KR100642592B1

KR100642592B1 - 갑상선 자극 호르몬의 변이체 및 이에 근거한 방법

Info

Publication number: KR100642592B1
Application number: KR1020057013108A
Authority: KR
Inventors: 브루스 디 웨인트럽; 마리우스 더블유 스즈쿠드린스키
Original assignee: 유니버시티 어브 메릴랜드, 발티모어
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2006-11-13
Also published as: KR20010030661A; DE69837271T2; CA2302993A1; DE69837271D1; EP1017817A2; CN1277633A; JP2001517445A; KR20050085969A; KR100642586B1; KR100642599B1; KR20050085970A; EP1017817B1; WO1999015665A3; AU9499898A; US20040266665A1; EP1816199A1; WO1999015665A2; KR20050085968A; AU758156B2; ATE356209T1

Abstract

본 발명은 야생형에 대하여 각각 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 α 소단위체 및 돌연변이 β 소단위체를 생산할 수 있으며, 조합되어 증가된 실험실내 생체활성 및 생체내 연장된 반감기를 갖는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체를 형성할 수 있는 발견에 근거한다. 따라서, 본 발명은 갑상선 질환, 특히 갑상선 암의 치료 및 예방을 위한 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 절편 및 그들의 유도체를 사용하는 방법을 제공한다. 아울러, 본 발명은 갑상선-관련 기능을 진단, 예후 및 감시하는 방법에 관한 것이다. 또한, 약학적 및 진단학적 조성물, 대사성 및 생식 질환의 치료 및 예방을 위한 용도에 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 갑상선 자극 호르몬 유사체를 사용하는 방법을 제공한다.

TSH, 갑상선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬의 변이된 β 소단위체

Description

갑상선 자극 호르몬의 변이체 및 이에 근거한 방법{Mutants of Thyroid Stimulating Hormone and Methods Based Thereon}

도 1은 사람의 당단백질 호르몬의 일반적인 α 소단위체의 아미노산 서열(서열번호 1)이다. 서열 위의 선으로 표시된 것이 αL1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 잔기(8 내지 30 위치)이다. 서열 위에 기재된 숫자는 돌연변이가 잘 일어나는 아미노산의 위치를 나타낸다.

도 2는 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 아미노산 서열(서열번호 2)이다. 서열 위의 선으로 표시된 것이 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에 위치하는 아미노산 잔기(52 내지 87 위치)이다. 서열 위에 기재된 숫자는 돌연변이가 잘 일어나는 아미노산 위치를 나타낸다.

도 3은 hCG β 소단위체의 아미노산 서열이다. 밑줄 친 부분은 CTEP의 아미노산 잔기를 나타낸다.

도 4는 돌연변이 αG22R을 가진 α 소단위체 및 야생형 β 소단위체를 포함하는 돌연변이 이형이합체(닫힌 삼각형); 및, 야생형 갑상선 자극 호르몬(닫힌 원형)을 나타낸다.

도 5는 αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K 돌연변이를 가진 α4K 소단위체 및, β 소단위체와 CTEP의 융합 단백질을 포함하는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체(α4K+βCTEP; 십자 사각형); αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K 돌연변이 및, 야생형 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 포함하는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬(α4K, 열린 사각형); 야생형 갑상선 자극 호르몬(닫힌 원형)에 의한 JP09 세포에서 cAMP 생성의 자극을 나타낸다.

도 6은 갑상선 자극 호르몬-특이적 β 소단위체의 βL1 루프의 돌연변이를 나타낸다. 선 그래프는 β13E 및 βR14E가 야생형 갑상선 자극 호르몬과는 근본적으로 다르게 생물학적 활성을 가지지 않으나, βF1R, βE6N 또는 βA17R 돌연변이 소단위체의 어떠한 것과 합체된 이형이합체는, cAMP 생성에 대한 표준적인 실험실적 분석을 통하여 근본적으로 높은 생물학적 활성을 나타냄을 보여준다.

도 7은 갑상선 자극 호르몬-특이적 β 소단위체 내의 돌연변이의 조합이, cAMP 생성에 대한 표준적인 실험실적 분석을 통하여 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 근본적으로 호르몬 활성이 더 큼을 나타낸다. 돌연변이 이형이합체는 βF1R 및 βE6N 돌연변이의 조합 또는, βF1R, βE6N 및 βA17R 돌연변이의 조합 중의 하나를 포함한다.

도 8a 내지 8b는 사람의 갑상선 자극 호르몬 유사체의 생체내 활성을 나타내는 선 그래프이다. 도 8a는 사람의 갑상선 자극 호르몬 야생형(hTSH-wt) 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체 중의 하나를 복강내 주사하여 6시간 후에 T3-억제된 마우스의 혈액에서 T4의 수준을 나타낸다. 측정값은 각각의 자료값을 나타내는 5개의 마우스의 평균에 대한 평균+표준오차이다. 도 8b는 각각의 벡터에 대한 갑상선 자 극 호르몬에 대한 T4의 전체적인 비율을 나타내는 막대그래프이다. 단위는 복강내 주사하여 6시간 후에 혈청의 전체 평균 T4(㎍/㎗)를 혈청의 사람의 갑상선 자극 호르몬(ng/㎖)으로 나눈 것이다. 복강내 주사하여 6시간 후, 200 또는 20ng으로 주사된 물질의 회복은 유사하였다(야생형, α4K 및 α4K/β3R 각각 2%, 1% 및 1%).

본 발명은 갑상선 자극 호르몬의 돌연변이, 유도체 및 그의 유사체와 전기 갑상선 자극 호르몬의 돌연변이, 유도체 및 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 약학적 조성물 및 진단과 치료의 방법에 관한 것이다.

당단백질 호르몬(glycoprotein hormone)은 생식 및 대사의 조절에 관여하는, 진화적으로 보존된 호르몬의 일종이다(참조: Pierce and Parsons, Endocr. Rev., 11:354-385, 1981). 이러한 계통의 호르몬은 여포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 황체형성호르몬(leuteinizing hormone, LH), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone, TSH) 및 융모막의 생식선자극호르몬(chorionic gonadotropin, CG)을 포함한다.

갑상선 자극 호르몬은 뇌하수체 전엽의 향갑상선성세포(thyrotroph)에서 생산되는 28 내지 30kDa의 이형이합체의 당단백질(heterodimeric glycoprotein)이다. 갑상선호르몬의 분자량의 차이는 주로 당질 사슬의 이질성(heterogeneity) 때문이다. 갑상선호르몬의 합성 및 분비는 갑상선 자극 호르몬의 유리 호르몬(thyrotropin-releasing hormone, TRH)에 의하여 자극을 받으며, 고전적인 내분비계의 음성 되먹이 사슬(negative feedback loop)에서 갑상선호르몬에 의하여 억제된다. 갑상선 자극 호르몬은 G 단백질이 연결된 갑상선 자극 호르몬 수용체(G protein-coupled TSH receptor, TSHR)와 함께 작용하여 갑상선의 기능을 조절한다(참조: Vassant and Dumont, Endocr. Rev., 13:596-611, 1992). 갑상선 세포 상의 수용체와 갑상선 자극 호르몬의 결합은 사이클릭 아데노신 3',5'-모노포스페이트(cyclic adenosine 3',5'-monophosphate, cAMP), 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(inositol 1,4,5-triphosphate, IP3) 및 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)에 주로 관여하는 2차 메신저 경로(second messenger pathway)의 자극을 유도하며, 최종적으로 갑상선 유전자 발현의 변조(modulation)를 유발한다. 갑상선 자극 호르몬의 생리학적인 역할은 요오드 섭취 및 기관지향적 작용(organification) 등의 분화된 갑상선 기능의 자극, 선(gland)로부터 갑상선호르몬의 분비 및 갑상선 성장의 촉진을 포함한다(참조: Wondisford et al., Thyrotropin. In:Braverman et al.(eds.), Werner and Ingbar's The Thyroid, Lippencott-Raven, Philadelphia, pp. 190-207, 1996).

구조적으로 당단백질 호르몬은 일반적인 α 소단위체(α-subunit) 및 호르몬 특이적인 β 소단위체(β-subunit)가 포함된 이형이합체와 관계가 있다. 일반적인 사람의 α 소단위체는, 모두가 이황화물 결합(disulfide linkage)을 형성하는 10개 의 반-시스틴 잔기(half-cystine residue)를 함유하는 92개의 아미노산의 아포단백질의 중심부(apoprotein core)를 포함한다. α 소단위체는 사람의 염색체 6에 위치한 단일 유전자에 의하여 암호화되므로, α 소단위체가 주어진 종 내에서 아미노산 서열은 서로 동일하다(참조: Fiddes and Goodman, J. Mol. Appl. Gen., 1:3-18, 1981). 호르몬 특이적인 β 소단위체는 길이, 구조적 조직화 및 염색체내 위치(chromosome localization)가 상이하다(참조: Shupnik et al., Endocr. Rev., 10:459-475, 1989). 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 유전자는 118개의 아미노산 잔기의 성숙한 단백질을 발현시킬 것으로 예상되며, 염색체 1에 위치한다(참조: Wondisford et al., Thyrotropin. In:Braverman et al.(eds.), Werne and Ingbar's The Thyroid, Lippencott-Raven, Philadelphia, pp. 190-207, 1996). 다양한 β 소단위체는 6개의 이황화물 결합을 형성하는 12개의 불변성의 반-시스틴 잔기에 따라서 배열될 수 있다. 호르몬 간의 30 내지 80%의 아미노산 서열 상동성에도 불구하고, β 소단위체는 높은 특이성을 가지면서 직접 구별된 수용체 결합으로 충분히 구별된다(참조: Pierce and Parsons, Endocr. Rev., 11:354-385, 1981).

이러한 호르몬의 주요 구조적 성분은 중량의 15 내지 35%를 차지하는 그들의 당질 부위이다. 일반적인 α 소단위체는 2개의 아스파라긴-연결된 과당류(asparagine (N)-linked oligosacchride)를 가지며, β 소단위체는 하나(TSH 및 LH의 경우) 또는 2개(CG 및 FSH의 경우)를 가진다. 아울러, CG의 β 소단위체는 4개의 세린-연결된 글리코실화 부위(serine (O)-linked glycosylation site)를 가진 유일한 32 잔기의 카르복시-말단 확장 펩티드(carboxy-terminal extension peptide, CTEP)를 갖는다(참조: Baenziger, Glycosylation and glycoprotein hormone function, in Lustbander et al.(eds.) Glycoprotein Hormones: Structure, Function, and Clinical Implications, Springer-Verlag, New York, pages 167-174, 1994).

전통적으로 사람의 당단백질 호르몬의 구조 및 기능의 상관관계(structure-function relationship)는 주로 생식선자극호르몬, 특히 사람의 융모막의 생식선 자극 호르몬(hCG)을 대상으로 연구되었다. 최근에, 부분적으로 탈글리코실화된 hCG의 결정구조가 밝혀져서, 기타 당단백질 호르몬과 연관될 수 있는 두 개의 상관된 구조 생김새가 알려졌다(참조: Lapthorn et al., Nature, 369:455-461, 1994; Wu et al., Structure, 2:548-558, 1994). α 소단위체 및 hCG β 소단위체 모두 유사한 총체적 위상 형태(topology)를 갖는다-각각의 소단위체는 중심 시스틴 매듭(3개의 이황화물 결합에 의하여 형성)의 한쪽에는 두 개의 β-헤어핀 루프(L1 및 L3)를 가지며, 다른 한쪽에는 긴 루프(L2)를 가지고 있다.

사람의 갑상선 자극 호르몬의 분자생물학적인 연구는 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 cDNA 및 유전자의 클로닝(참조: Joshi et al., Endocrinol., 136:3839-3848, 1995), 갑상선 자극 호르몬 수용체 cDNA의 클로닝(참조: Parmentier et al., Science, 246:1620-1622, 1989; Nagayama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 166:394-403, 1990), 및 갑상선 자극 호르몬의 재조합적인 발현(참조: Cole et al., Bio/Technol., 11:1014-1024, 1993; Grossmann et al., Mol. Endocrinol., 9:948-958, 1995; Szkudlinski et al., Nat. Biotechnol., 14:1257- 1263, 1996)에 의하여 용이해졌다. 갑상선 자극 호르몬의 구조 및 기능에 대한 이전의 연구는 우선적으로 잘 보존된 영역 및 키메라 소단위체의 형성에 초점이 맞추어졌다. 그러나, 이러한 접근법은 실험실적으로 생체활성이 증가된 호르몬을 제조하지 못했다(참조: Grossmann et al., Endocr. Rev., 18:476-501, 1997).

순환시 당단백질 호르몬의 반감기를 연장시키기 위한 전략들이 개발되어 왔다. 유전자 융합 실험에서는, 여러 개의 O-연결된 당질을 포함하는 hCG β 소단위체의 카르복시-말단 확장 펩티드가, 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체에 첨가되었다(참조: Joshi et al., Endocrinol., 136:3839-3848, 1995; Grossmann et al., J. Biol., Chem., 272:21312-21316, 1997). 비록, 이러한 키메라의 실험실적인 활성은 변하지 않았으나, 순환시의 반감기는 연장되어 그 결과, 생체 내에서 생체활성이 증가되었다. 아울러, 단일 사슬로서 유전적으로 융합된, α 및 β 소단위체의 발현은 야생형 당단백질 호르몬과 비교할 때, 안정성 및 연장된 혈장 반감기의 증가를 가져왔다(참조: Sugahara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92:2041-2045, 1995; Grossmann et al., J. Biol. Chem., 272:21312-21316, 1997).

진단에서의 갑상선 자극 호르몬의 사용 및 갑상선 암종의 모니터링

재조합 갑상선 자극 호르몬은 진단에서 ¹³¹I의 섭취 및 Tg 분비를 자극하기 위하여 시험될 수 있으며, 분화된 갑상선 암종을 가진 19명의 환자를 대상으로 수행하여, 갑상선 자극 호르몬 철수(thyroid hormone withdrawal)의 부작용(참조: Meier et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 78:188-196)을 피하였다. 첫 번째 시도의 처음 결과는 상당히 고무적이었다. 미합중국 내에서 갑상선 암종의 발병률은 대략 1년에 14,000건이다. 이들 중 대부분은 분화된 및 유두종(papillary) 또는 소포성(follicular) 암이 대부분의 일반적인 유형이다. 전기 분화된 갑상선 암종의 10년 및 20년 생존율은 각각 90% 및 60%이고, 특히 암은 1차 치료 후 10년을 단위로 재발할 수 있으므로, 국소적인 재발병 및 원발성 전이(distant metastasis)를 장기간 모니터링하는 것은, 전기 환자를 돌보는데 필수적이다. 뒤이은 조치에 사용되는 주된 방법은 전신 방사성 요오드의 스캐닝(whole body radioiodine scanning) 및 혈청 티로글로불린(Tg) 측정이다. 전기 진단 과정의 최적의 민감성을 위하여, 잔여 갑상선 조직을 갑상선 자극 호르몬에 의하여 자극시킴으로써¹³¹I섭취 또는 Tg 분비를 증가시키는 것이 각각 요구된다. 그러나, 갑상선절제술 후의 갑상선 암 환자는 갑상선기능 정상(euthyroidism)을 유지할 뿐 아니라, 잔여 갑상선 조직에서의 갑상선 자극 호르몬의 잠재적인 자극효과를 피하기 위하여, 내인성 갑상선 자극 호르몬을 억제하는 갑상선 자극 호르몬을 사용하여 치료한다. 따라서, 좌회전성의 T₄(levo-T₄) 또는 덜 사용되는 T3는 내인성의 갑상선 자극 호르몬 분비를 자극하기 위하여, 방사성 요오드 스캐닝 및 Tg 측정 전에 4 내지 6 및 2주 안에 제거된다. 일시적으로 동반되는, 그러나 심각한 갑상선 저하증은 전기 환자에 있어서, 삶의 질을 심각하게 해치며, 그들의 작업능력을 방해할 수도 있다. 게다가, 갑상선 자극 호르몬은 악성 갑상선 조직에서 성장 인자로 작용할 수 있으므 로, 증가된 내인성의 갑상선 자극 호르몬 분비의 장기간 지속은 전기 환자에 잠재적 위험을 가져다준다.

1960년대에, 송아지 갑상선 자극 호르몬(bTSH)이 내인성 갑상선 자극 호르몬을 증가시키기 위한 요구를 극복하기 위하여 잔여 갑상선 조직을 자극하는데 사용되어 왔다(참조: Blahd et al., Cancer, 13:745-756, 1960). 그러나, 몇몇 단점 때문에 곧 임상적인 효용에서 지속적으로 사용할 수 없음이 명백해졌다. 호르몬 제거에 비하여, bTSH는 잔여 악성 갑상선 조직 및 전이를 측정하는데 덜 효과적임이 밝혀졌다. 아울러, 내인성 갑상선 자극 호르몬 측정을 방해할 뿐 아니라, 차후의 bTSH 투여의 영향을 추가로 제한할 수 있는 중화 항체와 더불어 알레르기 반응이 빈번히 확인되었다(참조: Braverman et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 74:1135-1139, 1992).

진단학적 또는 치료적 관점으로부터, 원하는 특성을 가진 신규한 사람의 갑상선 자극 호르몬의 개발에 대한 끊임없는 관심이 대두하였다. 호르몬 활성은, 일반적으로 호르몬 반감기의 연장(장시간 작용하는 유사체) 및 내재적 활성의 증가(초활성 유사체)에 의하여 증가될 수 있다. 본 발명자들은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 유사체를 제조하였으며, 이러한 신규의 분자가 야생형 갑상선 자극 호르몬의 실험실내 및 생체내 활성에 우월한 실험실내 및 생체내 활성을 가짐을 확인하고, 하기에 기술하였다.

발명의 요약

본 발명은 당단백질 호르몬에 일반적인 α 소단위체의 돌연변이, 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 돌연변이, 갑상선 자극 호르몬의 유사체, 유도체, 및 그들의 절편, 바람직하게는 생체내의 반감기를 증가시키기 위하여 아래에 기술된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환된 돌연변이 소단위체 및/또는 수식된(modified) 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 포함하는 갑상선 자극 호르몬의 돌연변이에 관한 것이다. 돌연변이 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 유도체 및 그들의 절편은, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 결합 및 TSHR 신호전달(signal transduction) 및 순환시의 연장된 호르몬 반감기의 측면에서 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 더 큰 활성이 있다.

바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 α 소단위체 β-헤어핀 L1 루프 근처 또는 전기 루프 내에서의 아미노산의 돌연변이를 갖는, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 갑상선 자극 호르몬 유사체를 제공하며, 가장 바람직하게는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬은 생체내의 반감기를 증가시키기 위하여 수식될 수 있으며, 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 사람의 융모막의 생식선자극호르몬(hCG) β 소단위체의 카르복시 말단 확장 펩티드(CTEP)에 융합시키는 것 및/또는 돌연변이 α 및 β 소단위체를 융합시켜 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체를 생산한다. 화학합성 또는 재조합 DNA 기술에 의하여 전기 물질을 제조하는 방법은 본 발명의 범주에 속한다.

또한, 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 도 1(서열번호 1)에 도시된 α 소단위체의 아미노산 서열에서의 22번째 위치의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체를 갖는, 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 돌연변이 α 소단위체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 α 및 β 소단위체의 돌연변이를 암호화하는 핵산의 염기서열 및, 갑상선 자극 호르몬의 융합 유사체 및 그의 소단위체, 생물학적 분석 및 호르몬 생산을 위한 숙주-벡터 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 갑상선 자극 호르몬 유사체, 갑상선 자극 호르몬 유도체 및 그들의 절편을 갑상선 저하증 및 암에서의, 특히 갑상선 암종에서의 진단학적 및 치료적인 사용방법을 제공한다. 바람직한 실시예에 있어서, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬은 갑상선 암의 진단 및 그 이후의 환자의 모니터링에 방사선 요오드의 섭취 및 티로글로불린(thyroglobulin)의 분비를 자극하는데 사용된다. 다른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 항체, 예를 들어 그레이브스병에 제한되지 않는 질환 또는 장애의 갑상선 자극 호르몬 수용체의 자가면역항체의 존재를 검출하기 위하여 갑상선 자극 호르몬 수용체 결합 억제 분석에 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체를 포함하는 약학적 및 진단학적 조성물을 제공한다.

정의

본 발명에서 사용된 하기의 용어는 다음과 같은 의미를 가진다.

TSH = 종이 언급되지 않는 한, 사람의 갑상선 자극 호르몬

TSHR = 종이 언급되지 않는 한, 사람의 갑상선 자극 호르몬 수용체

hCG = 사람의 융모막의 생식선자극호르몬

CTEP = hCG β 소단위체의 카르복시 말단 확장 펩티드

α-subunit = 다른 언급이 없는 한, 사람의 당단백질 호르몬 α 소단위체

β-subunit = 다른 언급이 없는 한, 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체

편의상 아미노산 잔기는 단일 문자로 나타내었다.

본 발명에서 사용된 갑상선 자극 호르몬 소단위체 내의 돌연변이는, 갑상선 자극 호르몬 소단위체 다음에 기재된 야생형 아미노산 잔기, 아미노산 위치, 및 돌연변이 아미노산 잔기에 의하여 개시된다. 예를 들어, βI58R은 TSH β 소단위체의 58번째 위치에서의 이소류신으로부터 아르기닌으로의 돌연변이를 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 신규한 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 단백질, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 그의 제조방법 및 그들의 진단학적 및 치료적 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 생체활성이 야생형 갑상선 자극 호르몬의 생체활성에 비하여 증가되며, 생체내 순환시 호르몬 반감기가 증가하도록 수 식된, α 및 β소단위체 내에서 돌연변이를 모두 갖는(바람직하게는 아미노산 치환) 돌연변이 갑상선 자극 호르몬(TSH), 갑상선 자극 호르몬 유도체, 갑상선 자극 호르몬 유사체 및 그들의 절편을 고안하고 제조하였다. 본 발명자들은 생체활성을 증가시키는 전기 돌연변이; 및, 초활성 돌연변이(superactive mutation) 및 장시간 작용하도록 하는 수식(long acting modification)을 모두 갖는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체와 같이 호르몬 반감기를 증가시키는 전략이 각각의 초활성(superactive) 돌연변이 및 장시간 작용하는 수식이 부여됨에 따라 추가된 활성의 합으로부터의 예상보다 훨씬 큰 생체활성을 나타냄을 확인하였다.

아울러, 본 발명자들은 도 1(서열번호 1)에 도시된 사람의 α 소단위체 아미노산 서열의 22번째 위치에서의 아미노산 치환이, 바람직하게는 라이신 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산의 치환이, 더욱 바람직하게는 아르기닌이 야생형 갑상선 자극 호르몬에 비하여 갑상선 자극 호르몬의 생체활성을 증가시킴을 확인하였다.

본 발명자들은 하기와 같이 생체 내에서 이형이합체의 반감기를 증가시키기 위하여 단일 소단위체 내의 개개의 돌연변이를 결합시키고, 소단위체 및 이형이합체를 수식함으로써, 돌연변이 소단위체를 고안하였다. 특히, 본 발명자들은 돌연변이 α, 돌연변이 β 및 돌연변이를 갖는, 특히 특이적 분역(domain)에 돌연변이를 갖는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 고안하였다. 전기 분역은 도 1에 도시된 일반적인 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 및, 도 2에 도시된 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프를 함유한다. 일실시예에 있어서, 본 발명은 돌연변이 α 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 및, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체 및 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 β 소단위체의 β-헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 β 소단위체(바람직하게는, 전기 돌연변이는 돌연변이 소단위체를 포함하는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 생체활성을 증가시키며, 돌연변이 소단위체를 가진 갑상선 자극 호르몬은 야생형 갑상선 자극 호르몬 이형이합체에 비하여 혈청 반감기가 증가하도록 수식되었다) 중의 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 제공한다.

본 발명에 따르면, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 β 소단위체는 카르복시 말단에서 CTEP와 융합될 수 있다. 전기 돌연변이 β 소단위체-CTEP 소단위는 야생형 또는 돌연변이 α 소단위체와 함께 발현 및/또는 단백질로 조립되어 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 증대된 생체활성 및 혈청 반감기를 갖는 기능적 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 형성할 수 있다.

다른 실시예에 있어서, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 β 소단위체 및, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치 환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체는 융합되어 단일 사슬의 갑상선 자극 호르몬 유사체를 형성한다. 전기 돌연변이 β 소단위체-돌연변이 α 소단위체 융합은 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 증대된 생체활성 및 혈청 반감기를 갖는다.

또 다른 실시예에 있어서, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하며 카르복시 말단에 CTEP를 추가로 포함하는 돌연변이 β 소단위체 및, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체는 융합되어 단일 사슬의 갑상선 자극 호르몬 유사체를 형성할 수 있다.

또한, 융합 단백질, 유사체 및 전기 단백질과 유사체를 암호화하는 핵산 분자 및, 재조합 DNA 방법 등에 의한 전기 단백질 및 유사체의 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 돌연변이 α 및 β 소단위체의 아미노산 서열 및 기능적으로 활성이 있는 그들의 단편 및 유도체를 제공한다. "기능적으로 활성이 있는(functionally active)" 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 α 및 β 소단위체는, 명세서에서 야생형 소단위체와 연관된 기능적 활성의 하나 또는 그 이상, 예를 들어 TSHR에 대한 결합, TSHR 신호전달의 자극, 항원성(항-갑상선 자극 호르몬 항체에 대한 결합), 면역원성 등을 언급한다.

구체적인 실시예에 있어서, 본 발명은 돌연변이 α의 절편 및 적어도 6개의 아미노산, 10개의 아미노산, 50개의 아미노산, 또는 적어도 75개의 아미노산으로 구성된 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 제공한다. 다양한 실시예에 있어서, 돌 연변이 α 소단위체는 반드시 돌연변이가 된 αL1 루프 분역을 포함하거나 전기 분역으로 구성되어 있고; 돌연변이 β 소단위체는 반드시 돌연변이가 된 βL3 루프 분역을 포함하거나 전기 분역으로 구성되어 있다.

또한, 본 발명은 돌연변이 α 및 β 소단위체를 암호화하는 핵산의 염기서열, 수식된 돌연변이 α 및 β 소단위체(예를 들어, 돌연변이 β 소단위체-CTEP 융합 또는 돌연변이 β 소단위체-돌연변이 α 소단위체 융합) 및 핵산의 염기서열을 이용하는 방법을 제공한다. α 및 β 소단위체의 돌연변이는 하기 발명의 상세한 설명 1 및 2에서 각각 보다 구체적으로 기술된다.

본 발명은 또한 치료적 및 진단학적 방법, 및 돌연변이 α 소단위체, 돌연변이 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유도체 및 그들의 절편을 유효성분으로 하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 갑상선 암의 진단과 치료에 있어서, 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 활성이 크며 순환시 반감기가 연장된 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 유사체를 투여하는, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 유사체의 용도를 제공한다. 아울러, 본 발명은 갑상선 자극 호르몬 수용체 결합 억제 분석시에, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 본 발명의 유사체를 사용하여 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 자가항체의 존재에 의하여 특징지어지는 질환 및 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 갑상선 암 등의 갑상선의 장애에 대한 치료의 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여, 제한되지 않는 방법에 의하여 하기에 부분별로 발명의 상세한 설명이 나뉘어져서 제시된다.

1. 일반적인 α 소단위체의 돌연변이

일반적인 사람의 당단백질 호르몬의 α 소단위체는 도 1(서열번호 1)에 도시된 것처럼 이황화물 결합을 형성하는 10개의 반-시스테인 잔기(half-cysteine residue)를 포함하는 92개의 아미노산을 함유한다. 본 발명은 바람직하게는 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 근처에서의 단일 또는 다수의 아미노산 치환을 포함하는 사람의 당단백질 호르몬의 α 소단위체의 돌연변이에 관한 것이다. αL1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 잔기는 도 1에 도시된 것처럼, 8 내지 30번째 위치로부터 시작하는 수용체 결합 및 신호전달을 달성함에 있어서 중요하다고 밝혀졌다. 11 내지 22번째 위치와 같이 αL1 루프에 존재하는 아미노산 잔기는 유인동물을 제외한 모든 척추동물에서 염기성 잔기의 무리를 형성하며, 수용체 결합 및 신호전달을 촉진하는 능력이 있다. 특별히, 22번째 위치의 아미노산 잔기는 갑상선 자극 호르몬의 역가(potency)에 영향을 주는 잔기 중의 하나로 밝혀졌다.

본 발명에 따르면, 돌연변이 α 소단위체는 야생형 단백질에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 삽입된 것이다.

일실시예에 있어서, 돌연변이 α 소단위체는 야생형 α 소단위체에 비하여 상대적으로 아미노산 잔기의 하나 또는 그 이상의 치환을 가지며, 바람직하게는 8 내지 30, 11 내지 22, 8 내지 22, 11 내지 30, 11 내지 16, 14 내지 22, 13 내지 14 또는 16 내지 17번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 돌연변이 α 소단위체는 α 소단위체의 11, 13, 14, 16, 17, 20 또는 22번째 위치에서의 단일 아미노산 치환을 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 돌연변이 α 소단위체는 11, 13, 14, 16, 17, 20 또는 22번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서의 다수의 아미노산 치환을 갖는다.

다양한 실시예에 있어서, 아미노산 치환은 라이신, 아르기닌 및 바람직하지는 않지만 히스티딘으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 양전하를 띤 잔기 또는 염기성 잔기로 이루어질 수 있다.

바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 돌연변이 α 소단위체는 22번째 위치에서의 단일 아미노산 치환을 가지며, 글라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 αG22R이다. αG22R 돌연변이를 포함하는 돌연변이 α 소단위체는 예를 들어 αT11K, αQ13K, αE14K, αP16K, αF17R 및 αQ20K에 제한되지 않는, 적어도 하나 또는 그 이상의 추가된 아미노산 치환을 가질 수 있다. 다른 바람직한 실시예에 있어서, 돌연변이 α 소단위체는 αT11K, αQ13K, αE14K, αP16K, αF17R, αQ20K 및 αG22R로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 아미 노산 치환을 갖는다. 예를 들어, 바람직한 돌연변이 α 소단위체(돌연변이 α 소단위체를 갖는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 혈청 반감기를 증가시키기 위한 수식으로 공역(conjugation)되어 사용됨) 중의 하나는 명세서에서는 α4K라고 언급되며, 다음의 4가지 돌연변이를 포함한다: αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K.

본 발명의 돌연변이 α 소단위체는 기능적으로 활성이 있다, 즉, 야생형 α 소단위체와 연관된 하나 또는 그 이상의 기능적 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이 α 소단위체는 갑상선 자극 호르몬 수용체에 결합하는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 형성하도록 야생형 또는 돌연변이 β 소단위체와 비공유적인 결합이 가능하다. 바람직하게, 전기 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 또한 신호전달을 유발할 수 있다. 가장 바람직하게는, 전기 돌연변이 α 소단위체를 포함하는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 큰 실험실적 생체활성 및/또는 생체내 생체활성을 갖는다. 본 발명에서는 하나 이상의 돌연변이가 초활성 α 돌연변이를 만들도록 돌연변이 α 소단위체 내에 조합될 수 있다는 것이 예상되었는데, 그것은 생체활성에 있어서, 야생형 갑상선 자극 호르몬에 비하여 상대적으로 현저한 증가를 나타내는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 형성하도록 야생형 또는 돌연변이 β 소단위체와 결합하는 것이다. 또한, α 소단위체 돌연변이는 돌연변이 α 소단위체를 갖는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 혈청 반감기를 증가시키기 위한 전략과 조합될 수 있다는 것이 예상되었다(즉, β 소단위체-CTEP 융합 또는 β 소단위체-α 소단위체 융합을 가진 갑상선 자극 호르몬 이형이합체). 소단위체 내의 돌연변이 및 장시간 작용하도록 하는 수식은 협동적으로 작용하여 생체활성에 있어서 기대치 않은 증가를 가져온다.

다른 실시예에서와 같이, 원하는 면역원성 또는 항원성을 갖는 돌연변이 α 소단위체가 예를 들어, 면역분석, 면역화(immunization), 갑상선 자극 호르몬 수용체 신호전달의 억제 등에 사용될 수 있다. 돌연변이 α 소단위체는 발명의 상세한 설명 8에 개시된 분석법에 제한되지 않는 당업계에서 잘 알려진 방법에 의하여 그의 활성이 시험될 수 있다.

2. 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 돌연변이체

일반적인 사람의 당단백질 호르몬의 β 소단위체는 도 2(서열번호 2)에 도시된 것처럼 118개의 아미노산을 함유한다. 본 발명은 단일 또는 다수의 아미노산 치환을 포함하는 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 돌연변이에 관한 것이며, 바람직하게는 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 근처에서의 아미노산의 치환에 관한 것인데, 전기 돌연변이 β 소단위체는 hCG β 소단위체의 CTEP와 융합되거나, 도 1(서열번호 1)에 도시된 22번째 위치에서의 아미노산의 치환을 갖는 돌연변이 α 소단위체를 가진 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 부분이 된다. 사람의 갑상선 자극 호르몬 β-소단위체의 52 내지 87번째 위치의 βL3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 잔기는, 말초적으로 분포되어 있는 hCG의 아미노산 잔기에 지도화되어(mapped)있고, 결정구조에서는 표면이 밖으로 노출되어 있다. 가장 주된 관심사는 (58 내지 69번째 위치에서 시작되는) 갑상선 자극 호르몬에 존재하지 않는 hCG의 염기성 잔기의 무리이다. 사람의 갑상선 자극 호르몬의 전기 분역(domain) 내의 염기성 또는 양전하를 띤 잔기로의 치환은 내재성 활성(intrinsic activity)뿐 아니라, 갑상선 자극 호르몬 수용체 결합 친화력에서 추가적이며 근본적인 증가를 유발한다.

본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 야생형 소단위체에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 가진 β 소단위체를 가진다.

일실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체는 야생형 β 소단위체에 비하여 아미노산 잔기의 하나 또는 그 이상의 치환을 가지며, 바람직하게는 도 2(서열번호 2)에 도시된 β 소단위체의 52 내지 87, 52 내지 69, 58 내지 69 또는 58 내지 87번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서의 하나 또는 그 이상의 치환을 가진다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체는 도 2(서열번호 2)에 도시된 β 소단위체 염기서열의 58, 63 또는 69번째 위치에서의 단일 아미노산 치환을 가진다. 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체는 도 2(서열번호 2)에 도시된 β 소단위체 염기서열의 58, 63 또는 69번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서의 다수의 아미노산 치환을 가진다.

바람직한 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체는 βI58R, βE63R 및 β L69R로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 예를 들어, 바람직한 돌연변이 β 소단위체는 명세서에서는 β3R이라고 언급되며, 다음의 3가지 돌연변이를 포함한다: βI58R+βE63R+βL69R.

돌연변이 β 소단위체를 갖는 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 유도체 및 그들의 절편은 도 1에 도시된 22번째 위치의 아미노산 치환을 가진 α 소단위체를 가지고/가지거나 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 큰 혈청 반감기를 갖는다. 일실시예에 있어서, 야생형 갑상선 자극 호르몬에 비하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 돌연변이 β 소단위체는 hCG의 카르복시 말단 확장 펩티드(carboxyl terminal extension peptide, CTEP)에 공유적으로 결합되어 있다. hCG β 소단위체의 카르복시 말단의 32번째 아미노산을 포함하는 CTEP는, 돌연변이 β 소단위체에 공유적으로 결합되어 있으며, 바람직하게는 돌연변이 β 소단위체의 카르복시 말단은 CTEP의 아미노 말단에 공유적으로 결합되어 있다. β 소단위체 및 CTEP는 당업계의 통상의 방법에 의하여, 즉 펩티드 결합 또는 단백질의 아미노 말단 및 카르복시 말단 사이에 공유결합을 형성케 할 수 있으며, 예를 들어 펩티드 링커(linker)에 제한되지 않는 이형이구조적인(heterobifunctional) 시약에 의하여 공유적으로 결합될 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체 및 CTEP는 펩티드 결합을 통하여 연결된다. 다양한 바람직한 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체-CTEP 융합은 βI58R, βE63R 및 βL96R로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 치환의 하나, 둘, 셋 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

또 다른 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체는 공유결합을 통하여 α 소단위체와 융합되며, 바람직하게는 돌연변이 α 소단위체와 결합된다(예를 들어, 전술된 바와 같음).

본 발명의 돌연변이 β 소단위체는 기능적으로 활성이 있다. 즉, 야생형 β소단위체와 연관된 하나 또는 그 이상의 기능적 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이 β 소단위체는 갑상선 자극 호르몬 수용체에 결합하는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 형성하도록 유발된 야생형 또는 돌연변이 α 소단위체와 비공유적으로 결합할 수 있다. 바람직하게, 전기 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 또한 신호전달을 유발할 수 있다. 가장 바람직하게, 전기 돌연변이 β 소단위체를 포함하는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 큰 실험실적 생체활성 및/또는 생체내 생체활성을 갖는다. 본 발명에서는, 야생형 갑상선 자극 호르몬에 대하여 상대적으로 생체활성이 유의적으로 증가된 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 제조하기 위하여 β 소단위체 돌연변이 내에서 하나 이상의 돌연변이를 조합할 수 있다는 것이 예측되었다. 본 발명자들은 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 반감기를 증가시키기 위하여 소단위체 내의 다수의 돌연변이와 수식(즉, β 소단위체-CTEP 융합 및/또는 β 소단위체-α 소단위체)이, 돌연변이 및 장시간 작용하도록 하는 수식의 합보다 더 큰 생체활성을 나타내도록 협동적으로 작용할 수 있음을 확인하였다.

돌연변이 β 소단위체는 당업계의 통상의 과정에 의하여 발명의 상세한 설명 8에 개시되어 있는 분석에 제한되지 않는, 원하는 활성에 대한 시험을 행할 수 있 다.

3. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 갑상선 자극 호르몬 유사체

본 발명은 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 발명의 상세한 설명 1에 개시된 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산의 치환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체; 및, 단일 또는 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 발명의 상세한 설명 2에 개시된 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산의 치환을 포함하는 돌연변이 β 소단위체로 구성된, 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 사람의 갑상선 자극 호르몬 유사체를 제공하며, 이형이합체 또는 유사체는 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 수식되었다(예를 들어, β 소단위체-CTEP 융합 또는 α 소단위체-β 소단위체 융합). 돌연변이 α 소단위체 내의 단일 또는 다수의 아미노산 치환은 8 내지 30번째 위치 및, 바람직하게는 사람의 α 소단위체 아미노산 서열의 11 내지 22번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어날 수 있다. 돌연변이 β 소단위체 내의 단일 또는 다수의 아미노산 치환은 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 아미노산 서열의 52 내지 87번째 위치 및, 바람직하게는 58 내지 69번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어날 수 있다. 상술된 바와 같이, 돌연변이 α 소단위체, α4K, 돌연변이 β 소단위체 및 β3R의 이형이합체를 포함하는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 등은 실시예에 국한되지 않는다.

일실시예에 있어서, 본 발명은 α 소단위체를, 바람직하게는 돌연변이 α 소단위체 및 β 소단위체, 바람직하게는 돌연변이 β 소단위체를 포함하며, 돌연변이 α 또는 돌연변이 β 소단위체는 발명의 상세한 설명 2에 개시된 hCG의 β 소단위체의 CTEP에 융합된, 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 제공한다. 융합단백질이라는 용어는 명세서에서 두 개의 펩티드의 공유결합의 산물인 단백질로 지칭된다. 공유결합은 아미노-잔기 및 카르복시-잔기에 각각 공유적으로 두 개의 펩티드를 결합시키는 당업계에 통상적으로 알려진 방법을 포함하며, 전기 방법은 펩티드 결합을 통하여 또는 이형이구조적인 시약, 예를 들어 펩티드 링커(linker)에 제한되지 않는 이형이구조적인 시약을 통하여 연결되는, 제한적이지 않은 방법을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 돌연변이 사람의 α 소단위체 및 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 포함할 수 있으며, 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체는 그의 카르복시 말단이 CTEP의 아미노 말단과 공유적으로 결합된다.

아울러, 본 발명은 돌연변이 α 소단위체 또는 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체가 각각의 소단위체의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 각각 포함하는 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체에 돌연변이 사람의 α 소단위체가 공유적으로 결합된(β 소단위체-CTEP 융합으로 상술됨) 돌연변이 사람의 α 소단위체를 포함하는, 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체에 관한 것이다. 바람직한 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체는 펩티드 링커를 통하여 돌연변이 α 소단위체와 연결된다. 더욱 바람직한 실시예에 있어서, 세린/ 프롤린이 높게 함유되어 있고 의미 있는 이차구조가 결핍된 hCG의 CTEP가 펩티드 링커이다.

바람직하게, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는(발명의 상세한 설명 1에 개시됨) α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체는(발명의 상세한 설명 2에 개시됨) 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 β 소단위체에 공유적으로 결합된다.

일실시예에 있어서, 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 아미노산 서열의 52 내지 87번째 위치, 바람직하게는 58 내지 69번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체는, 카르복시 말단에서 야생형 사람의 갑상선 자극 호르몬 α 소단위체 또는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 α 소단위체의 아미노 말단과 공유적으로 결합되며, 사람의 α 소단위체의 아미노산 서열의 8 내지 30번째 위치, 바람직하게는 11 내지 22번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서의 하나 또는 그 이상의 치환을 가진다.

돌연변이 α 소단위체 또는 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체는 각각 그들의 신호 염기서열이 결핍될 수 있다.

아울러, 본 발명은 돌연변이 α 소단위체에 차례로 공유적으로 결합된 CTEP에 공유결합된 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 포함하는 사람 의 갑상선 자극 호르몬 유사체를 제공하며, 돌연변이 α 소단위체 및 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체는 각각의 소단위체 아미노산 서열에서의 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 각각 포함한다.

구체적인 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체-CTEP 융합은 돌연변이 α 소단위체에 공유적으로 결합되어 있으며, 전기 돌연변이 β 소단위체의 카르복시 말단은 hCG의 CTEP를 통하여 돌연변이 β 소단위체의 아미노 말단에 연결되어 있다. 바람직하게는, 돌연변이 β 소단위체의 카르복시 말단은 CTEP의 아미노 말단에 공유적으로 결합되어 있으며, CTEP의 카르복시 말단은 신호 염기서열이 없이 돌연변이 α 소단위체의 아미노 말단에 공유적으로 결합되어 있다.

구체적인 실시예에 따르면, 사람의 갑상선 자극 호르몬 유사체는, 카르복시 말단이 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체의 아미노 말단에 공유적으로 연결된 CTEP의 아미노 말단에 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 카르복시 말단이 공유적으로 결합된 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 아미노산의 58 내지 69번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 포함하며, 하나 또는 그 이상의 치환은 사람의 α 소단위체 아미노산 서열의 11 내지 22번째 위치로부터 선택되는 아미노산 잔기에 존재한다.

다른 바람직한 실시예에 있어서, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 도 1(서열번호 1)에 도시된 사람의 α 소단위체 염기서열의 22번째 위치에서의 아미노산 치환을, 바람직하게는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신, 바람직하지 않게 는 히스티딘), 더욱 바람직하게는 아르기닌을 포함하는 돌연변이 α 소단위체를 포함한다.

구체적인 실시예에서, 상술된 적어도 하나의 돌연변이 소단위체 또는 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체를 포함하는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 기능적으로 활성이 있다. 즉, 갑상선 자극 호르몬 수용체 결합, 갑상선 자극 호르몬 신호 및 세포외 분비 등의 야생형 갑상선 자극 호르몬과 연관된 하나 또는 그 이상의 기능적인 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체는 갑상선 자극 호르몬 수용체와 결합할 수 있으며, 바람직하게는 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 큰 친화력을 갖는다. 또한, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체는 신호전달을 유발하는 경우도 바람직하다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 적어도 하나의 돌연변이 소단위체 또는 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체를 포함하는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 큰 실험실내 생체활성 및/또는 생체내 생체활성을 가지며, 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 연장된 혈청 반감기를 갖는다. 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체는 발명의 상세한 설명 8에 개시된 분석법에 제한되지 않는 당업계에 알려진 과정에 의하여 원하는 활성을 측정할 수 있다. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 실시예는 발명의 상세한 설명 6에 개시되어 있다.

4. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드

아울러, 본 발명은 본 발명의 사람의 갑상선 자극 호르몬의 돌연변이 소단위체 및 갑상선 자극 호르몬 유사체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 핵산분자에 관한 것이며, 염기서열은 적어도 하나의 염기의 삽입, 결실 또는 치환 또는 야생형 갑상선 자극 호르몬에 비하여 단일 또는 다수의 아미노산 부가, 결실 및 치환을 유발하는 그들의 조합을 함유한다. 암호 영역(coding region)의 리딩 프레임(reading frame)을 변화시키지 않는 염기의 돌연변이가 바람직하다. 본 발명에서 사용한 바와 같이, 두 개의 암호화 영역이 융합될 때, 하나의 핵산 분자의 3' 말단이 다른 핵산분자의 5' 말단(또는 펩티드 링커를 암호화하는 핵산을 통하여)에 연결되며, 전기 번역은 프레임쉬프트(frameshift) 없이 다른 핵산 분자에 있는 하나의 핵산분자의 암호 영역으로부터 일어난다.

핵산 암호 영역의 축퇴(degeneracy)로 인하여, 돌연변이 α 또는 β 소단위체에 대한 동일한 아미노산 염기서열을 암호화하는 다른 DNA 염기서열의 어느 것이라도 본 발명의 실시예에서 사용될 수 있다. 전기 염기서열은, 염기서열 내의 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 다른 코돈(codon)의 치환에 의하여 변화가 일어나 발현 상의 변화가 없는(silent change) α 또는 β 소단위체의 암호 영역의 전부 또는 부분을 포함하는 뉴클레오티드 염기서열에 국한되지 않는다.

하나의 실시예에 있어서, 본 발명은 돌연변이 α 소단위체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 돌연변이 α 소단위체는 단일 또는 다수 의 아미노산 치환을, 바람직하게는 발명의 상세한 설명 1에서 개시된 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함한다. 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명은 돌연변이 도 1(서열번호 1)에 도시된 α 소단위체 아미노산 서열의 22번째 위치에서의 아미노산 치환을, 바람직하게는 염기성 아미노산의 치환을, 더욱 바람직하게는 아르기닌으로 치환된 아미노산 치환을 가진 돌연변이 α 소단위체를 암호화하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함, 및/또는 CTEP와 공유적으로 연결된 돌연변이 β 소단위체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 발명의 상세한 설명 3에 개시된 바와 같은 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 α 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 α 소단위체의 암호 영역은 단일 또는 다수의 아미노산 치환을, 바람직하게는 β 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 돌연변이 β 소단위체의 암호 영역과 융합된다. 아울러, 돌연변이 β 소단위체의 카르복시 말단이 hCG β 소단위체의 CTEP를 통하여 돌연변이 α 소단위체의 아미노 말단과 연결된 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 바람직한 실시예에 있어서, 핵산은 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체를 암호화하며, 돌연변이 β 소단위체의 카르복시 말단이 CTEP의 아미노 말단에 공유적으로 결합되어 있으며, CTEP의 카르복시 말단이 단일 펩티드가 없는 돌연변이 α 소단위체의 아미노 말단과 공유적으로 결합되어 있다.

본 발명의 단일 사슬 유사체는 적절한 암호 골격 내에서 당업계에 알려진 방법에 의하여 돌연변이 α 및 β 소단위체를 암호화하는 핵산의 염기서열을 서로 연결시키는 방법 및, 당업계에서 통상적으로 알려진 방법에 의하여 융합 단백질을 발현하는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 전기 융합 단백질은 단백질 합성 기술, 예를 들어, 펩티드 합성기에 의하여 제조될 수도 있다.

5. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 소단위체 및 유사체의 수득

본 발명의 돌연변이 α 소단위체, 돌연변이 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 유사체, 유도체 및 그들의 절편의 제조 및 용도는 본 발명의 범주 내에 속한다. 다음에 기술된 내용은 전기 물질을 제조하는 방법이다.

5-1. 갑상선 자극 호르몬 유전자 클로닝

cDNA의 뉴클레오티드 염기서열과 사람의 일반적인 α 소단위체(참조: Fiddes and Goodman, Nature, 281:351-356, 1979; Fiddes and Goodman, J. Mol. Appl. Gen., 1:3-18, 1981) 및 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체(참조: Hayashizaki et al., FEBS Lett, 88:394-400, 1985; Wondisford et al., J. Biol. Chem., 263:12538-12542, 1988; Wondisford et al., Mol. Endocrinol., 2:32-39, 1988)를 암호화하는 유전자가 밝혀졌다.

소단위체의 암호 영역은 원하는 세포로부터 정제된, 화학합성, cDNA 클로닝, 게놈 DNA의 클로닝, 또는 그들의 절편에 의하여 클로닝된 DNA(예를 들어, DNA "라이브러리")로부터 당업계의 표준적인 과정에 의하여 수득될 수 있다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Labratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1990; Glover, D.M.(eds), DNA cloning: A Practical Approach, Vol. I, II, MRL Press, Ltd., Oxford, UK, 1985). 중합효소 연쇄반응(PCR)은 게놈 또는 cDNA 라이브러리 내의 일반적인 α 또는 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 암호화하는 염기서열을 증폭하는데 사용할 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드는 시료(RNA 또는 DNA)로부터 PCR 염기서열에 의하여 증폭되는 프라이머(primer)로, 바람직하게는 cDNA 라이브러리로 사용될 수 있다. 증폭되는 DNA는 사람으로부터의 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 소단위체 조각(segment)의 성공적인 분리 또는 증폭 후에, 그 조각은 클로닝되고 염기서열이 분석되어, 전체 cDNA 또는 게놈 클론을 분리하도록 탐침(probe)으로 사용될 수 있다. 이어서, 하기에 기재된 바와 같이, 유전자의 뉴클레오티드 염기서열의 특성을 확인 및, 기능적 분석 및/또는 치료적 또는 진단학적 용 도를 위한 단백질 산물의 수득에 사용될 수 있다.

소단위체의 암호 영역을 분리하는 것은 알려진 염기서열로부터 유전자 염기서열 그 자체를 화학적으로 합성하는 것에 국한되지 않으면서 이를 포함한다. 기타 방법도 가능하며 본 발명의 범주에 속한다. 전기 방법은 호르몬 소단위체의 돌연변이가 획득될 수 있는 하기의 방법의 일반적인 기술에 제한되지 않는다.

동정 및 분리된 유전자는 유전자 서열의 증폭하기 위하여 적절한 클로닝 벡터 내에 삽입할 수 있다. 당업계에서 알려진 벡터-숙주 시스템의 다수가 사용될 수 있다. 사용가능한 벡터는, 플라스미드 또는 수식된 바이러스에 제한되지 않으나, 벡터 시스템은 숙주세포와 병용되어야만 한다. 전기 벡터는 람다 유도체 등의 박테리오파지, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 BLUESCRIPT 벡터(Stratagene)에 제한되지 않는다. 클로닝 벡터로의 삽입은 예를 들면, 상보적 점착말단(cohesive termini)을 가진 클로닝 벡터 내에서 DNA 절편을 연결시킴으로 수행할 수 있다. 그러나, DNA를 절단시키는 상보적인 절단 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단이 효소적으로 수식될 수 있다. 다시 말해서, 원하는 부위의 어느 부분이라도 DNA 말단에 뉴클레오티드 염기서열(링커)을 연결시킴으로써 수득될 수 있다. 전기 연결된 링커는 화학적으로 합성된 제한효소(restriction endonuclease) 인식 염기서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 절단된 벡터 및 돌연변이 소단위체 유전자는 호모폴리머테일링(homopolymer tailing)에 의하여 수식될 수 있다. 재조합 분자는 형질전환, 트랜스펙션, 감염, 일렉트로포레이션(electroporation) 등을 통 하여 숙주세포로 도입될 수 있으며, 유전자의 많은 복제수(copy)가 생성된다.

다른 방법에서는, 원하는 유전자를 "쇼트건(shot gun)" 접근법으로 적합한 클로닝 벡터 내로 도입한 후 동정 및 분리할 수도 있다. 원하는 유전자의 대량생산은 예를 들어, 크기 분획 등에 의하여 클로닝 벡터에 도입되기 전 수행할 수 있다.

구체적인 실시예에 있어서, 돌연변이 소단위체 유전자, cDNA, 또는 재조합 DNA 분자를 가진 숙주세포의 형질전환은 합성된 DNA 염기서열을 포함하는 유전자의 다수의 복제수를 생산할 수 있게 한다. 따라서, 유전자는 성장 형질전환체, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자의 분리 및, 필요한 경우의 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자의 복귀에 의하여 대량적으로 수득할 수 있다. 유전자의 복제수는 돌연변이 소단위체, 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 갑상선 자극 호르몬 유사체의 구조 및 기능을 연구하기 위하여 돌연변이 실험에 사용될 수 있다.

5-2. 돌연변이유발

본 발명의 돌연변이 α 또는 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체에서 발견되는 돌연변이는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 전기 물질의 수득을 가져오는 조작은 유전자 또는 분자 수준에서 행할 수 있다. 예를 들어, 소단위체의 클로닝된 암호 영역은 당업계에 알려진 다양한 전략의 어느 것에 의하든지 수식될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Labratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1990). 염기서열은 적절한 부위에서 제한효소에 의하여 절단될 수 있으며, 원하면 추가로 실험실 내에서 효소적으로 수식화, 동정, 절단될 수 있다. 돌연변이 소단위체의 수득에 있어서, 수식된 유전자는 번역 종결 신호에 의하여 방해되지 않은 채로, 소단위체가 암호화되는 유전자 영역 내의 동일한 번역 리딩 프레임 내에 존재한다는 것을 주의하여야 한다.

아울러, 소단위체를 암호화하는 핵산은 암호 영역의 다양성을 창출 및/또는, 번역, 개시, 및/또는 종결 염기 서열의 생성 및/또는 파괴 및/또는, 새로운 제한효소의 위치를 형성하거나 이미 존재하는 제한효소의 위치를 파괴하여 추가로 실험실내 수식을 용이하게 할 수 있도록 실험실내 또는 생체 내에서 돌연변이화 될 수 있다. 당업계에서 알려진 화학적 돌연변이 유발, 실헐실내 특정부위의 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)(참조: Hutchinson C et al., J. Biol. Chem., 253:6551, 1978), 중합효소 연쇄반응에 근거한 겹침 연장(overlap extension)(참조: Ho et al., Gene, 77:51-59, 1989) 등의 기술에 제한되는 것은 아니다. 돌연변이는 이중가닥 디데옥시 DNA 염기서열분석에 의하여 확인할 수 있다.

소단위체 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 기능적으로 다른 범위의 아미노산을 유발시키기 위하여, 바람직하게는 다른 특성을 가진 다른 아미노산에 의하여 치환될 수 있다. 염기서열 내의 아미노산의 치환은 아미노산의 다른 그룹으로부터 선택될 수 있다. 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성인 자연의 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하를 띤(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

또한, 돌연변이 소단위체 염기서열의 조작은 단백질 수준에서 시행될 수 있다. 돌연변이 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 알려진 방어/억제(protecting/blocking) 그룹에 의한 유도체화, 단백질 분해적 절단, 항체 분자에 연결 또는 다른 세포적 리간드 등의 번역시 또는 번역 후의 다른 수식에 의한 단일 사슬 유사체가 본 발명의 범주에 속할 수 있다. 많은 화학적 수식은 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH₄; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 튜니카마이신의 존재시 대사적 합성에 의한 선택적인 절단을 포함하나, 이에 제한되지 않는 알려진 기술에 의하여도 수행될 수 있다.

아울러, 돌연변이 소단위체 및 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 돌연변이화된 영역을 포함하는 돌연변이 소단위체의 한 부분에 상응하는 펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 게다가, 원하는 경우, 비고전적(non-classical) 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체는 치환체 또는 삽입체로 돌연변이 소단위체의 염기서열 내에 도입될 수 있다. 비고전적 아미노산은 일반적인 아미노산의 D-이형질체, 알파-아미노 뷰 티릭 에시드(α-aminobutyric acid), 4-아미노뷰티릭 에시드(4-aminobutyric acid), 아미노뷰티릭 에시드(Abu), 2-아미노뷰티릭 에시드(2-aminobutyric acid), 감마-아미노뷰티릭 에시드(γ-aminobutyric acid), 엡실론-아미노헥사노익 에시드(ε-aminohexanoic acid), 아미노이소부티릭 에시드(aminoisobutyric acid), 2-아미노이노뷰티릭 에시드(2-aminoisobutyric acid), 3-아미노이소프로피오닉 에시드(3-aminoisopropionic acid), 오르니틴(ornithine), 노르류신(norleucine), 노르발린(norvaline), 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 사르코신(sarcosine), 시트룰린(citrulline), 시스테익 에시드(cysteic acid), t-부틸글라이신(t-butylglycine), t-부틸알라닌(t-butylalanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 시클로헥사알라닌(cyclohexalanine), 베타-알라닌(β-alanine), 플루오로-아미노산(fluoro amino acid), 베타-메틸 아미노산(β-methylamino acid), C알파-메틸 아미노산(Cα-amino acid), N알파-아미노산(Nα-amino acid)과 같은 설계된 아미노산, 일반적인 아미노산 유사체를 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 게다가, 아미노산은 D(우회전성, dextrorotary) 또는 L(좌회전성, levorotary)가 될 수 있다.

구체적인 실시예에 있어서, 돌연변이 소단위체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체는 예를 들어서 돌연변이 β 소단위체 및 hCG β 소단위체의 CTEP 또는 돌연변이 β 소단위체 및 돌연변이 α 소단위체에 제한되지 않는 융합 단백질이다. 일실시예에 있어서, 전기 융합 단백질은 돌연변이를 암호화하는 핵산 또는 다른 단백질의 암호 영역에 프레임 내에(in-frame) 연결된 야생형 소단위체의 재조합 발현에 의하여 수득될 수 있으며, 이러한 것은 리신 또는 디프테리아 독소 등의 독소에 제 한되지 않는다. 전기 융합단백질은 당업계에 알려진 방법에 의하여 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 적절한 핵산 염기서열을 적합한 암호 영역에서 서로 연결시키고, 당업계의 통상적인 방법에 의하여 융합 단백질을 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 한편으로는, 전기 융합 단백질은 예를 들어 펩티드 합성기와 같은 단백질 합성 기술에 의하여 제조될 수도 있다. 이종성(heterologous) 단백질-암호 영역 염기서열에 융합된 돌연변이 α 및/또는 β 소단위체의 부분을 포함하는 키메라 유전자가 제조될 수 있다. 구체적인 실시예에 있어서, 돌연변이 β 소단위체에 융합된 돌연변이 α 소단위체를 포함하는, 바람직하게는 돌연변이 α 소단위체 및 돌연변이 β 소단위체 사이의 펩티드 링커를 가진 펩티드 유사체를 제공한다.

6. 돌연변이 소단위체 유전자의 발현

갑상선 자극 호르몬의 돌연변이 소단위체를 암호화하는 뉴클레오티드 염기서열 또는 기능적으로 활성이 있는 유사체 또는 절편 또는 그들의 다른 유도체(발명의 상세한 설명 5-4)는 적합한 발현 벡터 내로, 즉 삽입된 단백질-암호 염기서열의 전사 및 번역에 관계된 필요한 요소를 포함하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 전사 및 번역에 필요한 신호 또한 일반적인 α 소단위체 cDNA 또는 유전자, 또는 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 cDNA 또는 유전자, 및/또는 두 개의 유전자가 서로 인접하고 있는 게놈 유전자에 의하여 제공될 수 있다. 다양한 숙주-벡터 시스템은 단백질-암호 영역을 발현하기 위하여 사용될 수 있다. 전기 시스템은 바 이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus) 등)에 감염된 포유동물의 세포 시스템; 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스(baculovirus)에 감염된 곤충 세포 시스템; 이스트 벡터를 포함하는 이스트 등의 미생물을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현 요소는 길이 및 특징에 따라 다양하다. 숙주-벡터 시스템의 사용에 의존하여, 적합한 전사 및 번역 요소들 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 구체적인 실시예에 있어서, 돌연변이 사람의 α 소단위체의 암호 영역 및/또는 사람의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 암호 영역, 또는 돌연변이를 암호화하는 염기서열 및 각각의 돌연변이 소단위체의 기능적으로 활성이 있는 부분이 발현된다.

상술된 벡터 내로 DNA 절편의 삽입에 대한 방법의 어느 것이라도 적절한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 암호 염기서열로 구성된 키메라 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 전기 방법은 실험실 내의 재조합 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합체(유전적 재조합)를 포함할 수 있다. 돌연변이 α 소단위체 및/또는 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 또는 그들의 펩티드 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 염기서열의 발현은 2차 뉴클레오티드 염기서열에 의하여 조절이 되어서, 돌연변이 소단위체 또는 펩티드가 재조합 DNA 분자와 함께 숙주로 형질전환되어 발현이 가능하다. 예를 들어, 돌연변이 α 소단위체 및/또는 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 또는 그들의 펩티드 절편의 발현은 당업계에서 알려진 프로모터/인헨서(promoter/enhancer)에 의하여 조절이 될 수 있다. 프로모터는 SV40 조기 프로모터 영역(early promoter region)(참조: Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus 3'에 위치한 긴 말단의 반복되는 부분(3' long terminal repeat)에 포함된 프로모터(참조: Yamamoto et al., Cell, 22:787-797, 1980), 포진 티미딘키나제 프로모터(herpes thymidine kinase promoter)(참조: Wangner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78:1441-1445, 1981), 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자의 조절 염기서열(참조: Brinster et al., Nature, 296:39-42, 1982)를 포함하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

구체적인 실시예에 있어서, 벡터는 돌연변이 α 소단위체 또는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 또는 둘 다의 암호 영역; 하나 또는 그 이상의 복제기점; 및, 선택성이 있는 하나 또는 그 이상의 선택적 표지자(selectable marker, 예를 들어, 항생제 내성 유전자)에 기능적으로 연결된(operably linked) 하나 또는 그 이상의 프로모터를 포함하여 사용될 수 있다. 동일한 진핵 숙주세포 내의 두 개의 소단위체의 발현은 기능적 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 적절한 조립(assembly) 또는 글리코실화를 선호하는 동시발현(coexpression)으로 언급된다. 따라서, 바람직한 실시예에 있어서, 전기 벡터는 숙주세포 내의 돌연변이 α 및 돌연변이 β 소단위체 모두를 발현하는데 사용될 수 있다. 각각의 돌연변이 소단위체의 암호 영역은 분리된 벡터 내로 클로닝; 및, 벡터는 순서적으로 또는 동시에 숙주세포로 도입될 수 있다. 다른 한편으로는, 두 가지 소단위체의 암호 영역은 적절한 프로모터가 기능적으로 연결된 하나의 벡터 내로 삽입될 수도 있다.

숙주세포주는 삽입된 염기서열의 발현을 변조(modulation) 또는 원하는 특이 적 양상의 유전자 산물을 수식 및 공정할 수 있도록 선택될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 유도자(inducer)의 존재하에 가속화될 수 있다. 따라서, 유전공학적으로 돌연변이가 일어난 소단위체의 발현은 조절될 수 있다. 게다가, 다른 숙주세포는 번역 및 번역후 공정 및 변조(예를 들어, 단백질의 글리코실화, 포스포릴화)의 특성 및 특이적 과정을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외부 단백질의 원하는 변조 및 공정을 확인하기 위하여 선택될 수 있다. 포유동물의 세포의 발현은 이종성 단백질의 "자연적인(native)" 글리코실화를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 더욱이, 다른 벡터/숙주 발현 시스템은 다른 범위까지 공정반응에 영향을 미칠 수 있다.

일단, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 α 및/또는 β 소단위체 유전자 염기서열을 발현하는 숙주세포가 동정되면, 유전자 산물은 분석될 수 있다. 이것은 전기 산물의 동위원소표지 이후, 젤 전기영동 또는 면역분석에 의하여 분석하는 것을 포함하는 전기 산물의 물리적 또는 기능적 특성에 근거한 분석법에 의하여 수행될 수 있다.

7. 돌연변이 소단위체 및 그들의 유사체에 대한 항체의 생산

본 발명에 따르면, 돌연변이 α 및 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체, 그들의 절편 또는 그들의 유도체는 면역원에 면역특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 면역원으로 사용될 수 있다. 전기 항체는 다클론성(polyclonal), 단클론성(monoclonal), 키메라, 단일 사슬, Fab 절편 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 구체적인 실시예에 있어서, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬에 대한 상체를 생산한다. 다른 실시예에 있어서, 돌연변이 α 또는 β 소단위체의 분역에 대한 항체를 생산한다.

당업계에 알려진 다양한 과정은 돌연변이 α 및 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체, 그들의 절편 또는 그들의 다른 유도체에 대한 다클론성 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 항체 생산에 있어서, 다양한 숙주 동물이 소단위체, 이형이합체, 단일 사슬 유사체 및 그들의 유도체의 주입에 의하여 면역화될 수 있으며, 전기 동물은 토끼, 마우스, 랫트 등을 포함한다. 다양한 아쥬반트(adjuvant)가 숙주의 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키기 위하여 사용될 수 있으며, 프로인트 보조액(Freund's, 완전 또는 불완전), 알루미늄 하이드록시드와 같은 미네랄 젤, 라이소레시틴(lysolecithin) 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 폴리아나이온(polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀(dinitrophenol) 및 BCG(Bacille-Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파붐(corynebacterum parvum)과 같은 잠재적 용도의 사람의 아쥬반트가 전기 아쥬반트에 포함되며, 이에 국한되지 않는다.

돌연변이 α 및 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 갑상선 자극 호르몬 유사체, 그들의 절편 또 는 그들의 다른 유도체에 직접 작용하는 단클론성 항체의 수득을 위하여, 배양된 연속적인 세포주에 의하여 항체 분자의 생산을 제공하는 어느 기술이라도 사용될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 기술은 최초로 코흐러 및 밀스타인(참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)에 의하여 개발되었으며, 트리오마 기술(trioma technique)뿐 아니라, 사람의 B-세포 하이브리도마 기술(참조: Kozbor et al., Immunology Today, 4:72, 1983) 및 사람의 단클론 항체 생산을 위한 엡스테인바바이러스(EBV) 하이브리도마 기술(참조: Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc, 77-96, 1985)도 개발되었다. 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 단클론성 항체는 최근의 기술(참조: PCT/US90/02545)를 사용한 세균 없는(germ-free) 동물에서 생산가능하다. 본 발명에 따르면 사람의 항체가 사용될 수 있고, 사람의 하이브리도마를 사용하거나(참조: Cote et al., Proc. Natl. Acad, Sci., U.S.A., 80:2026-2030, 1983), 실험실 내에서 사람의 B 세포를 EBV로 형질전환시킴(참조: Cote et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc, 77-96, 1985)으로써 수득할 수 있다. 실제로, 본 발명에 따르면, 항원결정기(epitope)에 특이적인 마우스 항체 분자의 유전자를 적절한 생물학적 활성을 가진 사람의 항체 분자와 함께 스플라이싱(splicing)함으로써 "키메라 항체(chimeric antibody)"(참조: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature, 312:604-608, 1984; Takeda et al., Nature, 314:452-454, 1985)의 생산을 위한 고도의 기술이 사용될 수 있고, 전기 항체는 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명에 따르면, 단일 사슬 항체의 생산을 위하여 개시된 기술(참조: 미합중국 특허 제 4,946,778호)이 갑상선 자극 호르몬 소단위체, 이형이합체, 단일 사슬 유사체 또는 그들의 절편 및 유도체에 대한 특이적 단일 사들 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 추가된 실시예는 원하는 특이성을 가진 단클론성 Fab 절편의 신속하고 용이한 동정을 위하여 Fab 라이브러리의 제조를 위하여 개시된 기술(참조: Huse et al., Science, 246:1275-1281, 1989)을 이용한다.

분자의 유전인자형(idiotype)을 포함하는 항체 절편은 공지된 기술로 생산이 가능하다. 예를 들어서, 전기 절편은 항체 분자의 펩신분해에 의하여 생성되는 F(ab')₂절편, 파파인 및 환원시약에 의하여 항체를 처리하여 생성되는 Fab 절편, 및 Fv 절편 등에 제한되지 않는다.

항체 생산에 있어서, 원하는 항체의 검사법은 당업계에 공지된 기술, 예를 들면 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 소단위체의 특이적 분역을 인식하는 항체를 선별하기 위하여, 전기 분역을 함유하는 돌연변이 소단위체의 절편과 결합하는 산물을 위하여 생성된 하이브리도마로 검사할 수 있다. 돌연변이 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 또는 야생형 갑상선 자극 호르몬에 특이적으로 결합하지 않는 단일 사슬 유사체에 특이적으로 결합하는 항체의 선별을 위하여, 돌연변이에 대한 양성결합 및 야생형 단백질에 대한 결합의 부재에 근거하여 선별할 수 있다. 아울러, 돌연변이 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 또는 단일 사슬 유사체 에 특이적인 항체가 제공된다.

전기 항체는 본 발명의 돌연변이 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 또는 단일 사슬 유사체와 관련된 당업계의 공지된 기술에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 전기 단백질의 영상화(imaging), 진단방법 등에서 적절한 물리학적 시료 내의 전기 물질들의 수준을 측정하는데에 사용될 수 있다.

8. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 소단위체의 분석

하기에 기재된 것은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 소단위체, 돌연변이 이형이합체 및 갑상선 자극 호르몬 유사체의 구조를 결정하고, 전기 물질의 실험실내 활성 및 생체내 생물학적 기능을 분석하기 위한 방법이다.

일단, 돌연변이 α 또는 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체가 동정되면, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화 및 젤 여과 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이를 포함하는 표준적인 방법 또는 단백질의 정제를 위한 표준적 기술의 어느 것에 의하여 분리 및 정제될 수 있다. 기능적인 특성은 적합한 분석법(전술된 면역분석을 포함)을 사용하여 평가될 수 있다.

다른 한편으로는 재조합 숙주세포에 의하여 제조된 돌연변이 α 소단위체 및/또는 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체가 동정되면, 소단위체 아미노산 서열은 예를 들어, 자동화된 아미노산 서열기(automated amino acid sequencer)를 이용한 단백질 염기서열분석을 위한 표준적인 기술에 의하여 결정될 수 있다.

돌연변이 소단위체 염기서열은 친수성 분석(hydrophilicity analysis)(참조: Hopp T. and Woods. K., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78:3824, 1981)에 의하여 성상 확인될 수 있다. 친수성 프로파일(hydrophilicity profile)은 소단위체의 소수성 및 친수성 영역 및 전기 영역을 암호화하는 유전자 서열의 상응하는 영역을 동정하는데 사용될 수 있다.

또한, 이차 구조 분석(참조: Chou. P. and Fasman. G., Biochemistry, 13:222, 1974)이 특이적 이차 구조를 갖는다고 사료되는 소단위체의 영역을 동정하는데 사용될 수 있다.

구조 분석의 다른 방법들 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 X-레이 크리스탈로그래피(참조: Engstom. A., Biochem. Exp. Biol., 11:7-13, 1974) 및 컴퓨터 모델링(참조: Fletterick. R. and Zoller. M.(eds.), Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986)을 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 상동성 모델링뿐만 아니라, 구조 예상, 크리스탈로그래피 자료의 분석, 염기서열 배열은 당업계에서 이용가능한 예를 들어 블라스트(BLAST), 참 릴리즈 21.2(CHARMm release 21.2 for the Convex) 및 퀀타 v.3.3(QUANTA v.3.3, Molecular Simulations Inc., York, United Kingdom) 등의 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.

돌연변이 α 소단위체, 돌연변이 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 유사체, 유도체 및 그들의 절 편의 기능적 활성은 당업계의 다양한 방법에 의하여 분석될 수 있다.

예를 들어, 야생형 갑상선 자극 호르몬에 결합하거나 경쟁하는 돌연변이 소단위체 또는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 능력 또는 항체에 대하여 결합하는 소단위체를 분석하는 방법에 있어서, 당업계에서 사용되는 동위원소면역분석, 효소결합흡착분석, "샌드위치(sandwich)" 면역분석, 면역방사성검출분석(immunoradiometric assay), 젤 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 인 시투(in situ) 면역분석(예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성 동위원소를 사용), 웨스턴 블랏, 침전 반응, 응집분석(예를 들어, 젤 응집분석, 혈청응집분석), 보체결합분석, 면역 형광분석, 단백질 A 분석 및 면역 전기영동분석 등의 다양한 면역분석법을 포함하되 이들에 국한되지 않는 분석법을 사용할 수 있다. 다른 한편으로는, 1차 항체는 2차 항체 또는 1차 항체에 대한 시약을 사용하여 검출할 수도 있으며, 특별히 2차 항체는 표지된다. 면역분석에서 결합을 검출하기 위한 당업계에서 공지된 많은 수단이 있으며, 이들은 본 발명의 범주에 속한다.

돌연변이 α 소단위체, 돌연변이 β 소단위체, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 유사체, 유도체 및 그들의 절편의 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 결합은, 예를 들어(참조: Szkudlinski et al., Endocriol., 133:1490-1503, 1993) 소의 갑상선 자극 호르몬에 국한되지 않는 다른 종의 방사성 동위원소 표지된 갑상선 자극 호르몬의 갑상선 자극 호르몬 수용체로부터 치환되는 것에 근거한 실험실내 분석법에 제한되지 않는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 검출될 수 있다. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체, 단일 사슬 유사체, 유도체 및 그들의 절편의 생체활성 또한, 예를 들어 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 세포에서의 cAMP 자극에 근거한 분석법에 의하여 측정될 수 있으며, 이에 국한되지 않고, 예를 들어, 실시예 2-3 및 그로스만 등(참조: Grossmann et al., Endocrinol., 9:948-958, 1995)에 상세히 개시된 분석법에 제한되지 않으며; 예를 들어, 스즈쿠드린스키에 의하여 개시된 분석법(참조: Szkudlinski et al, Endocrinol., 133:1490-1503, 1993)에 제한되지 않는다.

생체활성은 예를 들어, 하기 실시예 2 및 이스트-팔머에 의하여 개시된(참조: East-Palmer et al., Thyroid, 5:55-59, 1995) 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 갑상선 자극 호르몬 유사체 또는 단일 사슬 유사체를 마우스에 주입시킨 후 T4의 분비를 측정하는 것과 같은 동물 모델 내에서의 갑상선 자극 호르몬 수용체 결합의 물리학적 상관성에 의하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 야생형 갑상선 자극 호르몬 및 돌연변이 갑상선 자극 호르몬은 전처리로 6일 동안 물을 먹이며 3㎍/㎖의 T₃의 주입에 의하여 내인성 갑상선 자극 호르몬을 억제한 웅성 알비노 스위스 Crl:CF-1 마우스에 복강 내로 주사한다. 혈액 시료는 6시간 이후 안와 정맥(orbital sinus)으로부터 수득될 수 있으며, 혈청 T₄및 갑상선 자극 호르몬의 수준은 화학발광분석(Nichols Institute)에 의하여 측정될 수 있다.

단백질의 반감기는 단백질의 안정성에 대한 측정이며, 단백질의 농도가 반으로 감소하는데 필요한 시간을 나타낸다. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 반감기는 일정한 시간이 지난 개체로부터 수득된 시료의 갑상선 자극 호르몬 수준을 측정하기 위한 어느 방법에 의하여 측정될 수 있으며, 예를 들어, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 주입후 일정한 시간이 지난 뒤의 시료 내의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 수준을 측정하기 위한 항-갑상선 자극 호르몬을 사용한 면역분석 및 동위원소 표지된 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 주입후 개체로부터 수득된 시료 내의 동위원소 표지된 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 측정에 제한되지 않는다.

다른 모든 방법은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 것이며, 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.

9. 진단학적 및 치료적 용도

본 발명은 본 발명의 치료적 화합물("본 발명에서는 치료제")을 투여함으로써 다양한 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 제공한다. 전기 치료제는 도 1(서열번호 1)에 도시된 α 소단위체의 22번째 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 치환 및 돌연변이 또는 야생형 β 소단위체 중의 하나를 갖는 돌연변이 α 소단위체를 갖는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 포함한다. 돌연변이 α 소단위체를 갖는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는, 바람직하게는 (도 1(서열번호 1)에 도시된 8 내지 30번째 아미노산) L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환 및 돌연변이 β 소단위체를 가지며, 바람직하게는 (도 2(서열번호 2)에 개시된 52 내지 87번째 아미노산) L3 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가지며, hCG β 소단위체의 CTEP에 공유적으로 결합되어 있고; 돌연변이 α 소단위체를 갖는 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는, 바람직하게는 L1 루프 내에서의 또는 루프 근처에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환 및 돌연변이 β 소단위체를 가지며, 바람직하게는 L3 루프 내에서의 또는 루프 근처의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가지고, 돌연변이 α 소단위체 및 β 소단위체는 단일 사슬 유사체에 공유적으로 결합되어 있으며, 전기 유사체는 돌연변이 α 소단위체 및 β 소단위체 및 hCG β 소단위체의 CTEP가 단일 사슬 유사체, 다른 유도체, 유사체 및 그들의 절편(상술됨) 및 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 및 유도체, 유사체, 및 그들의 절편에 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 유도체, 유사체 및 그들의 절편을 암호화하는 핵산에 공유결합된 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 포함한다.

치료제는 바람직하게는 암소, 돼지, 말, 닭, 고양이 개 등의 동물을 포함하는 개체에 투여되나, 이들에 국한되지 않고, 바람직하게는 포유동물에 투여된다. 아울러, 사람인 개체에 투여됨이 바람직하다. 일반적으로, 치료제가 투여되는 개체와 동일한 종에서 유래한 치료제를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 구체적인 실시예에 있어서, 사람의 돌연변이 및/또는 수식된 갑상선 자극 호르몬 이형이합체, 유도체, 유사체 또는 핵산은 사람인 환자에 치료적으로 또는 예방적으로 또는 진단학적으로 투여된다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 치료제는 본질적으로 정제되는 것을 특징으로 한다.

갑상선 저하증과 같은 증상이 나타나는 다수의 장애는 본 발명의 방법에 의하여 치료될 수 있다. 갑상선 자극 호르몬이 정상 또는 원하는 수준에 비하여 없거나 감소가 되는 장애에 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체의 투여에 의하여 치료 또는 예방될 수 있다. 아울러, 갑상선 자극 호르몬 수용체가 정상수준에 비하여 없거나 감소되는 경우 또는 야생형 갑상선 자극 호르몬의 정상적 갑상선 자극 호르몬 수용체에 비하여 무반응이거나 덜 반응을 하는 장애를 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체의 투여에 의하여 치료할 수 있다. 구조적으로 활성이 있는 갑상선 자극 호르몬 수용체는 갑상선 과다증을 유발할 수 있으며, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 갑상선 자극 호르몬 유사체가 길항제로 사용될 수 있으리라 예상된다.

구체적인 실시예에 있어서, 발현된 갑상선 기능을 자극할 수 있는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체가 예방을 포함한 치료적으로 투여될 수 있다. 치료 또는 예방될 수 있는 질환 및 장애는 갑상선 저하증, 갑상선 과다증, 갑상선 발달, 갑상선 암, 양성 갑상선종(benign goiter), 비대해진 갑상선, 세포사멸로부터 갑상선 세포의 보호 등에 국한되지 않는다.

갑상선 자극 호르몬 단백질 또는 기능 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체 단백질 및 기능의 부재 또는 감소된 수준은 예를 들어, 환자의 시료(예를 들어, 절제된 조직)로부터 즉각적으로 검출되고 실험실 내에서 RNA 또는 단백질 수준, 발현된 RNA의 구조 및/또는 활성 또는 갑상선 자극 호르몬 또는 갑상선 자극 호르몬 수용 체의 단백질을 분석할 수 있다. 갑상선 자극 호르몬 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체 단백질의 검출 및/또는 가시화를 위한 면역분석(예를 들어, 웨스턴 블랏, 면역침전 후의 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동, 면역조직화학염색 등) 및/또는 갑상선 자극 호르몬 또는 갑상선 자극 호르몬 mRNA을 검출 및/또는 가시화함(예를 들어, 노던 블랏, 도트 블랏, in situ 잡종형성(hybridization)으로써 갑상선 자극 호르몬 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 발현을 검출하는 잡종형성분석 등의 당업계의 표준적인 다수의 방법이 적용될 수 있다.

구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 치료제는 갑상선 암을 치료하는데 사용된다. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 및 유사체는 방사성 요오드로 치료에 의한 절제 전에 갑상선 및 전이성 조직을 자극하는 데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬은 방사성 절제술을 위하여 방사성 동위원소 표지된 요오드를 투여하기 전 갑상선 암 환자에 투여될 수 있다. 본 발명의 치료제는 다결절성 갑상선종(benign multinodular goiter)의 치료를 위한 방사성 절제술 이전에 양성 다결절성 갑상선종에 의한 요오드의 섭취를 자극하거나, 비대해진 갑상선의 치료를 위한 방사성 절제술 이전에 갑상선 조직에 의한 요오드의 섭취를 자극하는데 사용될 수 있다.

특별히, 방사성 절제 치료법은 본 발명의 치료제를 투여함으로써 수행될 수 있으며, 바람직하게 치료제의 근육내 투여에 있어서, 1회 내지 3회 섭생(regimen)의 용법에 있어서, 예를 들면 2일 동안 하루에 한 번 또는 7일 동안 첫 번째, 4번 째, 7번째 일에 1회 용법에 국한되지 않는다. 용량은 하기 발명의 상세한 설명의 10에 기재되어 있듯이, 적절한 용법이 될 수 있고, 예를 들어서 적절하게 10㎍ 내지 1㎎의 용량, 바람직하게는 10㎍ 내지 100㎍의 용량에 제한되지 않는다. 용법의 마지막 섭생 후 그 다음날, 동위원소 표지된 요오드, 바람직하게는 ¹³¹I가 암, 비암성 갑상선종 또는 비대해진 갑상선의 치료에 충분한 양으로 개체에 투여된다. 투여된 동위원소 표지된 요오드의 양은 질환의 유형 및 심각성에 의존한다. 일반적으로, 30 내지 300mCi의 ¹³¹I가 갑상선 암종을 치료하는데 투여된다.

다른 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 갑상선 또는 갑상선 암세포의 치료의 표적하는 전달(delivery)에, 예를 들면 유전자치료(예를 들면, 갑상선 암세포로 암 억제 유전자의 표적하는 전달)를 위한 핵산의 표적하는 전달 또는 리신(ricin) 또는 디프테리아 독소에 국한되지 않는 독소의 표적하는 전달에 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명은 본 발명의 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 투여함으로써 갑상선 암, 바람직하게는 갑상선 암종의 진단, 예후, 검진, 및 갑상선 암의 치료를 모니터링하는 방법을 추가로 제공한다. 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 치료제는 갑상선 세포(갑상선 암세포를 포함)에 의한 요오드 섭취(바람직하게는 예를 들면 ¹³¹I 또는 ¹²⁵I에 국한되지 않는 방사성 동위원소 표지된 요오드)를 자극 및/또는 갑상선 세포(갑상선 암세포를 포함)로부터 티로글로불린의 분비를 자극하기 위하여 개체에 투여될 수 있다. 치료제의 투여 이후에, 방사성 동위원소 표 지된 요오드는 환자에 투여될 수 있고, 그 다음으로 동위원소 표지된 요오드(즉, 갑상선 세포)의 존재 및 이동이 개체 내에서 측정될 수 있고/있거나(예를 들어, 전신 스캔(whole body scanning)에 의한 방법에 제한되지 않음), 티로글로불린의 수준은 생체 내에서 측정 또는 검출될 수 있으며, 갑상선 암 또는 질환이 없는 개체 또는 정상적인 수준과 비교하여 동위원소 표지된 요오드 섭취의 증가된 수준 또는 티로글로불린 분비의 증가된 수준이 개체가 갑상선 암임을 나타낸다. 전기 개체는 갑상선절제 또는 갑상선 조직 절제치료를 받고 있거나 적은 또는 잔여의 갑상선 조직을 가질 수 있다. 전기 개체, 또는 비암성(non-cancerous)의 갑상선 세포가 부족한 개체에서, 요오드의 섭취의 어는 것 또는 티로글로불린 분비의 검출(전기 갑상선절제 또는 절제치료법 또는 다른 원인에 의한 갑상선 조직의 손실 후의 잔여 수준)은 갑상선 암 세포의 존재를 나타낸다. 개체 내에 삽입된 방사성 동위원소의 이동은 질환의 확장 또는 전이 또는 악성을 검출하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 진단학적 방법은 치료시 반응에서 동위원소 표지된 요오드 또는 티로글로불린 수준의 변화를 측정함으로써 또는 갑상선 암의 퇴행 또는 성장 또는 전이를 측정함으로써 갑상선 암의 치료를 모니터링하는데 사용될 수 있다.

특별히, 진단학적 방법은 본 발명의 치료제를 투여함으로써, 바람직하게는 근육내 주사로 1 내지 3회 섭생의 용법으로, 예를 들면 2일 동안 하루에 1회 또는 7일 섭생의 1번째, 4번째 및 7번째 일에 1회 용법에 국한되지 않는다. 용량은 하기 발명의 상세한 설명 10에 기재된 적절한 용량, 예를 들어 적합하게 10㎍ 내지 1㎎의 용량, 바람직하게는 적합하게 10㎍ 내지 100㎍의 용량에 국한되지 않는다. 용법의 마지막 섭생후 그 다음날, 동위원소 표지된 요오드, 바람직하게는 ¹³¹I가 개체에 갑상선 세포(갑상선 암세포를 포함)의 측정에 충분한 양으로 투여될 수 있는데, 일반적으로, 1 내지 5mCi의 ¹³¹I가 갑상선 암종을 진단하는데 투여된다. 동위원소 표지된 요오드의 투여 이틀 후, 환자 내의 동위원소 표지된 요도드의 섭취는 환자 내에서 측정되고/되거나 이동되며, 예를 들어서 전신 스캔에 국한되지 않는다. 다른 한편으로는 갑상선 조직이 제거된 모든 또는 대부분의 경우(예를 들어, 이전의 갑상선절제 또는 갑상선 조직 제거 치료한 환)에, 티로글로불린의 수준은 본 발명의 치료제의 마지막 용량의 투여 후 2 내지 7일째 측정될 수 있다. 티로글로불린은 당업계에 잘 알려진 티로글로불린에 특이적인 면역방사선검출분석의 사용을 포함한 당업계에 공지된 방법에 의하여 측정될 수 있다.

아울러, 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 예를 들어, 카키누마 등에 의하여 개시된(참조: Kakinuma et al., J. Clin. Endo. Met., 82:2129-2134, 1997) 갑상선 자극 호르몬 수용체 자가항체에 대한 갑상선 자극 호르몬 결합 억제 분석에 사용될 수 있다. 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 항체는 그레이브스병(Grave's disease) 및 하시모도 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)에 국한되지 않는 특정한 갑상선 질환에 관여된다; 따라서, 그레이브스병 및 하시모도 갑상선염과 같은 갑상선 질환의 진단에 전기 결합 억제 분석이 사용될 수 있다. 요약하면, 갑상선 자극 호르몬 수용체를 함유하는 세포 또는 세포막은 갑상선 자극 호르몬 수용체 항체의 시험을 위한 시료에 가할 수 있으며, 그 다음 본 발명의 동위원소 표지된 갑상선 자극 호르몬에 가할 수 있고, 본 발명의 시험되는 시료와 접촉하지 않고 동위원소 표지된 돌연변이 갑상선 자극 호르몬과 접촉하는 세포 또는 세포막에 대한 결합에 대하여 상대적인 동위원소 표지된 갑상선 자극 호르몬에 대한 결합의 억제는 시험하는 시료가 갑상선 자극 호르몬 수용체와 반응하는 항체를 가짐을 의미한다. 본 발명의 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 생체활성이 큰, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 사용한 결합 억제 분석은 야생형 갑상선 자극 호르몬을 사용한 결합 억제 분석을 시행했을 때보다 항-갑상선 자극 호르몬 항체에 대하여 더 큰 민감성을 가진다.

따라서, 본 발명의 실시예는 갑상선 자극 호르몬 수용체를 포함하는 배양된 세포 또는 분리된 세포막을 첫 번째 개체로부터 수득된 항체를 포함한다고 추정되는 시료에 가한 다음, 여기에 본 발명의 진단학적 유효량의 제 30항의 동위원소 표지된 갑상선 자극 호르몬 유사체에 가하는 단계; 및, 배양된 세포 또는 분리된 세포막에 대한 동위원소 표지된 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 전기 세포 또는 세포막에 전기 시료를 가하지 않거나 전기 질환이나 장애가 없는 두 번째 개체의 시료를 가할 경우 동위원소 표지된 갑상선 자극 호르몬 결합의 상대적인 감소로서 첫 번째 개체에서 전기 질환 또는 장애가 나타남을 확인하는, 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 항체의 존재에 의하여 특징지어지는 질환 또는 장애를, 바람직하게는 그레이브스병을 진단 또는 검진하는 방법을 제공한다.

또한, 돌연변이 이형이합체 및 유사체는 자동적인 과작동성 (hyperfunctioning) 갑상선 소결절(nodule)을 가지거나 외인성 갑상선호르몬 치료를 받고 있는 환자에게서 억제된 기능의 갑상선 조직을 측정하는 자동적인 진단학적 방법에 사용될 수 있다. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 갑상선 자극 호르몬 유사체는 1차성 및 주된 갑상선 저하증, 갑상선의 반측위축증(hemiatrophy) 및 갑상선 자극 호르몬 작용에 대한 내성의 진단과 관련된 적용 등에 국한되지 않는 다른 적용에도 사용될 수 있다.

10. 약학적 조성물

본 발명은 진단학적 방법 및 본 발명의 치료제의 유효량을 대상 개체에 투여함에 의한 치료 방법을 제공한다. 치료제는 충분히 정제되는 것이 바람직하다. 대상 바람직하게는 암소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등에 국한되지 않는 동물을 포함하는 개체에 투여되나, 바람직하게는 포유동물에 투여되며, 가장 바람직하게는 사람에 투여된다. 구체적인 실시예에 있어서, 사람이 아닌 포유동물이 투여되는 대상 개체이다.

본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 및 갑상선 자극 호르몬 유사체는 바람직하게는 실험실 내에서 시험될 수 있으며, 사람에 적용되기 전 원하면 생체내 실험을 할 수 있다. 다양한 구체적인 실시예에 있어서, 실험실내 분석은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체가 전기 세포유형, 예를 들어 발명의 상세한 설명 8에 개시된 세포유형에 따라서 원하는 효과를 가지 는지를 측정하기 위하여, 환자의 장애와 관련된 세포유형(예를 들어, 갑상선 세포)의 대표적인 세포를 대상으로 수행될 수 있다.

치료에 사용되는 화합물은 사람에게 시험되기 전에 랫트, 마우스, 닭, 암소, 원숭이, 토끼 등에 제한되지 않는 적합한 동물 모델 시스템 내에서 시험될 수 있다. 사람에게 투여되기 전, 생체내 시험을 위하여 당업계에 공지된 어떠한 동물 모델 시스템이라도 사용할 수 있다.

다양한 전달 시스템이 알려져 있고, 예를 들면 리포솜 내의 캡슐화(encapsulation in liposomes), 미세입자(microparticle), 미세캅셀(microcapsule), 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포내이입(receptor-mediated endocytosis)(참조: Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987) 등이 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체의 투여를 위하여 사용된다. 투여 방법은 내피(intradermal), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 피하(subcutaneous), 비강내(intranasal), 경막외(epidural) 및 경구투여를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 화합물은 용이한 형태의 경로, 예를 들면 주입(infusion) 또는 환괴 주입(bolus injection)에 의하여, 상피세포 또는 점막피부층의 선(예를 들면, 구강 점막, 직장 및 장내 점막 등)을 통한 흡수에 의하여 투여될 수 있으며, 생물학적 활성이 있는 유효성분과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적인 투여가 가능하다. 아울러, 본 발명의 약학적 조성물을 뇌실내 (intraventricular) 및 포막내(intrathecal)를 포함한 적합한 경로로 주입될 수 있으며; 뇌실내 주입은 도관(catheter)에 의하여, 예를 들면, Ommaya 저장소와 같은 저장소에 부착되어 용이하게 이루어질 수 있다. 또한, 폐의 투여는 예를 들면 흡입기 또는 분무기의 사용 및 에어로졸제의 제제에 의하여 적용될 수 있다.

구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 치료가 필요한 부분에 국소적으로 투여될 수 있으며; 전기 투여는 예를 들면, 도관의 수단, 좌약의 수단, 이식의 수단에 의하여 수술시의 국소적 주입(infusion)될 수 있으며, 전기 이식 재료는 시알라스틱 멤브레인(sialastic membrane) 또는 섬유질과 같은 멤브레인을 포함하는 다공성의(porous), 비다공성의(non-porous) 또는 젤라틴성의 물질이 될 수 있다.

다른 실시예에 있어서, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 유사체는 소포(vesicle) 내에서, 특히 리포좀(참조: Langer, Science, 249:1527-1533, 1990; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious disease and Cancer, Pipez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp.353-365, 1989; Lopez-Berstein, in Liposomes in the Therapy of Infectious disease and Cancer, Pipez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp.317-327)내에서 전달될 수 있다.

또 다른 실시예에 있어서, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체는 조절된 방출 시스템(controlled releasing system)내에서 전달될 수 있다. 일실시예에 있어서, 펌프가 사용될 수 있다(참조: Langer, Science, 249:1527-1533, 1990; Sefton. CRC Crit Fef. Biomed. Eng., 14:201, 1987; Buchwald et al., Surgery, 88:507, 1980; Saudek et al., New. Engl. J. Med., 321:574, 1989). 다른 실시예에 있어서, 폴리머 기재(material)가 사용될 수 있다(참조: Medical Applications of controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Press., Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61, 1983; Levy et al., Science, 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol., 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg., 71:105, 1989). 또 다른 실시예에 있어서, 조절된 방출 시스템은 치료적 표적의 가까이에 위치할 수 있고, 따라서 전신적 용량의 부분만이 요구된다(참고: Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Press., Boca Raton, Florida, 2:115-138, 1984).

다른 조절된 방출 시스템은 란거(Langer)에 의한 검토에서 논의되었다(참조: Langer, Science, 249:1527-1533, 1990).

구체적인 실시예에 있어서, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체를 암호화하는 핵산은 암호된 단백질의 발현을 촉진하기 위하여 생체 내로 투여될 수 있으며, 적절한 발현 벡터의 한 부분을 제작하고 예를 들면 레트로바이러스 벡터(참조: 미합중국 특허 제 4,980,286호), 직접 주입 또는 미세분자 포격(microparticle bombardment)(예를 들어 a gene gun, Biolistic, Dupont) 또는 지질 및 세포표면 수용체 또는 트랜스펙션제로 코딩하는 방법 또는 전기 벡터를 핵 내로 이동한다고 알려진 호메오박스-유사 펩티드(homeobox-like peptide)(참조: Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:1864-1868, 1991)을 사용하여 세포내로 투여하는 방법 등에 의하여 이루어질 수 있다. 다른 한편으로는, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체를 암호화하는 핵산 분자를 동종 재조합에 의하여, 세포 내로 도입되거나 발현을 위한 숙주세포 DNA 내에 삽입될 수도 있다.

아울러, 본 발명은 약학적 조성물을 제공한다. 전기 조성물은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 구체적인 실시예에 있어서, "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"이라는 용어는 미국 약전에 개시된 정부 또는 주정부의 표준국에 의하여 입증되거나 또는 동물에서 사용 및 더욱 바람직하게는 사람에서 사용되는 다른 약전에 의하여 일반적으로 입증된 것을 의미한다. "담체(carrier)"라는 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형체 또는 부형제(vehicle)를 일컫는다. 전기 약제학적 담체는 예를 들면 물 및 땅콩유, 콩기름, 광물유, 깨기름, 등의 석유, 동물, 식물 또는 합성품으로부터 수득된 오일과 같은 멸균된 액체가 될 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 특히 주사용제로 사용될 때 생리식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 액체 담체로써 적용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아레이트 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 수산화나트륨, 건조된 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 그와 유사한 것을 포함한다. 조성물은, 원하면, 보습제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 소량 포함할 수 있다. 전기 조성물은 용액, 현탁제, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 파우더, 서방성제제 및 그와 유사한 형태로 제제화될 수 있다. 조성물은 트리글리세리드와 같은 통상적인 결합체 및 담체와 함께 좌약의 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등의 약제학적인 등급품과 같은 통상적인 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 마르틴(Martin E.W.)에 의한 "레밍텅의 약제학(Remington's Pharmaceutical Sciences)"에 개시되어 있다. 전기 조성물은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체의 치료학적 유효량을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 정제된 형태로, 환자에게 적절한 투여의 형태를 제공하기 위하여 적합한 양의 담체를 함께 포함할 수 있다. 제제화는 투여의 형태에 적합해야만 한다.

바람직한 실시예에 있어서, 조성물은 사람에게 정맥투여에 적용되는 약학적 조성물과 같은 통상적인 과정에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥투여를 위한 조성물은 멸균된 등장 수성 완충액이다. 필요에 따라, 조성물은 용액화제 및 주사시 통증을 경감시키는 리그노카인(lignocaine)과 같은 국소마취체를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분은 예를 들어, 동결건조된 파우더 또는 유효성분의 양을 표시할 수 있는 앰플 또는 향주머니(sachette)와 같은 밀봉입된 무수의 농도물로 건조된 1회 용량의 형태(unit dosage form)로 별도로 혹은 함께 혼합되는 방법 중의 하나로 적용될 수 있다. 주입에 의하여 조성물이 투여될 때, 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 생리식염수를 포함한 주입 용기에 포함되어 투약될 수 있다. 조성물이 주사에 의하여 투여되는 장소에서, 주사를 위한 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공되어 투여되기 전 성분이 혼합될 수 있다.

본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체는 중성 또는 염의 형태로 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래한 자유 아미노기와 함께 형성되는 염 및 염화나트륨, 염화칼륨, 암모니아, 염화칼슘, 염화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래한 자유 카르복실기와 함께 형성되는 염을 포함한다.

특정 장애 또는 질병의 치료에 유효하게 작용하는 본 발명의 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체 또는 갑상선 자극 호르몬 유사체는 장애 또는 질병의 상태에 의존하며, 표준적인 임상기술에 의하여 측정될 수 있다. 아울러, 실험실내 분석 및 동물 모델은 적절한 용량 범위를 산정하기 위하여 적용될 수 있다. 제제화에 적용되는 구체적인 용량은 투여경로, 질환 또는 장애의 심각성에 의존되며, 기술자 및 각각의 환자의 환경에 대한 판단에 따라 결정되어야 한다.

구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 치료제는 근육 내로 투여될 수 있다. 근육내 투여의 적합한 용량 범위는 일반적으로 1회에 대략 10㎍ 내지 1㎎, 바람직하게는 대략 10 내지 100㎍이다. 일반적으로, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬에 의 한 요오드 섭취를 자극시키기 위하여 투여되는 방법 진단학적 및 치료적 방법을 위하여, 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 1 내지 3회 주입의 섭생으로 적용될 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 2회 용량으로 투여되는 치료제는 2회 용량은 1회 용량의 투여 24시간 후에 투여되며; 다른 실시예에 있어서, 3회 용량으로 투여되는 치료제는 7일 섭생의 1일째, 4일째, 7일째에 투여된다.

유효량은 실험실내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 얻은 용량-반응 곡선(dose-response curve)에서 외삽법에 의하여 결정될 수 있다.

좌약은 일반적으로 전체 무게의 0.5% 내지 10%의 범위에서 활성 성분을 함유하며; 경구제제는 바람직하게는 10% 내지 95%의 활성 성분을 포함한다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 하나 또는 그 이상의 성분이 채워진 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는, 치료적 또는 진단학적 용도를 위한 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 전기 용기는 제조를 관할하는 정부국에 의하여 약제학적 또는 진단학적 제품의 사용 또는 매약이 통지될 수 있으며, 사람의 투여를 위한 사용 및 매약이 제조국에 의하여 승인된 통지서에 반영될 수 있다.

실시예

신규한 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 두 가지 실시예가 하기에 제공된다. 자료는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬이 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 높은 생체활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 1: 시료

제한효소, DNA 표지자 및 다른 분자생물학적 시약은 Gibco BRL(Gaithersburg, MD) 또는 Boehringer-Mannheim(Indianapolis, IN) 둘 중의 한 회사로부터 구입하였다. 세포배양액, 태아 송아지 혈청 및 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)은 New England Biolabs(Beverly, MA)로부터 구입하였다. 전체-길이의 사람의 α-cDNA(840bp)는 pcDNA I/Neo 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)의 BamHI/XhoI 부위 내에서 아클로닝(subcloning)되었고, hCG-β 유전자는 T.H. Ji(University of Wyoming, Laramie, WY)로부터 입수하였다. 번역되지 않는 첫 번째 엑손 및 고유한 번역 개시 부위를 가지며, 첫 번째 인트론(intron)이 없는 hTSH-β 소유전자(minigene)는 본 발명자들에 의하여 형성되었다. 재조합 사람의 갑상선 자극 호르몬 표준품은 Genzyme(Framingham, MA)으로부터 입수되었다. 안정하게 hTSH 수용체를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소세포주(CHO)(CHO-hTSHR clone JP09 및 clone JP26)은 바사트(Vassart. G., University of Brussels, Brussels, Belgium)에 의하여 제공되었다. 40 내지 60μCi/㎍의 특이적 활성을 갖는 동위원소 표지된 ¹²⁵I cAMP, ¹²⁵I-사람의 갑상선 자극 호르몬 및 ¹²⁵I-송아지의 갑상선 자극 호르몬은 Haezleton Biologicals(Vienna, VA)로부터 입수되었다.

실시예 2: 방법

실시예 2-1: 특정부위의 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)

사람의 α-cDNA의 특정부위의 돌연변이유발은 중합효소 연쇄반응에 근거한 메가프라이머 방법(Sarker et al., Biotechniques, 8:404-407, 1990)에 의하여 수행되었다. 증폭은 Vent^R DNA Polymerase(New England Biolabs)를 사용하여 최적화되었다. BamHI 및 XhoI에 의하여 절단된 PCR 산물은 절단된 BamHI/XhoI 절편과 함께 pcDNA I/Neo 벡터(Invitrogen) 내에서 연결되었다. MC1061/p3 대장균 세포는 Ultracomp E.coli Transformation Kit(Invitrogen)을 사용하여 형질전환되었다. QIAprep 8 Plasmid Kit(Qiagen)는 다수의 플라스미드 DNA 수득을 위하여 사용되었다. Qiagen Mega and Maxi Purification Protocols는 이후의 돌연변이유발에 주형(template)으로서 단일 또는 다수의 돌연변이를 가진 α-cDNA를 포함하는 플라스미드를 대량으로 정제하는데 사용되었다. 돌연변이는 생거(Sanger)의 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결 과정(dideoxynucleotide chain termination procedure)을 이용한 이중가닥 염기서열분석에 의하여 확인되었다. CTEP내에 융합된 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 제조는 조시(Joshi) 등에 의하여 개시되었다(참조: Joshi et al., Endocrinology, 136:3839-3848, 1995).

실시예 2-2: 재조합 호르몬의 발현

CHO-K1 세포(ATCC, Rockville, MD)는 글루타민, 10%의 태아 송아지 혈청, 페니실린(50 units/㎖) 및 스트렙토마이신(50㎍/㎖)을 함유한 HAM's F-12 배지에서 계대되었다. 세포의 플레이트(100㎜ 배양용기)는 pcDNA I/NEO내에 삽입된 야생형 또는 돌연변이 α-cDNA 및 p(LB)CMV 벡터 내에 삽입된 hTSHβ 미니유전자를 동시에 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, 트랜스펙션된 세포는 나트륨이 없는 CHO-혈청(CHO-SFM-II, Gibco BRL)로 옮겨졌다. 유전자 삽입체가 없는 발현 벡터를 사용한 대조군(mock transfections)의 배양액을 포함한 세포배양액은 트랜스펙션한 72시간 후에 수거되어, 농축 및 원심분리되었고; 분취량(aliquot)은 -20℃에서 보관하고, 각각의 분석 직전에 하나씩 해동하였다. 야생형 및 돌연변이 hTSH는 다양한 활성 분석 및 면역분석에 의하여 측정되고 입증되었다.

실시예 2-3: 사람의 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 포유동물의 세포에서 cAMP 자극

안정하게 hTSHR cDNA로 트랜스펙션된 CHO-K1 세포(JP09 또는 JP26)는 상술된 야생형 및 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 연속적 희석으로 성장 및 배양되었다. 배양액으로 분비된 cAMP는 방사성 면역분석에 의하여 측정되었다. 전체 배양액 단백질의 동일한 양이 대조군 및 트랜스펙션된 세포로부터 수득된 hTSH를 함유한 시료로 사용되었다.

실시예 2-4: 생체내 갑상선 자극 호르몬 생체활성 분석

hTSH의 갑상선 친화성 활성은 hTSHR을 발현하는 CHO 세포(clones JP09 및 JP26) 및 내인성 랫트 TSHR를 발현하는 FRLT-5 세포 내에서의 cAMP 생산을 유도하는 능력에 의하여 측정되었다. FRTL-5 세포는 또한 hTSH-유도 세포 성장을 시험하는데 사용되었다. 결국, 안정하게 hTSHR을 발현하는 CHO 세포(JP09 또는 JP26)는 96-c웰 조직 배양 플레이트 내에서 HAM's F12 배지의 보충하에 성장되었다. 이후, 세포는 대조군의 대조 배양액뿐만 아니라 야생형 및 돌연변이 hTSH의 연속적 희석액과 함께 염이 없는 조건 또는 생리학적 염화나트륨(0.9%)의 조건에서 37℃의 5% 이산화탄소 배양기에서 2시간 동안 배양되었다. 배양액으로의 cAMP의 분비량은 방사성 면역분석에 의하여 측정되었다. hTSH 유사체의 생체활성은 츠들린스키 등(참조: Szkudlinski et al., Nat. Biotechnol., 14:1257, 1996)에 의하여 개시된 T₃억제 마우스 내로 복강 주사한 후의 총 티록신(total thyroxine, total T₄) 수준에 의하여 측정되었다.

실시예 3: 결과

도 4 내지 8에 도시된 결과는 본 발명에 따른 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체가 야생형 갑상선 자극 호르몬과 비교할 때 증가된 생체활성을 나타낸다 는 결론을 뒷받침한다. 특별히, 전기 결과는 상술된 과정에서의 갑상선 자극 호르몬 소단위체 내의 단일 또는 다수의 돌연변이가 실험실내 및 생체 내에서 증가된 활성을 갖는 이형이합체 내에 함유될 수 있음을 나타낸다. 이러한 사실은 몇몇 다른 돌연변이 및 그들의 조합에서 실제적으로 일어나며, 본 발명의 범주에 개시되어 있다.

일반적인 사람의 α 소단위체의 αL1 루프 내에서의 돌연변이는 호르몬 활성을 증가시키며, 이것은 α 소단위체의 22번째 위치에서 일반적으로 나타나는 글라이신 잔기가 아르기닌 잔기로 치환(αG22R)되어 생성된 돌연변이에 의하여 나타남을 제시한다. 야생형 β 소단위체와 전기 돌연변이가 조합된 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 CHO-K1 세포 내의 각각의 소단위체를 순간적으로 동시에 발현시킴으로써 생산되었다. 그 결과로 생성된 돌연변이 이형이합체는 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 CHO-JP26 세포를 사용한 생체활성 분석으로 시험되었다. 도 4에 도시된 결과에서 보듯이, 돌연변이 호르몬은 갑상선 자극 호르몬 수용체에 결합하였고, 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 높은 수준의 cAMP 생성을 유도하였다.

돌연변이 갑상선 자극 호르몬 초활성 이형이합체, 야생형 또는 Q13K+E14K+P16K+Q20K의 4개의 돌연변이 즉 α4K를 포함하는 돌연변이 일반적인 α 소단위체의 혈장 반감기 및 안정성은 α4K 소단위체를, 야생형 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체 또는 CHO-K1 세포 내에서 hCG의 CTEP와 융합된 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체(β-CTEP)와 동시에 발현시킴으로써 증가되었다. 야생형 및 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 화학발광 면역분석(Nihols Institute)을 사용하여 정량화될 수 있었다. 그 결과는 표 1에 개시되었다(100% 발현이 ㎖당 야생형 갑상선 자극 호르몬 47ng임).

갑상선 자극 호르몬의 유형	발현(% 야생형)	SEM
hTSH 야생형	100	6
hTSH-α4K	26	5
hTSH-α4K+CTEP	20	3

CTEP의 존재는 α4K 및 야생형 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체를 포함하는 이형체에 비하여, α4K 및 βCTEP 융합 단백질을 포함하는 이형이합체의 발현을 감소시키지 않았다.

갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 야생형 및 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 결합 능력은 트랜스펙션된 갑상선 자극 호르몬 수용체를 안정하게 발현하는 CHO-JP09내에서의 cAMP 생산의 자극에 의하여 측정되었다. 도 5에서 보듯이, α4K/β-CTEP 이형이합체는 야생형 갑상선 자극 호르몬에 비교하여 역가가 200배 증가하였고, Vmax가 1.5배 증가하였다. 놀랍게도 α4K/β-CTEP 이형이합체의 생체내 반감기를 연장시킨 CTEP의 융합은 α4K/야생형 β 이형이합체에 비하여 실험실적 활성을 3 내지 4배 증가시켰다.

상기 결과는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬의 생체활성을 증가시키는 돌연변이가 실험실내 및 생체내 특성에서 우월성을 나타내는 돌연변이 호르몬을 생산하기 위하여 돌연변이 또는 순환 반감기가 연장된 수식과 유리하게 조합될 수 있다는 것을 보여주었다.

다른 실시예에 있어서, 일반적인 사람의 α 소단위체의 β 헤어핀 L3 루프 내에서의 돌연변이는 또한 호르몬 활성을 증가시킨다. 돌연변이 중의 하나는 81번째 위치에서의 알라닌 잔기가 라이신 잔기로의 치환(αA81K)이다. 다른 돌연변이는 66번째 위치에서의 아스파라긴 잔기가 라이신 잔기로의 치환(αN66K)이다. 사람의 α 소단위체 돌연변이의 각각은 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 생산하도록 야생형 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체와 조합되어 CHO-K1 세포 내에서 순간적으로 발현되어 있다. 전기 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체의 각각은 사람의 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 CHO-JP09 세포를 사용하여 생체활성 분석을 시험할 수 있다. 이러한 과정의 결과는 두 가지 돌연변이 호르몬 모두가 야생형 호르몬에 비하여 cAMP 생산의 높은 수준을 자극함을 제시하였다. α 소단위체 내의 81번째 위치의 알라닌으로부터 라이신으로의 치환(αA81K)은 다른 동종 염기서열에서는 나타나지 않는 라이신 잔기의 β 헤어핀 루프로의 도입을 처음 입증한 것이다.

또 다른 실시예에 있어서, 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체의 β 헤어핀 L1 루프 근처의 돌연변이는 이러한 돌연변이 소단위체를 포함하는 이형이합체의 호르몬 활성을 증가시켰다. 돌연변이는 6번째 위치에서의 글루타메이트 잔기를 β 헤어핀 L1 루프 말단의 음전하를 띤 잔기를 나타내는 아스파라긴 잔기로 치환하였다. 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체를 생산하도록 야생형 사람의 일반적인 α 소단위체와 조합된 CHO-K1 세포 내에서 순간적으로 발현되었다. 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 이형이합체는 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 CHO-JP09 세포를 사용하여 생체활성이 시험될 수 있다. 다시 언급하면, 그 결과는 이러한 돌연변이 갑상선 자극 호르몬이 수용체에 결합하며, 야생형 갑상선 자극 호르몬보다 cAMP 생산의 증가된 수준을 야기한다는 것을 제시하였다.

도 6 내지 7의 결과는 β L1 루프 내에서의 돌연변이가, 실험실 내의 분석법을 사용하여 시험했을 때 증가된 생물학적 활성을 유리하게 가진 돌연변이 이형이합체를 생산하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 특이하게도, 도 6의 결과는 돌연변이 βF1R, βE6N 및 βA17R 각각이 증가된 호르몬 활성을 가지는 돌연변이 이형이합체를 형성하도록 야생형 α 소단위체와 조합될 수 있음을 나타내었다. 도 7은 βF1R과 βE6N의 조합 또는 βF1R, βE6N 및 βA17R의 조합을 포함하는 β 소단위체가 증가된 생물학적 활성을 가진다는 것을 보여준다.

상술된 실험실내의 발견에 따라, 돌연변이 사람의 갑상선 자극 호르몬 유사체는 생체내 활성에 있어서 유사한 증가를 나타내었다. 사실상, 상술된 과정에 따라서 수득된 갑상선 자극 호르몬 돌연변이의 생체내 활성의 한가지 증거에는, 3가지 점돌연변이(βI58R, βE63R 및 βL69R)를 갖도록 생성된 갑상선 자극 호르몬 β 소단위체(β3R)가 존재한다. 상술된 α4K 돌연변이 α소단위체 및 β3R 돌연변이 β 소단위체는 세포 내에서 동시에 발현되고, 조건배양액으로부터 수거되며 결과적으로 이형이합체는 전체 T4의 형태로 측정가능한 생물학적 활성을 위하여 시험되었다. 돌연변이유발은 순환으로부터 유사체의 제거에 유의적인 영향을 주지 못하였다. 도 8에서 보여진 결과는, 2개의 다른 돌연변이 이형이합체가 생체 내에서 현저히 증가된 생체활성을 나타낸다는 것을 제시하였다. 도 8에서 보여진 결과는, 야생형 대조군에 비하여 α4K/β3R 이형이합체의 증가된 생체활성의 강도가 최소한 100배임을 나타낸다. 더욱이, 이러한 결과는 돌연변이 갑상선 자극 호르몬 소단위체 조합이 생체 내에서 현저히 호르몬 활성을 극적으로 증가시킬 수 있음을 확증하였다. 이러한 결과로 볼 때, 여기에 기술된 대로 갑상선 자극 호르몬 돌연변이 및 유사체가 갑상선 암의 진단학적 측면에서 상업적인 재조합 hTSH보다 우월할 것으로 기대되었다.

전기에 나타난 결과는 실시예에서 제공된 결과에 의한 갑상선 자극 호르몬 소단위체의 돌연변이가 증가된 생물학적 활성을 갖는 갑상선 자극 호르몬 돌연변이를 제조하고 사용할 수 있다는 것을 확증하였다.

실시예에 개시된 결과는 hTSH의 αL1 및 βL3 루프의 말단 영역이, "수식가능한(modification-permissive)" 분역을 나타내었으며, 전기 분역은 높은 수용체 결합 및 활성을 위하여 조작될 수 있음을 나타내었다. 이러한 수식가능한 분역의 위치는 2원자가의 리간드(bivalent ligand)를 형성하여 결합 공유영역의 상호대칭이 동종이형체(homodimer) 또는 이형이형체(heterodimer)의 머리 대 꼬리의 이형체화(dimerization)로부터 야기되며, 리간드 유도된 수용체 이형체화를 매개한다고 여겨진다. 비록, 기능적으로 연관된 수용체 이형체화가 G 단백질-연관된 수용체를 위하여 개시되어 있지 않으나, 예상된 반응 부위가 아드레날린 수용체의 6번째 세포투과성 분역에 위치되어 있고, 그 부위가 갑상선 자극 호르몬 수용체의 구조적 활성 돌연변이의 "빈번한 부위(hot spot)"가 된다.

따라서, 20개 미만의 돌연변이 시험에 의한 진화적인 측면 및 상동성 비교에 근거한 비교 전략을 사용하여, 갑상선 자극 호르몬 분자의 전체 204개의 아미노산 중에서 단지 7개의 돌연변이를 가지고, 결합 친화력에서 50,000배의 증가를 가지며, 호르몬 역가에서 1,300배의 증가를 보이는 α4K/β3R hTSH 유사체를 확인하였다. 작동상의 특정한 이론에만 국한되지는 않지만, 당단백 호르몬의 진화시에 말단의 루프의 변조가 다양한 계통발생적 단계에서 호르몬 작용을 수식하였을 수도 있다. 수용체반응에서 두 개의 조작된 루프 영역의 상승효과는 호르몬 진화의 다른 단계에서 최적화되는 공간적으로 원거리의 분역에서 조합된 수식이 사람의 단백질 유사체를 조작하기 위한 보편적인 전략을 제공할 수도 있다는 것을 제시한다. 본 명세서에서 개시된 유형의 재조합 유사체는 진화적인 어떠한 단계에서 어떠한 것에서도 나타나지 않는 자연적인 호르몬의 염기성 잔기의 조합을 가지며, 어떠한 종으로부터 얻어진 갑상선 자극 호르몬의 수용체 결합 친화력 또는 활성이 능가한다.

본 발명의 구체적인 다양화는 당업계의 통상을 가진 자에 의하여 제시될 수 있을 것이다. 상술한 상세한 설명은 첨가된 청구항의 범위에 제한되지 않는 발명의 도면, 취지 및 범주에 의하여 자세하게 이해된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

도 2(서열번호 2)에 도시된 β 소단위체의 아미노산 서열 중에서, F1 및 A17로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 하나 또는 그 이상의 염기성 아미노산으로의 아미노산 치환, 및/또는 E6, R13 및 R14로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 하나 또는 그 이상의 극성 아미노산으로의 아미노산 치환을 포함하는, 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone: TSH)의 변이된 β 소단위체.
제 1항에 있어서,

염기성 아미노산으로의 치환은 F1R 및 A17R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 1항에 있어서,

극성 아미노산으로의 치환은 E6N, R13E 및 R14E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 1항에 있어서,

I58, E63 및 L69으로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치에서 하나 또는 그 이상의 염기성 아미노산으로의 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 1항에 있어서,

I58R, E63R 및 L69R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 염기성 아미노산으로의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 1항에 있어서,

β 소단위체가 F1R, E6N 및 A17R의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 1항에 있어서,

β 소단위체가 F1R 및 E6N의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,

정제된 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,

변이된 TSH의 β 소단위체는 도 3(서열번호 3)에 도시된 융모막 생식선자극호르몬(chorionic gonadotropin: CG)의 β 소단위체에서의 카르복시 말단 확장 펩티드(carboxy terminal extension peptide: CTEP)에 연결되는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 9항에 있어서,

변이된 TSH의 β 소단위체는 카르복시 말단이 CG의 CTEP의 아미노 말 단에 공유결합으로 연결된 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 10항에 있어서,

변이된 TSH의 β 소단위체는 CG의 CTEP에 펩티드 결합을 통해 연결된 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 10항에 있어서,

TSH의 β 소단위체와 CG의 CTEP 사이에 공유결합을 형성하도록 이형의 양 기능성(heterobifunctional) 물질이 사용되는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 10항에 있어서,

CG는 사람의 CG인 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 10항에 있어서,

변이된 TSH의 β 소단위체는 야생형 TSH의 β 소단위체에 비해 더 길어진 호르몬적 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 14항에 있어서,

변이된 TSH β 소단위체는 야생형 TSH의 β 소단위체에 비해 생체내 순환시 더 길어진 호르몬적 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
제 10항에 있어서,

CTEP은 도 3(서열번호 4)에 도시된 염기서열에 의하여 암호화되는 것을 특징으로 하는

변이된 β 소단위체.
α 소단위체 및 제 1항의 변이된 β 소단위체를 포함하고, 야생형 TSH 이형이합체보다 더 큰 생물학적 활성을 가지는, 변이된 TSH 이형이합체.
제 17항에 있어서,

염기성 아미노산으로의 치환은 F1R 및 A17R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 17항에 있어서,

극성 아미노산으로의 치환은 E6N, R13E 및 R14E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 17항에 있어서,

I58, E63 및 L69으로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치에서 하나 또는 그 이상의 염기성 아미노산으로의 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 17항에 있어서,

I58R, E63R 및 L69R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 염기성 아미노산으로의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 17항에 있어서,

β 소단위체가 F1R, E6N 및 A17R의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 17항에 있어서,

β 소단위체가 F1R 및 E6N의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 17항에 있어서,

α 소단위체는 도 1(서열번호 1)에 도시된 야생형 α 소단위체인 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 24항에 있어서,

α 소단위체는 사람의 것임을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
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제 17항에 있어서,

TSH의 β 소단위체는 도 3(서열번호 3)에 도시된 CG의 β 소단위체에서의 CTEP에 연결되는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 28항에 있어서,

TSH의 β 소단위체는 카르복시 말단이 CG의 CTEP의 아미노 말단에 공유결합으로 연결된 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 28항에 있어서,

TSH의 β 소단위체는 CG의 CTEP에 펩티드 결합을 통해 연결된 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 28항에 있어서,

TSH의 β 소단위체와 CG의 CTEP 사이에 공유결합을 형성하도록 이형의 양 기능성 물질이 사용되는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 28항에 있어서,

CG는 사람의 CG인 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
제 28항에 있어서,

CTEP은 도 3(서열번호 4)에 도시된 염기서열에 의하여 암호화되는 것을 특징으로 하는

변이된 TSH 이형이합체.
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정제된 제 17항 내지 제 25항 및 제 28항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 변이된 TSH 이형이합체.
제 17항 내지 제 25항 및 제 28항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 변이된 TSH 이형이합체의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 갑상선 저하증의 치료 또는 예방제.
제 17항 내지 제 25항 및 제 28항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 변이된 TSH 이형이합체의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 갑상선암 치료제.
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갑상선암세포에 의한 요오드 섭취를 자극하기에 충분한, 제 17항 내지 제 25항 및 제 28항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 변이된 TSH 이형이합체의 유효량; 및, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 갑상선암 진단학적 조성물.
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제 17항 내지 제 25항 및 제 28항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 변이된 TSH 이형이합체에 대한 항체.
제 54항에 있어서,

항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는

항체.