DD251998A5

DD251998A5 - Verfahren zur Herstellung eines Peptids

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Publication number: DD251998A5
Authority: DD
Publication date: 1987-12-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids. Erfindungsgemaess wird ein Peptid hergestellt, das die Formel (I) aufweist: R1R2R3AlaR5R6R7R8R10R11R12R13LeuR15GlnLeuR18R19R20R21LeuLeuGlnGluR26R27R28ArgY worin R1 ist Tyr, DTyr, Met, Phe, DPhe, Leu, His oder DHis das entweder eine CaMe- oder NaMe-Substitution aufweist oder unsubstituiert ist; worin R2 gleich Ala oder D-Ala ist; R3 ist Asp oder DAsp; R5 ist Ile oder Leu; R6 ist Phe oder Tyr; R7 ist Ser oder Thr; R8 ist Ser, Asn, Thr oder Gln; R9 ist Ala oder Ser; R10 ist Tyr, Phe oder Leu; R11 ist Arg, Orn oder Lys; R12 ist Arg, Orn oder Lys, R13 ist Ile, Leu, Phe oder Val; R15 ist Gly oder Ala; R18 ist Ala oder Ser; R19 ist Ser oder Ala; R20 ist Arg, Orn oder Lys; R21 ist Arg, Orn oder Lys; R26 ist Leu, Ile, Val oder Phe, R27 ist Nle, Nva oder eine natuerliche Aminosaeure; R28 ist Ala, Leu, Asn, Gln oder Ser; und Y ist OH oder NH2; mit der Massgabe, dass wenigstens vier der folgenden Reste R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R15, R18, R19, R20, R21 und R26 verschieden von den Resten sind, die in der entsprechenden Position natuerlicher hGRF auftreten.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit Einfluß auf die Funktion der Hirnanhangdrüse bei Menschen und anderen Lebewesen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hersteilung von Peptiden, die die Freisetzung von Wachstumshormonen durch die Hypophyse beschleunigen. ·

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß hergestellte Peptide enthalten, werden angewandt als Arzneimittel bei Mensch und Tier sowie für diagnostische Zwecke.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Physiologen haben bereits seit längerer Zeit entdeckt, daß der Hypothalamus die Sekretfunktionen der Adenohypophysis mit vom Hypothalamus produzierten speziellen Substanzen steuert, die die Ausscheidung jedes Hypophysenhormons stimulieren oder inhibieren. Im Jahre 1982 wurden Humanpankreatische (Tumor-)freisetzende Faktoren (hpGRF) aus Extrakten humanpankreatischer Tumore extrahiert, gereinigt, bestimmt, synthetisiert und getestet, wobei gefunden wurde, daß sie die Freisetzung von GH durch die Hypophyse beschleunigen. Seit dieser Zeit wurden entsprechende hypothalamische GH-freisetzende Faktoren von anderen Arten Lebewesen und vom Menschen ebenso bestimmt und synthetisiert. Von menschlichen hypothalamischen GRF (hGRF) wurde gefunden, daß er dieselbe Formel wie hpGRF aufweist, nämlich: H—Tyr-Ala-Asp-Ala —Ile-Phe—Thr-Asn —Ser—Tyr—.··

Arg-Arg- Leu-Leu-AIa-Gln-Leu-Äla-Ser-Arg-Arg-Leu' -Leu-Gln-Asp- lie- Met-Ser-Arg- Gin -Gin- GIy- Glu-Ser-Asn -Gin- GIu- Arg- GIy- AIa- Arg- AIa -Arg-Leu -NH₂.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens, mit dem Peptide hergestellt werden können, die die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hypophyse beschleunigen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahrensschritte aufzufinden, welche die Herstellung des gewünschten Peptids ermöglichen.

Erfindungsgemäß wurden synthetische Polypeptide, die Analoge von menschlichem GRF sind, synthetisiert und getestet, die GH von kultivierten Hypophysenzellen freisetzen. Diese Peptide weisen zumindest vier Unterschiede zu den Resten auf, die im natürlichen Hormon zwischen der 5-Position und der 26-Position auftreten.

Die Peptide können auch einen Rest in der 1-Position aufweisen, ausgewählt unter Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, Leu, His und D-His (wobei dieser Rest gegebenenfalls eine Methylsubstitution entweder am alpha-Kohlenstoff oder in der alpha-Aminogruppe aufweisen kann). Diese Peptide können gegebenenfalls D-AIa in der 2-Positioruund/oder D-Asp in der 3-Position haben. Die Peptide weisen vorzugsweise eine Substitution wie Leu, Nie oder Nva für Met in der 27-Position auf.

Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten derartige Analoge, die etwa 29 Reste in der Länge darstellen oder ein nichttoxisches Salz eines dieser, dispergiert in einem pharmazeutisch oder vom tiermedizinischen Standpunkt aus annehmbaren flüssigen oder festen Trägerstoff.

Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können in der klinischen Medizin, sowohl bei Mensch als auch bei Tier, für therapeutische und auch diagnostische Zwecke eingesetzt werden.

Die verwendete Nomenklatur zur Definition der Peptide entspricht der von Schroder & Lubke, „The Peptides", Academic Press (1965), worin in Übereinstimmung mit der üblichen Darstellung die Aminogruppe am N-Terminus links und die Carboxygruppe am C-Terminus rechts erscheint. Unter natürlichen Aminosäuren sind solche üblichen, natürlich auftretenden Aminosäuren zu verstehen, die in Proteinen gefunden werden, wie GIy, Ala, VaI, Leu, He, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, GIu, GIn, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Mit Nie ist Norleucin gemeint und mit Nva Norvalin. Wenn die Aminosäurereste isomere Formen aufweisen, ist es die L-Form der Aminosäure, die dargestellt wird, sofern nichts anderes ausdrücklich genannt wird.

Die Erfindung betrifft synthetische Peptide mit der folgenden Sequenz:

R₁ - R₂-R3-Ala-R₅-R₆-Ji₇-R₈-Rg-Rio-Rn-Ri₂-FIi₃-Leu-R₁₅-GIn-Leu-R,S-R₁₉-R₂₀-R₂I-LeU-Leu-Gin-GIu-R₂₆-R₂₇-R₂S-R₂8-^Ar9-^Y

worin R₁ Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe,.Leu, His oder D-His darstellt, das entweder eine CMe- oder N'Me-Substitution aufweist oder unsubstituiert ist;

R₂ ist AIa oder D-AIa; R₃ ist Asp oder D-Asp; R₅ ist He oder Leu; R₆ ist Phe oder Tyr; R₇ ist Ser oder Thr; R₈ ist Ser, Asn, Thr oder Gin; R₉ ist AIa oder Ser; R₁₀ ist Tyr, Phe oder Leu; R₁₁ ist Arg, Orn oder Lys; R₁₂ ist Arg, Orn oder Lys; R₁₃ ist He, Leu, Phe oder VaI; R₁₅ ist GIy oder Ala; R₁₃ ist AIa oder Ser; R₁₉ ist Ser oder Ala; R₂₀ ist Arg, Om oder Lys.

R₂₁ ist Arg, Orn oder Lys; R₂₆ ist Leu, He, VaI oder Phe; R₂₇ ist Nie, Nva oder eine natürliche Aminosäure; R₂₈ ist AIa, Leu, Asn, GIn oder Ser; und Y ist OH oder NH₂, mit der Maßgabe, daß wenigstens vier der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₅, R₁₈, R₁₉, R₂₀, R₂₁ und R₂₆von den Resten verschieden sind, die in der entsprechenden Position beim natürlichen Molekül auftreten. Bei Ersatz von 4 oder mehr Resten wird vermutet, daß ein verkürztes Analoges gebildet werden kann mit gesteigerter biologischer Potenz gerade ohne einen amidierten C-Terminus.

Die Peptide können durch ein geeignetes Verfahren synthetisiert werden, z. B. allein durch Festphasentechniken, durch teilweise Festphasentechniken, durch Fragmentkondensation oder durch klassische Lösungskupplungen. Es kann auch mit den kürzlich entwickelten rekombinanten DNA-Techniken gearbeitet werden, um ein vollständiges Analoges oder einen Teil eines Analogen herzustellen, uas nur natürliche Aminosäurereste enthält. So sind beispielsweise die Techniken der ausschließlichen Festphasensynthese in „Solid-Phase Peptide Synthesis", Steward und Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969 beschrieben und in der US-PS 4 105 603 vom Ausgabetag 8. August 1978 (VaIe et al.) vertieft. Die klassische Lösungssynthese ist detailliert in dem

Standardwerk „Methoden der Organischen Chemie (Heuben-Weyl), Synthese von Peptiden", E. Wunsch (Hrsg.), 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD beschrieben. Das Syntheseverfahren der Fragmentkondensation ist in der US-PS 3 972 859

(3. August 1976) dargestellt. Andere Synthesen sind in der US-PS 3 842 067 (15. Oktober 1974) und US-PS 3 862 925 (28. Januar 1975) dargestellt.

Bei derartigen chemischen Synthesen ist es üblich, die labilen Seitenkettengruppen verschiedener Aminosäurereste mit geeigneten Schutzgruppen zu schützen, wodurch eine chemische Reaktion an dieser Stelle verhindert wird, bis die Gruppe schließlich entfernt wird. Üblich ist auch der Schutz einer alpha-Aminogruppe an einer Aminosäure oder einem Fragment, während die gesamte Struktureinheit an der Carboxygruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe, um die · nachfolgende Reaktion an diesem Ort stattfinden zu lassen. Dementsprechend ist es üblich, daß als Stufe bei der Synthese eine Zwischenverbindung entsteht, die jeden der Aminosäurereste, angeordnet in seiner gewünschten Sequenz in der Peptidkette aufweist, mit Seitenketten-Schutzgruppen, die mit den entsprechenden Resten verbunden sind.

Ebenso im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sind Zwischenprodukte der Formel:

X'-R₁(XoderX²J-R₂-R₃(X³)-Ala-R_B-R₆(X²)-R₇(X⁴)-R₈(X⁴oderX⁵)-R₉(X⁴l-r?,o(X²)-R„(X^eoderX⁷J-R₁₂(X⁶oder " .

X⁷)-R₁₃-Leu-R₁₅-GIn(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-R₁₉(X⁴)-R₂₀(X⁶ oder X⁷J-R₂₁(X⁶ oder X⁷J-LeU-LeU-GIn(X⁵J-GIu(X³J-R₂₆-R₂₇(X⁸J-R₂₈(X⁴ oder X⁵)-Ar₉(X⁶J₇-X⁵,

worin X¹ entweder Wasserstoff oder eine a-Amino-Schutzgruppe ist. Die a-Amino-Schutzgruppe, die als Xl bezeichnet werden können, sind jene, die aus der Stufensynthese von Polypeptiden bereits gut bekannt sind. Zu diesen Klassen von a-Amino-Schutzgruppen, die als X¹ angesehen werden können, gehören (1) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Z, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (2) aliphatische Urethanschutzgruppen wie t-Butyloxycarbonyl (BOC), Diisopropylmethyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; und (3) Cycloalkyl-Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl. Die bevorzugte a-Amino-Schutzgruppe ist BOC, gerade wenn ein N^aMe-substituierter Rest in der 1 -Stellung eingesetzt ist.

X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Imidazolstickstoff von His, wie Tos.

X² kann eine geeignete Schutzgruppe für die phenolische Hydroxygruppe von Tyr sein, wie Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, TrityJ, BzI, CBZ, 4Br-CBZ und 2,6-Dichlorbenzyl (DCB). Die bevorzugte Schutzgruppe ist 2,6-Dichlorbenzyl (DCB).

X² kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß in dieser Position am Aminosäurerest keine Seitenkettenschutzgruppe vorhanden ist.

X³ ist Wasserstoff oder eine geeignete esterbildende Schutzgruppe für die Carboxygruppe von Asp oder GIu, wie Benzyl (OBzI), 2,6-Dichlorbenzyl, Methyl und Ethyl.

X⁴ kann eine geeignete Schutzgruppe für die Hydroxylgruppen von Thr oder Ser sein, wie Acetyl, Benzoyl, ter.-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, BzI, 2,6-Dichlorbenzyl und CBZ. Die bevorzugte Schutzgruppe ist BzI. X⁴ kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß in dieser Position an der Hydroxylgruppe keine Schutzgruppe vorhanden ist.

X⁵ ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Asn oder GIn. Vorzugsweise ist es Xanthyl (Xan).

X⁶ ist eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arg, wie Nitro, Tos., CBZ, Adamantyloxycarbonyl und BOC, oder es ist Wasserstoff.

X⁷ ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Lys oder Orn. Beispiele für geeignete Seitenkettenamino-Schutzgruppen sind 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (2-CI-Z), Tos, t-Amyloxycarbonyl und BOC.

X⁸ ist Wasserstoff oder eine geeignete Seitenkettenschutzgruppe wie oben generell spezifiziert.

Met kann gegebenenfalls durch Sauerstoff geschützt werden, bleibt jedoch vorzugsweise ungeschützt.

Die Auswahl einer Seitenkettenamino-Schutzgruppe ist nicht kritisch, mit der Ausnahme, daß im allgemeinen eine solche gewählt wird, die nicht während der Entschützung der a-Aminogruppen bei der Synthese entfernt wird.

Allerdings ist für einige Aminosäuren, z. B. für His, ein Schutz nicht allgemein erforderlich, nachdem die Kupplung beendet ist, und die Schutzgruppen können die gleichen sein.

X⁹ ist eine geeignete Schutzgruppe für die C-terminale Carboxygruppe oder ist eine Ankerbindung, die in der Festphasensynthese für die Bindung zu einem festen Harzträger verwendet wird, oder ist des-X⁹, wobei in einem solchen Fall der Arg-Rest am C-Terminus amidiert ist. Wenn ein solcher fester Harzträger verwendet wird, der im weitesten Sinn als Schutzgruppe anzusehen ist, wird ein entsprechender ausgewählt, wie er aus dem Stand derTechnik bekannt ist, z. B. -O-CH₂-Harzträger, -NH-Benzydrylamin(BHA)-Harzträger oder -NH-Paramethylbenzhydrylamin (MBHA)-Harzträger. Wenn ein unsubstituiertes Amid am C-Terminus hergestellt werden soll, ist der Einsatz von BHA- oder MBHA-Harz bevorzugt, da die Spaltung direkt zum Amid führt.

In der Formel für das Zwischenprodukt ist zumindest eine der X-Gruppen eine Schutzgruppe oder X⁹ schließt den Harzträger mit ein.

Somit betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Peptids durch

(a) Bilden eines Peptid-Zwischenproduktes mit zumindest einer Schutzgruppe und der Formel (II)

X¹-R₁(X oder X²)-R₂-R₃(X³)-Aia-R₅-R₆(X²J-R₇(X⁴J-R₈(X⁴ oder X⁵)-R₃(X⁴)-R₁₀(X²)-R„(X⁶ oder X⁷J-R₁₂(X⁶ oder X⁷)-R,3-Leu-R₁₅-Gln(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-R₁₉(X⁴)-R₂₀(X⁶ oder X⁷)-R₂₁(X⁶ oder X⁷)-Leu-Leu-Gln(X⁵)-Glu(X³)-R₂₆-R₂₇(X⁸J-R₂₈(X⁴ oderX⁵)-Arg(X⁶)-X⁹

worin X, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷ und

X⁸ entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe darstellen und X⁹ ist entweder eine Schutzgruppe oder eine Ankerverbindung zu dem Harzträger oder des-X⁹;

(b) Abspalten der Schutzgruppe oder -gruppen oder der Ankerbindung von dem Peptid der Formel (II); und

(c) gewünschtenfalls Umwandeln eines erhaltenen Peptids in dessen nichttoxisches Salz.

Bei der Auswahl einer speziellen Seitenkettenschutzgruppe zum Einsatz in der Peptidsynthese gibt es folgende allgemeine Regeln: (a) die Schutzgruppe behält ihre schützenden Eigenschaften und wird unter Kupplungsbedingungen nicht abgespalten; (b) die Schutzgruppe sollte dem Reagens gegenüber stabil sein und ist, mit Ausnahme von X_3n, vorzugsweiss unter den Reaktionsbedingungen stabil, die für die Entfernung der a-Aminoschutzgruppe bei jedem Syntheseschritt ausgewählt wurden, und (c) die Seitenkettenschutzgruppe muß entfernbar sein nach Abschluß der Synthese mit der gewünschten Aminosäuresequenz, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die die Peptidkette nicht in unerwünschter Weise beeinträchtigt.

Verbindungen dieser Erfindung können auch über die rekombinante DNA-Methodik hergestellt werden. Dabei wird eine Nucleotidsequenz, die für das gewünschte Peptid codiert, unter Verwendung von nunmehr Routineverfahren für derartige Synthesen hergestellt. Zu diesen Methoden gehört allgemein die Herstellung von Oligonucleotiden, die sowohl für die Fragmente der gewünschten Codierungssequenz als auch für deren komplementäre Sequenzen codieren. Die Oligonucleotide sind dazu bestimmt, ein Fragment der Codierungsseq'uenz mit zwei Fragmenten der komplementären Sequenz zu überlappen und umgekehrt. Die Oligonucleotide sind gepaart und miteinander verbunden und produzieren letzten Endes die gewünschte Gensequenz. Die Sequenz wird in einen klonierenden Vektor an einem Ort insertiert, der es gestattet, das Peptidprodukt, für das sie codiert zu exprimieren. Ein geeigneter Klonierungsvektor enthält wenigstens einen Teil einer Expressionssteuerungssequenz eines Gens. Eine typische Expressionssteuerungssequenz kann mit den Begriffen von fünf Elementen beschrieben werden. In der Reihenfolge, in der sie im Gen auftreten, sind dies die folgenden Elemente:

(a) die Promotor-Region;

(b) die 5'-untrans!atierte Region;

(c) die Proteincodierungssequenz; ,

(d) die 3'-untranslatierte Region und

(e) die Endstelle der Transkription.

Die Funktion jedes dieser Elemente in Gensystemen ist festgelegt. Die Promotor-Region vermittelt die Initiierung der Produktion von Boten-RNA (mRNA) (Transkription). Der Promotor kann (1) frei von äußerer Steuerung sein (konstitutiv), (2) unter Steuerung durch einen Repressor stehen, einer Substanz, die bei Vorhandensein die Genfunktion unterdrückt, oder (3) unter Steuerung einer auslösenden Verbindung (Inducer) stehen, einer Substanz, die erforderlich ist, die Genfunktion zu induzieren. Ein äußeres Membranlipoprotein (Ipp)-Gen von E. coli ist beispielsweise frei von äußerer Steuerung und wird daher als „konstitutiv" bezeichnet.

Am oder nahe dem Promotor angeordnet ist die „Transkriptionsinitiierungsstelle", ein Punkt, an dem RNA-Polymerase die Transkription von mRNA initiiert. Ist die Transkription erst einmal initiiert, wird mRNA- produziert. Die Struktur der erhaltenen mRNA wird durch die DNA-Sequenzen der obigen Genelemente (b) bis (d) bestimmt.

Die erhaltene mRNA trägt eine Sequenz, die in ein Proteinprodukt translatierbar ist. Die translatierbare Sequenz ist in Abwärtsrichtung von der 5'-untranslatierten Region angeordnet und in Aufwärtsrichtung von der 3'-untranslatierten Region. Die Translation wird vermittelt durch Binden der Ribosome an eine Sequenz in der mRNA-5'-untranslatierten Region, die als Ribosombindungsstelle bezeichnet wird und wird am Translations-Startcodon (AUG) initiiert, das als das erste Codon der Produktgensequenz auftritt und ebenso für die Aminosäure Methionin (Met) codiert. Die Translation ist'an einem oder mehreren Stopcodons (termination codons) beendet, die am Ende der Translationsregion auftreten.

Mit Hilfe der rekombinanten DNA-Techniken wurde es möglich, Klonierungsvektoren herzustellen, die für die Produktion ausgewählter fremder (exogener) Proteine nützlich sind, durch Insertieren in derartige Vektoren einer Expressionssteuerungssequenz, d. i. eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression struktureller Gene mit der Produktion exogenen Proteins, wenn es operativ mit jenen Genen verbunden ist, steuert und reguliert.

Im Kontext mit dem vorgenannten umfaßt der Begriff „Expressionssteuerungssequenz" Elemente von (a), (b), (d) und (e).

Die rekombinante DNA-Methodik kann eingesetzt werden, um erfindungsgemäße Verbindungen entweder als ein Teil eines größeren „Hybrid"moleküls zu exprimieren oder durch direkte Expression. Bei der direkten Expressionsweise wird der Klonierungsvektor so ausgewählt, daß das Expressionsprodukt vollständig aus dem gewünschten Produkt besteht, dem ein Methioninrest (Met) vorangeht, der sich aus der Anwesenheit des notwendigen Startcodons ergibt. Der überflüssige Met-Rest kann durch Behandlung des Produktes mit Cyanbromid oder mit Phenylisothiocyanat entfernt werden, gefolgt von einer starken Säure wie Trifluoressigsäure.

Bei der Hybridmolekülexpressionsweise wird eine DNA-Sequenz, die für das gewünschte Produkt codiert, in die Expressionssteuerungssequenz eines klonierenden Vektors an einem Punkt insertiert, so daß das exprimierte Produkt ein Hybridprotein umfaßt. Unter dem hier benutzten Begriff „Hybridprotein" wird ein rekombinantes DNA-Produkt verstanden, das ein Fremdprotein enthält, im allgemeinen ein ganzes oder ein Teil des natürlichen (endogenen) Proteins, das durch die Expressionssteuerungssequenz (beispielsweise Lipoprotein im Lipoproteingen) hergestellt wird, an die das gewünschte Protein angefügt ist.

Das korrekt bestimmte Hybridprotein, das mittels rekombinanter DNA-Methodik hergestellt wurde, enthält eine Schnittstelle an der Verbindung des endogenen Proteinteiles mit dem gewünschten Produkt. Die Schnittstelle gestattet die Erzeugung des reifen Produktes durch chemische oder enzymatische Behandlung des Hybridproteinproduktes. Im höchsten Maße nützliche, selektive Schnittstellen bestehen aus einer DNA-Sequenz, die für eine Aminosäure codiert oder für eine Sequenz von Aminosäuren codiert oder für eine Sequenz von Aminosäuren die chemisch oder enzymatisch an ihrem C-Terminal geschnitten (bzw. gespalten) werden können.

Beispiele chemischer Agenzien zum Schneiden von Proteinen sind Cyanbromid, BNPS-skatol', Hydroxylamin und ähnliche Produkte.

Cyanbromid schneidet die Proteine am C-Terminus eines Methioninrestes. Daher ist die selektive Schnittstelle an einem Methioninrest selbst.

Hydroxylamin schneidet am C-Terminus vom Rest-Asn-Q, worin Q GIu, Leu oder AIa ist.

B NPS-skatol schneidet am C-Terminus eines Tryptophanrestes. Für das Schneiden nützliche enzymatische Agenzien sind Beispiele:

Trypsin, Papain, Pepsin, Plasmin, Thrombin, Enterokinase und ähnliche Produkte. Jedes bewirkt einen Schnitt an einer besonderen Aminosäuresequenz, die es wiedererkennt.

Ein Enzym der Wahl ist Enterokinase. Eine bevorzugte Schnittstelle ist daher jene, die Enterokinase erkennt, nämlich eine DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz -(Asp)„-Lys- codiert, wobei η eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist.

Die bevorzugteste selektive Schnittstelle ist ein Methioninrest, da die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise Methionin nicht enthalten. Dieser Rest, gebunden an das N-Terminal des gewünschten Produktes, wird leicht durch die bekannten Verfahren unter Verwendung von Cyanbromid geschnitten, um das gewünschte reife Produkt zu erzeugen.

Gewisse eukaryotische Zellen, z. B. Hefe und Säugetierzellen, sind in der Lage, kleine Peptide durch Synthetisieren eines größeren Precursor-Moleküls herzustellen.'Diese Organismen enthalten hoch spezifische Enzyme, die in der Lage sind, die gewünschten Peptide von dessen Precursor an exakt definierten Schnittstellen abzutrennen. Zu den exaktesten definierten proteolytisch'en Arbeitsstellen gehören gepaarte basische Aminosäurereste. Ein anderes Beispiel derartiger Arbeitsstellen sind die Aminosäuren GIu-AIa oder Asp-Ala. Die meisten hypothalamischen Peptide werden ebenso wie einige Hypophysenhormone in dieser Art hergestellt. Andere Beispiele der Herstellung kleiner Peptide in eukaryotischen Organismen sind der Hefe-alpha-Faktor oder a-Faktor, der kleine Peptide gepaart mit Pheromonen darstellt.

Es sollte möglich sein, synthetische GRF-Analoge verschlüsselnde DNA-Sequenzen an den Precursorteil derartiger proteinverschlüsselnder Sequenzen (oft als Pre-Pro-Segment bezeichnet) anzufügen, unmittelbar benachbart zu und in abwärtiger Richtung von deren normalen proteolytischen Arbeitsstellen. Kulturen eukaryotischer Zellen, die Plasmidelemente tragen, die eine derartige Expressionseinheit enthalten, sollten in der Lage sein, das gewünschte Precursor-Peptidmolekül mit Hilfe des normalen Mechanismus der Genexpression von Wirtszellen zu erzeugen. Darüber hinaus sollten die normalen Zellprozesse für die präzise Entfernung des gewünschten Produktes aus dem Precursormolekül sorgen.

Bei der Konstruktion nützlicher Klonierungsvektoren sind eine Reihe von Elementen erforderlich. Zwei dieser Elemente sind für alle nützlichen Klonierungsvektoren üblich. Erstens muß der Vektor eines DNA-Segment aufweisen, das einen funktionellen Ursprung der Replikation enthält (Replicon). Plasmide und Phagen-DNA enthalten bei ihrer starken Natürlichkeit Replicone, die eine Replication in einer Wirtszelle bewirken.

Zweitens muß der Vektor ein DNA-Segment aufweisen, das einer transformierbaren Wirtszelle eine Eigenschaft verleiht, die für die Auswahl transformierter Zellen aus nichttransformierten Zellen nützlich ist. Beliebige einer Vielzahl von Eigenschaften können für Auswahlzwecke verwendet werden. Eine der üblicherweise am meisten eingesetzten Eigenschaften ist die antibiotische Resistenz, z. B. Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz, insbesondere bei der Transformation von E. coli. Ebenfalls üblicherweise eingesetzt werden die Komplementierung auxotropher Mutanten durch Plasmiderzeugte Kopien des Gens vom Wildtyp, das in der Lage ist, derartige Unzulänglichkeiten zu heilen.

Die beiden vorgenannten Elemente sind im allgemeinen in leicht erhältlichen und bestimmten Klonierungsvektoren vorhanden. Beispiele geeigneter Klonierungsvektoren sind bakterielle Plasmide, wie Plasmide von E. coli, einschließlich pBR 322, pMB 9, Co1E1, pCR1; Plasmide vieler anderer Wirte, einschließlich RP4; Phagen-DNAs wie Lambda und ähnliches. Die meisten, wenn nicht alle der oben gekennzeichneten Vektoren weisen die vorher beschriebenen beiden Elemente schon auf.

Ein drittes Element ist die Expressionssteuerungssequenz. Beliebige einer Vielzahl derartiger Steuerungssequenzen können eingesetzt werden, einschließlich zum Beispiel jene des Lipoproteingens, des ß-Galactosidasegens, des Tryptophangens, des ß-Lactamasegens, des Phagen Lambda und ähnliche.

Bei der Herstellung eines geeigneten Klonierungsvektors durch Insertion der ausgewählten Expressionssteuerungssequenz wird mit Routinemethoden gearbeitet. Es existieren innerhalb des Klonierungsvektors zahlreiche Stellen, an denen Schnitte vorgenommen werden können bei Einsatz einer für diese Stelle spezifischen Restriktionsendonukiease. Für die Insertion der Expressionssteuerungssequenz können beliebige dieser Stellen ausgewählt werden. Als ein Beispiel existieren in dem gut bekannten und beschriebenen Plasmid pBR322 verschiedene geeignete Restriktionsstellen, von denen beliebige als Insertionsstellen benutzt werden können. Eine Pstl-Stelle ist innerhalb des Gens für ß-Lactamase angeordnet. Andere Stellen außerhalb eines speziellen Codierungsbereiches sind EcoRI und Pvull. Diese und andere Stellen sind durch die Fachwelt gut bestimmt worden. Wenn man sich diese oder andere Stellen zunutze macht, kann die Insertion einer Expressionssteuerungssequenz oder dessen wesentlichen Teiles bei der Herstellung von erfindungsgemäß definierten Vektoren leicht verwirklicht werden. Ein viertes Element ist natürlich die für das gewünschte Produkt codierende DNA-Sequenz. Wie vorher bereits festgestellt, wird diese DNA-Sequenz synthetisch unter Verwendung der bekannten Phosphotriester-Methode oder anderen wohlbekannten Methoden konstruiert.

Geeignete Klonierungsvektoren können bei einem großen Bereich von Wirtsorganismen verwendet werden, z. B. gramnegative prokaryotische Organismen wie Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas und ähnliche; grampositive prokaryotische Organismen wie Bacillus, Streptomyces und ähnliche; und eukaryotische Organismen wie Saccharomyces und ähnliche. Wenn der Wirtsorganismus ein gramnegativer prokaryotischer Organismus ist, ist E. coli bevorzugt, beispielsweise ein E. coli Κ-12-Stamm wie RV308. Unter Einsatz der bekannten Methode werden die entsprechend präparierten Klonierungsvektoren verwendet, um die geeigneten Wirtsorganismen zu transformieren, werden in derartigen Organismen amplifiziert, und das exogene Proteinprodukt wird bei Standardfermentierungsbedingungen exprimiert. Das exogene Proteinprodukt wird durch Routineverfahren aus der erhaltenen Fermentationsbrühe isoliert.

Zu einem typischen Verfahrensablauf für die Produktisolierung eines eine Met-Schnittstelle enthaltenden Precursors gehört die Lyophilisierung der das Produkt enthaltenden Zellen. Zu einem Liter 70%iger (V/V) Ameisensäure wurden 10 g lyophilisierte Fermentationsfeststoffe gegeben. Nach Auflösen (etwa 60 Minuten) wurde die Lösung in einer Cyanbromidkonzentration auf 0,1 M eingestellt durch Zugabe von 10,6 g Reagens. Der quantitative Peptidschnitt zum gewünschten Amino-Ternninal-Produkt war in etwa 8 Stunden bei 23⁰C vollständig. Die Ameisensäure wurde durch Eindampfen unter Vakuum entfernt und die geschnittenen Fermentationsfeststoffe wurden lyophilisiert. Die Feststoffe wurden mit 10 g/l in 10%iger (V/V) Essigsäure gelöst und bis zu 5% des Säulenvolumens auf eine G-50 Superfein-Sephadexsäule (2,6 cm χ 100 cm) mit einer Fließrate von 5 cm/Stunde, 4°C, gegeben. Die Reinigung bis zur Homogenität wurde durch Umkehrphase auf einer 0,46 cm χ 25 cm Zorbax-C₈-Säule erreicht unter Einsatz eines linearen Acetonitrilgradienten in 0,1 M Ammoniumphosphat, pH 7,2. Das gewünschte Produkt wurde auf Sephadex G-25 in 0,01 M Ammoniumhydrogencarbonat entsalzt, pH 8,5, und lyophilisiert.

Wenn Peptide nicht unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt werden, so werden sie vorzugsweise mittels Festphasensynthese hergestellt, wie dies allgemein durch Merrifield, 1. Am. Chem. Soc, 85, S. 2149 (1963) beschrieben wurde, obgleich andere äquivalente chemische Synthesen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, ebenso wie die vorgenannten verwendet werden können. Die Festphasensynthese beginnt am C-Terminal des Peptide durch Kupplung einer geschützten a-Aminosäure an ein geeignetes Harz. Ein derartiges Startmaterial kann durch Anknüpfen einer a-Amino-geschützten Aminosäure über eine Esterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hadroxymethylharz hergestellt werden, oder durch eine Amidbindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist von Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38, 1597—98 (1966) beschrieben worden. Chlormethylierte Harze sind im Handel erhältlich. Die Herstellung eines solchen Harzes ist von Stewart et al. in „Festphasenpeptidsynthese" (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois 1984), Kapitel 1, S. 8-9 beschrieben. BHA- und MBHA-Harzträger sind im Handel erhältlich, werden jedoch allgemein nur dann verwendet, wenn das gewünschte Peptid, das synthetisiert werden soll, ein unsubstituiertes Amid am C-Terminal aufweist.

Die C-terminale Aminosäure, d. i. Arg, geschützt durch BOC und durch Tos, kann erst an ein chlormethyliertes Harz gekuppelt werden oder an ein hier beschriebenes BHA- oder MBHA-Harz. Nach dem Kuppeln der BOC-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die a-Aminoschutzgruppe entfernt, wie z. B. mittels Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid oder durch TFA allein. Das Entschützen erfolgt bei einer Temperatur zwischen etwa O⁰C und Zimmertemperatur. Andere Standardreagenzien zum Abspalten, wie HCI in Dioxan, sowie andere Bedingungen für die Entfernung spezieller a-Aminogruppen können angewandt werden, wie in Schroder u. Lubke, „Die Peptide", 1, S. 72-75 (Academie Press 1965) beschrieben.

Nach der Entfernung der a-Aminoschutzgruppe werden die verbliebenen a-Amino- und Seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise in gewünschter Folge gekuppelt, um die anfangs hier definierte Zwischenverbindung zu erhalten oder als Alternative jede Aminosäure getrennt in der Synthese zuzusetzen, wobei einige von ihnen vor der Zugabe zum Festphasenreaktionsgefäß an eine andere gekuppelt werden können. Die Auswahl eines entsprechenden Kupplungsreagens ist dem Fachmann geläufig. Insbesondere geeignet als Kupplungsreagens ist N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI).

Die bei der Festphasensynthese der Peptide verwendeten Aktivierungsr-eagentien sind in der Peptidchemie bekannt. Beispiele geeigneter Aktivierungsreagentien sind Carbodiimide wie Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-djmethyl-aminopropyl)carbodiimid.'Andere Aktivierungsreagentien und ihre Verwendung bei der Peptidkupplung sind von Schroder und Lubke, s. o. in Kapitel III und von Kapoor, I. Phar-Sci. 59, S. 1—27 (1970) beschrieben worden. Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in das Festphasenreaktionsgefäß mit etwa vierfachem oder größerem Überschuß eingebracht, und die Kupplung kann in einem Medium von Dimethylformamid (DMF): CH₂Cl₂(V-I) oder in DMF oder CH₂CI₂ allein durchgeführt werden. In Fällen, wo eine unvollständige Kupplung erfolgt, wurde die Kupplung vor der Entfernung der a-Aminoschutzgruppe wiederholt, bevor die nächste Aminosäure gekuppelt wurde. Der Erfolg der Kupplungsreaktion wird in jedem Stadium des Verfahrens bei manueller Durchführung vorzugsweise über die Ninhydrinreaktion beobachtet, wie von E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben. Die Kupplungsreaktionen können automatisch z. B. auf einem Beckman 990-Syntheseautomaten unter Verwendung eines Programmes, wie das, über das von Rivier et al. in Biopolymeres, 1978,17, S. 1927-1938 berichtet wurde, erfolgen.

Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vervollständigt wurde, kann das Peptid-Zwischenprodukt vom Harzträger durch Behandlung mit einem Reagens, wie Flußsäure in flüssiger Form entfernt werden, wobei das Reagens nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch alle verbliebenen Seitenkettenschutzgruppen X, X², X³, X⁴, X^s, X⁶, X⁷ und X⁸ abspaltet, und ebenso die a-Aminoschutzgruppe X', falls eine verwendet wurde, wobei man das arhidierte Peptid erhält. Sollte Met in der Sequenz auftreten, wird die BOC-Schutzgruppe vorzugsweise zuerst entfernt unter Einsatz von Trifluoressigsäure (TFA)/Ethandiol vor dem Abspalten des Peptids vom Harz mit HF, um eine potentielle S-Alkylierung auszuschließen. Bei Verwendung von Flußsäure zum Abspalten werden Anisol und Methylethylsulfid als Spülmittel im Reaktionsgefäß eingesetzt. ' .

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Beispiel I stellt eine bevorzugte Synthesemethode eines bevorzugten amidierten Peptids über die Festphasentechnik dar. Die Synthese entsprechend anderer Peptide, die in der Länge unterschiedlich sind, kann in gleicher Weise erfolgen durch bloßes Hinzugeben oder Eliminieren der erforderlichen Anzahl Aminosäuren an einem Ende der Kette; allerdings wird gegenwärtig vermutet, daß biologisch aktive Analoge die angegebene Sequenz, der Äquivalente, vom N-Terminal zum Rest 27 aufweisen sollten.

Beispiel I

Die Synthese des Peptids [Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala³-¹⁵·'⁸·²³, Arg¹²·²¹, Leu'³-²⁶'²⁷]-hGRF (1-29)-NH₂ mit der Formel':

H-Tyr-Ala-Asp-Aia-lle-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-.Arg- Arg-Leu-Leu-Ala-GIn-Leu-AIa-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gin-GIu-Leu-Leu-AIa-Arg-NH₂ erfolgte schrittweise unter Verwendung eines Beckmann 990 Peptidsynthetisators auf einem MBHA-Harz mit einem Substitionsbereich von etwa 0,35 bis 0,5 mmol/g Harz. Die Kupplung von BOC-Arg (Tos) an das Harz erfolgte nach dem allgemeinen Verfahren der US-PS 4 292 313 (VaIe) unter Verwendung von KF in DMF bei etwa 60°C über 24 Stunden unter Rühren. Man erhielt eine Substitution von etwa 0,35 rnmol Arg pro Gramm des Harzes.

Nach der Entblockierung und Neutralisation wurde die Peptidkette Schritt für Schritt auf dem Harz aufgebaut. Das Entblockieren, das Neutralisieren und die Zugabe jeder Aminosäure erfolgte in genereller Übereinstimmung mit der Verfahrensweise, die im Detail von Rivier, J. in J. Armer. Chem. Soc, 96, 2986-2992 (1974) beschrieben wurde. Alle Lösungsmittel, die verwendet wurde, waren sorgfältig entgast durch Spülen mit einem Inertgas, ζ. B. Helium oder Stickstoff, um die Anwesenheit von Sauerstoff zu gewährleisten.

Das Entblockieren erfolgte vorzugsweise in Übereinstimmung mit dem folgenden Ablaufschema A

Reagens	Ablaufschema A	Mischzeit (Min.
1. 60% TFA/2 % Ethandithiol		10
2. 60% TFA/2 % Ethandithiol		15
Reagens	Mischzeit (Min.)
3. IPA/1% Ethandithiol	0,5
4. Et₃N (10%) in CH₂CI₂	0,5
5. MeCfH	0,5
6. Et₃N (10%) in CH₂CI₂	0,5
7. MeOH (zweimal)	0,5
8. CH₂CI₂	0,5

Die Kupplungen erfolgten vorzugsweise wie im folgenden Ablaufschema B dargestellt

Ablaufschema B	Mischzeit (Min
Reagens	_
9. DCCI	50-90
10. BOC-Aminosäure	0,5
11. MeOH (zweimal)	0,5
12. CH₂CI₂ (zweimal)	15,0
13. Ac₂O (3M) InCH₂CI₂	0,5
14. CH₂CI₂	0,5
15. MeOH	0,5
16. CH₂CI₂ (zweimal)

Zusammengefaßt: es wurden zwei mmol BOC-geschützter Aminosäure in Methylenchlorid pro Gramm Harz verwendet plus ein Äquivalent 1,0 molarer DCCI in Methylenchlorid über zwei Stunden. Wenn BOC-Arg/Tos) gekuppelt wurde, wurde ein Gemisch von 50%igem DMF und Methylenchlorid eingesetzt. Bzl-Ether wurde verwendet als Hydroxyseitenkettenschutzgruppe für Ser und Thr. Die Amidgruppe von Asn oder GIn wurde durch Xan geschützt, wenn mit der DCC-Kupplung gearbeitet wurde, was bevorzugt war. p-Nitrphenylester (ONp) kann auch verwendet werden, um das Carboxy-Ende von Asn oder GIn zu aktivieren, und beispielsweise kann BOC-Asn (ONp) über Nacht gekuppelt werden unter Einsatz eines Äquivalentes HOBt in einem 50% Gemisch von DMF und Methylen-chlorid, wobei in einem solchen Falle kein DCC hinzugegeben wurde.

2-Chlor-benzyloxycarbonyl (2CI-Z) wurde als Schutzgruppe für die Lys-Seitenkette verwendet. Tos wurde verwendet, die Guanidingruppe von Arg zu schützen und den Imidazolstickstoff von His. Die GIu- oder Asp-Seitenkettencarboxygruppe wurde durch OBzI geschützt. Die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr wurde mit 2,6-Dichlorbenzyl (DCB) geschützt. Am Ende der Synthese erhielt man die folgende Zusammensetzung: ;

BOC-Tyr(X)-Ala-Asp(X³)-Äia-lle-Phe-Ser(X⁴)-Ser(X⁴)-Ala-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Arg(X⁶)-Leu-Leu-Ala-Gln(X^s)-Leu-Ala-Ser(X⁴)-Arg(X⁶)-Arg(X⁶)-Leu-Leu-Gln(X⁵)-Glu(X³)-Leu-Leu-Ala-Arg(X⁶)-X⁹, worin X ist Tos, X² ist DCB, X³ ist OBzI, X⁵ ist Xan, X⁶ ist Tos und X⁹ ist -NH-Harzträger und X⁴ ist BzI. .

Xan kann teilweise oder vollständig durch die TFA-Behandlung entfernt worden sein, die zur Deblockierung der a-Aminoschutzgruppe erforderlich war. .

Um das geschützte Peptidharz abzuspalten und zu entschützen, wurde es mit 1,5 ml Anisol, 0,5 ml Methylethylsulfid und 15 ml Flußsäure (HF) pro Gramm Peptidharz bei -20°C über eine halbe Stunde und bei 0°C über eine halbe Stunde behandelt. Nach Entfernung von HF unter Hochvakuum wurde der Harz-Peptidrest nacheinander mit trockenem Diethylether und Chloroform gewaschen und das Peptid dann mit entgaster 2N wäßrigen Essigsäure extrahiert und vom Harz durch Filtration abgetrennt. Das abgespaltene und entschützte Peptid wurde dann in 0,5%iger Essigsäure aufgelöst und einer Reinigung unterworfen, wozu auch eine Sephadex G-50 Feingelb-Filtration gehörte.

Das Peptid wurde dann weiter gereinigt durch präparative oder halbpräparative HPLC, wie von Rivier et al. in „Peptide: Struktur und biologische Funktion", (1979), S. 125-128 und von Marki et al. in J. Am. Chem. Soc, 103, 3178 (1981) beschrieben. Von Waters Assogiates ausgerüstete prep LC-500 Hülsen wurden mit 15-20 μ C₁₈ - Silicagel von Vydac (300 A) gefüllt. Ein CH₃CN-Gradient in TEAP wurde mittels eines Niederdruck-Eldex-Gadientenherstellers erzeugt, wie von Rivier, J., in J. Liq. Chromatography 1, 343-367 (1978) beschrieben. Die chromatografischen Fraktionen wurden sorgfältig durch HPLC beobachtet, und es wurden nur die Fraktionen gesammelt, die im wesentlichen rein waren. Das Entsalzen der gereinigten Fraktionen, die unabhängig auf ihre Reinheit geprüft wurden, erreichte man durch Verwendung eines CH₃CN-Gradienten in 0,1 % TFA. Der Mittelschnitt wurde dann lyophilisiert, um das gewünschte Peptid zu erhalten, dessen Reinheit größer als 98% sein kann.

Beispiel 11

Die Synthese eines Peptids mit der gleichen Sequenz, jedoch in Form der freien Säure, d. i. [Ser⁷·⁸¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹, _Leui3,26,27]__hGRp (1_29)-OH mit der Formel:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-

Arg-Leu-Leu-Ala-Gin-Leu-AIa-Ser-A^rg-A^rg-Leu-Leu-Gin-GIu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH erfolgt schrittweise unter

Verwendung eines Beckman 990-p Peptidsynthetisators auf einem chlormethylierten Harz mit einem Substitutionsbereich von etwa 0,35 bis 0,5 mmol/g Harz. Die Kupplung von BOC-Arg(Tos) an das Harz erfolgte durch das allgemeine Verfahren, das von Monhan et al. in Biopolymers 12 (1973) S. 2513-2519 beschrieben wurde, unter Verwendung von Methylenchlorid als Lösungsmittel für zwei Stunden unter Rühren plus ein Äquivalent von 2M DCCI in Methylenchlorid, was zu einer Substitution von etwa 0,35 mmol Arg pro Gramm Harz führt. Der restliche Ablauf der Synthese erfolgte wie im Beispiel I einschließlich der Abspaltung, des Entschützens und der Reinigung.

Das Peptid wurde nach TLC und HPLC als im wesentlichen rein befunden.

Beispiel 111

Die Synthese des gleichen Peptids, das in Beispiel Il synthetisiert wurde, wurde mittels rekombinanter DNA-Technologie durchgeführt.

Das 1,7 Kb EcoRI-Fragment, das das alpha-Faktor strukturelle Gen verschlüsselt, wie von Kurjan und Herskowitz beschrieben (Cell 30: 933-943, Okt. 1982), wurde in pB R322 subkloniert, so daß sich das alpha-Faktor strukturelle Gen in gleicher Orientierung befand wie das Tetracycli-Resistenzgen. Dieses Plasmid wurde mit Ball abgebaut und wieder ringgeschlossen, das erhaltene Plasmid enthielt den alpha-Faktor Promoter, die pre-pro-Peptid-codierende Sequenz und einen Teil des 13 Aminosäure-reifen alpha-Faktorpeptids. Dieses Plasmid wurde weiter modifiziert durch Insertieren eines BamHI-Linkers in die einzige Pvull-stelle dieses Vektors, wodurch eine Stelle für die Insertierung der GRF-Analogen verschlüsselnden Sequenz gebildet wurde.

Die folgende Nucleotidsequenz (sinngemäßer Strang) wurde für das in Beispiel Il beschriebene GRF-Analoge ausgewählt:

TAT GCT GAC GCT ATT TTC TCC TCC GCC TAT AGA AGA CTT CTT GCT CAG CTT GCC TCC AGA AGA CTC CTC CAA GAA CTT CTT GCT AGG TAG.

Dazu gehört der TAG-Terminalcode an ihrem 3'-Ende. Diese DNA-Sequenz zusammen mit deren gegensinnigen Strang wurde nach Verfahren des Standes der Technik synthetisiert. Um diese Sequenz mit dem Expressionsvektor kompatibel zu machen, wurde die folgende Sequenz, die für einen Teil des alpha-Faktorpeptids und Arbeitsstellen codiert, zum 5'-Ende des sinngemäßen Stranges des GRF-Analogen gegeben: CCAACCAATGTACAAAAGG.

Der gegensinnige Strang besteht aus dem genauen Komplement zu sowohl diesem Oligo- als auch dem GRF-Analogen; er enthält jedoch einen BamHI-Überhang an seinem 5'-Ende.

Der wie oben beschrieben hergestellte Vektor wurde dann mit BamHI und Ball geschnitten, und das synthetische Gen wurde insertiert, wodurch ein Vektor mit den folgenden Merkmalen entstand. Er enthält den alpha-Faktor Promoter und die pre-pro-Sequenz, ebenso wie eine alpha-Faktor-peptidverschlüsselnde Sequenz. Dieser peptidverschlüsselnden Sequenz folgt die Sequenz für Lys-Arg. die die proteolytische Abspaltung des GRF-Analogen vom alpha-Faktorpeptid signalisiert. Das GRF-Analoge, das das Translationsstop enthält, ist nach der Lys-Arg-Sequenz angeordnet.

Die Expressionseinheit des GRF-Analogen wurde präzise aus diesem Vektor mittels Abbau mit BamHI und BgIII herausgeschnitten, und das Fragment wurde aus einem 6%igen Acrylamidgel durch Elektroeluierung isoliert und. phenolextrahiert und ethanolgefallt. Annähernd 20 ng dieses Fragments wurden unter Standardbedingungen ligiert an 6 ng eines entphosphorylierten BamHI-Abbaus eines geeigneten Hefezubringervektors, vorzugsweise einem der auf pBR322 basierte, in den hefespezifizierte Sequenzen isertiert worden waren, z. B. der Expressionsvektor TRP209, der detailliert in der US-Patentanmeldung 747 152 vom 20. Juni 1985 (Thill et al.) beschrieben wird, auf deren Offenbarung hier Bezug genommen wird. Dieses Produkt wurde dann dazu verwendet, den E. coli Stamm MC1061 zur Ampicillinresistenz zu transformieren.

Die Transformanten wurden durch Xbal-Abbau von Minilysaten analysiert. Jene mit der korrekten Orientierung, d. i. dem 3'-Ende des Gens als nächstes zum Transkriptionsterminator, wurden durch Identifizierung diagnostischer Restriktionsfragmente im Verhältnis zu Standards mit bekannter Molekularmasse ausgewählt. Der erhaltene Hefeexpressionsvektor trägt das Wildtyp TRP1-Geri für die Selektion in Hefe un den Replikationsursprung vom endogenen Hefeplasmid^-Ring. Er wurde dazu verwendet, einen Tryptophan-erfordernden Saccharomyces-Stamm, wie GG100-14D (ATCC 20762) zur Prototrophie zu transformieren. Darüber hinaus trägt er die Expressionskassette, die den vorher beschriebenen alpha-Faktor Promoter, die pre-pro-Region, das alpha-Faktorpeptid, Arbeitsstellen, das GRF-Analoge und den alpha-Faktor-Transkriptionsterminator enthält. Positive Transformanten wurden mit Hilfe von Standardtechniken erzeugt und wuchsen in synthetischen Medien unter Tryptophanmangel ansatzweise oder in kontinuierlicher Kultur. Immunoreaktive GRF-Analoge wurden im Wachstumsmedium über RIA ermittelt. Die Analyse zeigte, daß das 29-Aminosäurepeptid mit freier Säure am C-Terminal produziert worden war.

Beispiel IV

Die Festphasensynthese der folgenden hGRF-Analogen wird nach Verfahren ausgeführt, die allgemein in den Beispielen 1 und Il beschrieben wird:

[His¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·'⁵·¹⁸·²⁸, Arg'²·²¹,

Leu¹³-²⁶-²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷·⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,

Leu¹³²⁶Aia²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁸·¹⁹, Ala³·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,

LeU¹³^-²⁷I-HGRF(I-29)-NH₂; [Ser⁷·¹⁹, Gin⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,

Leu¹³-²⁶·²⁷] -hGRF(1 -29)- NH₂; [Phe¹, Leu⁵-¹³-²⁶·²⁷, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala¹⁵·¹⁸·²⁸,

Arg¹²-²¹]-hGRF(1-29)-NH₂; [Ser⁷·⁸·¹⁹-²⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸, Phe¹⁰, Arg¹²·²¹,

[His¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Om¹²,

Arg¹²·²¹, Leu¹³-²⁷, Val²⁶]-hGRF(1-29)-OH; [Leu⁵·¹³·²⁶, Ser⁷·¹⁹, Ala⁹·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,

Nle²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷·¹⁹, ThH*, Ala⁹-¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg²¹,

Leu¹³-²⁶-²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷·⁸-¹⁹, Ala⁹·¹⁵·²⁸, Arg¹²·²¹,

Leu^iW7]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, SER⁷-⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹, He¹³

Leu²⁶'²⁷]-hGRF(1-29)-NH,; [His¹, Tyr⁶, Ser⁷·⁸-¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸-²⁸, Arg¹², ^_ Phe¹³, Leu²⁶]-hGRF(1-29)-0H;

[D-Asp², Ser™¹⁹, AIa⁹^²⁸, Arg¹²-²¹,

Leu¹³-²⁶, Nle²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [D-Phe¹, Ser⁷·⁸, AIa⁹-¹⁵-²⁸, Arg¹²-²¹,

Leu¹³·²⁶, Nva²⁷]^hGRF(1-29)-NH₂; [D-His¹, D-Asp³, Ser⁷·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Argi2_r Leui3,26_{( N}le27, Orn2i]-hGRF(1-29)-NH₂; [Na Me-D-Tyr¹, Ser⁷.8,19, Ala⁹'¹⁸.²⁸,Orn¹¹, Argiz.21, Leuis.26, He27]-hGRF(1-29)-NH₂;

Leu26,27]_hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷-⁸, AIa⁹-¹⁵-²⁸, Arg¹²,

Leu¹³·²⁶-²⁷, Orn²⁰-²¹]-hGRF(-29)-NH₂; [Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸-²⁸, Leu¹⁰·¹³, Arg¹²·²¹,

Phe²⁶, Glu²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂;

[CMe-Tyr¹, Ser⁷·⁸.·¹⁹, Ala³·'⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,

Leu¹³·²⁶, Orn²⁰, Asp²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [Leu¹·¹³, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,

He^2M7]-hGRF(1-29)-OH; [N^aMe-Met', Ser⁷·¹⁹, Thr⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Lys¹¹,

Arg¹²·²¹, Leu'ww'l-hGRFil-aai-NHj; [Ser⁷·⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸, Arg¹²·²¹, -

Leu¹³·²⁶·²⁷, Asn²⁸] -hGRF( 1 -29)-NH₂; [N³Me-HiS¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Phe¹⁰, Ala¹⁵·¹⁸·²⁸,

Orn¹²·²¹, Leu¹³·²⁶, Lys²⁰, Gln²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [C³Me-HiS¹, Ser⁷·¹⁹, Gin⁸, Ala⁹·¹⁵·¹³·²⁸, Orn¹¹,

Arg¹²·²¹, Leu¹³·²⁶, TrP²⁷J-HGRF(I^g)-OH; [His¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·

Leu¹³·²⁶, Lys²⁰, Tyr²⁷]-HGRF(I^)-N H₂;

Von diesen Analogen wurde bestätigt, daß sie nach TLC und HPLC im wesentlichen rein waren.

Von diesen synthetischen Peptiden wurde gefunden, daß sie - durch Vergleich mit synthetischen hGRF(1-40)-OH - etwa die gleiche und oftmals größere Wirksamkeiten hinsichtlich der GH-Sekretion zeigten. Als ein Testbeispiel für die Wirksamkeit des synthetischen Peptids von Beispiel I, die Freisetzung von Wachstumshormonen zu beschleunigen, wurden in vitro Assays unter Verwendung von synthetischer hGRF(1-40)-OH als Standard im Nebeneinander-Vergleich mit äquimolaren Konzentrationen von verschiedenen anderen synthetisierten Analogen und Fragmenten durchgeführt. Es wurden Kulturen verwendet, die Zellen von Rattenhypophysen enthielten, die vier Tage vor dem Test entfernt worden waren. Kulturen, die als optimal für die Sekretion von Wachstumshormon betrachtet wurden, wurden für den Vergleichstest eingesetzt, der ganz allgemein von VaIe et al. in Endocrindogy, 91, 562-572 (1972) beschrieben wurde und detaillierter von VaIe et al. in Endocrindogy, 112, 1553-1555 (1983). Die zu testende Substanz wurde vier Stunden inkubiert, und Aliquote des Kulturmediums wurden entfernt und behandelt, um ihren entsprechenden Gehalt an immunoreaktiver GH(ir GH) über eine charakteristische Immunoassay zu messen. Die Ergebnisse dieses Vergleichstests unter Verwendung äquimolarer Konzentrationen zeigen, daß die Peptide der Beispiele I und Il eine Wirksamkeit aufwiesen, die der des hpGRF(1—4O)-OH Standards äquivalent ist. Derartige synthetische hpGRF-Analoge sollten für Anwendungen am Menschen nützlich sein, bei denen ein Arzt die GH-Produktion anheben will, und sie sollten natürlicher hpGRF vorzuziehen sein. Die Festphasensynthese dieser Analoge ist leichter als die Synthese des natürlichen Moleküls, wegen der kürzeren Länge des hpGRF-Analogpeptids. Darüber hinaus kann die geordnetere Struktur, die in den Analogen gefunden wurde, zu stabileren Peptiden führen, wodurch deren Reinigung leichter wird. Die Stimulierung der GH-Sekretion durch derartige Analoge ist bei Patienten von Interesse, die völligen oder relativen GH-Mangel aufweisen, hervorgerufen durch Unterproduktion endogener GRF. Darüber hinaus ist zu vermuten, daß eine steigende GH-Sekretion und deren davon abhängiges steigendes Wachstum bei Menschen oder Tieren mit normalen GH-Spiegeln erreicht werden kann. Weiterhin sollte die Verabreichung den Körperfettgehalt ändern und andere GH-abhängige metabolische, immunologische und Entwicklungsprozesse modifizieren. Beispielsweise können diese Analoge als Mittel zur Stimulierung anabolischer Prozesse beim Menschen unter Begleitumständen nützlich sein, wie siez. B. bei Verbrennungen eintreten. Als ein anderes Beispiel können diese Analoge warmblütigen Nutztieren verabreicht werden, wie Hühnern, Truthühnern, Schweinen, Ziegen, Rindern und Schafen, und sie können in der Aquokultur zur Aufzucht von Fischen und anderen kaltblütigen Seelebewesen, z. B. Seeschildkröten und Aalen sowie Amphibien verabreicht werden, um das Wachstum zu beschleunigen und das Verhältnis von Protein zu Fett zu steigern, was durch Verfütterung wirksamer Mengen der Peptide erreicht wird.

Für die Verabreichung am Menschen sollten diese synthetischen Peptide eine Reinheit von wenigstens etwa 93% und vorzugsweise von wenigstens 98% haben. Die Reinheit für die Zweckadieser Anwendung bezieht sich auf das ausgewählte Peptid und macht den festgestellten (Masse-)Prozentsatz aller vorhandenen Peptide und Peptidfragmente aus. Für die Verabreichung derartiger synthetischer Peptide an Nutz- und andere Tiere, um deren Wachstum zu beschleunigen und den Fettgehalt zu reduzieren, kann eine Reinheit von weniger als 5% oder noch von 0,01 % annehmbar sein.

Diese synthetischen Peptide oder deren riichttoxische Salze, kombiniert mit einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung können an Lebewesen, einschließlich Menschen verabreicht werden, entweder intravenös, subkutan!, inframuskulär, perkutan z. B. intranasal oder eben oral. Die Verabreichung kann durch einen Arzt erfolgen, um die Freisetzung von GH zu stimulieren, in den Fällen, wo ein Patient eine solche therapeutische Behandlung benötigt. Die erforderliche Dosis hängt von den besonderen zu behandelnden Bedingungen ab, von der Schwierigkeit des Zustandes und von der Dauer der gewünschten Behandlung.

Derartige Peptide werden oft in Form von nichttoxischen Salzen verabreicht, wie Säureadditionssalze oder Metallkomplexe, z. B. mit Zink, Eisen oder ähnlichem (die als Salze für die Zwecke dieser Anmeldung angesehen werden). Beispiele für derartige Säureadditionssalze sind das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat und ähnliche. Wenn der aktive Bestandteil oral in Tablettenform zu verabreichen ist, kann die Tablette ein Bindemittel enthalten, wie Tragant, Maisstärke oder Gelatine; ein Verteilungsmittel wie Alginsäure; und ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat. Falls die Verabreichung in flüssiger Form wünschenswert ist, kann ein Süßungs- und/oder Geschmacksstoff verwendet.werden. Die intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Salzlösung, Phosphatpufferlösungen oder ähnlichem erfolgen.

Die Peptide sollten beim Menschen unter ärztlicher Aufsicht verabreicht werden, und pharmazeutische Zusammensetzungen werden üblicherweise das Peptid in Verbindung mit einem konventionellen festen oder flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten. Üblicherweise wird die parenterale Dosis zwischen etwa 100 Nanogramm bis etwa 50 Mikrogramm Peptid pro Kilogramm Körpermasse des zu Behandelnden liegen.

Obgleich die Erfindung im Hinblick auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, insbesondere Beispiel I und II, die die beste, den Erfindern gegenwärtig bekannte Art darstellten, sollte klar sein, daß zahlreiche Änderungen und Modifikationen für den auf dem Fachgebiet tätigen Fachmann naheliegend sind, ohne vom Schutzbereich der Erfindung, wie sie in den folgenden Ansprüchen dargelegt ist, abzuweichen. Beispielsweise können Modifikationen in der Peptidkette, insbesondere Weglassen eines oder zweier Reste erfolgen, beginnend am C-Terminal des Peptids, in Übereinstimmung mit bisher bekannten experimentellen Praktiken, um zu Peptiden zu gelangen, die sehr wesentliche Teile der biologischen Potenz des Peptids aufweisen. Solche Peptide sind als innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung liegend anzusehen.

Darüber hinaus können am C-Terminal Zusätze angefügt werden und /oder allgemein äquivalente Reste können für natürlich auftretende Reste substituiert werden, wie das. in der Peptidchemie allgemein üblich ist, um beispielsweise andere Analoge mit erhöhter Resistenz gegen Proteolyse herzustellen, und auch um wenigstens einen wesentlichen Teil der Wirksamkeit des beanspruchten Polypeptide zu erhalten, ohne dabei vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie das im Beispiel IV erläutert wurde. Desgleichen können bekannte Substitutionen im Carboxylrest am C-Terminal, z. B. ein niederes Alkylamid, ebenfalls zu äquivalenten Molekülen führen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel (I)

R₁-R₂-R₃-AIa-R₅-R₆-R₇-R₈-R₁O-RiI-R₁₂-R₁₃-LeU-R₁₅-GIn-LeU-R₁₈-R₁₉-R₂O-R₂I-LeU-LeU-QJ^_G|_U_R₂₆_R₂₇_R_?S—Arg— Y worin RiistTyoD-Tyr.Met/Phe.D-Phe^ei^His oder D-His das entweder eine C^aMe- oder N³Me-Substitution aufweist oder unsubstituiert ist; worin R₂ gleich AIa oder D-AIa ist;

R₃ ist Asp oder D-Asp; R₅ ist He oder Leu; R₆ ist Phe oder Tyr; R₇ ist Ser oder Thr; R₈ ist Ser, Asn, Thr oder Gin; R₉ ist AIa oder Ser; R₁₀ ist Tyr, Phe oder Leu; R_n ist Arg, Om oder Lys; R₁₂ ist Arg, Orn oder Lys; R₁₃ ist He, Leu, Phe oder VaI; R₁₅ ist GIy oder Ala; R₁₈ ist AIa oder Ser; R₁₉JSt Ser oder Ala; R₂₀ ist Arg, Om oder Lys; R₂₁ ist Arg, Om oder Lys; R₂₆ ist Leu, lie, VaI oder Phe, R₂₇ ist Nie, Nva oder eine natürliche Aminosäure; R₂₈ ist AIa, Leu, Asn, GIn oder Ser; und Y ist OH oder NH₂; mit der Maßgabe, daß wenigstens vier der folgenden Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, Rn, Ri₂, R13, Ri₅, Ri₈, R₁₉, R₂₀, R₂i und R₂₆ verschieden von den Resten sind, die in der entsprechenden Position natürlicher hGRF auftreten, gekennzeichnet durch entweder (A) die Schritte

(a) Bilden eines Peptidzwischenprcduktes mit wenigstens einer Schutzgruppe und der Formel (II) X'-R,(X oder X²)-R₂-R₃(X³)-Ala-R₅-R₆(X²)-R₇(X⁴)-R₈(X⁴ oder X⁵)-R₉(X⁴)-R,o(X²)-Rii(X⁶ oder X⁷)-R₁₂(X⁶ oder X⁷)-R,₃-Leu-R₁₅-Gln(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-R₁₉(X⁴)-R₂₀(X⁶ oder X⁷)-R₂₁(X⁶ oder X⁷)-Leu-Leu-Gln(X⁵)-Glu(X³)-R₂₆-R₂₇(X⁸)-R₂₈(X⁴ oder X⁵)-Arg(X⁶)-X⁹, worin X, X¹, X², X³, X⁴, X^s, X⁶, X⁷ und X⁸ jeweils entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe darstellen und X⁹ ist entweder eine Schutzgruppe oder eine Ankerbindung zum Harzträger oder des -X⁹;

(c) gewünschtenfalls Umwandeln eines erhaltenen Peptids in ein nichttoxisches Salz davon; oder (B) die Schritte zum Erhalten einer DNA-Kette, die ein Peptid der Formel (I) verschlüsselt, Insertieren der DNA-Kette in einen Klonierungsvektor in genauer Beziehung zu DNA-Sequenzen, die die Expression des verschlüsselten Peptids starten, Transformieren eines Organismus oder einer Zellinie mit dem Klonierungsvektor, der die insertierte DNA-Kette enthält, Kultivieren des transformierten Organismus oder der Zellinie und Erhalten des dadurch produzierten Peptids.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Kette durch schrittweise Konstruktion des Oligonucleotids mit überlappenden Komplementärsequenzen synthetisiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein prokaryotischer ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus oder die Zellinie ein(e) eukaryotische ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X¹ Wasserstoff oder eine a-Amino-Schutzgruppe ist; X² ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr; X³ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Carboxygruppe von Asp oder GIu; X⁴ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser oder Thr; X⁵ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Seitenkettenamidogruppe von Asn oder Gin; X⁶ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arg; X⁷ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Lys oder Orn; X⁸ ist Wasserstoff oder eine geeignete Seitenkettenschutzgruppe; X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Imidazolstickstoff von His; und X⁹ ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus OH, Amide, -O-CH₂-Harzträger und -NH-Harzträger.

6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid die Formel aufweist H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-

-Leu-Gln-Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH und worin X¹ gleich BOC ist, X² ist 2,6-Dichlorbenzyl, X³ ist OBzI, X⁴ ist BzI, X⁵ ist Xan, X⁶ ist Tos und X^s ist -O-CHj-Harzträger.

7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Formel (I) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr- Arg-

,,-Arg-Leu-Leu-Ala-GIn-Leu-AIa-Ser-Arg-Leu-Leu-Gin-GIu-Leu-Leu-AIa-Arg-N H₂ ist, worin X¹ gleich BOC ist, X² ist 2,6-Dichlorbenzyl, X³ ist OBzI, X⁴ ist BzI, X^B ist Xan, X⁶ ist Tos und X⁹ ist -NH₂-Harzträger.