ES2251731T3

ES2251731T3 - Gonadotropina monocatenaria.

Info

Publication number: ES2251731T3
Application number: ES97122148T
Authority: ES
Inventors: William R. Moyle
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2006-05-01
Anticipated expiration: 2015-02-17
Also published as: CA2183564A1; DE69534723D1; EP0751782A1; PT751782E; JPH11263799A; US20070253955A1; EP1849802A2; JPH09509418A; EP0839831A2; DE69535260D1; ATE342061T1; DE69534723T2; ES2273335T3; DE69535260T2; AU1878795A; EP0751782A4; US7001597B1; ATE314392T1; EP0839831A3; AU695111B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LOS METODOS PARA POTENCIAR LA FERTILIDAD REDUCIENDO LAS ACTIVIDADES Y/O LOS NIVELES DE HORMONAS GLUCOPROTEICAS CIRCULANTES CON ACTIVIDAD LUTEOTROPICA (LH). LAS MOLECULAS DE LA INVENCION SON ANTICUERPOS U OTROS AGENTES DE UNION QUE REDUCEN LAS ACTIVIDADES BIOLOGICAS DE LA LH. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A METODOS NUEVOS PARA DISEÑAR Y/O SELECCIONAR ANTICUERPOS CONTRA PARTES ESPECIFICAS DE PROTEINAS COMO LA LH Y LA GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (HCG) CON EL FIN DE PERMITIR LA REDUCCION DE SUS ACTIVIDADES BIOLOGICAS HASTA LOS GRADOS DESEADOS. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA PREPARACION DE SUBUNIDADES AISLADAS DE LAS GONADOTROPINAS Y DE ANTAGONISTAS DE GONADOTROPINAS PARA SER UTILIZADOS EN LA ESTIMULACION E INHIBICION DE LA FERTILIDAD Y PARA EL CONTROL DE LA HIPERESTIMULACION OVARICA. EN UNA REALIZACION PREFERENTE, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE ESTIMULACION DE LA FERTILIDAD EN MAMIFEROS BASADO EN LA REDUCCION DE LAACTIVIDAD DE HORMONAS GLUCOPROTEICAS CON ACTIVIDAD LUTEINIZANTE PRESENTES EN LA CIRCULACION Y A LA ESTIMULACION DE LA PRODUCCION DE HORMONA FOLICULOESTIMULANTE MEDIANTE LA ADMINISTRACION A MAMIFEROS DE UNA CANTIDAD EFECTIVA DEL AGENTE DE UNION QUE SE UNE A LA HORMONA LUTEINIZANTE.

Description

Gonadotropina monocatenaria.

La presente invención se refiere a nuevos agonistas y antagonistas de hormonas glicoproteicas que reducen las actividades de hormonas con actividades como LH y/o aumentan las actividades de hormonas con actividad de folitropina.

Las descripciones referidas en este documento que ilustran los antecedentes de la invención y que proporcionan detalles adicionales en lo que concierne a su práctica son, por conveniencia, referidas numéricamente en el texto siguiente y son agrupadas respectivamente en la bibliografía añadida.

La familia de hormonas glicoproteicas (1) consiste en tres glicoproteínas \alpha,\beta-heterodiméricas encontradas en la hipófisis anterior donde se forman. Las hormonas glicoproteicas son la hormona luteinizante (también conocida como lutropina o LH), la hormona estimulante del folículo (folitropina o FSH); y la hormona estimulante del tiroides (también conocida como tirotropina o TSH). Se conocen hormonas en seres humanos tales como hLH, hFSH y hTSH, respectivamente. En alguna especie, una hormona glicoproteica estructuralmente similar a la LH llamada coriogonadotropina o CG, se prepara en la placenta y se libera en la circulación. En los seres humanos, esta hormona glicoproteica se llama hCG. En primates, también se encuentran cantidades significativas de todas las hormonas como productos de excreción en la orina. Después de la menopausia, cuando la secreción de LH y FSH de la hipófisis anterior aumenta enormemente, se encuentran cantidades significativas de LH y FSH en la orina. Los extractos de gonadotropina de orina de mujeres menopáusicas se llaman gonadotropinas menopáusicas humanas (hMG). A diferencia de la hCG, que interactúa como la LH con los receptores de LH, pero sólo débilmente con los receptores de FSH, la hMG interactúa tanto con los receptores de LH como de FSH. La actividad dual de hMG es debida a la presencia de hLH, hFSH y sus metabolitos en el extracto urinario. La orina de mujeres embarazadas y menopáusicas es la fuente principal de las actividades de gonadotropina y tiene importantes usos comerciales.

Las gonadotropinas tales como FSH, LH, y, en alguna especie, CG juegan un papel principal en el proceso reproductivo (1-6), mientras que la hormona estructuralmente emparentada, TSH, es importante para la función de tiroides (1). Tanto la LH como la FSH son esenciales para la pubertad y la función reproductiva normal. La carencia de FSH, LH, o hCG suficiente en momentos apropiados causa infertilidad o finalización del embarazo. Cantidades excesivas de estas hormonas pueden causar una pubertad prematura o una hiperestimulación de las gónadas. En los hombres, la FSH es esencial para el inicio y el mantenimiento de la espermatogénesis (7,8). La inmunoneutralización de la FSH conduce a una disminución en la espermatogénesis y una pérdida de fertilidad. En las mujeres, la FSH es esencial para el desarrollo folicular que conduce a la producción del gameto femenino en la ovulación. La enfermedad poliquística ovárica es una causa común de infertilidad en mujeres y es una condición caracterizada por un desarrollo folicular incompleto. La fertilidad, por lo general, puede ser restaurada por la administración de FSH o hMG. La fertilidad también puede ser restaurada a menudo por tratamientos con antiestrógenos, compuestos que inhiben el efecto de la regeneración negativa de estrógenos con la secreción de FSH permitiendo así que los niveles de FSH aumenten. En los hombres, la LH se requiere para la pubertad y, en su ausencia, hay una incapacidad para adquirir los atributos sexuales y la fertilidad de un adulto. La LH es principalmente responsable de la síntesis de andrógenos en los testículos. Estos esteroides tienen una influencia beneficiosa en la espermatogénesis y de modo anormal altos niveles de andrógenos pueden mantener la espermatogénesis una vez que ha sido iniciada (9). En las mujeres, la LH es esencial para la ovulación y la formación del cuerpo lúteo. La LH también tiene una influencia sinérgica con la FSH en el desarrollo del folículo (4) y es conocida por promover la síntesis de andrógenos foliculares. Estos andrógenos sirven como precursores para la formación de estrógeno etimulada por FSH. La LH también puede aumentar el efecto de FSH sobre células granulosas, particularmente en las etapas posteriores de la maduración del folículo cuando las células granulosas han adquirido los receptores de LH. La hCG preparada por el tropoblasto es importante para el mantenimiento de la secreción de progesterona del cuerpo lúteo durante el inicio del embarazo humano. Las actividades clínicas de estas hormonas y sus usos son revisadas ampliamente en varios manuales estándar incluyendo el de Yen y Jaffe (2).

Las diferencias de los efectos de FSH y LH y las interacciones endocrinas complejas entre las dos hormonas hacen que tengan acciones sinérgicas sobre el desarrollo folicular y la síntesis del estradiol (4). Por ejemplo, la producción de estrógeno ovárica normal es debida al efecto de la LH sobre la formación de andrógenos y la influencia de FSH sobre la conversión de andrógenos a estradiol. A su vez, el estradiol puede suprimir la secreción de FSH de la hipófisis. Durante el ciclo menstrual normal, los niveles de FSH disminuyen cuando el folículo se agranda y secreta cantidades crecientes de estradiol. Cuando los niveles de estradiol alcanzan una cantidad suficiente durante la fase folicular, pueden provocar un aumento de la secreción de LH de la hipófisis que causa la ovulación. La relación de la actividad de LH/FSH así como de los niveles hormonales absolutos en la sangre son importantes para las funciones reproductivas tales como la maduración del folículo y la ovulación del número apropiado de ovocitos durante los ciclos de estro y menstrual.

Aunque la secreción, tanto de LH como de FSH, puede ser inhibida por hormonas esteroides, la secreción de FSH es más sensible por lo general que la de LH en la regulación de regeneración negativa por estrógenos. De hecho, en muchas especies, los altos niveles de estrógenos pueden aumentar la secreción de LH, particularmente si los niveles de progesterona son bajos. La administración de antiestrógenos, compuestos que interrumpen la regulación de la regeneración normal negativa de estradiol sobre la secreción de FSH, conduce, a menudo, a una mayor liberación de FSH y una mayor producción de gametos. Clínicamente, los antiestrógenos son ampliamente usados para aumentar la probabilidad de la ovulación en mujeres que tienen enfermedad poliquística ovárica. Lamentablemente, ya que los efectos negativos del estradiol sobre la secreción de FSH son responsables, en parte, de controlar el número de folículos que se desarrollan al punto de la ovulación, la interrupción del bucle de regeneración negativa de estrógeno-FSH normal puede originar un número inadecuado de óvulos que se mestrúan. Un mecanismo que cause una mayor secreción de FSH sin eliminar el control de regeneración negativa de la secreción de FSH tendría un uso valioso en un aumento de la fertilidad.

La FSH purificada es capaz de estimular el desarrollo del folículo en mujeres, particularmente cuando está también presente alguna LH endógena. La relación de FSH/LH es la más alta en el momento del ciclo menstrual cuando se inicia el desarrollo folicular. Sin embargo, ambas hormonas son esenciales para la fertilidad. La inmunoneutralización de LH conduce a infertilidad en hombres y mujeres (10-12). De la misma manera, se ha demostrado que la inmunoneutralización de CG, una hormona que actúa vía los receptores de LH, impide la fertilidad en primates (13-16). No se han mostrado anticuerpos para la LH antes de estimular la fertilidad.

Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales de hCG (llamados hCG-mAb) inhiben la unión de hCG a su receptor in vitro (17). Dependiendo de la posición de sus epítopos, los hCG-mAbs tiene capacidades diferentes para inhibir la unión de hCG a los receptores de LH. B105 y B110 son ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos en hCG y LH que permanecen expuestos cuando las hormonas se unen a los receptores de LH (17). Los complejos de las hormonas con estos anticuerpos monoclonales se unen a los receptores de LH, aunque con una afinidad inferior que las hormonas libres. Por consiguiente, estos anticuerpos inhiben la unión de las hormonas a los receptores de LH. Sin embargo, el grado máximo de inhibición observada en presencia de anticuerpos en exceso es de menos del 100% y más bajo que los de los anticuerpos que forman complejos con las hormonas que no se unen a los receptores de LH. En presencia de B105 suficiente o B110, la cantidad de hormona necesitada para inducir una respuesta biológica aumenta. Por lo tanto, incluso un exceso masivo o de anticuerpos suficientes para unirse prácticamente a toda la hCG libre o de la LH en el ensayo es incapaz de prevenir una respuesta a cada hormona cuando las concentraciones de los complejos hormona-anticuerpo exceden el nivel umbral.

Como se ha comentado antes, se ha demostrado hace varios años que la inmunoneutralización de LH impide la fertilidad. Estos fenómenos ocurren porque el antisuero que fue usado en estos estudios neutralizó la actividad biológica de LH. Sin embargo, cuando el antisuero apropiado o los anticuerpos, tales como B105 o B110, son usados, la actividad biológica de LH no se elimina. Más bien, una cantidad predeterminada la reduce. Cuando esto pasa, se reduce la síntesis de andrógenos. Ya que los andrógenos son precursores de estrógenos, también se reduce la síntesis de estrógenos. La disminución del estradiol tiene un impacto más grande sobre la secreción de FSH que sobre la secreción de LH. La secreción de FSH será realzada y esto conducirá a una relación mayor de FSH/LH y a un potenciado desarrollo folicular. En mujeres, esta relación de FSH/LH conducirá a un mayor desarrollo del folículo. En los hombres, esta relación de FSH/LH conducirá a una mayor función de las células de Sertoli y a una mayor espermatogénesis.

Un enfoque para aumentar la fertilidad que se basa en reducir los niveles de LH no ha sido usado antes. En parte, esto es debido a la existencia de muchos informes de que los anticuerpos para LH inhibien la fertilidad y porque los métodos para preparar y seleccionar los anticuerpos que reducen, pero que no neutralizan, la actividad de LH eran desconocidos antes. Por lo tanto, no se esperaría que este enfoque para la fertilidad fuera acertado. Como será comentado más tarde, este enfoque para una mayor fertilidad tiene varias ventajas en relación con las técnicas actuales, en principio, en mujeres que generan y liberan LH y FSH de sus glándulas pituitarias. Ya que la reducción de los niveles de LH no interrumpe las relaciones de regeneración endocrinas normales entre el estradiol y la FSH en la función pituitaria, hay una menor probabilidad posiblemente de inducir la hiperestimulación ovárica que con las técnicas existentes. Esto significa que habrá menos necesidad de un control caro y exigente del paciente. Además, sólo uno o como mucho unos pocos tratamientos serán requeridos para inducir la fertilidad.

Otro método nuevo para aumentar la fertilidad es emplear un antagonista de LH durante la fase folicular del ciclo menstrual. Desde hace varios años se sabe que las cadenas de oligosacáridos sobre las hormonas de glicoproteicas son esenciales por sus posibilidades de provocar la transducción de señal (1). Las hormonas glicoproteicas que carecen de restos de carbohidratos tienen peores capacidades de provocar una respuesta biológica. Estos análogos pueden usarse para bloquear la unión de LH a sus receptores. Esto reducirá la actividad de la LH en circulación y por lo tanto mejorará la fertilidad. Se han encontrado gonadotropinas desglicosadas que tenían semividas biológicas cortas y se descubrió que no eran útiles para su uso original pretendido, a saber, para inhibir la fertilidad reduciendo la síntesis de progesterona luteínica y causando el aborto. Moviendo los restos de carbohidratos para alternar las porciones de la hormona eliminando las señales de glicosilación (es decir, las secuencias de aminoácidos Asparagina-X-Treonina o Asparagina-X-Serina, donde X es cualquier aminoácido excepto Prolina) de un sitio y creando señales de glicosilación en sitios alternos de las subunidades \alpha y \beta, es posible diseñar análogos con actividad agonista reducida que tienen semividas lo suficientemente largas para ser útiles. Además, preparando gonadotropinas monocatenarias en las cuales las subunidades \alpha y \beta están unidas covalentemente, es posible aumentar la estabilidad de las hormonas en la circulación. Esto es porque las actividades de unión del receptor y las semividas en plasma de las gonadotropinas heterodiméricas son mayores que cualquiera de las subunidades. El enlace covalente previene la disociación de las dos subunidades en la circulación. Ha sido descrito anteriormente que el enlace covalente une dos dominios de polipéptido conectados por un enlazante polipeptídico. Estos dos dominios de polipéptido definen un sitio de unión sintético híbrido que tiene especificidad para un antígeno preseleccionado (66). Se han usado para unir polipéptidos de fusión nuevos enlazantes peptídicos que proporcionan una mayor estabilidad y que son menos susceptibles a la agregación que los enlazantes peptídicos anteriormente conocidos (67).

Aunque la estimulación de la fertilidad es importante para restaurar la fertilidad a parejas estériles, la inhibición de la fertilidad es deseable a menudo como un método de planificación familiar. Además, la inhibición de la fertilidad sería útil en la producción comercial de ganadería ya que se eliminaría la necesidad de la castración o se prevendría el desarrollo del celo en el ganado mantenido en la zona de alimentación. La inhibición de la fertilidad en otros animales, incluyendo perros y gatos, también sería deseable como un reemplazo de la esterilización o la castración de ellos. La inhibición de la fertilidad en caballos también sería preferible al caballo castrado, particularmente si puede reversible. Como se dice anteriormente, la fertilidad puede ser inhibida por la administración de anticuerpos neutralizantes para LH o FSH. También puede ser inhibida usando una vacuna que induzca a la formación de estos anticuerpos. Debido a la acción de hCG en el mantenimiento del embarazo, también se esperaría que los tratamientos que conducen a una menor secreción o actividad de hCG causen infertilidad. En mujeres, sería más deseable inhibir la fertilidad inhibiendo más bien hCG que hLH o hFSH. Esto es porque los tratamientos que neutralizaron hLH o hFSH causarían el cese de la función ovárica y apresurarían el inicio de los problemas asociados con la menopausia. En el ganado y otros animales domésticos, sería más importante inhibir la LH para prevenir la pubertad o interrumpir el celo. Como se dice anteriormente, los anticuerpos apropiados para la coriogonadotropina son capaces de inhibir la fertilidad en primates y en mujeres y ha sido reconocido que el desarrollo de anticuerpos para hCG es un método potencial importante de contracepción desde hace muchos años (18). Dado que la hCG es producida por un gran número de cánceres humanos y ya que los anticuerpos para hCG pueden interrumpir estos tumores, la inmunización también tendría un impacto beneficioso sobre la terapia del cáncer o la prevención (19).

Varias tentativas han sido hechas para inventar una vacuna tal como una vacuna anticonceptiva basada en HCG que tenga en cuenta las diferencias entre la hCG y otras hormonas glicoproteicas (14,18). Lamentablemente, el desarrollo de la vacuna ha sido obstaculizado por las homologías estructurales entre todas las hormonas glicoproteicas. El inmunógeno preferido debe ser altamente antigénico aunque no induzca a los anticuerpos a reaccionar en cruzado con otras glicoproteínas tales como la FSH humana, LH o TSH. Basado en el conocimiento de las actividades de las hormonas glicoproteicas descritas anteriormente, una vacuna que indujera los anticuerpos que interactuan con LH, FSH o TSH también causaría la infertilidad y/o la inhibición de la función del tiroides. Lamentablemente, la neutralización de LH o FSH también causaría el cese de ciclos menstruales normales y la pérdida de la producción de estrógeno que está asociada con la fertilidad en las mujeres. La terminación de la función ovárica causaría probablemente el desarrollo prematuro de la osteoporosis y otros problemas asociados con la menopausia. La inhibición de la función del tiroides conduciría a hipotiroidismo. Las semejanzas en las estructuras de hCG y hLH han hecho particularmente difícil diseñar un inmunógeno apropiado que no genere anticuerpos de reacción cruzada. La mayor parte de los trabajos han sido dedicados a la preparación de anticuerpos contra el extremo C único de la subunidad \beta de hCG ya que esta parte de la molécula no se encuentra en la hLH (1). Sin embargo, esta región no es muy antigénica. En los trabajos para inventar inmunógenos también se han empleado péptidos obtenidos a partir de la subunidad \beta (14), conjugados de la subunidad \beta con otras proteínas (20), o heterodímeros que contenían conjugados de la subunidad \beta de hCG y subunidades a ovinas (18). Lamentablemente, la mayor parte de estos inmunógenos no son muy eficaces y se necesita un mejor inmunógeno para preparar este método práctico.

La dificultad de inventar una vacuna basada en hCG puede ser apreciada por una comprensión de las estructuras de las hormonas glicoproteicas. Todas las hormonas glicoproteicas contienen una subunidad \alpha común. Mientras la conformación de las partes de la subunidad \alpha se diferencia en todas las hormonas y puede ser reconocida por anticuerpos monoclonales seleccionados (21), las partes de la subunidad \alpha tiene la misma conformación en cada hormona glicoproteica. Por lo tanto, muchos anticuerpos para la subunidad \alpha reconocen la LH, FSH, hCG y TSH. Ya que los anticuerpos de la antisubunidad \alpha son capaces a menudo de bloquear las actividades de las hormonas (22), un inmunógeno que induzca una respuesta a la subunidad \alpha tiene probablemente efectos secundarios no deseados. Por lo tanto, la mayor parte de estrategias para inventar una vacuna anticonceptiva están dirigidas a la subunidad \beta específica de la hormona de hCG.

La subunidad \beta de hCG es la más estrechamente emparentada con la subunidad \beta de hLH. Muchos anticuerpos dirigidos contra la subunidad \beta de hCG intacta también se combinarán con la subunidad \beta de LH. Aunque las subunidades \beta de las otras hormonas se diferencian bastante de la de hCG, algunos de los restos en todas las subunidades \beta son idénticos y hay posibilidad, aunque pequeña, de que algunos anticuerpos anti-subunidad \beta vayan a reaccionar en cruzado con estas hormonas también. Los 31 aminoácidos del extremo carboxi de la subunidad \beta de hCG (CTP) no están emparentados con ninguno de los restos en las otras hormonas glicoproteica. En teoría, los anticuerpos para esta región no pueden provocar ninguna reacción cruzada con las otras hormonas. Como se espera, cuando esta región es usada como un inmunógeno, los anticuerpos son desarrollados para no producir una reacción en cruzado con ninguna de las otras hormonas glicoproteicas. Lamentablemente, los anticuerpos que son producidos para péptidos sintéticos de CTP no se unen con alta afinidad a la hCG. En parte, esto es debido a la observación de que esta región de hCG contiene cuatro sitios potenciales de glicosilación unidos por serina y que está sumamente glicosilada. Además, la mayor parte de esta región de hCG no es esencial para la interacción con receptores de LH. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra CTP de hCG se unen a complejos del receptor de hCG y son principalmente del tipo no neutralizantes. Por consiguiente, no inhiben la acción de hCG similar a anticuerpos tales como B101 (22) que impiden a hCG unirse a los receptores de LH.

También se han hecho trabajos para inventar anticuerpos contra otras partes de la subunidad \beta de hCG. Una región que ha sido investigada ampliamente es la encontrada entre los restos de cisteína 38 y 57. Se conoce esta parte de la proteína por formar un bucle grande y los estudios han demostrado que este bucle es capaz de estimular la génesis de esteroides (23,24). Por lo tanto, se esperaría que los anticuerpos contra este bucle serían del tipo neutralizantes. En realidad, B101, un anticuerpo que se ha demostrado que reconoce restos dentro de este bucle (22,25,26), es capaz de neutralizar la actividad de hCG. El problema con la utilización de esta estructura de bucle es que los anticuerpos que son producidos son a menudo de baja afinidad. Además, dado que hCG y hLH son similares en esta región de la molécula (es decir, hay sólo tres aminoácidos que se diferencian), se esperaría que la inmunización con este bucle causaría la producción de anticuerpos contra hLH. En realidad, B101, un anticuerpo que se une a esta región de la molécula, tiene una afinidad inacceptablemente alta para hLH.

Los trabajos recientes en la identificación de la estructura terciaria de las hormonas glicoproteicas han dependido de la caracterización de los sitios de unión de los paneles de anticuerpos monoclonales (26). Se han identificado anticuerpos que previenen la actividad biológica de hCG o que sólo neutralizan parcialmente su actividad biológica. Como se describe en el ejemplo 7 de la presente memoria descriptiva, estos y otros anticuerpos similares pueden ser usados para inventar inmunógenos que tengan el potencial para neutralizar la hCG, pero no hLH, usando el procedimiento de selección positivo y negativo descrito en los ejemplos 6 y 7 expuestos más abajo. Aunque la hormona ha sido cristalizada y una estructura cristalina sería valiosa en la determinación de los tipos de inmunógenos que darían una respuesta inmune de un título alto para las partes particulares de la molécula, las dificultades en la resolución de la estructura cristalina han excluído a este enfoque. Por lo tanto, en el estado presente del conocimiento de la estructura de hCG, no hay un buen método que pudiera ser usado para predecir el tipo de inmunógeno que sería más eficaz.

Otro método útil para aumentar la fertilidad es aumentar los niveles de actividad de FSH. Un modo de lograr esto es administrar pequeñas dosis de folitropinas de acción lenta. Éstas pueden prepararse acoplando moléculas con actividad de folitropina a moléculas con largas semividas en plasma (es decir, inmunoglobulinas) o preparando análogos de gonadotropina monocatenaria que tengan actividad con folitropina (Tablas 1 y 2). Solas, o en combinación con anticuerpos para LH y/o antagonistas de LH, estas hormonas facilitan el desarrollo del folículo en mujeres con enfermedad poliquística ovárica.

La figura 1 es un gráfico que ilustra la influencia de anticuerpos y antisuero sobre la unión de hLH radiomarcada para receptores de LH.

La figura 2 es un gráfico que ilustra la influencia de anticuerpos y antisuero sobre la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides in vitro.

La figura 3 es un gráfico que ilustra la influencia de anticuerpos y antisuero sobre la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides in vivo.

La figura 4 muestra los vectores que pueden ser usados en estrategias de selección/exclusión de plantillas.

La figura 5 muestra los tipos de inmunógenos que han aumentado la antigenicidad para uso en la inmunización activa contra LH, hCG o FSH.

La figura 6 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 1 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 7 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 2 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 8 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 3 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 9 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 4 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 10 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 5 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 11 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 6 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 12 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 7 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 13 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 8 de gonadotropina monocatenaria y los iniciadores (subrayados).

La figura 14 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 9 de gonadotropina monocatenaria y el casete (subrayado).

\newpage

La figura 15 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 10 de gonadotropina monocatenaria y el casete (subrayado).

La figura 16 ilustra la preparación de una subunidad \alpha que codifica la región que carece de secuencias de señal del oligosacárido.

La figura 17 ilustra la preparación de una subunidad \beta que codifica la región que carece de secuencias de señal del oligosacárido asn-unido.

La figura 18 ilustra la secuencia codificante del análogo Nº. 1a de gonadotropina monocatenaria.

La presente invención se refiere a:

a): la molécula de ADN o ARN que codifica una proteína monocatenaria que es un agonista o antagonista de una hormona de vertebrados seleccionada del grupo que consiste en hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH) y coriogonadotropina (CG), proteína monocatenaria que tiene una secuencia de aminoácidos de la fórmula:

\beta-(enlazante)-\alpha

o

\alpha-(enlazante)-\beta

en la que

\beta es la subunidad \beta de LH, FSH o CG o una variante suya;

"enlazante" se refiere a un enlazante peptídico que contiene al menos 1 y no más de 16 aminoácidos; y

\alpha representa la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha común a la LH, FSH y CG o una variante suya.

En una realización más, la presente invención se refiere a un sistema de expresión para la producción de una proteína monocatenaria como se define anteriormente, cuyo sistema de expresión comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína monocatenaria unida operativamente para controlar secuencias capaces de efectuar la expresión de dicha primera secuencia de nucleótidos.

La invención también se refiere a células huésped recombinantes modificadas para contener el sistema de expresión que se menciona anteriormente y a un método para producir una proteína monocatenaria que es un agonista o antagonista de una hormona de vertebrados seleccionada del grupo que consiste en LH, FSH y CG, cuyo método comprende cultivar las células anteriores en las condiciones en las que dicha proteína es producida y recuperar opcionalmente la proteína del cultivo.

La invención se refiere en una realización más a la proteína monocatenaria que se define anteriormente.

En las realizaciones anteriores, la proteína monocatenaria puede tener una fórmula como la expuesta en adelante en la Tabla 1 o en la que \beta es la subunidad \beta de coriogonadotropinay \alpha es una subunidad \alpha de vertebrados.

La presente solicitud describe métodos para realzar la fertilidad reduciendo las actividades y/o los niveles de hormonas glicoproteicas en circulación que tienen actividad de lutropina (LH). Las moléculas que pueden ser usadas, por lo tanto, son anticuerpos que reducen la actividad biológica de LH. Ya que las moléculas con actividad de lutropina son esenciales para la fertilidad, se esperaría que bloqueando sus actividades la fertilidad más bien disminuiría que aumentaría. Sin embargo, las lutropinas, por lo general, se sabe que realzan la producción de los esteroides que pueden reducir la secreción de folitropinas (FSH), hormonas que tienen papeles importantes en la fertilidad. Por consiguiente, la reducción de las actividades de lutropinas conduce a un aumento de los niveles de folitropinas y/o las relaciones de folitropina/lutropina. Cuando la actividad de LH se reduce, pero no se suprime, el aumento de la actividad de FSH y/o la relación de FSH/LH conduce a una mayor producción de gametos y a una mayor fertilidad en seres humanos y animales. La presente solicitud también describe nuevos métodos para inventar y/o seleccionar anticuerpos para las partes específicas de proteínas incluyendo la LH y la coriogonadotropina humana (hCG) para permitir que sus actividades biológicas sean reducidas a los niveles deseados. En este documento se presentan ejemplos que ilustran cómo inventar anticuerpos e inmunógenos contra partes específicas de gonadotropinas seleccionadas; incluyendo anticuerpos e inmunógenos que son muy similares en la estructura. Algunos de estos anticuerpos e inmunógenos tendrán usos para suprimir la fertilidad y otros anticuerpos e inmunógenos tendrán usos para realzar la fertilidad.

La presente invención se refiere a la preparación de moléculas que pueden unirse a receptores de LH y FSH y que pueden procurar acciones tanto de un aumento en la fertilidad como de una inhibición de la fertilidad dependiendo del tiempo de administración. Algunos de éstas son moléculas que se unirán a receptores de LH y que bloquearán la acción de LH. Cuando son administradas en la fase folicular, suprimirán la actividad de LH suprimiendo así la secreción de estrógenos y andrógenos. Por consiguiente, los niveles de FSH se elevarán y la fertilidad será realzada. Cuando se dan después de la ovulación durante la fase luteínica del ciclo menstrual, suprimen la actividad de hCG y hacen que el embarazo se termine. Otras moléculas se unen a receptores de FSH y tienen actividad con FSH. Estos son análogos de larga acción de FSH y cuando se dan en pequeñas cantidades, estimulan la maduración folicular. Como estimulan la síntesis de estrógenos, los niveles de estrógenos se elevarán y la secreción de los niveles de FSH de la hipófisis disminuirá. Con la condición de que sean administrados en cantidades limitantes, no inducirán ninguna hiperestimulación ovárica. También tendrán efectos directos en la estimulación de la fertilidad en los hombres. Además, la presente invención se refiere a la preparación de moléculas que tienen la capacidad de inhibir las acciones de FSH y de ambas FSH y LH. Estas moléculas serán útiles para tratar a mujeres que tienen tejido ovárico hiperactivo, a menudo, como resultado de una terapia con gonadotropina. La hiperestimulación del ovario es potencialmente fatal y estos análogos se unen a receptores de FSH o a receptores de tanto FSH como de LH para suprimir un desarrollo ovárico posterior.

De acuerdo con los métodos de la presente aplicación, se describen para mejorar la fertilidad en seres humanos y animales por el nuevo método de inhibir la actividad de lutropina usando inmunización pasiva o activa. Estudios anteriores han demostrado que el bloqueo de las acciones de LH conducirá a una inhibición de la fertilidad. En este documento se demuestra que pueden ser usados anticuerpos de LH apropiados para restaurar o estimular la fertilidad. Este enfoque debería reducir el riesgo de la hiperestimulación y permitir una regulación más normal de la fertilidad con menos control. Se proporcionan varios métodos para producir y analizar los anticuerpos o el antisuero necesitados para potenciar la fertilidad.

Otros métodos que alteran la relación FSH/LH están disponibles, incluyendo los métodos de administrar FSH o proporcionar antiestrógenos. Sin embargo, el procedimiento descrito en este documento basado en el uso de Anti-LH tiene importantes ventajas respecto a estos otros métodos. El grado de inhibición máximo puede ser determinado cuidadosamente para cada anticuerpo por análisis in vitro. Por lo tanto, independientemente de la cantidad de anticuerpo administrado, se podría prevenir la inhibición de la actividad de LH por debajo de un nivel predeterminado por la elección apropiada del anticuerpo. Por ejemplo, el B105 reduciría los niveles de hLH eficaces por un factor de aproximadamente 4, mientras que el B110 reducirá los niveles de hLH eficaces por un factor de aproximadamente 2. Al reducir los niveles de LH se permitirá que los niveles de FSH se eleven. Cuando los niveles de FSH aumenten, se producirá el desarrollo folicular y la producción de estrógenos. Cuando estos niveles hayan alcanzado las concentraciones fisiológicas características de un desarrollo del folículo apropiado, se inhibirá negativamente la secreción de más FSH. Por lo tanto, el tratamiento descrito en este documento conserva los aspectos valiosos de autorregulación que no se encuentran en los métodos existentes que dependen de la administración de FSH o antiestrógenos para estimular la fertilidad. Además, a diferencia de la inducción de la ovulación con GnRH (la hormona que libera gonadotropina) o análogos de GnRH, el método basado en Anti-LH no requiere la infusión pulsátil de una hormona o análogo hormonal. Este tratamiento ofrece la ventaja potencial de un tratamiento simple o como mucho de unos cuantos tratamientos de varios días. Esto será particularmente importante en la regulación de la ovulación en seres humanos o animales. En seres humanos, este método debería ser el tratamiento más apropiado de la enfermedad poliquística ovárica que, a menudo, está caracterizada por altos niveles de LH de manera inapropiada. Cuando los niveles de LH se reducen, los niveles de FSH se elevarán y ocurrirá el desarrollo del folículo. Sin embargo, cuando ocurre el desarrollo del folículo, los niveles crecientes de estrógenos bloquearán la secreción de la FSH adicional. Por lo tanto, la tendencia de promover el desarrollo de demasiados folículos con sus peligrosas consecuencias potenciales será reducida al mínimo.

Se describen también métodos para producir un inmunógeno específico que está basado en el uso de anticuerpos de exclusión y plantilla. El uso de estos anticuerpos permitirá inventar una respuesta inmune específica a los dominios particulares de una proteína. Este método tendrá usos en la inducción o la inhibición de la fertilidad como se ilustra en este documento. Ya que los anticuerpos contra hCG pueden inhibir el crecimiento tumoral, este método también debería ser útil para inventar vacunas necesarias que inhiban el desarrollo o la progresión de tumores que secretan hCG. El método también debería tener uso en cualquier sistema en el cual un inmunógeno específico sea necesario.

No hay nada único en la estructura de los anticuerpos para que los haga útiles en inducir fertilidad que el hecho de que se unan a hLH o a otra LH. Por lo tanto, se esperaría que las partes de los anticuerpos que conservan la capacidad de unirse a la LH también tendrán una actividad similar. Estos incluirían fragmentos Fab, fragmentos (Fab')_{2}, anticuerpos monocatenarios, o cualquier molécula que se una a hLH o LH reduciendo su actividad biológica. El fragmento Fab es una parte de un anticuerpo que contiene el sitio de unión del antígeno y que es generado por la digestión de papaína. El fragmento F(ab')_{2} es una parte de un anticuerpo que contiene dos sitios de unión de antígeno y que está generado por la digestión de pepsina.

Preferiblemente, los métodos para realzar la fertilidad se llevan a cabo durante la fase folicular del mamífero y más preferiblemente durante la fase folicular del ciclo menstrual.

La hormona glicoproteica que está regulada en la presente aplicación es un reactante en una reacción entre antagonistas que se unen. Los antagosintas que se unen son proteínas que tienen una afinidad de unión específica entre sí. Un antagonista que se une es un agente con capacidad de unión que se selecciona del grupo que consiste en un antígeno y un hapteno. El agente con capacidad de unión preferido es un antígeno. Otro antagonista que se une es un agente de unión que se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo y una proteína de unión específica. El agente de unión preferido es un anticuerpo.

Los antígenos son sustancias que son capaces, en condiciones apropiadas, de inducir la formación de anticuerpos y de reaccionar específicamente en alguna manera detectable con los anticuerpos así inducidos. Los antígenos pueden ser sustancias solubles, tales como toxinas y proteínas extrañas, o sustancias en partículas, tales como células de tejido o bacterias. En general, los antígenos son sustancias de alto peso molecular tales como proteínas simples y conjugadas y carbohidratos.

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina que tienen una secuencia de aminoácidos específica que les permiten interactuar sólo con el antígeno que indujo su síntesis en el tejido linfoide o con un antígeno estrechamente emparentado con aquel antígeno. Las inmunoglobulinas son proteínas compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas.

En una realización preferida, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en proteínas recombinantes y péptidos sintéticos.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados a mamíferos, por ejemplo, animales o seres humanos, en cantidades eficaces para proporcionar la actividad deseada. Ya que la actividad de los compuestos y el grado del efecto terapéutico deseado varía, el nivel de dosificación del compuesto empleado también variará. La dosificación real administrada también será determinada por tales factores generalmente reconocidos tales como el peso corporal del paciente y la hipersensibilidad del individuo de un paciente particular. Por lo tanto, la dosificación unitaria para un paciente particular (hombre) puede variar de tan bajo como aproximadamente 0,1 \mug por kg de peso corporal, que el médico puede titular para producir el efecto deseado. Una dosis mínima preferida para la titulación es de 1 \mug/kg de peso corporal.

La presente aplicación además está ilustrada por los ejemplos siguientes. Todas las partes y porcentajes en los ejemplos y en todas las partes de la memoria descriptiva y las reivindicaciones son en peso de la composición final a no ser que sea especificado de otra manera.

\vskip1.000000\baselineskip

Agentes de unión que reducen las actividades biológicas de la hormona luteinizante y la coriogonadotropina humana para permitir que sus actividades biológicas sean reducidas a los grados deseados.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Uso de anticuerpos anti-LH para inducir la fertilidad

Como algunos anticuerpos antihormonales inhiben la actividad biológica de las hormonas impidiendo que la hormona se una a receptores o aumentando su metabolismo, serán útiles para reducir el nivel de hormona activa en la circulación. Los anticuerpos para la LH son capaces de aumentar la relación de FSH biológicamente activo respecto a la LH en circulación. En parte, esto es porque reducen la actividad de LH. Además, ya que la LH es una hormona que estimula la síntesis de sustratos esteroides que pueden ser convertidos a estrógenos (4), la disminución en la actividad de LH estará acompañada por una disminución en los estrógenos. La disminución en los niveles de estrógeno reducirá la inhibición de la secreción de FSH y los niveles de FSH se elevarán. Como consecuencia, en las hembras, el desarrollo folicular será realzado. En machos, la espermatogénesis será aumentada. No todos los anticuerpos tienen la capacidad de reducir los niveles de LH en una manera no neutralizante. Los anticuerpos que neutralizan las acciones de LH acortarán completamente la fertilidad a no ser que sean administrados de una manera restrictiva (es decir, que la cantidad total de anticuerpo dado sea menor que la cantidad total de LH en circulación). Los anticuerpos no neutralizantes son preferidos para realzar la fertilidad ya que se pueden dar en exceso de la cantidad total de LH. Por lo tanto, incluso aunque la mayor parte de la LH pueda estar unida a los anticuerpos, se reduce la actividad de LH, pero no se neutraliza. Como hay más que suficiente LH para el desarrollo del folículo, la reducción parcial de la actividad de LH no previene el desarrollo del folículo. Además, el aumento de estrógenos, que son preparados cuando el folículo aumenta su desarrollo, imitará el control de regeneración normal de la secreción de FSH para prevenir la hiperestimulación ovárica. La administración de 10 \mug - 10 mg de anticuerpos de alta afinidad (es decir, Ka> 5 x 10^{7}M^{-1}) será suficiente para inducir la fertilidad en mujeres que tienen enfermedad poliquística ovárica. La identificación y la caracterización de anticuerpos apropiados se ilustran en el ejemplo 2.

Ejemplo 2 Identificación y selección de los mejores anticuerpos de LH

No todos los anticuerpos que inhiben la actividad de LH serán igualmente útiles para el tratamiento de la infertilidad. Por ejemplo, altas concentraciones en exceso de anticuerpos tales como B101 que se unen a hCG y LH (aunque con afinidad inferior) pueden impedir a las hormonas unirse a los receptores de LH (22). Cuando están presentes en exceso, los anticuerpos que previenen la unión de LH o hCG a sus receptores "neutraliza" la actividad biológica de la hormona. Aunque la neutralización de LH sea seguida de una disminución en los niveles de andrógenos y estrógenos y una subida de los niveles de FSH, ya que la LH es necesaria para la fertilidad, la reducción de la actividad de LH por debajo del nivel mínimo necesario para la fertilidad previene la fertilidad siempre que un exceso del anticuerpo esté presente. En realidad, se ha demostrado que los anticuerpos neutralizantes o los antígenos que provocan la producción de anticuerpos neutralizantes inhiben la fertilidad en animales (10). Es posible administrar cantidades limitadas de anticuerpos neutralizantes para reducir las concentraciones de LH a un nivel predeterminado o invertir el efecto inhibitorio de un anticuerpo neutralizante administrando un anticuerpo anti-idiotípico. Sin embargo, debido a las variaciones entre los individuos es difícil determinar cuanto anticuerpo es necesario para obtener el efecto deseado a no ser que sea deseada una inhibición casi completa de la actividad de LH o a no ser que sean realizadas medidas de FSH y/o de la función gonadal (por ejemplo, determinando los niveles de esteroide en plasma). Aunque esto sea factible, la necesidad de preparar estas medidas reduce el atractivo de usar anticuerpos que neutralicen completamente la actividad de LH para aumentar la fertilidad. También se podrían dar anticuerpos neutralizantes para prevenir la acción de LH temporalmente hasta que se hubieran elevado los niveles de FSH. Entonces, el anticuerpo neutralizante en exceso podría ser eliminado por la administración de un anticuerpo anti-idiotípico para neutralizar anticuerpos Anti-LH para restaurar la fertilidad o superar el efecto del anticuerpo usando LH o CG o usando una cantidad de anticuerpo que sería degradado suficientemente para permitir la acción del aumento vertiginoso del interciclo de LH. Sin embargo, este enfoque es más complejo que el uso de anticuerpos no neutralizantes, ilustrados a continuación.

Los anticuerpos preferidos inhiben la actividad de LH, pero fallan en bloquear completamente su acción incluso cuando se dan en concentraciones suficientes para unir toda la LH presente en la circulación. Estos anticuerpos son, por lo general, capaces de unirse a la hormona libre así como a complejos hormonal-receptor. Ellos inhiben la acción hormonal bajando la afinidad de la hormona para su receptor, reduciendo la actividad de la hormona unida, y/o aumentando la eliminación hormonal. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen B105 y B110. Estos anticuerpos reducen las actividades biológicas de las hormonas a grados diferentes (17) y pueden ser comprados en la Universidad de Columbia, Nueva York, NY o de UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ. Otros anticuerpos disponibles en el comercio incluyen el 518B7 (disponible del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis, Davis, CA) y ZMCG7 (disponible de Pierce Chemical Co., 3747 North Meridian Road, Roclcord, IL). Como los complejos de estos anticuerpos con hCG pueden unirse a receptores, el grado de inhibición está limitado hasta en presencia de un exceso masivo de anticuerpos. La cantidad de inhibición puede ser determinada a partir de análisis simples in vitro antes de su uso in vivo. Por ejemplo, se demostró que un exceso masivo de B110 reduce la actividad de hCG sólo aproximadamente la mitad mientras que un exceso masivo de B105 redujo la actividad de hCG aproximadamente tres cuartas partes. Cada uno de estos anticuerpos se une a hLH y se esperaría que tuvieran la misma influencia sobre la actividad de hLH.

La identificación de anticuerpos apropiados de un panel de anticuerpos monoclonales preparados contra hLH puede prepararse de la manera siguiente. Estos anticuerpos pueden ser obtenidos según procedimientos estándar (22,27-32) inmunizando ratones con hLH, hCG o LH de otra especie, fragmentos de LH o hCG, parcialmente o completamente desglicosados, o hCG o análogos de LH o hCG capaces de proporcionar una respuesta inmune a la especie deseada de LH. Estos anticuerpos también podrían ser obtenidos por la selección de anticuerpos artificiales (33-36). Esta misma estrategia podría ser usada para identificar anticuerpos para LH de prácticamente cualquier otra especie. Esto también podría ser usado para identificar el antisuero que tiene propiedades similares. Este antisuero podría prepararse en respuesta a los análogos de LH o hCG o podrían ser obtenidos por inmunoadsorción o eliminación de componentes de anticuerpos indeseables.

Los anticuerpos que tienen las características inhibitorias deseadas pueden ser identificados midiendo sus capacidades para inhibir la unión de LH a los receptores de LH. Este tipo de ensayo puede ser realizado por un experto en la técnica de medir la unión del receptor y el ejemplo siguiente se refiere a cómo se seleccionaría para anticuerpos para hLH. Claramente, esto también sería aplicable a cualquier especie de LH para la cual los anticuerpos estuvieran disponibles. Dado que la hLH se une bien a receptores de LH de roedores, no se tienen que usar receptores de LH humanos en el ensayo, aunque los receptores de LH humanos también funcionan. Una primera etapa simple debe controlar la influencia del anticuerpo sobre la unión de hLH radiomarcada en receptores de LH luteínicos ováricos de rata. La hLH radiomarcada puede prepararse incubando 10 \mug de hLH con 500 \muCi de Na^{125}I durante 30 segundos a 4ºC en un pequeño tubo de vidrio que ha sido revestido de 1,5 \mug de Iodo-Gen® (Pierce Chemical Co.). La ^{125}I-hLH y ^{125}I no reaccionada se separan por filtración de gel. Los receptores pueden prepararse administrando 50 UI de gonadotropina en suero de yeguas embarazadas también conocidas como PMSG o CG equino (obtenido de la Compañía Sigma Chemical, San Louis, MO) en ratas hembra Sprague-Dawley que tienen 23-26 días de edad. La PMSG estimula el desarrollo del folículo. Aproximadamente 56-65 horas más tarde, se le dan a los animales 25 UI de hCG (también obtenida de la Compañía Sigma Chemical) causándose la formación del cuerpo luteo. Los ovarios altamente luteinizados son eliminados una semana más tarde y homogeneizados en tampón que contiene Tris 40 mM (pH 7,4) y MgCl_{2} 5 mM. Una fracción ordinaria del núcleo y de la membrana del homogenado es recogida centrifugando el homogenado a 1000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Esto se lava una vez resuspendiéndolo en el tampón Tris - MgCl_{2} y se resedimenta a 1000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El pelet final (llamado "pelet de homogenado ovárico") es resuspendido en el tampón Tris - MgCl_{2} usando un volumen de 2 ml por cada ovario presente en el principio de la homogeneización. Una cantidad de pelet de homogenado ovárico aproximadamente igual a 1/20 de un ovario (es decir, aproximadamente 5 mg de material en 100 \mul de tampón) es añadida a los tubos que contienen aproximadamente 1-2 ng de hLH radiada con yodo (es decir, aproximadamente 100.000 cpm) y diferentes cantidades de anticuerpo (es decir, en los límites de 1 pg a 10 \mug o más). Después de que los tubos se hayan incubado el tiempo suficiente para permitir a la LH radiomarcada unirse a los receptores (es decir, 30-60 minutos a 37ºC o de la noche a la mañana a temperatura ambiente), el receptor unido y los radiomarcadores libres se separan diluyendo la mezcla de reacción en 2 ml con una solución de NaCl del 0,9%, centrifugando la mezcla y aspirando el sobrenadante. La cantidad de hLH radiomarcada unida a los receptores de LH ováricos de ratas se determina analizando el pelet en un contador \gamma. Se esperaría observar los tipos de inhibición mostradas en la Figura 1. Algunos anticuerpos inhibirán completamente la unión de hLH radiomarcada al mismo grado que un exceso masivo de hLH no marcada o hCG mientras que otros no inhibirán la unión o hasta pueden potenciar la unión cuando está presente en un exceso molar enorme en relación con la hLH radiomarcada. Ambos de estos tipos de anticuerpos son menos deseables que los anticuerpos que suprimen la unión de hLH a un nivel intermedio (c.f., la Figura 1). Por lo tanto, los anticuerpos más útiles inhibirán la unión de la LH radiomarcada, pero no al mismo grado que un exceso masivo de LH no marcada. Los anticuerpos que inhiben la unión de LH radiomarcada al mismo grado que un exceso masivo de LH no marcada también serán útiles pero será necesario un mayor cuidado para estar seguros de que el anticuerpo no suprimirá la actividad de LH demasiado cuando se use in vivo. Si es neutralizada demasiada actividad de LH en el aumento vertiginoso de LH, se producirá infertilidad como resultado.

Otro procedimiento útil para identificar anticuerpos que tienen la capacidad deseada de reducir la actividad de LH debe realizarse como un ensayo in vitro para determinar si los anticuerpos inhiben el efecto de hLH sobre la biosíntesis de esteroides. En este ensayo, se pueden utilizar testículos de roedores machos. Un ejemplo típico que usa hLH se ilustra en la Figura 2. Una suspensión celular de rata Leydig ordinaria fue preparada usando colagenasa como se describe en (37) y las células fueron incubadas con cantidades variables de LH y los anticuerpos que se analizaron. Después de aproximadamente 2-4 horas a 37ºC, se mide el contenido de testosterona en los tubos por radioinmunoensayo. Cuando se incuban concentraciones crecientes de hLH con células Leydig, se origina una mayor producción de testosterona y se obtendrá una curva respuesta de dosis típica en la cual las concentraciones de hLH de 1-10 pM serán suficientes para elevar la producción de esteroides aproximadamente al 50% del nivel máximo (véase la Figura 2, curva A). Los anticuerpos más útiles son identificados por sus capacidades para inhibir la génesis de esteroides inducida por LH. Cuando se añaden diferentes anticuerpos monoclonales a la LH antes de que la hormona sea añadida a las células, unos serán encontrados que reducen la capacidad de LH para estimular la formación de testosterona. Los anticuerpos inhibitorios más útiles cambiarán la curva respuesta de dosis a valores menos sensibles (véase la Figura 2, curvas B y C). Aunque el grado del cambio al principio será dependiente de la concentración de anticuerpo, un exceso masivo de anticuerpos (es decir, más de 100 veces mayor que la cantidad máxima de hLH usada) no impedirá la formación de testosterona inducida por LH. Los anticuerpos menos útiles prevendrán la estimulación de la formación de testosterona cuando el anticuerpo esté presente en un exceso molar de 100 veces (véase la Figura 2, curva D). Este tipo de ensayo detectará anticuerpos que inhiben la actividad de LH reduciendo su unión a receptores de LH y también detectará a los anticuerpos que inhiban la actividad de LH unida. Los ejemplos de anticuerpos útiles incluyen B105, B110, 518B7 y ZMCG7, mencionados anteriormente. Estos tendrán que ser modificados como se describe a continuación antes de que puedan ser usados repetidamente en mujeres.

Una vez que los anticuerpos o el antisuero han sido seleccionados y satisfacen los criterios descritos anteriormente e ilustrados en las Figuras 1 y 2, deberían ser analizados respecto a sus capacidades para inhibir las acciones de LH in vivo. En ratas masculinas se da un gran exceso de anticuerpos (es decir, 100 \mug o más). Veinte minutos más tarde algunas ratas son tratadas con vehículo solo (control) y a otras se les proporciona hLH o LH similar o igual en estructura a la del animal para el cual el anticuerpo se usa. Una hora más tarde, los niveles de testosterona en plasma se miden por radioinmunoensayo. Un ejemplo típico se ilustra en la Figura 3. Los anticuerpos más útiles o el antisuero reducirán la potencia de hLH, pero no prevendrán su actividad incluso cuando esté presente en exceso respecto a la cantidad total de LH dada. Este ensayo detectará a los anticuerpos que reducen la actividad hormonal inhibiendo la unión de LH a los receptores, inhibiendo la actividad de LH unida, y/o aumentando la eliminación de LH. Independientemente de la causa de la inhibición in vivo, los anticuerpos más útiles o el antisuero no prevendrán la actividad de altos niveles de LH incluso cuando estén presentes en exceso respecto a la LH en circulación. Esto puede controlarse midiendo la capacidad del suero de unirse a hLH radiada con yodo después de la administración del anticuerpo. Una muestra en suero (0,01 - 1 \mul) se diluye en 25 \mul con una solución que contiene NaCl del 0,9%, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y tampón de fosfato de sodio 0,02 M (pH 7,2). A esto se añaden 25 \mul de LH radiada con yodo (aproximadamente 50 nCi que contiene aproximadamente 1 ng). La solución resultante se incuba durante 30 minutos a 37ºC. Una solución de inmunoglobulina G de antiratón de cabra (IgG) (disponible de Cappel, Organon Teknia Corp., West Chester, PA) que contenía 2 \mug de IgG en 50 \mul de la solución de NaCl-albúmina descrita anteriormente se añade y la solución resultante se incuba durante 90 minutos a 37ºC o de la noche a la mañana a 4ºC. A esta solución se añade 100 \mul de IgGsorb del 1% (obtenido de "The Enzyme Center", Inc., 36 Franklin St., Maiden, MA) reconstituido en agua. Esta suspensión se mezcla durante 30 minutos a 22ºC y luego se diluye por la adición de 3 ml de la solución de NaCl-albúmina que se enfrió en hielo. La mezcla se centrifuga durante 10 minutos a 2000 x g a 4ºC. El sobrenadante se aspira y la radiactividad en el pelet se mide en un contador \gamma. Como control negativo, se usa un suero de un animal que no haya sido inmunizado activamente o pasivamente. Como control positivo, se usan 0,1 - 1 ng del anticuerpo que fue inyectado al principio en el animal. La radiactividad medida en el pelet del control negativo es restada de la del control positivo y de los peletes de las muestras en suero que están siendo analizadas. Cuando los valores resultantes para el control positivo y las muestras en suero son comparados, el suero que contiene el anticuerpo en exceso respecto a la LH será capaz de inmunoprecipitar al menos el 1%-10% de la LH radiada con yodo como control positivo.

La administración de anticuerpos a hLH en seres humanos reducirá las concentraciones eficaces de LH en circulación. La cantidad máxima de reducción depende de la posición del sitio de unión del anticuerpo sobre la LH. La reducción de la actividad de LH reduce la secreción de hormonas ováricas y de testículos y así se reduce la inhibición de la regeneración de FSH. Por consiguiente, el aumento de los niveles de FSH y la fertilidad son realzados. Los anticuerpos para hLH que reaccionan en cruzado con la LH de otras especies o anticuerpos que han sido seleccionados por sus capacidades de unirse a la LH de otra especie y que reducen, pero que no suprimen, la actividad hormonal tendrán efectos similares en otras especies. Los anticuerpos más apropiados para uso en seres humanos serán los que tienen las regiones variables y constantes similares a la inmunoglobulina humana y que no son antigénicos o sólo débilmente antigénicos cuando se inyectan a seres humanos. Los anticuerpos adecuados pueden prepararse "humanizando" anticuerpos monoclonales de ratón (es decir, sustituyendo las regiones variables y constantes de ratón con secuencias similares encontradas en inmunoglobulinas humanas). Los procedimientos para lograr esto son conocidos en la técnica (38-40). Otros métodos para preparar anticuerpos adecuados incluyen la inmunización de primates tales como el macaco (41) seguido del aislamiento y de la clonación de linfocitos simples (42). Las inmunoglobulinas en estos primates tienen regiones variables similares a las inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos monoclonales preparados a partir de estos animales deberían servir como un buen punto de partida para los anticuerpos que puedan ser usados en seres humanos.

Ejemplo 3 Métodos alternativos para obtener y seleccionar a los anticuerpos deseados

Muchos anticuerpos que son capaces de una inhibición parcial de la actividad de hLH tienen una propensión de unirse a hLH o a otras moléculas de LH que han sido adsorbidas a plástico u otras superficies. Por lo tanto, la selección de los anticuerpos deseados se facilita a menudo controlando las capacidades de los anticuerpos de unirse a hLH u otra LH que sea adsorbida a placas de microtítulo de plástico o a la LH que está unida a complejos del receptor de LH. La selección para los anticuerpos que se unen a hLH que se adsorben a una superficie plástica puede ser lograda como sigue. Los pocillos de una placa de microtítulo de plástico son revestidos de 50 \mul de una solución que contiene 0 ó 1 \mug de hLH en NaCl del 0,9% - tampón de fosfato de sodio 0,02 M (pH 7,2). Esto permite a la hLH ser adsorbida a la superficie de la placa de microtítulo. Después de 1 hora a 37ºC, las soluciones son eliminadas y sustituidas con 200 \mul de NaCl del 0,9% - tampón de fosfato de sodio 0,02 M (pH 7,2) que contenía 200 \mug de albúmina de suero bovino por más de una hora a 37ºC. Esto rellena la mayor parte de los sitios de adsorción que quedan. La solución de albúmina se elimina y se sustituye con 50 \mul de NaCl del 0,9% - tampón de fosfato de sodio 0,02 M (pH 7,2) que contenía 50,000 - 100,000 dpm del anticuerpo monoclonal de ensayo marcado con ^{125}I. El marcaje del anticuerpo monoclonal se realiza usando Iodo-Gen u otro agente oxidante (22,43) como se describe anteriormente para la LH usando 10 pg de anticuerpo y 500 \muCi de Na^{125}I, excepto que el tiempo de reacción se amplía a 1-5 minutos. Después de 1 hora a 37ºC, el fluido se elimina y la radiactividad que está unida a la superficie de la placa de microtítulo se mide en un contador \gamma·. Los anticuerpos que tienen una alta probabilidad de ser útiles para inhibir la actividad de hLH serán encontrados que están unidos a los pocillos revestidos de hLH en cantidades mayores que los de los pocillos no revestidos de hLH. Este ensayo también detectará otros tipos de anticuerpos también y debería ser realizada una selección posterior de los anticuerpos positivos como se describe a continuación o como en el ejemplo 2.

La unión a complejos del receptor de LH no garantiza que un anticuerpo será útil para neutralizar parcialmente la actividad de LH, muchos de los anticuerpos preferidos se unen a complejos del receptor de LH. Por lo tanto, es posible seleccionar al principio los anticuerpos deseables midiendo sus capacidades de unión a complejos del receptor de LH. Este ensayo es esencialmente el mismo que Bio-IRMA que ha sido descrito con anterioridad (44) y que puede ser realizado en una manera secuencial o simultánea. En el Bio-IRMA simultáneo, se añaden 0,025 \muCi - 0,1 \muCi del anticuerpo radiado con yodo de ensayo (es decir, preparado como se describe anteriormente) a un homogenado ovárico de rata (es decir, preparado como se describe anteriormente) y cantidades crecientes de LH incluyendo 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100 y 1000 ng. Después de 1 hora a 37ºC, la parte membranosa del homogenado se sedimenta en pelets por centrifugación a 1000 x g durante 10-20 minutos, el sobrenadante se aspira y la radiactividad en el pelet se mide en un contador \gamma. Los anticuerpos que se unen a los complejos del receptor de LH serán detectados por su mayor capacidad de unirse a las membranas incubadas con al menos una de las concentraciones de LH respecto a un ensayo en blanco (es decir, ninguna LH añadida). En el Bio-IRMA secuencial, las membranas son incubadas con la LH primero durante una hora a 37ºC, son lavadas por centrifugación y aspiradas como se describe anteriormente y luego son incubadas con 50.000 - 100.000 dpm de anticuerpo radiado con yodo. Después de una incubación de una 1 hora adicional a 37ºC, las fracciones de anticuerpo unidas y libres son separadas por centrifugación y aspiración como se describe anteriormente y el pelet se introduce en un contador gama. Los anticuerpos más útiles se unirán a los complejos del receptor de LH. Sin embargo, este procedimiento es sólo un método de selección útil y un ensayo más concluyente de un anticuerpo implica el uso de un ensayo biológico in vitro como el que se basa en la formación de testosterona que se describe en el Ejemplo 2.

La propensión de los anticuerpos más útiles a unirse a las superficies que contienen LH o a los complejos de LH y los receptores de LH también puede facilitar el aislamiento de linfocitos después de la inmunización en monos o ratones usando un procedimiento con movimiento panorámico. En este procedimiento, se añaden linfocitos a superficies plásticas que han sido revestidas de albúmina de suero humano u otra proteína que prevenga la unión no específica exponiéndolos a soluciones que contienen 1 mg/ml de albúmina de suero humano en NaCl del 0,9% - tampón de fosfato de sodio 0,02 M (pH 7,2) durante más de 1 hora a 37ºC. Los linfocitos que no se unen a estas superficies se añaden después a las superficies que están revestidas exponiéndolos a hLH y luego a albúmina de suero humano como anteriormente. La cantidad de hLH usada no es crítica siempre que una cantidad de material suficiente se haya adsorbido al plástico. Esto puede ser logrado usando 20-50 \mug de hLH/ml. Sin embargo, cantidades menores y mayores también funcionarán. Los linfocitos que se unen a superficies revestidas de LH se seleccionan y se funden con células de mieloma para preparar hibridomas (30), se transforman con Epstein-Barr u otro virus, se someten a clonación en bacteriófago \lambda (36), o se seleccionan células individuales para la clonación por reacción en cadena de la polimerasa (42). Los anticuerpos que son producidos son sometidos a selección como se describe en el ejemplo 2. Estas estrategias aumentan el porcentaje de anticuerpos que serán deseables.

Muchos anticuerpos que son capaces de una inhibición parcial de LH también pueden ser seleccionados por un procedimiento que depende de sus capacidades de unirse a la LH que está unida a receptores de LH. A continuación de la inmunización de ratones o monos con hLH, las células de bazo y otros linfocitos se aislan y se estratifican en monocapas de células eucariotas que expresan a los receptores de LH. Estas monocapas de células pueden prepararse transfectando células con vectores de expresión capaces de expresar el cDNA del receptor de LH en ratas (45), seres humanos (46), porcinos (47), u otros por métodos que son estándar en la técnica (48, 49). Los linfocitos que se adhieren a las monocapas son desechados. Los linfocitos que no se adhieren a las monocapas son añadidos a monocapas similares de células que expresan a los receptores de LH que contienen hLH u otra LH. Estos pueden prepararse añadiendo 100 ng de hLH u otra LH a las monocapas de la noche a la mañana a 4ºC y lavando la hormona que no se unió. Los linfocitos que se adhieren a estas células son seleccionados y se funden con células de mieloma para preparar hibridomas (30), transformados con Epstein-Barr u otro virus, o sometidos a clonación por la reacción en cadena de la polimerasa (42). Los anticuerpos que son producidos son sometidos a selección como se describe en el ejemplo 2. Estas estrategias también realzarán el porcentaje de anticuerpos que son deseables. Aunque esta estrategia a base del receptor sea más tediosa que una estrategia basada en la selección de linfocitos sobre superficies plásticas revestidas de LH, proporcionará un porcentaje más alto de anticuerpos útiles.

Ejemplo 4 Uso de anticuerpo para tratar el síndrome poliquístico ovárico

El síndrome poliquístico ovárico (PCO) se caracteriza por un desarrollo del folículo incompleto y una inhabilidad de la mujer de ovular normalmente. El ovario contiene muchos pequeños folículos inmaduros, muy pocos si alguno de los cuales progresa al punto de ovulación en ausencia de intervención clínica. Estas mujeres a menudo tienen elevados los andrógenos y una alta relación de LH/FSH en relación a mujeres fértiles con el ciclo normal. Hay dos procedimientos principales para la inducción de la ovulación en mujeres con PCO. Estos incluyen la administración de FSH para aumentar el desarrollo del folículo o antiestrógenos para facilitar la secreción de FSH de la hipófisis anterior. Aunque ambos tratamientos son capaces de inducir la ovulación, tienen el riesgo de inducir múltiples ovulaciones ya que evitan la regeneración del bucle de estrógeno negativo normal que regula la secreción de FSH. Por consiguiente, las mujeres tratadas con estos agentes son controladas por lo general con cuidado para prevenir la hiperestimulación, un efecto secundario potencialmente mortal del tratamiento.

La administración de 10 \mug - 10 mg de un anticuerpo no neutralizante para la LH que causa una subida transitoria y autorestrictiva de la secreción de FSH inducirá la ovulación con menos riesgo de hiperestimulación que el tratamiento con la gonadotropina. El efecto es transitorio porque el anticuerpo será metabolizado o de otra forma será eliminado de la circulación y su eficacia será perdida en 1-2 semanas después de la administración. El tratamiento es autorestrictivo porque el efecto de regeneración negativa de estradiol sobre la secreción de FSH no estará eliminado. Por lo tanto, como los niveles de FSH se elevan y se estimula el desarrollo del folículo, la secreción de estradiol se elevará e inhibirá además los aumentos de la secreción de FSH.

Ejemplo 5 Inducción de tratamiento simple o doble de dosis de ovulación

No hay buenos métodos que puedan ser usados para inducir la ovulación en mujeres con PCO que impliquen sólo un tratamiento simple o doble. La mayor parte de los tratamientos para este síndrome requieren múltiples tratamientos con FSH, FSH más LH o hCG, hMG, antiestrógenos, GnRH, o varias combinaciones de estos agentes. Algunas tentativas también han empleado a antagonistas de GnRH para reducir los niveles en circulación tanto de LH como de FSH de modo que pudiera inducirse la ovulación por el tratamiento con hormonas exógenas. Una administración simple de una alta concentración del anticuerpo preferido del tipo como se describe anteriormente en este documento puede inducir la ovulación. Esto es porque puede proporcionarse anticuerpo de forma segura en un exceso masivo y, ya que los anticuerpos tienen semividas largas en plasma, el anticuerpo seguirá siendo eficaz con el aumento de los niveles de FSH durante varios días. A causa del efecto de regeneración natural del estradiol sobre la secreción de FSH, la secreción de FSH será controlada por los estrógenos hechos por el folículo cuando el folículo se desarrolle. Cuando el folículo dominante haya sido seleccionado y los niveles de estradiol hayan aumentado, la mayor parte del anticuerpo habrá sido eliminado de la circulación. El anticuerpo no interferirá con las acciones del aumento vertiginoso de LH necesaria para la ovulación por uno o varios de diversos motivos. Primero, la cantidad de LH liberada está en exceso respecto a la cantidad necesaria para la ovulación. Segundo, el anticuerpo sólo reducirá la actividad de LH, no la neutralizará. Y tercero, cuando surge la LH la mayor parte del anticuerpo ha sido eliminado de la circulación. Por lo tanto, el tratamiento con el anticuerpo será seguido del desarrollo del folículo y la ovulación.

Ejemplo 6 Antígenos que inducen el antisuero inhibitorio apropiado

La administración de los anticuerpos apropiados ilustrados en el Ejemplo 1 puede usarse para aumentar la fertilidad. Sin embargo, ya que esto es una inmunización "pasiva", se requerirá la administración repetida del anticuerpo para mantener los niveles de anticuerpos altos durante más de varios días o semanas. La elevación a corto plazo (por ejemplo, días) es suficiente para inducir la ovulación en mujeres o aumentar el número de ovulaciones en animales en uno o varios ciclos. Cuando se desea suprimir parcialmente la actividad de LH y así aumentar la fertilidad durante períodos más largos o varios ciclos, es útil inducir una respuesta inmune que cause la formación activa de anticuerpos contra la LH. Para obtener los anticuerpos más útiles, es necesario diseñar un inmunógeno capaz de inducir una respuesta a una parte de la molécula de LH similar a la reconocida para B105, B110, u otros anticuerpos que formen complejos con la LH que conserven alguna actividad de LH. Los inmunógenos más apropiados se derivan de la subunidad \beta de LH ya que esta subunidad es única para la LH. La subunidad \alpha es común a la LH, TSH y FSH. Su conformación parece diferenciarse ligeramente en las hormonas (21) y, por lo tanto, también pueden prepararse anticuerpos útiles contra la subunidad \alpha. Sin embargo, los anticuerpos de la subunidad \alpha tienen el potencial de inhibir las acciones de las tres hormonas. Si la respuesta inmune está dirigida contra hFSH, esto puede no realzar la fertilidad y puede causar la infertilidad. Cuando es deseable inmunizar activamente a mujeres contra hLH para realzar la fertilidad, debe tomarse cuidado en prevenir la inducción de anticuerpos para hCG. Los anticuerpos para hCG tienen el potencial de reducir la fertilidad (véase a continuación). Esto no es, por lo general, un problema con la inmunización pasiva descrito anteriormente ya que los anticuerpos administrados para la LH, por lo general, son eliminados de la circulación hasta que la hCG sea necesaria para la fertilidad.

Los antígenos capaces de inducir la formación de anticuerpos contra una parte de LH que no neutralizan su actividad (es decir, la respuesta inmune deseada) contienen una secuencia derivada de una parte de la subunidad \beta de LH. A menudo, ésta es una región de la subunidad \beta que permanece expuesta después de que la LH se une a los receptores de LH. Para ser más antigénicos, los inmunógenos también deberían contener secuencias que fueran extrañas para la persona o animal que se inmuniza. Si la subunidad \beta de LH entera es usada para la inmunización, se puede conseguir la producción de anticuerpos que inhiban completamente la actividad de LH. Altos títulos de anticuerpos neutralizantes pueden causar la infertilidad o tener otras consecuencias negativas tales como la inducción de menopausia prematura o la pérdida de tamaño de los testículos o función. La mejor opción de los restos de la subunidad \beta de LH que deberían ser incluidos en el inmunógeno son los que permanecen expuestos cuando la hormona se une a los receptores de LH. Estos incluyen la parte de la hormona cercana a los restos 74-77, una región de la hormona que es reconocida por los anticuerpos que se unen a las subunidades \beta de hLH o hCG y hLH o complejos del receptor de HCG (26,50). Las regiones de la subunidad \beta que no deberían ser usadas para la inmunización incluyen secuencias cercanas a los restos 89-92 y 47-51. Éstas son las posiciones de los sitios de unión para los anticuerpos que neutralizan la actividad.

El diseño de un antígeno sintético mínimo incluye los restos de la subunidad \beta de hLH expuesta cuando la LH se une a los receptores de LH. Algunos de estos incluyen Pro73-Arg74-Gly75-Val76-Asp77-Pro78-Val79-Val80-Ser81. Péptidos sintéticos que contienen estas secuencias pueden ser unidos a moléculas vehículo grandes y ser usados para la inmunización usando métodos conocidos en la técnica (14-16,51-53). Los anticuerpos no neutralizantes producidos se combinarán con hLH e inhibirán su actividad biológica.

A menudo, la capacidad de pequeños antígenos peptídicos de producir una respuesta inmune de alto título es baja. Lo siguiente ilustra cómo crear un antígeno que será más eficaz en la obtención de anticuerpos para las regiones de hLH que permanezcan expuestas cuando la hormona se una a los receptores de LH. Un enfoque similar podría ser usado para diseñar inmunógenos para cualquier proteína incluyendo otras LH de vertebrados. Los mejores inmunógenos son conocidos porque son los que se diferencian sustancialmente de las proteínas encontradas en un animal que aún conservan la configuración terciaria del epítopo o epítopos para los cuales es deseada una respuesta inmune. Un inmunógeno apropiado puede prepararse modificando la subunidad \beta de hLH tal que i) conserva la capacidad de unirse a B105 y/o otros anticuerpos que inhiban parcialmente las acciones de hLH, ii) pierde la capacidad de unirse a los anticuerpos que neutralizan la actividad de LH, e iii) es antigénico. Los inmunógenos apropiados también pueden ser diseñados comenzando con una proteína diferente a la subunidad \beta de LH y modificándola para que adquiera la capacidad de unirse a B105 y/o a otros anticuerpos que inhiban parcialmente las acciones de hLH. Los anticuerpos que inhiben parcialmente las acciones de hLH son los anticuerpos llamados de "plantilla" y son usados para controlar y/o para seleccionar positivamente la retención de los epítopos deseados. Buenos ejemplos de anticuerpos de plantilla son los que se encuentran que son eficaces en aumentar la fertilidad como se describe en el ejemplo 2. Otros anticuerpos que son los anticuerpos llamados de "exclusión" son usados para seleccionar contra análogos de antígeno que contienen a los epítopos indeseables. Los ejemplos de anticuerpos de "exclusión" son los que neutralizan completamente la actividad biológica de hLH y/o que le impiden unirse a su receptor.

Hay dos estrategias globales diferentes que serán llamadas "A" y "B" para construir los antígenos usando una estrategia de selección positiva/negativa basada en anticuerpos de exclusión y de plantilla. En el enfoque "A", se empieza con la subunidad \beta de LH y se usa mutagénesis aleatoria para hacer sustituciones en las regiones de la molécula fuera del epítopo reconocido por el anticuerpo de "plantilla". Las nuevas moléculas que son producidas son expresadas (véase a continuación) y son controladas sus capacidades de unirse al anticuerpo de plantilla. Aquellas que siguen uniéndose al anticuerpo de plantilla y que tienen mutaciones en otras regiones de la molécula son utilizadas en una segunda ronda de mutagénesis sobre una parte diferente de la molécula. Este procedimiento es continuado hasta que todas las regiones de la proteína excepto hasta que haya sido modificada la que está implicada en el sitio de unión del anticuerpo (por ejemplo, B105). Los análogos finales se unirán a los anticuerpos de plantilla, pero no a los anticuerpos de exclusión. En una variante de este procedimiento, se comienza con una quimera hormonal que se une al anticuerpo de plantilla. Tales quimeras pueden prepararse comenzando con una especie diferente de LH conocida que no se una a los anticuerpos de plantilla o inducir una respuesta inmune que neutralice a hLH. Los ejemplos de este tipo de inmunógeno son quimeras de la subunidad \beta de LH humana y LH bovina. Estos incluyen la subunidad \beta de la LH bovina que ha sido modificada sustituyendo la prolina 74 con arginina, el resto encontrado en la subunidad \beta de LH humana en esta posición. Los restos de hLH son sustituidos por las regiones homólogas de la especie diferente de LH para crear el sitio de unión para los anticuerpos de plantilla. Las regiones homólogas son identificadas por la alineación de las secuencias de hLH y otras LH por las posiciones de sus restos de cisteína altamente conservados como se muestra por Pierce y Parsons (1).

En el enfoque "B" se usa una molécula variable que no está emparentada o sólo es débilmente similar a la estructura de las subunidades \beta de la hormona glicoproteica. Esto puede incluir cualquier proteína que contenga estructuras de bucle tales como las encontrados en los pliegues de inmunoglobulina o entre las hélices en proteínas unidas de cuatro hélices. La secuencia de hLH entre los restos 65-85 es sustituida por uno de los bucles según procedimientos de mutagénesis estándar. Cuando esta proteína se prepara en un vector de expresión de E. coli adecuado (por ejemplo, uno de los vectores T7 que se pueden obtener de Novagen), puede ser analizada por su capacidad de unirse a los anticuerpos monoclonales que se unen a los complejos del receptor de hLH. Ya que sólo una parte de los restos que forman el epítopo estará presente en la proteína expresada, su afinidad será inferior que la de hLH para el anticuerpo.

Para mejorar la selectividad y la afinidad de las proteínas preparadas en los enfoques "A" o "B", se puede usar un sistema de expresión bacteriano o de bacteriófago (34, 36, 55-58). En cualquier caso se preparan las genotecas de análogos de mutante y se selecciona al mutante que tiene la afinidad más alta para B105, B110, u otro anticuerpo de plantilla similar que sea útil en el ejemplo 2. Además, también se puede usar la selección negativa usando anticuerpos neutralizantes o antisuero que no sea útil en el ejemplo 2. Esto reducirá al mínimo la capacidad del antígeno de proporcionar anticuerpos indeseables cuando se usen en una vacuna.

La descripción siguiente se aplica a un método de selección basado en la tecnología de despliegue en fago, pero podría ser adaptada fácilmente por un experto en la técnica de preparación y selección de genotecas para casi cualquier sistema de expresión. Un sistema que es ameno para la selección es el basado en la inmunotransferencia de proteínas (59). Pueden usarse también varios sistemas de bacteriófago de muestra diferentes. Uno implica la utilización de un vector (es decir, pX-M13gIII) similar a phGH-M13gIII (34). Cuando se usa el enfoque "A" antes comentado, este nuevo vector llamado pA-M13gIII contiene o la subunidad \beta de hLH o una quimera de la subunidad \beta de hLH-LH en lugar de las secuencias que codifican la hormona del crecimiento de phGH-M13III (Figura 4). Cuando se usa el enfoque "B" antes comentado, las secuencias que codifican la hormona del crecimiento de phGH-M13gIII son sustituidas por un gen que codifica una molécula no emparentada con la subunidad \beta de hLH excepto para la inclusión de las secuencias que codifican la subunidad \beta de hLH cercanas al resto 74 para dar un nuevo vector llamado pB-M13gIII. La secuencia codificante de la región del vector que codifica las secuencias de "B" también contiene sitios de restricción que permiten al casete u otros tipos de mutagénesis permitir la introducción de secuencias aleatorias. Cuando son introducidas secuencias aleatorias en las regiones codificantes de pA-M13gIII o en vectores de pB-M13gIII y los vectores usados para transformar E. coli, será creada una genoteca de mutantes. Estas proteínas de mutantes pueden ser expresadas sobre la superficie de partículas del fagómido M13 como proteínas de fusión del gen III añadiendo el bacteriófago adyudante M13KO7 a E. coli. Estas partículas de fagómido se unirán al anticuerpo en proporción a las afinidades de las proteínas modificadas "A" o "B" para el anticuerpo. Un método conveniente de selección para las partículas de fagómido que se unen a los anticuerpos de plantilla es usar un protocolo de ensayo en fase sólida. En este ensayo, el anticuerpo de plantilla se usa para revestir una superficie como se ha descrito (22) y luego se añade una solución que contiene las partículas de fagómido. Las partículas de fagómido que no se unen a la superficie pueden ser desechadas. Aquellas partículas que realmente se unen al anticuerpo sobre la superficie pueden ser eliminadas del anticuerpo por la adición de tampones de pH bajo (es decir, pH 3) y son usadas para transformar de nuevo E. coli. Cuando se desea una selección negativa, se pueden sustituir los anticuerpos de exclusión por los anticuerpos de plantilla sobre la superficie. En este caso las partículas que se unen a la superficie son desechadas. Este procedimiento es repetido varias veces y luego las regiones codificantes de varios genes para las proteínas "A" y "B" son sometidas a la secuenciación del ADN. De este modo, se pueden identificar las secuencias que son críticas para la unión del anticuerpo de plantilla. Además, si son usados los anticuerpos de exclusión, se pueden seleccionar contra epítopos indeseables. También, se pueden identificar sustituciones en otras partes de la molécula que tengan poco o ningún efecto sobre la conformación de la región de unión del anticuerpo deseado. Cuando son usadas moléculas codificadas por estas secuencias para inmunizar animales o seres humanos, proporcionarán la formación de anticuerpos que reaccionen en cruzado con hLH. Ya que estos anticuerpos reconocerán una parte de la molécula conocida que se expone después de que hLH se una a sus receptores, serán capaces de inhibir las acciones de hLH, pero no de prevenir completamente su actividad biológica.

En algunos casos, los anticuerpos de plantilla y los anticuerpos de exclusión pueden no estar disponibles. En estos casos, se puede crear un antisuero de plantilla y un antisuero de exclusión que pueda ser sustituido para los anticuerpos que usen la estrategia siguiente. Se prepara cuerpo lúteo ovárico de rata por tratamiento de ratas femeninas con PMSG y hCG como se describe antes. Este cuerpo lúteo se incuba con hLH para permitir a la hormona unirse a los receptores de LH en las membranas. Entonces, las membranas son lavadas para eliminar la hLH libre y las membranas se incuban con el antisuero. Los anticuerpos que se unen a la hLH que está unida a los receptores de LH de la membrana son separados entonces del resto del antisuero lavando las membranas. Estos anticuerpos se liberan por tratamiento de las membranas a un pH por debajo de 5. Este tratamiento libera tanto a los anticuerpos como a la hLH de los receptores. Los anticuerpos se separan de hLH por filtración de gel u otro método y luego pueden ser usados como plantillas. Los anticuerpos que permanecen en el suero agotado de los anticuerpos de plantilla pueden servir como anticuerpos de exclusión.

Ejemplo 7 Desarrollo de un inmunógeno para proporcionar anticuerpos neutralizantes para hCG

Los inmunógenos preferidos que previenen la fertilidad proporcionarán la producción de anticuerpos contra hCG, pero no contra hLH. Estos pueden prepararse usando el procedimiento de plantilla/exclusión descrito en el ejemplo 6 empleando anticuerpos diferentes. Los anticuerpos de plantilla que pueden ser usados incluyen B107 y B109 disponibles de la Universidad de Columbia. Estos anticuerpos se unen a hCG con alta afinidad y tienen una afinidad muy baja para la subunidad \beta de hCG libre o para hLH. Como son específicos para la forma del heterodímero de hCG (es decir, la forma biológicamente activa de la molécula), porque no se unen a la mayor parte de otras formas inactivas de hCG en la circulación, y porque son neutralizantes, los inmunógenos que pueden ser reconocidos por estos anticuerpos con alta afinidad (es decir, Ka> 5 x 10^{7} M^{-1}) proporcionarán la formación de anticuerpos neutralizantes para hCG. Las partes de la subunidad \beta que deberían ser conservadas preferencialmente en este inmunógeno incluyen los restos 43-53 y 91-92. Además, otros anticuerpos de plantilla útiles HCZ107 y HCO514 están disponibles en Hybritech, San Diego, CA. Estos anticuerpos se unen tanto a hCG como a su subunidad \beta libre con alta afinidad y neutralizan la actividad de la hormona. Ambos tienen baja afinidad para hLH. Los restos críticos para la interacción de HCZ107 con hCG incluyen aquellos cercanos a 114 y los restos críticos para la interacción de HCO514 con hCG incluyen los cercanos a 77.

Ejemplo 8 Aumento de la actividad inmunológica

Durante la inmunización activa contra la LH o la coriogonadotropina se crea una respuesta autoinmune dirigida. Por lo tanto, es esencial usar proteínas que sean sumamente antigénicas. Esto puede ser facilitado usando el enfoque de plantilla/exclusión descrito en el ejemplo 6 para hacer el inmunógeno tan extraño como sea posible. Además, es deseable preparar la molécula multivalente para aumentar las posibilidades de que vaya a interactuar con el sistema inmunológico. Un buen método para preparar la molécula multivalente es añadir restos al extremo C o al extremo N que causará la formación de una hélice a que puede formar una cola superenrrollada con otras moléculas. Las reglas para diseñar las secuencias peptídicas que forman colas superenrolladas son conocidas en la técnica (60, 61). Además, es posible también usar secuencias que ocurren naturalmente de proteínas conocidas para formar colas superenrolladas como las encontradas en la proteína hemaglutinina del virus de la gripe, laminina, GCN4, o cualquier otra proteína. Es posible también añadir restos al extremo C o al extremo N que causarán la formación de una triple hélice similar a la encontrada en el colágeno. Estas triples hélices permitirán combinarse a tres o más moléculas de antígeno. Otras estrategias para aumentar la antigenicidad del inmunógeno también pueden ser empleadas incluyendo el acoplamiento de inmunógenos de extremo a extremo para preparar una poliproteína. Como se describe (Figura 5) es posible diseñar una proteína que tenga cualquier número de unidades de repetición usando esta estrategia.

Los anticuerpos preferidos que proporcionan una inhibición no neutralizante de la actividad de LH por lo general interactúan bien con la subunidad \beta libre y con el heterodímero. Por lo tanto, en la preparación de inmunógenos para proporcionar la formación de estos anticuerpos es conveniente por lo general comenzar con la subunidad \beta libre. Al contrario, muchos anticuerpos preferidos que proporcionan una inhibición neutralizante de la actividad de hCG se unen al \alpha,\beta-heterodímero mejor que la subunidad \beta libre de hCG. Para proporcionar la formación de estos anticuerpos, es útil a menudo comenzar con un inmunógeno que es una proteína de fusión preparada acoplando el extremo C del péptido comprendido de los restos 1-114 de la subunidad \beta de hCG al extremo N de un enlazante de proteína flexible compuesto de seis unidades de repetición de glicina y serina. El extremo C de esta proteína de fusión entonces se acopla al extremo N de los restos 1-96 de la subunidad \alpha bovino. Esto proporciona un solo polipéptido que tiene la conformación total de los restos de la subunidad \beta encontrados en hCG y que puede ser usado para inmunizar directamente o que puede ser usado como el compuesto de partida en el ejemplo 6. La administración del antígeno puede ser realizada de cualquier manera que sea conocida en la técnica. Esto incluye la inyección, la inyección en adyuvantes y el acoplamiento del antígeno a un virus.

Ejemplo 9 Inversión del efecto de hCG

La vacunación de mujeres con hCG para inducir la infertilidad tiene varias propiedades deseables incluyendo 1) los anticuerpos funcionarán sólo si la fertilización ha ocurrido, 2) el tratamiento será a largo plazo (es decir, ocurrirá durante muchos ciclos menstruales) y 3) las mujeres no tendrán que tomar píldoras o tener implantes. Además, la vacunación será reversible usando progestágenos que se sabe que previenen el rechazo del feto por el útero. Estos incluyen muchos compuestos progestágenos tal como didrogesterona (62). Este compuesto está disponible en el comercio en Solvay Pharmaceuticals, 901 Sawyer Road, Marietta, Georgia y tiene la propiedad deseada de no reaccionar en cruzado con la progesterona en inmunoensayos. Por lo tanto, el tratamiento con didrogesterona no impide la medida exacta de los niveles de progesterona. Las mujeres que son activamente inmunizadas contra hCG seguirán teniendo ciclos menstruales normales ovulando en el momento esperado durante los puntos medios de su ciclo menstrual. En el procedimiento para inducir la fertilidad, es deseable saber cuando ha ocurrido la ovulación. Sin embargo, también puede ser asumido que ha ocurrido antes del día 18 del ciclo menstrual. En la ovulación, la progesterona se produce por el cuerpo lúteo bajo la influencia de LH. La progesterona causa el aumento de la temperatura corporal basal que está asociada con la ovulación y es un método conocido para controlar la ovulación. Otro método para controlar el aumento vertiginoso de LH es medir la LH en la orina usando uno de los muchos kits de detección de ovulación. Después del día 20, la mujer que desea quedarse embarazada comienza a tomar didrogesterona (3-6 mg tres veces al día) y 0,625-1,25 mg de Premarin® (Ayerst Limited, Nueva York, NY). Esto es suficiente para imitar la secreción de la progesterona luteínica que sería causada por la hCG si no fuera neutralizada como resultado de la vacunación. El tratamiento con didrogesterona es continuado para prevenir la menstruación durante 6 semanas. En aquel tiempo la terapia con didrogesterona termina. Si los niveles de progesterona en suero son bajos, el embarazo no ha ocurrido, la menstruación seguirá y puede hacerse otra tentativa en el embarazo. Si los niveles de progesterona en suero son altos, los niveles de progesterona serán altos debido al embarazo y a la producción placentaria de progesterona. La terminación con la didrogesterona no parará el embarazo. El nivel de progesterona en suero también puede ser controlado usando técnicas de radioinmunoensayo estándar.

Ejemplo 10 Supresión de la fertilidad masculina por vacunación con FSH

Se ha demostrado que la inmunoneutralización de la FSH bloquea la fertilidad en monos y se espera que bloquee la fertilidad en hombres (8). Ha sido extremadamente difícil desarrollar una vacuna sumamente específica a hFSH capaz de proporcionar un alto título de anticuerpos neutralizantes para FSH para el uso en cualquier especie debido a la naturaleza altamente conservada de la subunidad \beta de FSH. Los métodos que han sido descritos para el desarrollo de anticuerpos para hCG también pueden ser aplicados para el desarrollo de anticuerpos para hFSH. Por lo tanto, se comienza con moléculas en las que los restos 1-111 de la subunidad \beta de hFSH están sustituidos por los restos 1-114 o 1-117 de la subunidad \beta de hCG. Como anticuerpo de plantilla se puede usar FSG761 (Hybritech). Dado que son deseados anticuerpos neutralizantes, una molécula de partida preferida también contendrá el polipéptido de la subunidad \alpha bovino acoplado al polipéptido de la subunidad \beta de hFSH por un enlazante de glicina-serina. El uso de esta vacuna en hombres prevendrá la fertilidad.

Ejemplo 11 Detalles del enfoque de ensayo de la presente aplicación para hCG

1. Se obtienen anticuerpos neutralizantes preparando monoclonales o comprándolos. También se puede obtener antisuero neutralizante inmunizando conejos u otros animales contra hCG. También será útil obtener anticuerpos o antisuero contra hLH.

2. Estos anticuerpos o antisuero son usados como plantillas positivas y negativas para seleccionar las genotecas de mutantes de la subunidad \beta de hCG. Estas genotecas pueden prepararse por mutagénesis aleatoria de la subunidad \beta de hCG en las regiones particulares de la molécula. Nótese que es preferible usar una subunidad \beta de hCG que omite el extremo C o que tiene una secuencia diferente para esta parte de la molécula para evitar seleccionar para los inmunógenos que no son neutralizantes. Un procedimiento conveniente implica el uso de técnicas de muestra de bacteriófago también discutido a continuación. Sin embargo, la muestra de bacteriófago no es esencial para que la técnica funcione.

3. Se permite a los mutantes unirse a los anticuerpos de selección negativos primero. En el ejemplo presente, el desarrollo de una vacuna de hCG, esto implicaría la unión a los anticuerpos para H o el antisuero para LH para eliminar a los mutantes que fueran estructuralmente idénticos a la LH.

4. Después, se permite a los mutantes que no se unieron a los anticuerpos de selección negativos unirse a los anticuerpos de selección positivos, es decir, aquellos que fueron hechos por la inmunización de hCG. Durante el procedimiento de selección positivo, la subunidad \beta de hCG libre se añade también para eliminar los anticuerpos que se unen a la subunidad libre y para limitar el procedimiento de selección para aquellos anticuerpos que son específicos al dímero. Los mutantes que no se unen a los anticuerpos de selección positivos son desechados. En el caso de las proteínas expresadas por bacteriófago, el bacteriófago es eluido de los anticuerpos de selección positivos y usado para infectar E. coli.

5. Este procedimiento es repetido varias veces para eliminar los inmunógenos potenciales que son capaces de unirse a los anticuerpos de hLH y además excluir aquellos que tienen una baja afinidad para los anticuerpos de hCG. Las secuencias de ADN que codifican los inmunógenos se secuencian. Los inmunógenos que más se diferencian de hCG aún conservan la capacidad de unirse a anticuerpos específicos de hCG o antisuero son usados además con alta afinidad.

6. De ser necesario, una segunda ronda de mutagénesis es realizada para aumentar el número de diferencias entre el inmunógeno potencial y la hCG. El objetivo es inventar un inmunógeno que se diferencie de hLH y que tanto como sea posible la hCG aún conserve los aspectos claves de la estructura de hCG que permita proporcionar un alto título de anticuerpos neutralizantes. Estos incluyen las regiones de la subunidad \beta distintas al extremo C que es la que más se diferencia de la subunidad \beta de hLH.

7. Una vez que los principales determinantes antigénicos únicos han sido seleccionados, el inmunógeno se hace multivalente. Hay varios métodos para lograr esto. En uno se debe fusionar el determinante a una proteína que por sí misma es multivalente o que forma multímeros (por ejemplo, la inmunoglobulina). En el otro se debe fusionar los restos a la proteína formando colas superenrolladas y esto promoverá la asociación. Cuando sea posible, son proteínas naturales que se sabe que proporcionan una respuesta inmune (por ejemplo, la gripe).

8. A. Es esencial conseguir títulos altos contra la molécula de hCG intacta si se desea prevenir la fertilidad. Esto puede requerir la combinación de hCG con una molécula que sea similar a una subunidad \alpha. La subunidad \alpha de otras glicoproteínas de mamífero es adecuada como material de partida.

8. B. Una molécula que es también un punto de partida adecuado es la que tiene propiedades deseables de ser un polipéptido simple y que conserve la estructura del heterodímero. En este caso, es deseable también hacer mutaciones en la parte de la molécula derivada de la subunidad \alpha.

8. C. Los inmunógenos pueden ser producidos usando cualquier método conveniente tal como la expresión en E. coli, levadura o células de mamíferos. No se requiere que los inmunógenos esten glicosilados. Los inmunógenos también pueden ser ADN o ARN. También pueden ser integrados en la cubierta de virus.

8. D. Tampoco se requiere que comience con la subunidad \beta de hCG. Se puede comenzar con cualquier proteína. La clave es usar la estrategia de plantilla de seleccionar las proteínas que se quieren. Por ejemplo, se puede comenzar con una unión de cuatro hélices e incorporar las secuencias de aminoácidos de las partes de la subunidad \beta de hCG que están cercanas a los restos 38-57 y 91-92. También se puede comenzar con una inmunoglobulina, incluyendo una que es un anticuerpo monoclonal antiidiotípico para un anticuerpo específico de HCG.

La figura 1 es un gráfico que ilustra la influencia de anticuerpos y antisuero en la unión de hLH radiomarcada a receptores de LH. La figura 1 ilustra la influencia de tres tipos diferentes de anticuerpos o antisuero en la unión de hLH a receptores de LH. El anticuerpo "A" tiene poco o ningún efecto sobre la unión de la hormona a receptores. Su principal influencia inhibitoria potencial in vivo sería en el metabolismo de la hormona. El anticuerpo "B" tiene la capacidad de bloquear parcialmente la unión de hLH a receptores de LH. Por lo tanto, aunque el anticuerpo fuera inhibitorio in vivo, hasta un exceso muy grande de este anticuerpo en relación con la LH sería incapaz de reducir su actividad por debajo del 40% como se muestra en este documento. Nótese que pueden ser producidos diferentes anticuerpos teniendo diferentes capacidades de bloquear las actividades de LH (por ejemplo, B105 y B110). El anticuerpo "B" es un ejemplo del tipo general de anticuerpo que es el más útil in vivo. El anticuerpo "C" es un anticuerpo neutralizante dado que a altas concentraciones puede prevenir la actividad de hLH. Debido a su potencial de prevenir la actividad de LH, un exceso de este anticuerpo inhibiría la fertilidad.

La figura 2 es un gráfico que ilustra la influencia de anticuerpos y antisuero sobre la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides in vitro. La figura 2 ilustra los efectos de tres anticuerpos sobre la capacidad de LH de inducir la síntesis de testosterona (es decir, la génesis de esteroides) de suspensiones celulares de testículos de rata Leydig. La curva "A" ilustra la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides en ausencia de anticuerpos. La curva "B" ilustra la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides en presencia de un exceso masivo de anticuerpos que puede reducir la actividad de hLH aproximadamente 3 veces. La curva "C" ilustra la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides en presencia de un exceso masivo de anticuerpos que puede reducir la actividad hLH aproximadamente 20 veces. La curva "D" ilustra la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides en presencia de un exceso masivo de anticuerpos que puede neutralizar la actividad de hLH. La decisión de usar el anticuerpo "B" y/o "C" in vivo dependerá de la relación de LH/FSH y del grado en el que se desee suprimir la actividad de LH. Cuando los niveles de hLH son altos y tienen que reducirse más, el anticuerpo "C" será el preferido. Cuando las relaciones hLH/hFSH sólo son ligeramente elevadas, el anticuerpo "B" será el preferido. El uso del anticuerpo "D" en dosis muy altas causaría la infertilidad. Es esperado que muchos anticuerpos útiles serán encontrados teniendo la capacidad de reducir la actividad de hLH u otra LH sobre células ováricas así como en células de testículos.

La figura 3 es un gráfico que ilustra la influencia de anticuerpos y antisuero sobre la capacidad de hLH de inducir la génesis de esteroides in vivo. La figura 3 ilustra los efectos de tres anticuerpos diferentes sobre la formación de testosterona en hombres cuando son administradas i.v. cantidades masivas de anticuerpos antes de diferentes cantidades de hLH también dadas i.v. En todos los ejemplos ilustrados, la cantidad de anticuerpo administrado excede enormemente la de hLH en una base molar. Se esperarían efectos similares para los anticuerpos en la génesis de esteroides en mujeres. La curva "A" muestra el efecto de hLH sobre la génesis de esteroides en ausencia del anticuerpo. La curva "B" ilustra el efecto de una cantidad masiva de anticuerpos que puede inhibir la actividad de hLH en un 40% como mucho. La curva "C" ilustra la influencia de una cantidad masiva de anticuerpos que puede inhibir la actividad de hLH en un 95% como mucho. La curva "D" ilustra los efectos de una cantidad masiva de un anticuerpo neutralizante.

La figura 4 muestra los vectores que pueden ser usados en estrategias de selección de plantilla/exclusión. Estos vectores son similares en el diseño a los descritos por Bass et al. (34) y son preparados sustituyendo las secuencias codificantes de la hormona del crecimiento humana con aquellos de las subunidades a de hLH o una quimera de hLH usando los procedimientos de mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa que son estándar en la técnica tal como el procedimiento SOEing descrito por Ho, et al. (63). Vectores similares para la generación de inmunógenos para hCG y hFSH podrían prepararse sustituyendo la secuencia de la hormona del crecimiento con las secuencias codificantes de los restos 1-114 de la subunidad \beta de hCG, los restos 1-111 de la subunidad \beta de hFSH, las secuencias codificantes de los restos 1-114 de la subunidad \beta de hCG acoplados a 5' de las secuencias codificantes para los aminoácidos glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-5' acoplados de las secuencias codificantes de la subunidad \alpha bovina, o las secuencias codificantes de los restos 1-111 5'-acoplados de la subunidad \beta de hFSH de las secuencias codificantes de los aminoácidos glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-5' acoplados de las secuencias codificantes de la subunidad \alpha bovina. En esta Figura el "lac p" representa al promotor lac, stll representa la secuencia líder, "hLH \beta" representa la secuencia que codifica la subunidad \beta de LH humana del codon 1 al codon 114, "gen M13 III" representa la secuencia codificante de los codones 198-410 de proteína del gen M13 en el mismo marco de lectura que stll y los codones \beta de LH humanos. "Resistencia a Amp" es el gen del pBR322 que codifica la enzima b-lactamasa, "322 ori" es el origen de replicación de pBR322 y "f1 ori" es el origen de replicación de M13. Las mutaciones serían preparadas en la parte de "hLH \beta" de este vector. Además, los codones de "hLH \beta" podrían ser sustituidos por los codones para las otras proteínas descritas en el texto.

La figura 5 muestra los tipos de inmunógenos que tienen mayor antigenicidad para el uso en la inmunización activa contra LH, hCG, o FSH. Algunos de estos tienen la repetición heptad conocida por formar una cola superenrrollada (panel A). Otros tienen una repetición conocida por formar una triple hélice (panel B). Estos dan una mayor antigenicidad porque son poliméricos. Otros métodos para preparar inmunógenos poliméricos incluyen la preparación de proteínas de fusión con cualquiera del extremo C (panel C) o del extremo N o de las inmunoglobulinas (panel D). Un inmunógeno monocatenario comprendido por una proteína de fusión de la subunidad \alpha bovina y las subunidades \beta de hCG y hFSH tendría mayor antigenicidad en seres humanos.

Ilustración A: Los codones para dos o más repeticiones heptad son insertados en el marco entre el codon 114 y el codon de terminación de la LH o la subunidad \beta del análogo. El diseño de la repetición heptad es similar al descrito en la referencia 60. Cada repetición contiene 7 aminoácidos marcados para "A, B, C, D, E, F, G" que tienen las propiedades siguientes. Los aminoácidos A y D son hidrófobos y son leucina, isoleucina o valina. Los aminoácidos E y G son aminoácidos cargados. El aminoácido E debería tener una carga opuesta al aminoácido G para formar homodímeros. Por lo tanto, si E es un glutamato, entonces G debería ser lisina. Los aminoácidos "B, C, F" pueden ser casi cualquier tipo que favorezca la formación de la hélice. Por lo tanto, deberían contener pocas, si alguna, prolinas o glicinas.

Ilustración B: Los codones para 6 o más repeticiones de aminoácidos tripletes son insertados en el marco entre el codon 114 y el codon de terminación de la unidad \beta. Estos tripletes codifican los aminoácidos de glicina, X, Y si X y Y son cualquier aminoácido conocido que sea parte de la secuencia de colágeno que forma una triple hélice.

Ilustración C: Los codones para la cadena pesada de IgG son insertados inmediatamente en 5' del codon 1 de la subunidad \beta. Cuando estos genes son co-expresados con la cadena ligera de IgG \lambda o \kappa, causarán la producción de una IgG que contenga dos subunidades \beta en su extremo C.

Ilustración D: Los codones para la región de la cadena pesada de IgG que carecen de la región variable y la primera constante son insertados en el marco entre el codon 114 y el codon de terminación de la subunidad \beta.

Ilustración E: Los codones para una secuencia de repetición de glicina-serina (es decir, la repetición GS) tal como la secuencia serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina son insertados en el marco entre el codon 114 y el codon de terminación de un análogo de la subunidad \beta. El último codon de este análogo se vuelve el 126. Después, los codones 1-96 para la subunidad \alpha bovina u otra o los codones 1-92 de la subunidad \alpha humana se insertan en el marco entre los codones 126 y el codon de terminación de la estructura de la subunidad \beta conteniendo la cola de poli-glicina-serina. Esto forma una gonadotropina de una subunidad individual que transporta la estructura del heterodímero de la hormona glicoproteica.

Ilustración F: Se añaden los codones para la subunidad \alpha humana, bovina, o de otro vertebrado, o la secuencia análoga entre el último codon y el codon de terminación de un gen que codifica una repetición heptad que contiene sólo aminoácidos positivamente cargados en las posiciones E y G en la repetición heptad (es decir, repetición Heptad Nº. 1) utilizando métodos conocidos para cualquier experto experto en las técnicas de ADN recombinante estándar para preparar y expresar genes. Cuando este gen es expresado en bacterias o levaduras, u otras células eucariotas u organismos, producirá una proteína que tiene la repetición heptad positivamente cargada en su extremo amino y una subunidad \alpha o un análogo de la subunidad \alpha en su extremo carboxi. Los codones para una repetición heptad que codifican aminoácidos negativamente cargados en las posiciones E y G (es decir, repectición Heptad Nº. 2) son añadidos entre el último codon y el codon de terminación para un análogo de la subunidad \beta. Cuando este gen es expresado en bacterias o levadura u otras células eucariotas u organismos, producirá una proteína que tiene una subunidad \beta o análogo en su extremo amino y la repetición heptad negativamente cargada en su extremo carboxi.

Ilustración G: Ésta muestra el heterodímero que se forma cuando las proteínas que tienen la forma descrita en la ilustración F son mezcladas. Las secuencias de la repetición heptad Nº. 1 y repetición heptad Nº. 2 son escogidas para crear la formación de heterodímeros y reducir la formación de homodímeros.

Ilustración H: Los multímeros son formados cuando los compuestos en las ilustraciones F y G son mezclados debido a la combinación de las subunidades \alpha y \beta y las repeticiones heptad. En las ilustraciones A - H, "N-" y "-C" se refieren al extremo amino y el extremo carboxi de las proteínas. "i" se refiere a una unidad individual que puede ser repetida varias veces. Nótese también que mientras las repeticiones heptad ilustradas en este documento son idénticas, el uso de repeticiones idénticas no es esencial. Hay un gran número de proteínas que contienen repeticiones heptad no idénticas que son capaces de formar homodímeros o heterodímeros (60).

\vskip1.000000\baselineskip

Gonadotropinas monocatenarias con actividad de lutropina y/o foliotropina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Preparación y uso del Análogo Nº. 1 (c.f., Tabla 1), una gonadotropina monocatenaria con actividad de lutropina. (Véase la Figura 6)

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 1 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse comenzando con las secuencias codificantes de la subunidad \beta de hCG y la subunidad \alpha humana. Éstas pueden ser clonadas a partir de una genoteca de cDNA de placenta humana. Las secuencias que codifican el péptido de señal de la subunidad \alpha humana son suprimidas y las secuencias codificantes de las proteínas son empalmadas juntas usando la técnica SOEing (63) como sigue: el iniciador Nº. 1 (100 ng) que tiene la secuencia 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGATGGA
GATGTTCCAGGGGCTGCT-3' y el iniciador Nº. 2 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-GGGAGCCTGTGGGGC
TAGGAGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCATCG-5' son mezclados con cDNA de la subunidad \beta de hCG (1 \mug) que sirve como una plantilla y se realiza la PCR para 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando ADN polimerasa Pfu comprada en Strate-gene, La Jolla, CA y trifosfatos de dioxinucleótido y tampón para la PCR como se ha descrito (63). El iniciador Nº. 3 (100 ng) que tiene la secuencia 5'-GGATCCGGTAGCGGATCTGGTAGCGCTCCTGATGTGCAGGATTGCCCA-3' y el iniciador Nº. 4 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-ACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTC
GATTAGGCCT-5' son mezclados con cDNA de la subunidad \alpha humana (1 \mug) que sirve como una plantilla y se realiza la PCR para 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando ADN polimerasa Pfu y trifosfatos de dioxinucleótido y tampón para la PCR como ha sido descrito (63). Estas dos reacciones PCR dan productos que sirven como plantillas de intermedios en una tercera reacción de la PCR (final) que proporcionan las estructuras deseadas en una forma adecuada para la clonación. La reacción de la PCR final se realiza mezclando 1 \mul de los productos de las dos primeras reacciones de la PCR con el iniciador Nº. 5 que tiene la secuencia 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGG-3' y el iniciador Nº. 6 que tiene la secuencia 3'-ATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5' para 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando ADN polimerasa Pfu, trifosfatos de dioxinucleótido adicionales y tampón para la PCR. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BgIII y se liga en pSVL (un vector de expresión obtenido de Pharmacia, Piscataway, NJ) que ha sido digerido con XhoI y BamHI para crear un vector que dirigirá la síntesis del Análogo 1. El sitio de Xhol del producto de la PCR se ligará al sitio de XhoI de pSVL y el sitio de BgIII del producto de la PCR se ligará al sitio de BamHI de pSVL. El sitio de XhoI será regenerado y los sitios de BgIII y BamHI serán eliminados. Las secuencias de las regiones codificantes (es decir, entre los sitios de XbaI y KpnI, c.f., Figura 6) de varias estructuras son determinadas hasta que se encuentre una que codifique una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos deseada ilustrada en la Figura 6. Es se hace para eliminar los errores posibles que surgen como resultado de la PCR y otras manipulaciones del ADN y es una precaución estándar para estar seguro de que es obtenida la secuencia deseada. Se espera que la proteína expresada carezca de restos del aminoácido MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que son la parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que se elimina por la célula durante la síntesis de la proteína. Este vector se expresa en células COS-7 como ha sido descrito (64) y la proteína liberada en el medio es analizada por su capacidad de inhibir la unión de hCG radiada con yodo para anticuerpos monoclonales o antisuero preparado contra hCG. La proteína hecha por las células COS-7 competirá con la hCG radiada con yodo por unirse a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido de la Universidad de Columbia), B105 (obtenido de la Universidad de Columbia), B107 (obtenido de la Universidad de Columbia) B109 (obtenido de la Universidad de Columbia), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), HCZ107 (obtenido de Hybritech), o HCO514 (obtenido de Hybritech), ZMCG18 (obtenido de Pierce), ZMCG13 (obtenido de Pierce), o ZMCG7 (obtenido de Pierce) o 518B7 (obtenido del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG radiomarcada por unirse a los receptores sobre el cuerpo lúteo como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación de testosterona en un ensayo con células Leydig funcionando de modo similar al descrito por Moyle et al. (37) y para estimular la ovulación en animales hembras y para estimular la formación de testosterona en mamíferos machos. También se espera que este análogo sea un punto de partida bueno para el uso en una vacuna anticonceptiva usando el enfoque de plantilla descrito en el Ejemplo 11. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 1 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con las enzimas de restricción de endonucleasa de ApaI y Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contengan cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de ApaI/Eco47III por métodos estándar, secuenciando la región entre Apal/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 13 Preparación y uso del análogo Nº. 2, una gonadotropina monocatenaria con actividad de lutropina. (Véase la Figura 7)

Las secuencias codificantes del Análogo Nº. 2 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse por PCR utilizando los iniciadores Nº. 1 y Nº. 7 y estructura de la expresión descrita en el Ejemplo 12 y en la Figura 6 como una plantilla. La secuencia del iniciador Nº. 7 es 3'-TGGTGGGGAACTGGACACTACTGGGCGCCCCTAGGCCATCG-5'. El producto de la PCR final se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se liga con el fragmento grande de ADN obtenido digiriendo la estructura de la expresión como ha sido descrita en el Ejemplo 12 con XhoI y BamHI. Las secuencias de las regiones codificantes entre los sitios de XhoI y BamHI de varias estructuras son determinadas hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 7. Esto asegurará que no esten presentes artefactos de clonación en la región que ha sido cambiada. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos del aminoácido MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que es parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. Este vector se expresa en células COS-7 y las proteínas liberadas en el medio son analizadas por su capacidad de inhibir la unión de hCG radiada con yodo para anticuerpos monoclonales o antisuero preparado contra hCG. La proteína preparada por las células COS-7 competirá con hCG radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: B101 (obtenido de la Universidad de Columbia), B105 (obtenido de la Universidad de Columbia), B107 (obtenido de la Universidad de Columbia), B109 (obtenido de la Universidad de Columbia), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), o HCO514 (obtenido de Hybritech), ZMCG18 (obtenido de Pierce), ZMCG13 (obtenido de Pierce), o ZMCG7 (obtenido de Pierce) o 518B7 (obtenido del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG radiomarcada por unirse a los receptores sobre el cuerpo lúteo como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación de testosterona en un ensayo de células Leydig funcionando de modo similar al descrito por Moyle et al. (37) y para estimular la ovulación en animales hembras y para estimular la formación de testosterona en mamíferos machos. También se espera que este análogo sea un punto de partida bueno para el uso en una vacuna anticonceptiva que use el enfoque de plantilla descrito en el Ejemplo 11. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 2 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con las enzimas de restricción de endonucleasa SstII y Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contengan cualquier número de codones de glicina o de serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de SstII/Eco47111 por métodos estándar, secuenciando la región entre SstII/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 14 Preparación y uso del Análogo Nº. 3, una gonadotropina monocatenaria con actividad de lutropina. (Véase la Figura 8)

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 3 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse en la manera en la que se describe para el Análogo Nº. 2 en el Ejemplo 13 pero los iniciadores Nº. 1 y Nº. 7 son sustituidos por los iniciadores Nº. 8 y Nº. 9 y el cDNA de la subunidad \beta de hLH es usado como plantilla en lugar del cDNA de la subunidad \beta de hCG. El cDNA de la subunidad \beta de hLH puede obtenerse seleccionando a partir de una genoteca de hipófisis humana. La secuencia del iniciador Nº. 8 es 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGAATGGAGATGCTCCAGGGGCTGCT-3' y la secuencia del iniciador Nº. 9 es 3'-GTGGGGAACTGGACACTGGTGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTA
GACCATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y es subclonado en los sitios de XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 12. Las secuencias de las regiones codificantes entre los sitios de XhoI y BamHI de diversas estructuras son determinadas hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 8. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos del aminoácido MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que es la parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hLH y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. Este vector se expresa en células COS-7 y la proteína liberada en el medio se analiza por su capacidad de inhibir la unión de hCG radiada con yodo para anticuerpos monoclonales o antisuero preparado contra hCG. La proteína preparada por las células COS-7 competirá con la hCG radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: B101 (obtenido de la Universidad de Columbia), B105 (obtenido de la Universidad de Columbia), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), ZMCG7 (obtenido de Pierce) o 518B7 (obtenido del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG radiomarcada por unirse a los receptores sobre el cuerpo lúteo como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación de testosterona en un ensayo de células Leydig realizado similar al descrito por Moyle et al. (37) y para estimular la ovulación en animales hembras y para estimular la formación de testosterona en mamíferos machos. También se espera que este análogo sea un punto de partida bueno para el uso en el diseño de vacunas para realzar o inhibir la fertilidad usando el procedimiento de plantilla descrito antes. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 3 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con BamHI y las enzimas de restricción de endonucleasa Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contengan cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHI/Eco47III por métodos estándar, secuenciando la región entre BamHI/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 15 Preparación y uso del Análogo Nº. 4, una gonadotropina monocatenaria con actividad de folitropina. (Véase la Figura 9)

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 4 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse en la manera en la que se describe para el Análogo Nº. 2 en el Ejemplo 13 pero los iniciadores Nº. 1 y Nº. 7 son sustituidos por los iniciadores Nº. 10 y Nº. 11 y que el cDNA de la subunidad \beta de hFSH se use como plantilla en lugar del cDNA de la subunidad \beta de hCG. El cDNA de la subunidad \beta de hFSH puede obtenerse a partir de una genoteca de la hipófisis humana. La secuencia del iniciador Nº. 10 es 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCC-3' y la secuencia del iniciador Nº. 11 es 3'-GACGAGGAAACCACTTTACTTTCTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCA-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios de XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 12. Las secuencias de las regiones codificantes entre los sitios de XbaI y BamHI de diversas estructuras son determinadas hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 9. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos de aminoácidos MKTLQFFFLFCCWKAICC que son la parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hFSH y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. El vector se expresa en células COS-7 y la proteína preparada por las células competirá con la hFSH radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: ZMFS1 (obtenido de Pierce), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), FSG76 (obtenido de Hybritech), FSR093.3 (obtenido de Hybritech), FSH107 (obtenido de Hybritech), FSB061 (obtenido de Hybritech), FSM210 (obtenido de Hybritech) y FSM268 (obtenido de Hybritech). La proteína liberada en el medio competirá con hFSH por unirse a los receptores en testículos bovinos como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación del estradiol en un ensayo de células granulosas realizado similar al descrito por Skaf et al. (65) y para estimular el desarrollo del folículo y la espermatogénesis en mamíferos hembras y machos. Este análogo es también un compuesto de partida útil para seleccionar un inmunógeno que proporcione anticuerpos para FSH y que sea parte de una vacuna anticonceptiva. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 4 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con las enzimas de restricción de endonucleasa ApaI y Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con codones de los aminoácidos deseados que contengan cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHI/Eco47111 por métodos estándar, secuenciando la región entre ApaI/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 16 Preparación y uso del Análogo Nº. 5, una gonadotropina monocatenaria con actividad de FSH que es estructuralmente más similar a hCG que hFSH. (Véase la Figura 10)

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 5 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse en la manera en la que se describe para el Análogo Nº. 2 en el Ejemplo 13 pero el iniciador Nº. 7 es sustituido por el iniciador Nº. 12. La secuencia del iniciador Nº. 12 es 3'-CGACAGTCGACAGTTACACGTGAGACGCTGTCGCTGTCGTGACTAACATGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGAGGAAACCACTTTACTTTCTTCCTAGGCCATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios de XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 12. Las secuencias de las regiones codificantes entre los sitios de XbaI y BamHI de diversas estructuras son determinadas hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 10. Se espera que la proteína expresada carezca del resto de aminoácido: MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que es parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. Este vector se expresa en células COS-7 y la proteína liberada en el medio se analiza por su capacidad de inhibir la unión de hCG radiada con yodo para anticuerpos monoclonales o antisuero preparado contra hCG. La proteína preparada por las células COS-7 competirá con la hCG radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: B101 (obtenido de la Universidad de Columbia), B105 (obtenido de la Universidad de Columbia), B107 (obtenido de la Universidad de Columbia), B109 (obtenido de la Universidad de Columbia), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), o HCO514 (obtenido de Hybritech), ZMCG18 (obtenido de Pierce), ZMCG13 (obtenido de Pierce), o ZMCG7 (obtenido de Pierce) o 518B7 (obtenido del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hFSH por unirse a los receptores en testículos bovinos como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación del estradiol en un ensayo de células granulosas realizado similar al descrito por Skaf et al. (65) y para estimular el desarrollo del folículo y la espermatogénesis en mamíferos hembras y machos. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 5 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con enzimas de restricción de endonucleasa ApaI y Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contengan cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHUEco47III por métodos estándar, secuenciando la región entre ApaI/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 17 Preparación y uso del Análogo Nº. 6, una gonadotropina monocatenaria con actividades de FSH y LH que son estructuralmente más similares a hCG que hFSH. (Véase la Figura 11)

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 6 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse en la manera en la que se describe para el Análogo Nº. 2 en el Ejemplo 13 pero el iniciador Nº. 7 es sustituido por el iniciador Nº. 13. La secuencia del iniciador Nº. 13 es 3'-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGAGGAAAC
CACTTTACTTTCTTCCTAGGCCATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios de XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 12. Las secuencias de las regiones codificantes entre los sitios de XbaI y BamHI de diversas estructuras son determinadas hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 11. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos de aminoácidos MEMLQGLLLLLLLSMG
GAWA que es parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad de HCG y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. Este vector se expresa en células COS-7 y la proteína liberada en el medio se analiza por su capacidad de inhibir la unión de hCG radiada con yodo para anticuerpos monoclonales o antisuero preparado contra hCG. La proteína preparada a partir de células COS-7 competirá con la hCG radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: B101 (obtenido de la Universidad de Columbia), B105 (obtenido de la Universidad de Columbia), B107 (obtenido de la Universidad de Columbia), B109 (obtenido de la Universidad de Columbia), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), o HCO514 (obtenido de Hybritech), ZMCG18 (obtenido de Pierce), ZMCG13 (obtenido de Pierce), o ZMCG7 (obtenido de Pierce) o 518B7 (obtenido del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con hFSH por unirse a los receptores en testículos bovinos como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación del estradiol en un ensayo de células granulosas realizado similar al descrito por Skaf et al. (65) y para estimular el desarrollo del folículo y la espermatogénesis en mamíferos hembras y machos. La proteína liberada en el medio competirá con la hCG radiomarcada por unirse a los receptores sobre el cuerpo lúteo como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación de testosterona en un ensayo de células Leydig realizado similar al descrito por Moyle et al. (37) y para estimular la ovulación en animales hembras y para estimular la formación de testosterona en mamíferos machos. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 6 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con enzimas de restricción de endonucleasa ApaI y Eco47I1I, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contienen cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHI/Eco47I1I por métodos estándar, secuenciando la región entre ApallEco471II para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 18 Preparación y uso del Análogo Nº. 7, una gonadotropina monocatenaria con actividades de FSH y LH que es estructuralmente más similar a hCG que hFSH.

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 7 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse en la manera en la que se describe para el Análogo Nº. 2 en el Ejemplo 13 pero el iniciador Nº. 7 es sustituido por el iniciador Nº. 14. La secuencia del iniciador Nº. 14 es 3'-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGAGGAAAC
CACTTCCTAGGCCATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios de XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 12. Las secuencias de las regiones codificantes entre los sitios de XbaI y BamHI de diversas estructuras son determinadas hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 12. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos de aminoácidos MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que es parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. Este vector se expresa en células COS-7 y la proteína liberada en el medio se analiza por su capacidad de inhibir la unión de hCG radiada con yodo para anticuerpos monoclonales o antisuero preparado contra hCG. La proteína preparada por las células COS-7 competirá con la hCG radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: B101 (obtenido de la Universidad de Columbia), B105 (obtenido de la Universidad de Columbia), B107 (obtenido de la Universidad de Columbia), B109 (obtenido de la Universidad de Columbia), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), o HCO514 (obtenido de Hybritech), ZMCG18 (obtenido de Pierce), ZMCG13 (obtenido de Pierce), o ZMCG7 (obtenido de Pierce) o 518B7 (obtenido del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con hFSH por unirse a los receptores en testículos bovinos como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación del estradiol en un ensayo de células granulosas realizado similar al descrito por Skaf et al. (65) y para estimular el desarrollo del folículo y la espermatogénesis en mamíferos hembras y machos. La proteína liberada en el medio competirá con la hCG radiomarcada por unirse a los receptores sobre el cuerpo lúteo como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación de testosterona en un ensayo de células Leydig realizado similar al descrito por Moyle et al. (37) y para estimular la ovulación en animales hembras y para estimular la formación de testosterona en mamíferos machos. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 17 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con las enzimas de restricción de endonucleasa ApaI y Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contienen cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHI/Eco47III por métodos estándar, secuenciando la región entre ApaI/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 19 Preparación y uso del Análogo Nº. 8, una gonadotropina monocatenaria con actividades de FSH y LH que es estructuralmente más similar a hCG que hFSH. (Véase la Figura 13)

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 8 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse en la manera en la que se describe para el Análogo Nº. 2 en el Ejemplo 13 pero el iniciador Nº. 7 es sustituido por el iniciador Nº. 15. La secuencia del iniciador Nº. 15 es 3'-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGC
TACTGGGCGCCCCTAGGCCATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios de XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 12. Las secuencias de las regiones codificantes entre los sitios de XbaI y BamHI de diversas estructuras son determinadas hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 13. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos de aminoácidos MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que es parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. Este vector se expresa en células COS-7 y la proteína liberada en el medio se analiza por su capacidad de inhibir la unión de hCG radiada con yodo para anticuerpos monoclonales o antisuero preparado contra hCG. La proteína preparada por las células COS-7 competirá con la hCG radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: B101 (obtenido de la Universidad de Columbia), B105 (obtenido de la Universidad de Columbia), B107 (obtenido de la Universidad de Columbia), B109 (obtenido de la Universidad de Columbia), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), o HCO514 (obtenido de Hybritech), ZMCG18 (obtenido de Pierce), ZMCG13 (obtenido de Pierce), o ZMCG7 (obtenido de Pierce) o 518B7 (obtenido del Doctor Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con hFSH por unirse a los receptores en testículos bovinos como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación del estradiol en un ensayo de células granulosas realizado similar al descrito por Skaf et al. (65) y para estimular el desarrollo del folículo y la espermatogénesis en mamíferos hembras y machos. La proteína liberada en el medio competirá con la hCG radiomarcada por unirse a los receptores sobre el cuerpo lúteo como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación de testosterona en un ensayo de células Leydig realizado similar al descrito por Moyle et al. (37) y para estimular la ovulación en animales hembras y para estimular la formación de testosterona en mamíferos machos. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 8 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con enzimas de restricción de endonucleasa ApaI y Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contienen cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHI/Eco47III por métodos estándar, secuenciando la región entre el ApaI/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

\newpage

Ejemplo 20 Preparación y uso del Análogo Nº. 9; una gonadotropina monocatenaria con actividad de folitropina. (Véase la Figura 14)

Las secuencias codificantes del análogo Nº. 9 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizados usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse digiriendo la estructura como ha sido descrita en el Ejemplo 15 usada para expresar el Análogo 4 con las enzimas de restricción ApaI y BamHI. El trozo pequeño es sustituido por un casete de ADN sintético para dar la secuencia ilustrada en la Figura 14. La secuencia codificante entre los sitios de ApaI y BamHI de varias estructuras se determina hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 14. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos de aminoácidos MKTLQFFFLFCCWKAICC que es parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hFSH y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. El vector se expresa en células COS-7 y la proteína preparada por las células competirá con la hFSH radiada con yodo por unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes: ZMFS1 (obtenido de Pierce), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia), HCU061 (obtenido de Hybritech), FSG761 (obtenido de Hybritech), FSR093.3 (obtenido de Hybritech), FSH107 (obtenido de Hybritech), FSB061 (obtenido de Hybritech), FSM210 (obtenido de Hybritech) y FSM268 (obtenido de Hybritech). La proteína liberada en el medio competirá con hFSH por unirse a los receptores en testículos bovinos como ha sido descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación del estradiol en un ensayo de células granulosas realizado similar al descrito por Skaf et al. (65) y para estimular el desarrollo del folículo y la espermatogénesis en mamíferos hembras y machos. Este análogo es también un compuesto de partida útil para seleccionar un inmunógeno que proporcione anticuerpos para FSH y es parte de una vacuna anticonceptiva. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 9 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con las enzimas de restricción de endonucleasa ApaI y Eco47III, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contienen cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHI/Eco47I11 por métodos estándar, secuenciando la región entre ApaI/Eco471I1 para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 21 Preparación y uso del Análogo Nº. 10, una gonadotropina monocatenaria con actividad de folitropina. (Véase la Figura 15)

Las secuencias codificantes del Análogo Nº. 10 catalogado en la Tabla 1 pueden ser sintetizadas usando el enfoque de ligamiento en bloque anteriormente descrito (54) o pueden prepararse digiriendo la estructura como ha sido descrita en el Ejemplo 15 usada para expresar el Análogo 4 con las enzimas de restricción ApaI y BamHI. El trozo pequeño es sustituido por el casete de ADN sintético para dar la secuencia ilustrada en la Figura 15. La secuencia codificante entre los sitios de ApaI y BamHI de varias estructuras se determina hasta que sea encontrada una que codifique una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 15. Se espera que la proteína expresada carezca de los restos de aminoácidos MKTLQFFFLFCCWKAICC que es parte de la secuencia de señal encontrada en la subunidad \beta de hFSH y que es eliminada por la célula durante la síntesis proteica. El vector expresado en células COS-7 y la proteína preparada por las células competirá con la hFSH radiada con yodo para unirse a uno o varios de los anticuerpos siguientes ZMFS1 (obtenido de Pierce), A201 (obtenido de la Universidad de Columbia) HCU061 (obtenido de Hybritech), FSG761 (obtenido de Hybritech) FSR093.3 (obtenido de Hybritech), FSH 107 (obtenido de Hybritech), FSB061 (obtenido de Hybritech), FSM210 (obtenido de Hybritech) y FSM268 (obtenido de Hybritech). La proteína liberada en el medio competirá con hFSH por unirse a los receptores en testículos bovinos como ha sido descrito por Campbell Dean-Emig y Moyle (64). Se espera que esto estimulará la formación del estradiol en un ensayo de células granulosas realizado de modo similar al descrito por Skaf et al. (65) y para estimular el desarrollo del folículo y la espermatogénesis en mamíferos machos y hembras. Este análogo es también un compuesto de partida útil para seleccionar el inmunógeno que proporcione anticuerpos para FSH y es parte de una vacuna anticonceptiva. Se muestra este análogo en la Tabla 1 como el Análogo Nº. 10 y contiene una secuencia enlazante de GSGSGSGS. Este enlazante puede ser modificado digiriendo el vector de expresión con las enzimas de restricción de endonucleasa ApaI y Eco47111, desechando el pedazo corto, ligando un casete de ADN bicatenario sintético con los codones de los aminoácidos deseados que contienen cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio de BamHI/Eco471TI por métodos estándar, secuenciando la región entre ApaI/Eco47III para confirmar que han sido hechas las mutaciones deseadas y expresando la proteína en células COS-7. Esto puede hacerse para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que la proteína funcione como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se espera que varias copias de la proteína se combinen para formar multímeros.

Ejemplo 22 Preparación de un análogo de la subunidad \alpha que carece de sitios de glicosilación. (Véase la Figura 16)

Se espera que los análogos 1-10 contengan 4 oligosacáridos unidos por asparagina ya que contienen 4 grupos de codones para la secuencia Asparagina-X-Treonina/Serina donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. Se ha demostrado que la eliminación de oligosacáridos unidos por asparagina, particularmente los de la subunidad \alpha, reduce la eficacia hormonal. Las señales de glicosilación unidas por asparagina pueden ser eliminadas de la parte de la subunidad \alpha de las gonadotropinas monocatenarias usando la PCR como se describe en este documento. El iniciador 16 de la PCR que tiene la secuencia: 5'-TGCTTCTCTAGAGCATATCCCACTCCACTAAGGTCCAAGAAGAC
GATGTTGGTCCAAAAGCAAGTCACCT-3' y el iniciador 17 de la PCR que tiene la secuencia: 3'-CAAAGTTT
CACCTCGTTGTGTGCCGCACGGTGACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCATG-5' son
usados en una reacción PCR con el vector que es capaz de dirigir la expresión del Análogo 1 y que se describe en el Ejemplo 12 y la Figura 6. Después de 25 ciclos en las condiciones descritas en el Ejemplo 12, el producto de la PCR y el vector de expresión son digeridos con XbaI y KpnI. El pequeño fragmento producido por la digestión del vector es desechado y el producto de la PCR digerido se liga en el vector en su lugar. Esto produce un vector de expresión que codifica el Análogo 11, un análogo que contiene sólo 2 señales de glicosilación unidas a Asn pero se espera que conserve su afinidad para anticuerpos y antisuero que se unen a hCG. También se espera que conserve su afinidad para los receptores de LH como se muestra por su capacidad de competir con hCG por unirse a membranas del cuerpo lúteo de rata. Sin embargo, se espera que tenga una capacidad reducida de inducir la transducción de señal, especialmente cuando su capacidad de proporcionar la acumulación de AMP cíclico se analiza (37). Es posible crear derivados similares de los Análogos 2-10 en los que los oligosacáridos son eliminados de la parte de la proteína derivada de la subunidad \alpha digiriendo cada uno de los vectores de expresión con BamHI y KpnI, desechando el pedazo más pequeño y ligando el fragmento pequeño de BamHI/KpnI obtenido por la digestión del Análogo 11. Por lo tanto, el Análogo 2 sería el Análogo 12, el Análogo 3 sería el Análogo 13, el Análogo 4 sería el Análogo 14, el Análogo 5 sería el Análogo 15, el Análogo 6 sería el Análogo 16, el Análogo 7 sería el Análogo 17, el Análogo 8 sería el Análogo 18, el Análogo 9 sería el Análogo 19 y el Análogo 10 sería el Análogo 20. Nótese que también sería posible eliminar sólo una de las dos señales de glicosilación sobre la parte de las gonadotropinas monocatenarias derivadas de la subunidad \alpha simplemente cambiando las secuencias de los iniciadores 16 y 17 durante su síntesis y después del protocolo descrito en este documento. Cada uno de estos análogos exhibiría la misma unión del anticuerpo y del receptor que sus precursores. Habrían reducido la eficacia y como consecuencia, inhibirían la transducción de la señal. Los análogos 11, 12 y 13 reducirían la actividad de LH y estimularían la fertilidad cuando se dan en la temprana parte de la fase folicular del ciclo menstrual. Reducirían la actividad de hCG y prevendrían la fertilidad cuando se administran cerca del momento de la menstruación esperado.

Ejemplo 23 Preparación del Análogo 1a que carece de oligosacáridos unidos por asparagina. (Véanse las Figuras 17 y 18)

La eficacia de gonadotropinas es proporcional a su contenido de carbohidratos y aunque los Análogos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 tengan una eficacia inferior, es posible reducir su eficacia eliminando además todas las cadenas de oligosacáridos. Las cadenas de oligosacáridos unidas por asparagina pueden ser eliminadas del Análogo 11 por PCR SOEing (63) usando los iniciadores 1 y 18 en una reacción y los iniciadores 2 y 19 en una segunda reacción. El vector de expresión para el Análogo 11 sirve como plantilla en ambas reacciones. La secuencia del iniciador Nº. 18 es 5'-CGGGGTAGGTTCGGTGGGACCGACACCTCTTCCTCCCGACGGGG-3' y la secuencia del iniciador Nº. 19 es 3'-GTGGAGAAGGAGGGCTGCCCCGTGTGCATCACCGTCAACACCACCATC-5'. Después de 25 ciclos de temperaturas a 94ºC (30 s), 55ºC (60 s) y 72ºC (60 s), 1 \mul de cada reacción PCR se mezcla con el iniciador Nº. 5 y el iniciador Nº. 2 adicional, nuevo tampón, enzima y trifosfatos de desoxinucleótido. El producto de la reacción después de 25 ciclos adicionales es cortado con XhoI y BamHI y es sustituido por el ADN original encontrado entre los sitios de XhoI/BamHI del vector que codifica el Análogo 11. Esto se logra digiriendo el vector con XhoI y BamHI, desechando el fragmento pequeño y luego ligando el fragmento grande con el producto de la PCR digerido de XhoI/BamHI. Varios clones son sometidos a la secuenciación del ADN hasta que sea obtenido el que codifica el análogo descrito en la Figura 18 llamado Análogo 1a. Cuando esto se expresa en células COS-7, la proteína que se prepara será reconocida por los mismos anticuerpos y el antisuero que el Análogo 1. El análogo 1a también se une a receptores de lutropina, pero tiene menor eficacia en relación con hCG. Por lo tanto, será útil para reducir la función de LH o hCG. Cuando se administra en la fase folicular temprana del ciclo menstrual, el Análogo 1a reducirá la síntesis de andrógenos. Como consecuencia, la síntesis de estradiol disminuirá, los niveles de FSH se elevarán y la fertilidad será estimulada. El análogo 1a también será útil para inhibir la luteinización prematura del folículo. Cuando se administra en la fase luteínica en aproximadamente el tiempo de la menstruación esperado, el análogo bloqueará las acciones de hCG y servirá como un inductor de la menstruación y un inhibidor de la fertilidad. El análogo 1a también servirá como un buen compuesto de partida para diseñar vacunas que usan la estrategia de plantilla descrita antes.

Ejemplo 24 Preparación de otras gonadotropinas que carecen de oligosacáridos unidos por asparagina

Los vectores codificantes de los Análogos 2a, 5a, 6a, 7a y 8a se preparan fácilmente a partir del Análogo 1a y los Análogos 12, 15, 16, 17 y 18. El análogo 1a se digiere con KpnI y MstII y el fragmento pequeño se desecha. El fragmento grande se liga separadamente al pequeño fragmento preparado por la digestión KpnI-MstII de los vectores codificantes de los Análogos 12, 15, 16, 17 y 18. Los análogos 2a, 5a, 6a, 7a y 8a se unirán igual a los anticuerpos y receptores que los Análogos 2, 5, 6, 7 y 8, respectivamente. Sin embargo, se reducirán sus capacidades de proporcionar la transducción de señal. Por consiguiente, servirán como inhibidores. El análogo 2a será eficaz principalmente en el bloqueo de la unión de hormonas a receptores de LH. Dependiendo del tiempo que sea administrado, el Análogo 2a proporcionará fertilidad (es decir, cuando se da en el ciclo menstrual temprano) o inhibirá la fertilidad (es decir, cuando se da cerca del tiempo de implantación o de la menstruación esperada). En cuanto a esto, los Análogos 1a y 2a tendrán actividades similares. El análogo 5a será eficaz principalmente en el bloqueo de la unión de hormonas a los receptores de FSH. El análogo 5a será útil para suprimir la hiperestimulación ovárica. Los análogos 6a, 7a y 8a serán los inhibidores de unión para la LH y los receptores de FSH. Estos serán útiles para suprimir la hiperestimulación ovárica y para bloquear la luteinización prematura.

Los vectores codificantes de los Análogos 3a y 4a pueden prepararse por SOEing PCR (63) en la que los Análogos 13 y 14 sirven como plantillas. La estrategia para el diseño de los iniciadores es similar al descrito para la preparación de los iniciadores usados para modificar el vector de expresión para el Análogo 1a. Cuando los Análogos 3a y 4a son expresados en células COS-7, las proteínas que son preparadas serán reconocidas por los mismos anticuerpos y antisuero que los Análogos 3 y 4, respectivamente. El Análogo 3a será útil para inhibir la actividad de las hormonas que se unen a los receptores de LH. Como tal, esto estimulará la fertilidad cuando se da en la fase folicular temprana. El análogo 4a será útil para inhibir la actividad de FSH. El análogo 3a será útil como una molécula de partida para diseñar la vacuna que se usa para aumentar la fertilidad usando la estrategia de plantilla y los anticuerpos que sean capaces de neutralizar parcialmente la actividad de LH. El análogo 3a también será útil como una molécula de partida para diseñar la vacuna para prevenir la fertilidad usando la estrategia de plantilla y los anticuerpos que sean capaces de neutralizar la actividad de LH. El anticuerpo 4a también será útil como una molécula de partida para diseñar la vacuna anti-FSH descrita utilizando la estrategia de plantilla anterior.

Los vectores codificantes de los Análogos 9a y 10a pueden prepararse a partir del vector codificante del Análogo 4a. El vector codificante del Análogo 4a se digiere con la BaII y KpnI y el fragmento pequeño se desecha. Los fragmentos pequeños de BaII-KpnI de los vectores codificantes de los análogos 19 y 20 son ligados separadamente con el fragmento grande del Análogo 4a para producir vectores codificantes de los Análogos 9a y 10a. Cuando se producen en células COS-7, los Análogos 9a y 10a tendrán anticuerpos similares y receptores de FSH que unen específicamente como los Análogos 9 y 10. Los análogos 9a y 10a tendrán una eficacia inferior e inhibirán la actividad de FSH. Por lo tanto, serán útiles para reducir la hiperestimulación ovárica. También serán vectores de partida útiles para el diseño de vacunas anti-FSH usando la estrategia de plantilla.

Ejemplo 25 Procedimiento típico para introducir un sitio de glicosilación en una gonadotropina

Debido a la influencia positiva de restos de oligosacáridos sobre la estabilidad de hormonas en la circulación, es útil añadir a menudo cadenas de oligosacáridos suplementarias a las proteínas. La adición de oligosacáridos también puede ser usada para prevenir las interacciones del anticuerpo no deseadas o del receptor. Las superficies de la proteína que no interactúan con receptores son sitios útiles para añadir las cadenas de oligosacáridos que deben ser usadas para estimular la función hormonal. Esto puede tener un efecto valioso en la modulación de las actividades de hormonas glicoproteicas monocatenaria o de modular las actividades de las hormonas de glicoproteicas \alpha,\beta-heterodiméricas. Por ejemplo, la adición de una señal de glicosilación a la subunidad \beta de FSH en los restos 71-73 para causar la creación de un oligosacárido unido por asparagina en el resto 71 conducirá a una hormona que tiene una actividad más alta. A la inversa, la adición de un resto de glicosilación en esta región de la proteína después de que las otras glicosilaciones hayan sido eliminadas realzará su actividad inhibitoria. Los métodos para realizar la mutagénesis son estándar en la técnica y abarcan desde la síntesis total de las secuencias codificantes por ligamiento en bloque de oligonucleotidos sintéticos (54) a SOEing PCR (63). Ya se han dado varios ejemplos de mutagénesis por SOEing PCR.

Ejemplo 26 Uso de otras secuencias que las derivadas de subunidades humanas

Los análogos 1-20, los Análogos 1b-10b y, en particular, los Análogos 1A-10a servirán como compuestos de partida útiles para diseñar la vacuna dirigida de plantilla. Para el desarrollo de vacunas hormonales específicas para uso en seres humanos, es útil preparar análogos similares a los catalogados en la Tabla 1 con una subunidad \alpha no humana en lugar de la subunidad \alpha humana. Esto es porque la subunidad \alpha bovina da las proteínas más distintas a las hormonas humanas que los análogos catalogados en la Tabla 1. El enfoque para el diseño de hormonas glicoproteicas monocatenarias es similar al catalogado en los ejemplos 12-21 pero las secuencias codificantes de las subunidades a no humanas son sustituidas por las secuencias de la subunidad \alpha humana ilustradas. Asimismo, las señales de glicosilación pueden ser eliminadas cambiando los codones para asparagina o serina o treonina o insertando una prolina entre asparagina y serina o treonina.

Además, usando la estrategia de plantilla para diseñar inmunógenos es deseable a menudo comenzar con una molécula no humana que tiene poca, si alguna, de afinidad para las plantillas usadas en la selección positiva e introducir los restos que causarán la selección. Estos análogos pueden prepararse sustituyendo las secuencias de la subunidad \beta de FSH, LH, o TSH de fuentes no humanas en lugar de las secuencias FSH, LH y hCG humanas ilustradas en los ejemplos 12-25 y la Tabla 1.

TABLA 1 Estructuras de gonadotropinas monocatenarias

\vskip1.000000\baselineskip

Análogo: Composición

1: n-hCG\beta(1-145)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

2: n-hCG\beta(1-114)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

3: n-hLH\beta(1-114)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

4: n-hFSH\beta(1-111)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

5: n-hCG\beta(1-93)-hFSH\beta(88-111)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

6: n-hCG\beta(1-100)-hFSH\beta(95-111)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

7: n-hCG\beta(1-100)-hFSH\beta(95-108)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

8: n-hCG\beta(1-100)-hFSH\beta(95-103)-DDPR- Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

9: n-hFSH\beta(1-108)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

10: n-hFSH\beta(1-104)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

1a: n-hCG\beta(1-145)[N13X.N30X)-Enlazante-\alpha humano(1-92)(N52X,N78X]-c

2a: n-hCG\beta(1-114)(N13X,N30X]-Enlazante-\alpha humano(1-92)[N52X,N78X]-c

3a: n-hLH\beta(1-114)[N30X]-Enlazante-\alpha humano(1-92)[N52X,N78X)-c

4a: n-hFSH\beta(1-111)(N7X.N24X]-Enlazante-\alpha humano(1-92)[N52X,N78X]-c

5a: n-hCG\beta(1-93)[N13X,N30X]-hFSH\beta(88-111)-Enlazante-\alpha humano(1-92)[NS2X,N78X]-c

6a: -hCG\beta(1-100)(N13X,N30X]-hFSH\beta(95-111)-Enlazante-\alpha humano(1-92)(N52X,N78X)-c

7a: n-hCG\beta(1-100)(N13X,N30X]-hFSH \beta(95-L08)-Enlazante-\alpha humano(1-92)(N52X,N78X]-c

8a: n-hCG \beta(1-100)(N13X.N30X]-hFS140(95-103)-DDPR- Enlazante-\alpha humano(1-92)(NS2X,N78X]-c

9a: n-hFSH\beta(1-108)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-(N52X,N78X]-c

10a: n-hFSH\beta(1 -104)(N7X,N24X]-Enlazante-\alpha humano(1-92)-c

1b: n-hCG\beta(1-145)[N13X,N30X,P78X,V79T]-Enlazante-\alpha humano(1-92)(N52X,N78X]-c

2b: n-hCG \beta(1-114)[N13X.N30X.P78X.V79T1- Enlazante-\alpha humano(1-92)[N52X,N78X]-c

3b: n-hLH\beta(1-114)[N30X,P78X,V79T1- Enlazante-\alpha humano(1-92)(N52X,N78X]-c

4b: n-hFSH\beta(1-111)(N7X,N24X,D71N,L73T]-Enlazante-\alpha humano(1-92)(N52X,N78X]-c

5b: n-hCG\beta(1-93)(N13X,N3OX,P78X,V79T]-hFSH8(88-111)-Enlazante-\alpha humano(1-92)[N52X,N78X]-c

6b: n-hCG \beta(1-100)[N13X,N30X,P78X,V79T)-hFSH \beta(95-111)-Enlazante-\alpha humano(1-92)[N52X,N78X]-c

7b: n-hCG\beta(1-100)(N13X,N30X,P78X,V79T)-hFSH\beta(95-108)-Enlazante-\alpha humano([-92)[N52X,N78X]-c

TABLA 1 (continuación)

Análogo: Composición

8b: n-hCG\beta(1-100)[N13X,N3OX,P78X,V79T]-hFSH\beta(95-103)-DDPR- Enlazante-\alpha humano(I-92)[N52X,N78X]-c

9b: n-hFSH\beta(1-108)[N7X,N24X,D71N,L73T]-Enlazante-\alpha humano(1-92)-(NS2X,N78X]-c

10b: n-hFSH\beta(1-104)[N7X,N24X,D71N,L73T)-Enlazante-\alpha humano(1-92)-(N52X,N78X]-c

Definiciones de las letras y secuencias en la Tabla 1

"n" se refiere al extremo N de la proteína.

"-c" se refiere al extremo C de la proteína.

"hCG\beta (1-145)" se refiere a los restos 1-145 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hCG:

"hCG\beta (1-114)" se refiere a los restos 1-114 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hCG:

"HCG\beta (1-93)" se refiere a los restos 1-93 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hCG:

"hLH\beta (1-114)" se refiere a los restos 1-114 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hLH:

"hFSH\beta (1-111)" se refiere a los restos 1-111 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hFSH:

"hFSH\beta (1-108)" se refiere a los restos 1-108 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hFSH:

"hFSH\beta (1-104)" se refiere a los restos 1-104 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hFSH:

"hFSH\beta (88-111)" se refiere a los restos 88-111 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hFSH:

"hFSH\beta (95-111)" se refiere a los restos 95-111 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hFSH:

"hFSH\beta (95-108)" se refiere a los restos 95-108 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hFSH:

"hFSH\beta (95-103)" se refiere a los restos 95-103 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hFSH:

"N13X" se refiere a la sustitución de glutamina u otro aminoácido por la asparagina 13 del resto de la subunidad \beta de hCG y análogos

"N30X" se refiere a la sustitución de glutamina u otro aminoácido por la asparagina 30 del resto de la subunidad \beta de hLH o hCG y análogos

"N52X" se refiere a la sustitución de glutamina u otro aminoácido por la asparagina 52 del resto de la subunidad \alpha humana y análogos

"N78X" se refiere a la sustitución de glutamina u otro aminoácido por asparagina 78 del resto de la subunidad \alpha humana y análogos

"P78X" se refiere a la sustitución de cualquier aminoácido excepto prolina por prolina 78 en las subunidades \beta de hCG o hLH y análogos

"V79T" se refiere a la sustitución de treonina o serina por valina 79 en las subunidades \beta de hLH o hCG y análogos

"D71N" se refiere a la sustitución de asparagina para el ácido aspártico 71 en subunidades \beta de hFSH y análogos

"L73T" se refiere a la sustitución de treonina o serina por la leucina 73 en la subunidad \beta de hFSH y análogos

"\alpha humana (1-92)" se refiere a los restos 1-92 de la secuencia de la subunidad \alpha humana.

"Enlazante" se refiere a una secuencia que contiene repetición de aminoácidos de glicina y serina tales como GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS o cualquier otra secuencia de aminoácidos que permita a las secuencias de la subunidad \alpha y \beta de la gonadotropina monocatenaria formar un complejo en el que las partes de la subunidad \alpha y \beta se combinan con las partes de la subunidad \alpha y \beta de la misma u otra molécula.

"DDPR" se refiere a la secuencia de aminoácidos Asparagina-Asparagina-Prolina-Arginina.

\newpage

Apuntes para la Tabla 1

1. El orden de los componentes de izquierda a derecha en la tabla es el orden en la que los componentes ocurren en la proteína del extremo amino al extremo carboxi.

2. Debido a la alta conservación de la secuencia en todas las gonadotropinas de vertebrados que pueden ser vistas por la alineación de sus restos de cisteína, las gonadotropinas monocatenarias pueden prepararse sustituyendo cualquier resto homólogo por las partes correspondientes de las subunidades \beta de hCG, hLH y hFSH.

3. La secuencia de las otras subunidades \alpha de gonadotropina en vertebrados puede ser sustituida por a humana (1-92). Esto incluye, pero no se limita a los restos 1-96 de la subunidad \alpha bovina.

4. Como se muestra, el orden de los componentes tiene las secuencias derivadas del extremo amino de la subunidad \beta de las secuencias derivadas de la subunidad \alpha. El orden de los componentes en la tabla puede ser invertido tal que las secuencias de la subunidad \alpha sean amino-terminal de las secuencias de la subunidad \beta.

5. Las secuencias de aminoácidos son mostradas en el código de letras estándar, excepto cuando se especifica.

6. Las secuencias codificantes para todos estos análogos pueden hacerse por los métodos de ADN recombinante estándar que son conocidos en la técnica. Un procedimiento para preparar estos es proporcionado por Campbell et al. (54). Pueden ser expresados en células eucariotas por métodos conocidos en la técnica usando los vectores que han sido diseñados para la expresión eucariota y que están disponibles de InVitrogen, San Diego, CA. Los que no contienen cadenas de oligosacárido también pueden prepararse en E. coli por métodos conocidos en la técnica usando vectores tales como los vectores pET que pueden ser obtenidos de Novagen.

7. Los sitios de glicosilación en asparaginas 13 y/o 30 de la subunidad \beta de hCG pueden ser destruidos por la sustitución de asparagina como se ilustra y/o por la sustitución de los restos 14 y/o 31 con una prolina y/o por la sustitución de los restos 15 y/o 32 con cualquier otro aminoácido que serina o treonina.

8. El sitio de glicosilación en la asparagina 30 de la subunidad \beta de hLH puede ser destruido por la sustitución de asparagina como se ilustra y/o por la sustitución del resto 31 con una prolina y/o por la sustitución del resto 32 con cualquier otro aminoácido que serina o treonina.

9. Los sitios de glicosilación en las asparaginas 52 y/o 78 de la subunidad \alpha humana pueden ser destruidos por la sustitución de asparagina como se ilustra y/o por la sustitución de los restos 53 y/o 79 con una prolina y/o por la sustitución de los restos 54 y/o 80 con cualquier otro aminoácido que serina o treonina.

10. Los sitios de glicosilación en las asparaginas 56 y/o 82 de la subunidad \alpha no humana pueden ser destruidos por la sustitución de asparagina con cualquier otro aminoácido y/o por la sustitución de los restos 57 y/o 83 con una prolina y/o por la sustitución de los restos 58 y/o 84 con cualquier otro aminoácido que serina o treonina.

TABLA 2 Propiedades y usos de los análogos ilustrados en la Tabla 1

Análogo \hskip0.3cm Actividad: Uso

1 \hskip1.5cm LH: Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad masculina

2 \hskip1.5cm LH: Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad masculina

3 \hskip1.5cm LH: Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad masculina

4 \hskip1.5cm FSH: Induce el desarrollo del folículo; Aumenta la fertilidad masculina

5 \hskip1.5cm FSH: Induce el desarrollo del folículo; Aumenta la fertilidad masculina

6 \hskip1.5cm FSH y LH: Induce el desarrollo del folículo; Aumenta la fertilidad masculina

7 \hskip1.5cm FSH y LH: Induce el desarrollo del folículo; Aumenta la fertilidad masculina

8 \hskip1.5cm FSH y LH: Induce el desarrollo del folículo; Aumenta la fertilidad masculina

9 \hskip1.5cm FSH: Induce el desarrollo del folículo; Aumenta la fertilidad masculina

10 \hskip1.3cm FSH: Induce el desarrollo del folículo: Aumenta la fertilidad masculina

\global\parskip0.950000\baselineskip

TABLA 2 (continuación)

Análogo \hskip0.3cm Actividad: Uso

1a \hskip1.3cm Anti-LH: \text{*}Facilita la ovulación; Termina el embarazo: Reduce la secreción de andrógenos

2a \hskip1.3cm Anti-LH: \text{*}Facilita la ovulación; Termina el embarazo; Reduce la secreción de andrógenos

3a \hskip1.3cm Anti-LH: \text{*}Facilita la ovulación: Termina el embarazo; Reduce la secreción de andrógeno

4a \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

5a \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

6a \hskip1.3cm Anti-FSH {}\hskip0.4cm {}\hskip1.8cm y Anti-LH: Trata la hiperestimulación ovárica: Reduce la espermatogénesis

7a \hskip1.3cm Anti-FSH {}\hskip0.4cm {}\hskip1.8cm y Anti-LH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

8a \hskip1.3cm Anti-FSH {}\hskip0.4cm {}\hskip1.8cm y Anti-LH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

9a \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

10a \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

1b \hskip1.3cm Anti-LH: \text{*}Facilita la ovulación; Termina el embarazo; Reduce la secreción de andrógenos

2b \hskip1.3cm Anti-LH: \text{*}Facilita la ovulación; Termina el embarazo; Reduce la secreción de andrógenos

3b \hskip1.3cm Anti-LH: \text{*}Facilita la ovulación; Termina el embarazo; Reduce la secreción de andrógenos

4b \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

5b \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

6b \hskip1.3cm Anti-FSH {}\hskip0.4cm {}\hskip1.8cm y Anti-LH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

7b \hskip1.3cm Anti-FSH {}\hskip0.4cm {}\hskip1.8cm y Anti-LH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

8b \hskip1.3cm Anti-FSH {}\hskip0.4cm {}\hskip1.8cm y Anti-LH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

9b \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

10b \hskip1.3cm Anti-FSH: Trata la hiperestimulación ovárica; Reduce la espermatogénesis

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados a mamíferos, por ejemplo, animales o seres humanos, en cantidades eficaces para proporcionar el efecto terapéutico deseado. Dado que la actividad de los compuestos y el grado del efecto terapéutico deseado varía, el nivel de dosificación del compuesto empleado también variará. La dosificación real administrada también será determinada por tales factores generalmente reconocidos como el peso corporal del paciente y la hipersensibilidad del individuo de un paciente particular.

Por todas partes en esta aplicación se ha hecho referencia a diversas publicaciones:

1. Pierce JG, Parsons TF (1981). "Glycoprotein hormones: structure and function". Ann Rev Biochem 50:465-495.

2. Yen SSC, Jaffe RB (1986) "Reproductive Endocrinology: Physiology, Pathophysiology and Clinical Management". W.B. Saunders, Philadelphia.

3. Moyle WR (1980) "Biochemistry of gonadotropin receptors". En: Oxford Reviews of Reproductive Biology Volumen 2, editado por Finn CA. Oxford University Press, New York, págs. 123-204.

4. Hsueh AJW, Adashi EY, Jones PBC, Welsh TH, Jr. (1984). "Hormonal regulation of the differentiation of cultured ovarian granulosa cells". Endocr Rev 5:76-127.

\global\parskip0.990000\baselineskip

5. Hodgen GD, Itskovitz J (1988). "Recognition and maintenance of pregnancy". En: The physiology of reproduction, editado por Knobil E,. Neill FD. Raven Press, New York, págs. 995-2021.

6. DiZerega GS, Hodgen GD (1981) "Folliculogenesis in the primate ovarian cycle". Endocr Rev 2:27-49.

7. Vaishnav MY, Moudgal NR (1991). "Effect of specific FSH or LF deprivation on testicular function of the adult rat". Indian J Biochem Biophys 28:513-520.

8. Aravindan GR, Ravindranath N, Moudgal NR (1991). "Use of DNA Flowcytometry in assessing gonadotropin regulation of spermatogenesis in monkeys". En: Perspectives in Primate Reproductive Biology, editado por Moudgal NR, Yoshinaga K, Rao AJ, Adiga PR. Wiley Eastern Limited, New Delhi, págs. 189-199.

9. Steinberger E (1971). "Hormonal control of mammalian spermatogenesis". Physiol Rev 51:1-22.

10. Moudgal NR, Macdonald GJ, Greep RO (1972). "Role of endogenous primate LH in maintaining corpus luteum function of the monkey". J Clin Endocrinol Metab 35:113-116.

11. Moudgal NR (1976). "Passive immunization with antigonadotropin antisera as a method of menstrual regulation in the primate". En: Immunization with hormones in reproduction research, editado por Nieschlag E. North-Holland, Amsterdam, págs. 233.

12. Moudgal NR, Sairam MR, Mahoney J (1985). "On the immunogenicity of the beta subunit of ovine luteinizing hormone (oLH beta) and equine chorionic gonadotropin (eCG) in the chimpanzee (Pan troglodytes): effect of antiserum on monkey cycle and early pregnancy". Am J Reprod Immunol Microbiol 8:120-124.

13. Moudgal NR, Macdonald GJ, Greep RO (1971). "Effects of HCG antiserum on ovulation and corpus luteum formation in the monkey (Macaca fascicularis)". J Clin Endocrinol Metab 32:579-581.

14. Stevens VC (1990). "Birth control vaccines and immunological approaches to the therapy of noninfectious diseases". Inf Dis Clin North Am 4:343-354.

15. Dunbar BS, Lo C, Powell J, Stevens VC (1989). "Use of a synthetic peptide adjuvant for the immunization of baboons with denatured and deglycosylated pig zona pellucida glycoproteins". Fertil Steril 52:311-318.

16. Stevens VC (1986). "Use of synthetic peptides as immunogens for developing a vaccine against human chorionic gonadotropin". Ciba Found Symp 119:200-225.

17. Moyle WR, Pressey A, Dean Emig D, Anderson DM, Demeter M, Lustbader J, Ehrlich P (1987). "Detection of conformational changes in human chorionic gonadotropin upon binding to rat gonadal receptors". J Biol Chem 262:16920-16926.

18. Singh O, Rao LV, Gaur A, Sharma NC, Alam A, Talwar GP (1989). "Antibody response and characteristics of antibodies in women immunized with three contraceptive vaccines inducing antibodies against human chorionic gonadotropin". Fertil Steril 52:739-744.

19. Kumar S, Talwar GP, Biswas DK (1992). "Necrosis and inhibition of growth of human lung tumor by anti-a-human chorionic gonadotropin antibody". JNCI 84:42-47.

20. Gaur A, Arunan K, Singh O, Talwar GP (1990). "Bypass by an alternate ``carrier'' of acquired unresponsiveness to hCG upon repeated immunization with tetanus-conjugated vaccine". Int Immunol 2:151-155.

21. Hojo H, Ryan RJ (1985). "Monoclonal antibodies against human follicle-stimulating hormone". Endocrinology 117:2428-2434.

22. Moyle WR, Ehrlich PH, Canfield RE (1982). "Use of monoclonal antibodies to hCG subunits to examine the orientation of hCG in the hormone-receptor complex". Proc Natl Acad Sci USA 79:2245-2249.

23. Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO, Vutyavanich T (1987). "Structure-function relationships of gonadotropins". Recent Prog Horm Res 43:383-429.

24. Keutmann HT, Charlesworth MC, Mason KA, Ostrea T, Johnson L, Ryan RJ (1987). "A receptor-binding region in human choriogonadotropin/lutropin beta subunit". Proc Natl Acad Sci USA 84:2038-2042.

25. Moyle WR, Dean Emig DM, Lustbader N, Keutmann HT (1988). "Identification of an epitope on the 8-subunit of human chorionic gonadotropin (hCG) near the receptor binding site". ICSU Short Rep 8:116.

26. Moyle WR, Matzuk MM, Campbell RK, Cogliani E, Dean Emig DM, Krichevsky A, Barnett RW,
Boime I (1990). "Localization of residues that confer antibody binding specificity using human chorionic gonadotropin/luteinizing hormone beta subunit chimeras and mutants". J Biol Chem 265:8511-8518.

27. Krichevsky A, Birken S, O'Connor J, Bikel K, Schlatterer J, Yi C, Agosto G, Canfield R (1991). "Development and characterization of a new, highly specific antibody to the human chorionic gonadotropin-beta fragment". Endocrinology 128:1255-1264.

28. Ehrlich PH, Moustafa ZA, Krichevsky A, Birken S, Armstrong EG, Canfield RE (1985). "Characterization and relative orientation of epitopes for monoclonal antibodies and antisera to human chorionic gonadotropin". Am J Reprod Immunol Microbiol 8:48-54.

29. Matteri RL, Roser JF, Baldwin DM, Lipovetsky V, Papkoff H (1987). "Characterization of a monoclonal antibody which detects luteinizing hormones from diverse mammalian species". Domest Anim Endocrinol 4:157-165.

30. Ehrlich PH, Moyle WR, Canfield RE (1983). "Monoclonal antibodies to gonadotropin subunits". Methods Enzymol 50:638-655.

31. Moyle WR, Anderson DM, Macdonald GJ, Armstrong EG (1988). "Bioimmunoassay (BIA): A sandwich immunoassay scheme employing monoclonal antibodies and hormone receptors to quantify analytes". J Receptor Res 8:419-436.

32. Fiedler R, Verbitskii MS (1990). "Monoclonal antibodies to human chorionic gonadotropin and certain human and animal hormones of the adenohypophysis". Biomedical Science 1:251-255.

33. Winter G, Milstein C (1991) "Man-made antibodies". Nature 349:293-299.

34. Bass S, Greene R, Wells JA (1990). "Hormone phage: an enrichment method for variant proteins with altered binding properties". Proteins 8:309-314.

35. Barrett RW, Cwirla SE, Ackerman MS, Olson AM, Peters EA, Dower WJ (1992). "Selective enrichment and characterization of high affinity ligands from collections of random peptides on filamentous phage". Analytical Biochemistry 204:357-364.

36. Huse WD, Sastry L, Iverson SA, Kang AS, Alting-Mees M, Burton OR, Benkovic SJ, Lerner RA (1992). "Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda". 1989 Biotechnology 24:517-523.

37. Moyle WR, Bahl OP, Marz L (1975). "Role of the carbohydrate of human choriogonadotropin in the mechanism of hormone action". J Biol Chem 250:9163-9169.

38. Lesk AM, Tramontano A (1992). "Antibody structure and structural predictions useful in guiding antibody engineering". En: Antibody engineering: a practical guide, editado por Borrebaeck CAK. W.H.Freeman and Co., New York, págs. 1-38.

39. Cheetham JC (1992). "Engineering antibody affinity". En: Antibody engineering: a practical guide, editado por Borrebaeck CAK. W.H.Freeman and Co., New York, págs. 39-68.

40. Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT (1984). "Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant regions". Proc Natl Acad Sci USA 81:6851-6855.

41. Newman R, Alberts J, Anderson D, Carner K, Heard C, Norton F, Raab R, Reff M, Shuey S, Hanna N (1992) "Prioritization of recombinant antibodies for immunotherapy of human diseases: a macaque/human chimeric antibody against human CD4". Biotechnology 10:1455-1460.

42. Danielsson L, Borrebaeck CAK (1992). "Amplification of rearranged Ig variable region DNA from single cells". En: Antibody engineering: a practical guide, editado por Borrebaeck CAK. W.H.Freeman and Co., New York, pág. 89-102.

43. Cruz RI, Anderson DM, Armstrong EG, Moyle WR (1987). "Nonreceptor binding of human chorionic gonadotropin (hCG): detection of hCG o a related molecule bound to endometrial tissue during pregnancy using labeleled monoclonal antibodies that bind to exposed epitopes on the hormone". J CIit Endocrinol Metab 64:
433-440.

44. Moyle WR, Anderson DM, Macdonald GI, Armstrong EC (1988). "Bioimmunoassay (BIA): a sandwich immunoassay scheme employing monoclonal antibodies and hormone receptors to quantify analytes". J Recept Res 8:419-436.

45. McFarland KC, Sprengel R, Phillips HS, Kohler M, Rosemblil N, Nikolics K, Segaloff DL, Seeburg PH (1989). "Lutropin-choriogonadotropin receptor: an unusual member of the G protein-coupled receptor family". Science 245:494-499.

46. Jia X, Oikawa M, Bo M, Tanaka T, Ny T, Boime I, Hsueh AJW (1991). "Expression of human luteinizing hormone (LH) receptor: Interaction with LH and chorionic gonadotropin from human but not equine, rat, and ovine species". Mol Endocrinol 5:759-768.

47. Loosfelt H, Misrahi M, Atger M, Salesse R, Vu Hai Luu Thi MT, Jolivet A, Guiochon Mantel A, Sar S, Jallal B, Gamier J, et al. (1989). "Cloning and sequencing of porcine LH-hCG receptor cDNA: variants lacking transmembrane domain". Science 245:525-528.

48. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989). "Molecular cloning: a laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

49. Kriegler M (1990). "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual". Stockton Press, New York.

50. Cosowsky LN, Campbell RK, Papkoff HR, Moyle WR, Macdonald GJ (1991). "Use of hormone chimeras to identify the binding site for a monoclonal antibody which binds to a highly conserved site on mammalian LH and LH receptor complexes". Biol Reprod 44, Suplemento Nº. 1:70.

51. Stevens VC (1990). "Birch control vaccines and immunological approaches to the therapy of noninfectious diseases". Infect Dis Clin North Am 4:343-354.

52. Jones WR, Bradley J, Judd SJ, Denholm EH, Ing RM, Muelle UW, Powell J, Griffin PD, Stevens VC (1988). "Phase I clinical trial of a Wort (Health Organisation birth control vaccine". Lancet 1:1295-1298.

53. Bidart JM, Bellet DH, Alberici GF, Van Besien F, Bohuon E (1987). "The immune response to a synthetic peptide analogous to the 109-145 beta hCG carboxyl-terminus is directed against two major and two minor regions". Mol Immunol 24:339-345.

54. Campbell RK, Erfle H, Barnett RW, Moyle WR (1992). "Assembly and expression of a synthetic gene encoding the bovine glycoprotein hormone a-subunit". Mol Cell Endocrinol 83:195-200.

55. Lowman HB, Bass SH, Simpson N, Wells JA (1991). "Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display". Biochemistry 30:10832-10838.

56. Hoogenboom HR, Winter G (1992). "By-passing immunisation. Human antibodies froth synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro". J Mol Biol 227:381-388.

57. Fersht A, Winter G (1992). "Protein engineering". Trends Biochem Sci 17:292-295.

58. Scott JK, Smith GP (1990). "Searching for peptide ligands with an epitope library". Science 249:386-390.

59. Skerra A, Dreher ML, Winter G (1991). "Filter screening of antibody Fab fragments secreted from individual bacterial colonies: specific detection of antigen binding with a two-membrane system". Anal Biochem 196:151-155.

60. Cohen, C. and Parry, D.A.D. (1990). "\alpha-Helical coiled coals and bundles: how to design an \alpha-helical protein". Proteins: structure, function, and genetics 7: 1-15.

61. Hu, J.C., Newell, N.E., Tidor, B., and Sauer, R.T. (1993). "Probing the roles of residues at the e and g positions of the GCN4 leucine zipper by combinatorial mutagenesis". Protein Science 2: 1072-1084.

62. King, R.I.B. and Whitehead, M.I. (1986). Assessment of the potency or orally administered progestins in women''. Fertility and Sterility 46: 1062-1066.

63. Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R:M., Pullen, J.K. and Pease, L.R. (1989). "Site directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction". Gene 77: 51-59.

64. Campbell RK, Dean Emig DM, Moyle WR (1991). "Conversion of human choriogonadotropin into a follitropin by protein engineering". Proc Natl Acad Sci USA 88:160-764.

65. Skaf R, Macdonald GJ, Sheldon RM, Moyle WR (1985). "Use of antisera to follicle-stimulating hormone (FSH) to detect non-FSH factors in human serum which modulate rat granulosa cell steroidogenesis". Endocrinology 117:106-113

66. El documento WO 88/09344

67. El documento WO 94/12520

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: SENSI-TEST

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para alterar la fertilidad

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 67

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Richard R. Muccino

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 758 Avenida Springfield

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Summit

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 07901

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Ordenador personal de IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Patentln release *1.0, Versión Nº. 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/199.382

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 18 de febrero de 1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE Muccino, Richard R.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32.538

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: MOY1-001

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (908) 273-4988

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (908) 273-4679

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAATCGA CGGAATCAGA CTCGAGCCAA GGATGGAGAT GTTCCAGGGG CTGCT

\hfill

55

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGCCTGT GGGGCTAGGA GGGGGTTCCT AGGCCATCGC CTAGACCATC G

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCGGTA GCGGATCTGG TAGCGCTCCT GATGTGCAGG ATTGCCCA

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTCATGAA CAATAATAGT GTTTAGAATT CCATGGCCTA GGTAGAGTTC GATTAGGCCT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAATCGA CGGAATCAGA CTCGAGCCAA GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTCCATGGC CTAGGTAGAG TTCGATTAGG CCT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTGGGGAA CTGGACACTA CTGGGCGCCC CTAGGCCATC G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 56 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAATCGA CGGAATCAGA CTCGAGCCAA GGAATGGAGA TGCTCCAGGG GCTGCT

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGGGAACT GGACACTGGT GGGGGTTCCT AGGCCATCGC CTAGACCATC G

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAATCGA CGGAATCAGA CTCGAGCCAA GGATGAAGAC ACTCCAGTTT TTCTTCC

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGAGGAAA CCACTTTACT TTCTTCCTAG GCCATCGCCT AGACCA

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:12:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:13:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:14:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:15:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEO ID NO:16:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:17:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGGGTAGGT TCGGTGGGAC CGACACCTCT TCCTCCCGAC GGGG

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGAGAAGG AGGGCTGCCC CGTGTGCATC ACCGTCAACA CCACCATC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly}

\sac{Gly Thr Trp Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Glu Met Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly}

\sac{Gly Ala Trp Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile}

\sac{Cys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Arg Gly Val Asp Pro Val Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 145 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:25:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:26:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 93 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:27:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:28:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:29:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:30:

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº.:31:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr}

\sac{Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys}

\sac{Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:36:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Gly Ser Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID Nº.:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº.:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asp Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 836 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 828

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 42:

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 265 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 743 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 735

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 44:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 234 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 45:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 744 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD;

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:34.. 736

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 46:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 234 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido amino

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID el Nº. 47:

24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº.: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 728 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD;

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:34.. 720

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

25

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 229 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 49:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 752 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 744

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 50:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 237 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 51:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 752 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI - SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 744

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 52:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 237 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 53:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 743 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 735

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 54:

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 234 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 55:

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 743 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 735

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 56:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 234 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 57:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 719 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 711

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 58:

42

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 226 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 59:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 707 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 699

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 60:

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 222 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 61:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 312 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:1.. 304

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 62:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 101 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 63:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 575 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 575

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 64:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 181 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 65:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 836 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI - SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): PROPIEDAD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:33.. 828

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 66:

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. Nº. 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 265 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº. 67:

53

Claims

1. Una molécula de ADN o ARN que codifica una proteína monocatenaria que es un agonista o antagonista de una hormona de vertebrados seleccionada del grupo que consiste en hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH) y coriogonadotropina (CG), proteína monocatenaria que tiene una secuencia de aminoácidos de la fórmula

\beta-(enlazante)-\alpha

o

\alpha-(enlazante)-\beta

en la que

\beta es la subunidad \beta de LH, FSH o CG o una variante suya;

\alpha representa la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha común a LH, FSH y CG o una variante suya.

2. Un vector de expresión para la producción de una proteína monocatenaria que es un agonista o antagonista de una hormona de vertebrados seleccionada del grupo que consiste en hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH) y coriogonadotropina (CG), proteína monocatenaria que tiene una secuencia de aminoácidos de la fórmula

\beta-(enlazante)-\alpha

o

\alpha-(enlazante)-\beta

en la que

\beta es la subunidad \beta de LH, FSH o CG o una variante suya;

\alpha representa la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha común a LH, FSH y CG o una variante suya

vector de expresión que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína monocatenaria unida operativamente para controlar las secuencias capaces de efectuar la expresión de dicha primera secuencia de nucleótidos.

3. Células huésped recombinantes modificadas para contener el vector de expresión de la reivindicación 2.

4. Un método para producir una proteína monocatenaria que es un agonista o antagonista de una hormona de vertebrados seleccionada del grupo que consiste en LH, FSH y CG, método que comprende cultivar las células de la reivindicación 3 en las condiciones en las que dicha proteína es producida.

5. Una proteína monocatenaria que es un agonista o antagonista de una hormona de vertebrados seleccionada del grupo que consiste en hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH) y coriogonadotropina (CG), proteína monocatenaria que tiene una secuencia de aminoácidos de la fórmula

\beta-(enlazante)-\alpha

o

\alpha-(enlazante)-\beta

en la que

\beta es la subunidad \beta de LH, FSH o CG o una variante suya;

6. Una molécula de ADN o ARN de la reivindicación 1, en la que dicha proteína monocatenaria codificada tiene una fórmula como la expuesta en la Tabla 1 o en la que \beta es la subunidad \beta de coriogonadotropina y \alpha es una subunidad \alpha de vertebrados.

7. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que dicha proteína monocatenaria codificada tiene una fórmula como la expuesta en la Tabla 1 o en el que \beta es la subunidad \beta de coriogonadotropina y \alpha es una subunidad \alpha de vertebrados.

8. Las células huésped recombinantes de la reivindicación 3, en las que dicha proteína monocatenaria codificada tiene una fórmula como la expuesta en la Tabla 1 o en las que \beta es la subunidad \beta de coriogonadotropina y \alpha es una subunidad \alpha de vertebrados.

9. El método de la reivindicación 4, en el que dicha proteína monocatenaria tiene una fórmula como la expuesta en la Tabla 1 o en el que \beta es la subunidad \beta de coriogonadotropina y \alpha es una subunidad \alpha de vertebrados.

10. La proteína de la reivindicación 5, en la que la proteína monocatenaria tiene una fórmula como la expuesta en la Tabla 1 o en la que \beta es la subunidad \beta de coriogonadotropina y \alpha es una subunidad \alpha de vertebrados.

11. El método de la reivindicación 4 que comprende además recuperar la proteína del cultivo.