CN1157408C - 以糖蛋白激素四成员家族的单链形式存在的糖蛋白激素活性的促效剂或拮抗剂 - Google Patents
以糖蛋白激素四成员家族的单链形式存在的糖蛋白激素活性的促效剂或拮抗剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了单链形式的糖蛋白激素四成员家族，其中至少部分成员已在绝大多数脊椎动物中发现。一个单链形式例子是将野生型异源二聚体的α和β亚基或其变异形式共价相连，其中可任选地通过接头成分。在接头成分中还可含有导向激素受体的药物。某些单链形式是糖蛋白激素活性的促效剂，某些是拮抗剂。另一种本发明单链形式化合物例子含有糖蛋白激素的两个β亚基，其中β亚基可相同或不同。“双β”形式是糖蛋白激素活性的拮抗剂。
Description
本发明根据国立卫生研究院的NIH合同No.No1-HD-9-2922，在政府资助下完成。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域以及一般以异源二聚体形式存在的蛋白质激素。更具体地，本发明涉及绒毛膜促性腺激素(CG)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的单链形式。
背景技术
在人中，四种重要的糖蛋白激素异源二聚体(LH、FSH、TSH和CG)具有相同的α亚基和不同的β亚基。这些激素中的三种几乎存在于所有其它的脊椎动物中；目前仅在灵长类以及马胎盘和尿中发现CG。
PCT申请WO90/09800(1990年9月7日出版，在此引用作为参考)描述了大量这些激素的修饰形式。一种重要的修饰是用人绒毛膜促性腺激素或其变异体的羧基端肽(carboxy terminal peptide，CTP)对β亚基进行C端延伸。也描述了这些激素的其他突变蛋白。CTP的相关位置是从人绒毛膜促性腺激素β亚基的位置112-118中任一位置至位置145。该PCT申请描述，通过保守氨基酸置换而获得的CTP延伸变异体，没有破坏CTP的改变清除特性的能力。此外，美国专利申请No.08/049,869(1993年4月20日申请，在此引用作为参考)描述，通过在除C末端之外的位置延伸或插入CTP而修饰这些激素，而且CTP片段比从位置112-118延伸至145的序列更短。
FSH的CTP-延伸型β亚基还在申请人的两篇文章中有描述：LaPolt，P.S.et al.；Endocrinoloy(1992)131：2514-2520和Fares，F.A.et al.；Proc Natl Acad Sci USA(1992)89：4304-4308。这两篇文章在此引用作为参考。
人绒毛膜促性腺激素异源二聚体形式的晶体结构已经发表于几乎同时出版的两篇文章中。一篇是Lapthorn，A.J.et al Nature(1994)369：455-461，另一篇是Wu，H.et al.Structure(1994)2：545-558。这些文章的结果总结于Patel，D.J.Nature(1994)369：438-439中。
目前已经知道至少有一个成功制备异源二聚体单链形式的例子。从夜乐甜蛋白莓中分离出处于异源二聚体形式的天然增甜剂蛋白-应乐果甜蛋白(monellin)。对该异源二聚体的晶体结构的研究与假设是一致的：B链C末端可以与A链N末端通过接头(linker)而连接，并保留异源二聚体形式的空间特性。这种连接是有利的，因为当作为增甜剂蛋白进行使用时，它使分子在高温下处于稳定的形式。这是通过制备单链形式而成功地达到的，从而阻止了热变性，参见美国专利5,264,558。
PCT申请WO91/16922(1991年11月14日出版)描述了异源二聚体糖蛋白激素的多种嵌合的及其他修饰形式。一般而言，该文献针对涉及各种α或β链的α亚基或β亚基的嵌合物。简单地列在该申请中而没有给出其他说明的一个构建物将几乎所有人绒毛膜促性腺激素的β链与α亚基前体蛋白(即含有该亚基的分泌信号序列)融合在一起。该构建物不在本发明范围之内，因为位于β和α链之间的信号序列不能作为本申请所定义和描述的接头成分(linkermoiety)。
目前已发现，当处于单链形式时(其中包括含有各种上述CTP延伸和插入的单链形式)，一般的异源二聚体糖蛋白激素保留其特性。
发明简述
本发明提供了糖蛋白激素的单链形式，其中至少部分激素存在于绝大多数脊椎动物中。本发明的单链形式可以是糖基化、部分糖基化或非糖基化的，而且存在于天然糖蛋白激素或其变异体中的α和β链(或α和α，或β和β)可以任选地通过接头成分而连接。特别优选的接头成分包括羧基端肽(CTP)单元，它或者是完整的单元或者是其一部分。产生的单链激素或者保留未修饰的异源二聚体形式活性，或者是该活性的拮抗剂。
因此，一方面，本发明涉及一种糖基化或非糖基化蛋白质，它含有糖蛋白激素共有的α亚基氨基酸序列，该序列共价及任选地通过接头成分连于一种这类激素的β亚基氨基酸序列，或该氨基酸序列的变异体(其中该变异体在本文中定义)。
另一方面，本发明涉及一种糖基化或非糖基化蛋白质，它含有糖蛋白激素四成员家族中某一成员的β亚基氨基酸序列，该序列共价及任选地通过接头成分连于一种这类激素的β亚基氨基酸序列，或该氨基酸序列的变异体(其中该变异体在本文中定义)。
另一方面，本发明涉及一种糖基化或非糖基化蛋白质，它含有糖蛋白激素四成员家族的α亚基氨基酸序列，该序列共价及任选地通过接头成分连于另一α亚基氨基酸序列，或该氨基酸序列的变异体(其中该变异体在本文中定义)。
另一方面，本发明涉及糖基化或非糖基化的生物学上重要的二聚体的单链形式，通过激素四成员家族的单链形式，可以预期它们是有效的。因此，本发明还涉及白细胞介素3和12(IL-3和IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和抑制素的单链形式。还包括杂合的白细胞介素，例如IL-3的一个亚基和IL-12的其他亚基的单链形式。
另一方面，本发明涉及产生本发明的单链蛋白的重组材料和方法，涉及含有单链蛋白的药物组合物，涉及对单链蛋白特异的抗体，以及涉及其用途。
附图简述
图1是在SαlI位点结合的DNA片段从使CGβ的第三外显子和编码α亚基的第二外显子融合的构建图。
图2是人CGβ的氨基酸序列和位置112-145的编号。
图3是用各种FSH类似物对FSH受体进行竞争结合测定的结果。
图4是FSH受体对各种FSH类似物的信号转导测定的结果。
发明的实施方式
在人体中有四种“糖蛋白”激素构成一个包括人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黄体生成素(LH)和促甲状腺激素(TSH)在内的家族。如此处所用，“糖蛋白激素”指该家族的成员，无论是在人体还是在其他脊椎动物中发现的。所有这些激素都是由α亚基和β亚基构成的异源二聚体，其中对于某一物种而言在组别中的α亚基氨基酸序列是相同的，而β亚基因家族成员的不同而不同。因此，一般情况下这些糖蛋白激素是由相互结合但又不共价相连的α和β亚基构成的异源二聚体。大多数脊椎动物产生FSH、TSH和LH；绒毛膜促性腺激素只在包括人在内的灵长类和马中发现。一种马CG的具体形式已经被命名为受孕母马血清糖蛋白(PMSG)。
因此，该激素“四成员家族”是异源二聚体构成，其中各自的α和β亚基由不同的基因编码而且由宿主分别合成。然后宿主将分别合成的亚基装配成非共价相连的异源二聚体复合物。按这种方式，该激素四成员家族的异源二聚体与那些由单一基因合成(在这种情况下有间插的“前”序列)、并且亚基通过二硫键而共价连接的异源二聚体如胰岛素不同。该激素四成员家族也不同于免疫球蛋白，后者是从不同位点装配而得但通过二硫键共价连接。另一方面，尽管应乐果甜蛋白是植物蛋白质，但是它通过A和B链之间的非共价作用结合在一起。目前还不知道这两条链是否由不同基因编码。
因此，对于由相同或不同亚基构成的二聚体的生物学活性化合物，众多因素影响其行为的确定。亚基可以是共价或非共价连接；它可以由相同或不同基因合成；在其前体形式中，它们可以含有或不含有将二聚体的两个单元连接在一起的“前”序列。根据对此处糖蛋白激素四成员家族的单链形式研究而获得的结果，很明显白细胞介素12、白细胞介素3(IL-12和IL-3)、肿瘤坏死因子(TNF)和转化生长因子(TGF)的生物学活性二聚体的单链形式也具有生物学活性。
异源二聚体或同源二聚体的单链形式与其二聚体形式相比具有许多优点。首先，一般它们更稳定。人们尤其注意到LH的不稳定性和半衰期短。其次，减少了有关重组生产的问题，因为只有一个单一基因需要转录、翻译和加工。这对于在细菌中的表达尤为重要。第三，当然它们提供了另一种形式从而可以精细地调控活性水平和其在体内的半衰期。最后，对于鉴定具有二聚体活性的截短形式，单链形式是优异的材料。亚基之间的键允许蛋白质被工程化而不破坏蛋白质的总体折叠。
四成员家族的成员特性
hCG的β亚基基本上比其他的β亚基大，因为它在C末端含有约34个额外氨基酸，此处被称为羧基端部分(CTP)。当在O-连接位点糖基化时，人们认为是CTP使hCG比其他促性腺激素具有相对更长的血清半衰期(Matzuk，M.et al.，Endocrinol(1989)126：376)。在天然激素中，该CTP延伸含有4个粘蛋白状O-连接的寡糖。
在本发明的一个例子中，糖蛋白激素的α和β链被偶联成单链的蛋白质物质，其中α和β链共价及任选地通过接头成分相连。接头成分可以含有其他氨基酸序列，尤其此处描述的CTP单元可以有利地包含于接头成分中。此外，接头成分可以含有针对激素受体的肽或非肽药物。
除了简单地通过肽键将两个肽链偶联而获得头对尾构型之外，α和β链也可以头对头或尾对尾连接。头对头和尾对尾偶联涉及使用将两个羧基或两个氨基通过接头成分相连的标准技术的合成化学方法。例如，用标准活化技术，两个氨基可以通过酸酐或通过任何二羧酸衍生物而连接；两个羧基可以通过二胺或二醇连接。但是，最优选的形式是头对尾构型，其中形成标准的肽键，而且单链化合物可以通过重组方式或肽合成技术以融合蛋白形式制备，它或者是单链，或者较佳地连接全长序列的各部分。当然，如果需要，也可以使用肽或非肽接头成分，但这是不必要的，而且常规的单链蛋白质重组生产方法暗示，使用这种生产方式的实施例显然包括了最佳的方法。
采用头对尾型构型时，接头成分基本上由额外肽序列构成。对于异源二聚体的情况，两个β链可以通过CTP单元连接，详见下文。因此，本发明的可能例子包括：α-FSHβ、βFSH-α、α-βLH、α-CTP-βLH、βLH-CTP-α、CTP-βLH-CTP-α等，其中N端在左边。
异源二聚体促性腺激素或糖蛋白四成员家族的单链形式也包括其他重要的例子，其中与偶联α和β亚基不同，将两个β或两个α亚基连接在一起形成单链化合物。对于异源二聚体，偶联可以是头对头、头对尾或尾对尾。
“双β”单链串联肽尤其可以用作拮抗剂，用于通常被异源二聚体糖蛋白激素所激活的受体。因为据信α亚基主要负责信号转导，而β亚基提供受体特异性，而且因为α和β亚基具有相似的构象，所以单链化合物应能够特异地结合至少存在一个β链的受体而不会激活受体。
“双β”单链串联肽的拮抗剂活性部分地基于异源二聚体的晶体结构。应注意，α和β链具有类似的半胱氨酸结(cystine-knot)构型，而且两种链的某些折叠方式类似。
本发明的“双β”单链化合物含有串联式排列的相同β亚基的拷贝，即FSHβ-FSHβ；HCGβ-HCGβ；TSHβ-TSHβ；或LHβ-LHβ；也可采用嵌合的单链化合物，例如HCGβ-FSHβ；FSHβ-LHβ；LHβ-TSHβ等。一共有12种可能的组合。此外，当HCG β亚基的羧基端肽(CTP)存在于两个β链之间时会改善单链化合物的构象。当HCG是上游部分时，这是自动的；但是在其他情况下，常规方法是在上游部分的羧基端采用此处所述的CTP单元。两个这种CTP单元也包括在本发明范围内。因此，优选的例子包括FSHβ-CTP-FSHβ；FSHβ-CTP-CTP-FSHβ；LHβ-CTP-FSHβ；LHβ-CTP-CTP-FSHβ等。
类似的描述适用于“双α”单链化合物，当然除了α变异体之外不包括嵌合型配对。也包括各种接头成分尤其是基于CTP的接头成分和CTP延伸。
下列定义帮助描述单链形式分子。
如此处所用，α亚基，和FSH、LH、TSH和CGβ亚基以及异源二聚体形式一般与其常规定义相同，指具有本领域中已知氨基酸序列的蛋白质或其等位变异体，而不论糖基化方式。
这些肽的“天然”形式是指具有从相关脊椎动物组织中分离出的氨基酸序列、而且具有本领域中已知氨基酸序列的蛋白质或其等位变异体。
这些蛋白质的“变异体”形式指通过例如定点突变或其他重组操作而产生的或者人工合成的、在天然蛋白质氨基酸序列中具有故意改变的蛋白质。
这些改变由1-10、较佳地1-8、更佳地1-5个氨基酸变化构成，包括缺失、插入和取代，其中最佳的保守氨基酸取代如下所述。得到的变异体必须保留活性以实现相应天然激素活性，即或者它们必须直接地保留天然激素的生物学活性，或者它们必须起拮抗剂的作用，一般是能够与天然激素的受体结合但不能实现信号转导。例如，已知如果α亚基52位上的糖基化位点通过氨基酸置换而去除，从而防止该位点上的所有糖基化的话，那么具有这种改变的α亚基的异源二聚体激素一般是促效剂，而且能够在竞争中与受体结合以防止天然激素的结合。(另一方面，α亚基78位的糖基化位点似乎对激素活性的影响不大)。氨基酸序列的其他改变也可能使变异体是拮抗剂而不具有促效剂活性。
一组优选变异体是α或β亚基或两者的糖基化位点被改变的种类。α亚基含有两个糖基化位点，一个在52位，另一个在78位，这些位点改变对活性的影响刚才已经描述过。类似地，β亚基一般含有两个N-连接的肽键位点(所处的位置随β链性质的不同而相异)，而且可以在这些位点进行类似的改变。hCG的CTP延伸含有4个O-连接的糖基化位点，在丝氨酸残基处的保守性突变(例如将丝氨酸变为丙氨酸)会破坏这些位点。O-连接的糖基化位点的破坏会导致从促效剂活性向拮抗剂活性的转变。
最后，靠近N-连接或O-连接的糖基化位点处的氨基酸序列的改变会影响存在于产生的分子中糖基化的性质，而且也会改变其活性。
氨基酸序列的改变也包括插入和缺失。因此，激素的截短形式被包括在变异体中，例如缺失C末端85-92位中部分或全部氨基酸的α亚基突变型。此外还包括缺失N末端的1-10个氨基酸的α亚基。此处所述的激素四成员家族的部分有用变异体在美国专利5,177,193中有描述(1993年1月5日出版，在此引用作为参考)。如其所述，可以通过破坏相关位点，或者通过选择产生蛋白质的宿主细胞而改变糖基化方式。
如上所述，单链形式是常规的、用于各种工程化突变蛋白的材料。这种突变蛋白包括非关键区域被改变或被去除的突变蛋白。这种缺失和改变可包括整个环，从而缺失或改变远大于10个氨基酸的序列。但是单链分子必须至少保留受体结合域和/或涉及信号转导的区域。
有相当多的文献涉及此处所述的激素四成员家族的变异体，而且从这些文献中明显地知道，可以制备大量可能具有促效剂和拮抗剂活性的变异体。参见Chen，F.et al.Molec Endocrinol(1992)6：914-919；Yoo，J.et al.J Biol Chem(1993)268：13034-13042；Yoo，J et al.J Biol Chem(1 991)266：17741-17743；Puett，D.etal.Glycoprotein Hormones，Lusbader，J.W.et al.EDS，Springer Verlag New York(1994)122-134；Kuetmann，H.T.etal(ibid)P103-117；Erickson，L.D.et al.Endocrinology(1990)126：2555-2560；和Bielinska，M.et al.J Cell Biol(1990)111：330a(Abstract 1844)。
如上所述，一种构建有效拮抗剂的方法是制备含有糖蛋白四成员家族中相同或不同成员的两个β亚基单链分子。特别优选的这些单链形式的变异体包括其中有一个或多个半胱氨酸连接被缺失的种类，典型地是通过用中性氨基酸置换一个或两个参与连接的半胱氨酸实现缺失。特别优选的可被缺失的半胱氨酸连接是位于26位和110位之间以及23位和72位之间的半胱氨酸。
此外，已表明，激素四成员家族的β亚基可以以嵌合形式构建从而提供具有嵌合的两种组份的生物学功能，或者一般提供生物学功能改变的激素。因此，可以按Moyle，Proc Natl Acad Sci(1991)88：760-764；Moyle，Nature(1994)368：251-25 5中的方法构建具有FSH和LH/CG活性的嵌合分子。如这些文章中所述，用FSH-β101-109位氨基酸置换CG-β亚基中的相应残基可得到具有hCG和FSH活性的类似物。
β亚基的这些嵌合形式也可以用于偶联两个β亚基成为一个分子的单链化合物。
尽管意识到糖基化方式对活性会产生量和质方面的影响，但是出于方便，与“α亚基”相同，术语FSH、LH、TSH和CGβ亚基指具有肽特性的氨基酸序列。当仅指β链时，术语是例如FSHβ；当指异源二聚体时，使用简单术语“FSH”。从上下文中可以清楚地知道糖基化方式是如何受影响的，例如通过重组表达宿主或糖基化位点的改变。同样也注意到具有特殊糖基化方式的糖蛋白形式。
如此处所用，“肽”和“蛋白质”可互换使用，因为它们之间的长度区别不明确。
在本发明的单链形式中，α和/或β链可以在非关键区域插入CTP延伸。
α和β亚基的“非关键”区域是生物学活性(包括促效剂和拮抗剂活性)非必需的分子区域。一般地，这些区域可以从结合位点、前体剪切位点和催化区域中去除。应避免对引导合适折叠、与受体结合和催化活性等至关重要的区域；类似地，也应避免对确保蛋白质三维构象至关重要的区域。应注意，在二聚体情况下是关键的某些区域在单链形式下会变成非关键的，因为由单链所赋予的构象限制可能会改变这些区域的关键性。非关键区域的确定可以方便地通过缺失或修饰候选区域然后对所需活性进行适当的测试即可实现。导致活性损失的修饰区域是关键的；导致相同或相似活性(包括拮抗剂活性)改变的区域被认为是非关键的。
应强调，“生物学活性”指对天然激素的活性起促效的或拮抗的活性。因此，某些区域对变异体作为拮抗剂起作用至关重要，尽管拮抗剂不能直接提供激素的生理效应。
例如，对于α亚基，33-59位被认为是信号转导所必需的，而羧基端20个氨基酸的延伸段是信号转导/受体结合所必需的。与β亚基进行装配中的关键残基至少包括残基33-58，尤其是37-40。
当非关键区域“靠近”N末端或C末端时，插入可以位于10个末端氨基酸中的任何位置，更佳地在5个氨基酸中，最佳地为末端本身。
一般地，“靠近”用于表示在参照位置10个氨基酸之内，较佳地5个氨基酸之内，最佳地为参照位置本身。因此，某些变异体可含有“靠近”糖基化位点的氨基酸取代；其定义在此处是很明确的。此外，α和β亚基可以在“靠近”其N末端或C末端的位置相互连接。
如此处所用，“CTP单元”指在人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基端发现的、在C末端从氨基酸112-118延伸至残基145的氨基酸序列，或指其片段。因此，每个“完整”CTP单元含有28-34个氨基酸，其长度取决于CTP的N末端。位置112-145的天然序列示于图2。
“部分”CTP单元指这样的氨基酸序列，它位于位置112-118至145(含145本身)，但是从最短的“完整”CTP单元(即从118-145位)中缺失至少一个氨基酸。如果需要的是促效剂活性，则包括在本发明范围内的“部分”CTP单元最好含有至少一个糖基化位点。激素的某些非糖基化形式是拮抗剂，因此可以作为拮抗剂使用。CTP单元在丝氨酸残基处含有4个这样的位点，分别位于121(位点1)、127(位点2)、132(位点3)和138(位点4)位。用于本发明的促效剂的CTP部分形式可含有一个或多个按在天然CTP序列中的次序排列的这些位点。因此，用于本发明促效剂的“部分”CTP单元可以含有所有4个糖基化位点；位点1、2和3；位点1、2和4；位点1、3和4；位点2、3和4；或仅有位点1和2；位点1和3；位点1和4；位点2和3；位点2和4或位点3和4；或者仅含有一个位点1，2，3，或4。
“串联式”插入或延伸表示插入子或延伸段含有至少两个“CTP单元”。每个CTP单元可以是完整的或是片段，可以是天然的或变异的。在串联式延伸或插入中的所有CTP单元可以是相同的，也可以互不相同。因此，例如，串联式延伸或插入可以被分成若干种类：部分-完整；部分-部分；部分-完整-部分；完整-完整-部分等，其中各个部分或完整CTP单元可以各自独立地为变异的或天然序列。
“接头成分”是将α和β序列连接在一起而又不干扰活性的组成部分，这些活性由作为异源二聚体成员的同一α和β所表现，或者它改变活性使其从促效剂转变成拮抗剂活性。活性水平可以在合理的范围内变动，但是接头物的存在不能使单链形式基本上同时丧失其促效剂或拮抗剂活性。当从生产介质中回收时，必须仍维持单链形式，而且必须表现出与异源二聚体(异源二聚体的元件形成其组成)的激素活性有关的活性。
变异体
激素亚基和CTP单元可以完全对应于天然的激素或CTP序列，也可以对应于变异体。变异体的性质已经在上面描述过。在这些变异体中，天然序列中的1-10，较佳地1-8，更佳地1-5个氨基酸被与该位置上天然氨基酸不同的氨基酸所取代，或者1-10，较佳地1-8，更佳地1-5个氨基酸被简单地缺失，或是上述变化的组合。如上所述，尤其当通过检测非关键“环”的存在而鉴别出单链形式的非关键区域时，缺失或取代而改变的氨基酸数目可以增加至20或30个氨基酸，或者某一任意数字，这取决于有关的非关键区域的氨基酸序列长度。当然，在一个以上非关键区域进行的缺失或取代会导致单链形式中受影响的氨基酸数目更大，而且缺失和取代方案可以组合使用。累积性地进行取代或缺失不会导致与激素相关的促效剂或拮抗剂活性的基本丧失。对天然氨基酸的保守类似物进行取代是优选的。
与常规含义相同，“保守类似物”指这样的类似物，其中被取代的残基与进行取代的残基属于同一氨基酸种类。如本领域中熟知的那样，氨基酸已经被划分成几组，例如参见Dayhoff，M.et al.，Atlasof Protein Sequences and Structure(1972)5：89-99。一般地，酸性氨基酸被归在一组；碱性氨基酸被归在一组；中性亲水氨基酸被归在一组；等等。
更具体地，氨基酸残基一般可以如下进一步分成4个主要的亚组：
酸性的：这种残基在生理pH条件下由于失去H离子而带负电荷，当含有该残基的肽处于生理pH条件下的水性介质中时，该残基受水溶液的牵引从而位于肽构象的表面位置。
碱性的：这种残基在生理pH条件下由于携带H离子而带正电荷，当含有该残基的肽处于生理pH条件下的水性介质中时，该残基受水溶液的牵引从而位于肽构象的表面位置。
中性的/非极性的：这种残基在生理pH条件下不带电荷，当含有该残基的肽在水性介质中时，该残基受水溶液的排斥从而位于肽构象的内部位置。这些残基也被称为是“疏水性的”。
中性的/极性的：这种残基在生理pH条件下不带电荷，当含有该残基的肽处于水性介质中时，该残基受水溶液的牵引从而位于肽构象的外部位置。
当然，应理解，对于统计意义上的一组残基分子而言，一些分子带电荷，另一些不带电荷，水性介质的吸引或排斥的程度会较大或较小。为了符合“带电荷”的定义，在生理pH下应有有意义的百分比(至少约25％)的分子是带电荷的。对于划分极性或非极性所需的吸引或排斥程度是任意确定的，因此本发明具体构思中的氨基酸被归为这一组或那一组。大多数没有具体命名的氨基酸可以依据其已知的行为进行划分。
氨基酸残基还可以进一步细分成环状的或非环状的，芳香族的或非芳香族的，按残基侧链取代基以及大小进行划分。如果残基总共含有4个或更少的碳原子(包括羧基碳原子)，那么该残基被认为是小的。当然，小残基总是非芳香族的。
对于天然存在的蛋白质氨基酸，用上述方法进行划分的结果如下：
酸性：天冬氨酸和谷氨酸；
碱性/非环状：精氨酸，赖氨酸；
碱性/环状：组氨酸；
中性/极性/小的：甘氨酸，丝氨酸，半胱氨酸；
中性/非极性/小的：丙氨酸；
中性/极性/大的/非芳香族的：苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；
中性/极性/大的/芳香族的：酪氨酸；
中性/非极性/大的/非芳香族的：缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸；
中性/非极性/大的/芳香族的：苯丙氨酸和色氨酸。
基因编码的二级氨基酸脯氨酸，尽管技术上被划分在中性/非极性/大的/环状和非芳香族的，但它是一个特殊例子，由于众所周知它对肽链二级结构的影响，因此没有被划入这一组中。
如果本发明的单链蛋白质是用重组方法构建，那么它们仅含有基因编码的氨基酸取代；但是，如果任一部分是用标准的方法如固相合成、肽合成方法合成的，并用例如酶法连入其余蛋白质中，那么可以用非基因编码的氨基酸，例如氨基异丁酸(Aib)、苯基甘氨酸(Phg)等取代其对应的类似物。
这些非编码的氨基酸还可以包括，例如β-丙氨酸(β-Ala)，或其他ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸、4-氨基丁酸等，肌氨酸(Sar)，鸟氨酸(Orn)，瓜氨酸(Cit)，叔丁基丙氨酸(t-BuA)、叔丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)和环己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、磺基丙氨酸(Cya)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；巯基戊酸(Mvl)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)和甲硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide，MSO)，这些氨基酸可方便地归入各组别。
根据上述定义，
Sar和β-Ala和Aib是中性/非极性/小的；
t-BuA、t-BuG、N-MeIle、Nle、Mvl和Cha是中性/非极性/大的/非芳香族的；
Orn是碱性/非环状的；
Cya是酸性的；
Cit、乙酰基Lys和MSO是中性/极性/大的/非芳香族的；
Phg、Nal、Thi和Tic是中性/非极性/大的/芳香族的；
各种ω-氨基酸根据其大小被分成中性/非极性/小的(β-Ala，即3-氨基丙酸，4-氨基丁酸)或大的(所有其他的)。
因此，本发明范围之内的肽化合物还可以含有除基因编码的取代之外的氨基酸取代，而且这些取代可以根据其结构用上述一般方案进行分类。
单链激素的优选例子
本发明的单链激素可用重组技术进行最有效和最经济地生产。因此，优选那些仅含有基因编码的氨基酸的α和β链、CTP单元和其他接头成分形式。然而，如上所述，有可能用肽合成技术或其他有机合成技术可以合成至少部分单链激素，因此含有非基因编码的氨基酸的变异体也在本发明范围之内。
在本发明的最佳单链激素例子中，β亚基的C-末端是任选地通过接头而共价连于成熟α亚基的N-末端；至于α亚基的C末端连于β亚基的N末端的形式，也是有用的，但是其作为相关的受体拮抗剂或促效剂的活性稍低。连接可以是直接肽连接，其中一个亚基的C末端氨基酸与另一亚基的N末端直接通过肽键而相连；但是，在大多数情况下，最好在两个末端之间含有接头成分。在大多数情况下，接头成分在两个链之间至少提供一个β转角。因此，在接头中存在脯氨酸是有利的。
如上所述，在任何情况下，通过接头单元也可将α链的N末端偶联于β链的N末端，或者将α链的C末端偶联于β链的C末端，类似的组合也可存在于含有两个α或两个β亚基的单链形式中。
应理解，在所讨论的构成单链形式的亚基末端之间的连接中，一个或多个末端也可以通过如上所述的取代和/或缺失而改变。
含有两个β亚基的单链化合物的优选例子是那些一个亚基的C末端任选地通过接头，尤其是肽接头，而与另一亚基的N末端相连的种类。同样，如上所述，在两个β链的N末端之间的连接或在两个β链的C末端之间的连接也是可行的；当然，在这些例子中需要接头。
尽管已对单链异源二聚体和单链双β亚基形式的头对头、尾对尾和头对尾构型进行了描述，但是在两个亚基之间的连接可以不正好位于各亚基的N-或C-末端，是位于末端附近的位置。
在一组特别优选的例子中，连接是头对尾型，接头成分含有一个或多个CTP单元和/或变异CTP单元或其片段。用于这种接头成分的CTP单元的优选形式在下面描述。
此外，接头成分可含有共价地(最好可以释放)连于接头成分的药物。将药物偶联于接头成分的方法以及使其释放的方法都属常规。
CTP单元和变异CTP单元及其片段除了位于接头成分之外，还可以位于构成单链激素的各亚基的任何非关键区域。这种包含形式的性质及位置在本专利应用中有详细描述。
尽管CTP单元是接头成分中的优选包含例子，应理解接头可以是能提供α和β亚基适当空间关系的任何合适的共价结合材料。因此，对于头对尾构型，接头一般是肽，它可含有任意数目的、但通常小于100个、更佳地小于50个的氨基酸，其中具有适当的亲水性/疏水性比率以便在溶液中能提供适当的空间和构象。一般地，接头应有均衡的亲水性，从而位于周围溶液中并且不干扰α和β亚基或者两个β亚基之间的相互作用。较佳地，接头含有通常由脯氨酸提供的β转角。可以使用具有上述正确特性的任何合适的聚合物，其中包括肽接头。
一种不在本发明范围之内的特殊接头成分是含有正好位于亚基上游的信号肽的接头成分。
特别优选的本发明的单链激素例子包括：
βFSH-α；βFSH-βFSH；βFSH-βLH；
βLH-α；βLH-βLH；βLH-βFSH；
βTSH-α；βTSH-βTSH；βTSH-βFSH；
βCG-α；β-CG-β-CG；βCGG-βFSH；βCG-βTSH；
βFSH-CTP-α；βFSH-CTP-βFSH；βFSH-CTP-βLH；
βLH-CTP-α；βLH-CTP-βLH；βLH-CTP-βFSH；
βCG-CTP-α；βFSH-CTP-CTP-βLH；
βFSH-CTP-CTP-α；βFSH-CTP-CTP-βTSH；
βLH-CTP-CTP-α；βLH-CTP-CTP-βLH；
βCG-CTP-CTP-α；βD-CTP-CTP-βLH；
α-α；α-CTP-α；和α-CTP-CTP-α等。人的亚基形式也是特别优选的。在上述构建物中，“CTP”指CTP或变异形式或它们的片段，这在下文中进一步描述。
CTP单元的优选例子
用于本发明的CTP单元的标志法如下：对于完整的CTP单元各部分，在该部分中包括的位置用数目进行命名，如图2所示。当发生取代时，取代氨基酸带有一个标明其位置的上标。因此，例如CTP(120-143)表示从位置120延伸至位置143的CTP部分；CTP(120-130；136-143)表示缺少天然序列位置118-119、131-135和144-145的融合氨基酸序列。CTP(Arg122)指122位赖氨酸被精氨酸取代的变异序列；CTP(Ile134)指134位亮氨酸被异亮氨酸取代的变异序列。CTP(Val128 Val143)指发生两个取代的变异形式，其中一个取代128位亮氨酸而另一个取代142位异亮氨酸。CTP(120-143；Ile128Ala130)表示发生两个所标出取代的CTP单元的相应部分。
在CTP变异形式中，那些一个或多个O-连接的糖基化位点被改变或缺失的种类也是优选的。一种改变位点以防止糖基化的特别优选方法是用丙氨酸取代这些位置的丝氨酸。
特别优选的是下式CTP单元：
#1 CTP(116-132)
#2 CTP(118-128；130-135)
#3 CTP(117-142)
#4 CTP(116-130)
#5 CTP(116-123；137-145)
#6 CTP(115-133；141-145)
#7 CTP(117-140，Ser123Gln140)
#8 CTP(125-143，Ala130)
#9 CTP(135-145，Glu139)
#10 CTP(131-143，Val142Val143)
#11 CTP(118-132)
#12 CTP(118-127)
#13 CTP(118-145)
#14 CTP(115-132)
#15 CTP(115-127)
#16 CTP(115-145)
#17 CTP(112-145)
#18 CTP(112-132)
#19 CTP(112-127)
α和β亚基的优选例子
当然，天然的α和β亚基的单链形式属于优选例子。但是，某些变异体也是优选的。
具体地，52位N-连接的糖基化位点通过对该位置或其附近处的氨基酸进行取代而得以消除或改变的α亚基变异形式，优选用于拮抗剂活性。对78位糖基化位点进行类似修饰也是优选的。缺失85-92位的一个或多个氨基酸也会影响含有α亚基的激素的活性性质，对这些位置的氨基酸进行取代或缺失也是优选的。
类似地，β链中N-连接的糖基化位点可以方便地进行修饰以消除糖基化，从而影响β链的促效剂或拮抗剂活性。如果存在CTP，无论是天然地存在于CG中还是以接头形式存在，在这一成分中的O-连接的糖基化位点也可被改变。
含有修饰或缺失的糖基化位点的各种变异形式在下列文献中有描述：Yoo，J.et al.J.Biol Chem(1993)268：13034-13042；Yoo，J.et al.J.Biol Chem(1991)266：17741-17743和Bielinska，M.et al.J Cell biol(1990)111：330a(都引用)和Matzuk，M.M.et al.J Biol Chem(1989)264：2409-2414；Keene，J.L.et al.J BiolChem(1989)264：4769-4775和Keene，J.L.et al.Mol En-docrinol(1989)3：2011-2017。
不仅糖基化位点本身可以被直接修饰，而且这些位点的邻近位置也可以优先被修饰从而影响突变型的糖基化状态。对于α亚基，例如50-60位之间的氨基酸被取代(包括保守的和非保守的取代)的变异形式是优选的，尤其是51、53和55位的取代，因为它们靠近糖基化位点Asn52。
91位赖氨酸被转变成甲硫氨酸或谷氨酸的α亚基突变型也是优选的。
尽管变异形式是按各亚基的变化进行讨论的，但是应理解，二聚体中的单链形式可提供额外的修饰机会。具体地，对二聚体的折叠至关重要的区域可能对于单链分子的正确构象并不是关键的，因而这些区域可以在单链形式中进行改变，尽管上面并没有对二聚体形式的各成员进行描述。此外，单链形式还可以在非关键区域进行剧烈的修饰，如上所述，这些非关键区域的改变和/或缺失不会影响生物学活性。
合适的药物
可以包含在接头成分中的合适药物包括肽或蛋白质，例如类似胰岛素的生长因子；表皮生长因子；酸性和碱性成纤维细胞生长因子；血小板衍生的生长因子；各种集落刺激因子(CFS)，例如粒细胞CFS、巨噬细胞CFS等；各种细胞素如IL-2、IL-3和多种其他白细胞介素蛋白质；各种干扰素；肿瘤坏死因子等。肽类或蛋白质类药物的优点是它们能被包含在单链中，而且整个构建物可以方便地通过单个基因的重组表达而生产。另外，也可以使用小分子药物如抗生素、消炎药、毒素等。
一般地，包含在接头成分中的药物可以是需要在激素通常结合的受体附近发挥作用的药物。还可提供合适的将药物从接头的包含形式中释放出来的方法，例如通过在下面的“制备方法”一节中所述的引入酶催化裂解位点的方法。
其他修饰
本发明的单链蛋白质还可以用公知的方法进行偶联或衍化从而对氨基酸序列进行衍生，例如磷酸化、糖基化、对通常的糖基化形式进行去糖基化、对氨基酸侧链进行修饰(如将脯氨酸转变成羟基脯氨酸)以及与那些翻译后修饰事件(已发现普遍存在)类似的修饰类似物。
本发明的激素的糖基化状态尤为重要。激素可以以非糖基化形式制备，这可通过在原核宿主中生产，或通过改变亚基和/或任何CTP单元中一般存在的糖基化位点。非糖基化形式和部分糖基化的激素可以通过对糖基化位点的操作而制备。当然，糖基化形式是在本
发明范围之内的。
正如本领域中熟知的那样，本发明的单链蛋白质也可偶连于标记物、载体、固相载体等，这取决于所需的用途。可以使用标记形式来跟踪其代谢结果；用于该目的的合适标记物包括(尤其是)放射性同位素标记物如碘131、锝99、铟111等。这些标记物也可用于介导在测试系统中对单链蛋白质进行检测；在该例子中，可以使用放射性同位素以及酶标记物、荧光标记物、生色标记物等。使用这类标记物对于这些蛋白质特别有利，因为它们是导向式(targeting)试剂受体配体。
本发明的蛋白质还可偶联于载体以便在制备与这些新的修饰形式发生特异性免疫反应的抗体的过程中增加其免疫原性。用于该目的的合适载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、白喉类毒素等。可以采用标准偶联技术将本发明的修饰肽与载体相连，包括使用双功能接头。
可以使用类似的连接技术及其他技术，将本发明的蛋白质偶联于固相载体。偶联后，可以将这些蛋白质用作亲和试剂，分离所需的、与其具有特异反应的组份。
制备方法
构建本发明的蛋白质的方法是本领域中众所周知的。如上所述，如果仅含有基因编码的氨基酸，而且单链是处于头对尾构型，那么目前最实际的方法是通过表达编码所需蛋白质的DNA而重组合成这些材料。含有编码单链形式(包括变异形式)的核酸序列的DNA可以用天然序列制备。定点诱变、连入额外序列、PCR和构建合适表达系统的技术目前都是本领域中众所周知的。编码所需蛋白质的部分或全部DNA可以用标准的固相合成技术合成，最好引入限制性酶切位点以方便连接。可将用于转录和翻译包含的编码序列的合适控制元件提供给DNA编码序列。众所周知，目前已有可以与大量不同宿主相容的表达系统，这些宿主包括原核宿主如细菌和真核宿主如酵母、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞等。
宿主的选择尤其应涉及翻译后事件，特别是包括糖基化。糖基化的位置主要由分子内的糖基化位点的性质所控制；但是，占据位点的糖的性质主要由宿主的性质所决定。因此，本发明激素性质的微调可以通过适当地选择宿主而实现。
α亚基部分(其中α亚基是修饰的或非修饰的)的一种特别优选的基因形式是“小基因”(minigene)构建物。
如本文所用，α亚基“小基因”指在Matzuk，M.M.，et al，MolEndocrinol(1988)2：95-100中描述pM2/CGα或pM2/α构建物中所公开的基因构建物。该“小基因”的特征是仅保留外显子3和外显子4之间的内含子序列，所有上游内含子都已缺失。在描述的具体构建物中，衍生自外显子2和一部分外显子3的N端编码序列是从cDNA获得的，并且直接通过XbaI限制性位点而连入外显子3的编码序列，从而缺少外显子I和II之间以及外显子II和III之间的内含子。然而，外显子III和IV之间的内含子以及编码序列3′的信号序列被保留下来。得到的小基因可以方便地作为BamHI/BglII片段而插入。当然，其他构建相容性小基因的方法也是可能的，因而并不需要将定义局限于编码序列是通过XbaI位点而连入的特定构建物。但是，这是构建基因的方便方法，而且其他方法如通过合成或部分合成而制备基因的方法并没有特别的优点。此处的定义包括那些保留外显子III和IV之间内含子，或任何其他内含子(但最好不含其他内含子)的α亚基编码序列。
对于重组生产，可使用已用表达系统修饰的宿主细胞，并培养至产生所需的蛋白质。此处使用的术语如下：
“修饰的”重组宿主细胞，即“经修饰从而含有”本发明的重组表达系统的细胞，指这样的宿主细胞，它已经用任何方便的引入方法(包括转染、病毒感染等)处理从而含有表达系统。“修饰的”是指细胞含有该表达系统而不论该表达系统是整合入染色体还是位于染色体之外。“修饰的”细胞对于包含表达系统可以是稳定的，也可以是不稳定的。简而言之，带有本发明的表达系统的“修饰的”重组宿主细胞是指，当天然不含有该表达系统时，通过引入操作而含有该表达系统的细胞，而不论用何种方式实现这种引入。
“表达系统”指含有待表达的编码核苷酸序列及其相伴的、实现编码序列表达所必需的控制序列的DNA分子。典型地，这些控制序列包括：启动子、终止调控序列以及(在某些情况下)操纵子或其他调控表达的序列。控制序列是那些设计用于在特定靶宿主细胞中发挥作用的序列，因此必须选择宿主细胞使之与构建的表达系统中的控制序列相容。
如果需要分泌产生的蛋白质，那么还要包含编码信号肽的其他核苷酸序列，从而产生可操作地连于(operably linked)所需单链激素的信号肽，进而产生前体蛋白。一旦分泌，信号肽被切除，释放出成熟的单链激素。
如本文所用，“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”可互换使用而不必在意其细微区别。在需要区分它们的地方，会在上下文中清楚地表明。对于都可以表示的场合，所有的都包括在内。
产生的蛋白质可以从细胞裂解液中获得(如果产生于细胞内)，或者从培养基中获得(如果是分泌的)。从细胞培养物中回收重组蛋白质的技术是本领域中众所周知的，而且可以用已知技术如色谱法、凝胶电泳、选择性沉淀等纯化这些蛋白质。
本发明的全部或部分激素可以用本领域已知的肽合成技术直接合成。合成的部分可以连接起来，而在接头成分中所含的任何药物的释放位点可以用标准化学方法引入。当然，对于那些含有非基因编码的氨基酸的例子以及采用头对头或尾对尾构型的例子，合成工作至少部分是处于蛋白质水平的。在天然N端或靠近天然N端的位置的头对头连接，可以通过含有与氨基起反应的官能团的接头如二羧酸衍生物而实现。在天然C端或靠近天然C端的位置的尾对尾连接，可以通过二胺、二醇或其组合的接头而实现。
抗体
本发明的蛋白质可以用于产生与这些新化合物起特异性免疫反应的抗体。这些抗体可以用于各种诊断和治疗用途。例如，当本发明的单链形式用于治疗人或动物时，药物的浓度可以通过常规的免疫分析技术，用这些抗体进行监测。此外，因为某些用单链形式产生的抗体会与异源二聚体起交叉反应，因此可用于诊断天然存在的异源
二聚体的浓度。
抗体一般是用标准免疫方案在哺乳动物如兔、小鼠、羊或大鼠中制备，并且抗体作为多克隆抗血清进行效价测定以保证有足够的免疫。然后收获多克隆抗血清以用于例如免疫测定。来自宿主的分泌抗体的细胞，如脾细胞或外周血白细胞，可以用已知的技术进行永生化处理并筛选以产生与本发明的蛋白质呈免疫特异性的单克隆抗体。
“对蛋白质免疫特异的”指在确定亲和性或非亲和性的普通常数下，抗体能与单链蛋白质起免疫反应，但是不与异源二聚体本身起免疫反应。应理解，特异性是一个相对概念，可以选择任意的限度，例如免疫反应性可相差100倍或更多。因此，本发明范围内的免疫特异性抗体与单链蛋白质的反应比与相应异源二聚体的反应至少大100倍。
配方
可用与人们已知的、用于与单链形式相应的异源二聚体的方法相类似的方法，来配制和施用本发明的蛋白质。因此，配制和施用方法会随所用的特定激素而有所不同。然而，与异源二聚体相比，剂量水平和施用频率也可以改变，尤其考虑到如果存在CTP单元，那么生物学半衰期会因其存在而延长。
本发明的蛋白质的配方是典型的用于蛋白质或肽药物的配方，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack Pub-lishing Company，Easton，PA中所述的配方。蛋白质的给药一般是通过注射，例如静脉注射、肌内注射、皮下注射、或腹膜内注射，或者使用透粘膜或透皮给药的配方。这些配方一般含有表面活性剂或渗透剂如胆盐、梭链孢酸等。这些配方还可以以气雾剂或栓剂形式，或者在透皮给药中以皮肤膏药(patch)形式给药。
口服给药也是可行的，只要配方能防止本发明的肽在消化道中被降解。
剂量规定和配方的优化可以作为常规方法并如本领域中通常进行的那样进行。
使用方法
本发明的单链肽可以用于许多方面，最明显地是作为激素异源二聚体形式的替代物。因此，与异源二聚体相同，本发明的促效剂形式的单链激素可用于在人或动物中治疗不育症(作为体外受精技术的辅助剂)以及其他与天然激素相关的治疗方法。
单链激素还可以以类似于异源二聚体的方法用作试剂。
此外，本发明单链激素可用作诊断工具，检测在生物样品中针对天然蛋白质的抗体的存在与否。它们还可以作为评估各种样品中激素水平的试剂盒的对照试剂。用于评估激素本身的水平或针对它们的抗体的水平的方法是本领域中公知的标准免疫分析方法。可以使用各种涉及放射性同位素标记、荧光标记、酶标记等的标记技术的竞争性和直接分析方法。
本发明的单链激素还可用于检测和纯化与天然激素结合的受体。因此，本发明的单链激素可以偶联于固相载体，用于受体或抗激素抗体的亲和色谱制备。得到的受体本身可用于在筛选治疗和候选试剂的试验中评估激素作为候选药物的活性。
最后，唯一地与本发明的单链激素反应的抗体可用作纯化工具，用于分离随后的这些材料的制备物。它们还可用于监测单链激素作为药物施用时的水平。
下列实施例用于阐述本发明，而不是限制本发明。
实施例1
制备编码CGβ-α的DNA
图1为表达载体中插入子的构建图，其中人CG的β链C末端与成熟的人α亚基N末端相连。
如图1所示，用聚合酶链反应(PCR)将CGβ外显子3和α亚基外显子2之间的两个亚基融合在一起，使在阅读框中CGβ羧基端氨基酸的密码子直接与α亚基N末端氨基酸的密码子融合。这是通过使用杂合引物扩增含有CGβ外显子3的片段而实现，其中杂合引物含有编码α亚基N末端序列的“尾部”。得到的扩增片段因此含有编码人CGα外显子2的一部分。
与之相独立地，将编码与CGβ的C末端密码子融合的α亚基N末端序列的杂合引物作为扩增α小基因的引物之一。将两个扩增片段，每个都含有编码其他亚基的重叠部分，合并起来用另外两个覆盖全部区域的引物扩增，从而得到SalI插入子。
更具体地，反应1显示了含有CGβ外显子3和成熟α亚基的前4个氨基酸以及在编码序列5′侧的SalI位点的片段的产生过程。它通过扩增CGβ基因组序列的一部分而获得，该基因组序列见Matzuk，M.M.et al.，Proc Natl Acad Sic USA(1987)84：6354-6358；Policastro，P.et el.，J Biol Chem(1983)258：11492-11499。
引物1提供SalI位点，其序列如下：
5′-GGA GGA AGG
GTG GTC GAC CTC TCT GGT-3′
SalI
另一引物即引物2，与α的N末端序列的4个密码子和CGβ的C末端序列的5个密码子互补，其序列如下：
因此，作为反应I的产物，得到的扩增片段在融合的编码区域的5′端具有SalI位点。
在反应II中，从上述的α小基因获得一个类似的融合编码区域。引物3是含有β亚基的4个密码子和α的5个密码子的杂合引物，其序列如下：
引物4含有一个SalI位点并且与α外显子4的延伸部分互补。引物4的序列如下：
5′-TGA
GTC GAC ATG ATA ATT CAG TGA TTG AAT-3′
SalI
因此，反应I和反应II的产物有重叠，当它们在引物1和4存在下进行PCR时，便产生所需的SalI产物，如反应III所示。
含有CGβ外显子3和α小基因的扩增片段被插入pM2HA-CGβ外显子1、2中的SalI位点。pM2HA-CGβ外显子1、2是从含有CGβ外显子1和2的pM2衍生而得的表达载体，详见Sachais，B.，Snider，R.M.，Lowe，J.，Krause，J.J Biol Chem(1993)268：2319。含有CGβ外显子1和2的pM2在Matzuk，M.M.et al.，Proc Natl Acad Sic USA(1987)84：6354-6358和Matzuk，M.M.et al.，J Cell Biol(1988)106：1049-1059中有描述。
该表达载体接着用于产生单链形式的人CG，其中β亚基的C末端直接连于α亚基的N末端。
实施例2
单链人CG的产生和活性
将实施例1中构建的表达载体转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，通过放射性标记的蛋白质在SDS凝胶上的免疫沉淀而评估蛋白质的产生情况。收集培养基，在对人LH受体的竞争性结合分析中，将单链蛋白质的生物活性与异源二聚体进行比较。在该分析中，编码完整的人LH受体的cDNA被插入表达载体pCMX(Oikawa，J.X-C et al.Mol Endocrinol(1991)5：759-768)。将处于幂指数生长期的293细胞用该载体并用Chen，C.et al.Mol Cell Biol(1987)7：2745-2752中的方法进行转染。
在该分析中，表达人LH受体的细胞(2×105/管)与lng标记的hCG及与样品竞争性地一起保温以便在22℃测试18小时。然后样品用补充有0.1％BSA的冷Dulbecco′s PBS(2ml)稀释5倍，在800×g离心15分钟。沉淀物用D′s PBS洗涤2次，用伽马计数器测量放射性。在缺乏样品时，特异性结合为加入的总标记(碘标记化)hCG的10-12％。在样品存在时，标记的下降便为样品的结合能力。在该分析中，对于293细胞中的人LH受体，野生型hCG的ED50为0.47ng，而单链蛋白质的ED50为1.1ng。
在另一测定促效剂活性的分析中，评估刺激cAMP产生的情况。在该试验中，将表达人LH受体的293细胞(2×105/管)与各种浓度的异源二聚体hCG或单链hCG一起保温，培养18小时。按Da-voren，J.B.et al.Biol Reprod(1985)33：37-52中所述的特异放射性免疫分析方法测定胞外cAMP的水平。在该分析中，野生型的ED50为0.6ng/ml，而单链形式的ED50为1.7ng/ml(ED50为50％有效剂量)。
因此，在所有情况下，野生型和单链形式的行为是类似的。
实施例3
其他活性的测定
收集已用βFSH-CTP-α单链构建物表达载体转染的CHO细胞的培养基，如实施例2所述进行测定。对于与FSH受体结合的竞争性分析的结果列于图3。结果表示，单链形式比野生型FSH或在β链含有CTP延伸的FSH能更有效地抑制FSH本身与受体的结合。单链形式的ED50约为50mIU(毫免疫单位)/ml，而延伸型异源二聚体的ED50超过100mIU/ml。野生型FSH的ED50约为120mIU/ml。
信号转导测定的结果示于图4。所有三种FSH的效率都差不多。
实施例4
构建其他的表达载体
按与实施例1类似的方式，制备产生单链FSH、TSH和LH(βFSH-α、βFSH-CTP-α、βTSH-α、βTSH-CTP-α、βLH-α、βLH-CTP-α)的表达载体，然后转染入CHO细胞。当按实施例2类似方法进行分析时，得到的激素的活性与野生型激素的活性类似。
类似地，按与实施例1相似的方法构建“双β”单链形式的表达载体，并且如实施例2那样进行表达和分析。
Claims (15)
1.一种糖蛋白激素活性的促效剂或拮抗剂，其特征在于，它是糖基化或非糖基化的下式所示的蛋白质物质，
α-(接头成分)n-β(1)或
β-(接头成分)n-α(2)
其中，糖蛋白激素选自：促卵泡成熟激素FSH、黄体生成素LH、绒毛膜促性腺激素CG、或促甲状腺激素TSH；
n为0或1；
α表示糖蛋白激素或其变异形式的共有的α亚基氨基酸序列；
β表示糖蛋白激素或其变异形式的β亚基氨基酸序列；
其中，所述的变异形式是在α或β亚基的天然氨基酸序列中有1-10个氨基酸被缺失、插入和/或取代所形成的，且所述的缺失、插入或取代所形成的变异体仍然保留天然激素活性。
2.如权利要求1所述的促效剂或拮抗剂，其特征在于，含有该接头成分，而且该接头成分含有可导向糖蛋白激素受体的药物。
3.如权利要求1所述的促效剂或拮抗剂，其特征在于，所述的α和β亚基来自人。
4.如权利要求1所述的促效剂或拮抗剂，其特征在于，所述的接头成分是完整或部分羧基端肽CTP单元，其中完整的CTP单元表示从人绒毛膜促性腺激素β亚基的位置112-118中任一位置至位置145的多肽。
5.如权利要求1所述的促效剂或拮抗剂，其特征在于，α亚基或β亚基或两者通过在非关键区域插入完整或部分CTP单元而被修饰。
6.如权利要求4或5所述的促效剂或拮抗剂，其特征在于，该部分CTP单元含有位置112-132；115-132；116-132；或118-132；112-127；115-127；116-127；或118-127。
7.如权利要求5所述的促效剂或拮抗剂，其特征在于，该非关键区域靠近C末端；或该非关键区域靠近N末端。
8.如权利要求1所述的促效剂或拮抗剂，其特征在于，β亚基含有一个或多个N-连接的糖基化位点的修饰；且
a)其中α亚基的一个或两个N-连接的糖基化位点已被修饰；
b)它是非糖基化的；
c)α亚基85-92位置中的一个或多个氨基酸已缺失；或
d)(a)-(c)的组合。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有与适当的药物赋形剂相混合的如权利要求1所述的促效剂或拮抗剂。
10.一种对权利要求1所述的促效剂或拮抗剂免疫特异的抗体。
11.一种DNA或RNA分子，其特征在于，含有编码权利要求1所述的促效剂或拮抗剂的核苷酸序列。
12.一种用于产生糖蛋白激素促效剂或拮抗剂的核酸，其特征在于，该核酸含有编码权利要求1所述的促效剂或拮抗剂的主要核苷酸序列，该序列可操作地连于能够实现该主要核苷酸序列表达的控制序列。
13.如权利要求12所述的核酸，其特征在于，还含有编码信号肽的次要核苷酸序列，该信号肽可操作地连于主要核苷酸序列编码的蛋白质。
14.一种宿主细胞，其特征在于，它经修饰以含有权利要求12的核酸。
15.一种产生糖蛋白激素活性的促效剂或拮抗剂的方法，其特征在于，该方法包括：
培养权利要求14所述的细胞从而产生所述的促效剂或拮抗剂；和
从培养物中回收所述的促效剂和拮抗剂。
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