ES2273335T3 - Uso de un anticuerpo no neutralizante especifico para la subunidad beta de la hormona luteinizante para aumentar la fertilidad. - Google Patents
Uso de un anticuerpo no neutralizante especifico para la subunidad beta de la hormona luteinizante para aumentar la fertilidad. Download PDFInfo
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Abstract
METODO PARA MEJORAR LA FERTILIDAD MEDIANTE LA REDUCCION DE LA ACTIVIDAD Y/O NIVELES DE CIRCULACION DE HORMONAS DE GLICOPROTEINA QUE TIENEN ACTIVIDAD LUTROPINICA (LH). LAS MOLECULAS AQUI REFERIDAS SON ANTICUERPOS U OTROS AGENTES DE UNION QUE REDUCEN LAS ACTIVIDADES BIOLOGICAS DE LH. TAMBIEN SE APORTAN NUEVOS METODOS PARA DESARROLLAR Y/O SELECCIONAR ANTICUERPOS EN PARTES ESPECIFICAS DE PROTEINAS ENTRE LAS QUE SE INCLUYEN LH Y GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (HCH) PARA PODER REDUCIR SU ACTIVIDAD BIOLOGICA A NIVELES DESEABLES. TAMBIEN SE HACE REFERENCIA A LA PREPARACION DE UNA SOLA SUBUNIDAD DE GONADOTROPINAS Y ANTAGONISTAS DE GONADOTROPINA PARA SU USO EN LA ESTIMULACION E INHIBICION DE LA FERTILIDAD Y PARA CONTROLAR LA HIPERESTIMULACION OVARICA. SE TRATA FUNDAMENTALMENTE DE UN METODO PARA ESTIMULAR LA FERTILIDAD EN LOS MAMIFEROS REDUCIENDO LA ACTIVIDAD DE LAS HORMONAS DE GLICOPROTEINA QUE TIENEN ACTIVIDAD HORMONAL LUTEINIZANTE EN CIRCULACION Y DE ESTE MODO ESTIMULAR LA PRODUCCION DE LA HORMONAESTIMULADORA DEL FOLICULO MEDIANTE LO QUE SUPONE LA ADMINISTRACION EN CANTIDAD EFECTIVA TERAPEUTICAMENTE A UN MAMIFERO DE UN AGENTE DE UNION PARA LIGAR LA HORMONA LUTEINIZANTE.
Description
Uso de un anticuerpo no neutralizante específico
para la subunidad \beta de la hormona luteinizante para aumentar
la fertilidad.
La presente invención se refiere al uso de un
anticuerpo no neutralizante que se une a la subunidad \beta de la
hormona luteinizante y disminuye pero no elimina la actividad de
hormonas glicoproteicas sobre el receptor para la hormona
luteinizante incluso cuando está en una concentración en la que se
une a la totalidad de dicha hormona glicoproteica presente, en la
preparación de una composición farmacéutica para estimular la
fertilidad en mamíferos hembras estimulando la producción de la
hormona estimulante del folículo.
A las divulgaciones aquí citadas para ilustrar
los antecedentes de la invención y para proporcionar detalles
adicionales con respecto a su práctica, por comodidad, se les ha
asignado una referencia numérica en el texto que viene a
continuación y aparecen agrupadas respectivamente en la bibliografía
adjunta.
La familia de hormonas glicoproteicas (1)
consiste en tres glicoproteínas
\alpha,\beta-heterodiméricas que se han
encontrado en la adenohipófisis en donde se fabrican. Las hormonas
glicoproteicas son la hormona luteinizante (también conocida como
lutropina o LH), la hormona estimulante del folículo (folitropina o
FSH) y la hormona estimulante del tiroides (también conocida como
tirotropina o TSH). Estas hormonas, procedentes de seres humanos, se
conocen como hLH, hFSH y hTSH respectivamente. En algunas especies,
una hormona glicoproteica estructuralmente similar a la LH,
denominada gonadotropina coriónica o CG, se fabrica en la placenta y
se libera en la circulación. En seres humanos, esta hormona
glicoproteica se denomina hCG. En primates, se han encontrado
también cantidades significativas de todas estas hormonas en forma
de productos de excreción en orina. Después de la menopausia, cuando
la secreción de LH y FSH por la adenohipófisis está enormemente
incrementada, se encuentran cantidades significativas de LH y FSH en
la orina. Los extractos de orina que contienen gonadotropinas
procedentes de mujeres menopáusicas se denominan gonadotropinas
menopaúsicas humanas (hMG). A diferencia de la hCG, que interacciona
al igual que la LH con los receptores para LH pero que interacciona
sólo débilmente con los receptores para FSH, la hMG interacciona
tanto con receptores para LH como con receptores para FSH. Esta
actividad dual de la hMG se debe a la presencia de hLH, hFSH y sus
metabolitos en el extracto de orina. Las orinas procedentes de
mujeres embarazadas y de mujeres menopáusicas son las principales
fuentes de actividades de gonadotropina y presentan importantes usos
comerciales.
Las gonadotropinas tales como FSH, LH y, en
algunas especies, CG, desempeñan un papel importante en el proceso
reproductivo (1-6), mientras que la hormona TSH,
estructuralmente relacionada, es importante para la función tiroidea
(1). Tanto la LH como la FSH son esenciales para la pubertad y para
la función reproductora normal. La deficiencia de FSH, LH o hCG en
momentos adecuados, produce esterilidad o la terminación de un
embarazo. Cantidades excesivas de estas hormonas pueden producir una
pubertad prematura o una hiperestimulación de las gónadas. En el
macho, la FSH es esencial para el inicio y mantenimiento de la
espermatogénesis (7, 8). La inmunoneutralización de FSH da lugar a
una disminución de la espermatogénesis y a una pérdida de
fertilidad. En la hembra, la FSH es esencial para el desarrollo
folicular que da lugar a la producción del gameto femenino en la
ovulación. La enfermedad ovárica poliquística es una causa común de
esterilidad en mujeres y es un estado caracterizado por un
desarrollo folicular incompleto. Normalmente la fertilidad se puede
restablecer con la administración de FSH o hMG. La fertilidad
también se puede restablecer muchas veces mediante tratamientos con
antiestrógenos, compuestos que inhiben el efecto de retroinhibición
de los estrógenos sobre la secreción de FSH permitiendo de esta
manera que los niveles de FSH suban. En los machos, la LH se
requiere para la pubertad y, en su ausencia, se produce un defecto
en la adquisición de los atributos sexuales y la fertilidad de un
adulto. La LH es sobre todo responsable de la síntesis de andrógenos
en los testículos. Estos esteroides ejercen una influencia
beneficiosa sobre la espermatogénesis y niveles anormalmente altos
de andrógenos pueden mantener la espermatogénesis una vez que ésta
se ha iniciado (9). En las hembras, la LH es esencial para la
ovulación y la formación del cuerpo lúteo. La LH también ejerce una
influencia sinergística junto con la FSH sobre el desarrollo del
folículo (4) y se sabe que promueve la síntesis de andrógenos
foliculares. Estos andrógenos actúan como precursores para la
formación de estrógenos estimulada por FSH. La LH también puede
multiplicar el efecto de FSH sobre las células de la granulosa, en
particular en las fases tardías de la maduración del folículo cuando
las células de la granulosa han adquirido receptores para LH. La hCG
fabricada por el trofoblasto es importante para el mantenimiento de
la secreción de progesterona por el cuerpo lúteo durante las
primeras etapas de un embarazo en seres humanos. Las actividades
clínicas de estas hormonas y sus usos han sido objeto de extensas
revisiones en varios libros de texto convencionales que incluyen el
de Yen y
Jaffe (2).
Jaffe (2).
Las diferencias en los efectos de FSH y LH y las
complejas interacciones endocrinas entre estas dos hormonas las
hacen que presenten acciones sinergísticas sobre el desarrollo
folicular y sobre la síntesis de estradiol (4). Por ejemplo, la
producción normal de estrógenos por los ovarios se debe al efecto de
la LH sobre la formación de andrógenos y a la influencia de la FSH
sobre la conversión de andrógenos a estradiol. A su vez, el
estradiol puede suprimir la secreción de FSH por la hipófisis.
Durante el ciclo menstrual normal, los niveles de FSH descienden a
medida que el folículo aumenta de tamaño y secreta cantidades
crecientes de estradiol. Cuando los niveles de estradiol alcanzan
una cantidad suficiente durante la fase folicular, pueden provocar
un aumento en la secreción de LH por la hipófisis que hace que se
produzca la ovulación. El cociente de las actividades de LH/FSH así
como los niveles absolutos de las hormonas en sangre son importantes
para las funciones reproductoras tales como la maduración de los
folículos y la ovulación del número idóneo de oocitos durante los
ciclos menstrual y estral.
Mientras que la secreción tanto de LH como de
FSH puede ser inhibida por hormonas esteroides, la secreción de FSH
normalmente es más sensible que la de LH a la regulación por
retroinhibición ejercida por los estrógenos. De hecho, en muchas
especies, los niveles altos de estrógenos pueden aumentar la
secreción de LH, en particular si los niveles de progesterona son
bajos. La administración de anti-estrógenos,
compuestos que alteran la regulación normal por retroinhibición del
estradiol sobre la secreción de FSH, frecuentemente da lugar a una
liberación de FSH aumentada y a una producción de gametos aumentada.
Clínicamente, los anti-estrógenos son ampliamente
utilizados para aumentar la probabilidad de ovulación en mujeres que
padecen la enfermedad ovárica poliquística. Desgraciadamente, debido
a que los efectos negativos del estradiol sobre la secreción de la
FSH son parcialmente responsables del control del número de
folículos que se desarrollan hasta alcanzar el punto de la
ovulación, la interrupción del bucle normal de retroinhibición de
estrógenos-FSH puede dar como resultado que se
desprendan cantidades inadecuadas de óvulos. Un mecanismo que
produjese una secreción de FSH aumentada sin que eliminase el
control de retroinhibición de la secreción de FSH, tendría un uso
apreciado para aumentar la fertilidad.
La FSH purificada es capaz de estimular el
desarrollo folicular en mujeres, en particular cuando algo de LH
endógena está también presente. El cociente FSH/LH es más alto en el
momento del ciclo menstrual en el que se inicia el desarrollo
folicular. Sin embargo, ambas hormonas son esenciales para la
fertilidad. La inmunoneutralización de la LH da ligar a esterilidad
en machos y hembras (10-12). Asimismo se demostró
que la inmunoneutralización de CG, hormona que actúa a través de los
receptores para LH, bloqueaba la fertilidad en primates
(13-16). No se ha demostrado previamente que
anticuerpos contra LH estimulen la fertilidad.
Se ha demostrado que anticuerpos monoclonales
dirigidos contra hCG (denominados hCG-mAb) inhiben
la unión de hCG a su receptor in vitro (17). Dependiendo de
la posición de sus epítopos, los hCG-mAb presentan
diferentes capacidades para inhibir la unión de hCG a receptores
para LH. B105 y B110 son ejemplos de anticuerpos monoclonales que
reconocen epítopos sobre hCG y LH que quedan expuestos cuando estas
hormonas se unen a receptores para LH (17). Los complejos de estas
hormonas con estos anticuerpos monoclonales se unen a receptores
para LH, aunque con una menor afinidad que las hormonas libres. Por
consiguiente, estos anticuerpos inhiben la unión de las hormonas a
los receptores para LH. Sin embargo, el grado máximo de la
inhibición observada en presencia de un exceso de anticuerpo es de
menos del 100% y menor que el de los anticuerpos que forman
complejos con las hormonas que no se unen a receptores para LH. En
presencia de una cantidad suficiente de B105 o B110, la cantidad de
hormona necesaria para inducir una respuesta biológica aumenta. Así,
incluso un exceso masivo de cualquiera de los dos anticuerpos,
suficiente para unir virtualmente toda la hCG o LH libre en el
ensayo, no es capaz de impedir una respuesta contra cualquiera de
las dos hormonas cuando las concentraciones de los complejos
hormona-anticuerpo excedieron un nivel umbral.
Según se ha comentado anteriormente, hace unos
años se demostró que la inmunoneutralización de LH previene la
fertilidad. Este fenómeno tiene lugar debido a que los antisueros
que se usaron en estos estudios neutralizaron la actividad biológica
de LH. Sin embargo, cuando se usan antisueros o anticuerpos
adecuados como B105 o B110, la actividad biológica de LH no se
elimina. Más bien, esta actividad disminuye en una cantidad
predeterminada. Cuando esto sucede, la síntesis de andrógenos
disminuye. Ya que los andrógenos son precursores de los estrógenos,
la síntesis de estrógenos también disminuye. El descenso en
estradiol tiene un impacto mayor sobre la secreción de FSH que sobre
la secreción de LH. La secreción de FSH aumentará y esto dará lugar
a un incremento en el cociente FSH/LH y a un aumento en el
desarrollo folicular. En hembras, este cociente FSH/LH dará lugar a
un aumento en el desarrollo folicular. En machos, este cociente
FSH/LH dará lugar a un aumento en la función en las células de
Sertoli y a un aumento en la espermatogénesis.
Una estrategia para aumentar la fertilidad que
esté basada en disminuir los niveles de LH no se ha usado con
anterioridad. En parte, esto se debe a los muchos informes
existentes sobre que los anticuerpos contra LH inhiben la fertilidad
y a que los métodos para fabricar y seleccionar anticuerpos que
disminuyan pero que no neutralicen la actividad de LH no eran
conocidos anteriormente. Por lo tanto, no era de esperar que esta
estrategia para incrementar la fertilidad tuviera éxito. Como se
tratará más adelante, esta estrategia para incrementar la fertilidad
presenta varias ventajas con respecto a las técnicas actuales,
principalmente en mujeres que fabrican y liberan LH y FSH por sus
hipófisis. Debido a que disminuir los niveles de LH no altera las
interrelaciones normales de autorregulación endocrina entre el
estradiol y la FSH sobre la función hipofisaria, esta disminución
tiene una probabilidad mucho menor de inducir una hiperestimulación
ovárica que las técnicas existentes. Esto significa que habrá una
menor necesidad de realizar a las pacientes controles costoso y que
exigen un gran esfuerzo. Además, se requerirán sólo uno o a lo sumo
unos cuantos tratamientos para inducir la fertilidad.
Otro método nuevo para aumentar la fertilidad es
utilizar un antagonista de LH durante la fase folicular del ciclo
menstrual. Desde hace algunos años se sabe que las cadenas de
oligosacáridos presentes en las hormonas glicoproteicas son
esenciales para la capacidad que tienen estas hormonas para inducir
la transducción de señales (1). Las hormonas glicoproteicas que
carecen de residuos de carbohidratos tienen capacidades disminuidas
para inducir una respuesta biológica. Estos análogos se pueden usar
para bloquear la unión de LH a sus receptores. Esto disminuirá la
actividad de la LH circulante y con ello favorecerá la fertilidad.
Se ha descubierto que las gonadotropinas desglicosiladas tienen
semividas biológicas cortas y se encontró que no eran útiles para el
uso originalmente planeado de las mismas, en concreto, para inhibir
la fertilidad disminuyendo la síntesis luteínica de progesterona y
produciendo el aborto. Trasladando los residuos de carbohidrato a
otras porciones de la hormona mediante la retirada de las señales de
glicosilación (es decir, las secuencias de aminoácido
Asparagina-X-Treonina o
Asparagina-X-Serina, en las que X es
cualquier aminoácido excepto Prolina) de un sitio y creando señales
de glicosilación en sitios alternativos de las subunidades \alpha
y \beta, es posible diseñar análogos con una actividad agonista
disminuida y que posean semividas suficientemente largas para poder
ser útiles. Además, preparando gonadotropinas monocatenarias en las
que las subunidades \alpha y \beta están unidas covalentemente
es posible aumentar la estabilidad de las hormonas circulantes. Esto
es debido a que las actividades de unión a los receptores y las
semividas plasmáticas de las gonadotropinas heterodiméricas son
mayores que las de cualquiera de las dos subunidades. La unión
covalente previene la disociación de las dos subunidades cuando se
encuentran en la circulación.
Aunque la estimulación de la fertilidad es
importante para restablecer la fertilidad en parejas estériles, la
inhibición de la fertilidad es muchas veces deseada como método de
planificación familiar. Además, la inhibición de la fertilidad sería
útil en la producción comercial de ganado ya que eliminaría la
necesidad de castración o prevendría el desarrollo del celo en
ganado vacuno apresado en el comedero. La inhibición de la
fertilidad en otros animales incluyendo perros y gatos sería también
conveniente como sustitutiva a extirparles los ovarios o castrarles.
La inhibición de la fertilidad en caballos también sería preferible
a la capadura, en particular si puede ser reversible. Según se ha
indicado anteriormente, la fertilidad se puede inhibir mediante la
administración de anticuerpos neutralizantes contra LH o FSH.
También se puede inhibir usando una vacuna para inducir la formación
de estos anticuerpos. Debido a la acción de la hCG en el
mantenimiento del embarazo, los tratamientos que dan lugar a una
hiposecreción o hipoactividad de la hCG, se esperaría también que
produjeran esterilidad. En las mujeres, esto sería más conveniente
para inhibir la fertilidad, inhibiendo la hCG mejor que hLH o hFSH.
Esto es porque los tratamientos que neutralizasen hLH o hFSH
provocarían el cese de la función ovárica y acelerarían la aparición
de los problemas asociados con la menopausia. En ganado vacuno y en
otros animales domésticos, sería más importante inhibir la LH para
prevenir la pubertad o interrumpir el celo. Según se ha indicado en
trabajos previos, anticuerpos adecuados dirigidos contra la
gonadotropina coriónica son capaces de inhibir la fertilidad en
primates y en mujeres, y el desarrollo de anticuerpos contra hCG
durante muchos años ha sido reconocido como un importante método
potencial de anticoncepción (18). Debido a que la hCG es producida
por gran número de cánceres humanos y debido a que los anticuerpos
contra la hCG pueden afectar a estos tumores, la inmunización
tendría también un impacto beneficioso sobre el tratamiento o
prevención del cáncer (19).
Se han realizado varios intentos para diseñar
una vacuna anticonceptiva de ese tipo, basada en la hCG, teniendo en
cuenta las diferencias entre la hCG y las otras hormonas
glicoproteicas (14, 18). Desgraciadamente, el desarrollo de la
vacuna ha sido obstaculizado por las homologías estructurales
habidas entre todas las hormonas glicoproteicas. El inmunógeno
preferido debe ser altamente antigénico aunque sin embargo no
induzca la formación de anticuerpos que presenten reacciones
cruzadas con las otras glicoproteínas tales como la FSH, LH o TSH
humanas. Sobre la base del conocimiento de las actividades de las
hormonas glicoproteicas anteriormente descritas, una vacuna que
indujese la formación de anticuerpos que interaccionasen con LH, FSH
o TSH, provocaría también esterilidad y/o la inhibición de la
función tiroidea. Desgraciadamente, la neutralización de LH o FSH
produciría también el cese de los ciclos menstruales normales y la
pérdida de la producción de estrógenos que está asociada con la
fertilidad en las mujeres. La terminación de la función ovárica
produciría probablemente un desarrollo prematuro de osteoporosis y
de otros problemas asociados con la menopausia. La inhibición de la
función tiroidea daría lugar a hipotiroidismo. Las similitudes de
las estructuras de hCG y hLH han hecho particularmente difícil
diseñar un inmunógeno adecuado que no genere anticuerpos que den
reacciones cruzadas. Se han dedicado muchos esfuerzos a fabricar
anticuerpos contra el único extremo C-terminal de la
subunidad \beta de hCG debido a que esta porción de la molécula no
se encuentra en hLH (1). Sin embargo, esta región no es muy
antigénica. Los intentos realizados para diseñar inmunógenos también
han utilizado péptidos obtenidos de la subunidad \beta (14),
conjugados de la subunidad \beta con otras proteínas (20), o
conjugados de subunidades \beta de hCG que contienen
heterodímeros, y subunidades \alpha ovinas (18). Desgraciadamente,
la mayoría de estos inmunógenos no son muy eficaces y se necesita un
inmunógeno mejor para hacer que este método sea factible.
La dificultad para diseñar una vacuna basada en
hCG se puede apreciar mediante conocimiento de las estructuras de
las hormonas glicoproteicas. Todas las hormonas glicoproteicas
contiene una subunidad \alpha común. Aunque la conformación de
partes de la subunidad \alpha difieren en todas las hormonas y
pueden ser reconocidas por anticuerpos monoclonales seleccionados
(21), porciones de la subunidad \alpha presentan la misma
conformación en cada una de las hormonas glicoproteicas. Por lo
tanto, muchos anticuerpos dirigidos contra la subunidad \alpha
reconocen LH, FSH, hCG y TSH. Debido a que los anticuerpos
anti-subunidad \alpha con frecuencia son capaces
de bloquear las actividades de las hormonas (22), un inmunógeno que
induzca una respuesta contra la subunidad \alpha es probable que
tenga efectos secundarios no deseados. Por lo tanto, la mayoría de
las estrategias para diseñar una vacuna anticonceptiva están
dirigidas a la subunidad \beta hormona-específica
de la hCG.
La subunidad \beta de hCG es la más
estrechamente relacionada con la subunidad \beta de hLH. Muchos de
los anticuerpos dirigidos contra la subunidad \beta intacta de hCG
se unirán también con la subunidad \beta de LH. Aunque las
subunidades \beta de las otras hormonas difieren considerablemente
de la de hCG, algunos de los residuos de todas las subunidades
\beta son idénticos y existe la posibilidad, aunque pequeña, de
que algunos anticuerpos anti-subunidad \beta
presenten también reacciones cruzadas con estas hormonas. Los 31
aminoácidos carboxi terminales de la subunidad \beta de hCG (CTP)
(del inglés, " Carboxi Terminal
Peptide") no están relacionados con ninguno de los
residuos de las otras hormonas glicoproteicas. En teoría, los
anticuerpos dirigidos contra esta región no son capaces de inducir
reacciones cruzadas con las otras hormonas. Según lo esperado,
cuando esta región se usa como inmunógeno, se forman anticuerpos que
no presentan reacciones cruzadas con ninguna de las demás hormonas
glicoproteicas. Desgraciadamente, los anticuerpos que se producen
contra péptidos CTP sintéticos no se unen con una afinidad alta a
hCG. En parte, esto es debido a la observación de que esta región de
hCG contiene cuatro sitios de glicosilación potenciales ligados a
serina y está altamente glicosilada. Además, gran parte de esta
región de hCG no es esencial para la interacción con los receptores
para LH. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra el CTP de
hCG se unen a complejos de receptor-hCG y son en su
mayoría de tipo no neutralizante. Por consiguiente, estos
anticuerpos no inhiben la acción de hCG, al igual que anticuerpos
como el B101 (22) que impiden que hCG se una a los receptores para
LH.
Se han hecho intentos para diseñar anticuerpos
dirigidos contra otras porciones de la subunidad \beta de hCG. Una
de las regiones que ha sido extensamente investigada es la región
que se encuentra entre los residuos de cisteína 38 y 57. Se sabe que
esta porción de la proteína forma un gran bucle y existen estudios
que han demostrado que este bucle es capaz de estimular una
esteroidogénesis (23, 24). Por lo tanto, se podría prever que los
anticuerpos dirigidos contra este bucle serían de tipo
neutralizante. De hecho, B101, un anticuerpo que se ha demostrado
que reconoce residuos contenidos en este bucle (22, 25, 26) es capaz
de neutralizar la actividad de hCG. El problema existente con el uso
de esta estructura en bucle es que los anticuerpos que se producen
son frecuentemente de baja afinidad. Además, debido a que la hCG y
la hLH son similares en esta región de la molécula (es decir, tienen
solamente tres aminoácidos que difieren), es de esperar que la
inmunización efectuada con este bucle provoque la producción de
anticuerpos contra hLH. De hecho, B101, un anticuerpo que se une a
esta región de la molécula, presenta una afinidad inaceptablemente
alta por hLH.
Intentos recientes realizados para identificar
la estructura terciaria de las hormonas glicoproteicas han dependido
de la caracterización de los sitios de unión de grupos de
anticuerpos monoclonales(26). Se han identificado anticuerpos
que previenen la actividad biológica de hCG o que neutralizan sólo
parcialmente su actividad biológica. Según se describe en el ejemplo
7 de la presente memoria descriptiva, estos anticuerpos y
anticuerpos similares se pueden usar para diseñar inmunógenos que
posean el potencial para neutralizar hCG pero no hLH usando el
procedimiento de selección positiva y un procedimiento de selección
negativa descritos en los ejemplos 6 y 7 que se exponen más
adelante. Aunque la hormona ha sido cristalizada y una estructura
cristalina sería valiosa para determinar los tipos de inmunógenos
que pudieran producir una inmunorrespuesta con un título alto contra
partes concretas de la molécula, las dificultades encontradas en la
resolución de la estructura cristalina han impedido esta estrategia.
Por lo tanto, en el presente estado del conocimiento de la
estructura de hCG, no existe ningún método aceptable que pueda
usarse para predecir el tipo de inmunógeno que fuese más eficaz.
Otro método útil para aumentar la fertilidad es
aumentar los niveles de actividad de FSH. Uno de los modos de llevar
esto a cabo es administrar dosis pequeñas de folitropinas de acción
prolongada. Estas folitropinas se pueden fabricar acoplando
moléculas con actividad de folitropina a moléculas con semividas
plasmáticas largas (es decir, inmunoglobulinas) o preparando
análogos monocatenarios de gonadotropinas que tienen actividad de
folitropina (Tablas 1 y 2). Solas, o en combinación con anticuerpos
contra LH y/o con antagonistas de LH, estas hormonas facilitan el
desarrollo de folículos en mujeres con la enfermedad ovárica
poliquística.
La inmunización pasiva contra LH tiene el
potencial de estimular una superovulación en especies de animales
domésticos, aunque, a concentraciones de anticuerpo más altas, tanto
la inmunización pasiva como la inmunización activa contra LH
bloquean la ovulación (66).
La Figura 1 es una gráfica que ilustra la
influencia de anticuerpos y antisueros sobre la unión de hLH marcada
radiactivamente a receptores para LH.
La Figura 2 es una gráfica que ilustra la
influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH
para inducir la esteroidogénesis in vitro.
La Figura 3 es una gráfica que ilustra la
influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH
para inducir la esteroidogénesis in vivo.
La Figura 4 muestra vectores que se pueden usar
en estrategias de selección basadas en moldes/exclusión.
La Figura 5 muestra los tipos de inmunógenos que
poseen una antigenicidad aumentada para usar en la inmunización
activa contra LH, hCG o FSH.
La Figura 6 ilustra la secuencia codificadora
del análogo n.º 1 monocatenario de gonadotropinas y de los cebadores
(subrayados).
La Figura 7 ilustra la secuencia codificadora
del análogo n.º 2 monocatenario de gonadotropinas y de los cebadores
(subrayados).
La Figura 8 ilustra la secuencia codificadora
del análogo n.º 3 monocatenario de gonadotropinas y de los cebadores
(subrayados).
La Figura 9 ilustra la preparación de una región
que codifica una subunidad alfa y que carece de secuencias señal
oligosacáridas.
La Figura 10 ilustra la preparación de una
región que codifica una subunidad beta y que carece de secuencias
señal oligosacáridas ligadas a asn.
La Figura 11 ilustra la secuencia codificadora
del análogo n.º 1a monocatenario de gonadotropinas.
La presente invención se refiere al uso de un
anticuerpo no neutralizante que se une a la subunidad \beta de la
hormona luteinizante y disminuye pero no elimina la actividad de
hormonas glicoproteicas sobre el receptor para la hormona
luteinizante incluso cuando está en una concentración en la que se
une a la totalidad de dicha hormona glicoproteica presente, en la
preparación de una composición farmacéutica para estimular la
fertilidad en mamíferos hembras estimulando la producción de la
hormona estimulante del folículo.
La presente invención se refiere al uso de
anticuerpos no neutralizantes que se unen a la subunidad \beta de
la hormona luteinizante para aumentar la fertilidad disminuyendo,
pero no eliminando, las actividades de las hormonas glicoproteicas
circulantes que poseen actividad de lutropina (LH). Debido a que las
moléculas con actividad de lutropina son esenciales para la
fertilidad, sería de esperar que el bloqueo de sus actividades
disminuya la fertilidad en lugar de aumentarla. Sin embargo,
normalmente se encuentra que las lutropinas aumentan la producción
de esteroides que pueden disminuir la secreción de folitropinas
(FSH), hormonas que ejercen importantes papeles en la fertilidad.
Por consiguiente, la disminución de las actividades de lutropinas da
lugar a un aumento en los niveles de folitropinas y/o de los
cocientes folitropina/lutropina. Cuando la actividad de LH se
disminuye pero no se suprime, el aumento de la actividad de FSH y/o
del cociente FSH/LH da lugar a una producción aumentada de gametos y
a una fertilidad elevada en seres humanos y en animales. La presente
invención también describe nuevos métodos para diseñar y/o
seleccionar anticuerpos dirigidos contra porciones específicas de
proteínas que incluyen LH y la gonadotropina coriónica humana (hCG)
que permiten que sus actividades biológicas disminuyan hasta
alcanzar los grados deseados. En este documento se presentan
ejemplos que ilustran como diseñar anticuerpos e inmunógenos contra
porciones específicas de gonadotropinas seleccionadas, que incluyen
aquellos anticuerpos e inmunógenos que tienen una estructura muy
similar. Esos anticuerpos e inmunógenos tendrán usos para aumentar
la fertilidad. La presente invención también se refiere a la
preparación de moléculas que se pueden unir a receptores para LH y
de FSH y que presentan acciones que aumentan la fertilidad o que
inhiben la fertilidad dependiendo del tiempo que dure la
administración. Algunas de ellas son moléculas que se unirán a
receptores para LH y bloquearán la acción de LH. Cuando estas
moléculas se administren en la fase folicular, suprimirán la
actividad de LH suprimiendo con ello la secreción de andrógenos y
estrógenos. Por consiguientes, los niveles de FSH subirán y
aumentará la fertilidad. Cuando estas moléculas se administren
después de la ovulación durante la fase luteínica del ciclo
menstrual, suprimirán la actividad de hCG y provocarán el final del
embarazo. Además, la presente invención se refiere a la preparación
de moléculas que presentan la capacidad para inhibir las acciones de
FSH y de tanto FSH como LH. Estas moléculas serán útiles para tratar
a mujeres que tienen un tejido ovárico hiperactivo, muchas veces
como resultado de un tratamiento con gonadotropinas. La
hiperestimulación del ovario es potencialmente mortal y estos
análogos se unen a los receptores para FSH o a los receptores tanto
para FSH como para LH, para suprimir el posterior desarrollo
ovárico.
De acuerdo con la presente invención, se
proporcionan usos para mejorar la fertilidad en seres humanos y en
animales con el nuevo método para inhibir la actividad de lutropina
usando una inmunización activa o pasiva. Estudios previos han
demostrado que el bloqueo de las acciones de LH da lugar a la
inhibición de la fertilidad. En el presente documento se muestra que
se pueden usar anticuerpos contra LH apropiados para restablecer o
para estimular la fertilidad. Esta estrategia debe disminuir el
riesgo de una hiperestimulación y debe permitir una regulación más
normal de la fertilidad con un seguimiento menor. Se proporcionan
varios métodos para producir y realizar ensayos de los anticuerpos o
antisueros necesarios para promover la fertilidad.
Se encuentran disponibles otros métodos para
alterar el cociente FSH/LH que incluyen métodos para administrar FSH
o para proporcionar antiestrógenos. Sin embargo, el procedimiento
que aquí se describe, basado en el uso de anti-LH
presenta importantes ventajas sobre estos otros métodos. El grado de
inhibición máxima se puede determinar como precaución para cada uno
de los anticuerpos mediante realización de ensayos in vitro.
Así pues, independientemente de la cantidad de anticuerpo
administrado, se podría prevenir la inhibición de la actividad de LH
por debajo de un nivel predeterminado mediante la elección adecuada
del anticuerpo. Por ejemplo, B105 disminuiría los niveles eficaces
de hLH en un factor de aproximadamente 4 mientras que B110
disminuiría los niveles eficaces de hLH en un factor de
aproximadamente 2. La disminución de los niveles de LH permitirá que
los niveles de FSH suban. A medida que los niveles de FSH suben,
provocarán el desarrollo folicular y la producción de estrógenos.
Cuando estos niveles hayan alcanzado las concentraciones
fisiológicas características de un desarrollo folicular adecuado,
inhibirán negativamente la secreción de más FSH. Por lo tanto, el
tratamiento que aquí se describe mantiene los aspectos valiosos de
una autorregulación que se pierden en los métodos existentes que
dependen de la administración de FSH o de
anti-estrógenos para estimular la fertilidad.
Además, a diferencia de la inducción de la ovulación con GnRH
(hormona liberadora de gonadotropina) (del inglés,
" Gonadotropine Releasing
Hormone") o con análogos de GnRH, el método basado en
anti-LH no requiere la infusión pulsátil de una
hormona o de un análogo hormonal. Este tratamiento ofrece la ventaja
potencial de realizar un único tratamiento o como mucho unos pocos
tratamientos a lo largo de algunos días. Esto será particularmente
importante para regular la ovulación en seres humanos o animales. En
seres humanos, este método debe ser más adecuado para el tratamiento
de la enfermedad ovárica poliquística que frecuentemente se
caracteriza por unos niveles de LH inapropiadamente elevados. A
medida que los niveles de LH disminuyan, los niveles de FSH subirán
y tendrá lugar el desarrollo folicular. Sin embargo, a medida que el
desarrollo folicular tiene lugar, los niveles crecientes de
estrógenos bloquearán la secreción de FSH adicional. Por lo tanto,
se minimizará la tendencia a promover el desarrollo de demasiados
folículos con sus peligrosas consecuencias potenciales.
En el presente documento se proporcionan también
métodos para producir un inmunógeno específico que se basa en el uso
de un molde y de anticuerpos de exclusión. El uso de estos
anticuerpos permitirá diseñar una inmunorrespuesta específica
dirigida contra dominios particulares de una proteína. Este método
tendrá usos en la inducción o inhibición de la fertilidad según aquí
se ilustra. Debido a que los anticuerpos contra hCG son capaces de
inhibir el crecimiento tumoral, este método debe también ser útil
para diseñar vacunas necesarias para inhibir el desarrollo o
progresión de tumores que secretan hCG. El método debe también tener
aplicación en cualquier sistema en el que se necesite un inmunógeno
específico.
No hay nada que sea exclusivo en la estructura
de los anticuerpos que los haga útiles para inducir la fertilidad a
parte del hecho de que se unen a hLH o a otra LH. Por lo tanto, se
podría esperar que porciones de anticuerpos que conservan la
capacidad para unirse a LH tuvieran también una actividad similar.
Estos anticuerpos incluirían los fragmentos Fab, los fragmentos
(Fab')_{2} o anticuerpos monocatenarios. El fragmento Fab es una
porción de un anticuerpo que contiene el sitio de unión a antígeno y
que se genera mediante digestión con papaína. El fragmento
(Fab')_{2} es una
porción de un anticuerpo que contiene dos sitios de unión a antígeno y que se genera mediante digestión con pepsina.
porción de un anticuerpo que contiene dos sitios de unión a antígeno y que se genera mediante digestión con pepsina.
Preferiblemente, las administraciones de la
composición farmacéutica para aumentar la fertilidad se llevan a
cabo durante la fase folicular en el mamífero, y más preferiblemente
durante la fase folicular del ciclo menstrual.
La hormona glicoproteica que ha de ser regulada
en la presente invención es uno de los reaccionantes en una reacción
que tiene lugar entre partes contrarias de una unión. Las partes
contrarias de una unión son proteínas que presentan una afinidad de
unión específica de la una por la otra. Una de las partes contrarias
de la unión es un agente unible, que se selecciona entre el grupo
que consiste en un antígeno y un hapteno. El agente unible preferido
es un antígeno. La otra parte contraria de la unión es un agente que
une, que se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo
y una proteína de unión específica. El agente que une preferido es
un anticuerpo.
Los antígenos son sustancias que en condiciones
adecuadas son capaces de inducir la formación de anticuerpos y de
reaccionar específicamente de una manera detectable con los
anticuerpos así inducidos. Los antígenos pueden ser sustancias
solubles, tales como toxinas y proteínas extrañas, o pueden ser
sustancias en partículas, tales como bacterias o células de tejidos.
En general, los antígenos son sustancias de alto peso molecular
tales como proteínas y carbohidratos simples y conjugados.
Los anticuerpos son moléculas de
inmunoglobulinas que poseen una secuencia de aminoácidos específica
que les permite interaccionar únicamente con el antígeno que indujo
su síntesis en el tejido linfático o con un antígeno estrechamente
relacionado con ese antígeno. Las inmunoglobulinas son proteínas
constituidas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas.
Los anticuerpos no neutralizantes usados en la
presente invención se pueden administrar a mamíferos, p. ej.,
animales o seres humanos, en cantidades eficaces para proporcionar
la actividad deseada. Debido a que la actividad de los compuestos y
el grado del efecto terapéutico deseado varían, el nivel de
dosificación del compuesto empleado también variará. La dosificación
real administrada se determinará también por medio de factores
generalmente reconocidos tales como el peso corporal del paciente y
la hipersensibilidad individual del paciente particular. Así, la
dosificación unitaria para un paciente particular (un hombre) puede
variar desde aproximadamente 0,1 \mug por kg de peso corporal como
mínimo, unidad de dosificación que el facultativo puede titular
hasta conseguir el efecto deseado. Una dosis mínima preferida para
la titulación es 1 \mug/kg de peso corporal.
La presente invención se ilustra más ampliamente
por medio de los siguientes ejemplos que no tiene intención de
limitar el alcance efectivo de las reivindicaciones. Todas las
partes y porcentajes que aparecen en los ejemplos y a lo largo de
esta memoria descriptiva están expresados por peso de la composición
final salvo que se especifique lo contrario.
Aunque los métodos de vacunación y los métodos
para diseñar una vacuna para estimular la fertilidad en mamíferos no
están comprendidos en la presente invención, los Ejemplos referentes
al desarrollo de antígenos eficaces en la inducción de la producción
de anticuerpos contra LH, incluyendo los Ejemplos referentes a
análogos útiles como uno de los compuestos de partida para el diseño
de vacunas, se mantienen ya que una divulgación así es ilustrativa
del diseño de los inmunógenos que inducen la producción de los
anticuerpos útiles en la presente invención.
Debido a que algunos anticuerpos
anti-hormona inhiben la actividad biológica de las
hormonas ya sea impidiendo que la hormona se una a los receptores o
ya sea aumentando su metabolismo, estos anticuerpos serán útiles
para disminuir el nivel de la hormona circulante activa. Los
anticuerpos contra LH son capaces de aumentar el cociente de la FSH
biológicamente activa entre la LH biológicamente activa circulantes.
En parte, esto es porque estos anticuerpos disminuyen la actividad
de LH. Además, debido a que la LH es una hormona que estimula la
síntesis de sustratos esteroides que pueden ser convertidos en
estrógenos (4), el descenso en la actividad de LH estará acompañado
por un descenso en estrógenos. El descenso en los niveles de
estrógenos disminuirá la inhibición de la secreción de FSH y los
niveles de FSH subirán. A consecuencia de ello, en la hembra, el
desarrollo folicular aumentará. En el macho, la espermatogénesis se
multiplicará. No todos los anticuerpos tienen la capacidad para
disminuir los niveles de LH de una manera no neutralizante. Los
anticuerpos que neutralizan las acciones de LH en su totalidad
restringirán la fertilidad a menos que se administren de una manera
limitada (es decir, que la cantidad total de anticuerpo administrado
sea menor que la cantidad total de LH circulante) y no están por lo
tanto incluidos en el alcance de la presente invención. Para
aumentar la fertilidad se prefieren anticuerpos no neutralizantes ya
que se pueden administrar en exceso sobre la cantidad total de LH.
Los anticuerpos no neutralizantes están incluidos en el alcance de
la invención. Así pues, incluso cuando la mayor parte de LH pueda
encontrarse unida a los anticuerpos, la actividad de LH disminuye
pero no se neutraliza. Debido a que hay una cantidad de LH más que
suficiente para el desarrollo folicular, la disminución parcial de
la actividad de LH no impide el desarrollo folicular. Además, el
aumento de estrógenos que se produce a medida que el folículo
aumenta su desarrollo, imitarán el control de autorregulación normal
de la secreción de FSH para prevenir una hiperestimulación ovárica.
La administración de 10 \mug - 10 mg de un anticuerpo de alta
afinidad (es decir, Ka > 5 x 10^{7} M^{-1}) será suficiente
para inducir la fertilidad en mujeres que padecen la enfermedad
ovárica poliquística. La identificación y caracterización de los
anticuerpos convenientes se ilustra en el Ejemplo 2.
No todos los anticuerpos que inhiben la
actividad de LH serán igualmente útiles para el tratamiento de la
esterilidad. Por ejemplo, altas concentraciones en exceso de
anticuerpos como B101 que se unen a hCG y a LH (aunque con menor
afinidad) pueden impedir que estas hormonas se unan a los receptores
para LH (22). Cuando están presentes en exceso, los anticuerpos que
impiden la unión de LH o de hCG a sus receptores "neutralizan"
la actividad biológica de la hormona. Aunque la neutralización de LH
fuera seguida por un descenso de los niveles de andrógenos y
estrógenos y por una subida de los niveles de FSH, debido a que la
LH es necesaria para la fertilidad, la disminución de la actividad
de LH por debajo del nivel mínimo necesario para la fertilidad
impediría la fertilidad siempre y cuando hubiera un exceso de
anticuerpo. De hecho, los anticuerpos neutralizantes o los antígenos
que inducen la producción de anticuerpos neutralizantes se ha
demostrado que inhiben la fertilidad en animales (10). Sería posible
administrar cantidades limitadas de anticuerpos neutralizantes para
disminuir las concentraciones de LH hasta un nivel predeterminado o
para revertir el efecto inhibidor de un anticuerpo neutralizante
administrando un anticuerpo anti-idiotipo. Sin
embargo, debido a las variaciones interindividuales, sería difícil
determinar cuanto anticuerpo se necesitaría para obtener el efecto
deseado a menos que conviniera una inhibición casi completa de la
actividad de LH o a menos que se realizaran medidas de FSH y/o de la
función gonadal (p. ej., determinando los niveles de esteroides en
plasma). Aunque estas medidas son posibles, la necesidad de realizar
estas medidas disminuye el interés de usar anticuerpos que
neutralizan por completo la actividad de LH con el fin de
multiplicar la fertilidad. Los anticuerpos neutralizantes también se
podrían administrar para prevenir temporalmente la acción de LH
hasta que los niveles de FSH hayan subido. Entonces el exceso de
anticuerpo neutralizante podría retirarse mediante la administración
de un anticuerpo anti-idiotipo que neutralice los
anticuerpos anti-LH para restablecer la fertilidad,
o venciendo el efecto del anticuerpo usando LH o CG, o usando una
cantidad de anticuerpo que estuviera lo suficientemente degradado
como para permitir la acción de la subida intermenstrual de LH. Sin
embargo, esta estrategia es más compleja que el uso de anticuerpos
no neutralizantes, que se ilustra más delante.
Los anticuerpos usados en la presente invención
inhiben la actividad de LH pero no son capaces de bloquear
completamente su acción incluso cuando se administran en
concentraciones suficientes para unir toda la LH presente en la
circulación. Estos anticuerpos normalmente son capaces de unirse a
toda la hormona libre así como a los complejos
hormona-receptor. Inhiben la acción de la hormona
bajando la afinidad de la hormona por su receptor, disminuyendo la
actividad de la hormona unida y/o aumentando el aclaramiento de la
hormona. Ejemplos de estos anticuerpos incluyen B105 y B110. Estos
anticuerpos disminuyen las actividades biológicas de las hormonas en
diferentes medidas (17) y se pueden adquirir procedentes de la
Universidad de Columbia, Nueva York, NY, o procedentes de la
UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School,
Piscataway, NJ. Otros anticuerpos comercialmente disponibles
incluyen 518B7 (disponible procedente de la Dra. Janet Roser,
Universidad de California en Davis, Davis, CA) y ZMCG7 (disponible
procedente de la Pierce Chemical Co., 3747 North Meridian
Road, Rockford, IL). Debido a que los complejos de estos
anticuerpos con hCG pueden unirse a receptores, el grado de
inhibición es limitado incluso en presencia de un exceso masivo de
anticuerpos. La cantidad de inhibición se puede determinar con
simples ensayos in vitro antes de usar estos anticuerpos
in vivo. Por ejemplo, se ha demostrado que un exceso masivo
de B110 disminuye la actividad de la hCG en sólo aproximadamente la
mitad, mientras que un exceso masivo de B105 disminuye la actividad
de hCG en aproximadamente sus tres cuartas partes. Cada uno de estos
anticuerpos se une a hLH y sería de esperar que tuvieran la misma
influencia sobre la actividad de hLH.
La identificación de los anticuerpos apropiados
entre un grupo de anticuerpos monoclonales preparados contra hLH se
puede realizar de la siguiente manera. Estos anticuerpos se pueden
obtener por medio de procedimientos estándar (22,
27-32) inmunizando ratones con hLH, hCG o LH
procedentes de otras especies, con fragmentos de LH o hCG, con LH o
hCG parcial o totalmente desglicosiladas, o con análogos de LH o de
hCH capaces de inducir una inmunorrespuesta frente a las especies de
LH deseadas. Estos anticuerpos se podrían obtener haciendo una
selección de anticuerpos fabricados por el hombre
(33-36). Esta misma estrategia se podría usar para
identificar anticuerpos contra una LH procedente de virtualmente
cualquier otra especie. También se podrían usar para identificar
antisueros que tuvieran propiedades similares. Estos antisueros se
podrían prepara en respuesta a análogos de LH o de hCG o se podrían
obtener mediante inmunoadsorción o mediante la retirada de
componentes no deseados de los anticuerpos.
Los anticuerpos que poseen las características
inhibidoras deseadas se pueden identificar midiendo sus capacidades
para inhibir la unión de LH a receptores para LH. Este tipo de
ensayo lo puede realizar un experto en la técnica de medir la unión
a receptores y el siguiente ejemplo se refiere a cómo se
seleccionarían anticuerpos contra hLH. Evidentemente, esto sería
también aplicable a cualquiera de las especies de LH para las que
existieran anticuerpos disponibles. Ya que la hLH se une
perfectamente a receptores para LH de roedores, no es necesario usar
receptores humanos para LH en este ensayo, aunque los receptores
para LH humanos también servirían. Una primera etapa fácil es
determinar la influencia del anticuerpo sobre la unión de hLH
marcada radiactivamente a receptores para LH luteínicos de ovario de
rata. La hLH marcada radiactivamente se puede preparar incubando 10
\mug de hLH con 500 \muCi de Na^{125}I durante 30 segundos a
4ºC, en un tubo de vidrio pequeño que ha sido revestido con 1,5
\mug de Iodo-Gen® (Pierce Chemical
Co.). La ^{125}I-hLH y el ^{125}I que no ha
reaccionado se separan mediante filtración en gel. Los receptores se
pueden preparar administrando 50 IU de gonadotropina de suero de
yeguas preñadas, también conocida como PMSG (del inglés,
" Pregnant Mares Serum
Gonadotropin") o de CG equina (obtenida procedente de
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a ratas hembra
Sprague-Dowley de 23-26 días de
edad. La PMSG estimula el desarrollo folicular. Aproximadamente
56-65 horas después, a los animales se les
administra 25 IU de hCG (también obtenida procedente de Sigma
Chemical Co.) para provocar la formación de cuerpos lúteos. Los
ovarios altamente luteinizados se extirpan una semana después y se
homogeneizan en un tampón que contiene Tris 40 mM (pH 7,4) y
MgCl_{2} 5 mM. Una fracción nuclear y de membranas en crudo de los
homogeneizados se recoge centrifugando el homogeneizado a 1.000 x g
durante 20 minutos a 4ºC. Esta fracción se lava una vez
resuspendiéndola en el tampón de Tris-MgCl_{2} y
sedimentándola de nuevo a 1.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El
sedimento final (denominado "sedimento de homogeneizado de
ovario") se resuspende en el tampón de
Tris-MgCl_{2} usando un volumen de 2 ml por cada
uno de los ovarios presentes al comienzo de la homogeneización. Una
cantidad de sedimento de homogeneizado de ovario aproximadamente
igual a 1/20 parte de un ovario (es decir, más o menos 5 mg de
material en 100 \mul de tampón) se añade a los tubos que contienen
aproximadamente 1-2 ng de hLH marcada
radiactivamente con yodo (es decir, aproximadamente 100.000 cpm) y
diferentes cantidades de anticuerpo (es decir, cantidades que varían
desde 1 pg hasta 10 \mug o más). Después de que los tubos se hayan
incubado el tiempo suficiente para permitir que la LH marcada
radiactivamente se una a los receptores (es decir,
30-60 min a 37ºC o toda la noche a temperatura
ambiente), el receptor unido y los marcadores radiactivos libres se
separan diluyendo la mezcla de reacción hasta 2 ml con una
disolución de NaCl al 0,9%, centrifugando la mezcla y aspirando el
sobrenadante. La cantidad de hLH marcada radiactivamente y unida a
receptores para LH de ovario de rata se determina analizando el
sedimento en un contador gamma. Se esperaría observar los tipos de
inhibición mostrados en la Figura 1. Algunos anticuerpos inhibirán
totalmente la unión de la hLH marcada radiactivamente en la misma
medida que un exceso masivo de hLH o de hCG no marcadas, mientras
que otros anticuerpos no inhibirán la unión o pueden incluso
potenciar la unión cuando están presentes en un amplio exceso en
moles en comparación con la hLH marcada radiactivamente. Estos dos
tipos de anticuerpos son menos convenientes que los anticuerpos que
suprimen la unión de hLH en un nivel intermedio (cónfer, Figura 1).
Por lo tanto, los anticuerpos más útiles inhibirán la unión de la LH
marcada radiactivamente pero no en la misma medida que un exceso
masivo de LH no marcada. Los anticuerpos que inhiben la unión de la
LH marcada radiactivamente en la misma medida que un exceso masivo
de LH no marcada, serán también útiles pero se necesitará un cuidado
mayor para tener la seguridad de que el anticuerpo no suprimirá
demasiado la actividad de LH cuando se use in vivo. Si una
cantidad excesiva de actividad de LH es neutralizada en la oleada de
LH, se producirá esterilidad.
Otro procedimiento útil para identificar
anticuerpos que presentan la capacidad deseada para disminuir la
actividad de LH es realizar un ensayo in vitro para
determinar si los anticuerpos inhiben el efecto de la hLH sobre la
biosíntesis de esteroides. En este ensayo se pueden utilizar
testículos de roedores macho. Un ejemplo típico en el que se usa hLH
se ilustra en la Figura 2. Se prepara una suspensión en crudo de
células de Leydig usando colagenasa según se encuentra descrito (37)
y las células se incuban con cantidades variables de LH y de los
anticuerpos que se han de ensayar. Después de aproximadamente
2-4 horas a 37ºC, el contenido en testosterona de
los tubos se mide mediante radioinmunoensayo. Cuando concentraciones
crecientes de hLH se incuban con las células de Leydig, estas
concentraciones provocan una producción aumentada de testosterona y
darán lugar a una curva típica de dosis-respuesta en
la que concentraciones de hLH de 1 pM - 10 pM serán suficientes para
elevar la producción de esteroides en aproximadamente el 50% del
nivel máximo (véase Figura 2, curva A). Los anticuerpos más útiles
se identifican por sus capacidades para inhibir la esteroidogénesis
inducida por LH. Cuando diferentes anticuerpos monoclonales se
añaden a la LH antes de que la hormona se añada a las células, se
encontrará que algunos de ellos disminuyen la capacidad de la LH
para estimular la formación de testosterona. Los anticuerpos
inhibidores más útiles desplazarán la cuerva de
dosis-respuesta hacia valores menos sensibles (véase
la Figura 2, curvas B y C). Aunque el grado del desplazamiento
dependerá inicialmente de la concentración de anticuerpo, un exceso
masivo de anticuerpo (es decir, más de 100 veces mayor que la
cantidad máxima de hLH usada) no impedirá la formación de
testosterona inducida por LH. Los anticuerpos menos útiles impedirán
la estimulación de la formación de testosterona cuando el anticuerpo
está presente en un exceso de 100 veces en moles (véase la Figura 2,
curva D). Este tipo de ensayo detectará anticuerpos que inhiben la
actividad de LH disminuyendo su unión a receptores para LH y
detectará también anticuerpos que inhiben la actividad de la LH
unida. Ejemplos de anticuerpos útiles incluyen B105, B110, 518B7 y
ZMCG7, anteriormente indicados. Estos anticuerpos necesitarán ser
modificados según se describe más adelante antes de que puedan ser
utilizados repetidas veces en mujeres.
Una vez que se han seleccionado los anticuerpos
o antisueros y que se ha encontrado que satisfacen los criterios
anteriormente descritos e ilustrados en las Figuras 1 y 2, se deben
ensayar sus capacidades para inhibir las acciones de LH in
vivo. Se administra a ratas macho un gran exceso de anticuerpo
(es decir, 100 \mug o más). Veinte minutos después algunas de las
ratas son tratadas con vehículo solo (controles) y a otras se les
administra hLH o una LH que tenga una estructura igual o similar a
la del animal en el que el anticuerpo se va a utilizar. Una hora
después, los niveles de testosterona en plasma se miden mediante
radioinmunoensayo. Un ejemplo típico se ilustra en la Figura 3. Los
anticuerpos o antisueros útiles en la presente invención disminuirán
la potencia de la hLH pero no impedirán su actividad ni siquiera
cuando están presentes en un exceso sobre la cantidad total de LH
administrada. Este ensayo detectará anticuerpos que disminuyen la
actividad de la hormona inhibiendo la unión de LH a los receptores,
inhibiendo la actividad de la LH unida, y/o aumentando el
aclaramiento de LH. Independientemente de la causa de la inhibición
in vivo, los anticuerpos útiles en la presente invención no
impedirán la actividad de niveles elevados de LH ni siquiera cuando
esos anticuerpos están presentes en exceso sobre la cantidad de LH
circulante. Esto se puede detectar midiendo la capacidad del suero
para unir hLH marcada radiactivamente con yodo después de la
administración del anticuerpo. Una muestra de suero (0,01 \mul - 1
\mul) se diluye hasta 25 \mul con una disolución que contiene
NaCl al 0,9%, albúmina de suero bovino en concentración de 1 mg/ml y
tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2). A esto se añaden 25 \mul
de LH marcada radiactivamente con yodo (aproximadamente 50 nCi que
contienen aproximadamente 1 ng). La disolución resultante se incuba
30 minutos a 37ºC. Se añade una disolución de inmunoglobulina G
(IGg) anti-ratón, procedente de cabra, (disponible
procedente de Cappel, Organon Teknia Corp., West Chester, PA)
que contiene 2 \mug de IgG en 50 \mul de la disolución de
NaCl-albúmina anteriormente descrita, y la
disolución resultante se incuba 90 minutos a 37ºC o durante toda la
noche a 4ºC. A esta disolución se añaden 100 \mul de
IgGsorb al 1% (obtenida procedente de The Enzyme Center,
Inc., 36 Franklin St., Malden, MA) reconstituida en agua. Esta
suspensión se mezcla durante 30 minutos a 22ºC y a continuación se
diluye mediante adición de 3 ml de la disolución de
NaCl-albúmina que está enfriada en hielo. La mezcla
se centrifuga durante 10 minutos a 2.000 x g a 4ºC. El sobrenadante
se aspira y la radiactividad del sedimento se mide en un contador
gamma. Como control negativo, se usa suero de un animal que no ha
sido sometido a inmunización ni activa ni pasiva. Como control
positivo, se usa 0,1 ng - 1 ng del anticuerpo que se había inyectado
al principio en el animal. La radiactividad medida en el sedimento
del control negativo se resta de la radiactividad medida en el del
control positivo y de la radiactividad medida en los sedimentos de
las muestras de suero que están siendo ensayadas. Cuando se comparan
los valores resultantes del control positivo y de las muestras de
suero, el suero que contiene anticuerpo en exceso sobre LH será
capaz de inmunoprecipitar al menos el 1%-10% de la LH marcada
radiactivamente con yodo al igual que el control positivo.
La administración de anticuerpos contra hLH en
seres humanos disminuirá las concentraciones eficaces de LH
circulante. La cantidad máxima de disminución depende de lugar del
sitio de unión del anticuerpo sobre la LH. La disminución de la
actividad de LH baja la secreción de hormonas ováricas y
testiculares y con ello disminuye la retroinhibición de FSH. En
consecuencia, los niveles de FSH suben y la fertilidad se aumenta.
Los anticuerpos contra hLH que presentan reacciones cruzadas con una
LH procedente de otras especies o los anticuerpos que han sido
seleccionados por sus capacidades para unirse a LH procedente de
otras especies y para disminuir pero no suprimir la actividad de la
hormona, tendrán efectos similares en esas otras especies. Los
anticuerpos más adecuados para uso en seres humanos serán los que
tienen regiones estructurales y regiones constantes que son
similares a las de las inmunoglobulinas humanas y que son por sí
mismo no antigénicos o sólo débilmente antigénicos cuando se
inyectan en seres humanos. Se pueden preparar anticuerpos adecuados
"humanizando" anticuerpos monoclonales de ratón (es decir,
reemplazando las regiones estructurales y las regiones constantes de
ratón con secuencias similares encontradas en inmunoglobulinas
humanas). Los procedimientos para llevar esto a cabo son muy
conocidos en la técnica (38-40). Otros métodos para
fabricar anticuerpos adecuados incluyen la inmunización de primates
tales como el mono Cynomolgus (41), seguida del aislamiento y
clonación de linfocitos aislados (42). Las inmunoglobulinas de estos
primates tienen regiones estructurales similares a las de las
inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos monoclonales preparados a
partir de estos animales deberían servir como un buen punto de
partida de anticuerpos que se pueden usar en seres humanos.
Muchos anticuerpos que son capaces de una
inhibición parcial de la actividad de hLH presentan tendencia a
unirse a hLH o a otras moléculas de LH que han sido adsorbidas en
plástico o en otras superficies. Por lo tanto, el escrutinio de
anticuerpos deseados muchas veces se facilita detectando las
capacidades de los anticuerpos para unirse a hLH o a otras LH que se
encuentran adsorbidas en placas de microtitulación de plástico, o a
LH que se encuentra unida a complejos LH-receptor.
El escrutinio de anticuerpos que se unen a la hLH que está adsorbida
en una superficie de plástico se puede llevar a cabo de la siguiente
manera. Los pocillos de una placa de microtitulación de plástico se
revisten con 50 \mul de una disolución que contiene 0 \mug ó 1
\mug de hLH en NaCl al 0,9% - tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH
7,2). Esto permite que la hLH se adsorba en la superficie de la
placa de microtitulación. Después de 1 hora a 37ºC, las disoluciones
se retiran y se sustituyen con 200 \mul de NaCl al 0,9% - tampón
de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2) que contiene 200 \mug de
albúmina sérica bovina, durante más de 1 hora a 37ºC. Esto rellena
la mayoría de los sitios de adsorción restantes. La disolución de
albúmina se retira y se sustituye con 50 \mul de NaCl al 0,9% -
tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2) que contiene 50.000 dpm -
100.000 dpm del anticuerpo monoclonal a ensayar, marcado con
^{125}I. El marcaje del anticuerpo monoclonal se realiza usando
Iodo-Gen u otro agente oxidante (22, 43),
según se ha descrito en lo que antecede para el caso de LH, usando
10 \mug de anticuerpo y 500 \muCi de Na^{125}I, excepto que el
tiempo de reacción se prolonga a 1-5 minutos.
Después de una hora a 37ºC, el fluido se retira y la radioactividad
que está adherida a la superficie de la placa de microtitulación se
mide en un contador gamma. Los anticuerpos que presentan una alta
probabilidad de ser útiles para inhibir la actividad de hLH se
encontrarán unidos a los pocillos revestidos con hLH en cantidades
mayores que los anticuerpos unidos a los pocillos no revestidos con
hLH. Este ensayo asimismo detectará también otros tipos de
anticuerpos y se debe realizar un nuevo escrutinio de los
anticuerpos positivos según se describe más adelante o según se
explica en el Ejemplo 2.
Aunque la unión a complejos
LH-receptor no garantiza que un anticuerpo sea útil
para neutralizar parcialmente la actividad de LH, muchos de los
anticuerpos usados en la presente invención se unen a complejos
LH-receptor. Por lo tanto, es posible realizar en
principio un escrutinio con respecto a los anticuerpos convenientes
midiendo sus capacidades para unirse a complejos
LH-receptor. Este ensayo es esencialmente el mismo
que el ensayo Bio-IRMA que ha sido descrito en
trabajos previos (44) y se puede llevar a cabo de manera secuencial
o simultánea. En el ensayo Bio-IRMA simultáneo,
0,025 \muCi - 0,1 \muCi del anticuerpo a ensayar marcado
radiactivamente con yodo (es decir, preparado según se ha descrito
anteriormente), se añade a un homogeneizado de ovarios de rata (es
decir, preparado según se ha descrito anteriormente), y a cantidades
crecientes de LH que incluyen 0 ng, 0,01 ng, 0,1 ng, 1,0 ng, 10 ng,
100 ng y 1.000 ng. Después de una hora a 37ºC, la parte membranosa
del homogeneizado se precipita en forma de un sedimento mediante
centrifugación a 1.000 x g durante 10-20 minutos, el
sobrenadante se aspira y la radiactividad del sedimento se determina
en un contador gamma. Los anticuerpos que se unen a complejos
LH-receptor se detectarán por su capacidad aumentada
para unirse a las membranas incubadas con al menos una de las
concentraciones de LH, superior a la del blanco del ensayo (es
decir, en ausencia de LH añadido). En el ensayo
Bio-IRMA secuencial, las membranas se incuban con la
LH primero durante a 1 hora a 37ºC, se lavan mediante centrifugación
y aspiración según se ha descrito anteriormente y se incuban luego
con 50.000 dpm - 100.000 dpm de anticuerpo marcado radiactivamente
con yodo. Después de una incubación adicional de 1 hora a 37ºC, las
fracciones que contienen el anticuerpo unido y el anticuerpo libre
se separan mediante centrifugación y aspiración según se ha descrito
anteriormente y se miden las cuentas del sedimento en un contador
gamma. La mayoría de los anticuerpos útiles se unirán a los
complejos LH-receptor. Sin embargo, este
procedimiento es solamente un método de escrutinio útil y un ensayo
más concluyente de un anticuerpo implica el uso de un ensayo
biológico in vitro tal como el ensayo basado en la formación
de testosterona que se describe en el Ejemplo 2.
La tendencia de la mayoría de los anticuerpos
útiles a unirse a superficies que contienen LH o a complejos de LH y
de receptores para LH también puede facilitar el aislamiento de
linfocitos después de la inmunización de monos o ratones usando un
procedimiento de revestimiento de superficies (del inglés
"panning procedure"). En este procedimiento, los
linfocitos se añaden a superficies de plástico que han sido
revestidas con albúmina sérica humana o con otra proteína que
previene la unión inespecífica exponiéndolas a disoluciones que
contienen 1 mg/ml de albúmina sérica humana en NaCl al 0,9% - tampón
de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2) durante más de 1 hora a 37ºC. Los
linfocitos que no se unen a estas superficies se añaden luego a
superficies que se revisten exponiéndolas a hLH y luego a albúmina
sérica humana como en el caso anterior. La cantidad de hLH usada no
es crítica siempre y cuando se haya adsorbido material suficiente en
el plástico. Esto se puede conseguir usando 20 \mug - 50 \mug de
hLH/ml. Sin embargo, también servirán cantidades mayores y
cantidades menores. Los linfocitos que se adhieren a las superficies
revestidas con LH se seleccionan y, o se fusionan con células de
mieloma para preparar hibridomas (30), o se transforman con el virus
de Epstein-Barr u otros virus, o se someten a
clonación en el fago lambda (36), o se seleccionan células aisladas
para clonación mediante reacción en cadena de la polimerasa (42).
Los anticuerpos que se producen se someten a escrutinio según se ha
descrito en el ejemplo 2. Estas estrategias aumentan el porcentaje
de los anticuerpos
convenientes.
convenientes.
Muchos anticuerpos que son capaces de producir
una inhibición parcial de LH se pueden también seleccionar a través
de un procedimiento que depende de sus capacidades para unirse a LH
que está unida a receptores para LH. Después de la inmunización de
ratones o de monos con hLH, los esplenocitos y otros linfocitos se
aíslan y se extienden sobre monocapas de células eucariotas que
expresan receptores para LH. Estas monocapas celulares se pueden
preparar transfectando células con vectores de expresión capaces de
expresar el cDNA de receptores para LH de rata (45), humanos (46),
porcinos (47), o de otras especies, mediante métodos estándar en la
técnica (48, 49). Los linfocitos que se adhieren a las monocapas se
desechan. Los linfocitos que no se adhieren a las monocapas se
añaden a monocapas similares de células que expresan receptores para
LH que contienen hLH u otra LH. Estas monocapas se pueden preparar
añadiendo 100 ng de hLH o de otra LH a las monocapas durante toda la
noche a 4ºC y retirando mediante lavado la hormona que no se unió.
Los linfocitos que se adhieren a estas células se seleccionan y, o
se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas (30), o
se transforman con el virus de Epstein-Barr u otros
virus, o se someten a clonación en el fago lambda (36), o se
seleccionan células aisladas para clonación mediante reacción en
cadena de la polimerasa (42). Los anticuerpos que se producen se
someten a escrutinio según se ha descrito en el ejemplo 2. Estas
estrategias también aumentarán el porcentaje de los anticuerpos
convenientes. Aunque esta estrategia basada en receptores es más
tediosa que una estrategia basada en el escrutinio de linfocitos
sobre superficies de plástico revestidas con LH, rendirá un
porcentaje más alto de anticuerpos útiles.
El síndrome del ovario poliquístico (PCO) (del
inglés, " PolyCystic Ovarian") se
caracteriza por un desarrollo folicular incompleto y por una
incapacidad de la mujer para ovular con normalidad. Este ovario
contiene muchos folículos pequeños e inmaduros, de los cuales unos
pocos si acaso alguno, progresan hasta el punto de la ovulación en
ausencia de intervención clínica. Estas mujeres a menudo presentan
andrógenos elevados y un cociente LH/FSH alto en comparación con las
mujeres fértiles que tienen ciclos normales. Existen dos
procedimientos principales para la inducción de la ovulación en
mujeres con PCO. Estos procedimientos incluyen la administración de
FSH para reforzar el desarrollo folicular o la administración de
anti-estrógenos para facilitar la secreción de FSH
por la adenohipófisis. Aunque ambos tratamientos son capaces de
inducir la ovulación, presentan el riesgo de inducir ovulaciones
múltiples debido a que evitan el bucle normal de la retroinhibición
producida por estrógenos que regula la secreción de FSH. Como
resultado de ello, las mujeres tratadas con estos agentes
normalmente son cuidadosamente vigiladas para evitar una
hiperestimulación, efecto secundario potencialmente letal del
tratamiento.
La administración de 10 \mug - 10 mg de un
anticuerpo no neutralizante contra LH que produce una subida
transitoria y autolimitante de la secreción de FSH producirá la
ovulación con menos riesgo de una hiperestimulación que el
tratamiento con gonadotropina. El efecto es transitorio porque el
anticuerpo será metabolizado o será eliminado de la circulación de
alguna otra manera y su eficacia se perderá al cabo de
1-2 semanas después de la administración. El
tratamiento es autolimitante porque el efecto de retroinhibición del
estradiol sobre la secreción de FSH no será eliminado. Por lo tanto,
a medida que los niveles de FSH suben y estimulan el desarrollo
folicular, la secreción de estradiol subirá e inhibirá posteriores
aumentos de la secreción de FSH.
No existen métodos buenos que se puedan usar
para inducir la ovulación en mujeres con PCO y que impliquen
solamente un tratamiento único o doble. La mayoría de los
tratamientos de este síndrome requieren tratamientos múltiples con
FSH, FSH más LH o hCG, hMG, anti-estrógenos, GnRH, o
distintas combinaciones de estos agentes. Algunas estrategias han
empleado también antagonistas de GnRH para disminuir los niveles
circulantes tanto de LH como de FSH de manera que esa ovulación
pudiera inducirse mediante tratamiento con hormonas exógenas. Una
administración única de una concentración elevada del anticuerpo del
tipo del que aquí se describe y se usa es capaz de inducir la
ovulación. Esto es debido a que el anticuerpo se puede administrar
sin riesgo en un exceso enorme y, ya que los anticuerpos tienen
semividas plasmáticas largas, el anticuerpo seguirá siendo eficaz en
el aumento de los niveles de FSH durante varios días. Debido al
afecto de autorregulación natural del estradiol sobre la secreción
de FSH, la secreción de FSH será controlada por los estrógenos
fabricados por el folículo a medida que el folículo se desarrolla.
Cuando llega el momento en que el folículo dominante se ha
seleccionado y los niveles de estradiol han aumentado, gran parte
del anticuerpo habrá sido eliminado de la circulación. El anticuerpo
no interferirá con las acciones de la oleada de LH necesaria para la
ovulación por una o más de varias razones. Primero, la cantidad de
LH liberada está en exceso sobre la cantidad necesaria para la
ovulación. Segundo, el anticuerpo únicamente disminuirá la actividad
de LH, no la neutralizará. Y tercero, cuando llega el momento de la
oleada de LH, gran parte del anticuerpo habrá sido eliminado de la
circulación. Por lo tanto, al tratamiento con el anticuerpo le
seguirá el desarrollo folicular y la ovulación.
La administración de anticuerpos apropiados
ilustrada en el Ejemplo 1 se puede usar para aumentar la fertilidad.
Sin embargo, debido a que ésa es una inmunización pasiva, se
requerirá la administración repetida de anticuerpo para mantener
altos los niveles de anticuerpo durante más de unos pocos días o
semanas. Una elevación a corto plazo (p. ej., de días) es suficiente
para inducir la ovulación en mujeres o para aumentar el número de
ovulaciones en animales en uno solo o en unos cuantos ciclos. Cuando
se desea suprimir parcialmente la actividad de LH y con ello
aumentar la fertilidad durante períodos de tiempo más largos o
durante varios ciclos, es útil inducir una inmunorrespuesta que
provoque la formación activa de anticuerpos contra LH. Para obtener
los anticuerpos más útiles, es necesario diseñar un inmunógeno capaz
de inducir una respuesta contra a una porción de la molécula de LH
similar a la reconocida por los anticuerpos B105, B110 o por otros
anticuerpos que forman complejos con LH que conservan algo de
actividad de LH. Los inmunógenos apropiados derivan de la subunidad
\beta de LH debido a que esta subunidad es exclusiva para LH. La
subunidad \alpha es común para LH, TSH y FSH. Su conformación
parece diferir ligeramente en estas hormonas (21) y, por lo tanto,
también se pueden preparar anticuerpos útiles frente a la subunidad
\alpha. Sin embargo, el uso de los mismos no está comprendido en
la presente invención debido a que los anticuerpos contra la
subunidad alfa poseen el potencial de inhibir las acciones de las
tres hormonas. Si la inmunorrespuesta se dirige contra hFSH, puede
que no aumente la fertilidad y puede que produzca esterilidad.
Cuando lo que se desea es someter a las mujeres una inmunización
activa contra la hLH para aumentar la fertilidad, debe tenerse
cuidado de evitar la inducción de anticuerpos contra hCG. Los
anticuerpos contra hCG poseen el potencial de disminuir la
fertilidad (véase más adelante). Esto normalmente no es un problema
con la inmunización pasiva anteriormente descrita ya que los
anticuerpos contra LH administrados normalmente son eliminados de la
circulación antes del momento en el que la hCG es necesaria para la
fertilidad.
Los antígenos capaces de inducir la formación de
anticuerpos contra una porción de LH que no neutraliza su actividad
(es decir, la inmunorrespuesta deseada) contienen una secuencia
derivada de una porción de la subunidad \beta de LH.
Frecuentemente ésta es una región de la subunidad \beta que queda
expuesta después de que la LH se una a receptores para LH. Para ser
más antigénicos, los inmunógenos deben contener también secuencias
que son extrañas para la persona o animal que va a ser inmunizado.
Si para la inmunización se usa la subunidad \beta completa de LH,
se puede obtener una producción de anticuerpos que inhiben por
completo la actividad de LH. Títulos altos de anticuerpos
neutralizantes pueden producir esterilidad o pueden tener otras
consecuencias negativas tales como inducir una menopausia prematura
o una pérdida de tamaño o de función de los testículos. La mejor
elección de los residuos de la subunidad beta de LH que se deberían
incluir en el inmunógeno son los residuos que quedan expuestos
cuando la hormona se une a los receptores para LH. Estos residuos
incluyen la porción de la hormona cercana a los residuos
74-77, una región de la hormona que es reconocida
por anticuerpos que se unen a las subunidades \beta de hLH o hCG y
a los complejos hLH-receptor o
hCG-receptor (26, 50). Las regiones de la subunidad
\beta que no se deben usar para la inmunización incluyen las
secuencias cercanas a los residuos 89-92 y
47-51. Éstos son los lugares de los sitios de unión
de anticuerpos que neutralizan la actividad.
El diseño de un antígeno sintético mínimo
incluye los residuos de la subunidad \beta de hLH que quedan
expuestos cuando la LH se une a receptores para LH. Algunos de estos
residuos incluyen
Pro73-Arg74-Gly75-Val76-Asp77-Pro78-Val79-Val80-Ser81.
Se pueden acoplar péptidos sintéticos que contienen estas secuencias
a moléculas transportadoras grandes y se pueden usar para la
inmunización empleando métodos muy conocidos en la técnica
(14-16, 51-53). Los anticuerpos no
neutralizantes producidos se unirán con hLH e inhibirán su actividad
biológica.
Con frecuencia la capacidad de antígenos
peptídicos pequeños para inducir una inmunorrespuesta con título
alto es baja. A continuación se ilustra cómo crear un antígeno que
sea más eficaz en la inducción de anticuerpos contra regiones de hLH
que quedan expuestas cuando la hormona se une a receptores para LH.
Una estrategia similar se podría utilizar para diseñar inmunógenos
de cualquier proteína, incluyendo otras LH de vertebrados. Es de
sobra conocido que los mejores inmunógenos son aquellos que difieren
sustancialmente de las proteínas encontradas en un animal aunque
todavía conservan la configuración terciaria del epítopo o de los
epítopos para los que se desea inducir una inmunorrespuesta. Se
puede fabricar un inmunógeno adecuado modificando la subunidad
\beta de hLH de manera que i) conserve la capacidad para unirse a
B105 y/o a otros anticuerpos que inhiben parcialmente las acciones
de hLH, ii) pierda la capacidad de unirse a anticuerpos que
neutralizan la actividad de LH, y iii) sea antigénico. También se
pueden diseñar inmunógenos adecuados partiendo de una proteína
distinta de la subunidad beta de LH y modificándola para que
adquiera la capacidad de unirse a B105 y/o a otros anticuerpos que
inhiben parcialmente las acciones de hLH. Los anticuerpos que
inhiben parcialmente las acciones de hLH se denominan anticuerpos
"molde" y se utilizan para detectar y/o realizar una selección
positiva con respecto a la retención de los epítopos deseados. Son
buenos ejemplos de anticuerpos "molde" aquellos anticuerpos que
se ha encontrado que son eficaces para aumentar la fertilidad según
se ha explicado en el ejemplo 2. Otros anticuerpos que se denominan
anticuerpos de "exclusión" se usan para seleccionar frente a
análogos de antígenos que contienen epítopos no deseados. Son
ejemplos de anticuerpos de exclusión aquellos anticuerpos que
neutralizan por completo la actividad biológica de hLH y/o los que
impiden a la hormona unirse a su receptor.
Existen dos estrategias globales diferentes que
se denominarán "A" y "B" para construir estos antígenos
usando una estrategia de selección positiva/negativa basada en
anticuerpos molde y anticuerpos de exclusión. En la estrategia
"A", se parte de la subunidad \beta de LH y se usa una
mutagénesis al azar para hacer substituciones en regiones de la
molécula situadas fuera del epítopo reconocido por el anticuerpo
"molde". Las nuevas moléculas que se producen son expresadas
(véase más adelante) y se detectan sus capacidades para unirse al
anticuerpo molde. Aquellas moléculas que siguen uniéndose al
anticuerpo molde y que contienen mutaciones en otras regiones de la
molécula se utilizan en una segunda ronda de mutagénesis realizada
sobre una porción diferente de la molécula. Este procedimiento
continúa hasta que todas las regiones de la proteína excepto la
región implicada en el sitio de unión al anticuerpo (p. ej., a B105)
han sido modificadas. Los análogos finales se unirán a los
anticuerpos molde pero no a los anticuerpos de exclusión. En una
variante de este procedimiento, se comienza con una quimera de
hormonas que se une al anticuerpo molde. Estas quimeras se pueden
preparar partiendo de una especie de LH diferente que se sabe que no
se une a anticuerpos molde o que induce una inmunorrespuesta
neutralizante contra hLH. Son ejemplos de este tipo de inmunógenos
las quimeras de las subunidades \beta de LH humana y LH bovina.
Estas quimeras incluyen las subunidad \beta de la LH bovina que ha
sido modificada sustituyendo la prolina 74 con arginina, residuo
encontrado en la subunidad \beta de la LH humana en esta posición.
Regiones homólogas de la especie de LH diferente son sustituidas por
residuos de hLH para crear el sitio de unión para los anticuerpos
molde. Las regiones homólogas se identifican alineando las
secuencias de la hLH y de la otra LH por las posiciones de sus
residuos de cisteína altamente conservados según lo mostrado por
Pierce y Parsons (1).
En la estrategia "B", se usa una molécula
de región estructural que no está relacionada o que es sólo
levemente similar a la estructura de las subunidades \beta de las
hormonas glicoproteicas. Esta molécula puede incluir cualquier
proteína que contenga estructuras en bucle tales como las que se
encuentran en los pliegues de las inmunoglobulinas o entre las
hélices de proteínas reunidas en un haz de cuatro hélices. La
secuencia de uno de estos bucles es sustituida por la secuencia de
hLH comprendida entre los residuos 65-85 mediante
procedimientos estándar de mutagénesis. Cuando esta proteína se
prepara en un vector de expresión en E. coli adecuado (p.
ej., uno de los vectores T7 obtenible procedente de Novagen) se
puede a ensayar con respecto a su capacidad para unirse a
anticuerpos monoclonales que se unen a los complejos
hLH-receptor. Debido a que solamente una porción de
los residuos que forman el epítopo estará presente en la proteína
expresada, su afinidad por el anticuerpo será más baja que la de la
hLH.
Para mejorar la selectividad y la afinidad de
las proteínas fabricadas en las estrategias "A" o "B", se
puede usar un sistema de expresión en bacterias o en bacteriófagos
(34, 36, 55-58). En cada uno de los casos, se
preparan bibliotecas de análogos mutantes y se selecciona el mutante
que presenta la afinidad más alta por B105, B110 o por otro
anticuerpo molde similar que en el ejemplo 2 se haya encontrado que
es útil. Además, se puede utilizar también una selección negativa
usando anticuerpos o antisueros neutralizantes que en el ejemplo 2
se hayan encontrado que son útiles. Esto minimizará la capacidad del
antígeno para inducir la producción de anticuerpos no deseados
cuando el antígeno se usa en una vacuna.
La siguiente descripción se refiere a un método
de selección basado en la presentación en fagos pero un experto en
la técnica de fabricación y escrutinio de bibliotecas podría
adaptarlo fácilmente a casi cualquier sistema de expresión. Uno de
los sistemas que es susceptible a la selección es el basado en la
transferencia de proteínas (59). También se pueden usar varios
sistemas diferentes de presentación en fagos. Uno de esos sistemas
implica el uso de un vector (es decir, pX-M13gIII)
similar a phGH-M13gIII (34). Cuando se usa la
estrategia "A" anteriormente tratada, este nuevo vector
denominado pA-M13gIII contiene o una subunidad
\beta de hLH o una quimera de hLH-subunidad
\beta de LH en lugar de las secuencias que codifican la hormona de
crecimiento de phGH-M13gIII (Figura 4). Cuando se
usa la estrategia "B" anteriormente tratada, las secuencias que
codifican la hormona de crecimiento de phGH-M13gIII
son reemplazadas con un gen que codifica una molécula no relacionada
con la subunidad \beta de hLH excepto por la inclusión de las
secuencias que codifican la subunidad \beta de la hLH cercanas al
residuo 74 para obtener un nuevo vector denominado
pB-M13gIII. La secuencia codificadora de la región
del vector que codifica las secuencias "B" también contiene
sitios de restricción que permiten realizar una mutagénesis de
casete u otros tipos de mutagénesis para permitir la introducción de
secuencias aleatorias. Cuando se introducen secuencia aleatorias en
las regiones codificadoras de los vectores
pA-M13gIII o pB-M13gIII y estos
vectores se usan para transformar E. coli, se creará una
biblioteca de mutantes. Estas proteínas mutantes pueden ser
expresadas sobre la superficie de partículas del fagómido M13 en
forma de proteínas de fusión con el gen III añadiendo el fago
auxiliar M13KO7 a la E. coli. Estas partículas de fagómido se
unirán al anticuerpo en una proporción relativa a las afinidades que
las proteínas "A" o "B" modificadas presentan por el
anticuerpo. Uno de los métodos convenientes para seleccionar las
partículas de fagómido que se unen a los anticuerpos molde es usar
un protocolo de ensayo en fase sólida. En este ensayo, el anticuerpo
molde se usa para revestir una superficie según se encuentra
descrito (22) y seguidamente se añade una disolución que contiene
las partículas de fagómido. Las partículas de fagómido que no se
unan a la superficie se pueden desechar. Las partículas que se unen
al anticuerpo sobre la superficie se pueden separar del anticuerpo
mediante la adición de tampones de pH bajo (es decir, de pH 3) y se
usa para transformar de nuevo E. coli. Cuando se desea
realizar una selección negativa, se pueden sustituir los anticuerpos
de molde por los anticuerpos de exclusión sobre la superficie. En
este caso las partículas que se adhieren a la superficie se
desechan. Este procedimiento se repite varias veces y a continuación
las regiones codificadoras de los varios genes de las proteína
"A" y "B" se someten a secuenciación de DNA. De esta
manera se pueden identificar secuencias que son críticas para la
unión del anticuerpo molde. Además, si se usan anticuerpos de
exclusión, se puede realizar una selección contra epítopos no
deseados. Asimismo, se pueden identificar sustituciones en otras
porciones de la molécula que tengan un efecto escaso o nulo sobre la
conformación de la región de unión del anticuerpo deseado. Cuando
las moléculas codificadas por estas secuencias se usan para
inmunizar animales o seres humanos, inducirán la formación de
anticuerpos que presentan reacciones cruzadas con hLH. Ya que estos
anticuerpos reconocerán una porción de la molécula que se sabe que
está expuesta después de que la hLH se una a sus receptores, serán
capaces de inhibir las acciones de hLH pero no pero impedirán por
completo su actividad biológica.
En algunos casos puede no poder disponerse de
anticuerpos molde y anticuerpos de exclusión. En estos casos se
pueden crear un antisuero molde y un antisuero de exclusión los
cuales pueden sustituir a esos anticuerpos usando la siguiente
estrategia. Se preparan cuerpos lúteos de ovario de rata mediante
tratamiento de ratas hembras con PMSG y hCG según se ha descrito
anteriormente. Estos cuerpos lúteos se incuban con hLH para permitir
que la hormona se una a los receptores para LH presentes en las
membranas. Después las membranas se lavan para retirar la hLH libre
y las membranas se incuban con el antisuero. Los anticuerpos que se
quedan unidos a la hLH que está unida a los receptores para LH de la
membrana se separan luego del resto del antisuero lavando las
membranas. Estos anticuerpos son liberados mediante tratamiento de
las membranas a un pH inferior a 5. Este tratamiento libera de los
receptores tanto a los anticuerpos como a la hLH. Los anticuerpos se
separan de la hLH mediante filtración en gel o mediante otro método
y pueden luego usarse como moldes. Los anticuerpos que permanecen en
el suero desprovisto de anticuerpos molde pueden utilizarse como
anticuerpos de exclusión.
Durante una inmunización activa contra LH se
está creando una respuesta autoinmunitaria dirigida a un sitio
específico. Por lo tanto, es esencial usar proteínas que sean
altamente antigénicas. Esto se puede facilitar usando la estrategia
basada en molde/exclusión descrita en el ejemplo 6, para hacer al
inmunógeno lo más extraño posible. Además, es conveniente hacer la
molécula multivalente para aumentar las probabilidades de que
interaccione con el sistema inmunológico. Un buen método para hacer
la molécula multivalente es añadir residuos al extremo
C-terminal o al extremo N-terminal
que ocasionarán la formación de una hélice \alpha que puede formar
una superhélice con otras moléculas. Las reglas para diseñar
secuencias peptídicas que forman superhélices son muy conocidas en
la técnica (60, 61). Además, también es posible usar secuencias
presentes en la naturaleza, procedentes de proteínas que se sabe que
forman superhélices tales como las encontradas en la proteína
hemaglutinina del virus de la gripe, laminina, GCN4 o cualquiera de
varias otras proteínas. También es posible añadir residuos al
extremo C-terminal o al extremo
N-terminal que darán como resultado la formación de
una triple hélice similar a la encontrada en el colágeno. Estas
triples hélices permitirán que tres o más moléculas de antígeno se
unan. También se pueden utilizar otras estrategias para aumentar la
antigenicidad del inmunógeno, que incluyen acoplar los inmunógenos
por los extremos para fabricar una poliproteína. Según se ha
descrito (Figura 5), es posible diseñar una proteína que tenga un
número cualquiera de unidades repetidas usando esta estrategia.
Los anticuerpos usados en la presente invención
que proporcionan una inhibición no neutralizante de la actividad de
LH, normalmente interaccionan bien con la subunidad \beta libre y
con el heterodímero. Por lo tanto, en la preparación de inmunógenos
para inducir la formación de estos anticuerpos, generalmente es
conveniente partir de la subunidad \beta libre. Por el contrario,
muchos anticuerpos preferidos que proporcionan una inhibición
neutralizante de la actividad de la hCG, se unen al heterodímero
\alpha,\beta mejor que a la subunidad \beta libre de hCG. Para
inducir la formación de estos anticuerpos, muchas veces es útil
partir de un inmunógeno que sea una proteína de fusión preparada
acoplando el extremo C-terminal del péptido que
comprende los residuos 1-114 de la subunidad \beta
de hCG al extremo N-terminal de una proteína
enlazadora flexible compuesta por seis unidades repetidas de glicina
y serina que se repiten. El extremo C-terminal de
esta proteína de fusión se acopla luego al extremo
N-terminal de los residuos 1-96 de
la subunidad \alpha bovina. Esto proporciona un único polipéptido
que posee la conformación global de los residuos de la subunidad
\beta encontrados en hCG y que se puede usar directamente para la
inmunización o que se puede usar como compuesto de partida en el
ejemplo 6. La administración de este antígeno se puede llevar a cabo
de alguna manera que sea muy conocida en la técnica.
Esta manera incluye la inyección, inyección en adyuvantes y el acoplamiento del antígeno a un virus.
Esta manera incluye la inyección, inyección en adyuvantes y el acoplamiento del antígeno a un virus.
1. Se obtienen anticuerpos neutralizantes o bien
fabricando anticuerpos monoclonales o bien adquiriéndolos. También
se pueden obtener antisueros neutralizantes inmunizando conejos u
otros animales contra hCG. También es útil obtener anticuerpos o
antisueros contra hLH.
2. Estos anticuerpos o antisueros se usan como
moldes positivos y negativos para escrutar bibliotecas de mutantes
de la subunidad \beta de hCG. Estas bibliotecas se pueden preparar
mediante mutagénesis al azar de la subunidad \beta de hCG en
regiones concretas de esta molécula. Nótese que es preferible usar
una subunidad \beta de hCG que tiene perdido el extremo
C-terminal o que tiene una secuencia diferente de
esta parte de la molécula, para evitar seleccionar inmunógenos que
sean no neutralizantes. Uno de los procedimientos convenientes
implica el uso de técnicas de presentación en fagos, también
listados más adelante. Sin embargo, la presentación en fagos no es
esencial para que esta técnica sea efectiva.
3. Se permite que los mutantes se unan primero a
los anticuerpos de selección negativa. En el ejemplo presente,
concretamente el desarrollo de una vacuna contra hCG, esto
implicaría la unión a los anticuerpos contra LH o a los antisueros
contra LH para retirar los mutantes que son estructuralmente
idénticos a LH.
4. Los mutantes que no se unieron a los
anticuerpos de selección negativa, se permite luego que se unan a
los anticuerpos de selección positiva, concretamente a los que se
generaron mediante inmunización con hCG. Durante el procedimiento de
selección positiva, se añade también la subunidad \beta libre de
hCG para eliminar los anticuerpos que se unen a la subunidad libre y
para limitar el procedimiento de selección a aquellos anticuerpos
que son específicos para el dímero. Los mutantes que no se unen a
los anticuerpos de selección positiva se desechan. En el caso de
proteínas expresadas en fagos, los fagos se eluyen de los
anticuerpos de selección positiva y se usan para infectar E.
coli.
5. Este procedimiento se repite durante varias
rondas para eliminar los potenciales inmunógenos que son capaces de
unirse a los anticuerpos contra hLH y para excluir además a los
inmunógenos que presentan una baja afinidad por los anticuerpos
contra hCG. Las secuencias de DNA que codifican los inmunógenos se
secuencian. Los inmunógenos que más difieren de la hCG aunque
conservan la capacidad para unirse a anticuerpos o antisueros
específicos para hCG con una afinidad alta, se usan
posteriormente.
6. En caso necesario, se realiza una segunda
ronda de mutagénesis para aumentar el número de diferencias entre el
potencial inmunógeno y la hCG. El objetivo es diseñar un inmunógeno
que difiera de la hLH y que difiera lo más posible de la hCG aunque
conserve los aspectos clave de la estructura de la hCG que le
permiten inducir la producción de anticuerpos neutralizantes con un
título alto. Estos inmunógenos incluyen las regiones de la subunidad
\beta diferentes al extremo C-terminal, que más
difieren de la subunidad \beta de hLH.
7. Una vez que se han seleccionado los
determinantes antigénicos mayores y únicos, el inmunógeno se hace
multivalente. Existen varios métodos para llevar esto a cabo. Uno de
estos métodos consiste en fusionar el determinante a una proteína
que ya es multivalente por sí misma o que forma multímeros (p. ej.,
las inmunoglobulinas). Otro de los procedimientos es fusionar a la
proteína residuos que forman superhélices y que promoverán la
asociación. Siempre que sea posible, estos residuos procederán de
proteínas naturales que sean conocidas por inducir una
inmunorrespuesta (p. ej., proteínas asociadas con la gripe).
8.A. Es esencial conseguir títulos altos contra
la molécula intacta de hCG si se desea prevenir la fertilidad. Esto
puede requerir unir la hCG con una molécula que sea similar a una
subunidad \alpha. La subunidad \alpha de otras glicoproteínas de
mamíferos es adecuada como material de partida.
8.B. Una molécula que es también adecuada como
punto de partida es una molécula que posea las propiedades
convenientes de ser un péptido individual y que conserve la
estructura del heterodímero. En este caso, es conveniente hacer
también mutaciones en la porción de la molécula derivada de la
subunidad \alpha.
8.C. Los inmunógenos se pueden producir usando
cualquier método conveniente tal como la expresión en E.
coli, levaduras o células de mamífero. No se requiere que los
inmunógenos estén glicosilados. Los inmunógenos también pueden ser
DNA o RNA. También pueden encontrarse integrados en las cubiertas de
virus.
8.D. Tampoco se requiere partir de la subunidad
\beta de hCG. Se puede partir de cualquier proteína. La clave es
usar la estrategia basada en un molde para seleccionar las proteínas
que se desean. Por ejemplo, se puede partir de un haz de cuatro
hélices e incorporar las secuencias de aminoácidos procedentes de
porciones de la subunidad \beta de hCG que están cerca de los
residuos 38-57 y 91-92. Se puede
también partir de una inmunoglobulina incluyendo una inmunoglobulina
que sea un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo,
dirigido contra un anticuerpo específico contra hCG.
La Figura 1 es una gráfica que ilustra la
influencia de anticuerpos y antisueros sobre la unión de hLH marcada
radiactivamente a receptores para LH. La Figura 1 ilustra la
influencia de tres tipos diferentes de anticuerpos o antisueros
sobre la unión de hLH a los receptores para LH. El anticuerpo
"A" tiene un efecto escaso o nulo sobre la unión de la hormona
a los receptores. Su principal influencia inhibidora potencial in
vivo sería sobre el metabolismo de la hormona. En anticuerpo
"B" tiene la capacidad de bloquear parcialmente la unión de hLH
a los receptores para LH. Por lo tanto, aunque este anticuerpo sería
inhibidor in vivo, ni siquiera un exceso muy grande de este
anticuerpo en comparación con el nivel de LH sería incapaz de
disminuir su actividad por debajo del 40% según aquí se demuestra.
Nótese que se pueden producir anticuerpos diferentes que tienen
capacidades diferentes para bloquear las actividades de LH, (p. ej.,
B105 y B110). El anticuerpo "B" es un ejemplo del tipo general
de anticuerpo que es más útil in vivo. El anticuerpo "C"
es un anticuerpo neutralizante debido a que a concentraciones altas
es capaz de impedir la actividad de hLH. Debido a su potencial para
impedir la actividad de LH, un exceso de este anticuerpo inhibiría
la fertilidad.
La Figura 2 es una gráfica que ilustra la
influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH
para inducir la esteroidogénesis in vitro. La Figura 2
ilustra los efectos de tres anticuerpos sobre la capacidad de LH
para inducir la síntesis de testosterona (es decir, la
esteroidogénesis) en suspensiones de células de Leydig de testículos
de rata. La curva "A" ilustra la capacidad de hLH para inducir
la esteroidogénesis en ausencia de anticuerpos. La curva "B"
ilustra la capacidad de la hLH para inducir la esteroidogénesis en
presencia de un exceso masivo de un anticuerpo que es capaz de
disminuir la actividad de hLH en aproximadamente 3 veces. La curva
"C" ilustra la capacidad de la hLH para inducir la
esteroidogénesis en presencia de un exceso masivo de un anticuerpo
que es capaz de disminuir la actividad de hLH en aproximadamente 20
veces. La curva "D" ilustra la capacidad de la hLH para inducir
la esteroidogénesis en presencia de un exceso masivo de un
anticuerpo que es capaz de neutralizar la actividad de la hLH. La
decisión de usar un anticuerpo "B" o "C" in vivo
dependerá del cociente LH/FSH y de la medida en que se desea
suprimir la actividad de LH. Cuando los niveles de hLH son altos y
necesitan ser disminuidos al máximo, un anticuerpo "C" sería el
preferido. Cuando los cocientes hLH/hFSH están sólo ligeramente
elevados, un anticuerpo "B" sería el preferido. El uso de un
anticuerpo "D" a dosis muy altas produciría la esterilidad. Se
prevé que se descubrirá que muchos de los anticuerpos útiles
poseerán la capacidad para disminuir la actividad de hLH o de otra
LH en células de ovario igual que sucede en células de
testículos.
La Figura 3 es una gráfica que ilustra la
influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH
para inducir la esteroidogénesis in vivo. La Figura 3 ilustra
los efectos de tres anticuerpos diferentes sobre la formación de
testosterona en machos cuando cantidades masivas de los anticuerpos
se administran por vía i.v. antes de administrar diferentes
cantidades de hLH también por vía i.v. En todos los ejemplos
ilustrados, la cantidad de anticuerpo administrado excede
enormemente a la cantidad de hLH en una relación en moles. Se
esperaría encontrar efectos similares de estos anticuerpos sobre la
esteroidogénesis en hembras. La curva "A" muestra el efecto de
hLH sobre la esteroidogénesis en hembras en ausencia de anticuerpo.
La curva "B" ilustra el efecto de una cantidad masiva de un
anticuerpo que es capaz de inhibir la actividad de hLH en el 40%
como máximo. La curva "C" ilustra la influencia de una cantidad
masiva de anticuerpo que es capaz de inhibir la actividad de hLH en
el 95% como máximo. La curva "D" ilustra los efectos de una
cantidad masiva de un anticuerpo neutralizante.
La Figura 4 muestra vectores que se pueden usar
en las estrategias de selección basadas en molde/exclusión. Estos
vectores tienen un diseño similar al descrito por Bass y col. (34) y
se preparan reemplazando las secuencias codificadoras de la hormona
de crecimiento humana por secuencias de una quimera de hLH usando
procedimientos de mutagénesis mediante reacción en cadena de la
polimerasa, que son procedimientos estándar en la técnica, tal como
el procedimiento SOEing descrito por Ho y col. (63). En esta Figura,
"lac p" representa el promotor lac, stII representa la
secuencia conductora, "hLH beta" representa la secuencia que
codifica la subunidad beta de la LH humana desde el codón 1 hasta el
codón 114, "M13 gen III" representa la secuencia codificadora
de los codones 198-410 del gen de la proteína de M13
en el mismo marco de lectura que los codones de stII y de la
subunidad beta de LH humana. "Resistencia a Amp" es el gen
procedente de pBR322 que codifica la enzima
\beta-lactamasa, "322 ori" es el origen de
replicación procedente de pBR322 y "f1 ori" es el origen de
replicación procedente de M13. Las mutaciones se harían en la
porción "hLH beta" de este vector.
La Figura 5 muestra los tipos de inmunógenos que
poseen una antigenicidad aumentada para su uso en la inmunización
activa contra LH. Algunos de estos inmunógenos presentan la
repetición en heptada que se sabe que forma una superhélice
(recuadro A). Otros de estos inmunógenos presentan una repetición
que se sabe que forma una triple hélice (recuadro B). Estos
inmunógenos proporcionan una antigenicidad aumentada debido a que
son poliméricos. Otros métodos para fabricar inmunógenos poliméricos
incluyen preparar proteínas de fusión o con el extremo
C-terminal (recuadro C) o con extremo
N-terminal de las inmunoglobulinas (recuadro D). Un
inmunógeno monocatenario que comprende una proteína de fusión de la
subunidad \alpha bovina y de las subunidades \beta de hCG y de
hFSH tendría una antigenicidad aumetada en seres humanos.
Ilustración A: Los codones de dos o más
repeticiones en heptada se insertan en el marco de lectura entre el
codón 114 y el codón de terminación de la subunidad \beta de LH o
de una subunidad \beta análoga. El diseño de la repetición en
heptada es similar al que se describe en la referencia 60. Cada
repetición contiene 7 aminoácidos señalados en orden "A, B, C, D,
E, F, G" que tienen las siguientes propiedades. Los aminoácidos A
y D son hidrófobos y son leucina, isoleucina o valina. Los
aminoácidos E y G son aminoácidos con carga. El aminoácido E debe
tener la carga contraria a la del aminoácido G para formar
homodímeros. Así, si E es glutamato, G debe ser lisina. Los
aminoácidos "B, C, F" pueden ser prácticamente de cualquier
tipo que favorezca la formación de hélices. Por lo tanto, deben
contener un número bajo, si acaso alguno, de prolinas o
glicinas.
Ilustración B: Los codones de 6 o más
repeticiones de tripletes de aminoácidos se insertan en el marco de
lectura entre el codón 114 y el codón de terminación de la subunidad
\beta. Estos tripletes codifican los aminoácidos glicina, X, Y, de
los que X e Y son cualquier aminoácido que se sabe que forma parte
de la secuencia del colágeno que forma una triple hélice.
Ilustración C: Los codones correspondientes a la
cadena pesada de la IgG se insertan inmediatamente en 5' con
respecto al codón 1 de la subunidad \beta. Cuando estos genes se
coexpresan con los de la cadena ligera lambda o kappa de IgG,
provocarán la producción de una IgG que contiene dos subunidades
\beta en su extremo C-terminal.
Ilustración D: Los codones correspondientes a la
región de cadena pesada de IgG que carecen de la región variable y
de la primera región constante se insertan en el marco de lectura
entre el codón 114 y el codón de terminación de la subunidad
\beta.
Ilustración E: Los codones correspondientes a
una secuencia de repetición glicina-serina (es
decir, la repetición GS), tal como la secuencia
serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina,
se insertan en el marco de lectura entre el codón 114 y el codón de
terminación de un análogo de subunidad \beta. El último codón de
este análogo se convierte en el 126. A continuación, los codones
1-96 de la subunidad \alpha bovina o de otra
subunidad \alpha, o los codones 1-92 de la
subunidad \alpha humana, se insertan en el marco de lectura entre
el codón 126 y el codón de terminación de la construcción de la
subunidad \beta que contiene la cola de
poli(glicina-serina). Esto da lugar a una
gonadotropina de una sola subunidad que lleva en sí la estructura
del heterodímero de la hormona glicoproteica.
Ilustración F: Los codones correspondientes a la
subunidad \alpha humana, bovina, o de otras especies de
vertebrados, o una secuencia análoga, se añaden entre el último
codón y el codón de terminación de un gen que codifica una
repetición en heptada que contiene solamente aminoácidos con carga
positiva en las posiciones E y G de la repetición en heptada (es
decir, Repetición en heptada n.º 1) usando métodos conocidos por
toda persona experta en las técnicas estándar del DNA recombinante
para la preparación y expresión de genes. Cuando este gen se expresa
en células bacterianas o en levaduras, o en otras células u
organismos eucariotas, producirá una proteína que llevará la
repetición en heptada con carga positiva en su extremo amino
terminal y una subunidad \alpha o un análogo de subunidad \alpha
en su extremo carboxi terminal. Los codones de una repetición en
heptada que codifica los aminoácidos con carga negativa de las
posiciones E y G (es decir, Repetición en heptada n.º 2) se añaden
entre el último codón y el codón de terminación de un análogo de
subunidad \beta. Cuando este gen se expresa en bacterias o
levaduras, o en otras células u organismos eucariotas, producirá una
proteína que llevará una subunidad \beta o un análogo en su
extremo amino terminal y la repetición en heptada con carga negativa
en su extremo carboxi terminal.
Ilustración G: Esta ilustración muestra el
heterodímero que se forma cuando las proteínas que tienen la forma
descrita en la ilustración F se mezclan. Las secuencias de la
repetición en heptada n.º 1 y de la repetición en heptada n.º 2 se
eligen para propiciar la formación de heterodímeros y disminuir la
formación de homodímeros.
Ilustración H: Se forman multímeros cuando los
compuestos de las ilustraciones F y G se mezclan, debido a la
combinación de las subunidades \alpha y \beta y a las
repeticiones en heptada. En las ilustraciones A-H,
"N" y "C" hacen referencia al extremo amino terminal y al
extremo carboxi terminal de las proteínas. La "i" hace
referencia a una unidad individual que se puede repetir varias
veces. Nótese también que aunque las repeticiones en heptada aquí
ilustradas son idénticas, el uso de repeticiones idénticas no es
esencial. Existe una gran cantidad de proteínas que contienen
repeticiones en heptada no idénticas y que son capaces de formar
homodímeros o heterodímeros (60).
Las secuencias codificadoras del análogo n.º 1
listadas en la Tabla 1 se pueden sintetizar usando la estrategia
basada en la ligación de bloques que se encuentra descrita (54) o se
pueden preparar partiendo de las secuencias codificadoras de la
subunidad \beta de hCG y de la subunidad \alpha humana. Estas
secuencias se pueden clonar procedentes de una biblioteca de cDNA de
placenta humana. Las secuencias que codifican el péptido señal
procedentes de la subunidad \alpha humana se delecionan y las
secuencias codificadoras de las proteínas se empalman entre sí
utilizando la técnica SOEing (63) de la siguiente manera: Un cebador
nº 1 (100 ng)que tiene la secuencia
5'-ATGAAATCGACGGAAT
CAGACTCGAGCCAAGGATGGAGATGTTCCAGGGGCTGCT-3' y un cebador nº 2 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-GGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCATCG-5' se mezclan con el cDNA de la subunidad \beta de hCG (1 \mug) que hace de molde y se realiza una PCR durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa adquirida procedente de Stratagene, LaJolla, CA, y trifosfatos de los didesoxinucleótidos y un tampón para PCR según se encuentra descrito (63). Un cebador nº 3 (100 ng) que tiene la secuencia 5'-GGATCCGGTAGCGGATCTGGTAGCGCTCCTGATGTG
CAGGATTGCCCA-3' y un cebador nº 4 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-ACGTCATGAACAATAATAGTGTT
TAGAATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5' se mezclan con el cDNA de la subunidad \alpha humana (1 \mug) que hace de molde y se realiza una PCR durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa y trifosfatos de los didesoxinucleótidos y un tampón para PCR según se encuentra descrito (63). Estas dos reacciones de PCR dan lugar a productos que sirven como moldes intermediarios en una tercera (y última) reacción de PCR que da lugar a las construcciones deseadas en una forma adecuada para clonar. La reacción de PCR final se realiza mezclando 1 \mul de los productos procedentes de las dos primeras reacciones de PCR junto con un cebador n.º 5 que tiene la secuencia 5'-ATGAAATCGACGGAATCA
GACTCGAGCCAAGG-3' y un cebador n.º 6 que tiene la secuencia 3'-ATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGAT
TAGGCCT-5' durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa, trifosfatos de los didesoxinucleótidos adicionales y un tampón para PCR. El producto de la PCR final se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BglII y se liga en el pSVL (vector de expresión obtenido procedente de Pharmacia (Piscataway, NJ) que se había digerido con XhoI y BamHI para crear un vector que dirigirá la síntesis del Análogo 1. El sitio XhoI del producto de la PCR se ligará al sitio XhoI del pSVL y el sitio de la BglII del producto de la PCR se ligará al sitio BamHI del pSVL. El sitio XhoI se regenerará y los sitios BglII y BamHI serán eliminados. Las secuencias de las regiones codificadoras (es decir, las situadas entre los sitios XbaI y KpnI, cónfer, Figura 6) de varias construcciones se determinan hasta que se encuentra una de ellas que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos deseada, ilustrada en la Figura 6. Esto se hace para eliminar los posibles errores que surgen como resultado de la PCR y demás manipulaciones del DNA y es una precaución estándar para estar seguros de que se obtiene la secuencia deseada. Se espera que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que son la parte de la secuencia señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que son retirados por la célula durante la síntesis de proteínas. Este vector se expresa en células COS-7 según se encuentra descrito (64) y la proteína liberada en el medio se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada radiactivamente con yodo a anticuerpos monoclonales o a anticuerpos preparados contra hCG. La proteína fabricada por las células COS-7 competirá con la hCG marcada radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia University), B105 (obtenido procedente de Columbia University), B07 (obtenido procedente de Columbia University), B109 (obtenido procedente de Columbia University), A201 (obtenido procedente de Columbia University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), HCZ107 (obtenido procedente de Hybritech), o HCO514 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG18 (obtenido procedente de Pierce), ZMCG13 (obtenido procedente de Pierce) o ZMCG7 (obtenido procedente de
Pierce) o 518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37) y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimule la formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de esperar que este análogo fuera un buen punto de partida para usar en una vacuna anticonceptiva usando la estrategia basada en moldes descrita en el Ejemplo 11. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como Análogo nº 1 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS. Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de expresión con las enzimas endonucleasas de restricción ApaI y Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA bicatenario sintético con los codones de aminoácidos deseados que contiene cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio ApaI/Eco47III mediante métodos estándar, secuenciando la región situada entre el ApaI/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han realizado, y expresando la proteína en células COS-7. Esto se puede realizar para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta proteína actúe como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se esperaría que varias copias de la proteína se unieran para formar multímeros.
CAGACTCGAGCCAAGGATGGAGATGTTCCAGGGGCTGCT-3' y un cebador nº 2 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-GGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCATCG-5' se mezclan con el cDNA de la subunidad \beta de hCG (1 \mug) que hace de molde y se realiza una PCR durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa adquirida procedente de Stratagene, LaJolla, CA, y trifosfatos de los didesoxinucleótidos y un tampón para PCR según se encuentra descrito (63). Un cebador nº 3 (100 ng) que tiene la secuencia 5'-GGATCCGGTAGCGGATCTGGTAGCGCTCCTGATGTG
CAGGATTGCCCA-3' y un cebador nº 4 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-ACGTCATGAACAATAATAGTGTT
TAGAATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5' se mezclan con el cDNA de la subunidad \alpha humana (1 \mug) que hace de molde y se realiza una PCR durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa y trifosfatos de los didesoxinucleótidos y un tampón para PCR según se encuentra descrito (63). Estas dos reacciones de PCR dan lugar a productos que sirven como moldes intermediarios en una tercera (y última) reacción de PCR que da lugar a las construcciones deseadas en una forma adecuada para clonar. La reacción de PCR final se realiza mezclando 1 \mul de los productos procedentes de las dos primeras reacciones de PCR junto con un cebador n.º 5 que tiene la secuencia 5'-ATGAAATCGACGGAATCA
GACTCGAGCCAAGG-3' y un cebador n.º 6 que tiene la secuencia 3'-ATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGAT
TAGGCCT-5' durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa, trifosfatos de los didesoxinucleótidos adicionales y un tampón para PCR. El producto de la PCR final se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BglII y se liga en el pSVL (vector de expresión obtenido procedente de Pharmacia (Piscataway, NJ) que se había digerido con XhoI y BamHI para crear un vector que dirigirá la síntesis del Análogo 1. El sitio XhoI del producto de la PCR se ligará al sitio XhoI del pSVL y el sitio de la BglII del producto de la PCR se ligará al sitio BamHI del pSVL. El sitio XhoI se regenerará y los sitios BglII y BamHI serán eliminados. Las secuencias de las regiones codificadoras (es decir, las situadas entre los sitios XbaI y KpnI, cónfer, Figura 6) de varias construcciones se determinan hasta que se encuentra una de ellas que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos deseada, ilustrada en la Figura 6. Esto se hace para eliminar los posibles errores que surgen como resultado de la PCR y demás manipulaciones del DNA y es una precaución estándar para estar seguros de que se obtiene la secuencia deseada. Se espera que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que son la parte de la secuencia señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que son retirados por la célula durante la síntesis de proteínas. Este vector se expresa en células COS-7 según se encuentra descrito (64) y la proteína liberada en el medio se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada radiactivamente con yodo a anticuerpos monoclonales o a anticuerpos preparados contra hCG. La proteína fabricada por las células COS-7 competirá con la hCG marcada radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia University), B105 (obtenido procedente de Columbia University), B07 (obtenido procedente de Columbia University), B109 (obtenido procedente de Columbia University), A201 (obtenido procedente de Columbia University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), HCZ107 (obtenido procedente de Hybritech), o HCO514 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG18 (obtenido procedente de Pierce), ZMCG13 (obtenido procedente de Pierce) o ZMCG7 (obtenido procedente de
Pierce) o 518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37) y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimule la formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de esperar que este análogo fuera un buen punto de partida para usar en una vacuna anticonceptiva usando la estrategia basada en moldes descrita en el Ejemplo 11. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como Análogo nº 1 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS. Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de expresión con las enzimas endonucleasas de restricción ApaI y Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA bicatenario sintético con los codones de aminoácidos deseados que contiene cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio ApaI/Eco47III mediante métodos estándar, secuenciando la región situada entre el ApaI/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han realizado, y expresando la proteína en células COS-7. Esto se puede realizar para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta proteína actúe como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se esperaría que varias copias de la proteína se unieran para formar multímeros.
Las secuencias codificadoras correspondientes al
Análogo nº 2 que aparecen listadas en la Tabla 1 se pueden
sintetizar usando la estrategia basada en la ligación de bloques que
se encuentra descrita (54) o se pueden preparar mediante PCR usando
como molde los cebadores nº 1 y nº 7 y la construcción de expresión
descrita en el Ejemplo 9 y en la Figura 6. La secuencia del cebador
nº 7 es
3'-TGGTGGGGAACTGGACACTACTGGGCGCCCCTAGGCCATCG-5'.
El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de
restricción XhoI y BamHI y se liga con el fragmento mayor del DNA
obtenido digiriendo la construcción de expresión descrita en el
Ejemplo 12 con XhoI y BamHI. Las secuencias de las regiones
codificadoras situadas entre los sitios XhoI y BamHI de varias
construcciones se determinan hasta que se obtiene una que se
encuentra que codifica una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos descrita en la Figura 7. Esto asegurará que no existen
artefactos de clonación en la región que ha sido alterada. Se espera
que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos
MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que son la parte de la secuencia señal que se
encuentra en la subunidad \beta de hCG, y que son retirados por la
célula durante la biosíntesis de proteínas. Este vector se expresa
en células COS 7 y la proteína liberada en el medio se ensaya con
respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada
radiactivamente con yodo a los anticuerpos monoclonales o a los
antisueros preparados contra hCG. La proteína fabricada por las
células COS-7 competirá con la hCG marcada
radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes
anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia
University), B105 (obtenido procedente de Columbia
University), B07 (obtenido procedente de Columbia
University), B109 (obtenido procedente de Columbia
University), A201 (obtenido procedente de Columbia
University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), o
HCO514 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG18 (obtenido
procedente de Pierce), ZMCG13 (obtenido procedente de
Pierce) o ZMCG7 (obtenido procedente de Pierce) o
518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de
California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con
la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos
sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell,
Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto
estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de
Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37)
y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimula la
formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de
esperar que este análogo fuera un buen punto de partida para usar en
una vacuna anticonceptiva usando la estrategia basada en moldes
descrita en el Ejemplo 8. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como
el Análogo n.º 2 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS.
Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de
expresión con las enzimas de restricción endonucleasas SstII y
Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA
bicatenario sintético que lleva los codones de aminoácidos deseados
que contienen cualquier número de codones de glicina o serina u
otros codones de aminoácidos, en el sitio SstII/Eco47III mediante
métodos estándar, secuenciando la región situada entre el
SstII/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han
realizado, y expresando la proteína en células
COS-7. Esto se puede realizar para optimizar la
actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta
proteína actúe como un monómero o se una para formar homodímeros
activos. Además, se esperaría que varias copias de la proteína se
unieran para formar multímeros.
Las secuencias codificadoras del Análogo nº 3,
listadas en la Tabla 1, se pueden sintetizar usando la estrategia
basada en la ligación de bloques que se encuentra descrita (54) o se
pueden preparar de la manera descrita para el Análogo nº 2 en el
Ejemplo 10 a excepción de que los cebadores nº 1 y nº 7 se
reemplazan con los cebadores nº 8 y nº 9, y de que el cDNA de la
subunidad \beta de hLH se usa como molde en lugar del cDNA de la
subunidad \beta de hCG. El cDNA de la subunidad \beta de hLH se
puede obtener mediante escrutinio de una biblioteca de hipófisis
humana. La secuencia del cebador nº 8 es
5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGAATGGAGATGCTCCAGGGGCTGCT-3'
y la secuencia del cebador nº 9 es
3'-GTGGGGAACTGGACACTGGTGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGAC
CATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 9. Las secuencias de las regiones codificadoras situadas entre los sitios XhoI y BamHI de varias construcciones se determinan hasta que se encuentra una que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 8. Se espera que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que son la parte de la secuencia señal encontrada en la subunidad \beta de hLH, y que son retirados por la célula durante la biosíntesis de proteínas. Este vector se expresa en células COS 7 y la proteína liberada en el medio se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada radiactivamente con yodo a los anticuerpos monoclonales o a los antisueros preparados contra hCG. La proteína fabricada por las células COS-7 competirá con la hCG marcada radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia University), B105 (obtenido procedente de Columbia University), A201 (obtenido procedente de Columbia University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG7 (obtenido procedente de Pierce) o 518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37) y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimula la formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de esperar que este análogo constituya un buen punto de partida para usar en el diseño de vacunas para aumentar o inhibir la fertilidad usando el procedimiento basado en moldes anteriormente descrito. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como el Análogo nº 3 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS. Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de expresión con las enzimas endonucleasas de restricción BamHI y Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA bicatenario sintético que lleva los codones de aminoácidos deseados que contienen un número cualquiera de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos, en el sitio BamHI/Eco47III mediante métodos estándar, secuenciando la región situada entre el BamHI/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han realizado, y expresando la proteína en células COS-7. Esto se puede hacer para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta proteína actúe como un monómero o se una para formar homodímeros activos. Además, cabría esperar que varias copias de la proteína se unieran para formar multímeros.
CATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 9. Las secuencias de las regiones codificadoras situadas entre los sitios XhoI y BamHI de varias construcciones se determinan hasta que se encuentra una que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 8. Se espera que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que son la parte de la secuencia señal encontrada en la subunidad \beta de hLH, y que son retirados por la célula durante la biosíntesis de proteínas. Este vector se expresa en células COS 7 y la proteína liberada en el medio se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada radiactivamente con yodo a los anticuerpos monoclonales o a los antisueros preparados contra hCG. La proteína fabricada por las células COS-7 competirá con la hCG marcada radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia University), B105 (obtenido procedente de Columbia University), A201 (obtenido procedente de Columbia University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG7 (obtenido procedente de Pierce) o 518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37) y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimula la formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de esperar que este análogo constituya un buen punto de partida para usar en el diseño de vacunas para aumentar o inhibir la fertilidad usando el procedimiento basado en moldes anteriormente descrito. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como el Análogo nº 3 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS. Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de expresión con las enzimas endonucleasas de restricción BamHI y Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA bicatenario sintético que lleva los codones de aminoácidos deseados que contienen un número cualquiera de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos, en el sitio BamHI/Eco47III mediante métodos estándar, secuenciando la región situada entre el BamHI/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han realizado, y expresando la proteína en células COS-7. Esto se puede hacer para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta proteína actúe como un monómero o se una para formar homodímeros activos. Además, cabría esperar que varias copias de la proteína se unieran para formar multímeros.
Se espera que los análogos 1-3
contengan 4 oligosacáridos ligados a asparagina ya que contienen 4
grupos de codones para la secuencia
Asparagina-X-Treonina-Serina
en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina. La retirada de
los oligosacáridos ligados a asparagina, en particular los de la
subunidad \alpha, se ha observado que disminuye la eficacia de la
hormona. Las señales de glicosilación ligadas a asparagina se pueden
retirar de la porción de la subunidad \alpha de las gonadotropinas
monocatenarias usando una PCR según aquí se describe. Un cebador 16
de PCR que tiene la secuencia:
5'-TGCTTCTCTAGAGCATATCCCACTCCACTAAGGTCCAAGAAGACGATGTTGGTCCAAAAGCAAGTCACCT-3'
y un cebador 17 de PCR que tiene la secuencia:
3'-CAAAGTTTCACCTCGTTGTGTGCCGCACGGTGACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCATG-5'
se usan en una reacción de PCR con el vector que es capaz de dirigir
la expresión del Análogo 1 y que se describió en el Ejemplo 9 y en
la Figura 6. Después de 25 ciclos en las condiciones descritas en el
Ejemplo 9, el producto de la PCR y el vector de expresión se
digieren con XbaI y KpnI. El fragmento pequeño producido en la
digestión del vector se desecha y el producto de la PCR digerido se
liga en el vector en su sitio. Esto produce un vector de expresión
que codifica el Análogo 11, un análogo que contiene únicamente 2
señales de glicosilación ligadas a Asn pero que se espera que
conserve su afinidad por los anticuerpos y antisueros que se unen a
hCG. Se espera también que conserve su afinidad por los receptores
para LH, mostrada mediante su capacidad para competir con hCG por la
unión a membranas procedentes de cuerpos lúteos de rata. Sin
embargo, se espera que presente una capacidad disminuida para
inducir la transducción de señales, especialmente cuando se
determine su capacidad para inducir una acumulación de AMP cíclico
(37). Es posible crear derivados similares de los Análogos 2 y 3 en
los que los oligosacáridos se han retirado de la porción de la
proteína derivada de la subunidad \alpha, digiriendo cada uno de
los vectores de expresión con BamHI y KpnI, desechando el fragmento
más pequeño, y ligando el fragmento pequeño BamHI/KpnI obtenido
mediante digestión del Análogo 11. De esta manera, el Análogo 2 se
convertiría en el Análogo 12 y el Análogo 3 se convertiría en el
Análogo 13. Nótese que también sería posible retirar sólo una de las
dos señales de glicosilación presentes en la porción de la
gonadotropina monocatenaria, derivadas de la subunidad \alpha,
simplemente cambiando las secuencias de los cebadores 16 y 17
durante su síntesis y siguiendo el protocolo aquí descrito. Cada uno
de estos análogos exhibiría la misma unión a anticuerpo y a receptor
que sus precursores. Presentarían una eficacia disminuida y a
consecuencia de ello, inhibirían la transducción de señales. Los
análogos 11, 12 y 13 disminuirían la actividad de LH y estimularían
la fertilidad cuando se administraran en la primera parte de la fase
folicular del ciclo menstrual. Disminuirían la actividad de hCG e
impedirían la fertilidad cuando se administrasen cerca del momento
en el que se espera la menstruación.
La eficacia de las gonadotropinas es
proporcional a su contenido en carbohidratos y aunque los Análogos
11, 12 y 13 poseen una eficacia más baja, es posible disminuir aún
más su eficacia eliminando todas las cadenas de oligosacárido. Las
cadenas de oligosacárido ligadas a asparagina se pueden eliminar del
Análogo 11 mediante una PCR SOEing (63) usando los cebadores 1 y 18
en una de las reacciones y los cebadores 2 y 19 en una segunda
reacción. El vector de expresión del Análogo 11 se utiliza como
molde en ambas reacciones. La secuencia del cebador nº 18 es
5'-CGGGGTAGGTTCGGTGGGACCGACACCTCTTCCTCCCGACGGGG-3'
y la secuencia del cebador nº 19 es:
3'-GTGGAGAAGGAGGGCTGCCCCGTGTGCATCACCGTCAACACCACCATC-5'.
Después de 25 ciclos a 94ºC (30 s), 55ºC (60 s) y 72ºC (60 s), 1
\mul de cada una de las reacciones de PCR se mezcla con el cebador
nº 5 y con el cebador adicional nº 2, con tampón recién preparado,
con enzima y con los trifosfatos de los desoxinucleótidos. El
producto de la reacción después de 25 ciclos adicionales se corta
con XhoI y BamHI y con él se sustituye el DNA original que se
encuentra entre los sitios XhoI/BamHI del vector que codifica el
Análogo 11. Esto se lleva a cabo digiriendo el vector con XhoI y
BamHI, desechando el fragmento pequeño y ligando luego el fragmento
grande con el producto de la PCR digerido con Xho/BamHI. Unos
cuantos clones se someten a secuenciación del DNA hasta que se
obtiene el clon que codifica el análogo descrito en la Figura 11,
denominado Análogo 1a. Cuando este análogo se expresa en células
COS-7, la proteína que se fabrica será reconocida
por los mismos anticuerpos y antisueros que el Análogo 1. El Análogo
1a se unirá también a los receptores para lutropina pero tendrá una
eficacia disminuida en comparación con la hCG. Por lo tanto, será
útil para disminuir la función de LH o hCG. Cuando se administre en
las primeras etapas de la fase folicular del ciclo menstrual, el
Análogo 1a disminuirá la síntesis de andrógenos. A consecuencia de
ello, disminuirá la síntesis de estradiol, los niveles de FSH
subirán y se estimulará la fertilidad. El Análogo 1a también será
útil para inhibir la luteinización prematura del folículo. Cuando se
administre en la fase lútea en aproximadamente el momento en el que
se espera la menstruación, el análogo bloqueará las acciones de la
hCG y servirá como inductor de la menstruación y como inhibidor de
la fertilidad. El análogo 1a también servirá como un buen compuesto
de partida para diseñar vacunas usando la estrategia basada en
moldes anteriormente descrita.
El vector que codifica el Análogo 2a se prepara
fácilmente a partir del Análogo 1a y del Análogo 12. El Análogo 1a
se digiere con KpnI y MstII y el fragmento pequeño se desecha. El
fragmento grande se liga por separado al fragmento pequeño preparado
mediante digestión con KpnI-MstII del vector que
codifica el Análogo 12. El Análogo 2a se unirá a los mismos
anticuerpos y receptores que el Análogo 2. Sin embargo, sus
capacidades para inducir la transducción de señales disminuirán. Por
consiguiente, servirán como inhibidores. El Análogo 2a será eficaz
principalmente para bloquear la unión de las hormonas a receptores
para LH. Dependiendo del momento en el que se administra, el Análogo
2a inducirá fertilidad (es decir, cuando se administre en la primera
fase del ciclo menstrual), o inhibirá la fertilidad (es decir,
cuando se administre cerca del momento de la implantación o cerca
del momento en el que se espera la menstruación). En este sentido
los Análogos 1a y 2a presentarán actividades similares.
El vector que codifica el Análogo 3a se puede
fabricar mediante una PCR SOEing (63) en la que el Análogo 13 hace
de molde. La estrategia para el diseño de los cebadores es similar a
la que se describe para la preparación de los cebadores usados para
modificar el vector de expresión del Análogo 1a. Cuando el Análogo
3a se expresa en células COS-7, las proteínas que se
fabrican será reconocidas por los mismos anticuerpos y antisueros
que el Análogo 3. El Análogo 3a será útil para inhibir la actividad
de las hormonas que se unen a receptores para LH. Como tal
estimulará la fertilidad cuando se administre al principio de la
fase folicular. El análogo 3a será útil como molécula de partida
para diseñar la vacuna que se ha de usar para aumentar la fertilidad
usando la estrategia basada en moldes y los anticuerpos capaces de
neutralizar parcialmente la actividad de LH. El Análogo 3a será
también útil como molécula de partida para diseñar la vacuna para
prevenir la fertilidad usando la estrategia basada en moldes y los
anticuerpos que son capaces de neutralizar la actividad de LH.
Debido a la influencia positiva de los residuos
de oligosacárido sobre la estabilidad de las hormonas circulantes,
frecuentemente es útil añadir cadenas de oligosacárido extra a las
proteínas. La adición de oligosacáridos también se puede usar para
prevenir interacciones no deseadas con anticuerpos o receptores. Las
superficies de la proteína que no interaccionan con receptores son
lugares útiles para añadir las cadenas de oligosacáridos que se van
a usar para estimular la función de la hormona. Esto puede tener un
efecto importante para modular las actividades de hormonas
glicoproteicas monocatenarias o para modular las actividades de las
hormonas glicoproteicas
\alpha,\beta-heterodiméricas. Por ejemplo, la
adición de una señal de glicosilación a la subunidad \beta de FSH
en los residuos 71-73 para originar la creación de
un oligosacárido ligado a asparagina en el residuo 71, dará lugar a
una hormona con una actividad más alta. Por el contrario, la adición
de un residuo de glicosilación en esta región de la proteína después
de que los otros sitios de glicosilación hayan sido retirados,
aumentará su actividad inhibidora. Los métodos para llevar a cabo
la mutagénesis son métodos estándar en la técnica y varían desde la
síntesis completa de las secuencias codificadoras mediante ligación
de bloques de oligonucleótidos sintéticos (54) hasta la PCR SOEing
(63). Ya se han proporcionado varios ejemplos de mutagénesis
mediante PCR SOEing.
Los Análogos 1-3 y, en
particular, los Análogos 1-3a se utilizarán como
compuestos de partida para el diseño de vacunas dirigido con moldes.
Para el desarrollo de vacunas específicas de hormonas, de uso en
seres humanos, es útil fabricar análogos similares a los listados en
la Tabla 1, con una subunidad \alpha no humana en lugar de la
subunidad \alpha humana. Esto es debido a que la subunidad
\alpha bovina hace a las proteínas más desemejantes a las hormonas
humanas que los análogos listados en la Tabla 1. La estrategia para
diseñar hormonas glicoproteicas monocatenarias es similar a la
listada en los Ejemplos 9-11, a excepción de que las
secuencias que codifican la subunidad \alpha humana ilustradas son
sustituidas por las secuencias que codifican las subunidades
\alpha no humanas. De manera similar, las señales de glicosilación
se pueden retirar modificando cambiando los codones que codifican
asparagina o serina o treonina, o insertando una prolina entre la
asparagina y la serina o treonina.
Además, cuando para diseñar inmunógenos se
utiliza la estrategia basada en moldes, con frecuencia es
conveniente partir de una molécula no humana que tenga una afinidad
baja, si no nula, por los moldes usados en la selección positiva, e
introducir residuos que den como resultado la selección. Estos
análogos se pueden preparar haciendo sustituciones con las
secuencias de las subunidades \beta de FSH, LH o TSH procedentes
de fuentes no humanas, poniéndolas en lugar de la secuencia de la CG
humana ilustrada en los Ejemplos 9-15 y en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Análogo | Composición |
1 | n-hCG\beta(1-145)-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92)-c |
2 | n-hCG\beta(1-114)-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92)-c |
3 | n-hLH\beta(1-114)-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92)-c |
1a | n-hCG\beta(1-145)[N13X,N30X]-Secuencia enlazadora-\alphahumana (1-92)[N52X,N78X]-c |
2a | n-hCG\beta(1-114)[N13X,N30X]-Secuencia enlazadora-\alphahumana (1-92)[N52X,N78X]-c |
3a | n-hLH\beta(1-114)[N30X]-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92) [N52X,N78X]-c |
\newpage
"n-" se refiere al extremo
N-terminal de la proteína.
"-c" se refiere al extremo
C-terminal de la proteína.
"hCG\beta(1-145)"
se refiere a los residuos 1-145 de la secuencia de
aminoácidos de la subunidad \beta de hCG:
\vskip1.000000\baselineskip
"hCG\beta(1-114)"
se refiere a los residuos 1-114 de la secuencia de
aminoácidos de la subunidad \beta de hCG:
\vskip1.000000\baselineskip
"hLH\beta(1-114)"
se refiere a los residuos 1-114 de la secuencia de
aminoácidos de la subunidad \beta de hLH:
"N13X" se refiere a la sustitución del
residuo de asparagina 13 de la subunidad \beta de hCG por
glutamina u otro aminoácido y análogos.
"N30X" se refiere a la sustitución del
residuo de asparagina 30 de la subunidad \beta de hCG o de hLH por
glutamina u otro aminoácido y análogos.
"N52X" se refiere a la sustitución del
residuo de asparagina 52 de la subunidad \alpha humana por
glutamina u otro aminoácido y análogos.
"N78X" se refiere a la sustitución del
residuo de asparagina 78 de la subunidad \alpha humana por
glutamina u otro aminoácido y análogos.
"\alphahumana(1-92)"
se refiere a los residuos 1-92 de la secuencia de la
subunidad \alpha humana:
"Secuencia enlazadora" se refiere a una
secuencia que contiene los aminoácidos glicina y serina que se
repiten tal como GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGDS, GSGSGSGSGS o cualquier
otra secuencia de aminoácidos que permite que las secuencias de las
subunidad \alpha y de la subunidad \beta de la gonadotropina
monocatenaria formen un complejo en el que las porciones de la
subunidad \alpha y de la subunidad \beta se unen con las
porciones de la subunidad \alpha y de la subunidad \beta de la
misma molécula o de otra molécula.
Notas referentes a la Tabla
1
1. El orden de los componentes de izquierda a
derecha en la tabla es el orden en el que los componentes están
presentes en la proteína desde el extremo amino terminal hasta el
extremo carboxi terminal.
2. Debido a la alta conservación de la secuencia
de todas las gonadotropinas de vertebrados, que se puede observar
con el alineamiento de sus residuos de cisteína, se pueden preparar
gonadotropinas monocatenarias mediante sustitución de las
correspondientes porciones de las subunidades \beta de hCG, hLH y
hFSH por cualquiera de los residuos homólogos.
3. La secuencia
\alphahumana(1-92) puede ser sustituida por
la secuencia de las otras subunidades \alpha de gonadotropinas de
vertebrados. Esto incluye, pero no se limita a ellos, los residuos
1-96 de la subunidad \alpha bovina.
4. Como puede observarse, el orden de los
componentes es que las secuencias derivadas de la subunidad \beta
están en posición amino terminal con respecto a las secuencias
derivadas de la subunidad \alpha. El orden de los componentes en
la tabla se puede ser invertir de manera que las secuencias de las
subunidades \alpha estén en posición amino terminal con respecto a
las secuencias de las subunidades \beta.
5. Las secuencias de aminoácidos se muestran en
forma del código estándar de una sola letra excepto cuando se
indique.
6. Las secuencias codificadoras de todos estos
análogos se pueden fabricar mediante métodos estándar del DNA
recombinante que son muy conocidos en la técnica. Uno de los
procedimientos para componer estas secuencias es el proporcionado
por Campbell y col. (54). Estas secuencias se pueden expresar en
células eucariotas mediante métodos muy conocidos en la técnica
usando vectores que han sido diseñados para expresión en eucariotas
y que se encuentran disponibles procedentes de
In-Vitrogen, San Diego, CA. Los vectores que no
contienen cadenas de oligosacáridos también se pueden fabricar en
E. coli mediante métodos muy conocidos en la técnica usando
vectores tales como los vectores pET que se pueden obtener
procedentes de Novagen.
7. Los sitios de glicosilación situados en las
asparaginas 13 y/o 30 de la subunidad \beta de hCG pueden ser
destruidos mediante sustitución de esa asparagina según se ha
ilustrado, y/o mediante sustitución de los residuos 14 y/o 31 con
una prolina, y/o mediante sustitución de los residuos 15 y/o 32 con
cualquier otro aminoácido distinto de serina o treonina.
8. El sitio de glicosilación situado en la
asparagina 30 de la subunidad \beta de hLH puede ser destruido
mediante sustitución de esa asparagina según se ha ilustrado, y/o
mediante sustitución del residuo 31 con una prolina, y/o mediante
sustitución del residuo 32 con cualquier otro aminoácido distinto de
serina o treonina.
9. Los sitios de glicosilación situados en las
asparaginas 52 y/o 78 de la subunidad \alpha humana pueden ser
destruidos mediante sustitución de esa asparagina según se ha
ilustrado, y/o mediante sustitución de los residuos 53 y/o 79 con
una prolina, y/o mediante sustitución de los residuos 54 y/o 80 con
cualquier otro aminoácido distinto de serina o treonina.
10. Los sitios de glicosilación situados en las
asparaginas 56 y/o 82 de subunidades \alpha no humanas pueden ser
destruidos mediante sustitución de esa asparagina con cualquier otro
aminoácido, y/o mediante sustitución de los residuos 57 y/o 83 con
una prolina, y/o mediante sustitución de los residuos 58 y/o 84 con
cualquier otro aminoácido distinto de serina o treonina.
\vskip1.000000\baselineskip
Análogo | Actividad | Uso |
1 | LH | Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad en machos. |
2 | LH | Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad en machos. |
3 | LH | Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad en machos. |
1a | Anti-LH | *Facilita la ovulación; Pone fin a un embarazo; |
Disminuye la secreción de andrógenos. | ||
2a | Anti-LH | *Facilita la ovulación; Pone fin a un embarazo; |
Disminuye la secreción de andrógenos. | ||
3a | Anti-LH | *Facilita la ovulación; Pone fin a un embarazo; |
Disminuye la secreción de andrógenos. |
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la presente invención se
pueden administrar a mamíferos, p. ej., animales o seres humanos, en
cantidades efectivas para proporcionar el efecto terapéutico
deseado. Debido a que la actividad de estos compuestos y el grado
del efecto terapéutico deseado varían, el nivel de dosificación del
compuesto empleado también variará. La dosificación real
administrada vendrá también determinada por factores generalmente
conocidos tales como el peso corporal del paciente y la
hipersensibilidad individual del paciente particular.
\newpage
A lo largo de esta solicitud, se ha mencionado
la referencia de diversas publicaciones.
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Claims (6)
1. Uso de un anticuerpo no neutralizante que se
une a la subunidad \beta de la hormona luteinizante y disminuye
pero no elimina la actividad de hormonas glicoproteicas sobre el
receptor para la hormona luteinizante incluso cuando está presente
en una concentración que une la totalidad de dicha hormona
glicoproteica presente, en la preparación de una composición
farmacéutica para estimular la fertilidad en mamíferos hembra
estimulando la producción de la hormona estimulante del
folículo.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
el mamífero es un ser humano y la hormona luteinizante es la hormona
luteinizante humana.
3. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 2, en el que el anticuerpo se une a la
subunidad \beta de la hormona luteinizante cuando la hormona
luteinizante está unida a un receptor para hormona luteinizante.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que
el anticuerpo se une a uno de los residuos situados entre las
posiciones 70-80 de la subunidad \beta de la
hormona luteinizante.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que
el anticuerpo se une a uno de los residuos situados entre las
posiciones 74-77 de la subunidad \beta de la
hormona luteinizante.
6. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 5, en el que el anticuerpo se usa para
regular la ovulación en hembras humanas.
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