KR100497685B1 - 당단백질 호르몬 초활성 효능약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치들에 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개의 염기성 아미노산을 포함하는 인간 당단백질 호르몬에 관한 것이다. 본 발명은 또한 갑상선 자극 호르몬 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 염기성 아미노산인 인간 당단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 야생형 인간 당단백질 호르몬에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 비-인간 당단백질 호르몬에서와 동일한 위치에서 치환된 하나의 염기성 아미노산을 포함하는, 야생형 인간 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 변형된 인간 당단백질 호르몬에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다른 종으로부터 유래된 보다 활성이 뛰어난 동질체(homolog)의 아 미노산 서열을 인간 호르몬과 비교하는 단계; 인간 호르몬의 아미노산을 다른 종의 대응 아미노산으로 치환하는 단계; 전기 치환된 인간 호르몬의 활성을 측정하는 단계; 및, 전기 치환된 인간 호르몬들 중에서 초활성(superactive) 유사체를 선별하는 단계를 포함하는, 인간 호르몬의 초활성 비 키메라 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전기 변형된 인간 당단백질 호르몬을 코딩하는 핵산, 전기 핵산을 포함하는 벡터 및 전기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
Description
본 발명은 변형된 당단백질(glycoprotein)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 초활성 효능약(superagonist) 활성을 생성하는, 인간 당단백질의 변형에 관한 것이다.
타이로트로핀(thyrotropin: thyroid-stimulating hormone, TSH)과 융모성 성선자극 호르몬(chorionic gonadotropin), 류트로핀(lutropin: leuteinizing hormone, LH) 및 폴리트로핀(follitropin: follicle-stimulating hormone, FSH))과 같은 고나도트로핀은 당단백질 호르몬 패밀리를 구성한다. 각각의 호르몬은 두 개의 비공유 결합으로 연결된 α와 β 서브유닛으로 이루어진 헤테로다이머(heterodimer)이다. 같은 종(species) 내에서는 α 서브유닛의 아미노산 서열은 모든 호르몬에서 동일한 반면, β 서브유닛의 아미노산 서열은 호르몬 특이적이다(참조: Pierce, J. G. and Parsons, T. F. "Glycoprotein hormones: structure and function" Ann. Rev. Biochem., 50:465-495(1981)). 어류에서 포유동물에 이르기까지 서브유닛들의 아미노산 서열이 상당히 보존되어 있다는 사실은 이러한 호르몬들이 하나의 공통된 선조 단백질로부터 진화되어 왔음을 암시한다(참조: Fontaine Y-A. and Burzawa-Gerard, E. "Equisse de l'evolution des hormones gonadotopes et thyreotropes des vertebres" Gen. Comp. Endocrinol., 32:341-347(1977)). 생물학적 잠재력(biopotency)을 조절하는 특이한 구조 결정기들이 밝혀지지는 않았지만, 이러한 호르몬들의 진화상의 변화는 생물학적 활성의 변화를 초래하였다(참조: Licht, P. et al. "Evolution of gonadotropin structure and function" Rec. Progr. Horm. Res., 33:169-248(1977); Combarnous, Y. "Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors" Endocrine Rev., 13:670-691(1992)). 예를 들면, 인간 갑상선자극 호르몬(hTSH)과 소 갑상선자극 호르몬(bTSH)의 α(70%)와 β(89%) 서브유닛은 매우 높은 서열상동성을 공유하고 있으나, bTSH는 hTSH보다 6 내지 10배 더 강력하다(참조: YAmazaki, K. et al. "Potent thyrotropic activity of human chorionic gonadotropin variants in terms of 125I incorporation and de novo synthesized thyroid hormones release in human thyroid follicles" J. Clin. Endocrinol. Metab., 80:473-479(1995)).
당단백질 호르몬들은 갑상선암 환자의 치료와 같은 특정한 치료법에 있어서 중요하다(참조: Meier, C. A., et al. "Diagnostic use of Recombinant Human Thyrotropin in Patients with Thyroid Carcinoma(Phase I/II Study)" J. Clin. Endocrinol. Metabol., 78:22(1994)). 그러나, 전기 질병의 치료에 있어서 hTSH의 잠재적인 활용은 크루츠펠트-제이콥 병 (Creutsfeldt-Jacob disease)의 전이 가능성 때문에 포기할 수 밖에 없었다. hTSH 대신 bTSH를 사용할 수 있으나, bTSH는 구역, 구토, 국부적인 경화(induration), 두드러기 및 상대적으로 높은 과민성 쇼크 발생가능성과 같은 부작용을 유발하기 때문에, bTSH로의 대체는 매우 제한적이다(참조: Meier, C. A. et al.). 비뇨기 고나도트로핀의 생물학적일치(bioconsistency)의 결여와 재조합 당단백질의 제한된 효능으로 인하여 이들을 보다 효과적인 재조합 유사체(analogs)로 대체하여야 할 필요가 있다. 따라서, 전기 호르몬들의 효능약 뿐만 아니라 인간으로부터 유래된 당단백질이 요구되고 있는 실정이다.
예를 들면, 갑상선암과 같은 특별한 임상적 상황에서, 갑상선자극 호르몬의 효능약의 투여는 방사성 요오드의 종양 내로의 흡수를 증가시켜 질병을 치료할 것이다. 갑상전 자극 호르몬의 효능약은 훨씬 더 맣은 양의 방사성 요오드가 종양 내로 흡수되도록 합으로써 보다 효과적인 치료를 가능케 한다. 한편, 배란을 유도하기 위하여 사용되는 당단백질들은 초활성 효능약으로 대체될 수 있으며, 이는 현재 수정능력의 치료(fertility treatment)에 있어 의학적으로 주요한 문제가 되는 호르몬의 투여량을 낮출 수 있을 것이다(참조: Ben-Rafael, Z. et al. "Pharmacokinetics of follicle-stimulating hormone: clinical significance" Fertility and Sterility, 63:689(1995)). 야생형 여포 자극 호르몬의 사용은, 여러 개의 여포를 자극하는 다수의 호르몬 분자에 의하여 과도한 자극과 높은 쌍둥이 임신율 및 유산율을 초래하였으며, 여포 자극 호르몬의 초활성 효능약은 불임 치료에 사용될 수 있다. 이러한 변형된 호르몬의 효능약은 더 적은 수의 호르몬 분자를 투여하여도 원하는 결과를 얻을 수 있기 때문에, 다수의 여포를 자극하는 빈도를 낮출 수 있다.
본 발명은 우선 실험실적 조건(in vitro)하에서의 생물학적 활성 및 생체내 조건(in vivo)하에서의 생물학적 활성의 증가를 보이는 인간 당단백질 호르몬의 유사체를 초래하는, 인간 당단백질 호르몬의 특정한 아미노산 치환을 제공한다.
발명의 요약
여기에서 실시예로서 포함되고 광범위하게 개시되는 바와 같이, 본 발명의 목적에 따르면, 본 발명은, 한 가지 측면에서는, α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치들에 적어도 3개의 염기성 아미노산을 포함하는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치들에 적어도 1개의 염기성 아미노산을 포함하는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 야생형 인간 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 비-인간 당단백질 호르몬이 염기성 아미노산을 갖는 위치에 상응하는 위치에서 치환된 하나의 염기성 아미노산을 포함하는, 야생형 인간 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 변형된 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 당단백질 호르몬의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 당단백질 호르몬 활성과 관련된 상태를 처치하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다른 종으로부터 유래된 보다 활성이 뛰어난 동질체(homolog)의 아미노산 서열을 인간 호르몬과 비교하는 단계; 인간 호르몬의 아미노산을 다른 종의 대응 아미노산으로 치환하는 단계; 전기 치환된 인간 호르몬의 활성을 측정하는 단계; 및, 전기 치환된 인간 호르몬들 중에서 초활성(superactive) 유사체를 선별하는 단계를 포함하는, 인간 호르몬의 초활성 비 키메라 유사체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전기 변형된 당단백질 호르몬을 코딩하는 핵산을 제공한다.
도 1은 27개의 서로 다른 종들의 α-서브유닛의 관련된 일차 서열을 비교하여 나타낸 그림이다: (a) 진 뱅크(Gene Bank), 스위스 프롯(SWISS PROT) 및 PTB 데이터뱅크로부터 입수한 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이 및 비비(밑줄)의 지노믹 DNA로부터 PCR을 이용하여 증폭된 절편의 염기서열을 결정하여 얻어진 서브유닛 서열들을 정렬하였다. 서열의 번호는 인간 α-서브유닛 서열의 번호에 해당한다. 대쉬(--)는 인간 α-서브유닛의 아미노산 잔기와 동일한 어마노산 잔기를 나타낸다. 서로 다른 종들간에 보존된 리신 잔기들은 대문자로 표시하였다. 본 연구에서 결정된 영장류의 서열은 밑줄로 표시하였다. 인간, 침팬지 및 오랑우탄의 α-서브유닛 서열은, 다양한 척추동물 간의 상대적으로 높은 유사성에도 불구하고, 유일하게 전기 밑줄친 영역에 염기성 아미노산을 가지고 있지 않다. (b) 전기 영역에서의 인간 서열의 변이는 모든 비인간 포유동물의 서열에 존재하는 하나 또는 다수의 리신 잔기들의 삽입(introduction)을 포함하였다. 또한, 13, 16 및 20번 잔기의 알라닌 변이유발은 Gln13, Pro16 및 Gln20의 역할을 연구하기 위하여 사용되었다.
도 2는 가장 강력한 hTSH 유사체의 생물학적 활성과 수용체-결합 활성을 나타내는 그래프이다: (a, b) CHO-JP09 세포에서의 cAMP 자극을 보여주며, 각각의 데이터 포인트는 세 번(a) 또는 두 번(b) 반복된 대표실험으로부터 3증으로 측정하여 얻은 수치의 평균±SEM을 나타낸다. (c, d) 도 2a 및 도 2b에서 테스트한 것과 동일한 변이형(mutant)들의 CHO-JP09 세포에서의 수용체-결합 활성을 보여주며, 각각의 데이터 포인트는 두 번 반복된 실험으로부터 4중으로 측정하여 얻은 수치의 평균±SEM을 나타낸다. (e) FRTL-5 세포에서의 티미딘 흡수 자극을 보여주며, 각각의 데이터 포인트는 두 번 반복된 실험으로부터 4중으로 측정하여 얻은 수치의 평균±SEM을 나타낸다. (f) 마우스에서의 T4 분비 자극을 보여주며, 각각의 데이터 포인트는 두 번 반복된 대표실험의 4 내지 5마리의 마우스로부터 얻은 측정치의 평균±SEM을 나타낸다. (g) CHO-hTSH 세포에서의 cAMP 자극을 보여주며, 각각의 데이터 포인트는 세 번 반복된 대표실험으로부터 3 내지 4중으로 측정하여 얻은 수치의 평균±SEM을 나타낸다. (h) CHO-JP09 세포에서의 수용체-결합 활성을 보여주며, 각각의 데이터 포인트는 세 번 반복된 대표실험으로부터 3 내지 4중으로 측정하여 얻은 수치의 평균±SEM을 나타낸다. (i) 마우스에서의 T4 분비 자극을 보여주며, 각각의 데이터 포인트는 두 번 반복된 대표실험의 4 내지 5마리의 마우스로부터 얻은 측정치의 평균±SEM을 나타낸다.
도 3은 가장 강력한 hCG 유사체의 생물학적 활성과 수용체-결합 활성을 나타내는 그래프이다. (a) 및 (b)는 각각 MA-10 세포에서의 프로제스테론(progesterone) 생산 자극과 수용체-결합 분석을 보여준다. 각각의 데이터 포인트는 세 번 반복된 대표실험으로부터 3중으로 측정하여 얻은 수치의 평균±SEM을 나타낸다. 프로제스테론의 상대적인 최대 생산 수준은 WT-hCG로부터 얻은 수치의 %로서 표 2에 나타내었다. (c) 및 (d)는 각각 hLH 수용체를 발현하는 COS-7 세포에서의 cAMP 자극과 수용체-결합 분석 결과를 보여준다. 각각의 데이터 포인트는 두 번 반복된 대표실험으로부터 3중으로 측정하여 얻은 수치의 평균±SEM을 나타낸다.
본 발명은 하기의 본 발명의 상세한 설명, 실시예 및 도면과 도면의 설명을 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법이 개시되기 이전에, 본 발명은 특정한 호르몬, 특정한 대상 즉, 인간을 제외한 포유동물과 인간, 특정한 아미노산, 특정한 임상 상태, 특정한 유사체 또는 특정한 방법에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 하며, 다양한 변형 및 변화는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 또한, 여기에서 사용되는 용어는 다만 특정한 실시예를 기술하기 위한 것으로 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해하여야만 한다.
명세서와 청구항에 사용되었듯이, "a"라는 단어는 전기 단어가 사용된 문맥에 따라 하나 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들면, "a human glyoprotein hormone"이라는 문구는 적어도 하나 이상의 인간 당단백질 호르몬이 활용되었음을 의미한다.
한 측면에서, 본 발명은 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치들에 적어도 3개의 염기성 아미노산을 포함하는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치들에 적어도 1개의 염기성 아미노산을 포함하는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 야생형 인간 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 비-인간 당단백질 호르몬이 염기성 아미노산을 갖는 위치에 상응하는 위치에서 치환된 하나의 염기성 아미노산을 포함하는, 야생형 인간 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 변형된 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 당단백질 호르몬의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 당단백질 호르몬 활성과 관련된 상태를 처치하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 당단백질 호르몬을 보조량(assisting amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는 생식(reproduction) 보조 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다른 종으로부터 유래된 보다 활성이 뛰어난 동질체의 아미노산 서열을 인간 호르몬과 비교하는 단계; 인간 호르몬의 아미노산을 다른 종의 대응 아미노산으로 치환하는 단계; 치환된 인간 호르몬의 활성을 측정하는 단계; 및, 치환된 인간 호르몬들 중에서 초활성(superactive) 유사체를 선택하는 단계를 포함하는, 인간 호르몬의 초활성 비 키메라 유사체를 제조하는 방법을 제공한다.
"인간(human)" 당단백질 호르몬은, 야생형 서열 중에서 치환된 아미노산의 개수가 인간과 다른 종간의 대응 폴리펩티드의 대응 위치의 아미노산 차이 수의 절반을 초과하지 않음을 의미한다. 따라서, 변형된 호르몬은, 전기 변형된 호르몬을 제조하는 데 있어서 아미노산 코딩 서열에 기초한 아미노산 치환의 근거가 된, 인간이 아닌 다른 종의 대응 폴리펩티드 호르몬 보다는 오히려 인간의 야생형 호르몬과 더 유사한 것으로 간주될 것이다. 예를 들면, 만약 인간과 소의 서로 대응되는 당단백질 호르몬에서 대응 위치의 아미노산이 총 20가지가 서로 다르다면, "인간" 당단백질 호르몬은 전체 아미노산 서열 중에 소의 아미노산 서열에서의 대응 아미노산과 일치하는 아미노산으로 치환된 개수가 10 개 또는 그 이하인 변형된 야생형 인간 호르몬이다. 좀 더 구체적으로, 실시예에서 개시하는 바와 같이, 만약 인간과 소의 갑상선자극 호르몬의 α- 및 β-서브유닛 간에 총 40개의 아미노산이 서로 다르고, 그 중 20 개 또는 그 이상이 인간의 갑상선자극 호르몬의 대응 위치에 있는 아미노산과 일치한다면, 전기 갑상선자극 호르몬은 "인간", 즉 인간의 갑상선자극 호르몬으로 간주될 것이다.
당연히, 변형된 당단백질 호르몬의 투여대상이 인간인 경우 전기 변형된 당단백질 호르몬에 대한 역 면역반응의 위험성 때문에, 전기 변형된 당단백질 호르몬은 초활성 효능약 활성에 큰 손실이 없다면 가능한 인간의 아미노산 서열과 많이 일치하는 것이 바람직하다. 한편, 변형된 당단백질 호르몬의 투여대상이 인간이 아닌 경우에는, 전기 변형된 당단백질 호르몬은 초활성 효능약 활성에 큰 손실이 없다면 가능한 특정한 비인간의 아미노산 서열과 많이 일치하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일실시예에서 특정한 아미노산을 치환하여 초활성 효능약 활성을 가지는 변형된 당단백질을 제조하고자 야생형 당단백질을 변형하는데 있어서, 효능약 활성을 증가시키지 않는 치환된 아미노산은 10개 또는 그 이하 특히, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 0개에 이른다.
이와 마찬가지로, "비키메라(nonchimeric)"는, 치환된 아미노산의 개수가 종간의 대응 폴리펩티드의 대응 위치의 아미노산 차이 수의 절반을 초과하지 않아, 변형된 호르몬이 전기 변형된 호르몬을 제조하는 데 있어서 아미노산 코딩 서열에 기초한 아미노산 치환의 근거가 된 다른 종의 대응 폴리펩티드 호르몬 보다는 오히려 변형 전의 야생형과 더 유사한 것으로 간주됨을 의미한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전기 변형된 호르몬을 코딩하는 핵산을 제공한다.
당단백질 호르몬은 종간에 공통적인 α 서브유닛과 종간에 상이한 β 서브유닛으로 구성된 구조적으로 연관이 있는 헤테로다이머 호르몬 패밀리를 구성한다. 당단백질 호르몬에 관한 일반적인 리뷰를 위해서는, 피어스의 문헌(참조: Pierce, J. G. et al. "Glycoprotein hormones: structure and function" Ann. Rev. Biochem., 50:465-495(1981))과 콤바르나우스의 문헌(참조: Combarnous, Y. "Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors" Endocrine Rev., 13:670-691(1992))을 참조하면 된다. 당단백질 호르몬 패밀리에는 융모성 성선자극 호르몬(chorionic gonadotropin, CG), 류트로핀(lutropin: leuteinizing hormone, LH), 폴리트로핀(follitropin: follicle-stimulating hormone, FSH)) 및 타이로트로핀(thyrotropin: thyroid-stimulating hormone, TSH)이 포함된다. 본 발명은 전기 당단백질 호르몬 각각의 α-서브유닛에 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치 중 적어도 하나에 염기성 아미노산을 가지고 있는 당단백질 호르몬을 제공한다.
전기 염기성 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘과 전기 3가지 아미노산의 변형인 다른 모든 염기성 아미노산, 자연계에서 일반적으로 발견되지 않는 합성 아미노산 또는 중성 pH에서 양전하를 띠는 모든 아미노산으로 구성된다.
본 발명에 의하여 제공되는 당단백질은 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 당단백질 호르몬을 코딩하는 DNA 분자를 전기 DNA가 일반적으로 발견되는 생물로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 지노믹 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 구축하여 목적하는 핵산의 존재여부를 탐색할 수 있다. 그러한 라이브러리를 구축하고 탐색하는 방법은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 구축 및 탐색 단계를 수행하기 위한 킷트들도 상업적으로 입수 가능하다(예를 들면, 스트라타진 클로닝 시스템즈(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)). 일단 핵산을 분리한 다음에는, 전기 핵산을 적절한 벡터 내로 직접 클로닝 하거나, 또는 필요에 따라 다음에 이어지는 클로닝 단계를 촉진하기 위하여 변형될 수 있다. 그러한 변형 단계는 상례적인 일로서, 일례로서 핵산의 말단에 제한효소 위치를 포함하고 있는 올리고뉴클레오 티드 링커를 첨가하는 것을 들 수 있다. 이를 위한 일반적인 방법은 샘브룩의 문헌에 개시되어 있다(참조: Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Mannual" Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)).
원하는 당단백질 호르몬의 핵산 서열을 수득하고 난 다음에는, 당업계에서 잘 알려진 기술을 이용하여 염기성 아미노산을 어떠한 아미노산 위치에라도 위치시킬 수 있다. 예를 들면, 원하는 위치의 아미노산에까지 이르면서 비염기성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환할 수 있는 PCR 프라이머를 고안할 수 있다. 그런 다음, 당단백질 호르몬의 어떠한 위치에라도 가능한 모든 조합의 염기성 아미노산을 위치시키기 위하여, 핵산을 증폭하여 야생형 당단백질 호르몬을 코딩하는 서열 내로 삽입할 수 있다. 또한, 당업계에서 통상의 지식을 가지 자라면 점 돌연변이를 유발하는 기술을 이용하여 특정한 아미노산 서열의 어떤 위치에라도 특이적인 변이를 생성시킬 수 있다. 이를 위한 일반적인 방법은 스미스의 문헌(참조: Smith, M. "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Gen., 19:423-462(1985))과 졸러의 문헌(참조: Zoller, M. J. "New molecular biology methods for protein engineering" Curr. Opin. Struct. Bio., 1:605-610(1991))에 개시되어 있다.
특정한 당단백질 호르몬을 코딩하는 DNA 분자를 수득하기 위한 방법의 또 다른 예는 전기 당단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 합성하는 것이다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 합성 과정은 당업계에서는 통상적인 일로서, 자동화된 DNA합성기를 이용하여 특정한 단백질 영역을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 용이하게 수득할 수 있다. 이중 가닥 중 한 가닥의 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 그와 상보적인 가닥과 혼성화시킬 수 있으며, 전기 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA 분자가 내부에 제한효소 위치를 포함하거나 또는 적절한 벡터에 클로닝할 수 있도록 DNA 말단에 적절한 5' 또는 3' 돌출부를 가지도록 고안될 수 있다. 상대적으로 큰 단백질을 코딩하는 이중가닥 DNA 분자는, 먼저 전기 단백질의 일정한 영역을 코딩하는 몇 가지 서로 다른 이중가닥 DNA들을 제조한 다음, 전기 DNA들을 함께 연결시킴으로써 용이하게 합성될 수 있다. 예를 들면, 커닝햄 등은 서로 겹치면서 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 절편들을 제조한 다음, 전기 절편들을 함께 연결시켜 인간 성장 호르몬을 코딩하는 합성 유전자를 제조하였다(참조: Cunningham et al. "Receptor and Antibody Epitopes in Human Growth Hormone Identified by Homolog-Scanning Mutagenesis" Science, 243:1330-1336(1989)). 또한, 페레티도 합성 올리고뉴클레오티드로부터 1057bp의 소 로돕신 유전자를 합성한 바 있다(참조: Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:599-603(1986)). 이러한 방식으로 당단백질 호르몬을 제조함으로써, 당업계에서 통상의 지식을 지닌 자라면 누구나 용이하게 α-서브유닛, β-서브유닛 또는 두 서브유닛 모두에 어떤 특정한 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 어떠한 호르몬이라도 수득할 수 있다. 또한, 미국특허 USP 5,503,995호는 합성 유전자를 제조하기 위한 효소 주형 반응(enzyme template reaction) 방법을 개시하고 있는데, 전기 방법은 당업계에서 통상적인 일로서 문헌상으로도 잘 기술되어 있다. 당단백질 호르몬을 코딩하는 DNA 절편은 하기와 같이 생체내 조건 또는 실험실적 조건에서 발현될 수 있다.
원하는 특정 당단백질 호르몬을 코딩하는 핵산 또는 전기 핵산의 일부 영역을 제조하거나 변형시키거나 또는 분리한 다음, 전기 핵산을 생체내 조건 또는 실험실적 조건에서 야생형 및/또는 변형된 당단백질 호르몬을 합성할 수 있는 적절한 벡터에 클로닝할 수 있다. 전기 벡터는 삽입 유전자 또는 혼성 유전자(hybrid gene)의 전사를 조절하는데 필수적인 기능적 요소(functional element)를 가지고 있어야 한다. 전기 기능적 요소는 프로모터, 프로모터의 전사 활성을 조절하는 인핸서(enhancer) 와 같은 프로모터 상류 또는 하류의 영역, 복제 원점, 삽입 유전자를 프로모터 근방에 용이하게 클로닝하기에 적절한 제한효소 위치, 항생제 내성 유전자나 또는 벡터 또는 삽입 유전자가 들어있는 벡터를 포함하고 있는 세포를 선별하는 데 사용될 수 있는 다른 마커유전자, RNA 스플라이싱 정션( splice junction), 전사 종지 영역, 또는 삽입 유전자나 혼성유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 다른 어떤 영역도 포함할 수 있다(참조: Sambrook et al.).
삽입 유전자를 발현시키는데 유용한 다양한 대장균(Escherichia coli) 발현벡터들이 당 업계에 잘 알려져 있다. 사용하기에 적절한 다른 미생물 숙주에는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 간균, 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia)와 같은 엔테로박테리아(enterobacteria) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종들이 포함된다. 전기 원핵세포 숙주에서는, 전기 숙주세포와 조화를 이루는 발현 조절 서열(에를 들면, 복제원점)을 포함하는 발현벡터를 제조할 수도 있다. 또한, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(Trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제(β-lactamase) 프로모터 시스템 또는 람다 파아지(λ phage)의 프로모터 시스템과 같은 기지의 다양한 프로모터들을 몇 개라도 포함할 수 있다. 전기 프로모터들은 전형적으로, 때로는 오퍼레이터(operator) 서열과 더불어, 유전자 발현을 조절하며, 예를 들어 전사(transcription) 및 해독(translation)을 개시하고 종료하는데 필요한 리보좀 결합 위치를 가지고 있다. 필요에 따라서는, 삽입유전자의 5'에 Met 코돈을 삽임함으로써, N-말단 부위에 Met을 가지는 단백질을 발현할 수도 있다. 또한, 표준 올리고뉴클레오티드 변이유발법으로 삽입 유전자의 C-말단 연장부위를 제거할 수도 있다.
또한, 효모 발현 시스템을 사용할 수도 있다. 효모 발현 시스템에는 다음과 같은 몇 가지 잇점이 있다: 첫째, 효모 분비 시스템에서 생산된 단백질은 올바른 이황화 결합을 하고 있다. 둘째, 효모 분비 시스템에 의하여 해독 후 글리코실화가 효과적으로 이루어진다. 통상적으로 효모로부터 단백질 분비를 촉진시키기 위해서 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 프리-프로-알파-팩터 리더 영역(pre-pro-alpha-factor-leader region, MF"-I 유전자에 의하여 코딩됨)이 사용된다(참조: Brake et al. "α-Factor-Directed-Synthesis-and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae" Proc. Natl. Acad. Sci., 81:4642-4646(1984)). 전기 프리-프로-알파-팩터 리더 영역은 신호 펩티드와 KEX2 유전자에 의하여 코딩되는 효모 프로테아제(protease)의 인식 서열을 포함하는 프로-절편(pro-segment)을 가지고 있는데, 전기 프로테아제는 Lys-Arg이라는 절단 신호 서열의 카르복실기 쪽에서 전구체(precursor) 단백질을 절단한다. 원하는 단백질의 코딩 서열을 전기 프리-프로-알파-팩터 리더 영역에 융합시킬 수 있으며, 전기 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 알코올 탈수소효소 I(alcohol dehydrogenase I) 프로모터 또는 당분해(glycolytic) 프로모터와 같은 강력한 프로모터의 조절 하에 둘 수 있다. 전기 코딩서열 다음에는 해독 종지 코돈 및 전사 종지 신호가 순서대로 이어진다. 한편, 전기 코딩서열은, 친화 크로마토그래피에 의한 융합단백질의 정제를 용이하게 해주는 Sj26 또는 β-갈락토시다제와 같은 두 번째 단백질의 코딩 서열과 융합될 수도 있다. 효모 발현 시스템에서 사용될 벡터에 전기 융합단백질의 구성요소들을 서로 분리시키기 위한 절단 위치를 삽입할 수도 있다. 또한, 바큘로바이러스(Baculovirus) 시스템에서도 해독 후 글리코실화 및 재조합 단백질의 발현을 효율적으로 수행할 수 있다.
포유동물 세포에서는 단백질 접힘(folding)과 시스테인 짝짓기(cysteine pairing), 복잡한 탄수화물 구조의 첨가 및 활성 단백질의 분비와 같은 중요한 해독 후 변형이 선호되는 환경에서 단백질이 발현될 수 있다. 포유동물 세포에서 활성 단백질을 발현하는 데 유용한 벡터들은 강력한 바이러스 프로모터와 폴리아데닐화 신호 사이에 단백질 코딩 서열을 삽입한다는 특징을 가지고 있다. 전기 벡터는 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자, 젠타마이신(gentamycin) 내성 유전자 또는 선별 마커로서 적당한 다른 유전자나 표현형(phenotype), 또는 유전자 증폭에 대한 메쏘트렉세이트(methotrexate) 내성을 가지고 있다. 키메라 단백질 코딩 서열을 메쏘트렉세이트 내성을 코딩하는 벡터를 사용하여 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에 주입하거나 또는 적절한 선별 마커를 사용하여 다른 세포주에 주입할 수 있다. 형질전환된 세포에서 벡터 DNA의 존재여부는 서던 블롯팅으로 확인할 수 있으며, 삽입된 코딩 서열에 대응하는 RNA의 생산은 노던 블롯팅으로 확인할 수 있다. 완전한 인간 단백질을 분비할 수 있는 다른 많은 숙주세포주가 당업계에서 개발되어 있으며, CHO 세포, Hela 세포, 골수종(myeloma) 세포, Jurkat 세포 등이 이에 포함된다. 전기 세포주들에 적합한 발현 벡터들은 복제원점, 프로모터 및 인핸서와 같은 유전자 발현 조절 서열과 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종료 서열과 같은 필수적인 정보 프로세싱 부위들을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열의 예로는 면역글로블린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 보바인 파필로마 바이러스(Bovine Papilloma Virus) 등으로부터 유래된 프로모터들을 들 수 있다. 원하는 핵산 절편을 포함하는 벡터는 숙주 세포의 유형에 따라 기지의 방법에 의하여 숙주세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들면, 원핵세포에서는 일반적으로 염화칼슘 형질전환(transformation)법을 사용하는 반면, 다른 진핵세포 숙주에서는 인산칼슘, DEAE 덱스트란 또는 리포펙틴(lipofectin)을 이용한 트랜스펙션을 많이 사용한다.
포유동물 세포에서 유전자를 발현시키기 위하여, 인간 -인터페론, 티슈 플라스미노젠 엑티베이터(tissue plasminogen activator), 클롯팅 팩터(clotting factor) VII, B형 간염 바이러스 표면 항원, Nexini 프로테아제 및 에오시노필 메이저 베이직 프로테인(eosinophil major basic protein)들을 발현하기 위하여 개발된 것과 유사한 다른 벡터들을 사용할 수도 있다. 뿐만 아니라, 전기 벡터는 COS-7 세포와 같은 포유동물 세포에서 삽입 유전자를 발현하는데 유용한 CMV 프로모터 서열 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
유전자 또는 혼성유전자의 발현은 생체내 조건 또는 실험실적 조건에서 수행될 수 있다. 생체내 조건에서의 합성은 벡터에 대하여 숙주세포로 작용할 수 있는 원핵세포 또는 진핵세포를 형질전환시키는 단계를 포함한다. 원핵세포 발현 벡터에 삽입된 변형된 당단백질 호르몬의 일례를 실시예로 개시하였다.
한편, 실험실적 조건에서의 발현 시스템을 이용하여 유전자를 발현시킬 수도 있다. 예를 들면, 다량의 mRNA를 합성하는데 상용되는 실험실적 조건에서의 전사 시스템(in vitro transcription system)을 상업적으로 입수할 수 있다. 전기 실험실적 조건에서의 전사 시스템에서는, 당단백질 호르몬을 코딩하는 핵산을 발현 벡터의 전사 프로모터 근방에 클로닝할 수 있다. 예를 들면, 블루스크립트(Bluescript) II 클로닝 발현 벡터는 강력한 원핵세포 전사 프로모터 바로 옆에 다중 클로닝 위치를 포함하고 있다(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). 또한, 전기 블루스크립트 벡터와 같은 DNA 주형으로부터 실험실적 조건에서 RNA를 합성하는데 필요한 모든 시약들이 포함되어 있는 킷트들이 시판되고 있으며(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), 이와 같은 시스템을 이용하여 실험실적 조건에서 합성된 RNA를 실험실적 조건에서 해독하여 원하는 당단백질 호르몬을 생산할 수 있다(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).
당단백질 호르몬을 생산하는 또 다른 방법은 단백질 화학 기술을 이용하여 두 개의 펩티드 또는 폴리펩티들을 함께 연결하는 것이다. 예를 들면, Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) 또는 Boc(teri-butyloxycarbonyl) 화학을 이용하는 상용되는 실험 장비를 사용하여 펩티드 또는 폴리펩티드를 화학적으로 합성할 수 있다(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 혼성 당단백질 호르몬에 해당하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 표준적인 화학 반응에 의하여 합성할 수 있음을 용이하게 알 수 있다. 예를 들면, 혼성펩티드(hybrid)의 한 펩티드 또는 폴리펩티드 절편은 합성 후에 수지(resin)로부터 절단하지 않고 다른 한 펩티드 절편은 합성 후에 수지로부터 절단함으로써, 전기 다른 한 절편상에 기능적으로 차단되어 있던 말단 그룹을 노출시킬 수 있다. 펩티드 농축 반응에 의하여, 전기 두 절편을 각각의 카르복시 말단과 아미 말단을 통하여 펩티드 결합으로 연결시킴으로써 혼성 펩티드를 생성할 수 있다(참조: Grant, G. A. "Synthetic Peptides: A User Guide" W. H. Feeman and Co., N. Y. (1992); Bodansky, M. and Trost, B., Ed. "Principles of Peptides Synthesis" Springer-Verlag Inc., N. Y. (1993)). 또한, 전기 펩티드 또는 폴리펩티드는 상기와 같은 방법으로 생체내 조건에서 개별적으로 합성될 수도 있다. 즉, 전기 개별적인 펩티드 또는 폴리펩티드들을 분리한 다음, 유사한 펩티드 농축 반응에 의하여 연결함으로써 당단백질 호르몬을 생성할 수 있다.
예를 들면, 클로닝되거나 또는 합성된 펩티드 절편들을 효소 반응으로 연결함으로써 상대적으로 짧은 펩티드 절편들을 연결하여 더 긴 펩티드 절편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 영역을 제조할 수 있다(참조: Abrahmsen, I. et al., Biochemistry, 30:4151(1991)). 또한, 합성 펩티드를 화학적으로 연결하여 짧은 펩티드 절편들로부터 긴 펩티드 또는 폴리펩티들을 합성할 수도 있는데, 이러한 방법은 다음과 같은 두 단계의 화학 반응으로 구성된다(참조: Dawson, et al. "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation" Science, 266:776-779(1994)): 첫 번째 단계는 보호되지 않은 합성 펩티드-α-티오에스터와 아미노-말단 Cys 잔기를 가지고 있는 다른 보호되지 않은 펩티드 절편을 화학적으로 선택적으로 반응시켜, 초기 공유결합 산물로서 티오에스터 결합으로 연결된 중간체를 생성하는 것이다. 이어서, 전기 중간체들은 반응 조건의 변화없이 자발적이고 신속한 분자간 반응을 거쳐 연결부위에서 자연 상태의 펩티드 결합을 형성한다. 이와 같은 화학적 연결방법을 단백질 분자의 총 합성에 적용한 예를 인간 인터루킨 8(IL-8)의 합성에서 찾아볼 수 있다(참조: Clark-Lewis, I. et al., FEBS letter, 307:97(1987); Clark-Lewis, I. et al., Biochemistry, 30:3128(1991); Rajarathnam, K. et al., Biochemistry, 29:1689(1994)).
한편, 보호되지 않은 펩티드 절편들을 비자연상태의(non-peptide) 결합을 형성하면서 화학적으로 연결할 수도 있다(참조: Schnolzer, M. et al., Science, 256:221(1992)). 전기 방법은 완전한 생물학적 활성을 가지는 상대적으로 순수한 다량의 단백질 뿐만 아니라 단백질 영역의 유사체를 합성하는데 사용되어 왔다(참조: deLisle Milton, R. C. et al. "Techniques in Protein Chemistry IV" Academic Press, New York, pp.257-267(1992)).
본 발명은 또한 초활성 효능약 또는 길항약(길항약) 활성을 가지는 변형된 당단백질 호르몬의 절편을 제공한다. 본 발명의 당단백질 절편은 폴리펩티드 절편을 생산할 수 있는 발현 시스템에 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 클로닝하여 얻은 재조합 단백질일 수 있다. 예를 들면, β-서브유닛과 함께 당단백질 호르몬 수용체와 상호작용하여 당단백질 호르몬과 연관된 생물학적 효과를 야기할 수 있는 당단백질 호르몬의 활성 영역을 결정할 수 있다. 일례로서, 당단백질 호르몬의 활성, 결합 특이성 또는 친화도에 기여하지 않는 아미노산들을 각 활성의 손실 없이 제거할 수 있다.
예를 들면, 천연형 또는 변형된 당단백질 호르몬으로부터 아미노- 또는 카르복시-말단 아미노산들을 차례대로 제거하고, 다양한 분석 방법 중의 어느 하나로 각 경우의 활성을 테스트 할 수 있다. 다른 예를 들면, 변형된 당단백질의 한 절편이 변형된 호르몬을 구성할 수도 있는데, 이 때 전기 변형된 호르몬은 α- 또는 β-서브유닛의 특정한 위치의 아미노산이 하나 이상 치환되었고, 아미노 말단 또는 카르복시 말단 아미노산들의 일부 또는 호르몬 단백질의 내부 영역이 변형된 당단백질 호르몬의 정제를 용이하게 할 수 있는 폴리펩티드 절편 또는 비오틴과 같은 다른 단위체(moiety)로 대체되어 있다. 예를 들면, 펩티드 화학을 이용하거나 또는 두 개의 폴리펩티드 절편들을 코딩하는 각각의 핵산을 코딩 영역의 발현 결과 혼성 폴리펩티드가 생성되도록 한 발현벡터에 클로닝함으로써, 변형된 당단백질 호르몬을 말토오스-결합 단백질과 융합시킬 수 있다. 전기 혼성 폴리펩티드를 아밀로오스 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한 다음, 특정한 프로테아제 팩터 Xa로 전기 혼성 폴리펩티드를 절단함으로써, 전기 변형된 당단백질 호르몬을 말토오스 결합 영역으로부터 분리할 수 있다(참조: 예를 들면, New England Biolabs Product Catalog, 1996, p.164).
또한, 당단백질 호르몬의 활성 절편은 직접 합성하거나, 또는 커다란 당단백질 호르몬을 화학적으로 또는 기계적으로 파괴하여 얻을 수도 있다. 활성 절편은 자연계에서 발견되는 아미노산 서열로부터 유래된 최소한 약 5개의 연속적인 아미노산으로 구성된 아미노산 서열로 정의되며, 결합 활성 또는 조절 활성과 같은 적절한 활성을 가지고 있다.
전기 활성 절편은, 펩티드의 활성이 크게 변하거나 또는 손상되지 않는다면, 다른 서열에 연결되어 있건 또는 그렇지 않던 간에, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정 영역이나 특정 아미노산 잔기의 선택적인 변형을 포함할 수도 있다. 이와 같은 변형은 몇 가지 추가적인 특성, 예를 들면, 이황화결합을 할 수 있는 아미노산의 제거 또는 삽입, 생물학적 수명의 연장 등을 제공할 수 있다. 어떤 경우에든, 펩티드는 결합 활성, 결합 영역에서의 결합의 조절 등과 같은 생물학적 활성을 지니고 있어야만 한다. 당단백질 호르몬의 기능적 영역 또는 활성 영역은 호르몬의 특정 영역을 변이시키고 발현시킨 다음, 발현된 폴리펩티드를 테스트함으로써 규명될 지도 모른다. 이러한 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이한 일로, 수용체를 코딩하는 핵산의 위치-특이적 변이유발을 포함할 수 있다(참조: Zoller, M. J. et al.)
본 발명의 일실시예에서, 인간 당단백질 호르몬은 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치에 적어도 1개의 염기성 아미노산을 포함한다. 본 발명의 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 11번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 13번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 14번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 16번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 17번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 11, 13, 14, 16 및 20번 위치의 염기성 아미노산은 리신이다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 17번 위치의 염기성 아미노산은 아르기닌이다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 두 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다. 예를 들면, 염기성 아미노산은 11 및 13번 위치, 11 및 14번 위치, 11 및 16번 위치, 11 및 17번 위치, 11 및 20번 위치, 13 및 14번 위치, 13 및 17번 위치, 14 및 16번 위치, 14 및 17번 위치, 14 및 20번 위치, 16 및 17번 위치, 또는 17 및 20번 위치에 존재할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 16 및 13번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 20 및 13번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 16 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다. 예를 들면, 염기성 아미노산은 11, 13 및 14번 위치, 11, 13 및 16번 위치, 11, 13 및 17번 위치, 11, 13 및 20번 위치, 11, 14 및 16번 위치, 11, 14 및 17번 위치, 11, 14 및 20번 위치, 11, 16 및 17번 위치, 11, 16 및 20번 위치, 11, 17 및 20번 위치, 13, 14 및 16번 위치, 13, 14 및 17번 위치, 13, 14 및 20번 위치, 13, 16 및 17번 위치, 13, 17 및 20번 위치, 14, 16 및 17번 위치, 14, 16 및 20번 위치, 14, 17 및 20번 위치, 또는 16, 17 및 20번 위치에 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 13, 16 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 호르몬은 갑상선자극 호르몬이다, 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 호르몬은 여포자극 호르몬이다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 호르몬은 황체형성 호르몬이다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 호르몬은 융모성 성선자극 호르몬이다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세 위치에 있는 염기성 아미노산들은 리신이다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 세 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 인간 갑상선자극 호르몬을 제공하며, 이 때 전기 갑상선자극 호르몬은 또한 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 한 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 갑상선자극 호르몬은 β-서브유닛의 58번 위치에 하나의 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 갑상선자극 호르몬은 β-서브유닛의 63번 위치에 하나의 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 갑상선자극 호르몬은 β-서브유닛의 69번 위치에 하나의 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 갑상선자극 호르몬은 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치 각각에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 있는 염기성 아미노산은 아르기닌이다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 네 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다. 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 용이하게 가능한 위치의 조합을 결정할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 11, 13, 16 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 11, 13, 17 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 13, 14, 17 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 13, 14, 16 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 네 위치에 있는 염기성 아미노산들은 리신이다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 다섯 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다. 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 용이하게 가능한 위치의 조합을 결정할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 13, 14, 16, 17 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 인간 당단백질 호르몬은 11, 13, 14, 16 및 20번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 다섯 위치에 있는 염기성 아미노산들은 리신과 아르기닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 여섯 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있는 인간 당단백질 호르몬을 제공하며, 이때 전기 인간 당단백질 호르몬은 갑상선자극 호르몬이고, β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 한 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 전기 인간 당단백질 호르몬은 인간 갑상선자극 호르몬 β-서브유닛의 58번 위치에 하나의 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 인간 당단백질 호르몬은 인간 갑상선자극 호르몬 β-서브유닛의 63번 위치에 하나의 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 전기 인간 당단백질 호르몬은 인간 갑상선자극 호르몬 β-서브유닛의 69번 위치에 하나의 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 인간 당단백질 호르몬은 인간 갑상선자극 호르몬 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치에 염기성 아미노산을 가지고 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 전기 58, 63 및 69번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치의 염기성 아미노산은 아르기닌이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 여포자극 호르몬, 인간 황체형성 호르몬 또는 인간 융모성 성선자극 호르몬을 제공하며, 이 때 전기 호르몬은 인간 갑상선자극 호르몬 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치에 해당하는 모든 당단백질 호르몬의 β-서브유닛 상의 위치들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 염기성 아미노산을 포함한다. 이러한 접근 방법은 비인간 호르몬에 대해서도 동일하게 적용된다. 에를 들면, 두 가지 소 당단백질 호르몬의 β-서브유닛의 아미노산 서열을 서로 비교하고, 서열상의 차이에 근거하여 어떤 서브유닛에서라도 아미노산을 치환할 수 있다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 다른 당단백질 호르몬들의 β-서브유닛의 몇번 위치가 인간 갑상선자극 호르몬의 58, 63 및 69번 위치에 해당하는지를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 와드 등의 문헌은 26가지의 다양한 당단백질 호르몬의 β-서브유닛의 아미노산 서열들을 나란히 정렬하여 비교하고 있다(참조: Ward, et al., In: Bellet, D and Bidard, J. M.(eds) "Structure-function Relationships of Gonadotropins" Serono Symposium Publications, Raven Press, New York, 65:1-19(1990)). 따라서, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 용이하게 다른 당단백질 호르몬에서 인간 갑상선자극 호르몬의 58, 63 및 69번 위치에 해당하는 위치의 비염기성 아미노산들을 염기성 아미노산으로 치환할 수 있다.
이와 유사하게, 본 발명은 모든 당단백질 호르몬에서 동일한 위치에 해당하는 β-서브유닛 상의 위치들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 염기성 아미노산을 포함하는 모든 인간 당단백질을 제공한다. 예를 들면, 인간 황체형성 호르몬과 인간 융모성 성선자극 호르몬의 β-서브유닛의 아미노산 서열들을 서로 비교한 다음, 전기 두 β-서브유닛 간의 아미노산 차이에 근거하여 전기 당단백질 호르몬 중 어느 하나의 특정한 위치의 아미노산을 치환할 수 있다. 이러한 접근 방법은 비인간 호르몬에도 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 인간 당단백질에 호르몬에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 비-인간 당단백질 호르몬이 염기성 아미노산을 갖는 위치에 상응하는 위치에서 치환된 하나의 염기성 아미노산을 포함하는, 야생형 인간 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 변형된 인간 당단백질 호르몬을 제공한다.
전기 야생형 인간 당단백질에 호르몬에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 비인간 당단백질 호르몬은 인간을 제외한 모든 종을 포함한다. 예를 들면, 전기 인간을 제외한 종은 소가 될 수 있다. 예를 들면, 베누아의 문헌(Benua, R. S. et al. "An 18 year study of the use of beef thyrotropin to increase I-131 uptake in metastatic thyroid cancer" J. Nucl. Med., 5:796-801(1964))과 허쉬만의 문헌(Hershman, J. M. et al. "Serum thyropin(TSH) levels after thyroid ablation compared with TSH levels after exogenous bovine TSH: implications for I-131 treatment of thyroid carcinoma" J. Clin. Endocrinol. Metab., 34:814-818(1972))을 참조할 수 있다. 또한, 전기 인간을 제외한 종은 말, 돼지, 양 등이 될 수 있다. 여기에 포함된 실시예에서는, 27가지 종의 10번째 아미노산에서 21번째 아미노산까지에 해당하는 영역의 서열을 개시하고 있다.
본 발명은 또한 동종의 야생형 당단백질 호르몬보다 증가된 활성을 가지고 있는 다른 종의 당단백질 호르몬이 염기성 아미노산을 갖는 위치에 상응하는 위치에서 치환된 하나의 염기성 아미노산을 포함하는, 동종의 야생형 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 변형된 당단백질 호르몬을 제공한다. 따라서, 활성을 증가시키기 위하여 변형시킬 당단백질은 인간을 제외한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 돼지의 당단백질 호르몬과 소의 당단백질 호르몬을 서로 비교하여 돼지와 소의 서열이 차이가 나는 위치의 아미노산이 치환된 돼지의 당단백질 호르몬을 고안하고, 변형된 돼지 당단백질 호르몬을 제조한 다음, 전기 변형된 돼지 당단백질 호르몬을 돼지과의 동물에 투여할 수 있다. 전기 변형시킬 당단백질 호르몬은 소로부터 유래된 것일 수도 있다.
본 발명은 또한 야생형 당단백질 호르몬보다 증가된 활성을 가지고 있는 동종의 다른 당단백질 호르몬에서와 동일한 위치에서 치환된 하나의 염기성 아미노산을 포함하는, 동종의 야생형 당단백질에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 변형된 당단백질 호르몬을 제공한다. 예를 들면, 인간 갑상선자극 호르몬과 인간 융모성 성선자극호르몬의 β-서브유닛의 아미노산 서열을 서로 비교한 다음, 아미노산 서열의 차이에 근거하여 전기 두 호르몬의 β-서브유닛 중 어느 하나의 아미노산을 치환할 수 있다. 당연히, 호르몬의 수용체 특이성은 여전히 유지되어야 하기 때문에, 변형된 당단백질 호르몬의 활성을 일반적으로 증가시키거나 또는 감소시키는 변화만이 심사숙고된다. 그러한 β-서브유닛 변형의 일례가 실시예에 개시되어 있는데, 전기 실시예에서는 인간 갑상선자극 호르몬과 인간 융모성 성선자극호르몬 간의 아미노산 서열 비교에 근거하여, 인간 갑상선자극 호르몬의 58번 및 63번 위치의 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환하였다.
전기 변형은 야생형 당단백질의 어떤 특정한 위치(들)에 있는 비염기성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서, 전기 변형은 비염기성 아미노산의 리신으로의 치환을 포함한다.
야생형 당단백질 호르몬의 변형의 효과는 다양한 방법으로 확인될 수 있다. 에를 들면, 변형된 당단백질 호르몬으로 트랜스펙션된 세포에서 cAMP 생산량을 측정하여, 야생형 당단백질 호르몬으로 트랜스펙션된 유사한 세포에서의 cAMP 생산량과 비교할 수 있다. 또한, 변형된 당단백질 호르몬으로 트랜스펙션된 세포에서 프로제스테론 생산량을 측정하여, 야생형 당단백질 호르몬으로 트랜스펙션된 유사한 세포에서의 프로제스테론 생산량과 비교할 수 있다. 또한, 변형된 당단백질 호르몬의 활성을 수용체 결합 분석, 티미딘 흡수 분석, 또는 T4 분비 분석을 통하여 측정할 수 있다. 변형된 당단백질 호르몬의 활성을 측정하기 위한 분석의 특정예가 실시예에 개시되어 있다. 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 야생형 또는 변형된 당단백질 호르몬의 활성을 결정하기 위하여 어떤 분석을 사용할 것인가를 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 변형된 당단백질 호르몬은 야생형 당단백질 호르몬에 비하여 적어도 3배 정도 증가된 활성을 가지고 있다. 전기 증가된 활성은 상술 되고 실시예에 개시된 기술을 사용하거나 또는 당업계에서 공지된 적절한 분석 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 물론, 증가된 활성은 분석마다 또는 세포주마다 차이가 날 수 있다. 예를 들면, 실시예에 개시하고 있는 바와 같이, cAMP 분석에 있어서 인간 당단백질 호르몬 α-서브유닛에서의 P16K 변이의 상대적인 잠재력은 야생형 당단백질 호르몬의 활성에 비하여 약 6,4배 정도 더 높았다. 그러나, 프로제스테론 방출 분석에서는 전기와 동일한 변이형과 야생형 당단백질 호르몬 간에 잠재력은 3.4배, 그리고 Vmax는 1.6배 정도 차이가 났다. 전기 특정 변이는 적어도 한 분석에서는 최소한 3배 정도의 활성증가를 보여주었으며, 따라서 적어도 3배 정도 활성이 증가된 당단백질 호르몬을 나타낸다.
그외의 다른 아미노산 위치를 더 변형시키기 위하여, 인간과 인간이 아닌 종의 당단백질 호르몬 서열들을 DNASIS(Hitashi Software Engineering Co., Ltd.)와 같은 표준 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정렬시킨 다음, 인간 당단백질 호르몬과 비인간 당단백질 호르몬 간에 차이가 나는 아미노산 잔기들을 상술한 기술을 사용하여 치환시키고, 상기 분석 방법으로 치환된 당단백질 호르몬의 활성을 분석할 수 있다.
변형된 당단백질 호르몬을 처리하거나 투여할 대상은 인간 또는 인간을 제외한 포유동물이 될 수 있다. 예를 들면, 변형된 당단백질 호르몬 초활성 효능약을 소과의 동물에 투여함으로써 소과 동물의 배란을 촉진시킬 수 있다.
특정한 하나 또는 그 이상의 위치에서 비염기성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환하는데 사용되는 방법들은 또한 당단백질 호르몬의 길항약을 고안하는데에도 사용될 수 있다. 특정한 위치의 아미노산을 치환하고 변형된 당단백질 호르몬의 활성을 모니터함으로써, 어떤 변형이 호르몬 활성을 감소시키는가를 결정할 수 있다. 당단백질 호르몬 효능약은 수용체의 교체율(turnover rate), 당단백질 호르몬에 대한 수용체의 친화도와 같은 호르몬 수용체에 대한 연구 뿐만 아니라, 그레이브스 병( Grave's disease)의 치료와 같은 치료 과정 및 수정률(fertility)의 조절에도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 당단백질 호르몬의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 당단백질 호르몬 활성과 관련된 상태를 처치하는 방법을 제공한다. 전기 상태는 당단백질 호르몬 활성과 관련된 모든 상태를 포함하며, 전기 상태의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 배란 이상(ovulatory disfunction), 황체형성 단계의 결함(luteal phase defect), 원인불명의 불임증(unexplained infertility), 수컷의 불임증(male factor infertility), 시간 제한적인 수태(time-limited conception) 등이 포함된다.
또 다른 예로는, 갑상선 암을 진단하고 치료하기 위하여 당단백질 호르몬을 투여할 수도 있다. 예를 들면, 갑상선 암을 치료하기 위하여 소의 TSH를 인간 환자에게 투여하여 갑상선 조직내로의 131I의 흡수를 촉진할 수 있다(참조: Meier, C. A. et al. "Diagnostic Use of Recombinant Human Thyropin in Patients with Thyroid Carcinoma(Phase I/II Study))" J. Clin, Endocrinol. Metabol., 78:22(1994)).
당업계에서 통상의 지식을 지닌 자라면 누구나 용이하게 적절한 투여량을 결정할 수 있으며, 몸무게, 사이즈, 상태의 악화된 정도 및 투여 대상 자체의 유형과 같은 요인들에 의존한다. 치료학적으로 효과가 있는 유효량은 통상적인 최적화 과정을 통하여 용이하게 결정돌 수 있다. 본 발명은 야생형 당단백질 호르몬에 비하여 증가된 활성을 가지고 있는 당단백질 호르몬을 제공한다. 전기 변형된 당단백질 호르몬은 야생형 당단백질 호르몬에 비하여 상대적으로 적은 용량을 투여하여도 유사한 정도의 치료효과를 얻을 수 있게 하여주거나 또는 야생형 당단백질 호르몬과 유사한 용량을 투여하여도 증가된 치료효과를 얻을 수 있게 하여준다.
당단백질 호르몬을 경구로 투여하느냐, 비경구로 투여하느냐 또는 다른 방법으로 투여하느냐에 따라, 프로스타글란딘(prostaglandin)의 투여는 고형, 반고형, 또는 예를 들면 정제, 환제, 캡슐제, 분말, 액체, 크림 및 현탁제 등과 같은 액상 용량 형태(liquid dosage form)로, 바람직하게는 정확한 양을 전달하기에 적절한 단위 용량(unit dosage) 형태로 이루어질 수 있다. 전기 당단백질 호르몬은 약학적으로 허용가능한 담체와 결합된 형태로 선택된 당단백질 호르몬의 유효량을 포함할 수 있으며, 또한, 다른 의학적 제제, 약학적 제제, 담체, 보조제, 희석제 등을 추가로 포함할 수도 있다. "약학적으로 허용가능한"이라는 문구는 생물학적으로 또는 달리 바람직한 물질을 의미하며, 즉 전기 물질은 선택된 당단백질 호르몬과 함께, 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기시키거나 또는 전기 당단백질 호르몬과 바람직하지 않은 상호작용을 하지 않으면서, 환자에게 투여될 수 있다. 전기 용량 형태를 제조하는 실제적인 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이미 공지되어 있거나 또는 자명할 것이다(참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton, PA).
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 당단백질 호르몬을 보조량만큼 투여하는 단계를 포함하는 생식(reproduction) 보조 방법을 제공한다. 예를 들면, IGD(isolated gonadotropin deficiency) 환자에게 정상적인 생식기 기능을 회복할 수 있도록 변형된 여포자극 호르몬(FSH, follitropin)과 황체형성 호르몬(LH, lutropin)을 투여할 수 있다. FSH 및 LH와 같은 당단백질 호르몬들이 여성의 생식 생리현상에 필수적임은 당업계에서 공지의 사실이며, 다양한 생식 이상(reproductive disorder)을 극복하고 그럼으로써 생식을 돕기 위하여 전기 당단백질 호르몬들을 투여할 수 있다.
유전자 치료법은 본 발명의 변형된 당단백질 호르몬을 이용하여 호르몬 이상을 치료하기 위한 또 다른 접근법이 될 수 있다. 전기 접근법에서는, 변형된 당단백질 호르몬을 코딩하는 유전자를 생식세포 또는 체세포와 같은 세포 내로 주입하여, 전기 유전자가 세포내에서 발현되어 결과적으로 전기 주입된 유전자를 발현할 수 있는 세포가 생성된다. 예를 들면, 어떤 특정한 고나도트로핀 호르몬을 배란을 촉진키기 위하여 난소 세포 또는 그의 전구세포 내로 삽입할 수 있다. 또한, 갑상선자극 호르몬의 초활성 효능약을 코딩하는 유전자를 지니고 있는 갑상선 세포를 갑상선 종양을 가지고 있는 환자에게 주입함으로써, 갑상선 종양 내로 방사성 요오드의 흡수를 촉진시키기 위한 지속적인 TSH 투여에 대한 요구를 해결할 수 있다. 전기 코딩 서열을 전달하기에 적합한 벡터들은 당업계에서 공지되어 있으며, 아데노바이러스, adenoassociated virus, 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터와 양이온성 리포좀과 같은 비 바이러스성 벡터들을 예로 들 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 변형된 당단백질 호르몬은 치료제를 갑상선 조직 또는 생식기로 전달하거나 또는 종양을 치료하는데 이용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다른 종으로부터 유래된 보다 활성이 뛰어난 동질체(homolog)의 아미노산 서열을 인간 호르몬과 비교하는 단계; 인간 호르몬의 아미노산을 다른 종의 대응 아미노산으로 치환하는 단계; 치환된 인간 호르몬의 활성을 측정하는 단계; 및, 전기 치환된 인간 호르몬들 중에서 초활성 유사체(superactive analog)를 선별하는 단계를 포함하는, 인간 호르몬의 초활성 비 키메라 유사체를 제조하는 방법을 제공한다. 인간 호르몬의 초활성 유사체는 야생형 호르몬에 비하여 활성이 증가된 모든 유사체들을 포함한다. 예를 들면, 인간 갑상선자극 호르몬 α-서브유닛의 11번 아미노산을 트레오닌에서 리신으로(T11K) 변형시키면, 실험실적 조건에서 배양된 JP09 세포에서 cAMP의 생산이 상대적으로 증가된다(참조: 실시예의 표 2). 다라서, 인간 갑상선자극 호르몬의 전기 변형은 야생형 인간 갑상선자극 호르몬의 초활성 유사체를 초래한다. 이러한 변형을 생성하기 위하여 치환시킬 특정한 아미노산(들)은, 상술하였듯이, 다른 종으로부터 유래된 유사체의 활성을 측정하여 인간 호르몬과 비교하고; 정렬된 아미노산 서열을 비교하여 아미노산 서열상의 차이를 조사하고; 다른 종의 호르몬에 있는 적절한 아미노산으로 인간 호르몬의 대응 위치에 있는 아미노산을 치환하고; 상술한 기술을 이용하여 변형된 인간 호르몬의 활성을 측정하고; 그런 다음, 전기 변형된 호르몬의 활성과 야생형 인간 호르몬의 활성을 비교하여, 치환된 인간 호르몬 중에서 초활성 유사체를 선택함으로써 결정될 수 있다.
당단백질 효능약을 얻기 위하여 모든 조합의 아미노산 치환을 이용할 수 있다. 예를 들면, 염기성 또는 산성 아미노산을 중성 아미노산으로 대체할 수 있다. 또한, 산성 또는 중성 아미노산들을 염기성 아미노산으로 대체하거나, 또는 중성 또는 염기성 아미노산을 산성 아미노산으로 대체할 수도 있다. 상술하였듯이, 당업계에서 통상의 지식을 지닌 자라면 누구나 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체는 당단백질 호르몬이나 전기 당단백질 호르몬의 일부를 코딩하는 핵산 수준, 또는 폴리펩티드 수준에서 이루어질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 어떤 인간 호르몬이라도 전기 방법에 의하여 변형될 수 있으며, 전기 인간 호르몬의 초활성 유사체를 선택할 수 있다. 특히, 전기 인간 호르몬은 당단백질 호르몬일 수 있다.
실시예
변이유발의 첫 번째 목표로서 인간 α-서브유닛의 Cys10과 Pro20 사이의 서열을 선택하였다(참조: 도 1). hCG에 근거한 상동성 모델링은 α-서브유닛의 전기 영역이 모든 당단백질 호르몬에서 β-서브유닛으로부터 멀리 떨어져 있고, 몇몇 표면에 노출된 잔기들을 포함하고 있으며, Pro16과 Ser19 사이에 310-나선(helix)의 단일 회전(turn)을 포함하고 있음을 제시하였다. 인간의 α-서브유닛은 11,13, 16, 17 및 20번 위치에 있어서 소의 α-서브유닛과 다르며(참조: 도 1a), 이러한 변화 중의 네 가지는 비보전적이다(Thr1→Lys, Gln13→Lys, Pro16→Lys 및 Gln20→Lys). 본 발명자들은 PCR 증폭을 이용하여, 고등한 유인원(일반명 침팬지-Pan trogoldytes, 오랑우탄-Pongo pygmaeus), 하등한 유인원(긴팔원숭이-Hylobates sp.) 및 올드 월드 원숭이(비비-Papio anubis)를 포함하는 몇몇 영장류의 α-서브유닛의 11-20 영역의 서열을 결정하고, 전기 서열을 레수스 마카크(rhesus macaque, Macaca mulatta; Old World monkey), 일반명 마르모셋(Callithrix jacchus; New World monkey) 및 인간을 포함하는, 이미 알려진 포유동물의 서열과 비교하였다(참조: 도 1a). 다른 종들간의 서열의 동시 비교는 전기 영역의 염기성 잔기들이 영장류의 진화에 있어서 비교적 늦은 시기에 대체되었음을 제시하였다. 레수스 원숭이(Rhesus monkey)의 α-서브유닛 유전자는 11, 16 및 20번 위치에는 Lys 잔기를, 그리고 13번 위치에는 Arg 잔기를 코딩하고2, 비비의 α-서브유닛 유전자는 16번 위치에 Gln을 코딩하는 반면, 긴팔원숭이의 서열은 13번 위치에 His의 약염기성 이미다졸리움(imidazolium) 그룹 하나만을 포함한다(참조: 도 1a). 분명히 전기 영역의 양전하를 띤 아미노산 잔기들의 무리는 척추동물이 진화하는 동안 유지되고 변형되었지만, 고등한 유인원과 인간의 서열에는 존재하지 않는다. α-서브유닛의 11-20 영역의 양전하를 띤 잔기들의 점진적인 제거는 호미노이즈(hominoids, 인간과 유인원)의 올드 월드 원숭이로부터의 진화상 분기와도 일치한다. 전기 영역이 수용체에의 결합을 조절할 지도 모른다는 본 발명자들의 가설은, 1) bTSH의 Tyr21의 요오드화에 대한 높은 반응성, 2) hCG의 항원결정기의 매핑(mapping), 3) 아실화(acylation), 무수 아세트산(acetic anhydride)으로의 표지 및 개개의 서브유닛의 페질레이션(pegylation)에 의하여 연구된 바와 같이, 양과 인간의 α-서브유닛 Lys 잔기의 아미노기의 효과적인 호르몬-수용체 상호작용에 대한 역할에 의하여 더욱 뒷받침된다.
결과적으로, 양전하를 띤 Lys 잔기를 인간 α-서브유닛의 Cys10-Pro21 영역 내로 삽입하였다(참조: 도 1b). 두 개의 다른 영역 또한 변이시켰다(참조: 표 1). 한편, β-서브유닛의 하나의 비보존적인 Leu69의 Arg으로의 변이는 유사한 서열 비교에 근거하여 이루어졌다.
변이의 효과
야생형(wild-type, WT) 또는 변이된 인간 α 및 hTSHβ7 또는 hCGβ cDNA를 다양한 조합으로 CHO-K1 세포에 함께 트랜스펙션시킨 결과, 14가지 hTSH와 11가지 hCG 이종다이머(heterodimer)가 발현되었다(참조: 표 1). 다른 많은 변이유발 연구와는 대조적으로, 변이형의 발현은 일반적으로 야생형에 필적할 만 하였으며, T11K, Q13K, P16K, Q20K, Q50P 및 Q13K+P16K+Q20K와 같은 hTSH α-변이형들은 WT-hTSH 보다 높은 수준으로 발현되었다. 이처럼, 진화상 발생한 변이는 hTSH 또는 hCG 분자의 합성을 주요한 방식으로 손상시키는 것이 아니라, 어떤 경우에는 호르몬 생산을 촉진시킬 지도 모른다.
다양한 생물학적 분석을 이용하여 hTSH와 hCG 변이형의 상대적인 잠재력과 효능을 비교하였다. 안정하게 트랜스펙션(stable transfection)된 인간 TSH 수용체를 가지고 있는 CHO-JP09 세포에서 야생형과 변이형 hTSH의 cAMP 생산 촉진 능력을 테스트하였다. 그 결과, 다양한 단일 α-서브유닛 변이형들이 다음과 같은 서열의 잠재력을 가지고 있음을 확인하였다: P16K(WT 보다 6배 낮은 EC50) ≥ Q20K > Q13K > T11K > WT-hTSH ≒ Q50P ≒ R67K(참조: 표 1). 야생형과 변이형 hTSH의 수용체-결합 능력을 돼지의 갑상선 막에 대한 경쟁적 결합 분석으로 조사하였다. cAMP 생산 촉진과 일치하는 양상으로, 다음과 같은 서열의 잠재력이 관찰되었다: P16K(WT 보다 5배 큰 친화도) > Q20K ≥ Q13K > T11K > WT-hTSH ≒ Q50P ≒ R67K(참조: 표 1). 이와 같이, JP 709 세포에서 관찰되는 단일 변이형들의 잠재력의 증가는 TSH 호르몬에 대한 친화도의 증가와 직접적으로 연관이 있었다. 가장 주목할 만한 것은, 11-20 영역에서 Lys 잔기로의 각 변이는 활성에 있어서 상당한 증가를 초래하였으나, 전기 영역 이외에서의 변이(R67K, Q50P)는 수용체-결합 친화도 및 생물학적 활성에 아무런 영향을 미치지 않았다(참조: 표 1). hTSH의 13, 16 및 20번 아미노산의 Ala 변이는 호르몬 활성에 크게 영향을 미치지 않았으며, 이로부터 다른 종들의 유사한 호르몬에 존재하는 염기성 아미노산들의 선택적인 재구성만이 기능상의 변화를 초래함을 알 수 있었다. 또한, αSer43을 Arg으로 치환하고 αHis90과 αLys91을 교체해본 결과, 전기 아미노산 잔기들은 hTSH의 생물학적 활성에는 hCG의 활성에서만큼 중요하지 않은 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 염기성 잔기들의 호르몬- 및 위치-특이적인 역할을 강력하게 제시하였다.
조합된 변이를 가지고 있는 초활성 효능약
호르몬의 잠재력 증가와 직접적인 연관이 있는 Lys 잔기들의 효과를 보다 자세히 조사하고자, 다중 교체(multiple replacement)를 포함하는 변이형들을 제조하였다. 가장 활성이 높은 변이형들을 도 2와 도3에 나타내었다. 이중 변이형인 Pro16→Lys+Gln20→Lys 변이형와 삼중 변이형인 Pro16→Lys+Gln20→Lys+Gln13→Lys 변이형은 각각 WT-hTSH 보다 12 배 및 24배 높은 활성을 보였으며, TSH-β 서브유닛의 Leu69를 Arg으로 교체하자 잠재력이 35배 이상 증가하였다(참조: 도 2a). 또한, Glu14를 Lys으로 교체한 결과(이 위치의 Lys은 다랑어 서열에서 발견됨), 생물학적 활성이 95배 이상 증가하였으며, 전기 가장 강력한 다중 변이형들은 효능(최대 반응)을 최소한 1.5배 증가시켰다(참조: 도 2b). 이러한 활성의 증가는 변이된 hTSH의 배양된 인간 갑상선 림프소절에서의 T3 생산뿐만 아니라 인간 및 돼지의 TSH 수용체에 대한 결합 능력(참조: 표 1, 도 2c 및 도 2d)과 FRTL-5 세포의 성장 유도 능력(참조: 도 2e)을 테스트함으로써 확인되었다. 특히, Pro16→Lys+Gln20→Lys+Gln13→Lys/WT-hTSHβ와 Pro16→Lys+Gln20→Lys+Gln13→Lys/Leu69→Arg 변이형은 FRTL-5 세포에서 각각 WT-hTSH보다 18배 및 27배 낮은 농도에서도 3H-티미딘 삽입(incorporation) 자극의 최대치의 절반에 해당하는 값을 보여주었다(참조: 도 2e). 다중 변이의 TSH의 생물학적 활성에 대한 공동상승적인 효과는 α-서브유닛의 13-20 영역에 있는 Lys 잔기들과 수용체 간의 국지적인 협동작용에 제한되는 것이 아니라, β-서브유닛의 반대편 루프(loop)에 있는 Arg69도 이에 기여하는 것으로 확인되었다(참조: 표 2).
* n.a. = not applicable. 분비 수준은 WT5에 상대적인 평균±SEM으로 표시하였으며, 이때 전기 WT5는 WT-hTSH 또는 WT-hCG의 100%로 정의되었다. 전기 평균은 각각의 변이형에 대하여 매번 최소한 5개의 디쉬에서 수행된 최소한 4번의 독립적인 트랜스펙션으로부터 계산되었다.
또한, 이러한 결과는 동물 모델에서 재확인되었다. Pro16→Lys, Gln20→Lys 및 Gly13→Lys hTSH 변이형 중 하나를 마우스에 주입한 결과, WT-hTSH에 비하여 혈청 T4를 훨씬 증가시켰으며, Pro16→Lys+Gln20→Lys+Gln13→Lys/WT-hTSHβ와 Pro16→Lys+Gln20→Lys+Gln13→Lys/Leu69→Arg 변이형 또한 WT-hTSH에 비하여 높은 T4 수준을 보였다(참조: 도 2f). 마우스에서 복강 주사한 다음 6시간이 경과하였을 때 혈청에서의 hTSH 수준은 유사하였으며, 전기 hTSH 유사체(analog)들은 WT에 비하여 물질대사 제거율(metabolic clearance rate)에 있어서 큰 차이를 보이지 않았다.
* n.s. = no stimulation; n.a. = not applicable; n.d. = not determined. 커브-피팅(curve-fitting) 프로그램의 일종인 맥 알핏(Mac Allfit, NIH, Bethesda, MD)을 사용하여 용량-반응(dose-response) 데이터와 EC50 및 Vmax 수치를 계산하였다. 전기 수치들은 평균±SEM이다. 새로운 글리코실화(neoglycosylation)가 호르몬 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 글리코실화 컨센서스 서열(Asn-Lys-Thr)을 가지고 있는 Pro16/Lys+Phe17/Thr 변이형을 제조하였다.
hCG와 hTSH β-서브유닛의 서열 비교 결과, hCG만 한 영역에(TSHβ의 58번째 부터 69번째 잔기에 해당함) 염기성 잔기들의 무리를 포함하고 있음이 밝혀졌다. 본 발명자들은 위치-특이적 변이유발 방법으로 hGC 내의 염기성 잔기들의 위치에 근거하여, hTSH 내로 하나 또는 여러개의 염기성 잔기를 삽입하여, I58R, E63R, I58R+E63R 및 I58R+E63R+L69R 등의 새로운 hTSH β-서브유닛 변이형들을 제조하였다. 전기 변이형 hTSH β-서브유닛들을 인간의 α-서브유닛과 동시에 발현시킨 다음, 재조합 hTSH 유사체의 내재적인 활성을 랫트의 TSH 수용체(FRTL-5 세포)와 인간의 TSH 수용체(CHO-hTSHr 세포)에서 조사하였다. 전기 두 가지 시스템 모두에서, 단일 치환(I58R, E63R)은 hTSH의 잠재력을 2배 내지 4배 증가시켰으며, 효능도 약간 증시켰다(참조: 도 2g). 전기 두 가지 치환의 조합(I58R+E63R)은 WT-hTSH보다 15배나 높은 잠재력을 보였으며, 효능도 1,5배 증가시켰다(참조: 도 2g). 또한, 세 개의 염기성 잔기가 삽입된 I58R+E63R+L69R 변이형의 잠재력과 효능은 각각 50배 및 1.7배 증가하였다(참조: 도 2g). 이러한 내재적인 활성의 증가는 CHO-JP09 세포를 사용한 수용체-결합 분석으로부터 확인되었듯이, 수용체-결합 활성의 증가를 수반하였다(참조: 도 2h). 마찬가지로, 마우스에 I58R+E63R+L69R 변이형을 주입하였을 때, T4 자극은 위약(mock) 처리군 또는 대조군 마우스에서 보다 훨씬 높았다(참조: 도 2i).
hCG 변이형의 생물학적 활성을 MA-10 세포에서의 프로제스테론(progestron) 자극과 인간의 LH/hCG 수용체로 트랜스펙션된 COS-7 세포에서의 cAMP 자극을 이용하여 테스트하였다. hCG Lys 변이형은 ET-hCG보다 높은 효능(Vmax)과 높은 잠재력(낮은 EC50 수치)을 보였다(참조: 표 2, 도 3a). 단일 및 다중 변이의 효과는 hTSH 변이형에서 관찰된 것과 상대적으로 유사하였다. αPro16→Lys/WT-hCGβ 변이형은 MA-10 세포에서 프로제스테론 생산 자극과 수용체-결합 능력에 있어서 WT-hCG에 비하여 4배 더 높은 활성을 나타내었으며, Pro16→Lys+Gln20→Lys 및 Pro16→Lys+Gln20→Lys hCG+Gln13→Lys 변이형에 대해서는 잠재력과 효능 모두에서 증가하였다(참조: 도 3a 및 도 3b). 한편, 인간의 LH/hCG 수용체에서 조사한 경우에도, 내재적 활성의 유사한 증가가 확인되었다(참조: 도 3c 및 도 3d).
상기의 결과들은 단지 몇몇 아미노산의 치환만으로도 당단백질 호르몬의 생물학적 활성을 모델 호르몬(예를 들면 bTSH) 보다도 더 높은 수준까지 증가시키기에 충분함을 제시하였다. 흥미롭게도, 소와 인간 TSH 간의 40여개의 상이한 잔기들 중에서 단지 몇몇 잔기들만이 bTSH의 더 높은 생물학적 활성과 관련이 있는 것으로 판단된다. 다른 치환들의 대부분은 보존적이며, α-서브유닛에서의 R67K 변이에 의하여 설명되었듯이, 기능적인 중요성은 없는 것으로 사료된다. 반면, 본 발명자들은 α-서브유닛의 L1 루프와 β1-가닥(strand)에 무리지어 있는 표면에 노출된 Lys 잔기들이 bTSH의 높은 생물학적 활성에 필수적임을 확인하였다. 따라서, 오로지 단 2개의 변이된 아미노산을 가지고 있는 재조합 hTSH(P16K+Q20K)는 bTSH에 필적할 만한 내재적인 활성을 가지게 된다(참조: 표 2). 또한, 3중, 4중 및 5중 hTSH 변이형들은 bTSH보다 훨씬 높은 잠재력을 보여준다. 이러한 결과는 bTSH와 hTSH의 활성의 차이가, 활성을 증가시키는 치환을 포함하여 몇 가지 아미노산 변화에 기인할 뿐만 아니라, bTSH의 hTSH 수용체에서의 생물학적 잠재력을 감소시킬 지도 모르는 다른 아미노산 변화에도 기인함을 제시하였다.
몇몇 수용체 종들이 하나의 트랜스펙션된 cDNA로부터 유래되었을 가능성(비밀스런 위치로부터의 얼터너티브 스플라이싱에 의하거나 또는 전사 후 변형에 의하여)을 배제할 수 없음에도 불구하고, 활성 상의 유사한 차이점이 상이한 세포 시스템에서 관찰된다는 사실은, 전기 유사체들의 잠재력, 효능 및 친화도에 있어서 서로 다른 수용체 종들의 중요성에 대하여 강력하게 반박하는 것이다. 또한, 다양한 탄수화물 잔기들을 가지고 있는 자연적으로 발생하는 호르몬 이소폼(isoform)들이 수용체-결합 친화도에는 전혀 또는 거의 영향을 미치지 않으면서, 후-수용체 수준에서 그들의 영향을 발휘한다는 강력한 증거가 있다10. 야샹형 호르몬들과 그들의 유사체들은 여러 가지 실험 시스템에서 그 특성이 규명되었기 때문에, 본 실시예에개시된 생물학적 활성의 증가는 특정 세포-의존적인 수용체 변형체와 연관된 예외라기보다는 오히려 규칙에 가깝다.
합리적인 당단백질 호르몬 유사체 고안의 전망
당단백질 호르몬에서의 위치-측이적 변이유발에 관한 종래의 연구는, 알라닌 스캐닝 변이유발법(alanine scanning mutagenesis)11 또는 다중 치환 접근법(multiple replacement approach)9과 같은 전략을 사용하여, 주로 상당히 잘 보존된 영역과 잔기들에 촛점을 두고 이루어져 왔다. 몇몇 중요한 연구들은 카셋트 변이유발법 및/또는 제한효소 절편 교환(restriction fragment exchange)을 사용한 키메라 서브유닛의 생성에 근거를 두고 있다12, 13, 14. 본 발명자들은 비보존적인 잔기들을 다른 종에 존재하는 잔기들로 치환하는 전략을 사용하였는데, 이러한 전략은 성공적이어서 증가된 생물학적 활성을 가지고 있는 hFSH 변이형을 포함하여 다른 당단백질 호르몬 유사체들의 생성을 가능케하였다. 인간 α-서브유닛의 11-20 영역내로의 염기성 잔기들의 삽입에 의한 hTSH, hCG 및 hFSH의 생물학적 활성의 향상은, 전기 영역이 결정 구조에 근거한 hCG 모델과 hTSH의 상동성 모델에서 β-서브유닛으로부터 멀리 떨어져 있다는 사실과 연관이 있을 지도 모른다. 전기 두 가지 모델 모두에서 전기 영역의 실제적인 정체는, 11-26 영역에 대한 항체의 결합이 서브유닛 조합에 의하여 크게 영향을 받지 않는다는 관찰 결과15와 더불어 11-20 영역이 모든 당단백질 호르몬에 있어서 유사하게 작용할 지도 모름을 제시하고 있다. 일단 α-서브유닛을 성공적으로 조작하여 보다 강력한 hTSH, hCG 또는 hFSH를 생성한 다음에는, 동일한 패러다임을 전기 호르몬 개개의 β-서브유닛을 변형시켜 궁극적으로 각각의 당단백질 호르몬의 초활성 효능약을 제조하는데 이용하였다. 예를 들면, TSHβ-서브유닛의 비극성 Leu69를 Arg으로 치환하자 hTSH의 생물학적 활성이 더욱 증가하였다. 또한, 본 발명의 유사체들의 플라스마 반감기(plasma half-life)는 특정한 치료상의 필요에 따라 변형될 수 있다.
한편, 당단백질 호르몬 유사체들의 고안과 정제는 호르몬-수용체 복합체의 상세한 삼차원 구조를 포함할 것이다. 당단백질 호르몬 수용체의 정확한 구조는 아직 밝혀지지 않았지만, 호르몬-수용체 상호작용에 관한 몇 가지 모델이 제안된 바 있다15, 16, 17, 18. 지앙 등(Jiang et al.17)의 최근 모델에 따르면, α-서브유닛의 L1 루프는 수용체의 막통과 부위와의 상호작용에 관여할 지도 모른다. 전기 루프에 있는 양전하를 띤 잔기들의 무리는 그러한 작용을 증강시키고, 더 나아가 G 단백질(G protein)의 활성화와 신호 전달을 유도하는 수용체의 재배열을 촉진할 지도 모른다.
방법 및 재료
제한효소, DNA 마커 및 다른 분자생물학 시약들은 집코 비알엘사(Gibco BRL, Gaithersberg, USA) 또는 뵈링거 만하임사(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)로부터 구입하였다. 세포 배양용 배지, 우태아혈청(FBS) 및 리포펙타민(LipofectAMINE)은 집코 비알엘사(Gibco BRL, Gaithersberg, USA)로부터 구입하였다. 벤트 알 DNA 폴리머라제(VentR DNA polymerase)는 뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England Biolabs, Beverly, MD)로부터 구입하여 사용하였다. 인간 α cDNA 전장(840bp)은 pcDNAI/Neo 벡터(Invitrogen Corp., San Diego, CA)의 BamHI/XhoI 위치에 서브클로닝하였으며, hCG-β 유전자는 지 박사로부터 입수하였다(Dr. T. H. Ji, University of Wyoming, Laramie, WA). 첫번째 인트론이 없고, 해독되지 않는 첫 번째 엑손과 단백질 해독(translation) 개시 위치를 가지고 있는 hTSH-β 미니 유전자는 본 발명자들이 제조하였다. rhTSH-G 표준은 젠자임 사(Genzyme Corp., Framingham, MA)로부터 구입하였다. hTSH 수용체를 안정하게 발현하는 CHO 세포(CHO-hTSHR clone JP09 및 clone JP26)는 바싸트 박사(Dr. G. Vassart, University of Brussels, Brussels, Belgium)로부터 제공받았다. 인간 LH 수용체 cDNA는 미네기쉬 박사(Dr. T. Minegish, Gunma University, Gunma, Japan)로부터 입수하였다. FRTL-5 세포는 콘 박사(Dr. L. D. Kohn, NIDDK, NIH, Bethesda, MD)로부터 제공받았다. MA-10 세포는 아스콜리 박사(Dr. M. Ascoli, University of Iowa, Iowa City, IA)로부터 제공받았다. 125I cAMP와 125I-hTSH는 하즐레톤 바이올로지칼스(Hazleton Biologicals, Vienna, VA)로부터 구입하였다. 다양한 영장류의 혈액 샘플은 예케스 리저날 프라이미트 리서치 센터(Yerkes Regional Primate Research Center, Emory University, Atlanta, GA)와 애니멀 리소시즈(Animal Resources, University of Oklahoma, Oklahoma City, OK)로부터 입수하였다.
영장류의 α-서브유닛의 결정
서열
퀴아앰프 블러드 킷트(QIAampR Blood Kit, Quigen Inc., Chatsworth, CA)를 사용하여 침팬지(Pan trogoldytes), 오랑우탄(Pongo pygmaeus), 긴팔원숭이(Hylobates sp.) 및 비비(Papio anubis)의 혈청 샘플로부터 지노믹 DNA를 추출하였다. 전기 지노믹 DNA를 PCR에 사용하였으며, 인간 당단백질 호르몬의 공통적인 α-서브유닛을 코딩하는 유전자의 염기서열에 따라 합성된 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하였다19:
5'-CCTGATAGATTGCCCAGAATGC-3'(센스)(SEQ ID NO:1)
5'-GTGATAATAACAAGTACTGCAGTG-3'(안티센스)(SEQ ID NO:2)
지노믹 DNA 주형(template) 800 내지 1,000ng과 각 프라이머 10pmole을 사용하여, 10mM Tris-HCl(pH 9.0 at 25℃), 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 200uM dNTPs 및 Taq DNA 폴리머라제(Promega Corp., Madison, WI) 2 유닛을 포함하는 총 부피가 100ul인 반응액 중에서 PCR을 수행하였다. 전기 반응혼합물을 미네랄 오일로 덮고, 각 샘플을 95℃에서 10분간 가열하였다. PCR은 95℃ 1분 30초의 변성, 55℃ 1분 30초의 서냉복원(annealing) 및 72℃ 1분의 신장(extension)으로 구성되는 주기를 32회 반복하고, 72℃에서 7분간 최종 신장을 함으로써 수행되었다. 반응이 완료된 다음, 에티디움 브로마이드가 있는 조건에서 1% 아가로오스 젤로 전기 영동하였다. 엑손 3, 인트론 3 및 엑손 4의 염기서열을 포함하는 PCR 산물(약 700bp)을 퀴아퀵 피씨알 퓨리피케이션 킷트(QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN Inc., Chatsworth, CA)를 사용하여 정제한 다음, 오리지널 티에이 클로닝 킷트(Original TA Cloning Kit, Invitrogen Corp., San Diego, CA)를 사용하여 pCRTMII에 서브클로닝하였다. 전기 절편의 서열은 서브클로닝 후에 또는 시쿼나제 킷트(Sequenase kit, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH)를 사용한 직접적인 다이데옥시 염기서열 결정법으로 확인하였다.
상동성 모델링
모델링은 hCG와 hTSH간의 높은 서열상동성에 의존한다. 전기 서열들을 시스테인 노트(cysteine-knot) 잔기들이 일치되도록 정렬하고, 잘 보존된 치환 및 상동성의 퍼센티지를 참조문헌1에 개시된 바와 같이 계산하였다. hCG 와 hTSH 간에는 58%의 서열상동성이 있었고; 두 개의 β-서브유닛의 31%가 동일하였으며; 17%는 β-서브유닛의 잘 보존된 변화를 포함하고 있었다. 부룩해븐 데이터 뱅크20(Brookhaven Data Bank)로부터 입수한 크리스탈로그래픽 코디네이트(crystallographic coordinates)로부터 유추된 hCG 모델의 주형에 근거하여 hTSH의 분자 모델을 세웠다. 모든 코디네이트 조작과 에너지 계산은 콘벡스(Convex)용 참 릴리즈(CHARMm release 21.2) 21.2를 사용하여 이루어 졌으며, 분자 그래픽 팩키지인 큐안타(QUANTA, version 3.3., Molecular Simulations Inc., university of York, York, United Kingdom)를 사용하여 변형되었다.
위치-특이적 변이유발
PCR-기초 메가프라이머(PCR-based megaprimer) 방법21으로 인간 α-cDNA와 hTSHβ 미니 유전자의 변이유발을 수행하였다. 증폭은 벤트 DNA 폴리머라제(VentR DNA polymerase, New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 최적화되었다. 전기 PCR 산물을 BamHI과 XhoI으로 절단한 다음, BamHI/XhoI 절편을 pcDNA I/Neo(Invitrogen Corp., San Diego, CA)에 리게이션시켰다. 그런 다음, 울트라콤프 E. coli 트랜스포메이션 킷트(Ultracomp E. coli Transformation Kit, Invitrogen Corp.)를 사용하여 대장균 MC1061/p3을 형질전환시켰다. 여러 가지 플라스미드 DNA를 제조하는 데에는 퀴아프렙 8 플라스미드 킷트(QIAprep 8 Plasmid Kit, QIAGEN Inc., Chatsworth, CA)를 사용하였으며, 보다 많은 양의 플라스미드 DNA를 정제하기 위하여 퀴아젠 메가 앤드 맥시 퓨리피케이션 프로토콜(QUIGEN Mega and Maxi Purification Protocols)을 이용하였다. 단일 변이를 가지고 있는 α- cDNA를 포함하고 있는 플라스미드를 이후의 변이를 위한 주형으로 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 다중 변이형들을 제조하였으며, 변이 여부는 생거(Sanger)의 다이데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법에 의한 이중가닥 서열결정으로 확인하였다.
재조합 단백질의 발현
호르몬
CHO-K1 세포는 글루타민과 10% FBS, 페니실린(50 units/ml) 및 스트렙토마이신(50ug/ml)을 포함하고 있는 Ham's F-12 배지에서 유지되었다. 100mm 디쉬에서 배양된 세포를 리포펙타민(LipofectAMINE, Gibco BRL, Gaithersberg, USA)을 이용하여, 야생형 또는 변이형 α-cDNAr가 삽입되어 있는 pcDNA I/NEO와, hTSHβ 미니 유전자가 삽입되어 있는 p(LB)CMV 벡터7 또는 hCGβ-cDNA를 포함하고 있는 pcDNA I/NEO로 동시에 트랜스펙션시켰다. 24시간이 경과한 다음, 전기 트랜스펙션된 세포를 CHO-무혈청 배지(CHO serum-free medium, CHO-SFM-II, Gibco BRL)로 옮겼다. 트랜스펙션으로부터 72시간이 경과하였을 때, 삽입 유전자가 없는 발현벡터로 트랜스펙션된 대조군 세포의 배양액을 포함하여, 배양액을 회수하고, 농축하여 원심분리한 다음, aliquot을 -20℃에 보관하면서 각 분석 직전에 해동시켜 사용하였다. 야생형(WT)과 변이형 hTSH는 참조문헌9에 개시된 바와 같이 네 가지 다른 면역분석법으로 측정 및 확인되었다. WT과 변이형 hCG의 농도는 화학발광 분석법(chemiluminescence assay, hCG Kit, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA)과 면역분석법(hCG IRMA, ICN, Costa Mesa, CA)에 의하여 측정되었다.
인간 TSH 수용체를 발현하는 JP09 세포에서의 cAMP 자극
hTSH 수용체 cDNA가 안정하게 트랜스펙션된 CHO 세포(JP09 cell)를 참조문헌9에 개시된 바와 같이 농도별로 희석된 WT 또는 변이형 hTSH와 함께 배양하였다. 배양액 중으로 방출된 cAMP를 방사성 면역분석법으로 측정하였다22. 동일한 양의 총 배지 단백질을 각각 대조군과 트랜스펙션된 세포로부터 얻은 hTSH를 포함하는 샘플로 사용하였다.
인간 황체형성 호르몬을 발현하는 COS-7 세포에서의 cAMP 자극
hLH 수용체 cDNA로 일시적으로 트랜스펙션된 COS-7 세포를 참조문헌23에 개시된 바와 같이 농도별로 희석된 WT 또는 변이형 hCG와 함께 배양하였다. 배양액 중으로 방출된 cAMP를 방사성 면역분석법으로 측정하였다22. 동일한 양의 총 배지 단백질을 각각 대조군과 트랜스펙션된 세포로부터 얻은 hCG를 포함하는 샘플로 사용하였다.
MA-10 세포에서의 프로제스테론 생성 자극
96-웰 플레이트에서 자란 형질전환된 뮤린 Leydig 세포(MA-10 cell)를 참조문헌24에 개시된 바와 같이 분석용 배지 중에서 WT 또는 변이형 hCG와 함께 6시간 동안 배양하였다. 배양액 중으로 방출된 프로제스테론의 양을 방사성 면역분석법으로 측정하였다(CT Progesterone Kit, ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA).
수용체-결합 분석
hTSH 유사체의 수용체-결합 활성을 125I-bTSH를 용해된 돼지 갑상선 막으로부터 제거하는 능력을 측정함으로써 분석하였다224. 선택된 유사체의 인간 TSH 수용체에 대한 결합 활성을 JP09 세포를 사용하여 테스트하였다. hCG 유사체의 MA 세포와 인간 LH 수용체가 일시적으로 트랜스펙션된 COS-7 세포에 대한 결합활성은 참조문헌24에 개시된 바와 같이 125I-hCG와 분석용 배지를 사용하여 결정되었다.
FRTL-5 세포에서의 티미딘 흡수 자극
랫트 갑상선 세포(FRTL-5 cell)는 참조문헌22에 개시된 바와 같이 모니터되었다.
마우스에서 T
4
분비의 자극
WT과 변이형 TSH의 생체내 조건(in vivo)에서의 생물학적 활성을 변형된 멕켄지 바이오 어쎄이(McKenzie bioassay)22, 25를 이용하여 결정하였다. WT과 변이형 TSH를, 3ug/ml의 T3를 식수에 타서 6일 동안 투여함으로써 내재적인(endogenous) TSH를 미리 억제시켜둔 수컷 알비노(albino) 스위스 Crl:CF-1 마우스에 복강주사하였다. 6시간이 경과한 다음, 안와 동(orbital sinus)로부터 혈액 샘플을 수집하여, 각각의 화학발광분석법(Nichols Institute)으로 혈청 중의 T4 및 TSH 수준을 측정하였다.
본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 간행물들을 참조문헌으로 인용하였다. 어떤 간행물은 괄호 내에 번호로써 참조되었다. 번호로 참조된 간행물들의 전체 인용문을 아래에 정리하였다. 전기 인용문헌들 모두의 개시와 전기 간행물들 내에서 인용된 참조문헌들은, 본 발명이 속하는 기술분야의 상황을 완전히 개시하기 위하여 본 명세서에 참조문헌으로써 삽입된다. 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 본 발명의 범위와 정신으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형과 변화를 이룰 수 있음이 자명할 것이다. 본 발명의 다른 실시예는 여기에 개시된 본 발명의 명세서와 실시를 고려함으로써 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명해 질 것이다. 명세서와 실시예는 다음의 청구항이 개시하고 있는 발명의 진정한 범위와 정신에 입각하여 오로지 실시예로서 간주되어야 한다.
Claims (71)
- α-서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치들에 적어도 3개의 염기성 아미노산을 포함하는 변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치에 네 번째 염기성 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 2항에 있어서,염기성 아미노산은 11, 13, 16 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 2항에 있어서,염기성 아미노산은 11, 13, 17 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 2항에 있어서,염기성 아미노산은 13, 14, 16 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 2항에 있어서,염기성 아미노산은 13, 14, 17 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 위치에 다섯 번째 염기성 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 7항에 있어서,염기성 아미노산은 13, 14, 16, 17 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 7항에 있어서,염기성 아미노산은 11, 13, 14, 16 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,염기성 아미노산은 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,염기성 아미노산은 13, 16 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,호르몬은 갑상선자극 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 12항에 있어서,변형된 호르몬은 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 한 위치에 염기성 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 13항에 있어서,변형된 호르몬은 β-서브유닛의 58, 63 및 69번 위치에 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 13항에 있어서,염기성 아미노산은 58번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 13항에 있어서,염기성 아미노산은 63번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 13항에 있어서,염기성 아미노산은 69번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 1항에 있어서,호르몬은 여포자극 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,호르몬은 황체형성 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,호르몬은 융모성 성선자극 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,염기성 아미노산은 리신인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1항에 있어서,염기성 아미노산은 리신과 아르기닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1 내지 22항 중 어느 한 항의 적절한 당단백질 호르몬을 약학적으로 허용가능한 담체와 결합시키는 단계를 포함하는, 당단백질 호르몬 활성과 관련된 상태를 처치하기 위한 의약을 제조하는 방법.
- 제 23항에 있어서,상태는 배란 이상(ovulatory disfunction)인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 23항에 있어서,상태는 황체형성 단계의 결함(luteal phase defect)인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 23항에 있어서,상태는 원인불명의 불임증(unexplained infertility)인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 23항에 있어서,상태는 수컷의 불임증(male factor infertility)인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 23항에 있어서,상태는 시간 제한적인 수태(time-limited conception)인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 23항에 있어서,상태는 갑상선 암인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 1 내지 22항 중 어느 한 항의 당단백질 호르몬을 보조량(assisting amount)만큼 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 생식(reproduction) 보조 방법.
- 제 1 내지 22항 중 어느 한 항의 인간 당단백질을 코딩하는 핵산.
- 다음과 같은 특징을 가지는 제 31항의 핵산을 포함하는 벡터:전기 벡터는 전기 핵산을 발현하기에 적절하다.
- 다음과 같은 특징을 가지는 제 32항의 벡터를 포함하는 숙주:전기 숙주는 전기 핵산을 발현하기에 적절하다.
- 제 1 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서,변형된 인간 당단백질 호르몬은 α -서브유닛의 10, 12, 15, 18, 19 및 21번 위치에서는 인간 당단백질 호르몬과 완벽한 아미노산 서열 상동성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 18, 19 및 20항 중 어느 한 항에 있어서,변형된 인간 당단백질 호르몬은 인간 갑상선자극 호르몬 β -서브유닛의 58, 63 및 69번 위치에 해당하는 당단백질 호르몬의 β -서브유닛 상의 위치들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- α -서브유닛의 11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 염기성 아미노산을 포함하는 변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 11번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 13번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 14번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 16번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 17번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 리신인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,염기성 아미노산은 리신과 아르기닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,11, 13, 14, 16, 17 및 20번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 두 개의 위치에 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 45항에 있어서,염기성 아미노산은 16 및 20번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 45항에 있어서,염기성 아미노산은 16 및 13번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 45항에 있어서,염기성 아미노산은 20 및 13번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 45항에 있어서,염기성 아미노산은 리신과 아르기닌으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,호르몬은 갑상선자극 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 50항에 있어서,변형된 호르몬은 β -서브유닛의 58, 63 및 69번 위치로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 한 위치에 염기성 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 51항에 있어서,변형된 호르몬은 β -서브유닛의 58, 63 및 69번 위치에 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 51항에 있어서,염기성 아미노산은 58번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 51항에 있어서,염기성 아미노산은 63번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 51항에 있어서,염기성 아미노산은 69번 위치에 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 갑상선자극 호르몬.
- 제 36항에 있어서,호르몬은 여포자극 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,호르몬은 황체형성 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36항에 있어서,호르몬은 융모성 성선자극 호르몬인 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 1 내지 22항 및 제 36 내지 58항 중 어느 한 항의 적절한 당단백질 호르몬을 유효량 만큼 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 당단백질 호르몬 활성과 관련된 상태를 처치하는 방법.
- 제 59항에 있어서,상태는 배란 이상인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 59항에 있어서,상태는 황체형성 단계의 결함인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 59항에 있어서,상태는 원인불명의 불임증인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 59항에 있어서,상태는 수컷의 불임증인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 59항에 있어서,상태는 시간 제한적인 수태인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 59항에 있어서,상태는 갑상선 암인 것을 특징으로 하는방법.
- 제 36 내지 58항 중 어느 한 항의 변형된 당단백질 호르몬을 보조량만큼 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 생식 보조 방법.
- 제 37 내지 49항 중 어느 한 항의 변형된 인간 당단백질을 코딩하는 핵산.
- 다음과 같은 특징을 가지는 제 67항의 핵산을 포함하는 벡터:전기 벡터는 전기 핵산을 발현하기에 적절하다.
- 다음과 같은 특징을 가지는 제 68항의 벡터를 포함하는 숙주:전기 숙주는 전기 핵산을 발현하기에 적절하다.
- 제 36 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서,변형된 인간 당단백질은 α -서브유닛의 10, 12, 15, 18, 19 및 21번 위치에서는 야생형 인간 당단백질 호르몬과 완벽한 아미노산 서열 상동성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
- 제 36 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서,변형된 인간 당단백질 호르몬은, 갑상선자극 호르몬을 제외한 다른 당단백질 호르몬의 β -서브유닛의 아미노산 위치들 중 인간 갑상선자극 호르몬 β -서브유닛의 58, 63 및 69번 아미노산 위치에 상응하는 위치들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는변형된 인간 당단백질 호르몬.
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Applications Claiming Priority (1)
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1996
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