ed., „Principles of Peptide Synthesis," Springer-Verlag Inc., N. Y. (1993)). Alternativ kann das Peptid oder Polypeptid unabhängig in vivo synthetisiert werden, wie oben beschrieben. Sobald sie isoliert wurden, können diese unabhängigen Peptide oder Polypeptide verknüpft werden, um über ähnliche Peptidkondensationsreaktionen ein Glykoproteinhormon zu bilden.
Zum Beispiel kann es die enzymatische Ligation klonierter oder synthetischer Peptidsegmente relativ kurzen Peptidfragmenten ermöglichen mit größeren Peptidfragmenten, verbunden zu werden, um Polypeptide oder ganze Proteindomänen herzustellen (Abrahmsen, L. et al., Biochemistry, 30: 4151 (1991)). Alternativ kann die native chemische Ligation synthetischer Peptide benutzt werden, um synthetisch große Peptide oder Polypeptide aus kürzeren Peptidfragmenten zu konstruieren. Dieses Verfahren besteht aus einer chemischen Zwei-Schritt-Reaktion (Dawson, et al., "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation," Science, 266: 776–779 (1994)). Der erste Schritt ist die chemoselektive Reaktion eines ungeschützten synthetischen Peptid-α-Thioesters mit einem anderen ungeschützten Peptidsegment, das einen aminoterminalen Cys-Rest enthält, um ein Thioester-verknüpftes Zwischenprodukt als kovalentes Ausgangsprodukt zu ergeben. Ohne Veränderung der Reaktionsbedingungen erfährt dieses Zwischenprodukt eine spontane schnelle intramolekulare Reaktion, um eine native Peptidbindung an der Ligationsstelle zu bilden. Die Anwendung dieses nativen chemischen Ligationsverfahrens auf die gesamte Synthese eines Proteinmoleküls wird illustriert durch die Herstellung von humanem Interleukin 8 (IL-8) (Clark-Lewis, I., et al., FEBS Lett., 307: 97 (1987), Clark-Lewis, I., et al., J. Biol. Chem., 269: 16075 (1994), Clark-Lewis, I., et al., Biochemistry, 30: 3128 (1991), und Rajarathnam, K., et al., Biochemistry, 29: 1689 (1994)).
Alternativ können ungeschützte Peptidsegmente dort chemisch verknüpft werden, wo die Bindung, die sich zwischen den Peptidsegmenten infolge einer chemischen Ligation gebildet hat, eine unnatürliche (nicht peptidische) Bindung ist (Schnolzer, M., et al., Science, 256: 221 (1992)). Diese Technik wurde verwendet, um Analoga von Proteindomänen sowie große Mengen relativ reinen Proteins mit voller biologischer Aktivität zu synthetisieren (deLisle Milton, R. C., et al., "Techniques in Protein Chemistry IV," Academic Press, New York, pp. 257–267 (1992)).
Die Erfindung stellt auch Fragmente modifizierter Glykoproteinhormone bereit, die entweder superagonistische oder antagonistische Aktivität aufweisen. Die Polypeptidfragmente der vorliegenden Erfindung können rekombinante Proteine sein, die durch Klonieren von Nukleinsäuren, die das Polypeptid kodieren, in einem Expressionssystem erhalten werden, das in der Lage ist, die Polypeptidfragmente daraus herzustellen. Zum Beispiel lässt sich die aktive Domäne eines Glykoproteinhormons bestimmen, die, zusammen mit einer β-Untereinheit mit einem Glykoproteinhormonrezeptor interagieren, und eine biologische Wirkung hervorrufen kann, die mit dem Glykoproteinhormon assoziiert ist. In einem Beispiel können Aminosäuren, von denen festgestellt wird, dass sie weder zur Aktivität noch zur Bindungsspezifität oder -affinität des Glykoproteinhormons beitragen, entfernt werden ohne Verlust in der jeweiligen Aktivität.
Zum Beispiel können amino- oder carboxyterminale Aminosäuren nacheinander entweder aus dem nativen oder dem modifizierten Glykoproteinhormon entfernt werden und die jeweilige Aktivität kann mit einem von vielen verfügbaren Assays getestet werden. In einem anderen Beispiel kann ein Fragment eines modifizierten Glykoproteins ein modifiziertes Hormon umfassen, wobei mindestens eine Aminosäure an spezifischen Positionen entweder in der α- oder der β-Untereinheit mit der natürlich vorkommenden Aminosäure substituiert wurde, und ein Abschnitt entweder der aminoterminalen oder der carboxyterminalen Aminosäuren, oder sogar eine interne Region des Hormons durch ein Polypeptidfragment oder eine andere Komponente, wie etwa Biotin, das die Reinigung des modifizierten Glykoproteinhormons erleichtern kann, ersetzt wurde. Zum Beispiel kann ein modifiziertes Glykoprotein mit einem Maltosebindungsprotein entweder durch Peptidchemie oder durch Klonieren der jeweiligen Nukleinsäuren, die die beiden Polypeptidfragmente kodieren, in einen Expressionsvektor, derart verschmolzen werden, dass die Expression der kodierenden Region zu einem hybriden Polypeptid führt. Das hybride Polypeptid kann affinitätsgereinigt werden, indem es über eine Amylose-Affinitätssäule geleitet wird, und das modifizierte Glykoprotein kann dann von der maltosebindenden Region durch Spalten des hybriden Polypeptids mit dem spezifischen Proteasefaktor Xa getrennt werden. (Vgl. zum Beispiel New England Biolabs Product Catalog, 1996, S. 164.) Aktive Fragmente eines Glykoproteinhormons können auch direkt synthetisiert werden oder durch chemisches oder mechanisches Sprengen eines größeren Glykoproteinhormons erhalten werden. Ein aktives Fragment ist als eine Aminosäuresequenz von mindestens etwa 5 aufeinander folgenden Aminosäuren definiert, die von der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz abgeleitet sind, das die relevante Aktivität, z. B. Bindungsaktivität oder regulatorische Aktivität, aufweist.
Die Fragmente, ob an andere Sequenzen angeheftet oder nicht, können auch Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder andere ausgewählte Modifikationen besonderer Regionen oder spezifischer Aminosäurereste beinhalten, vorausgesetzt, dass die Aktivität des Peptids verglichen mit dem modifizierten Glykoproteinhormon nicht signifikant verändert oder gestört wird. Diese Modifikationen können einige andere Eigenschaften bereitstellen, wie etwa Aminosäuren entfernen/hinzufügen, die in der Lage sind, Disulfid zu binden, deren Bio-Lebensdauer usw. zu erhöhen. In jedem Fall muss das Peptid eine bioaktive Eigenschaft besitzen, wie etwa eine Bindungsaktivität, die Regulierung der Bindung an die Bindungsdomäne usw. Funktionelle oder aktive Regionen des Glykoproteinhormons können durch Mutagenese einer spezifischen Region des Hormons identifiziert werden, gefolgt durch die Expression und das Testen des exprimierten Polypeptids. Solche Verfahren sind für den Fachmann schnell offensichtlich und können ortsspezifische Mutagenese des die Nukleinsäure kodierenden Rezeptors beinhalten. (Zoller, M. J. et al.).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das humane Glykoproteinhormon, TSH, mindestens eine basische Aminosäure in der α-Untereinheit an der Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20. In einer Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 11. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 13. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 14. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 16. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 17. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 20. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die basische Aminosäure an Position 11, 13, 14, 16 und 20 Lysin. In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die basische Aminosäure an Position 17 Arginin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, mit basischen Aminosäuren in der α-Untereinheit in allen Kombinationen aller zwei Positionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 bereit. Zum Beispiel können basische Aminosäuren an den Positionen 11 und 13, oder den Positionen 11 und 14, oder den Positionen 11 und 16, oder den Positionen 11 und 17, oder den Positionen 11 und 20, oder den Positionen 13 und 14, oder den Positionen 13 und 17, oder den Positionen 14 und 16, oder den Positionen 14 und 17, oder den Positionen 14 und 20, oder den Positionen 16 und 17, oder den Positionen 17 und 20 vorhanden sein. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 16 und 13. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 20 und 13. In noch einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 16 und 20.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, mit basischen Aminosäuren in der α-Untereinheit in allen Kombinationen aller drei Positionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 bereit. Zum Beispiel können basische Aminosäuren an den Positionen 11, 13 und 14, oder den Positionen 11, 13 und 16, oder den Positionen 11, 13 und 17, oder den Positionen 11, 13 und 20, oder den Positionen 11, 14 und 16, oder den Positionen 11, 14 und 17, oder den Positionen 11, 14 und 20, oder den Positionen 11, 16 und 17, oder den Positionen 11, 16 und 20, oder den Positionen 11, 17 und 20, oder den Positionen 13, 14 und 16, oder den Positionen 13, 14 und 17, oder den Positionen 13, 14 und 20, oder den Positionen 13, 16 und 17, oder den Positionen 13, 17 und 20, oder den Positionen 14, 16 und 17, oder den Positionen 14, 16 und 20, oder den Positionen 14, 17 und 20, oder den Positionen 16, 17 und 20 vorhanden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 13, 16 und 20. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Hormon das Thyreoidea-stimulierende Hormon. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Hormon das follikelstimulierende Hormon. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Hormon das Luteinisierungshormon. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Hormon Choriongonadotropin. In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die basischen Aminosäuren an allen drei Positionen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16 17 und 20 Lysin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein humanes Thyreoidea-stimulierendes Hormon mit mindestens drei basischen Aminosäuren in der α-Untereinheit an den Positionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 bereit, wobei das Thyreoidea-stimulierende Hormon auch eine basische Aminosäure an mindestens einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 58, 63 und 69 der β-Untereinheit hat. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Thyreoidea-stimulierende Hormon eine basische Aminosäure an Position 58 der β-Untereinheit. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Thyreoidea-stimulierende Hormon eine basische Aminosäure an Position 63 der β-Untereinheit. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Thyreoidea-stimulierende Hormon eine basische Aminosäure an Position 69 der β-Untereinheit. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Thyreoidea-stimulierende Hormon eine basische Aminosäure an jeder der Positionen 58, 63 und 69 der β-Untereinheit. In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die basische Aminosäure an mindestens einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 58, 63 und 69 der β-Untereinheit Arginin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, mit basischen Aminosäuren in der α-Untereinheit in allen Kombinationen aller vier Positionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 bereit. Ein Fachmann kann die möglichen verfügbaren Kombinationen leicht bestimmen. In einer Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 11, 13, 16 und 20. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 11, 13, 17 und 20. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 13, 14, 17 und 20. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 13, 14, 16 und 20. In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die basischen Aminosäuren an allen vier Positionen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 Lysin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, mit basischen Aminosäuren in der α-Untereinheit in allen Kombinationen aller fünf Positionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 bereit. Ein Fachmann kann die möglichen verfügbaren Kombinationen leicht bestimmen. In einer Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 13, 14, 16, 17 und 20. In einer anderen Ausführungsform hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an den Positionen 11, 13, 14, 16 und 20. In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die basischen Aminosäuren an allen fünf Positionen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lysin und Arginin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, mit basischen Aminosäuren in der α-Untereinheit in sechs Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 bereit.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein humanes Glykoproteinhormon, TSH, mit einer basischen Aminosäure in der α-Untereinheit an mindestens einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 bereit, wobei es eine basische Aminosäure an mindestens einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 58, 63 und 69 der β-Untereinheit gibt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 58 der β-Untereinheit des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 63 der β-Untereinheit des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das humane Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure an Position 69 der β-Untereinheit des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das humane Glykoproteinhormon basische Aminosäuren an Position 58, 63 und 69 der β-Untereinheit des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons. In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die basische Aminosäure an der Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 58, 63 und 69 Arginin.
In einem anderen Aspekt wird ein humanes follikelstimulierendes Hormon, ein humanes Luteinisierungshormon oder ein humanes Choriongonadotropin-Glykoproteinhormon offenbart, wobei das Hormon eine basische Aminosäure an mindestens einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen in der β-Untereinheit jedes der Glykoproteinhormone umfasst, die den Positionen 58, 63 und 69 der β-Untereinheit des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons entsprechen. Dieser Ansatz ist in gleicher Weise auf nicht menschliche Subjekte anzuwenden. Zum Beispiel können die β-Untereinheit-Aminosäuresequenzen von zwei bovinen Glykoproteinhormonen verglichen werden und es können, basierend auf den Sequenzdifferenzen, Substitutionen an jeder der Untereinheiten vorgenommen werden.
Ein Fachmann kann leicht bestimmen, welche Stellen der β-Untereinheiten der anderen Glykoproteinhormone den Stellen 58, 63 und 69 der β-Untereinheit des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons entsprechen. Vgl. zum Beispiel Ward, et al., In: Bellet, D and Bidard, J. M. (Hrsg.) "Structurefunction relationships of gonadotropins" Serono Symposium Publications, Raven Press, New York, 65: 1–19 (1990), worin die Aminosäuresequenzen von 26 verschiedenen Glykoproteinhormon-β-Untereinheit angeordnet und verglichen werden. Daher kann ein Fachmann an diesen Stellen leicht nicht-basische Aminosäuren der anderen Glykoproteinhormone durch basische Aminosäuren ersetzen.
Auf ähnliche Weise werden andere humane Glykoproteine offenbart, wobei das Hormon eine basische Aminosäure an mindestens einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen in der β-Untereinheit eines Glykoproteinhormons umfasst, das den entsprechenden Positionen in einem beliebigen anderen humanen Glykoproteinhormone entspricht. Zum Beispiel können die Aminosäuresequenz der β-Untereinheiten des humanen Luteinisierungshormons und des humanen Choriongonadotropinhormons verglichen werden, und Aminosäuresubstitutionen an ausgewählten Stellen in jedem dieser Glykoproteinhormone, basierend auf den Aminosäuredifferenzen zwischen den beiden β-Untereinheiten, vorgenommen werden. Dieser Ansatz ist in gleicher Weise auch auf nicht menschliche Subjekte anwendbar.
Die vorliegende Erfindung stellt ein modifiziertes humanes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das gegenüber einem humanen Wildtyp-Glykoprotein eine erhöhte Aktivität aufweist, wobei das modifizierte humane Hormon eine basische Aminosäure umfasst, die an einer Position substituiert ist, die der gleichen Aminosäureposition in einem nicht humanen Glykoproteinhormon entspricht, das gegenüber dem humanen Wildtyp-Glykoprotein eine erhöhte Aktivität aufweist.
Das nicht humane Glykoproteinhormon, das eine erhöhte Aktivität gegenüber dem humanen Wildtyp-Glykoprotein aufweist, kann jede nicht humane Spezies sein. Zum Beispiel können die nicht humanen Spezies bovin sein. Vgl. zum Beispiel Benua, R. S., et al. "An 18 year study of the use of beef thyrotropin to increase I-131 uptake in metastatic thyroid cancer." J. Nucl. Med. 5: 796–801 (1964) und Hershman, J. M., et al. „Serum thyrotropin (TSH) levels after thyroid ablation compared with TSH levels after exogenous bovine TSH: implications for I-131 treatment of thyroid carcinoma." J. Clin. Endocrinol. Metab. 34: 814–818 (1972). Alternativ kann die nicht menschliche Spezies equin, porcin, ovin und so weiter sein. In dem hier enthaltenen Beispiel wird die Sequenz der 10–21 – Aminosäureregion von 27 Spezies offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein modifiziertes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das gegenüber einem Wildtyp-Glykoproteinhormon der gleichen Spezies eine erhöhte Aktivität aufweist, wobei das modifizierte Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure umfasst, die an einer Position substituiert ist, die der gleichen Aminosäureposition in einem Glykoproteinhormon einer anderen Spezies entspricht, das gegenüber dem Wildtyp-Glykoprotein eine erhöhte Aktivität aufweist. Daher kann das Glykoproteinhormon, das modifiziert wird, um seine Aktivität zu erhöhen, aus einer nicht menschlichen Spezies stammen. Zum Beispiel können porcine Glykoproteinhormone mit bovinen Glykoproteinhormonen, porcine Design-Glykoproteinhormone mit Aminosäuresubstitutionen an Positionen verglichen werden, an denen sich die porcinen und die bovinen Sequenzen voneinander unterscheiden, porcine Glykoproteinhormone mit den ausgewählten Veränderungen konstruiert, und die modifizierten porcinen Glykoproteinhormone an porcine Tiere verabreicht werden. Alternativ kann das Glykoproteinhormon, das modifiziert wird, bovin sein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein modifiziertes Glykoproteinhormon, TSH, bereit, das gegenüber einem Wildtyp-Glykoproteinhormon der gleichen Spezies eine erhöhte Aktivität aufweist, wobei das modifizierte Glykoproteinhormon eine basische Aminosäure umfasst, die an einer Position substituiert ist, die der gleichen Aminosäureposition in einem anderen Glykoproteinhormon der gleichen Spezies entspricht, das gegenüber dem Wildtyp-Glykoproteinhormon eine erhöhte Aktivität aufweist. Zum Beispiel können die β-Untereinheiten des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons und des humanen Choriongonadotropins verglichen werden, und es können Aminosäuresubstitutionen an jeder dieser β-Untereinheiten basierend auf jeder Sequenzdivergenz vorgenommen werden. Natürlich werden nur solche Veränderungen betrachtet, die die Aktivität des modifizierten Glykoproteinhormons allgemein erhöhen oder senken, da die Hormonrezeptorspezifität weiter erhalten werden muss. Ein Beispiel für eine Modifikation der β-Untereinheit wird in den Beispielen offenbart, die hier enthalten sind, wobei basische Aminosäuren an den Positionen 58 und 63 des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons, basierend auf dem Sequenzvergleich zwischen dem humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormon und dem humanen Choriongonadotropinhormon, substituiert wurden.
Modifikation bezieht sich auf die Substitution einer nicht-basischen Aminosäure an jeder besonderen Position oder Positionen des Wildtyp-Glykoproteins durch eine basische Aminosäure. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen diese Modifikationen die Substitution einer nicht-basischen Aminosäure durch Lysin.
Die Wirkung der Modifikation oder der Modifikationen auf das Wildtyp-Glykoproteinhormon kann auf beliebige Weise ermittelt werden. Zum Beispiel kann die cyclische AMP- Produktion (cAMP) in Zellen, die mit dem modifizierten Glykoprotein transfiziert wurden, mit der cAMP-Produktion ähnlicher Zellen gemessen und verglichen werden, die mit dem Wildtyp-Glykoproteinhormon transfiziert wurden. Alternativ kann die Progesteronproduktion in Zellen, die mit dem modifizierten Glykoprotein transfiziert wurden, mit der Progesteronproduktion ähnlicher Zellen gemessen und verglichen werden, die mit dem Wildtyp-Glykoproteinhormon transfiziert wurden. Alternativ kann die Aktivität eines modifizierten Glykoproteinhormons aus Rezeptorbindungsassays, aus Thymidin-Aufnahme-Assays oder aus T₄-Sekretionsassays bestimmt werden. Spezifische Beispiele für solche Assays zur Bestimmung der Aktivität der modifizierten Glykoproteinhormone werden in dem hier enthaltenen Beispielabschnitt offenbart. Ein Fachmann kann leicht jeden geeigneten Assay bestimmen, der zu benutzen ist, um die Aktivität entweder eines Wildtyp- oder eines modifizierten Glykoproteinhormons zu bestimmen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das modifizierte Glykoproteinhormon eine Aktivität, die gegenüber der Aktivität des Wildtyp-Glykoproteinhormons um mindestens das 3-fache erhöht ist. Diese erhöhte Aktivität kann mit jeder der Techniken bewertet werden, die oben genannt und in dem Beispiel, das hier enthalten ist, beschrieben werden, oder in jedem anderen geeigneten Assay, wie von einem Fachmann leicht festgestellt werden kann. Die erhöhte Aktivität muss von Assay zu Assay oder von Zelllinie zu Zelllinie nicht konsistent sein, da diese natürlich variieren werden. Zum Beispiel, und wie in dem hier enthaltenen Beispiel offenbart, war die relative Potenz der P16K-Mutation in der α-Untereinheit des humanen Glykoproteinhormons verglichen mit der Aktivität des Wildtyp-Glykoproteinhormons in einem cAMP-Assay ungefähr 6,4-fach höher. In dem Progesteronabgabe-Assay war die Differenz zwischen dem gleichen Mutanten und dem Wildtyp-Glykoproteinhormon jedoch ungefähr 3,4-fach in Potenz und 1,6-fach in Vmax. Diese spezifische Modifikation beweist mindestens einen 3-fachen Anstieg der Aktivität in mindestens einem Assay, und steht daher für ein Glykoproteinhormon mit mindestens einem 3-fachen Anstieg der Aktivität.
Um zusätzliche Aminosäurepositionen zu modifizieren, können Glykoproteinhormonsequenzen von menschlichen und nicht menschlichen Spezies unter Verwendung von Standardcomputersoftwareprogrammen, wie etwa DNASIS (Hitachi Software Engineering Co. Ltd.) angeordnet werden. Die Aminosäurereste, die sich in dem menschlichen und dem nicht menschlichen Glykoproteinhormon unterscheiden, können dann unter Verwendung einer der oben erwähnten Techniken substituiert, und das resultierende Glykoproteinhormon kann auf seine Aktivität unter Verwendung einer der oben erwähnten Assays getestet werden.
Das Subjekt, das behandelt wird oder dem ein modifiziertes Glykoproteinhormon verabreicht wird, kann ein Mensch oder jedes nicht menschliche Säugetier sein. Zum Beispiel können die modifizierten Glykoproteinhormonsuperagonisten bei der Superovulation boviner Tiere durch das Verabreichen dieser Glykoproteinhormone an diese bovinen Tiere verwendet werden.
Die Verfahren, die bei der Substitution einer nicht-basischen Aminosäure durch eine basische Aminosäure an jeder besonderen Position oder Positionen verwendet werden, können auch verwendet werden, um Glykoproteinhormonantagonisten zu entwerfen. Indem spezifische Substitutionen vorgenommen werden und indem die Aktivität dieser modifizierten Glykoproteinhormone überwacht wird, kann bestimmt werden, welche Modifikationen Glykoproteinhormone mit reduzierter Aktivität ergeben. Diese Glykoproteinhormonagonisten können in Untersuchungen des Hormonrezeptors verwendet werden, wie etwa Rezeptor- Turnover-Raten, Rezeptoraffinität für das Glykoproteinhormon, oder sogar in therapeutischen Prozeduren, wie etwa zur Behandlung der Basedow-Krankheit und bei der Fruchtbarkeitskontrolle.
Es wird ein Verfahren zur Behandlung eines Leidens offenbart, das mit einer Glykoproteinhormonaktivität in einem Subjekt assoziiert ist, das die Verabreichung einer therapeutischen Menge des Glykoproteinhormons der vorliegenden Erfindung an das Subjekt umfasst. Diese Leiden beinhalten alle Leiden, die mit einer Glykoproteinhormonaktivität assoziiert sind. Beispiele für diese Leiden beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf ovulatorische Dysfunktion, Lutealphaseninsuffizienz, ungeklärte Unfruchtbarkeit, Unfruchtbarkeit des Mannes, zeitlich begrenzte Fertilisation.
In einem anderen Beispiel kann das Glykoproteinhormon verabreicht werden, um ein Schilddrüsenkarzinom zu diagnostizieren und zu behandeln. Zum Beispiel kann die Verabreichung von bovinem TSH an ein humanes Subjekt verwendet werden, um die Aufnahme von ¹³¹J in Schilddrüsengewebe zu stimulieren, um das Schilddrüsenkarzinom zu behandeln. (Meier, C. A., et al., "Diagnostic use of Recombinant Human Thyrotropin in Patients with Thyroid Carcinoma (Phase I/II Study)." J. Clin. Endocrinol. Metabol. 78: 22 (1994)).
Ein geschickter Fachmann kann leicht die zu verabreichende wirksame Menge des Glykoproteinhormons bestimmen, die von Faktoren, wie etwa Gewicht, Größe, von der Schwere des spezifischen Leidens und der Art des Subjekts selbst abhängen wird. Die therapeutisch wirksame Menge kann leicht durch Routine-Optimierungsprozeduren bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung stellt Glykoproteinhormone, TSH, mit, verglichen mit dem Wildtyp-Glykoproteinhormon, erhöhter Aktivität bereit. Diese modifizierten Glykoproteinhormone werden es einem Fachmann ermöglichen, eine, verglichen mit den Wildtyp-Glykoproteinhormonen niedrigere Dosis eines modifizierten Glykoproteinhormons zu verabreichen, um eine ähnliche therapeutische Wirkung zu erreichen, oder alternativ, eine Dosis des modifizierten Glykoproteinhormons ähnlich der Dosis des Wildtyp-Glykoproteinhormons zu verabreichen, um eine stärkere therapeutische Wirkung zu erreichen.
Abhängig davon, ob das Glykoproteinhormon oral, parenteral oder anders verabreicht wird, kann die Verabreichung des Prostaglandins in Form von festen, halbfesten oder flüssigen Arzneiformen, wie zum Beispiel Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Cremen und Suspensionen, oder ähnliche erfolgen, bevorzugt in einer Dosierungseinheitsform, die sich zur Zuführung einer exakten Dosierung eignet. Das Glykoproteinhormon kann eine wirksame Menge des ausgewählten Glykoproteinhormons in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhalten, und kann zusätzlich andere Arzneimittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Hilfsmittel, Verdünnungsmittel usw. beinhalten. Mit "pharmazeutisch akzeptabel" ist ein Material gemeint, das weder biologisch noch sonst unerwünscht ist, d. h., dass das Material einem Individuum zusammen mit dem ausgewählten Glykoproteinhormon verabreicht werden kann, ohne unerwünschte biologische Wirkungen zu verursachen, oder auf unerwünschte Weise mit dem Glykoproteinhormon zu interagieren. Aktuelle Verfahren zur Produktion solcher Arzneiformen sind bekannt oder für den Fachmann offensichtlich; vgl. zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, jüngste Ausgabe (Mack Publishing Co., Easton, PA.).
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren offenbart, das die Reproduktion in einem Subjekt unterstützt, das das Verabreichen einer unterstützenden Menge des Glykoproteinhormons der vorliegenden Erfindung umfasst. Zum Beispiel kann bei einem Subjekt mit isolierter Gonadotropindefizienz (IGD) die Verabreichung eines modifizierten follikelstimulierenden Hormons (Follitropin) und eines Luteinisierungshormon (Lutropin) angewandt werden, um die normale Keimdrüsenfunktion wieder herzustellen. Es ist dem Fachmann allgemein bekannt, dass Glykoproteinhormone, wie etwa FSH und LH, bei der weiblichen Fortpflanzungsphysiologie integral sind, und diese Glykoproteinhormone können einem Subjekt verabreicht werden, um ein Anzahl von Reproduktionsstörungen zu beheben und dadurch die Reproduktion zu unterstützen.
Gentherapie ist ein anderer Ansatz zur Behandlung von Hormonstörungen mit den modifizierten Glykoproteinhormonen der vorliegenden Erfindung. In diesem Ansatz kann ein Gen, das das modifizierte Glykoproteinhormon kodiert, in eine Zelle, wie etwa eine Keimbahnzelle oder eine Körperzelle, eingeführt werden, so dass das Gen in der Zelle exprimiert wird, und die nachfolgenden Generationen dieser Zellen in der Lage sind, das eingeführte Gen zu exprimieren. Zum Beispiel kann jedes besondere Gonadotropinhormon in eine Ovarialzelle oder deren Vorläufer, inseriert werden, um die Ovulation zu verbessern. Alternativ kann das Einführen von Schilddrüsenzellen, die ein Gen tragen, das einen Superagonisten des Thyreoidea-stimulierenden Hormons kodiert, in ein Individuum mit Schilddrüsenkarzinom den Bedarf an kontinuierlicher Verabreichung von TSH zur Stimulierung der Radioiod-Aufnahme in das Schilddrüsenkarzinom beseitigen. Geeignete Vektoren, um die kodierende Sequenz zuzuführen, sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel könnte der Vektor viral, wie etwa adenoviral, adenoassoziierter Virus, Retrovirus, oder nicht viral, wie etwa kationische Liposomen, sein.
Die modifizierten Glykoproteinhormone, wie sie von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, können auch verwendet werden, um die Zuführung therapeutischer Mittel an Schilddrüsengewebe oder Keimdrüsengewebe zu lenken, oder bei der Behandlung bestimmter Neoplasmen.
In noch einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Konstruktion superaktiver nicht chimärischer Analoga humaner Hormone offenbart, das das Vergleichen der Aminosäuresequenz eines aktiveren Homologs einer anderen Spezies mit dem humanen Hormon, das Substituieren der Aminosäuren in dem humanen Hormon mit den entsprechenden Aminosäuren aus den anderen Spezies, das Bestimmen der Aktivität des substituierten humanen Hormons und das Auswählen superaktiver Analoga aus den substituierten humanen Hormonen umfasst. Superaktive Analoga humaner Hormone beinhalten jedes Analog, dessen Aktivität gegenüber der entsprechenden Aktivität des Wildtyp-Hormons erhöht ist. Zum Beispiel führt die Modifikation des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons an Position 11 in der α-Untereinheit von Threonin zu Lysin (T11K) zu einem relativen Anstieg in der cAMP-Produktion in JP09-Zellen, die in vitro kultiviert wurden. (Vgl. Tabelle II, wie in dem Beispiel offenbart, das hier enthalten ist). Diese Modifikation des humanen Thyreoidea-stimulierenden Hormons führt daher zu einem superaktiven Analog des humanen Wildtyp-Thyreoidea-stimulierenden Hormons. Die zu substituierende(n) spezifische(n) Aminosäure oder Aminosäuren, um die Modifikation zu erzeugen, kann, wie oben diskutiert, bestimmt werden durch: Bestimmen der Aktivität des Homologs einer anderen Spezies und Vergleichen der Aktivität mit dem humanen Hormon; dann Vergleichen der angeordneten Sequenzen, um die Aminosäuresequenzdifferenzen zu bestimmen; dann Substituieren der geeigneten Aminosäure in dem Hormon von einer anderen Spezies für die Aminosäure an der entsprechenden Position in dem humanen Hormon; dann Bestimmen der Aktivität des modifizierten humanen Hormons durch eine der oben erwähnten Techniken; und dann Vergleichen der Aktivität der modifizierten humanen Hormone mit den humanen Wildtyp-Hormonen, wodurch die superaktiven Analoga aus den substituierten humanen Hormonen ausgewählt werden.
Es können alle Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen benutzt werden, um einen Glykoproteinsuperagonisten zu erhalten. Zum Beispiel können neutrale Aminosäuren durch basische oder azidische Aminosäuren ersetzt werden. Alternativ können basische Aminosäuren mit azidischen oder neutralen Aminosäuren substituiert werden, oder azidische Aminosäuren können mit neutralen oder basischen Aminosäuren substituiert werden. Ein Fachmann wird erkennen, wie oben untersucht, dass Substitutionen von Aminosäuren durch andere entweder auf der Ebene der Nukleinsäure in der Nukleotidsequenz, die das Glykoproteinhormon kodiert oder Teile des Glykoproteinhormons, oder auf der Ebene des Polypeptid stattfinden kann.
BEISPIELE
Die Sequenz zwischen Cys10 und Pro21 der humanen α-Untereinheit wurde als primäres Target für die Mutagenese ausgewählt (1). hCG-basierte Homologiemodellierung deutete darauf hin, dass diese Region der α-Untereinheit von der β-Untereinheit in allen Glykoproteinhormonen entfernt ist, mehrere Oberflächen-exponierte Reste enthält und eine einzelne Windung einer 3₁₀-Helix zwischen Pro16 und Ser19¹ beinhaltet. Die humane α-Untereinheit unterscheidet sich von der bovinen in Position 11, 13, 16, 17 und 20 (1a) und vier von diesen Veränderungen sind nicht konservativ (Thr11 → Lys, Gln13 → Lys, Pro16 → Lys und Gln20 → Lys). Wir verwendeten PCR-Amplifikation, um die Sequenz der 11–20-Region in der α-Untereinheit mehrerer Primaten, einschließlich höherer Affen (gewöhnliche Schimpansen – Pan troglodytes, Orang-Utan – Pongo pygmaeus), niedriger Affen (Gibbon – Hylobates sp.), Schmalnasenaffen (Pavian – Papio anubis) zu bestimmen und sie mit den bereits bekannten Säugetiersequenzen zu vergleichen, einschließlich Macacus rhesus (Macaca mulatta; Schmalnasenaffe), gewöhnlicher Marmoset (Callithrix Jacchus; Breitnasenaffen) und Mensch (1a). Der gleichzeitige Vergleich der Sequenzen zwischen verschiedenen Spezies deutete darauf hin, dass in der Primatenevolution basische Reste in dieser Region erst relativ spät ersetzt wurden. Das Gen der Rhesusaffen-α-Untereinheit kodiert für Lys-Reste an den Positionen 11, 16 und 20 und einen Arg-Rest an Position 13², die Paviansequenz kodiert für Gln an Position 16, während die Gibbonsequenz nur eine schwach basische Imidazoliumgruppe von His an Position 13 enthält (1a). Offensichtlich wurde ein Cluster positiv geladener Aminosäuren in dieser Region erhalten und während der Wirbeltierevolution modifiziert, die aber in der Sequenz der höheren Affen und des Menschen nicht vorhanden ist. Die allmähliche Entfernung positiv geladener Reste in der 11–20-Region einer α-Untereinheit koinzidiert mit der evolutionären Divergenz der Hominoiden (Mensch und Affen) aus dem Schmalnasenaffen. Unsere Hypothese, dass diese Region die Bindung an den Rezeptor modulieren könnte, wurde ferner unterstützt durch: 1) die höchste Reaktivität von Tyr21 in bTSH gegenüber Iodierung³, 2) Kartierung antigener Determinanten in hCG⁴, 3) die Rolle der Aminogruppen von Lys in der α-Untereinheit von Mensch und Schaf für eine wirksame Hormon-Rezeptor-Interaktion, wie durch Acylierung⁵ untersucht, Markieren mit Essigsäureanhydrid⁶ und PEGylierung einzelner Untereinheiten.
Folglich wurden positiv geladene Lys-Reste in die Cys10-Pro21-Region der humanen α-Untereinheit inseriert (1b). Zwei andere Regionen wurden ebenfalls mutagenisiert (Tabelle I). Eine einzelne nicht konservative Leu69 → Arg-Mutation in der TSHβ-Untereinheit wurde, basierend auf einem ähnlichen Sequenzvergleich, vorgenommen.
Wirkungen der Mutationen
Die Cotransfektion von Wildtyp (WT) oder mutanten menschlichen α und hTSHβ⁷ oder hCGβ cDNAs in verschiedener Kombination in CHO-K1-Zellen führten zur Expression von 14 hTSH und 11 hCG Heterodimeren (Tabelle I). Im Gegensatz zu vielen anderen Mutagenese-Untersuchungen^8,9 war die Expression von Mutanten im Allgemeinen mit der des WT vergleichbar. Die folgenden hTSHα-Mutanten wurden mit höheren Leveln exprimiert als WT-hTSH: T11K, Q13K, P16K, Q20K, Q50P und Q13K + P16K + Q20K. Somit beeinträchtigt dieser Satz an evolutionär begründeten Mutationen die Synthese des hTSH- oder hCG-Moleküls nicht in größerem Umfang, kann aber in bestimmten Fällen die Hormonproduktion erleichtern.
Verschiedene Bioassays wurden verwendet, um die relative Potenz und Wirksamkeit von hTSH- und hCG-Mutanten zu vergleichen. Die Fähigkeit von WT- und Mutanten-hTSH, die cAMP-Produktion zu stimulieren, wurde in CHO-JP09-Zellen mit stabil transfiziertem humanem TSH-Rezeptor getestet. Dieser Assay lies die folgende Reihenfolge der Potenzen in einzelnen α-Untereinheit-Mutanten erkennen: P16K (6-fach niedrigere EC₅₀ als WT) ≥ Q20K > Q13K > T11K > WT-hTSH ≈ Q50P R67K (Tabelle II). Die Rezeptorbindungsaktivität von WT- und Mutanten-hTSH wurde in einem kompetitiven Bindungsassay an porcinen Schilddrüsenmembranen getestet. Konsistent mit der cAMP-Stimulation wurde die folgende Reihenfolge der Potenzen beobachtet: P16K (5-fache Affinität wie WT) > Q20K ≥ Q13K > T11K > WT-hTSH ≈ Q50P ≈ R67K (Tabelle II). Somit war der Potenzanstieg einzelner Mutanten, der in JP09-Zellen beobachtet wurde, direkt mit dem Anstieg der Affinität zu dem TSH-Rezeptor korreliert. Insbesondere verursachte jede Mutation an einem Lys-Rest in der 11–20-Region einen substanziellen Anstieg der Aktivität, Veränderungen außerhalb dieser kritischen Region hatten keine (R67K, Q50P) Wirkung auf die Rezeptorbindungsaffinität und die Bioaktivität (Tabelle II). Die Alaninmutagenese der Aminosäuren 13, 16 und 20 in hTSH veränderte die Hormonaktivität nicht signifikant, was anzeigt, dass nur die selektive Rekonstitution basischer Aminosäuren, die in homologen Hormonen anderer Spezies vorhanden sind, zu funktionellen Veränderungen führten. Überdies zeigte der Austausch von αSer43 mit Arg und das Ersetzen von αHis90 und αLys91, dass diese Reste für hTSH weniger wichtig waren als für die hCG-Bioaktivität, was die hormon- und ortsspezifischen Rollen der basischen Reste⁹ betont.
Superagonisten mit kombinierten Mutationen

Um die Wirkung von Lys-Resten, die einzeln für den größten Anstieg der Potenz verantwortlich waren, weiter zu untersuchen, wurden Mutanten produziert, die mehrfache Ersetzungen enthielten. Die aktivsten Mutanten sind in 2 und 3 dargestellt. Die doppelten Pro16 → Lys + Gln20 → Lys- und die dreifachen Pro16 → Lys + Gln20 → Lys + Gln13 – Lys-Mutanten zeigten jeweils eine 12 bzw. 24-fach höhere Aktivität als WT-hTSH, mit einem weiteren bis zu 35-fachen Potenzanstieg nach dem Ersatz von Leu69-Arg in der TSHβ-Untereinheit (2a). Zusätzliche Optimierung, die die Substitution Glu14 → Lys (Lys in dieser Position ist in der Tunfisch-Sequenz vorhanden) beinhaltete, führte zu einem weiteren bis zu 95-fachen Anstieg an Bioaktivität; diese potentesten mehrfachen Mutanten erhöhten die Wirksamkeit (maximale Antwort) mindestens 1,5-fach (2b). Diese Anstiege wurden durch Testen der Fähigkeit von hTSH-Mutanten, an porcinem TSH-Rezeptor sowie humanen TSH-Rezeptor zu binden, verifiziert (Tabelle II, 2c und 2d), um Wachstum in FRTL-5-Zellen (2e) sowie T₃-Produktion in kultivierten humanen Schilddrüsenfollikeln zu induzieren. Insbesondere Pro16 → Lys + Gln20 → Lys + Gln13 → Lys/WT-hTSHβ- und Pro16 → Lys + Gln20 → Lys + Gln13 → Lys/Leu69 → Arg-Mutanten erforderten eine 18- bzw. 27-fach niedrigere Konzentration als WT-hTSH, um die halbmaximale Stimulation der ³H-Thymidininkorporation in FRTL-5-Zellen zu erreichen (2e). Die synergistische Wirkung der mehrfachen Mutationen auf die TSH-Bioaktivität war nicht auf eine lokale Kooperation von Lys-Resten in der 13–20-Region der α-Untereinheit mit Rezeptor begrenzt, sondern umfasste auch die Kontribution von Arg69 in dem entgegengesetzten Loop der β-Untereinheit (Tabelle II). TABELLE I Relative Expression von Wildtyp-(WT) und Mutantenhormonen in CHO-K1-Zellen

	hTSH	hCG
WT	100 ± 7	100 ± 4
T11K	267 ± 22	82 ± 2
Q13K	188 ± 9	106 ± 7
P16K	206 ± 25	72 ± 6
Q20K	149 ± 18	117 ± 8
P16K + Q20K	86 ± 9	62 ± 6
Q13K + P16K + Q20K	134 ± 6	76 ± 12
Q13K + P16K + Q20K + E14K	76 ± 12	52 ± 8
P16K + F17T	23 ± 10	93 ± 4
Q50P	174 ± 15	83 ± 3
R67K	171 ± 14	88 ± 6
β3-L69R	74 ± 5	entfällt
Q13K + P16K + Q20K + β-L69R	86 ± 6	entfällt
Q13K + P16K + Q20K + E14K + β-L69R	25 ± 6	entfällt

Die Sekretionslevel sind als Mittelwert ± Standardfehler im Vergleich zum WT angegeben, der als 100% WT-hTSH bzw. WT-hCG definiert wurde. Der Mittelwert wurde aus mindestens vier unabhängigen Transfektionen berechnet, die für jeden Mutanten in mindestens fünf Platten durchgeführt wurden.
Diese Befunde wurden ferner im Tiermodell bestätigt. Eine einzige Injektion von Pro16 → Lys-, Gln20 → Lys- und Gln13 → Lys-hTSH-Mutanten in Mäusen erhöhte das T₄-Serum signifikant stärker als WT-hTSH. Überdies generierten Pro16 → Lys + Gln20 → Lys + Gln13 → Lys/WT-hTSHβ- und Pro16 → Lys + Gln20 → Lys + Gln13 → Lys/Leu69 → Arg-Mutanten auch verglichen mit WT-hTSH höhere T4-Levels (2f). Die hTSH-Serum-Level 6 Std. nach ip-Injektion in Mäusen waren ähnlich und die hTSH-Analoga zeigten, verglichen mit dem WT, große Differenzen bei der metabolischen Clearance-Rate.
Ein Sequenzvergleich der hCG- und hTSHβ-Untereinheiten zeigte eine Region (Reste 58–69 in TSHβ), die ein Cluster aus basischen Resten in hCG, nicht aber in hTSH, enthält. Wir verwendeten die ortsgerichtete Mutagenese, um einzelne und mehrfache basische Reste in hTSH einzuführen, basierend auf ihrer Lage in hCG, was die zusätzlichen hTSHβ-Untereinheit-Mutanten (I58R, E63R, I58R + E63R, 158R + E63R + L69R) generierte. Die Mutanten-hTSHβ-Untereinheiten wurden mit der humanen α-Untereinheit coexprimiert und die intrinsische Aktivität der rekombinanten hTSH-Analoga am Ratten-THS-Rezeptor (FRTL-5-Zellen) und am humanen TSH-Rezeptor (CHO-hTSHr-Zellen) untersucht. In beiden Systemen erhöhten einzelne Substitutionen (I58R, E63R) die Potenz von hTSH 2-fach bis 4-fach und führten zu einem leichten Anstieg der Wirksamkeit (2g). Die Kombination der beiden Substitutionen (I58R + E63R) führte zu einer Potenz, die 15-fach höher war als die des Wildtyp-hTSH und zu einem 1,5-fachen Anstieg der Wirksamkeit (2g). Die Potenz und Wirksamkeit der Mutantenkombination I58R + E63R + L69R, bei der drei basische Reste eingeführt wurden, war 50-fach bzw. 1,7-fach gesteigert (2g). Diese Anstiege der intrinsischen Aktivität waren von gleichzeitigen Anstiegen der Rezeptorbindungsaffinität begleitet, die mit einem Rezeptorbindungsassay unter Verwendung von CHO-JP09-Zellen beurteilt wurden. (2h). Auf ähnliche Weise war, wenn Mäusen der I58R + E63R + L69R-Mutant injiziert wurde, deren T4-Stimulation signifikant höher als bei Mäusen mit Schein- als auch mit Kontroll-Injektion. (2i).
Die Bioaktivität von hCG-Mutanten wurde unter Verwendung von Progesteronstimulation in mit humanem LH/hCG-Rezeptor transfizierten MA-10-Zellen und cAMP-Stimulation in COS-7-Zellen, getestet. Die hCG-Lys-Mutanten zeigten sowohl höhere Potenz (niedrigere EC₅₀-Werte) als auch höherer Wirksamkeit (V_max) als WT-hCG (Tabelle II, 3a). Die Wirkung einzelner und mehrfacher Mutationen war relative analog zu dem, was für die hTSH-Mutanten beobachtet wurde. Der αPro16 → Lys/WT-hCGβ-Mutant war bei der Stimulation der Progesteronproduktion und der Rezeptorbindungsaktivität in MA-10-Zellen 4-fach aktiver als WT-hCG, mit weiteren Anstiegen sowohl der Potenz als auch der Wirksamkeit für die Pro16 → Lys + Gln20 → Lys und Pro16 → Lys + Gln20 → Lys hCG + Gln13 → Lys-Mutanten (3a und 3b). Ähnliche Anstiege der intrinsischen Aktivität wurden auch bei der Untersuchung am humanen LH/hCG-Rezeptor (COS-7-hLH/hCG-R-Zellen) festgestellt (3c und 3d).
Unsere Daten deuten darauf hin, dass nur einige wenige Aminosäureersetzungen ausreichend sind, um die Glykoproteinhormonbioaktivität zu erhöhen, sogar auf eine höhere Ebene als die des Modellhormons (wie etwa bTSH). Interessanterweise scheinen nur einige wenige der 40 Reste, die sich in bovinem und humanem TSH unterscheiden, für die höhere biologische Aktivität von bTSH verantwortlich zu sein. Der Großteil der anderen Ersetzungen ist konservativ, und scheint, wie durch die R67K-Mutation in der A-Untereinheit illustriert, keine funktionelle Bedeutung zu haben. Dagegen zeigen wir, dass die an der Oberfläche liegenden Lys-Reste, die in dem L1-Loop und dem β1-Strang der α-Untereinheit geclustert sind, für die hohe Bioaktivität von bTSH entscheidend sind. Dementsprechend erreicht ein rekombinantes hTSH mit nur zwei mutierten Aminosäuren (P16K + Q20K) eine intrinsische Aktivität, die mit bTSH vergleichbar ist (Tabelle II). Überdies zeigen dreifache, vierfache und fünffache hTSH-Mutanten sogar noch höhere Potenz als bTSH. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Differenz in der Aktivität zwischen bTSH und hTSH ein Ergebnis mehrerer Aminosäureveränderungen ist, einschließlich Ersetzungen, die die Aktivität erhöhen, aber auch anderer, die die Biopotenz von bTSH am hTSH-Rezeptor reduzieren können.
Wenngleich wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass aus einer einzigen transfizierten cDNA mehrere Rezeptorspezies entstehen könnten (durch alternatives Spleißen aus kryptischer Stellen oder durch posttranslationale Modifikationen), spricht die Tatsache, dass ähnliche Differenzen bei der Aktivität in verschiedenen Zellsystemen beobachtet wurden, stark gegen die Bedeutung verschiedener Rezeptorspezies beim Anstieg an Potenz, Wirksamkeit und Affinität dieser Analoga. Weiterhin gibt es zwingende Beweise, dass natürlich vorkommende Hormonisoformen mit verschiedenen Kohlenhydratresten ihre Wirkung auf post-Rezeptorlevel mit keiner oder minimaler Wirkung auf die Rezeptorbindungsaffinität¹⁰ ausüben. Da die Wildtyp-Hormone und deren Analoga in mehrfachen Versuchssystemen charakterisiert wurden, ist es sehr wahrscheinlich, dass das Phänomen der erhöhten Bioaktivität, das hier beschrieben wird, bezogen auf besondere zellabhängige Rezeptorvarianten, eher die Regel als die Ausnahme ist.
Perspektiven zum rationalen Entwerfen von Glykoproteinhormonanaloga
Vorausgehende Untersuchungen von Glykoproteinhormonen mit ortsgerichteter Mutagenese konzentrierten sich primär auf die stark konservierten Regionen und Reste, unter Verwendung solcher Strategien, wie Alanin-Scanning-Mutagenese¹¹ oder Ansätze zur Mehrfachersetzung⁹. Mehrere wichtige Untersuchungen basierten auf der Erzeugung chimärischer Untereinheiten unter Verwendung von Kassettenmutagenese und/oder Restriktionsfragmentaustausch^12,13,14. Unsere Strategie des Ersetzens nicht-konservierter Reste durch solche, die in anderen Spezies vorhanden waren, war erfolgreich und erlaubte die Erzeugung anderer Glykoproteinhormonanaloga, einschließlich hFSH-Mutanten mit erhöhter Bioaktivität. Die gleichzeitige Verbesserung der Bioaktivität von hTSH, hCG und hFSH durch die Einführung basischer Reste in die 11–20-Region der humanen α-Untereinheit kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass diese Region von der β-Untereinheit in dem auf der Kristallstruktur basierenden Modell von hCG und unserem Homologiemodell von hTSH entfernt ist. Die virtuelle Identität dieses Bereichs in beiden Modellen sowie die Beobachtung, das die Antikörper, die an die 11–26-Region binden, von der Untereinheitkombination¹⁵ nicht stark beeinflusst werden, deuten darauf hin, dass diese Domäne in allen Glykoproteinhormonen ähnlich funktionieren könnte. Sobald die α-Untereinheit erfolgreich gentechnisch verändert wurde, um potentere Agonisten von hTSH, hCG oder hFSH zu erzeugen, wurde das gleiche Paradigma verwendet, um deren jeweilige β-Untereinheiten zu modifizieren, um die entscheidenden Superagonisten jedes Glykoproteinhormons zu generieren. Zum Beispiel führte eine zusätzliche Ersetzung eines nicht polaren Leu69 mit Arg in der TSHβ-Untereinheit zu einem weiteren Anstieg der hTSH-Bioaktivität. Außerdem kann die Plasma-Halbwertszeit unserer Analoga hinsichtlich spezifischer therapeutischer Bedürfnisse modifiziert werden.
Das weitere Design und die Verfeinerung von Glykoproteinhormonanaloga wird die ausführliche dreidimensionale Struktur des Hormon-Rezeptor-Komplexes beinhalten. Wenngleich die genaue Struktur des Glykoproteinhormonrezeptors noch nicht herausgefunden wurde, wurden mehrere Modelle der Hormon-Rezeptor-Interaktion vorgeschlagen^15,16,17,18. Gemäß dem neuen Modell von Jiang et al.¹⁷ kann der L1-Schleife der α-Untereinheit an der Interaktion mit dem Transmembranabschnitt des Rezeptors beteiligt sein. Die Cluster positiv geladener Reste in dieser Schleife können eine solche Interaktion verbessern und weitere Umordnungen in dem Rezeptor erleichtern, was zur Aktivierung von G-Proteinen und zu Signaltransduktion führt.
Verfahren und Materialien.
Restriktionsenzyme, DNA-Marker und andere molekularbiologische Reagenzien wurden entweder von Gibco BRL (Gaithersburg, Maryland) oder von Boehringer-Mannheim (Indianapolis, Indiana) gekauft. Zellkulturmedien, fötales Kälberserum und LipofectAMINE wurden von Gibco BRL (Gaithersburg, Maryland) gekauft. VentR-DNA-Polymerase wurde von New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) gekauft. Die humane Volllängen-αcDNA (840 bp), subkloniert in BamHI/XhoI-Stellen des pcDNA I/Neo-Vektors (Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornien) und hCG-β-Gen wurden von Dr. T. H. Ji (University of Wyoming, Laramie, Washington) erhalten. Das hTSH-β-Minigen ohne das erste Intron mit dem nichttranslatierten 1. Exon und authentischer Translationsinitiationsstelle wurde in unserem Labor konstruiert. Standard-rhTSH-G war von Genzyme Corp. (Framingham, Mass.). Die CHO-Zellen mit stabil exprimiertem hTSH-Rezeptor (CHO-hTSHR Klon JP09 und Klon JP26) wurden von Dr. G. Vassart (University of Brussels, Brüssel, Belgien) bereitgestellt. Die humane LH-Rezeptor-cDNA wurde von Dr. T. Minegishi (Gunma University, Gunma, Japan) erhalten. FRTL-5-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. L. D. Kohn (NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland) zur Verfügung gestellt. MA-10-Zellen wurden großzügigerweise von Dr. M. Ascoli (University of Iowa, Iowa City, Iowa) zur Verfügung gestellt. ¹²⁵I-cAMP und ¹²⁵I-hTSH waren von Hazleton Biologicals (Vienna, Virginia). Blutproben verschiedener Primaten wurden vom Yerkes Regional Primate Research Center (Emory University, Atlanta, Georgia) und Animal Resources (University of Oklahoma, Oklahoma City, Oklahoma) erhalten.
Bestimmung der α-Untereinheit-Sequenzen von Primaten
Der QIAamp^R-Blood-Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, Kalifornien) wurde für die Extraktion genomischer DNA aus allen Blutproben von Schimpanse (Pan troglodytes), Orang-Utan (Pongo pygmaeus), Gibbon (Hylobates sp.) und Pavian (Papio anubis) verwendet. Genomische DNA wurde in der PCR verwendet; die verwendeten synthetischen Oligonukleotidprimer waren
5'-CCTGATAGATTGCCCAGAATGC-3' (Sense) (SEQ ID NO: 1) und
5'-GTGATAATAACAAGTACTGCAGTG-3' (Antisense) (SEQ ID NO: 2)
und wurden gemäß der Nukleotidsequenz des Gens synthetisiert, das die gemeinsame α-Untereinheit der humanen Glykoproteinhormone¹⁹ kodiert. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 800 bis 1.000 ng genomischem DNA-Template und 10 Picomol jedes Primer in 100 μl Reaktionsvolumen, das auch 10 mM Tris-HCl, (pH-Wert 9,0 bei 25°C), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs und 2 U Taq DNA-Polymerase (Promega Corp. Madison, Wisconsin) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde mit mineralischem Öl bedeckt, und jede Probe wurde zuerst 10 Min. lang auf 95°C erhitzt. Das PCR-Programm bestand aus 32 Denaturierungszyklen bei 95°C während 1 Min. und 30 Sek., Annealing bei 55°C während 1 Min. und 30 Sek. und Extension bei 72°C während 1 Min., gefolgt von einer letzten Extensionsphase bei 72°C während 7 Min. Die Reaktionen wurden dann direkt der Elektrophorese auf einem 1%-igen Agarosegel in Gegenwart von Ethidiumbromid unterzogen. Das amplifizierte PCR-Produkt (700 bp), das die Nukleotidsequenz von Exon 3, Intron 3 und Exon 4 umspannte, wurde unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc., Chatsworth, Kalifornien) gereinigt und in pCR^TM II unter Verwendung des Original TA Cloning Kit (Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornien) subkloniert. Die Sequenz des Fragments wurde nach dem Subklonieren oder der direkten Didesoxy-Sequenzierung unter Verwendung eines Sequenase Kits (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) erhalten.
Homologiemodellierung.
Die Modellierung beruht auf der starken Sequenzhomologie zwischen hCG und hTSH. Die Sequenzen wurden angeordnet, um die Cysteinknotenreste in Übereinstimmung zu bringen, und der Prozentsatz der identischen als auch der hoch konservativen Ersetzungen wurde, wie beschriebene, berechnet. Es gab 58%-ige Sequenzidentität zwischen hCG- und hTSH-Molekülen; 31% der beiden β-Untereinheitsequenzen waren identisch und zusätzliche 17% beinhalteten stark konservative Veränderungen in der β-Untereinheit. Ein Molekularmodell von hTSH wurde auf einem Template des hCG-Modells erstellt, abgeleitet von den kristallographischen Koordinaten, die von der Brookhaven-Datenbank²⁰ erhalten wurden. Alle Koordinatenmanipulationen und Energieberechnungen erfolgten unter Verwendung von CHARMm, Version 21.2 für Convex und unter Verwendung der Molekülgrafik-Software QUANTA (Version 3.3, Molecular Simulations Inc., University of York, York, Vereinigtes Königreich) weiter modifiziert.
Ortsgerichtete Mutagenese.
Die Mutagenese der humanen α-cDNA und des hTSHβ-Minigens wurde durch das PCR-basierte Megaprimer-Verfahren²¹ ausgeführt. Die Amplifikation wurde unter Verwendung von Vent^R DNA Polymerase (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) optimiert. Nach der Verdauung mit BamHI und XhoI, wurde das PCR-Produkt in pcDNA I/Neo (Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornien) ligiert, wobei das BamI/XhoI-Fragment exzidiert wurde. MC1061/p3-E.-coli-Zellen wurden unter Verwendung von Ultracomp E. coli Transformation Kit (Invitrogen Corp.) transformiert. Der QIAprep 8 Plasmid Kit (QIAGEN Inc., Chatsworth, Kalifornien) wurde für mehrfache Plasmid-DNA-Produktionen verwendet. QIAGEN Mega- und Maxi-Reinigungsprotokolle wurden verwendet, um größere Mengen an Plasmid-DNA zu reinigen. Mehrfache Mutanten wurden mit dem gleichen Verfahren unter Verwendung von Plasmiden erzeugt, die α- cDNA mit einer einzigen Mutation als Template für weitere Mutagenese enthielten. Die Mutationen wurden durch Doppelstrang-Sequenzierung unter Verwendung der Sanger-Didesoxynukleotid-Kettenabbruch-Prozedur bestätigt.
Expression rekombinanter Hormone.
CHO-K1-Zellen (ATCC, Rockville, Maryland) wurden in Ham's F-12 Medium mit Glutamin und 10% FBS, Penicillin (50 Einheiten/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) erhalten. Zellplatten (100 mm-Petrischalen) wurden mit Wildtyp- oder Mutanten-α-cDNA in pcDNA I/NEO cotransfiziert und hTSHβ-Minigen in den p(LB)CMV-Vektor⁷ inseriert, oder pcDNAI/Neo, der hCGβ-cDNA⁸ enthielt, unter Verwendung von LipofectAMINE (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland). Nach 24 Std. wurden die transfizierten Zellen in CHO-Serum-freies Medium (CHO-SFM-II, Gibco BRL.) übertragen. Die Kulturmedien, einschließlich Kontrollmedium aus Schein-Transfektionen unter Verwendung der Expressionsplasmide ohne Geninserte wurden 72 Std. nach der Transfektion geerntet, konzentriert und zentrifugiert; die Aliquots wurden bei –20°C gelagert und erst direkt vor jedem Assay aufgetaut. WT- und Mutanten-hTSH wurden gemessen und unter Verwendung von vier verschiedenen Immunoassays, wie beschrieben⁹, verifiziert. Die Konzentrationen von WT- und Mutanten-hCG wurden unter Verwendung des Chemilumineszenzassays (hCG Kit, Nichols Institute, San Juan Capistrano, Kalifornien) und des immunoradiometrischen Assays (hCG IRMA, ICN, Costa Mesa, Kalifornien) gemessen.
cAMP-Stimulation in JP09-Zellen, die den humanen TSH-Rezeptor exprimieren.
CHO-Zellen, die stabil mit der hTSH-Rezeptor-cDNA (JP09) transfiziert waren, wurden gewachsen und mit Reihenverdünnungen von WT- und Mutanten-hTSH, wie beschrieben⁹, inkubiert. cAMP, das in das Medium abgegeben wurde, wurde mit einem Radioimmunoassay²² gemessen. Die äquivalenten Mengen des gesamtem Medienproteins wurden als Placebo-Kontrolle verwendet und der hTSH-enthaltenden Proben von transfizierten Zellen.
cAMP-Stimulation in COS-7-Zellen, die den humanen LH-Rezeptor exprimieren.
COS-7-Zellen, die vorübergehend mit hLH-Rezeptor-cDNA transfiziert wurden, wurden gewachsen und mit Reihenverdünnungen von WT- und Mutanten-hCG im Wesentlichen wie beschrieben²³ inkubiert. cAMP, das in das Medium abgegeben wurde, wurde mit einem Radioimmunoassay²² gemessen. Die äquivalenten Mengen des gesamtem Medienproteins wurden als Placebo-Kontrolle verwendet und der hCG-enthaltenden Proben von transfizierten Zellen.
Stimulation der Progesteronproduktion in MA-10-Zellen.
Transformierte murine Leydig-Zellen (MA-10), die in Kulturplatten mit 96-Vertiefungen gewachsen wurden, wurden mit WT- und Mutanten-hCG 6 Stunden lang in dem Assaymedium, wie beschrieben²⁴, inkubiert. Die Menge an Progesteron, die in das Medium abgegeben wurde, wurde mit Radioimmunoassay (CT Progesterone Kit, ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, Kalifornien) bestimmt.
Rezeptorbindungsassays.
Die Rezeptorbindungsaktivitäten der hTSH-Analoga wurden in ihrer Fähigkeit getestet, ¹²⁵I-bTSH aus löslich gemachten porcinen Schilddrüsenmembranen²²⁴ zu verdrängen. Die Bindungsaktivitäten ausgewählter Analoga des humanen TSH-Rezeptors wurden unter Verwendung von JP09-Zellen getestet. Die Bindungsaktivitäten der hCG-Analoga an MA-Zellen und an COS-7-Zellen, die vorübergehend mit humanem LH-Rezeptor transfiziert waren, wurden unter Verwendung von ¹²⁵I-hCG und Assaymedium, wie zuvor beschrieben²⁴, bestimmt.
Thymidin-Aufnahmestimulation in FRTL-5-Zellen.
Das Wachstum von Rattenschilddrüsenzellen (FRTL-5) wurde, wie zuvor beschrieben²² überwacht.
Stimulation der T₄-Sekretion bei Mäusen.
Die In-vivo-Bioaktivität des WT- und des Mutanten-TSH wurde unter Verwendung eines modifizierten McKenzie-Bioassays^22,25 bestimmt. WT- und Mutanten-TSH wurden i. p. in männliche Swiss Cr1:CF-1-Albinomäuse injiziert, wobei das endogene TSH durch Verabreichung von 3 μg/ml T₃ in Trinkwasser für 6 Tage supprimiert wurde. Blutproben wurden 6 Std. später aus dem orbitalen Sinus entnommen und die T4-Serum- und TSH-Level wurden jeweils mit Chemolumineszenzassays (Nichols Institute) gemessen.
In dieser gesamten Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Auf bestimmte Veröffentlichungen wird durch Zahlen in Klammern verwiesen. Die vollständigen Literaturangaben für Veröffentlichungen, auf die mit Zahlen verwiesen wird, sind nachfolgend aufgelistet. Die Offenbarungen aller dieser Veröffentlichungen und die jene Literaturhinweise, die in diesen Veröffentlichungen in ihrer Gänze zitiert werden, sind hier der Anmeldung als Bezugsdokumente beigefügt, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, auf den sich diese Erfindung bezieht.
LITERATURHINWEISE

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Modifiziertes humanes thyreotropes Hormon (Thyroid Stimulating Hormone TSH), das eine α-Untereinheit und eine β-Untereinheit umfasst, wobei die besagte α-Untereinheit mindestens eine basische Aminosäure an einer Position umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20, gemäß 1a.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei eine basische Aminosäure der α-Untereinheit an Position 11 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei eine basische Aminosäure der α-Untereinheit an Position 13 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei eine basische Aminosäure der α-Untereinheit an Position 14 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei eine basische Aminosäure der α-Untereinheit an Position 16 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei eine basische Aminosäure der α-Untereinheit an Position 17 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei eine basische Aminosäure der α-Untereinheit an Position 20 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, das ferner so modifiziert ist, dass die besagte α-Untereinheit mindestens zwei basische Aminosäuren an den Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 umfasst.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 8, wobei die basischen Aminosäuren der besagten α-Untereinheit an den Positionen 16 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 8, wobei die basischen Aminosäuren der besagten α-Untereinheit an den Positionen 16 und 13 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 8, wobei die basischen Aminosäuren der besagten α-Untereinheit an den Positionen 20 und 13 sind.
Modifiziertes humanes thyreotropes Hormon (TSH) gemäß Anspruch 1, wobei die α-Untereinheit mindestens drei basische Aminosäuren an den Positionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 umfasst.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 12, wobei die besagten basischen Aminosäuren der α-Untereinheit an den Positionen 13, 16 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 12, wobei die α-Untereinheit ferner eine vierte basische Aminosäure an einer Position ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 umfasst.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 14, wobei die besagten basischen Aminosäuren der α-Untereinheit an den Positionen 11, 13, 16 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 14, wobei die besagten basischen Aminosäuren der α-Untereinheit an den Positionen 11, 13, 17 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 14, wobei die besagten basischen Aminosäuren der α-Untereinheit an den Positionen 13, 14, 16 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 14, wobei die basischen Aminosäuren der α-Untereinheit an den Positionen 13, 14, 17 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 14, wobei die besagte α-Untereinheit ferner eine fünfte basische Aminosäure an einer Position ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 umfasst.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 19, wobei die besagten basischen Aminosäuren der α-Untereinheit an den Positionen 13, 14, 16, 17 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 19, wobei die besagten basischen Aminosäuren der α-Untereinheit an den Positionen 11, 13, 14, 16 und 20 sind.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei die α-Untereinheit sechs basische Aminosäuren an den Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20 umfasst.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei das besagte modifizierte humane TSH weniger als fünf Aminosäurensubstitutionen in der α-Untereinheit an Positionen hat, außerhalb der Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei das besagte modifizierte humane TSH weniger als vier Aminosäurensubstitutionen in der besagten α- Untereinheit an Positionen hat, außerhalb der Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei das besagte modifizierte humane TSH weniger als drei Aminosäurensubstitutionen in der besagten α-Untereinheit an Positionen hat, außerhalb der Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei das besagte modifizierte humane TSH weniger als zwei Aminosäurensubstitutionen in der besagten α-Untereinheit an Positionen hat, außerhalb der Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 1, wobei das besagte modifizierte humane TSH vollständige Aminosäurensequenzidentität mit dem entsprechenden humanen Wildtyp-TSH in der besagten α-Untereinheit an Positionen hat, außerhalb der Positionen 11, 13, 14, 16, 17 und 20.
Modifiziertes humanes TSH gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner so modifiziert ist, dass die besagte β-Untereinheit mindestens eine basische Aminosäure an einer Position ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 58, 63 und 69 umfasst.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 28, wobei die β-Untereinheit drei basische Aminosäuren an den Positionen 58, 63 und 69 umfasst.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 28, wobei eine basische Aminosäure der β-Untereinheit an Position 58 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 28, wobei eine basische Aminosäure der β-Untereinheit an Position 63 ist.
Modifiziertes humanes TSH nach Anspruch 28, wobei eine basische Aminosäure der β-Untereinheit an Position 69 ist.
Modifiziertes humanes TSH gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die basische Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lysin und Arginin.
Nukleinsäure, die die besagte α-Untereinheit eines modifizierten humanen TSH gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 34 umfasst, wobei der Vektor geeignet ist, die Nukleinsäure zu exprimieren.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 35 umfasst, wobei die Wirtszelle geeignet ist, die Nukleinsäure zu exprimieren.
Nukleinsäure, die die besagte modifizierte β-Untereinheit eines humanen TSH gemäß einem der Ansprüche 28 bis 33 kodiert.
Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 37 umfasst, wobei der Vektor geeignet ist, die Nukleinsäure zu exprimieren.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 38 umfasst, wobei die Wirtszelle geeignet ist, die Nukleinsäure zu exprimieren.