NO317394B1 - Enkelt-kjede former av glykoprotein-hormon-kvartetten - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en agonist eller antagonist av glykoproteinhormonaktivitet, farmasøytisk blanding omfattende den, antistoffer som er spesifikke for den, fremgangsmåte for fremstilling derav, samt DNA- eller RNA-molekyl som koder for den, ekspresjonssystem og vertscelle inneholdende

en nukleotidsekvens som koder for den.

Oppfinnelsen angår området proteinoppbygging og de glykoprotein-

hormoner som normalt forekommer som heterodimerer. Mer spesifikt angår oppfinnelsen enkeltkjedeformer av koriongonadotropin (CG), tyroidea-

stimulerende hormon (TSH), luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH).

Hos mennesker har fire viktige glykoproteinhormon-heterodimerer (LH,

FSH, TSH og CG) identiske a-underenheter og forskjellige p-underenheter. Tre av disse hormoner finnes også hos praktisk talt alle andre virveldyrarter; CG er hittil bare blitt funnet hos primater og i hesteplacenta og -urin.

PCT-patentsøknad WO 90/09800, publisert 7. september 1990, og medtatt i det foreliggende som referanse, beskriver en rekke modifiserte former av disse hormoner. Én viktig modifikasjon er C-terminal forlengelse av B-underenheten ved det karboksyterminale peptid i humant koriongonadrotropin eller en variant av dette. Andre muteiner av disse hormoner er også beskrevet. De aktuelle posisjoner for CTP er fra hvilken som helst av posisjonene 112-118 til posisjon 145 i B-underenheten i humant koriongonadotropin. PCT-søknaden beskriver varianter av CTP-forlengelsen oppnådd ved konservative aminosyre-

substitusjoner slik at evnen hos CTP til å forandre klaringsegenskapene ikke er ødelagt. Dessuten beskriver US-patentsøknad nr. 08/049 869, inngitt 20. april 1993, og medtatt i det foreliggende som referanse, modifisering av disse hormoner ved forlengelse eller innføring av CTP på andre steder enn i den C-terminale ende, og kortere CTP-fragmenter enn sekvensen som strekker seg fra posisjonene 112-118 til 145.

Den CTP-forlengede B-underenhet av FSH er også beskrevet i to publikasjoner av søkerne: P.S. LaPolt et al., Endocrinology (1992) 131:2514-2520,

og F.A. Fares et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA (1992) 89:4304-4308. Begge disse publikasjoner er medtatt i det foreliggende som referanse.

Krystallstrukturen av den heterodimere form av humant koriongonadotropin

er nå blitt publisert i mer eller mindre samtidige artikler; én av AJ. Lapthorn et al.,

Nature (1994) 369:455-461 og den andre av H. Wu et al., Structure (1994) 2:545-558. Resultatene av disse artikler er oppsummert av D.J. Patel, Nature (1994) 369:438-439.

Minst ett tilfelle som gjelder fremstilling av en vellykket enkeltkjedeform av en heterodimer er nå kjent. Det naturlig forekommende søtningsprotein, monellin, isoleres fra "serendipity"-bær i heterodimer form. Undersøkelser av krystallstrukturen hos heterodimeren var i overensstemmelse med den påstand at den C-terminale ende av B-kjeden kunne bindes til den N-terminale ende av A-kjeden via en linker som konserverte de romlige egenskaper hos den heterodimere form. En slik binding er fordelaktig på grunn av at det vil være fordelaktig å tilveiebringe dette molekyl i en form som er stabil ved høye temperaturer, for anvendelse som søtningsprotein. Dette ble med hell oppnådd ved fremstilling av enkeltkjedeformen, idet varmedenaturering ble hemmet, som beskrevet i US-patent 5 264 558.

PCT-patentsøknad W091/16922, publisert 14. november 1991, beskriver en mangfoldighet av kimær- og på andre måter modifiserte former av de heterodimere glykoproteinhormoner. Beskrivelsen fokuserer vanligvis på kimærformer av a-underenheter eller B-underen heter som innbefatter deler av hen-holdsvis forskjellige a- og B-kjeder. Ved én konstruksjon, som ganske enkelt er oppregnet i denne patentsøknad og som ikke er beskrevet ellers, koples hovedsakelig alle B-kjedene i humant koriongonadotropin til a-underenhet-preproteinet, d.v.s. innbefattende sekresjonssignalsekvensen for denne underenhet. Denne konstruksjon er utenfor den foreliggende oppfinnelses ramme, siden nærvær av signalsekvensen som inngår mellom B- og a-kjedene, ikke tjener som linkerdel som definert og beskrevet i det foreliggende.

Det er nå blitt funnet at de normalt heterodimere glykoproteinhormoner beholder sine egenskaper i enkeltkjedeform, innbefattende enkeltkjedeformer som inneholder de forskjellige CTP-forlengelser og -innskudd beskrevet ovenfor.

Oppfinnelsen tilveiebringer enkeltkjedeformer av glykoproteinhormonene, idet i det minste en del av disse hormoner finnes i de fleste virveldyrarter. Enkeltkjedeformene ifølge oppfinnelsen kan enten være glykosylerte, delvis glykosylerte eller ikke-glykosylerte, og a- og B-kjedene (eller a og a eller B og B) som finnes i de naturlige glykoproteinhormoner eller varianter av disse, kan eventuelt være sammenbundet via en linkerdel. Spesielt foretrukne linkerdeler innbefatter den karboksyterminale peptid-(CTP)-enhet enten som en fullstendig enhet eller kun som en del av denne. De resulterende enkeltkjedehormoner bibeholder enten aktiviteten av den ikke-modifiserte heterodimere form, eller de er antagonister med hensyn til denne aktivitet.

Ved ett aspekt er oppfinnelsen således rettet mot agonist eller antagonist av glykoproteinhormonaktivitet, hvor agonisten eller antagonisten er glykosylert eller ikke-glykosylert protein, kjennetegnet ved at det fatter a-p, B-a eller B- B; hvor nevnte glykoproteinhormon er valgt fra gruppen bestående av follikelstimulerende hormon (FSH), luteiniseirngshormon (LH), koriongonadotropin (CG) og tyroideastimulerende hormon (TSH); hvor nevnte a og p eller p og P-subenheter er bundet sammen kovalent, eventuelt med en linker-enhet; hvor a representerer den native aminosyresekvensen av en a-subenhet felles for glykoproteinhormonene eller en variant derav, og p eller hver p uavhengig representerer p-subenheten av glykoproteinhormonet eller en variant derav, hvor varianten av nevnte a eller p-subenhet er en modifisert form av nevnte subenhet som inneholder 1-10 delesjoner eller substitusjoner, hvor nevnte substitusjoner er konservative substitusjoner, hvor nevnte linker er en hydrofil enhet som binder a og p eller p og p-subenhetene uten å interferere med aktiviteten derav, med det unntak at linkeren ikke omfatter et signalpeptid umiddelbart oppstrøms av nedstrøms subenheten; og hvor p-subenheten er en koriongonadotropin p-subenhet bundet til en a-subenhet, er linkeren fraværende, eller så består den ikke av en linker som har fra 1 til 16 aminosyrerester.

Ved andre aspekter er oppfinnelsen rettet mot rekombinante materialer og fremgangsmåter for fremstilling av enkeltkjedeproteinene ifølge oppfinnelsen, farmasøytiske blandinger som inneholder dem og antistoffer som er spesifikke for dem.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser konstruksjonen av et Sall-bundet DNA-fragment, hvor det tredje ekson i CGp sammenkoples med det andre ekson som koder for a-underenheten.

Fig. 2 viser aminosyresekvensen og nummereringen av posisjoner 112-145

i humant CGp.

Fig. 3 viser resultatene av en konkurransebindingsanalyse med hensyn til FSH-reseptor ved hjelp av forskjellige FSH-analoger. Fig. 4 viser resultatene av enkelttransduksjonsanalyse med hensyn til FSH-reseptor for forskjellige FSH-analoger.

Fire "glykoprotein"-hormoner hos mennesker utgjør en familie som innbefatter humant koriongonadotropen (hCG), follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH) og tyroideastimulerende hormon (TSH). Anvendt i det foreliggende angir "glykoproteinhormoner" medlemmene i denne familie, enten de finnes hos mennesker eller hos andre virveldyr. Alle disse hormoner er heterodimerer som består av a-underenheter som, for en gitt art, er identiske når det gjelder aminosyresekvens innenfor gruppen, og B-underenheter som er forskjellige med hensyn til medlemmet i familien. Normalt forekommer disse glykoproteinhormoner således som heterodimerer som består av a- og B-underenheter som er forbundet med hverandre, men ikke kovalent bundet. De fleste virveldyr danner FSH, TSH og LH; koriongonadotropin er bare blitt funnet hos primater, innbefattende mennesker, og hester. En spesifikk form av CG fra hester er blitt betegnet serumglykoprotein fra gravide merrer (PMSG).

Denne hormon-"kvartett" består således av heterodimerer hvor a- og B-underenhetene i hver er kodet i forskjellige gener og syntetiseres separat av verten. Verten setter så sammen de separat syntetiserte underenheter til et ikke kovalent sammenbundet heterodimerkompleks. På denne måte er heterodimerene i denne hormonkvartett forskjellig fra heterodimerer så som insulin, som syntetiseres ut fra et enkelt gen (i dette tilfelle med en inngripende "pro"-sekvens), og underenhetene er kovalent koplet ved anvendelse av disulfidbindinger. Denne hormonkvartetten er også forskjellig fra immunglobulinene som er sammensatt fra forskjellige steder, men som er kovalent bundet via disulfidbindinger. På den annen side holdes monellin, som imidlertid er et planteprotein, sammen via ikke-kovalent vekselvirkning mellom sine A- og B-kjeder. Det er ikke kjent på det nåværende tidspunkt om de to kjedene kodes på separate gener.

Mange forskjellige faktorer har således innvirkning på bestemmelse av oppførselen hos biologisk aktive forbindelser som er dimerer dannet av underenheter som er identiske eller forskjellige. Underenhetene kan være kovalent eller ikke-kovalent sammenbundet; de kan syntetiseres av de samme eller av forskjellige gener; og de kan i sin forløperform inneholde, eller ikke inneholde, en "pro"-sekvens som binder sammen de to elementer i dimeren. Basert på resultatene oppnådd med enkeltkjedeformene av glykoproteinhormonkvartetten i det foreliggende, er det åpenbart at enkeltkjedeformer av de biologisk aktive dimerer interleukin-12, interleukin-3 (IL-12 og IL-3), inhibin, tumornekrosefaktor (TNF) og transformerende vekstfaktor (TGF) også vil være biologisk aktive.

Enkeltkjedeformene av heterodimerene eller homodimerene har en rekke fordeler i forhold til deres dimere former. For det første er de generelt mer stabile. LH fremheves spesielt for sin ustabilitet og korte halveringstid. For det annet reduseres problemer med rekombinant dannelse siden bare et enkelt gen behøver å transkriberes, translateres og bearbeides. Dette er spesielt viktig når det gjelder ekspresjon i bakterier. For det tredje tilveiebringer de selvfølgelig en alternativ form hvorved det tillates finjustering av aktivitetsnivåer og halveringstider in vivo. Endelig er enkeltkjedeformer unike utgangsmaterialer for identifisering av avskårne former med dimerens aktivitet. Bindingen mellom underenhetene gjør mulig at proteinet kan oppbygges uten at den totale folding av proteinet forstyrres.

Trekk ved elementene i kvartetten

6-Underenheten av hCG er vesentlig større enn de andre p-underenheter ved at den inneholder omtrent 34 ytterligere aminosyrer i den C-terminale ende, omtalt i det foreliggende som den karboksyterminale del (CTP), som ved glykosylering i de O-bundne seter anses for å ha ansvaret for den forholdsvis lengre serumhalveringstid hos hCG sammenliknet med andre gonadotropiner (M. Matzuk et al., Endocrinol (1989) 126:376). I det naturlige hormon inneholder denne CTP-forlengelse fire mucinliknende O-bundne oligosakkarider.

Ved én utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse koples a- og p-kjedene i glykoproteinhormonene inn i et enkeltkjedeproteinmateriale hvor a- og B-kjeden er kovalent sammenbundet, eventuelt via en linkerdel. Linkerdelen kan innbefatte ytterligere aminosyresekvens, og spesielt kan CTP-enhetene beskrevet i det foreliggende med fordel innarbeides i linkeren. Linkeren kan dessuten innbefatte peptid- eller ikke-peptidlegemidler som kan siktes inn mot reseptorene for hormonene.

I tillegg til hode-til-hale-konfigurasjonen som kan oppnås ved at de to peptidkjedene ganske enkelt koples via en peptidbinding, kan a- og p-kjedene sammenbindes hode-til-hode eller hale-til-hale. Hode-til-hode- og hale-til-hale-koplinger innbefatter syntetisk kjemi hvor det anvendes standardteknikker til sammenbinding av to karboksyl- eller to aminogrupper via en linkerdel. For eksempel kan to aminogrupper sammenbindes via et anhydrid eller via hvilket som helst dikarboksylsyrederivat; to karboksylgrupper kan sammenbindes via diaminer eller dioler under anvendelse av standard-aktiveringsteknikker. Den mest foretrukne form er imidlertid en hode-til-hale-konfigurasjon hvor standard-peptidbindinger er tilstrekkelig, og enkeltkjedeforbindelsen kan fremstilles som et koplingsprotein, på rekombinant måte eller ved anvendelse av peptidsyntese-teknikker enten i en enkelt kjede eller fortrinnsvis ved ligering av individuelle deler av hele sekvensen. Hvis ønskelig kan selvfølgelig peptid- eller ikke-peptid-linkerdeler også anvendes i dette tilfelle, men dette er unødvendig, og lettheten ved rekombinant fremstilling av enkeltkjedeproteinet tyder på at utførelsesformer som tillater denne fremstillingsmetode, omfatter den langt mest foretrukne fremgangsmåte.

Når det anvendes en hode-til-hale-konfigurasjon, kan linkerne hovedsakelig bestå av en ytterligere peptidsekvens. Som tilfellet er når det gjelder heterodimerer, kan de to B-kjeder sammenbindes via en CTP-enhet, som beskrevet ytterligere nedenfor. Mulige utførelsesformer av oppfinnelsen innbefatter således, med den N-terminale del til venstre, a-FSHB, BFSH-a, a-BLH, a-CTP-BLH, BLH-CTP-a, CTP-BLH-CTP-a og liknende.

Enkeltkjedeformene av de heterodimere gonadotropiner eller glykoproteinkvartetten har også forbindelse med ytterligere viktige sett av utførelsesformer hvor man i stedet for å kople a- og B-underenhetene, kan kople sammen to B- eller to a-underenheter under dannelse av en enkeltkjedeforbindelse. Som for heterodimeren, kan koplingen være hode-til-hode, hode-til-hale, eller hale-til-hale.

Enkeltkjede-"to-B"-tandempeptidene er særlig egnede som antagonister for reseptorene som normalt aktiveres av de heterodimere glykoproteinhormoner. Siden a-underenheten antas i stor grad å være ansvarlig for signaloverføring, mens B-underenheten gir reseptorspesifisitet, og siden a- og B-underenhetene har lik form, bør enkeltkjedeforbindelsene spesifikt kunne bindes til en reseptor for hvilken det finnes minst én B-kjede, uten at reseptoren aktiveres.

Antagonistaktiviteten av enkeltkjede-"2-B"-tandempeptidene er delvis basert på heterodimerenes krystallstruktur. Det skal bemerkes at a- og B-kjedene har liknende cystinknuteformer og at en del av foldemønstrene hos de to kjeder er analoge.

Enkeltkjede-"to-p"-forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan utformes slik at de inneholder tandemkopier av den samme p-underenhet - d.v.s. FSHp-FSHP; HCGp-HCGp; TSHP-TSHp; eller LHp-LHP; eller det kan anvendes kimære enkeltkjedeforbindelser så som HCGp-FSHP; FSHp-LHP; LHB-TSHp og liknende. Det er totalt 12 slike mulige kombinasjoner. Dessuten forbedrer det karboksylterminale peptid (CTP) i HCGp-underenheten formen av enkeltkjedeforbindelsen når det er tilstede mellom de to P-kjeder. Dette er automatisk når HCG P er i oppstrømsdelen; i andre tilfeller er det imidlertid hensiktsmessig å anvende en CTP-underenhet som beskrevet i det foreliggende i den karboksylterminale ende av oppstrømsdelen. To slike CTP-enheter er også innenfor oppfinnelsens ramme. Foretrukne utførelsesformer innbefatter således FSHP-CTP-FSHP; FSHp-CTP-, CTP-FSHP; LHp-CTP-FSHp; LHB-CTP-CTP-FSHp og liknende.

Liknende beskrivelser gjelder "to-a"-enkeltkjedeforbindelsene, selvfølgelig bortsett fra at kimær-par ikke inngår bortsett fra når det gjelder a-varianter. Forskjellige linkere, fortrinnsvis CTP-baserte, og CTP-forlengelser inngår også.

Følgende definisjoner kan være nyttige ved beskrivelse av enkeltkjedeformene av molekylene.

Anvendt i det foreliggende har en a-underenhet, og FSH-, LH-, TSH- og CG-p-underenheter så vel som de heterodimere former generelt sine vanlige definisjoner og angir proteinene hvor aminosyresekvensene er kjent på området i seg selv, eller allelvarianter av disse, uansett hvilket glykosyleringsmønster de har.

"Naturlige" former av disse peptider er slike som har aminosyresekvensene isolert fra det aktuelle virveldyrvev, og som har disse kjente sekvenser i seg selv, eller deres allelvarianter.

"Varianf-former av disse proteiner er slike som har tilsiktede forandringer i aminosyresekvensen i det naturlige protein, frembrakt for eksempel ved setespesifikk mutagenese eller ved andre rekombinante manipuleringer, eller som fremstilles syntetisk.

Disse forandringer består av 1-10, fortrinnsvis 1-8, og mer foretrukket 1-5 aminosyreforandringer, innbefattende utelukkelser, innskudd og substitusjoner, mest foretrukket konservative aminosyresubstitusjoner som definert nedenfor. De resulterende varianter må bibeholde aktivitet som påvirker den tilsvarende aktivitet hos det naturlige hormon - d.v.s. at de må enten bibeholde den biologiske aktivitet hos det naturlige hormon direkte, eller de må oppføre seg som antagonister, vanligvis ved at de er i stand til å binde reseptorene for de naturlige hormoner, men mangler evnen til å bevirke signaloverføring. Det er for eksempel kjent at hvis glykosyleringssetet i posisjon 52 på a-underenheten fjernes ved aminosyre-substitusjon, hvorfor all glykosylering på dette sete forhindres, er hormonene som er heterodimerer med denne forandrede a-underenhet, vanligvis agonister, og er i stand til å binde reseptorer, hvorved det naturlige hormon forhindres fra å gjøre dette ved konkurranse. (På den annen side ser det ikke ut til at glykosyleringssetet i a-underenheten i posisjon 78 påvirker hormonenes aktivitet i noen stor grad). Andre forandringer når det gjelder aminosyresekvens kan også resultere i antagonist- i stedet for agonistaktivitet med hensyn til varianten.

Ett sett av foretrukne varianter er slike hvor glykosyleringssetene på enten a- eller B-underenhetene, eller begge, er blitt forandret. a-Underenheten inneholder to glykosyleringsseter, ett i posisjon 52 og det annet i posisjon 78, og virkningen av forandringer av disse seter på aktiviteten er nettopp blitt beskrevet. På liknende måte inneholder B-underenhetene vanligvis to N-bundne glykosyleringsseter (i posisjoner som varierer en del med beskaffenheten av B-kjeden), og liknende forandringer kan utføres i disse seter. CTP-forlengelsen av hCG inneholder fire O-bundne glykosyleringsseter, og konservative mutasjoner ved serin-restene (f.eks. omdannelse av serinet til alanin) ødelegger disse seter.. Ødeleggelse av de O-bundne glykosyleringsseter kan bevirke omdannelse av agonistaktivitet til antagonistaktivitet.

Endelig påvirker forandringer i aminosyresekvens som er proksimal til de N-bundne eller O-bundne glykosyleringsseter, beskaffenheten av glykosyleringen som finnes på det resulterende molekyl, og forandrer også aktiviteten.

Forandringer i aminosyresekvens innbefatter dessuten både innsettinger og utelukkelser. Avskårne former av hormonene inngår således blant varianter, f.eks. mutanter av a-underenheten som mangler noen, eller alle, av aminosyrene i posisjoner 85-92 i den C-terminale ende. Dessuten inngår det a-underenheter med 1-10 aminosyrer utelukket fra den N-terminale ende. En del nyttige varianter av hormonkvartetten beskrevet i det foreliggende er anført i US-patent 5 177 193, utstedt 5. januar 1993, og medtatt i det foreliggende som referanse. Som vist i dette, kan glykosyleringsmønstrene forandres ved ødeleggelse av de aktuelle seter, eller i alternativet, ved valg av vertscelle hvor proteinet fremstilles.

Som forklart ovenfor, er enkeltkjedeformene hensiktsmessige utgangsmaterialer for forskjellige oppbygde muteiner. Slike muteiner innbefatter slike som har ikke-kritiske regioner forandret eller fjernet. Slike utelukkelser og forandringer kan omfatte hele sløyfer, slik at sekvenser med vesentlig mer enn 10 aminosyrer kan utelukkes eller forandres. Enkeltkjedemolekylene må imidlertid bibeholde minst de reseptorbindende domener og/eller regionene som inngår ved signal-overføring.

Det er en betydelig mengde litteratur når det gjelder varianter av hormonkvartetten beskrevet i det foreliggende, og det fremgår av denne litteratur at det kan fremstilles et stort antall mulige varianter som både resulterer i agonist- og antagonistaktivitet. Slike varianter er for eksempel beskrevet i F. Chen et al. Molec. Endocrinol. (1992) 6:914-919; J. Yoo et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:13034-13042; J. Yoo et al. J. Biol. Chem. (1991)266:17741-17743; D. Puett et al. Glycoprotein Hormones, J.W. Lusbader et al. RED, Springer Verlag New York (1994) 122-134; H.T. Kuetmann et al. (samme sted) sider 103-117; LD. Erickson et al. Endocrinology (1990) 126:2555-2560; og M. Bielinska et al. J. Cell. Biol. (1990) 111:330a (Abstract 1844).

Som beskrevet i det foregående, er én fremgangsmåte for konstruering av effektive antagonister, å fremstille et enkeltkjedemolekyl inneholdende to B-underenheter av det samme eller forskjellig element i glykoproteinkvartetten. Spesielt foretrukne varianter av disse enkeltkjedeformer innbefatter slike hvor én eller flere cystinbinding(er) er utelukket, typisk ved at ett eller begge cysteinene som inngår i bindingen, erstattes med en nøytral aminosyre. Spesielt foretrukne cystinbindinger som kan utelukkes, er bindinger mellom posisjonene 26 og 110 og mellom posisjonene 23 og 72.

Det er dessuten blitt vist at p-underenhetene i hormonkvartetten kan konstrueres i kimærformer for tilveiebringelse av biologiske funksjoner av begge komponenter i kimærene, eller generelt, hormoner med forandret biologisk funksjon. Kimærmolekyler som både oppviser FSH- og LH/CG-aktiviteter, kan således konstrueres som beskrevet av Moyle, Proe. Nati. Acad. Sei. (1991) 88:760-764; Moyle, Nature (1994) 368:251-255. Som beskrevet i disse publikasjoner, gir innsetting av aminosyrer 101-109 av FSH-p i stedet for de tilsvarende rester i CG-p-underenheten, en analog til både hCG- og FSH-aktiviteten.

Disse kimærformer av B-underenheter kan også anvendes i enkeltkjede-forbindelsene som kopler to B-underenheter i et enkelt molekyl.

Skjønt man er klar over at glykosyleringsmønsteret har en dyptgående innvirkning på aktiviteten både kvalitativt og kvantitativt, angir betegnelsene FSH-, LH-, TSH- og CG-B-underenheter for lettvinthets skyld aminosyresekvensegen-skapene hos peptidene, og likeså "a-underenhet". Når det bare henvises til B-kjeden, vil betegnelsen for eksempel være FSHB; når det vises til heterodimeren, vil den enkle betegnelse "FSH" bli anvendt. Det vil være klart ut fra sammenhengen på hvilken måte glykosyleringsmønsteret påvirkes for eksempel av rekombinant ekspresjonsvert eller forandring i glykosyleringssetene. Former av glykoproteinet med spesifiserte glykosyleringsmønstre vil bli anmerket på denne måte.

I det foreliggende anvendes "peptid" og "protein" om hverandre, siden lengdeforskjellen mellom dem er vilkårlig.

I enkeltkjedeformene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan a- og/eller B-kjeden inneholde en CTP-forlengelse innført i en ikke-kritisk region.

"Ikke-kritiske" regioner i a- og B-underenhetene er de regioner i molekylene som ikke er nødvendige for biologisk aktivitet (innbefattende agonist- og antagonistaktivitet). Disse regioner fjernes vanligvis fra bindingsseter, forløper-spaltingsseter og katalytiske regioner. Regioner som er kritiske for bevirking av riktig folding, binding til reseptorer, katalytisk aktivitet og liknende, bør unngås; likeledes bør regioner som er kritiske når det gjelder sikring av proteinets tredimensjonale form, unngås. Det skal bemerkes at noen av regionene som er kritiske når det gjelder dimeren, blir ikke-kritiske i enkeltkjedeformene, siden den formmessige begrensning som utgjøres av enkeltkjeden, kan gjøre at disse regioner blir unødvendige. Forvissingen om ikke-kritiske regioner kan lett skje ved utelukkelse eller modifisering av aktuelle regioner og utførelse av en hensiktsmessig analyse med hensyn til den ønskede aktivitet. Regioner hvor modifikasjoner resulterer i tap av aktivitet, er kritiske; regioner hvor forandringen resulterer i den samme eller liknende aktivitet (innbefattende antagonistaktivitet) anses som ikke-kritiske.

Det skal understrekes at det med "biologisk aktivitet" menes aktivitet som enten er agonistisk eller antagonistisk i forhold til aktiviteten av de naturlige hormoner. Visse regioner er således kritiske for en variants oppførsel som antagonist, selv om antagonisten ikke er i stand til direkte å tilveiebringe hormonets fysiologiske effekt.

Når det for eksempel gjelder a-underenheten, anses posisjonene 33-59 for å være nødvendige for signaloverføring, og området i den karboksyterminale ende på 20 aminosyrer er nødvendig for signaloverføring/reseptorbinding. Rester som er kritiske med hensyn til sammensetting med B-underenheten, innbefatter minst restene 33-58, spesielt 37-40.

Når den ikke-kritiske region er "proksimal" til den N- eller C-terminale ende, er innskuddet på hvilket som helst sted innenfor 10 aminosyrer i den terminale ende, fortrinnsvis innenfor 5 aminosyrer, og mest foretrukket i selve enden.

Vanligvis anvendes "proksimal" for angivelse av en posisjon som er innenfor 10 aminosyrer, fortrinnsvis innenfor 5 aminosyrer, i forhold til en referanse-posisjon, og mest foretrukket i selve referanseposisjonen. Visse varianter kan således inneholde substitusjoner av aminosyrer "proksimalt" til et glykosyleringssete; definisjonen er aktuell her. Dessuten kan a- og B-underenhetene bindes til hverandre i stillinger "proksimalt" til sine N- eller C-terminale ender.

Anvendt i det foreliggende angir "CTP-enheten" en aminosyresekvens som finnes i den karboksyterminale ende av B-underenheten i humant koriongonadotropin som strekker seg fra aminosyre 112-118 til rest 145 i den C-terminale ende eller til en del av denne. Hver "fullstendig" CTP-enhet inneholder således 28-34 aminosyrer, avhengig av den N-terminale ende av CTP. Den naturlige sekvens i posisjoner 112-145 er vist på fig. 2.

Med en "delvis" (eller "del")-CTP-enhet menes en aminosyresekvens som befinner seg mellom posisjonene fra 112-118 til og med 145, men som har minst én aminosyre utelukket fra den kortest mulige "fullstendige" CTP-enhet (d.v.s. fra posisjonene 118-145). "Del"-CTP-enhetene som inngår ved oppfinnelsen, inneholder fortrinnsvis minst ett O-glykosyleringssete hvis agonistaktivitet er ønskelig. En del ikke-glykosylerte former av hormonene er antagonister og er egnet som sådanne. CTP-enheten inneholder fire slike seter ved serinrestene i posisjonene 121 (sete 1); 127 (sete 3); 132 (sete 3); og 138 (sete 4). Delformene av CTP som er egnet i agonister ifølge oppfinnelsen, vil inneholde ett eller flere av disse seter anordnet i den rekkefølge i hvilken de forekommer i den naturlige CTP-sekvens. "Del"-CTP-enheten som anvendes i agonister ifølge oppfinnelsen, kan således innbefatte alle fire glykosyleringsseter; setene 1,2 og 3; setene 1, 2 og 4; setene 1, 3 og 4; setene 2, 3 og 4; eller ganske enkelt setene 1 og 2; 1 og 3; 1 og 4; 2 og 3;

2 og 4; eller 3 og 4; eller de kan inneholde bare ett av setene 1,2,3 eller 4.

Med <n>tandem"-innskudd eller -forlengelser menes at innskuddet eller forlengelsen inneholder minst to "CTP-enheter". Hver CTP-enhet kan være fullstendig eller et fragment, og naturlig eller en variant. Alle CTP-enhetene i tandemforlengelsen eller -innskuddet kan være identiske, eller de kan være forskjellige fra hverandre. Tandemforlengelsen eller -innskuddet kan således for eksempel generisk være delvis-fullstendig; delvis-delvis; delvis-fullstendig-delvis; fullstendig-fullstendig-delvis, og liknende, hvor hver av de angitte delvise eller fullstendige CTP-enheter uavhengig kan være enten en variant eller den naturlige sekvens.

"Linkerdelen" er en del som binder sammen a- og B-sekvensen uten å innvirke på aktiviteten som de samme a- og p-kjeder ellers ville utøve som elementer i en heterodimer, eller som forandrer denne aktivitet slik at den omdannes fra agonist- til antagonistaktivitet. Aktivitetsnivået kan forandres innenfor et rimelig område, men tilstedeværelse av linkeren kan ikke være slik at enkeltkjedeformen berøves både hovedsakelig agonist- og hovedsakelig antagonistaktivitet. Enkeltkjedeformen må forbli som enkeltkjedeform når den gjenvinnes fra dannelsesmediet, og den må ha en aktivitet som er i overensstemmelse med hormonaktiviteten hos heterodimeren, hvis elementer danner komponentene i den.

Varianter

Hormonunderenhetene og CTP-enhetene kan svare nøyaktig til den naturlige hormon- eller CTP-sekvens, eller de kan være varianter. Beskaffenheten av variantene er blitt definert i det foregående. I slike varianter er 1-10, fortrinnsvis 1-8, og mest foretrukket 1-5, av aminosyrene som finnes i den naturlige sekvens, erstattet med en annen aminosyre i forhold til den naturlige aminosyre i denne posisjon, eller 1-10, mer foretrukket 1-8, og mest foretrukket 1-5 aminosyrer er ganske enkelt utelukket, eller kombinasjoner av disse. Når ikke-kritiske regioner av enkeltkjedeformene identifiseres, spesielt ved påvisning av tilstedeværelse av ikke-kritiske "sløyfer", kan antallet aminosyrer som forandres ved utelukkelse eller substituering, som påpekt ovenfor, økes til 20 eller 30 eller hvilket som helst vilkårlig antall, avhengig av lengden av aminosyresekvensen i den aktuelle ikke-kritiske region. Utelukkelse eller substitusjoner i mer enn én ikke-kritisk region resulterer selvfølgelig i at enda større antall aminosyrer i enkeltkjedeformene påvirkes, og substitusjons- og utelukkelsesstrategier kan anvendes i kombinasjon. Substitusjonene eller utelukkelsene som anvendes kumulativt, resulterer ikke i noen vesentlig eliminering av agonist- eller antagonistaktiviteten som er bundet til hormonet. Substitusjoner med konservative analoger til den naturlige aminosyre er foretrukket.

"Konservativ analog" angir i vanlig betydning en analog hvor den substituerte rest er i den samme generelle aminosyreklasse som den som er substituert. Aminosyrer er blitt klassifisert i slike grupper, noe som er beskrevet på området, for eksempel av M. Dayhoff et al. i Atlas of Protein Sequences and Structure (1972) 5:89-99. Sure aminosyrer faller generelt i én gruppe; basiske aminosyrer i en annen; nøytrale hydrofile aminosyrer i en annen; og så videre.

Mer spesifikt kan aminosyrerester generelt underklassifiseres i fire hoved-underklasser som følger: Sure: Resten har negativ ladning på grunn av tap av hydrogen-ion ved fysiologisk pH, og resten tiltrekkes av vandig løsning slik at den søker overflateposisjonene i strukturen i et peptid hvor den finnes, når peptidet er i vandig medium ved fysiologisk pH.

Basiske: Resten har positiv ladning på grunn av tilknytning til hydrogen-ion ved fysiologisk pH, og resten tiltrekkes av vandig løsning slik at den søker overflateposisjonene i en peptidstruktur som den finnes i, når peptidet er i vandig medium ved fysiologisk pH.

Nøytrale/ikke-polare: Restene er ikke ladet ved fysiologisk pH, og resten avstøtes av vandig løsning slik at den søker de indre posisjoner i strukturen i et peptid hvor den finnes, når peptidet er i vandig medium. Disse rester er også betegnet "hydrofobe" i det foreliggende.

Nøytrale/polare: Restene er ikke'ladet ved fysiologisk pH, men resten tiltrekkes av vandig løsning slik at den søker de ytre posisjoner i strukturen i et peptid hvor den finnes, når peptidet er i vandig medium.

Det er selvfølgelig underforstått at når det gjelder en statistisk samling av individuelle restmolekyler, vil noen molekyler være ladet, og noen ikke, og det vil være en tiltrekning til, eller frastøting fra, et vandig medium i større eller mindre grad. For at definisjonen "ladet" skal passe, er en betydelig prosentandel (minst ca. 25%) av de individuelle molekyler ladet ved fysiologisk pH. Graden av tiltrekking eller frastøting som er nødvendig for klassifisering som polar eller ikke-polar, er vilkårlig, og aminosyrer som er spesifikt påtenkt ved oppfinnelsen, er derfor blitt klassifisert som den ene eller andre. De fleste aminosyrer som ikke er spesifikt angitt, kan klassifiseres på basis av kjent oppførsel.

Aminosyrerester kan videre underklassifiseres som sykliske eller ikke-sykliske, og aromatiske eller ikke-aromatiske, selvinnlysende klassifiseringer med hensyn til sidekjedesubstituentgruppene på restene, og som små eller store. Resten anses som liten hvis den inneholder totalt 4 karbonatomer eller mindre, innbefattende karboksylkarbonatomet. Små rester er selvfølgelig alltid ikke-aromatiske.

Når det gjelder de naturlig forekommende proteinaminosyrer, er underklassifisering ifølge forannevnte system som følger.

Sure: Asparaginsyre og glutaminsyre;

Basiske/ ikke- svkliske: Arginin, lysin;

Basisk/ syklisk: Histidin;

Nøytrale/ polare/ små: Glycin, serin, cystein;

Nøvtral/ ikke- polar/ liten: Alanin;

Nøvtrale/ polare/ store/ ikke- aromatiske: Treonin, asparagin, glutamin; Nøytral/ polar/ stor/ aromatisk: Tyrosin;

Nøytrale/ ikke- polare/ store/ ikke- aromatiske: Valin, isoleucin, leucin, metionin; Nøytrale/ ikke- polare/ store/ aromatiske: Fenylalanin og tryptofan.

Den gen-kodede sekundære aminosyre prolin er, skjønt den teknisk er innenfor gruppen nøytral/ikke-polar/stor/syklisk og ikke-aromatisk, et spesialtilfelle på grunn av sine kjente effekter på sekundærformen av peptidkjedene, og inngår derfor ikke i denne definerte gruppe.

Hvis enkeltkjedeproteinene ifølge oppfinnelsen er oppbygd ved hjelp av rekombinante metoder, vil de inneholde bare gen-kodede aminosyresubstitusjoner; hvis en del imidlertid er syntetisert ved standard-syntesemetoder, for eksempel fastfase-peptidsyntesemetoder, og ligert, for eksempel enzymatisk, i det gjenværende protein, kan ikke-genkodede aminosyrer, så som aminoisosmørsyre (Aib), fenylglycin (Phg) og liknende også innsettes i stedet for sine analoge motparter.

Disse ikke-kodede aminosyrer innbefatter også for eksempel B-alanin (B-Ala), eller andre omega-aminosyrer, så som 3-aminopropionsyre, 4-aminosmør-syre og så videre, sarkosin (Sar), ornitin (Orn), citrullin (Cit), t-butylalanin (t-BuA), t-butylglycin (t-BuG), N-metylisoleucin (N-Melle) og cykloheksylalanin (Cha), norleucin (Nie), cysteinsyre (Cya), 2-naftylalanin (2-Nal); 1,2,3,4-tetrahydriso-kinolin-3-karboksylsyre (Tic); merkaptovalerinsyre (Mvl); B-2-tienylalanin (Thi); og metioninsulfoksyd (MSO). Disse faller også hensiktsmessig i spesielle klasser.

Basert på ovenstående definisjoner er

Sar og B-Ala og Aib nøytrale/ikke-polare/små;

t-BuA, T-BuG, N-Melle, Nie, Mvl og Cha nøytrale/ikke-polare/store/ikke-aromatiske;

Orn er basisk/ikke-syklisk;

Cya er sur;

Cit, Acetyl-Lys og MSO er nøytrale/polare/store/ikke-aromatiske; og

Phg, Nal, Thi og Tic er nøytrale/ikke-polare/store/aromatiske.

De forskjellige omega-aminosyrer er klassifisert ifølge størrelse som nøytrale/ikke-polare/små (B-Ala, d.v.s. 3-aminopropionsyre, 4-aminosmørsyre) eller store (alle andre).

Andre aminosyresubstitusjoner enn slike som kodes i genet, kan således også innarbeides i peptidforbindelser innenfor oppfinnelsens ramme, og kan klassifiseres innenfor dette generelle system i henhold til sin struktur.

Foretrukne utførelsesformer av enkeltkjede- hormonene

Enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen fremstilles på den mest effektive og økonomiske måte ved anvendelse av rekombinante teknikker. Slike former av a- og B-kjedene, CTP-enhetene og andre linkerdeler som bare innbefatter gen-kodede aminosyrer, er derfor foretrukket. Det er imidlertid mulig, som angitt ovenfor, å konstruere i det minste deler av enkeltkjedehormonene ved anvendelse av teknikker for peptidsyntese eller andre organiske synteseteknikker, og derfor er varianter som inneholder ikke-genkodede aminosyrer, også innenfor oppfinnelsens ramme.

Ved de mest foretrukne utførelsesformer av enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen er den C-terminale ende av B-underenheten kovalent bundet,

eventuelt via en linker, til den N-terminale ende av den ferdige ct-underenhet;

former hvor den C-terminale ende av a-underenheten er bundet til den N-terminale ende av B-underenheten, er også egnet, men disse kan ha mindre aktivitet enten som antagonister eller agonister til den aktuelle reseptor. Bindingen kan være en direkte peptidbinding hvor den C-terminale aminosyre i én underenhet er direkte bundet via peptidbindingen til den N-terminale ende av den andre; i mange tilfeller er det imidlertid foretrukket å innarbeide en linkerdel mellom de to ender. I mange tilfeller vil linkerdelen gi minst én B-omgang mellom de to kjeder. Tilstedeværelse av prolinrester i linkeren kan derfor være fordelaktig.

Som beskrevet ovenfor, kan den N-terminale ende av a-kjeden også koples

til den N-terminale ende av B-kjeden eller den C-terminale ende av a-kjeden til den C-terminale ende av B-kjeden i hvert fall via en linkerenhet; liknende kombina-

sjoner er innbefattet i enkeltkjedeformene som omfatter to a- eller to B-underenheter.

Det bør være klart at ved omtale av bindinger mellom endene av underenhetene som omfatter enkeltkjedeformene, kan én eller flere ender forandres ved substituering og/eller utelukkelse, som beskrevet ovenfor.

Foretrukne utførelsesformer av enkeltkjedeforbindelsene som inneholder to p-underenheter, er slike hvor den C-terminale ende av én enhet er bundet til den N-terminale ende av den andre, eventuelt via en linker, fortrinnsvis en peptid-

linker. Bindinger mellom de N-terminale ender av de to p-kjeder eller bindinger mellom de C-terminafe ender av to de p-kjeder er også mulig, som beskrevet ovenfor; i disse tilfeller trenges det selvfølgelig en linker.

Skjønt hode-til-hode-, hale-til-hale- og hode-tii-hale-konfigurasjonene både

av enkeltkjedeheterodimer- og enkeltkjede-to-p-underenhetsformen er blitt beskrevet, kan bindingen mellom de to underenheter også forekomme i posisjoner som ikke er, nøyaktig i den N- eller C-terminale ende av hvert element, men i posisjoner som er proksimale til disse.

Ved ett spesielt foretrukket sett av utførelsesformer er bindingen hode-til-

hale, og linkerdelen vil innbefatte én eller flere CTP-enheter og/eller varianter eller avskårne former av disse. Foretrukne former av CTP-enhetene som anvendes i slike linkerdeler, er beskrevet i det følgende.

Videre kan linkerdelen innbefatte et legemiddel som er kovalent, fortrinnsvis på en frigjørbar måte, bundet til linkerdelen. Hjelpemidler for kopling av legemidlet til linkerdelen og for tilveiebringelse av frigjøring av det er vanlige.

I tillegg til at CTP og dets varianter og avskårne former forekommer i linkerdelen, kan de også innføres i hvilken som helst ikke-kritisk region i underenhetene som utgjør enkeltkjedehormonet. Beskaffenheten av disse innførte materialer, og posisjonene for dem, er beskrevet detaljert i opphavspatent-søknaden i det foreliggende.

Skjønt CTP-enheter er foretrukne innskuddsmaterialer i linkerdelen, er det underforstått at linkeren kan være hvilket som helst egnet kovalent bundet materiale som gir det hensiktsmessige rom-messige forhold mellom a- og B-underenhetene. Når det gjelder hode-til-hale-konfigurasjoner, kan linkeren således vanligvis være et peptid som omfatter et vilkårlig antall, men typisk under 100, mer foretrukket under 50, aminosyrer som har det riktige hydrofilitets/hydrofobitets-forhold, under tilveiebringelse av den hensiktsmessige avstand og utforming i løsning. Linkeren bør vanligvis i det store og hele være hydrofil slik at den kan være i den omgivende løsning og utenfor vekselvirkningen mellom a- og B-underenhetene eller de to p-underenheter. Det er foretrukket at linkeren innbefatter B-omganger som typisk tilveiebringes av prolinrester. Hvilken som helst egnet polymer, innbefattende peptidlinkere, med de ovenfor beskrevne riktige egenskaper, kan anvendes.

Én spesiell linkerdel som ikke inngår innenfor rammen av oppfinnelsen, er den som innbefatter et signalpeptid umiddelbart oppstrøms for nedstrømsunder-enheten.

Spesielt foretrukne utførelsesformer av enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen innbefatter: BFSH-a; BFSH-BFSH; BFSH-BLH;

pLH-a; pLH-pLH; <p>LH-PFSH;

pTSH-a; pTSH-<p>TSH; <p>TSH-PFSH;

<p>CG-a; P-CG-P-CG; <p>CG-<p>FSH; pCG-pTSH;

pFSH-CTP-a; pFSH-CTP-pFSH; pFSH-CTP-pLH;

pLH-CTP-a; PLH-CTP-pLH; pLH-CTP-PFSH;

pCG-CTP-a; PFSH-CTP-CTP-pLH;

pFSH-CTP-CTP-a; pFSH-CTP-CTP-pTSH;

BLH-CTP-CTP-a; BLH-CTP-CTP-BLH;

BCG-CTP-CTP-a; BCGrCTP-CTP-6LH;

a-a; a-CTP-a; og a-CTP-CTP-a

og liknende. Spesielt foretrukket er også humanformene av underenhetene. I ovennevnte konstruksjoner angir "CTP" CTP eller dets varianter eller avskårne former, som forklart ytterligere i avsnittet nedenfor.

Foretrukne utførelsesformer av CTP- enheter

Notasjonen som anvendes for CTP-enhetene ifølge oppfinnelsen, er som følger: for deler av den fullstendige CTP-enhet er posisjonene som inngår i delen, angitt ved sitt tall på fig. 2 i det foreliggende. Hvor det finnes substitusjoner, er den substituerte aminosyre angitt sammen med en indeks som angir posisjonen for den. Således representerer for eksempel CTP (120-143) den del av CTP som strekker seg fra posisjonene 120 til 143, CTP (120-130; 136-143) representerer en koplet aminosyresekvens som mangler posisjonene 118-119,131-135 og 144-145 i den naturlige sekvens. CTP (Arg<122>) angir en variant hvor lysinet i posisjon 122 er substituert med arginin; CTP (Ile<134>) angir en variant hvor leucinet i posisjon 134 er substituert med isoleucin. CTP (Val128Val143) representerer en variant hvor det er blitt gjort to substitusjoner, én for leucinet i posisjon 128 og den andre for isoleucinet i posisjon 142. CTP (120-143; lle<128>Ala<1>^°) representerer den aktuelle del av CTP-enheten hvor de to angitte substitusjoner er blitt gjort.

Blant varianter av CTP er slike hvor ett eller flere av de O-bundne glykosyleringsseter er blitt forandret eller utelukket, også foretrukket. Én spesielt foretrukket måte til forandring av setet for forhindring av glykosylering er. substituering av serinresten med en alaninrest i disse seter.

CTP-enhetene med følgende formler er spesielt foretrukket:

Nr. 1 CTP (116-132)

Nr. 2- CTP (118-128); 130-135)

Nr. 3 CTP (117-142)

Nr. 4 CTP (116-130) Nr. 5 CTP (116-123; 137-145)

Nr. 6 CTP (115-133; 141-145)

Nr. 7 CTP (117-140, Ser123Gln140)

Nr. 8 CTP (125-143, Ala<130>)

Nr. 9 CTP (135-145, Giu139)

Nr. 10 CTP (131-143, Val142Val<143>)

Nr. 11 CTP (118-132)

Nr. 12 CTP (118-127)

Nr. 13 CTP (118-145)

Nr. 14 CTP (115-132)

Nr. 15 CTP (115-127)

Nr. 16 CTP (115-145)

Nr. 17 CTP (112-145)

Nr. 18 CTP (112-132)

Nr. 19 CTP (112-127)

Foretrukne utførelsesformer av a- oa 3- underenhetene

De naturlige former av a- og B-underenhetene i enkeltkjedeformen er selvfølgelig blant de foretrukne utførelsesformer. Visse varianter er imidlertid også foretrukket.

Spesielt er varianter av a-underenheten hvor det N-bundne glykosyleringssete i posisjon 52 er eliminert eller forandret ved aminosyresubstitusjoner i dette sete eller proksimalt til dette foretrukket når det gjelder antagonist-aktivitet. Liknende modifikasjoner på glykosyleringssetet i posisjon 78 er også foretrukket. Utelukkelse av én eller flere aminosyrer i posisjoner 85-92 påvirker også beskaffenheten av aktiviteten av hormoner som inneholder a-underenheten, og substituering eller utelukkelse av minosyrer i disse posisjoner er også blant de foretrukne utførelsesformer.

Likeledes kan de N-bundne glykosyleirngsseter i B-kjeden hensiktsmessig modifiseres under eliminering av glykosylering, og således påvirke B-kjedenes agonist- eller antagonist-aktivitet. Hvis CTP er tilstede, enten naturlig som i CG eller ved at det er tilstede som linker, kan de O-bundne glykosyleringsseter i denne del også forandres.

Spesielle varianter som inneholder modifiserte eller utelukkede glykosyleringsseter, er beskrevet i J. Yoo et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:13034-13042; J. Yoo et al. J. Biol. Chem. (1991) 266:17741-17743; og M. Bielinska et al. J. Cell. Biol. (1990) 111:330a (alle omtalt ovenfor) og i M.M. Matzuk et al. J. Biol. Chem. (1989) 264:2409-2414; J.L. Keene et al. J. Biol. Chem. (1989) 264:4769-4775; og J.L. Keene et al. Mol Endocrinol (1989) 3:2011-2017.

Ikke bare kan selve glykosyleringssetene modifiseres direkte, men posisjoner som er proksimale til disse seter, modifiseres preferensielt slik at mutantens glykosylerings-tilstand vil bli påvirket. Når det gjelder a-underenheten, er for eksempel varianter hvor aminosyrer mellom posisjonene 50-60 er substituert, innbefattende både konservative og ikke-konservative substitusjoner, begunstiget, særlig substitusjoner i stillingene 51, 53 og 55 på grunn av deres nærhet til glykosyleringssetet ved Asn52.

Mutanter av a-underenheten hvor lysin i posisjon 91 er utbyttet med metionin eller glutaminsyre, er også foretrukket.

Skjønt variantene er blitt omtalt med hensyn til variasjoner i de individuelle underenheter ovenfor, vil man huske at enkeltkjedeformene av dimeren gir ytterligere modifikasjonsmuligheter. Spesifikt vil regioner som er kritiske når det gjelder folding av dimeren, kanskje ikke være avgjørende for den riktige utforming av enkeltkjedemolekylet, og disse regioner er tilgjengelige for variasjon i enkeltkjedeformen, skjønt det ikke er beskrevet ovenfor med hensyn til individuelle elementer i dimer-formene. Videre kan enkeltkjedeformene modifiseres dramatisk når det gjelder ikke-kritiske regioner hvis forandring og/eller utelukkelse ikke påvirker den biologiske aktivitet som beskrevet ovenfor.

Egnede legemidler

Egnede legemidler som kan inngå i linkerdelen, innbefatter peptider eller proteiner så som insulin liknende vekstfaktorer; epidermale vekstfaktorer; sure og basiske fibroblastvekstfaktorer; blodplateavledede vekstfaktorer; de forskjellige kolonistimulerende faktorer, så som granulocytt-CSF, makrofag-CSF og liknende; så vel som de forskjellige cytokiner så som IL-2, IL-3 og den overveldende mengde av ytterligere interleukinproteiner; de forskjellige interferoner; tumornekrosefaktor; og liknende. Peptid- eller proteinbaserte legemidler har den fordel at de kan innarbeides i enkeltkjeden, og hele konstruksjonen kan lett dannes ved rekombinant ekspresjon av et enkelt gen. Småmolekylære legemidler så som antibiotika, anti-inflammatoriske midler, toksiner og liknende kan også anvendes.

Legemidlene som inngår i linkerdelen, vil vanligvis være slike som man ønsker skal virke i nærheten av reseptorene som hormonene vanligvis bindes til. Egnet tilveiebringelse av frigjøring av legemidlet fra inneslutning i linkeren vil bli tilveiebrakt for eksempel ved at det også innesluttes seter for enzymkatalysert lysering, som beskrevet ytterligere under avsnittet med overskriften Fremstillingsmetoder nedenfor.

Andre modifikasjoner

Enkeltkjedeproteinene ifølge oppfinnelsen kan videre konjugeres eller derivatiseres på måter som man vanligvis er klar over derivatiserer aminosyre-sekvenser, så som fosforylering, glykosylering, deglykosylering av vanligvis glykosylerte former, modifisering av aminosyresidekjedene (f.eks. omdannelse av prolin til hydroksyprolin) og liknende modifikasjoner analoge til de post-translasjonstilfeller som er blitt funnet å forekomme vanligvis.

Glykosyleringstilstanden for hormonene ifølge oppfinnelsen er spesielt viktig. Hormonene kan fremstilles i ikke-glykosylert form enten ved at de fremstilles i prokaryote verter eller ved at glykosyleringssetene som normalt er tilstede i underenhetene, og/eller eventuelle CTP-enheter som kan være tilstede, muteres. Både ikke-glykosylerte former og delvis glykosylerte former av hormonene kan fremstilles ved manipulering av glykosyleringssetene. Normalt innbefattes selvfølgelig også glykosylerte former innenfor rammen av oppfinnelsen.

Som generelt kjent på området, kan enkeltkjedeproteinene ifølge oppfinnelsen også koples til merkematerialer, bærere, faste bærere og liknende, avhengig av den ønskede anvendelse. De merkede former kan anvendes til å oppspore deres metabolske vei; egnede merkematerialer for dette formål innbefatter særlig radioisotopmerkematerialer så som jod 131, technetium 99, indium 111 og liknende. Merkematerialene kan også anvendes til formidling av påvisning av enkeltkjedeproteinene i analysesystemer; i dette tilfelle kan radioiso- - toper også anvendes, så vel som enzymmerkematerialer, fluorescens-merkematerialer, kromogene merkematerialer og liknende. Anvendelse av slike merkematerialer er spesielt nyttig for disse proteiner, siden de er målsøkings-midlenes reseptorligand.

Proteinene ifølge oppfinnelsen kan også koples til bærere for forbedring av immunogeniteten av dem ved fremstilling av antistoffer som er spesifikt immunreaktive med disse nye modifiserte former. Egnede bærere for dette formål innbefatter "keyhole-limpef-hemocyanin (KLH), bovint serumalbumin (BSA) og difteritoksoid, og liknende. Standard-koplingsteknikker for binding av de modifiserte peptider ifølge oppfinnelsen til bærere, innbefattende anvendelse av bifunksjonelle linkere, kan anvendes.

Liknende bindingsteknikker, sammen med andre, kan anvendes for kopling av proteinene ifølge oppfinnelsen til faste bærere. Når disse proteiner er koplet, kan de så anvendes som affinitetsreagenser for separering av ønskede komponenter med hvilke det skjer spesifikk reaksjon.

Fremstillinasmetoder

Metoder for oppbygging av proteinene ifølge oppfinnelsen er velkjente på området. Hvis det bare inngår gen-kodede aminosyrer, og enkeltkjeden er i hode-til-hale-konfigurasjon, er, som omtalt ovenfor, den mest praktiske fremgangsmåte på det nåværende tidspunkt å syntetisere disse materialer rekombinant ved ekspresjon av DNA som koder for det ønskede protein. DNA inneholdende nukleotidsekvensen som koder for enkeltkjedeformene, innbefattende varianter, kan fremstilles av naturlige sekvenser. Teknikker for seterettet mutagenese, ligering av ytterligere sekvenser, PCR og konstruering av egnede ekspresjonssystemer er alle allerede velkjente på området. Deler av hele DNA som koder for det ønskede protein, kan oppbygges syntetisk under anvendelse av standard fast-faseteknikker, fortrinnsvis for innarbeidelse av restriksjonsseter for å gjøre ligeringen lett. Egnede kontrollelementer for transkripsjon og translasjon av den innarbeidede kodingssekvens kan tilveiebringes for de DNA-kodende sekvenser. Som velkjent, er det nå tilgjengelig ekspresjonssystemer som er forenlige med mange forskjellige verter, innbefattende prokaryote verter så som bakterier, og eukaryote verter så som gjærsopp, planteceller, insektceller, pattedyrceller, fugleceller og liknende.

Valg av vert er spesielt for post-translasjonelle tilfeller, mest spesielt innbefattende glykosylering. Glykosyleringssetet reguleres hovedsakelig ved beskaffenheten av glykosyleringssetene i molekylet; beskaffenheten av sukker-typene som opptar dette sete, reguleres imidlertid i stor grad ved vertens beskaffenhet. Det kan følgelig oppnås en finregulering av egenskapene hos hormonene ifølge oppfinnelsen ved riktig valg av vert.

En spesielt foretrukket genform for a-underenhetsdelen, enten a-underenheten er modifisert eller ikke-modifisert, er "minigen"-konstruksjonen.

Anvendt i det foreliggende angir a-underenhet-"minigenet" genkonstruksjonen beskrevet i M.M. Matzuk et al, Mol. Endocrinol. (1988) 2:95-100, i beskrivelsen av konstruksjonen av pM<2>/CG a eller pM<2>/a. Dette "minigen" er karakterisert kun ved retensjon av inkonsekvensen mellom ekson 3 og ekson 4, idet alle oppstrømsintroner er blitt utelukket. I den spesielle beskrevne konstruksjon tilføres den N-terminale kodingssekvens som avledes fra ekson 2, og en del av ekson 3, fra cDNA og ligeres direkte via et Xbal-restriksjonssete i kodingssekvensen for ekson 3 slik at intronene mellom eksoner I og II og mellom eksoner II og III er fraværende. Intronet mellom eksonene III og IV så vel som signalene 3' for kodingssekvensen beholdes imidlertid. Det resulterende minigen kan hensiktsmessig innføres som et BamHI/Bglll-segment. Andre måter til konstruering av et sammenliknbart minigen er selvfølgelig mulige, og definisjonen er ikke begrenset til den spesielle konstruering hvor kodingssekvensene ligeres via et Xbal-sete. Dette er imidlertid en hensiktsmessig måte for konstruksjon av genet, og det er ingen spesiell fordel i forhold til andre fremgangsmåter, så som syntetisk eller delvis syntetisk fremstilling av genet. Definisjonen innbefatter de kodingssekvenser for a-underenheten som beholder intronet mellom eksonene III og IV, eller hvilket som helst annet intron, og fortrinnsvis ingen andre introner.

Når det gjelder rekombinant fremstilling, anvendes og dyrkes modifiserte vertsceller under anvendelse av ekspresjonssystemer, for fremstilling av det ønskede protein. Disse betegnelser anvendes i det foreliggende, som følger: En "modifisert" rekombinant vertscelle, d.v.s. en celle som er "modifisert til å inneholde" med de rekombinante ekspresjonssystemer ifølge oppfinnelsen, angir en vertscelle som er blitt forandret slik at den inneholder dette ekspresjonssystem, på hvilken som helst hensiktsmessig måte for innføring av det, innbefattende transfeksjon, virusinfeksjon og så videre. "Modifisert" angir celler som inneholder dette ekspresjonssystem, enten systemet er integrert i kromosomet eller ekstrakromosomalt. De "modifiserte" celler kan enten være stabile når det gjelder inneslutting av ekspresjonssystemet, eller ikke. Kort angitt angir "modifiserte" rekombinante vertsceller ved ekspresjonssystemet ifølge oppfinnelsen celler som innbefatter dette ekspresjonssystem som resultat av manipulering av dem slik at de inneholder det, når de naturlig sett ikke gjør det, uansett hvilken måte denne innarbeidelse utføres på.

"Ekspresjonssystem" angir et DNA-molekyl som innbefatter en kodende nukleotidsekvens som skal uttrykkes, samt de ledsagende kontrollsekvenser som er nødvendige for bevirking av ekspresjon av kodingssekvensen. Disse kontroller innbefatter typisk en promotor, termineringsreguleringssekvenser og i noen tilfeller en operator eller annen mekanisme for regulering av ekspresjon. Kontrollsekvensene er slike som er utformet til å være funksjonelle i en spesiell rekombinant målvertscelle, og vertscellen må derfor velges slik at den er forenlig med kontrollsekvensene i det konstruerte ekspresjonssystem.

Hvis sekresjon av det dannede protein er ønskelig, inngår det også ytterligere nukleotidsekvenser som koder for et signalpeptid, under dannelse av signalpeptidet operabelt knyttet til det ønskede enkeltkjedehormon for dannelse av preproteinet. Ved sekresjon spaltes signalpeptidet under frigjøring av det ferdige enkeltkjedehormon.

I det foreliggende anvendes "celler", "cellekulturer" og "cellelinjer" om hverandre uten at det vies spesiell oppmerksomhet til betydningsnyanser. Når skjelning mellom dem er viktig, vil det fremgå av sammenhengen. Hvor alle kan inngå i betydningen, er alle ment å innbefattes.

Det fremstilte protein kan gjenvinnes fra lysatet av cellene hvis det fremstilles intracellulært, eller fra mediet hvis det utsondres. Teknikker for gjenvinning av rekombinante proteiner fra cellekulturer er godt kjent på området, og disse proteiner kan renses under anvendelse av kjente teknikker så som kromatografi, gelelektroforese, selektiv utfelling og liknende.

Alle, eller en del av, hormonene ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres direkte under anvendelse av peptidsyntetiseringsteknikker som er kjent på området. Syntetiserte deler kan ligeres, og frigjøringsseter for eventuelt legemiddel som finnes i linkerdelen kan innføres ved hjelp av kjemiske standardmetoder. Når det gjelder de utførelsesformer som inneholder aminosyrer som ikke kodes for ved genet, og de utførelsesformer hvor hode-til-hode- eller hale-til-hale-konfigurasjon anvendes, må syntetiseringen selvfølgelig i det minste delvis være på protein-nivået. Hode-til-hode-forbindelser i de naturlige N-terminale ender eller i posisjoner som er proksimale i forhold til de naturlige N-terminale ender, kan frembringes ved hjelp av linkere som inneholder funksjonelle grupper som er reaktive med aminogruppene, så som dikarboksylsyrederivater. Hale-til-hale-konfigurasjoner i de C-terminale ender eller i posisjoner som er proksimale til de C-terminale ender, kan frembringes via linkere som er diaminer, dioler elter kombinasjoner av disse.

Antistoffer

Proteinene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for dannelse av antistoffer som er spesifikt immunreaktive med disse nye forbindelser. Disse antistoffer er egnet ved mange forskjellige diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Når for eksempel enkeltkjedeformene ifølge oppfinnelsen anvendes terapeutisk enten i human- eller veterinærmedisinske sammenhenger, kan nivåene av legemiddel kontrolleres ved anvendelse av disse antistoffer under anvendelse av vanlige immunanalyseteknikker. Siden en del av antistoffene som frembringes ved disse enkeltkjedeformer, er kryssreaktive med heterodimeren, kan disse dessuten anvendes til diagnostisering av naturlig forekommende nivåer av heterodimeren.

Antistoffene fremstilles vanligvis under anvendelse av standard-immuniseringsprotokoller hos pattedyr så som kaniner, mus, sauer eller rotter, og antistoffene titreres som polyklonale antisera for at man skal være forvisset om tilstrekkelig immunisering. De polyklonale antisera kan så høstes som sådanne for anvendelse for eksempel ved immunanalyser. Antistoffutsondrende celler fra verten, så som miltceller, eller leukocytter fra perifert blod, kan immortaliseres under anvendelse av kjente teknikker, og screeningundersøkes med hensyn til dannelse av monoklonale antistoffer som er immunspesifikke overfor proteinene ifølge oppfinnelsen.

Med "immunspesifikke overfor proteinene" menes antistoffer som er immunreaktive med enkeltkjedeproteinene, men ikke med selve heterodimerene innenfor de generelle parametere som anses for å bestemme affiniteten eller ikke-affiniteten. Det er underforstått at spesifisitet er en realtiv betegnelse, og det kan velges en vilkårlig grense, så som en forskjell i immunreaktivitet på 100 ganger eller mer. Et immunspesifikt antistoff som inngår i oppfinnelsen, er således minst 100 ganger mer reaktivt overfor enkeltkjedeproteinet enn overfor de tilsvarende heterodimerer.

Utforming

Proteinene ifølge oppfinnelsen utformes og administreres ved anvendelse av metoder som kan sammenliknes med metoder som er kjent for heterodimerene som svarer til enkeltkjedeformen. Utformings- og administreringsmetoder vil således variere i henhold til det spesielle anvendte hormon. Doseringsnivået og administrasjonshyppigheten kan imidlertid forandres sammenliknet med heterodimeren, særlig hvis CTP-enheter er tilstede, i betraktning av den forlengede biologiske halveringstid på grunn av nærværet av dette.

Preparater av proteiner ifølge oppfinnelsen er slike som er typiske for protein- eller peptid-legemidler så som det finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences, siste utgave, Mack Publishing Company, Easton, PA. Vanligvis administreres proteiner ved injeksjon, typisk intravenøs, intramuskulær, subkutan eller intraperitoneal injeksjon, eller ved anvendelse av preparater for transmukosal eller transdermal avgivelse. Disse preparater innbefatter vanligvis en detergent eller et gjennomtrengningsmiddel så som gallesalter, fusidinsyrer og liknende. Disse preparater kan administreres som aerosoler eller stikkpiller, eller når det gjelder transdermal administrering, i form av hudplaster.

Oral administrering er også mulig, under forutsetning av at preparatet beskytter peptidene ifølge oppfinnelsen mot nedbrytning i fordøyelsessystemet.

Optimalisering av doseringskurer og preparat utføres rutinemessig og slik det vanligvis utføres på området.

Anvendelsesmetoder

Enkeltkjedepeptidene ifølge oppfinnelsen kan anvendes på mange måter, mest innlysende som erstatninger for de heterodimere former av hormonene. I likhet med heterodimerene, kan således agonistformene av enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen anvendes ved behandling av ufruktbarhet, som hjelpemidler ved befruktningsteknikker in vitro og ved andre terapeutiske metoder som er bundet til de naturlige hormoner, både hos mennesker og dyr.

Enkeltkjedehormonene er også egnet som reagenser på liknende måte som for heterodimerene.

Enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen kan dessuten anvendes som diagnostiske redskaper for påvisning av tilstedeværelse eller fravær av antistoffer med hensyn til de naturlige proteiner i biologiske prøver. De er også egnet som kontrollreagenser i analysesett for bestemmelse av nivåene av disse hormoner i forskjellige prøver. Protokoller for bestemmelse av nivåer av selve hormonene eller av antistoffer frembrakt mot dem er standard immunanalyseprotokoller som er vanlig kjent på området. Det kan anvendes forskjellige konkurrerende og direkte analysemetoder som innbefatter mange forskjellige merkingsteknikker, innbefattende radioisotopmerking, fluorescensmerking, enzymmerking og liknende.

Enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen er også egnet til påvisning og rensing av reseptorer som de naturlige hormoner bindes til. Enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen kan således koples til faste bærere og anvendes ved affinitetskromatografisk preparering av reseptorer eller antihormonantistoffer. De resulterende reseptorer er i seg selv egnet til bedømmelse av hormonaktiviteten for aktuelle legemidler ved screeningundersøkelser for aktuelle terapeutiske og reagensmaterialer.

Endelig kan antistoffene som er unikt reaktive med enkeltkjedehormonene ifølge oppfinnelsen, anvendes som renseredskaper for isolering av etterfølgende preparater av disse materialer. De kan også anvendes for kontrollering av nivåer av enkeltkjedehormonene som administreres som legemidler.

Følgende eksempler er ment å skulle illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av DNA som koder for CGB- a

Fig. 1 viser konstruksjonen av et innskudd for en ekspresjonsvektor, hvor den C-terminale ende av B-kjeden i humant CG er bundet til den N-terminale ende av den ferdige human-a-underenhet.

Som vist på fig. 1, anvendes polymerasekjedereaksjonen (PCR) til kopling av de to underenheter mellom ekson 3 i CGp og ekson 2 i a-underenheten, slik at kodonet for den karboksyterminale aminosyre i CGB koples direkte i leseramme til kodonet for den N-terminale aminosyre i a-underenheten. Dette utføres ved anvendelse av en hybridprimer til forøking av et fragment som inneholder ekson 3 av CGp hvor hybridprimeren inneholder en "hale" som koder for den N-terminale sekvens av a-underenheten. Det resulterende forøkede fragment inneholder således en del av ekson 2 som koder for humant CGa.

En hybrid-primer som koder for den N-terminale sekvens av a-underenheten som er koplet til kodonene svarende til den C-terminale ende av CGp, anvendes uavhengig som én av primerne for forøking av a-minigenet. De to forøkte fragmenter, som hvert nå inneholder overlappende deler som koder for den andre underenhet, forøkes sammen med to ytterligere primere som dekker hele lengden, under oppnåelse av Sall-innskuddet

Mer detaljert viser reaksjon 1 dannelse av et fragment som inneholder ekson 3 av CGB og de første fire aminosyrer i den ferdige a-underenhet, så vel som et Sall-sete i 5-avstand fra kodingssekvensene. Det oppnås ved forøking av en del av CGp-genomsekvensen som er beskrevet av M.M. Matzuk et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1987) 84:6354-6358; P. Policastro et al J. Biol. Chem.

(1983) 258:11492-11499.

Primer 1 gir Sall-setet og har sekvensen:

Den andre primer, primer 2, er komplementær til fire kddoner for den a-N-terminale sekvens og fem kodoner for den CGB-C-terminale sekvens, og har sekvensen:

Det resulterende forøkte segment som er produktet fra reaksjon I, har således et Sall-sete i 5'-avstand fra den koplede kodingsregion.

I reaksjon II fås en analogt koplet kodingsregion ut fra a-minigenet beskrevet ovenfor. Primer 3 er en hybridprimer som inneholder fire kodoner for p-underenheten og fem kodoner for a, og har sekvensen:

Primer 4 inneholder et Sall-sete og er komplementær til forlengelsen av a-ekson 4. Primer 4 har sekvensen:

Produktene fra reaksjonene I og II overlapper således og gir, når de under-kastes PCR i nærvær av primere 1 og 4, det ønskede Sall-produkt som vist i reaksjon III.

Det forøkte fragment som inneholder CGB-ekson 3 og a-minigenet, innføres i Sall-setet i pM<2>HA-CGBekson1,2, en ekspresjonsvektor som er avledet fra pM<2 >inneholdende CGB-eksoner 1 og 2, på den måte som er beskrevet av B. Sachais, R.M. Snider, J. Dowe, J. Krause J. Biol. Chem. (1993) 268:2319. pM<2> som inneholder CGB-eksoner 1 og 2, er beskrevet i M.M. Matzuk et al. Proe. Nati. Acad. USA (1987) 84:6354-6358 og M.M. Matzuk et al. J. Cell. Biol. (1988) 106:1049-1059.

Denne ekspresjonsvektor vil så danne enkeltkjedeformen av humant CG hvor den C-terminale ende av B-underenheten er direkte bundet til den N-terminale ende av a-underenheten.

Eksempel 2

Fremstilling oa aktivitet av det humane enkeltkiede- CG Ekspresjonsvektoren konstruert i eksempel 1 ble transfektert i ovarieceller av kinesisk hamster (CHO), og dannelsen av proteinet ble fastslått ved immunutfelling av radiomerket protein på SDS-geler. Dyrkningsmediet ble oppsamlet, og bioaktiviteten av enkeltkjedeproteinet ble sammenliknet med heterodimeren i en konkurrerende bindingsanalyse med hensyn til den humane LH-reseptor. Ved denne analyse ble cDNA som kodet for hele den humane LH-reseptor, innført i ekspresjonsvektoren pCMX (J. X-C Oikawa et al. Mol. Endocrinol. (1991) 5:759-768). Eksponensielt voksende 293-celler ble transfektert med denne vektor under anvendelse av metoden ifølge C. Chen et al. Mol. Cell. Biol. (1987)7:2745-2752.

Ved analysen ble cellene som eksprimerte reseptor for humant LH (2 x 10<5 >pr. rør), inkubert med 1 ng merket hCG i konkurranse med prøven som skulle undersøkes, ved 22°C i 18 timer. Prøvene ble så fortynnet 5 ganger med kald Dulbecco's PBS (2 ml) supplert med 0,1% BSA, og sentrifugert ved 800 x g i 15 minutter. Pelletene ble vasket to ganger med D's PBS, og radioaktiviteten ble bestemt med gammateller. Spesifikk binding var 10-12% av det totale merkede (joderte) hCG tilsatt i fravær av prøve. Reduksjonen i merking i nærvær av prøve måler bindingsevnen i prøven. I denne analyse hadde villtype-hCG, med hensyn til reseptoren for humant LH i 293-celler, en ED50 på 0,47 ng, og enkeltkjedeproteinet hadde en ED50 på 1,1 ng.

Ved en ytterligere analyse med hensyn til agonistaktiviteten ble stimulering av cAMP-dannelse bedømt. I dette tilfelle ble 293-celler som eksprimerte reseptorer for humant CG (2 x 10<5> pr. rør), inkubert med varierende konsentrasjoner av den heterodimere hCG eller enkeltkjede-hCG, og dyrket i 18 timer. Nivåene av ekstracellulært cAMP ble bestemt ved spesifikk radioimmun-analyse, som beskrevet av J.B. Davoren et al. Biol. Reprod. (1985) 33:37-52. Ved denne analyse hadde villtypen en ED50 på 0,6 ng/ml, og enkeltkjedeformen hadde en ED50 på 1,7 ng/ml. (ED50 er 50% av den effektive dose).

I alle tilfeller er således oppførselen både hos villtype- og enkeltkjede-formene like.

Eksempel 3

Ytterligere aktivitetsanalvser

Mediet fra CHO-celler transfektert med en ekspresjonsvektor for BFSH-CTPra-enkeltkjedekonstruksjonen ble gjenvunnet og analysert som beskrevet i eksempel 2. Resultatene av konkurranseanalysen med hensyn til binding til FSH-reseptor er vist på fig. 3. Resultatene tyder på at enkeltkjedeformen er mer effektiv enn både villtype-FSH eller FSH inneholdende en CTP-forlengelse ved B-kjeden, når det gjelder inhibering av binding av selve FSH til reseptoren. ED50 for enkeltkjedeformen er omtrent 50 ml E/ml, mens ED50 for den forlengede heterodimer er litt over 100 mIE/ml. ED50 for villtype-FSH er omtrent 120 mIE/ml.

Resultatene av signaltransduksjonsanalysen er vist på fig. 4. Effektiviteten av alle de tre typer av FSH er sammenliknbare.

Eksempel 4

Konstruering av ytterligere eks<p>resjonsvektorer

På liknende måte som den som er vist i eksempel 1, fremstilles ekspresjonsvektorer for fremstilling av enkeltkjedet FSH, TSH og LH (BFSH-a, BFSH-CTP-a, BTSH-a, BTSH-CTP-a, BLH-a, pLH-CTP-a) og transfekteres i CHO-celler. De resulterende hormoner viser liknende aktiviteter som aktivitetene hos villtypeformen, ved analysering som beskrevet i eksempel 2.

Likeledes konstrueres ekspresjonsvektorer for "to-P"-enkeltkjedeformene på analog måte til den som er beskrevet i eksempel 1, og eksprimeres og analyseres som beskrevet i eksempel 2.

Claims (13)

1. Agonist eller antagonist av glykoproteinhormonaktivitet, hvor agonisten eller antagonisten er glykosylert eller ikke-glykosylert protein, karakterisert ved a t det omfatter a-p, B-a eller B- B; hvor nevnte glykoproteinhormon er valgt fra gruppen bestående av follikelstimulerende hormon (FSH), luteiniseringshormon (LH), koriongonadotropin (CG) og tyroideastimulerende hormon (TSH); hvor nevnte a og B eller B og 8-subenheter er bundet sammen kovalent, eventuelt med en linker-enhet; hvor a representerer den native aminosyresekvensen av en a-subenhet felles for glykoproteinhormonene eller en variant derav, og p eller hver B uavhengig representerer p-subenheten av glykoproteinhormonet eller en variant derav, hvor varianten av nevnte a eller P-subenhet er en modifisert form av nevnte subenhet som inneholder 1-10 delesjoner eller substitusjoner, hvor nevnte substitusjoner er konservative substitusjoner, hvor nevnte linker er en hydrofil enhet som binder a og p eller B og P-subenhetene uten å interferere med aktiviteten derav, med det unntak at linkeren ikke omfatter et signalpeptid umiddelbart oppstrøms av nedstrøms subenheten; og hvor p-subenheten er en koriongonadotropin P-subenhet bundet til en a-subenhet, er linkeren fraværende, eller så består den ikke av en linker som har fra 1 til 16 aminosyrerester.

2. Agonist eller antagonist ifølge krav 1,karakterisert ved at proteinet omfatter a-p.

3. Agonist eller antagonist ifølge krav 1,karakterisert ved at proteinet omfatter p-a.

4. Agonist eller antagonist ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at a og p-subenhetene er human a og p-subenheter eller varianter derav.

5. Agonist eller antagonist ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at linkeren er et fullstendig karboksyterminalt peptid (CTP) eller variant derav hvor nevnte CTP representerer posisjonene 112-118 til og med 145 av human koriongonadotropin (hCG), og hvor nevnte variant av CTP er en modifisert form av CTP inneholdende fra 1-5 delesjoner og/eller substitusjoner, hvor enhver substitusjon er av en konservativ aminosyre, eller nevnte linker er en delvis CTP som omfatter i det minste posisjonene 112-132, 115-132,116-132 eller 118-132, eller 112-127,115-127,116-127 eller 118-127 av hCG.

6. Agonist eller antagonist ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at en eller begge av a og B eller B og B-subenhetene ytterligere omfatter et innskudd av en fullstendig karboksyterminalt peptid (CTP)-enhet eller variant derav hvor nevnte CTP er en modifisert form av CTP inneholdende 1-5 delesjoner og/eller substitusjoner, hvor enhver substitusjon er av en konservativ aminosyre, eller nevnte innskudd er av en delvis CTP som omfatter i det minste posisjonene 112-132,115-132,116-132 eller 118-132, eller 112-127,115-127,116-127 eller 118-127 av hCG, inn i en ikke kritisk region av nevnte a og B-subenhet, hvor nevnte innskudd er innen fem aminosyrer av N- eller C-terminal ende.

7. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter agonist eller antagonist ifølge et hvilket som helst av kravene 1 -6 i en blanding med en egnet farmasøytisk eksipient.

8. Antistoffer, karakterisert ved at de er immunospesifikke for agonisten eller antagonisten ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6.

9. Isolert DNA- eller RNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for proteinet ifølge et av kravene 1 til 6.

10. Ekspresjonssystem for fremstilling av en agonist eller en antagonist av et glykoproteinhormon, karakterisert ved at ekspresjonssystemet omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 operativt bundet til kontrollsekvenser som bevirker ekspresjon av nevnte nukleotidsekvens.

11. Ekspresjonssystem ifølge krav 10, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en andre nukleotidsekvens som koder for et signalpeptid operativt bundet til proteinet som kodes for av den første nukleotidsekvensen.

12. Vertscelle, karakterisert ved at den er modifisert til å inneholde ekspresjonssystemet ifølge kravene 10 eller 11.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av agonist eller antagonist av glykoproteinhormon aktivitet, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter dyrkning av celler ifølge krav 12 for å fremstille nevnte agonist eller antagonist og gjenvinning av agonisten eller antagonisten fra kulturen.