HU227311B1 - Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet - Google Patents

Description

A találmány fehérjék módosításaival és a glikoprotein hormonokkal foglalkozik, amelyek normális esetben heterodimerek formájában fordulnak elő. Pontosabban a találmány a magzatburki (korion) gonadotropin (CG), pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH), luteinizáló hormon (LH) és tüsző- (folliculus-) stimuláló hormon (FSH) egyláncú formáival foglalkozik.

Az emberekben négy fontos glikoprotein hormon heterodimer (LH, FSH, TSH és CG) azonos «-alegységekkel és eltérő β-alegységekkel bír. Ezen hormonok közül három jelen van gyakorlatilag minden emlősben; a CG-t viszont eddig csak főemlősökben találták meg, valamint a lovak méhlepényében és vizeletében.

A W090/09800 számú PCT közzétételi irat, amelyet 1990. szeptember 7-én tettek közzé, és amely referenciaként épül be jelen bejelentésbe, ezen hormonok számos formáját leírja. Az egyik fontos módosítás a β-alegység C-terminális kiterjesztése a humán magzatburki gonadotropinnak vagy valamely variánsának karboxiterminális peptidjével.

Ezeknek a hormonoknak más muteinjeit is leírták már. A CTP-hez (karboxiterminális) a releváns helyen humán magzatburki gonadotropin β-alegysége 112-118. helyeinek valamelyikétől a 145. helyéig terjednek. A PCT bejelentés CTP variánsokat ír le, amelyeket konzervatív aminosavhelyettesítésekkel kaptak úgy, hogy a CTP-nek az ürítőképességi jellemzők megváltoztatásával kapcsolatos képessége nem semmisült meg. Ezenkívül a 08/049.869 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyet 1993. április 20-án jelentettek be, és amely referenciaként épül be jelen bejelentésbe, leírja ezeknek a hormonoknak a módosítását a CTP kiterjesztésével vagy beiktatásával a C-terminálistól eltérő helyekre, és leír olyan CTPfragmentumokat, amelyek rövidebbek, mint a 112-118. és 145. helyek közt elterülő szekvencia.

Az FSH CTP-kiterjesztett β-alegységét is leírták már két helyen is, amelyek referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe [LaPolt P. S. és munkatársai: Endocrinology 131, 2514-2520 (1992); és Fares F. A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4304-4308 (1992)].

A humán magzatburki gonadotropin heterodimer formának kristályszerkezetét nemrégiben publikálták többé-kevésbé egyidejű közleményekben; az egyik Lapthorn A. J. és munkatársai közleménye [Natúré 369, 455—461 (1994)], a másik Wu H. és munkatársai közleménye [Structure 2, 545-558 (1994)]. Ezeknek a közleményeknek az eredményeit Patel D. J. foglalja össze [Natúré 369, 438-439 (1994)].

Már legalább egy példa ismeretes egy heterodimer egyláncú formájának sikeres előállítására. A természetben előforduló édesítő fehérje, a monellin, heterodimer kristályszerkezetével kapcsolatos tanulmányok egybevágnak azzal a feltételezéssel, hogy a B lánc C-terminálisát az A lánc N-terminálisával egy kapcsolótagon (linker) keresztül lehet összekötni, amely kapcsolótag megőrzi a heterodimer forma térbeli jellegzetességeit. Az ilyen kapcsolás azért előnyös, mert édesítő fehérjeként alkalmazva előnyös ezt a molekulát nagy hőmérsékleteken és stabil formában szolgáltatni. Ezt sikeresen el is érték az egyláncú forma előállításával, így megakadályozva a hődenaturálódást, amint ezt az 5,264,558 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti.

A W091/16922 számú PCT szabadalmi közzétételi irat, amelyet 1991. november 14-én tettek közzé, a heterodimer glikoprotein hormonok kiméra és egyéb módon módosított formáinak sokaságát írja le. A leírás általában az α-alegység vagy β alegység olyan kiméráira összpontosít, amelyek magukban foglalják különböző a, illetve β láncok részleteit. Az egyik konstrukció, amely a bejelentésben csak egyszerűen fel van sorolva, de egyéb módon nincs leírva, a humán magzatburki gonadotropin lényegében teljes β láncát összeköti az a preprotein alegységgel, vagyis olyan alegységgel, amely magában foglalja az ezen alegységhez tartozó szekréciós szignálszekvenciát is. Ez a konstrukció kívül esik a jelen találmány oltalmi körén, mivel a β és a láncok között elhelyezkedő szignálszekvencia nem kapcsolótagként (linker) szolgál, amint ezt itt majd meghatározzuk és leírjuk.

Arra jöttünk rá, hogy a normálisan heterodimer glikoprotein megőrzi tulajdonságait, amikor egyláncú formában van, beleértve azokat az egyláncú formákat, amelyek a fentebb leírt különböző CTP kiterjesztéseket és beiktatásokat tartalmazzák.

A találmány tehát a glikoprotein hormonok egyláncú formáit nyújtja, amely hormonok legalább néhánya megtalálható a legtöbb gerinces fajban. A találmány szerinti egyláncú formák lehetnek glikozilezettek, részben glikozilezettek, és az a vagy β (vagy a és a vagy β és β) láncok, amelyek előfordulnak a natív glikoprotein hormonokban vagy variánsaikban, kívánt esetben össze lehetnek kapcsolva egy kapcsolótag gyökön keresztül. A különösen előnyös kapcsolótag gyökök közt található e karboxiterminális peptid (CTP) egység akár mint teljes egység, akár csak mint annak egy része. Az így létrejövő egyláncú hormonok vagy megőrzik a módosítatlan heterodimer forma aktivitását, vagy ennek az aktivitásnak az antagonistái lesznek.

A találmány egyik szempontja szerint olyan glikozilezett vagy nem glikozilezett fehérjére irányul, amely tartalmazza a glikoprotein hormonokban közös a-alegység aminosavszekvenciáját, kovalensen kötve, kívánt esetben egy kapcsolótag gyökön keresztül, az említett hormonok valamelyike β-alegységének aminosavszekvenciájához vagy az említett aminosavszekvencia variánsaihoz, ahol a variánsok fogalmát a későbbiekben definiáljuk.

A találmány egy másik szempontja szerint olyan glikozilezett vagy nem glikozilezett fehérjére irányul, amely tartalmazza a glikoprotein hormon kvartett valamelyik tagja β-alegységének aminosavszekvenciáját, kovalensen kötve, kívánt esetben egy kapcsolótag gyökön keresztül, az említett hormonok valamelyike β-alegységének aminosavszekvencia variánsaihoz, ahol a variánsok fogalmát a későbbiekben definiáljuk.

A találmány egy még további szempontja szerint olyan glikozilezett vagy nem glikozilezett fehérjére irá2

HU 227 311 Β1 nyúl, amely tartalmazza a glikoprotein hormon kvartett α-alegységének aminosavszekvenciáját, kovalensen kötve, kívánt esetben egy kapcsolótag gyökön keresztül, egy másik α-alegység aminosavszekvenciájához vagy az említett aminosavszekvencia variánsaihoz, ahol a variánsok fogalmát a későbbiekben definiáljuk.

A találmány egy még további szempontja szerint az olyan biológiailag fontos dimerek glikozilezett vagy nem glikozilezett egyláncú formáira irányul, amelyek hatásosságát a hormon kvartett egyláncú formái révén meg lehet jósolni. így a találmány az interleukin 3 és interleukin 12 (IL—3 és IL—12), a tumornekrózis-faktor (TNF), transzformáló növekedési faktor (TGF), valamint az inhibin egyláncú formáira is irányul. Ideértendők a hibrid interleukinok is, mint pl. az olyan egyláncú formák, amelyekben az egyik alegység az IL—3-ból, míg a másik az IL—12-ből származik.

A találmány egy még további szempontja szerint olyan rekombináns anyagokra és eljárásokra irányul, amelyekkel elő lehet állítani a találmány szerinti egyláncú fehérjéket. Irányul továbbá a találmány az ilyen fehérjéket tartalmazó gyógyászati kompozíciókra, az ilyen fehérjékre fajlagos antitestekre, valamint az ilyen fehérjéket alkalmazó eljárásokra.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra bemutatja egy Sall-kötött DNS-fragmentum megalkotását, amely összeköti a CGB harmadik exonját az a-alegységet kódoló második exonnal.

A2. ábra a humán CGB 112-145. helyek közti aminosavszekvenciáját és annak számozását mutatja be.

A 3. ábra a különböző FSH analógok versengő kötődési vizsgálatát mutatja be az FSH receptorokhoz.

A 4. ábra a szignál átviteli vizsgálat eredményeit mutatja be az FSH receptor szempontjából a különböző FSH analógokhoz.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.

Az emberekben négy „glikoprotein” hormon egy családot alkot, amely magában foglalja a humán magzatburki (korion) gonadotropint (hCG), a tüsző- (folliculus-) stimuláló hormont (FSH), a luteinizáló hormont (LH) és a pajzsmirigy-stimuláló hormont (TSH). Ahogyan itt használjuk, a „glikoprotein hormon”-ok ezen család tagjaira utalnak, akár emberekben találhatók, akár más gerincesekben. Ezeknek a hormonoknak mindegyike heterodimer, és áll α-alegységekből, amelyek egy adott fajnál aminosavszekvenciájukban azonosak a csoporton belül, valamint β-alegységekből, amelyek különbözők a család tagjai szerint. így normálisan ezek a glikoprotein hormonok heterodimerekként fordulnak elő, amelyek a és β-alegységekből állnak. Ezek társulnak egymással, de kovalensen nincsenek összekapcsolva. A legtöbb gerinces termel FSH-t, TSH-t és LH-t; a magzatburki gonadotropint azonban csak a főemlősökben találtak, ideértve az embereket is, valamint lovakban. A CG egyik speciális formáját, amely lovakból származik, vemhes kanca szérum glikoproteinnek (pregnat maré serum glycoprotein, PMSG) nevezték el.

így ez a hormon „kvartett” heterodimerekből tevődik össze, ahol az egyes a- és β-alegységeket különböző gének kódolják, és külön-külön szintetizálódnak a gazdaszervezetben. A gazdaszervezet ezután összeilleszti a külön-külön szintetizált alegységeket egy nem kovalensen kötött heterodimer komplexszé. Ilyen módon a jelen hormon kvartett heterodimerjei különböznek az olyan heterodimerektől, mint az inzulin, amelyet egyetlen gén szintetizál (ebben az esetben egy közbeiktatott „pro” szekvenciával), és az alegységek kovalensen kapcsolódnak össze diszulfidkötések felhasználásával. Ez a hormon kvartett különbözik az immunglobulinoktól is, amelyek eltérő lokuszokon vannak összeillesztve, de kovalensen vannak kötve diszulfidhidakon keresztül. Másrészt viszont a monellin, amely növényi fehérje, A és b láncai közti nem kovalens kölcsönhatással van összetartva. Jelenleg még nem tudjuk, vajon a két láncot különböző gének kódolják-e.

így egy sor tényező gyakorol befolyást azoknak a biológiailag aktív vegyületeknek a viselkedésére, amelyek dimerek és azonos vagy különböző alegységekből vannak kialakítva. Az alegységek lehetnek kovalensen vagy nem kovalensen összekapcsolva; lehetnek szintetizálva azonos vagy különböző gének által; tartalmaznak vagy nem tartalmaznak prekurzor formáikban egy „pro” szekvenciát, amely összeköti a dimer két tagját. Az itt felsorolt glikoprotein hormon kvartett egyláncú formáiból nyert eredmények alapján nyilvánvaló, hogy az interleukin—12, interleukin—3 (IL—12 és IL—3), inhibin, tumornekrózis-faktor (TNF) és transzformáló növekedési faktor (TGF) biológiailag aktív dimerek egyláncú formái szintén biológiailag aktívak.

A heterodimerek vagy homodimerek egyláncú formái számos előnnyel bírnak dimer formáikhoz viszonyítva. Először is ezek általában stabilabbak. Elsősorban az LH-ról jegyzik meg, hogy instabil, és rövid a felezési ideje. Másodszor a rekombináns termelés problémái csökkennek, mivel csak egyetlen gént kell átírni, transzlatálni és működtetni. Ez különösen fontos a baktériumokban való kifejeződésnél. Harmadszor, természetesen ezek megváltoztatott formát jelentenek, így lehetővé teszik az aktivitási szintek és az in vivő félélettartamok finom beállítását. Végül az egyláncú formák egyedüli kiindulási anyagok a csonkított formák azonosítására a dimer aktivitásával. Az alegységek közti kapcsolódás lehetővé teszi, hogy a fehérjét megtervezzük és kivitelezzük anélkül, hogy megzavarnánk a fehérje általános összehajtogatottságát.

Az alábbiakban ismertetjük a kvartett tagjainak lényeges vonásait.

A HCG β-alegysége lényegesen nagyobb, mint a többi β-alegységek, amennyiben tartalmaz további mintegy 34 aminosavat C-terminálisán, amelyet a továbbiakban karboxiterminális résznek (CTP) nevezünk, amely, amikor az O-kapcsolt helyein glikozilezve van, felelősnek tekinthető a hCG jelentősen hosszabb szérum-félélettartamáért, összehasonlítva más gonadotropinokkal [Matzuk M. és munkatársai: Endocrinol.

HU 227 311 Β1

126, 376 (1989)]. A natív hormonban ez a CTP kiterjesztés négy mucinszerű, O-kapcsolt oligoszacharidot tartalmaz.

A jelen találmány egyik kiviteli formájában a glikoprotein hormonok a és β láncai össze vannak kapcsolva egy egyláncú, fehérjeszerű anyaggá, ahol az a és β láncok kovalensen vannak összekapcsolva, kívánt esetben egy kapcsolótag gyökön keresztül. A kapcsolótag gyök magában foglalhat további aminosavszekvenciát, és különösen az itt leírt CTP egységek lehetnek benne előnyösen a kapcsolótagban. Ezenkívül a kapcsolótag magában foglalhat peptid vagy nem peptid gyógyszereket, amelyeket a hormonokhoz szolgáló receptorokhoz lehet irányítani.

A fej-farok konfiguráción kívül, amely a két peptidlánc egyszerű összekapcsolásával érhető el peptidkötésen keresztül, az a és β láncokat összeköthetjük fejfej és farok-farok konfigurációban is. A fej-fej és farokfarok összekapcsolódások szintetikus kémiai beavatkozást igényelnek, olyan standard technikákkal alkalmazva, amelyekkel egy kapcsolótag gyökön keresztül össze lehet kötni két karboxil- vagy két aminocsoportot. így például két aminocsoport összekapcsolható valamely antihidriden keresztül vagy bármilyen dikarboxisavszármazékon keresztül; két karboxilcsoportot diaminokon vagy diolokon keresztül lehet összekapcsolni standard aktiváló technikákat alkalmazva. A legelőnyösebb forma azonban a fej-farok konfiguráció, ahol a standard peptidkötések elegendők, és az egyláncú vegyületet úgy lehet előállítani, mint fúziós fehérjét rekombináns úton, vagy szintetikus peptid technikákat alkalmazva vagy egy láncban, vagy előnyösen a teljes szekvencia egyes részleteinek ligálásával. Természetesen, ha kívánatos, lehet alkalmazni peptid vagy nem peptid kapcsolótag gyököket is ebben az esetben, de ez szükségtelen, és az egyláncú fehérje rekombináns termelésének kényelmessége azt sugallja, hogy azok a kiviteli módok, amelyek lehetővé teszik a termelésnek ezt a módját, messze a legelőnyösebb megközelítést jelentik.

Amikor fej-farok konfigurációt alkalmazunk, a kapcsolótagok lényegében további peptidszekvenciából állnak. A heterodimerek esetében a két β lánc egy CTP egységen keresztül lehet összekapcsolva, amint ezt a későbbiekben leírjuk. így a jelen találmány lehetséges kiviteli formái közt találjuk, bal oldalon elhelyezve az N-terminálist, az alábbiakat: α-ΕδΗβ, βΡδΗ-α, α-βύΗ, α-ΰΤΡ-βίΗ, βΙ_Η-ΰΤΡ-α, CTP^LH-CTP-a és hasonlók.

A heterodimer gonadotropinok vagy glikoprotein kvartett egyláncú formái vonatkoznak további kiviteli forma sorozatokra is, ahol az a és β-alegységek összekapcsolása helyett két β vagy két α-alegység kapcsolódhat össze egyláncú vegyületet képezve. Akárcsak a heterodimereknél, az összekapcsolódás lehet fej-fej, fej-farok vagy farok-farok típusú.

A „két-β” egyláncú tandem peptidek különösen hasznosak mint azoknak a receptoroknak az antagonistái, amelyeket a heterodimer glikoprotein hormonok normálisan aktiválnak. Mivel az α-alegységről úgy vélik, hogy nagymértékben felelős a szignáltranszdukcióért, míg a β-alegység adja át a receptorfajlagosságot, és mivel az a és β-alegységek hasonló konfigurációval bírnak, az egyláncú vegyületeknek képeseknek kell lenniük fajlagosan kötődni egy olyan receptorhoz, amelynél legalább egy β lánc van jelen, anélkül, hogy aktiválnák a receptort.

A „két-β” egyláncú tandem peptidek antagonista aktivitása részben a heterodimerek kristályszerkezetén alapul. Ismeretes, hogy az a és β láncok hasonló cisztin-csomó konfigurációval bírnak, és a két lánc összehajtogatási mintáinak néhánya analóg.

A találmány szerinti „két-β egyláncú vegyületeket tervezhetjük úgy, hogy az azonos β-alegység tandem kópiáit tartalmazzák, így például: ΕδΗβ-ΕδΗβ; Ι^ΰβhCGft; ΤδΗβ-ΤδΗβ; vagy Ι_Ηβ-Ι_Ηβ; vagy alkalmazhatunk kiméra egyláncú vegyületeket, mint például Ηΰΰβ-ΕΞΗβ; ΕΞΗβ-ίΗβ; ίΗβ-ΤΞΗβ és hasonlók. Összesen 12 ilyen lehetséges kombináció van. Ezenkívül a HCG β-alegység karboxilterminális peptidje javítja az egyláncú vegyület konfigurációját, ha jelen van a két β lánc között. Ez automatikus, amikor a Ηΰΰβ az „upstream” rész; más esetekben azonban kellemesebb egy CTP alegységet az „upstream” részt vevő karboxilterminálisánál alkalmazni, amint ezt itt le is írjuk. Két ilyen CTP egység alkalmazása szintén a találmány oltalmi körén belül van. Az előnyös kiviteli formák között találjuk az alábbiakat: ΕεΗβ-ΰΤΡ-ΕεΗβ; ΕεΗβ-ΰΤΡΰΤΡΈδΗβ; L^-CTP-FS^; ύΗβ-ΰΤΡ-ΰΤΡ-ΡδΗβ és hasonlók.

Hasonló leírások alkalmazhatók a „két-α” egyláncú vegyületekre, kivéve természetesen azt, hogy kiméra párok nem lehetségesek, legfeljebb az a variánsok esetében. Különböző kapcsolótagok, előnyösen CTPalapúak, és CTP kiterjesztések szintén lehetségesek.

Az alábbi definíciók segíthetnek a molekulák egyláncú formáinak leírásában.

Ahogyan itt alkalmazzuk, az α-alegység, az FSH, LH, TSH és CG β-alegységek, valamint a heterodimer formák általában rendelkeznek saját hagyományos definícióikkal, és utalnak azokra a fehérjékre, amelyek a szakterületen önmagában ismert aminosavszekvenciával bírnak, vagy ezek allélvariációival, tekintet nélkül arra, hogy a glikozilezési minta ki van-e mutatva.

Ezeknek a peptideknek a „natív” formái azok, amelyek a megfelelő gerinces szövetekből izolált aminosavszekvenciákkal bírnak, amelyek önmagukban ismertek, vagy ezek allélvariánsaival.

Ezeknek a fehérjéknek a „variáns” formái azok, amelyek a natív fehérje aminosavszekvenciájában előre megfontolt változásokkal bírnak, és amelyek készíthetők például helyspecifikus mutagenezissel vagy más rekombináns manipulációval, vagy elkészíthetők szintetikusan.

Ezek a változások 1-10, előnyösen 1-8, még előnyösebben 1-5 aminosawáltozást jelentenek, ideértve a kiiktatásokat (deléciókat), beiktatásokat (inzerciókat) és helyettesítéseket (szubsztitúciókat); a legelőnyösebbek a hagyományos aminosavhelyettesítések, amint ezt később meghatározzuk. A létrejövő varián4

HU 227 311 Β1 soknak meg kell őrizniük azt az aktivitást, amely a natív hormon megfelelő aktivitásához kapcsolódik, tehát ezeknek vagy közvetlenül meg kell őrizniük a natív hormon biológiai aktivitását, vagy antagonistaként kell viselkedniük azon képességeiknél fogva, hogy kötődnek a natív hormonokhoz szolgáló receptorokhoz, de hiányzik belőlük az a képesség, hogy hassanak a szignáltranzakcióra. így például ismeretes, hogy ha az a-alegység 52. helyénél lévő glikozilezési helyet aminosavhelyettesítéssel eltávolítják, ennélfogva mindenféle glikozilezést megakadályoznak ezen a helyen, a hormonok, amelyek ezzel a megváltozott a-alegységgel bíró heterodimerek, általában agonisták, és képesek kötődni a receptorokhoz, megakadályozva, hogy a versengésben a natív hormon így tegyen. (Másrészt az α-alegység glikozilezőhelye a 78. helynél, úgy tűnik, nem hat ilyen nagy mértékben a hormonok aktivitására.) Más változások az aminosavszekvenciában antagonistákat is eredményezhetnek a variáns agonista aktivitása helyett.

Az előnyös variánsok egyik készlete az, ahol az a vagy β-alegységek vagy mindkettő glikozilezőhelyei megváltoztak. Az α-alegység két glikozilezési hellyel bír, ezek egyike az 52., másika a 78. helyen van, és ezen helyek megváltozásának hatását az aktivitásra éppen az előzőekben írtuk le. A β-alegységek általában hasonlóan két N-kapcsolt glikozilezési hellyel bírnak (olyan helyeknél, amelyek valamelyest változók a β lánc természetével), és hasonló változásokat lehet előidézni ezeknél a helyeknél. A hCG CTP-kiterjesztése négy O-kapcsolt glikozilezési hellyel bír, és a hagyományos mutációk a szeringyököknél (például a szerin átalakulása alaninná) elroncsolják ezeket a helyeket. Az O-kapcsolt glikozilezőhelyek eltüntetése hathat az átalakulásra az aktivitástól az antagonista aktivitás felé.

Végül a változások az aminosavszekvenciában, amelyek proximálisak az N-kapcsolt vagy O-kapcsolt glikozilezőhelyekhez, befolyásolják a glikozilezés természetét, amely jelen van a képződött molekulában, és megváltoztatja az aktivitást is.

A változások az aminosavszekvenciában magukban foglalják a beiktatásokat és kiiktatásokat is. így a hormonok csonkított formái is megtalálhatók a variánsok között, például az α-alegység olyan mutánsai, amelyekből hiányzik a C-terminálisnál a 85-92. helyeknél lévő aminosavak néhánya vagy mindegyike. Idetartoznak még ezenkívül azok az α-alegységek, amelyekből az N-terminálisnál ki vannak iktatva az 1-10. aminosavak. A hormon kvartett itt leírt néhány hasznos variánsa le van írva az 1993. január 5-én megjelent 5,177,193 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban; ez referenciaként épül be a jelen bejelentésbe. Amint itt bemutatjuk, a glikozilezési mintázat változhat a releváns helyek szétroncsolásával, vagy egy másik módszer szerint olyan gazdaszervezet kiválasztásával, amelyben a fehérje termelődik.

Amint fentebb elmagyaráztuk, az egyláncú formák kényelmes kiindulási anyagok különböző megtervezett muteinekhez. Az ilyen muteinek közé értjük azokat, amelyekben nem kritikus részek meg vannak változtatva vagy el vannak távolítva. Az ilyen kiiktatások vagy változtatások magukban foglalhatnak teljes hurkokat is úgy, hogy jelentősen több mint 10 aminosav szekvenciáját lehet kiiktatni vagy megváltoztatni. Az egyláncú molekuláknak azonban meg kell őrizniük legalább a receptorkötő tartományokat és/vagy azokat a területeket, amelyek érdekeltek a szignáltranszdukcióban.

Az itt leírt hormon kvartett variánsainak jelentős irodalma van, és ebből az irodalomból világos, hogy nagyszámú lehetséges variáns állítható elő, amelyek eredményezhetnek mind agonista, mind antagonista aktivitást. Ilyen variánsokat írnak le például a következő irodalmi helyeken: Chen F. és munkatársai: Molec. Endocrinol. 6, 914-919 (1992); Yoo J. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 17741-17743 (1991); Puett D. és munkatársai: Glycoprotein Hormones, szerkesztők: Lusbader J. W. és munkatársai, kiadó Springer Verlag, New York, 122-134 (1994); Kuetmann Η. T. és munkatársai; előbb idézett könyv, 103-117; Erickson L. D. és munkatársai: Endocrinology 126, 2555-2560 (1990); és Bielinska M. és munkatársai: J. Cell. Bioi. 111 330a (1844. kivonat) (1990).

Amint fentebb leírtuk, a hatásos antagonisták megalkotásának egyik eljárása az, hogy olyan egyláncú molekulát állítunk elő, amely a glikoprotein kvartett azonos vagy eltérő tagjainak két β-alegységét tartalmazza. Ezek között az egyláncú formák között különösen előnyös variánsok azok, ahol egy vagy több cisztinkötés ki van iktatva tipikusan olyan módon, hogy az egyik vagy mindkét cisztein, amely részt vesz a kötésben, valamely semleges aminosavra van kicserélve. Különösen előnyös az olyan cisztinkötések kiiktatása, amelyek a 26. és 110. helyek közt, valamint a 23. és 72. helyek közt találhatók.

Ezenkívül bemutatjuk, hogy a hormon kvartett β-alegységeit meg lehet alkotni kiméra formákban úgy, hogy ezek a kiméra mindkét komponensének biológiai funkciójú hormonokat képezzenek. így lehet olyan kiméra molekulákat alkotni, amelyek mutatják mind az FSH, mind az LH/CG aktivitásokat, amint ezt Moyle leírja: Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 760-764 (1991); Natúré 368, 251-255 (1994). Amint ezekben a cikkekben le van írva, az FSH-β 101-109. aminosavainak helyettesítése a CG-β megfelelő gyökeire olyan analógot alakít ki, amelynek van mind hCG-, mind FSH-aktivitása.

A β-alegységek ezen kiméra formái alkalmazhatók az olyan egyláncú vegyületekben, amelyek két β-alegységet kapcsolnak össze egyetlen molekulába.

Bár elfogadható, hogy a glikozilezési mintázat jelentős befolyással bír az aktivitásra mind mennyiségileg, mind minőségileg, kényelmi okokból az FSH, LH, TSH és CG β-alegység fogalmak arra az aminosavszekvenciára utalnak, amely a peptidekre jellemző; ugyanez vonatkozik az „a-alegység”-re is. Amikor csak a β láncra utalunk, a kifejezés például ΡΞΗβ lesz; amikor a heterodimerre utalunk, az egyszerű „FSH” kifejezést alkalmazzuk. A szövegösszefüggésből világos, hogy a glikozilezési mintázatra milyen módon hat például a rekombináns kifejező gazdaszervezet vagy a változtatás

HU 227 311 Β1 a glikozilezőhelyeken. A speciális glikozilezési mintázattal bíró glikoproteineket így meg is jelöljük.

A „peptid” és „fehérje” (vagy „protein”) kifejezéseket néha egymással cserélhető módon használjuk, mivel a hosszúságkülönbség a kettő között önkényesen minősíthető.

A jelen találmány egyláncú formáiban az a és/vagy β lánc tartalmazhat valamely CTP kiterjesztést, amely a nem kritikus területekbe van beiktatva.

Az a és β-alegységek „nem kritikus” területei a molekulának azon területei, amelyek nem szükségesek a biológiai aktivitáskor (ideértve az agonista és antagonista aktivitást egyaránt). Általában ezeket a területeket a kötőhelyekről, a prekurzor hasítási helyekről és a katalitikus területekről távolítják el. A megfelelő hajtogatás indukálásához, a receptorokhoz való kötődéshez, a katalitikus aktivitáshoz és hasonlókhoz kritikus területeket el kell kerülni; hasonlóképpen el kell kerülni azokat a területeket is, amelyek a fehérje háromdimenziós konformációjának biztosításában kritikusak. Meg kell jegyeznünk, hogy néhány terület, amely kritikus a dimer esetében, nem kritikussá válik az egyláncú formában, mivel a konformációs korlátozás, amelyet az egyedi lánc előír, megszünteti ezeknek a területeknek a szükségességét. A nem kritikus területek megállapítása könnyen elvégezhető olyan módon, hogy a vizsgált területeket kiiktatjuk vagy módosítjuk, majd elvégezzük a kívánt aktivitáshoz szükséges méréseket. Azok a területek, ahol a módosítás az aktivitásban veszteséget eredményez, kritikusak; azok a területek, ahol a változás azonos vagy hasonló aktivitást eredményez (ideértve az antagonista aktivitást is), nem kritikusnak tekintendő.

Hangsúlyozzuk, hogy a „biológiai aktivitás” olyan aktivitást jelent, amely agonista vagy antagonista a natív hormon aktivitásával. így bizonyos területek kritikusak egy variáns, mint antagonista viselkedésénél, még akkor is, ha az antagonista nem képes közvetlenül nyújtani a hormon fiziológiai hatását.

így például az α-alegységnél a 33-59. helyekről úgy gondoljuk, hogy szükségesek a szignáltranszdukcióhoz, és a 20 aminosavas kiterjedés a karboxiterminálisnál szükséges a szignáltranszdukcióhoz és receptorkötéshez. A β-alegységgel való egyesüléshez kritikus területek között találjuk legalább a 33-58., és elsősorban a 37-40. gyököket.

Ahol a nem kritikus terület „proximális” az N- vagy C-terminálishoz, a beiktatás bármely helynél lehet a terminálistól számított 10 aminosavon belül, előnyösen 5 aminosavon belül, de elsősorban magánál a terminálisnál.

A „proximális” kifejezést általában olyan hely megjelölésére használjuk, amely 10 aminosavon belül, előnyösen 5 aminosavon belül van a szóban forgó helytől, és legelőnyösebben a szóban forgó helynél magánál van. így bizonyos variánsok tartalmazhatják egy glikozilezőhelyhez „proximális” aminosavak helyettesítését; a meghatározás itt helytálló. Ezenkívül az a és β-alegységek összekapcsolhatók egymással olyan helyeknél, amelyek proximálisak N- vagy C-terminálisukhoz.

Ahogyan itt használjuk, a „CTP egység” olyan aminosavszekvenciára vagy annak egy részére utal, amely a humán magzatburki gonadotropin β-alegységének karboxiterminálisánál található, és amely a C-terminálisnál lévő 112-118. aminosavak valamelyikétől a 145. gyökig terjed. így az egyes „komplett CTP egységek 28-34 aminosavat tartalmaznak, a CTP N-terminálisától függően. A 112-145. helyek közti natív szekvenciát a 2. ábrán mutatjuk be.

Egy „részleges” CTP egység olyan aminosavszekvenciát jelent, amely a 112-118. és 145. helyek közt található, de amelyből legalább egy aminosav ki van iktatva a lehetséges legrövidebb „komplett CTP egységből, vagyis a 118. és 145. helyek közti aminosavszekvenciából. A találmányba foglalt „részleges” CTP egységek tartalmaznak legalább egy O-glikozilezési helyet, ha agonista aktivitás kívánatos. A hormonok néhány nem glikozilezett formája antagonista és ilyen formában használható. A CTP egység négy ilyen helyet tartalmaz a szeringyököknél, mégpedig a 121. helynél (1. hely); 127. helynél (2. hely); 132. helynél (3. hely); és 138. helynél (4. hely). A CTP részleges formái, amelyek a találmány agonistáihoz használhatók, egyet vagy többet tartalmaznak az ilyen helyekből olyan sorrendben elrendezve, ahogyan ezek a natív szekvenciában megjelennek. így a találmány szerinti agonistákban alkalmazott „részleges” CTP egység magában foglalhatja mind a négy glikozilezőhelyet; az 1., 2. és 3. helyeket; az 1., 2. és 4. helyeket; az 1., 3. és 4. helyeket; a 2., 3. és 4. helyeket, vagy egyszerűen csak az 1. és 2. helyeket; az 1. és 3. helyeket; a 2. és 4. helyeket; vagy a 3. és 4. helyeket; vagy tartalmazhat csak egy ilyen helyet, vagyis az 1., vagy 2., vagy 3. vagy 4. helyet.

A kiterjesztések „tandem” beiktatása azt jelenti, hogy a beiktatás vagy kiterjesztés legalább két „CTP egység”-et tartalmaz. Az egyes CTP egységek lehetnek komplettek vagy fragmensek, natívak vagy variánsak. A tandem kiterjesztésben vagy kiiktatásban levő CTP egységek lehetnek azonosak, vagy lehetnek egymástól különbözők. így például a tandem kiterjesztés vagy beiktatás általában lehet részleges-komplett; részleges-részleges; részleges-komplett-részleges; komplett-komplett-részleges és hasonlók, ahol az egyes nevezett részleges vagy komplett CTP egységek lehetnek egymástól függetlenül variáns vagy natív szekvenciák.

A „kapcsolótag” egy olyan gyök (vagy maradék), amely összeköti az a és β szekvenciákat anélkül, hogy befolyásolná az aktivitást, amelyet az azonos a és β láncok, mint egy heterodimer tagjai egyébként mutatnának, vagy csak úgy változtatja meg az aktivitást, hogy az agonista aktivitást antagonista aktivitássá alakítja át. Az aktivitás szintje ésszerű határok között változhat, de a kapcsolótag jelenléte nem lehet olyan, hogy megfossza az egyláncú formát akár az értékes agonista, akár az értékes antagonista aktivitástól. Az egyláncú formának egyláncú formának kell maradnia, amikor ezt termelőközegéből kinyerjük, és azon heterodimer hormonális aktivitásának megfelelő aktivitást

HU 227 311 Β1 kell mutatnia, amelynek elemei képezik ezeket a komponenseket.

A hormonalegységek és a CTP egységek megfelelnek pontosan a natív hormonnak vagy CTP szekvenciának, vagy lehetnek variánsok. Ezekben a variánsokban a natív szekvenciában 1-10, előnyösen 1-8, és legelőnyösebben 1-5 aminosav különböző aminosavakkal van helyettesítve a natív aminosav ezen helyeinek aminosavaihoz viszonyítva, illetve 1-10, előnyösen 1-8, és legelőnyösebben 1-5 aminosav egyszerűen ki van iktatva; illetve lehetségesek mindezek kombinációi is. Amint fentebb hangsúlyoztuk, amikor az egyláncú forma nem kritikus területei meg vannak határozva, elsősorban a nem kritikus „hurkok” jelenlétének kimutatása révén, a kiiktatással vagy helyettesítéssel megváltoztatott aminosavszám 20-30-ra növekedhet, vagy bármely tetszőleges számra az aminosavszekvencia hosszúságától függően a szóban forgó nem kritikus területben. Az természetes, hogy a kiiktatások vagy helyettesítések több mint egy nem kritikus területen még nagyobb számú aminosavat eredményeznek az érintett egyláncú formában; a helyettesítési és kiiktatási stratégiák kombinálva is alkalmazhatók. A kumulatívan összekötött helyettesítések és kiiktatások nem eredményezik a hormonnal társult agonista vagy antagonista aktivitás jelentős eltűnését. A helyettesítéseknél előnyösek a natív aminosavak konzervatív analógjai.

A „konzervatív analóg” a szokásos értelemben olyan analógot jelent, amelyben a helyettesítő gyök ugyanabban az általános aminosavkategóriában található, mint az a gyök, amelyet helyettesít. A szakirodalomban az aminosavak be vannak osztva ilyen kategóriákba; ilyenről olvashatunk például az alábbi irodalmi helyen: Dayhoff és munkatársai: Atlas of Protein Sequences and Structure 5, 89-99 (1972). Általában a savanyú aminosavak esnek egy csoportba, a bázisos aminosavak egy másikba; a semleges aminosavak egy harmadikba, és így tovább.

Pontosabban az aminosavgyököket általában négy nagyobb alosztályba osztályozzuk az alábbiak szerint.

Savanyú (savas) aminosavak: a gyöknek negatív töltése van a H-ion elvesztésének következtében fiziológiai pH-értéken, és e gyököt a vizes oldat vonzza. így ezek a felületi helyeket keresik meg annak a peptidnek a konformációjában, amelyben benne foglaltatnak, amikor a peptid vizes közegben fiziológiai pH-értéken van.

Bázisos aminosavak: a gyöknek pozitív töltése van a H-ionnal való asszociáció következtében fiziológiás pH-η, és a gyököt a vizes oldat vonzza. így ezek a felületi helyeket keresik meg annak a peptidnek a konformációjában, amelyben benne foglaltatnak, amikor a peptid vizes közegben fiziológiás pH-értéken van.

Semleges/nem poláris aminosavak: a gyökök nem töltöttek fiziológiás pH-η, és a gyököt a vizes oldat taszítja. így ezek a belső helyeket keresik meg egy peptid konformációjában, amelyben benne foglaltatnak, amikor a peptid vizes közegben van. Ezeket a gyököket nevezik „hidrofób”-nak is.

Semleges/poláris aminosavak: a gyökök nem töltöttek fiziológiás pH-η, de a gyököt a vizes oldat vonzza, így ezek a külső helyeket keresik meg egy peptid konformációjában, amelyben benne foglaltatnak, amikor a peptid vizes közegben van.

Meg kell értenünk természetesen, hogy az egyes gyökmolekulák statisztikai gyűjteményében bizonyos molekulák feltöltődnek, és bizonyosak nem, és lesznek vonzások vagy taszítások vizes közegből kisebb vagy nagyobb mértékben. Abból a célból, hogy megfeleljen a „töltött” meghatározásnak, az egyes molekulák jelentős százalékának (legalább mintegy 25 százalékának) töltöttnek kell lennie. A vonzásnak vagy taszításnak a poláris vagy nem poláris beosztályozáshoz szükséges mértéke tetszőleges, ezért a találmány által speciálisan tervezett aminosavakat néha egyik, néha másik osztályba osztályoztuk. Több, meg nem nevezett aminosavat beosztályozhatunk ismert viselkedésük alapján.

Az aminosavgyököket további alosztályokba oszthatjuk be, például gyűrűs vagy nem gyűrűs, aromás vagy nem aromás, de osztályozhatunk a gyökök oldalláncainak helyettesítő csoportjait figyelembe véve, vagy e lánc hosszúságát figyelembe véve. A gyök kicsinek tekinthető, ha összesen négy szénatomot vagy ennél kevesebbet tartalmaz, beleértve a karboxilcsoport szénatomját is. A kis gyökök természetesen sohasem aromásak.

A természetben előforduló fehérjék aminosavainál alkalmazható az osztályozás alábbi vázlata.

Savanyú (savas) aminosavak: aszparaginsav, glutaminsav;

Bázisos/nem gyűrűs aminosavak: arginin, lizin;

Bázisos, gyűrűs aminosav: hisztidin;

Semleges, poláros, kis aminosavak: glicin, szerin, cisztein;

Semleges, apoláros, kis aminosav: alanin;

Semleges, poláros, nagy, nem aromás aminosavak: treonin, aszparagin, glutamin;

Semleges, poláros, nagy, aromás aminosav: tirozin;

Semleges, apoláros, nagy, nem aromás aminosavak: valin, izoleucin, leucin, metionin;

Semleges, apoláros, nagy, aromás aminosavak: fenil-alanin, triptofán.

A génnel kódolt szekunder prolin aminosav, bár technikailag a semleges/nem poláris/nagy/gyűrűs és nem aromás csoporton belül van, speciális eset ismert hatásainál fogva a peptidlánc szekunder konformációjára, ennélfogva nem foglaljuk be ebbe a meghatározott csoportba.

Amennyiben a találmány szerinti egyláncú fehérjéket rekombináns eljárásokkal alkothatjuk meg, ezek csak génnel kódolható aminosavhelyettesítéseket tartalmazhatnak; ha azonban bármely rész más standard módszerekkel, például szilárd fázisú eljárással vagy más peptidszintézissel van szintetizálva, majd például enzimesen ligáivá a többi fehérjerészhez, génnel nem kódolható aminosavakat, például amino-izovajsavat (Aib), fenil-glicint (Phy) és hasonlókat is helyettesíthetünk be az analóg vegyületbe.

HU 227 311 Β1

Ezek között a nem kódolható aminosavak között találjuk például a β-alanint (β-Ala), vagy más omega-aminosavakat, például a 3-amino-propionsavat, a 4-amino-vajsavat, és így tovább; a szarkozint (Sár), ornitint (Orn), citrullint (Cit), terc-butil-alanint (t-BuA), terc-butilglicint (t-BuG), N-metil-izoleucint (N-Melle) és a ciklohexil-alanint (ChA), a norleucint (Nle), a ciszteinsavat (CyA), a 2-naftil-alanint (2-Nal); az 1,2,3,4-tetrahidroizokinolin-3-karboxilsavat (Tic); a merkapto-valeriánsavat (Mvl), a β-2-tienil-alanint (Thi) és a metionin-szulfoxidot (MSo). Ezek mind könnyen beosztályozhatók a megfelelő kategóriákba.

A fenti definíciókat alkalmazva:

Sár, β-Ala és Aib: semleges, poláris, kicsi; t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nle, Mvl és Cha: semleges, nem poláris, nagy, nem aromás;

Orn: bázisos, nem gyűrűs;

Cys: savanyú;

Cit, acetil-Lys és MSO: semleges, poláros, nagy, nem aromás; és

Phy, NaL, Thi és Tic: semleges, apoláros, nagy aromás.

A különböző omega-aminosavak osztályozhatók méretük szerint, így lehet például semleges, nem poláris, kicsi (például 3-amino-propionsavJ-alanin, 4-amino-vajsavj-alanin) vagy nagy (minden további).

így azok az aminosavhelyettesítések is beleértendők a találmány oltalmi körébe eső peptidvegyületek közé, amelyek génnel nem kódolhatók; ezek szerkezetük alapján beosztályozhatók az általános osztályozási sémába.

Az alábbiakban előnyös kiviteli formákat mutatunk be az egyláncú hormonoknál.

A találmány szerinti egyláncú hormonok a leghatásosabban és leggazdaságosabban rekombináns technikákkal állíthatók elő. Ennélfogva is a és β láncoknak, a CTP egységeknek és más kapcsolótag gyököknek azok a formái előnyösek, amelyek csak génnel kódolható aminosavakat foglalnak magukban. Amint fentebb jeleztük, lehetséges azonban az egyláncú hormonok legalább egy részét szintetikus peptid technikák alkalmazásával vagy más szerves kémiai technika alkalmazásával megalkotni; ennélfogva azok a variánsok, amelyek tartalmaznak génnel nem kódolható aminosavakat, szintén a találmány oltalmi körén belül vannak.

A találmány szerinti egyláncú hormonok legelőnyösebb kiviteli formájában a β-alegység C-terminálisa kovalensen össze van kötve, kívánt esetben valamely kapcsolótagon keresztül az érett α-alegység N-terminálisával; azok a formák, ahol az α-alegység C-terminálisa a β-alegység N-terminálisával van összekapcsolva, szintén hasznosak, de kisebb az aktivitásuk akár antagonistaként, akár agonistaként a releváns receptorhoz. A kapcsolódás lehet közvetlen peptidkapcsolás, ahol az egyik alegység C-terminális aminosava közvetlenül kapcsolódik peptidkötéssel a másik N-terminálisához; sok esetben azonban előnyös beiktatni egy kapcsolótag gyököt is a két terminális közé. Sok esetben a kapcsolótag legalább egy β-fordulatot nyújt a két lánc között. A prolingyökök jelenléte a kapcsolótagokon ennélfogva előnyös.

Amint fentebb már leírtuk, az a lánc N-terminálisát összeköthetjük a β lánc N-terminálisával is, vagy az a lánc C-terminálisát a β lánc C-terminálisával, minden esetben valamely kapcsolótagegységen keresztül; minden hasonló kombináció benne foglaltatik a két a vagy két β-alegységből álló egyláncú formákba.

Meg kell értenünk, hogy amikor az egyláncú formákat alkotó alegységek terminálisai közti kapcsolatokat tárgyaljuk, egy vagy több terminális megváltozhat helyettesítéssel és/vagy kiiktatással, amint fentebb már jeleztük.

A két β-alegységet tartalmazó egyláncú vegyületek előnyös kiviteli formái azok, amelyekben az egyik egység C-terminálisa össze van kapcsolva a másik egység N-terminálisával, kívánt esetben valamely kapcsolótagon, előnyösen peptid kapcsolótagon keresztül. Az is lehetséges a fentebb leírtak szerint, hogy a két β lánc C-terminálisai között alakulnak ki kötések; ilyen esetekben természetesen feltétlenül szükséges kapcsolótag.

Már leírtuk a fej-fej, farok-farok és fej-farok kombinációkat mind az egyláncú heterodimerek, mind a két β-alegységből álló egyláncú formánál; a kapcsolat azonban a két alegység között megtörténhet olyan helyeknél is, amelyek nem pontosan az egyes tagok Cvagy N-terminálisainál vannak, hanem azokhoz proximális helyeknél.

A kiviteli formák egyik különösen előnyös sorozatában a kapcsolat fej-farok rendszerű, és a kapcsolótag gyök magában foglal egy vagy több CTP egységet és/vagy variánst, vagy ezek csonkított formáját. Az ilyen kapcsolótag gyökökben alkalmazott CTP egységek előnyös formáit a későbbiekben írjuk le.

A kapcsolótag gyök továbbá magában foglalhat valamely gyógyszert is kovalensen, előnyösen könnyen lehasíthatóan kötve a kapcsolótag gyökhöz. A gyógyszer hozzákapcsolását a kapcsolótag gyökhöz és könnyű lehasíthatóságát hagyományos eljárásokkal lehet biztosítani.

A kapcsolótag gyökökben való előforduláson kívül a CTP és variánsai, valamint csonkított darabjai benne lehetnek az egyláncú hormont alkotó alegységek bármely nem kritikus területében is. Ezeknek a beiktatásoknak a természete és lehetséges helyzetei részletesen meg vannak adva itt, az eredeti bejelentésben.

Bár a CTP egységek az előnyös beiktatások a kapcsolótag gyökben, meg kell érteni, hogy a kapcsolótag lehet bármely alkalmas, kovalensen kötött anyag, amely a megfelelő térbeli kapcsolatot biztosítja az aés β-alegységek között. így a fej-farok konfigurációkban a kapcsolótag általában tetszőleges számú, de tipikusan 100-nál kevesebb, még előnyösebben 50-nél kevesebb aminosavból álló peptid, amely a megfelelő hidrofil/hidrofób aránnyal bír, hogy az oldatban alkalmas térbeli elrendeződés és megerősödés alakuljon ki. A kapcsolótagnak olyan hidrofil egyensúlyt kell kialakítania, hogy ez legyen jelen a környező oldatban, és nem szabad hatással lennie az a és β-alegységek vagy a két β-alegység közti kölcsönhatásra. Előnyös,

HU 227 311 Β1 ha a kapcsolótag foglal magában β-fordulatokat, amelyeket tipikusan prolingyökök szolgáltathatnak. Bármely alkalmas polimer, ideértve a peptid kapcsolótagokat is, amely a fentebb leírt korrekt jellemzőkkel bír, használható.

Egy adott kapcsolótag, amely nem foglaltatik benne a találmány oltalmi körébe, az, amely magában foglal egy szignálpeptidet közvetlenül „upstream” a „downstream” alegységtől.

A jelen találmány szerinti egyláncú hormonok különösen előnyös kiviteli formái az alábbiak:

PFSH-α; pFSH-pFSH; pFSH-pLH; pLH-a; PLH-PLH; pLH-pFSH; pTSH-a; pTSH-pTSH; pTSH-pFSH; pCG-a; p-CG-p-CG; pCG-pFSH; pFSH-CTP-a; pFSH-CTP-pFSH; pFSH-CTP-pLH; pLH-CTP-a; pLH-CTP-pLH; pLH-CTP-pFSH; pCG-CTP-a; pFSH-CTP-CTP-pLH; PFSH-CTP-CTP-a; pFSH-CTP-CTP-pTSH; pLH-CTP-CTP-a; pLH-CTP-CTP-pLH; pCG-CTP-CTP-a; pCG-CTP-CTP-pLH; a-a; a-CTP-a; és a-CTP-CTP-a;

és hasonlók. Különösen előnyösek az alegységek humán formái. A fenti konstrukciókban a „CTP” vonatkozik a CTP-re vagy variánsaira vagy csonkított formáira, amint a későbbiekben majd leírjuk.

Az alábbiakban ismertetjük a CTP egységek előnyös kiviteli formáit.

A találmány szerinti egységekhez alkalmazott megjelölések az alábbiak: a komplett CTP egység részleteinél az adott részletben belefoglalt helyeket azokkal a számaikkal jelöljük, amelyek a 2. ábrán láthatók. Ahol helyettesítések történnek, a helyettesített aminosavakat olyan indexszámmal látjuk el, amely jelzi a helyét, így például a CTP (120-143) a CTP-nek azt a részletét képviseli, amely a 120. helytől a 143. helyig terjed; a CTP (120-130; 136-143) egy fuzionált aminosavszekvenciát képvisel, amelyből hiányzanak a natív szekvencia 118-119., 131-135. és 144-145. helyei. A CTP (Arg¹²²) olyan variánsra utal, ahol a 122. helynél levő lizin argininnel van helyettesítve; a CTP (Ile¹³⁴) olyan variánsra utal, ahol a 134. helyen levő leucin izoleucinnel van helyettesítve. A CTP (Val¹²⁸ Val¹⁴³) olyan variánst képvisel, ahol két helyettesítés történt, egyik a 128. helyen levő leucinnál és a másik a 142. helyen lévő izoleucinnál. A CTP (120-143; Ile¹²⁸ Alá¹³⁰) a CTP egység olyan releváns részletét képviseli, ahol elvégezték a két jelzett helyettesítést is.

A CTP variánsok között előnyösek azok is, amelyekben egy vagy több glikozilezőhely meg van változtatva vagy ki van iktatva. A glikozilezés kizárására szolgáló változtatásnak az adott helyen előnyös eszköze egy alaningyök kicserélése szeringyökre.

Különösen előnyösek az alábbi képletű CTP egységek:

1., CTP (116-132)

2., CTP (118-128; 130-135)

3., CTP (117-142)

4., CTP (116-130)

5., CTP (116-123; 137-145)

6., CTP (115-133; 141-145)

7., CTP (117-140; Ser¹²³ Gin¹⁴⁰)

8., CTP (125-143; Alá¹³⁰)

9., CTP (135-145, Glu¹³⁹)

10., CTP (131-143, Val¹⁴² Val¹⁴³)

11., CTP (118-132)

12., CTP (118-127)

13., CTP (118-145)

14., CTP (115-132)

15., CTP (115-127)

16., CTP (115-145)

17., CTP (112-145)

18., CTP (112-132)

19., CTP (112-127)

Az a- és β-alegységek natív formái az egyláncú formában természetesen az előnyös kiviteli formák között vannak. Van azonban néhány előnyös variáns is.

Az antagonista aktivitáshoz különösen előnyösek az α-alegység azon variánsai, amelyekben az 52. helyen lévő N-kapcsolt glikozilezési helyet eltüntetjük vagy megváltoztatjuk aminosavhelyettesítéssel ennél a helynél vagy ehhez proximális helyen. Ugyancsak előnyösek a hasonló módosítások a 78. helynél levő glikozilezési helynél. Egy vagy több aminosav kiiktatása a 85-92. helyek között szintén hat az α-alegységet tartalmazó hormon aktivitásának természetére, és az aminosavak helyettesítése vagy kiiktatása ezeknél a helyeknél szintén az előnyös kiviteli formák között van.

Hasonlóképpen az N-kapcsolt glikozilezési helyek a p láncban célszerűen módosíthatók, hogy megakadályozzuk a glikozilezést, és így hassunk a p láncok agonista vagy antagonista aktivitására. Ha CTP van jelen natív módon, mint a CG-ben, vagy egy kapcsolótag tagjaként, az O-kötött glikozilezési helyek ezekben a gyökökben szintén megváltoztathatók.

Különböző variánsokról, amelyek módosított vagy kiiktatott glikozilezési helyeket tartalmaznak, olvashatunk az alábbi helyeken: Yoo J. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 13034-13042 (1993); Yoo J. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 17741-17743 (1991); Bielinska M. és munkatársai: J. Cell. Bioi. 111, 330a (1990) (ezeket már korábban is idéztük); továbbá Matzuk Μ. M. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 2409-2414 (1989); Keene J. L. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 4769-4775 (1989); és Keene J. L. és munkatársai: Mól. Endocrinol. 3, 2011-2017 (1989).

Nem csupán a glikozilezőhelyeket magukat lehet közvetlenül módosítani, hanem az ezekhez a helyekhez proximális helyeket is előnyösen módosítani lehet úgy, hogy a mutáns glikozilezési státusára hatni lehessen. Az α-alegységnél például azok a variánsok kedvezőek, amelyekben az 50. és 60. helyek közti aminosavak vannak helyettesítve, ideértve mind a hagyományos, mind a nem hagyományos helyettesítéseket. Különösen előnyösek itt a helyettesítések az 51., 53. és 55. helyeken az Asn₅₂ helynél lévő glikozilezési hely közelsége miatt.

Előnyösek az α-alegység azon mutánsai is, amelyekben a 91. helyen levő lizin metioninná vagy glutaminsavvá van átalakítva.

HU 227 311 Β1

Bár az egyes alegységekben a variációk szempontjából szinte minden variánst megtárgyaltunk a fentiekben, fel kell hívnunk a figyelmet arra, hogy a dimer egyláncú formái még számos lehetőséget kínálnak a módosításra. így például azok a területek, amelyek a dimer összehajtogatásánál kritikusak, lehet, hogy nem kritikusak az egyláncú molekula korrekt konformációjához, így ezek a területek rendelkezésre állnak a változtatáshoz az egyláncú formában, bár nem írtuk le ezeket a dimer forma egyes tagjai szempontjából. Az egyláncú formák módosíthatók továbbá drámai módon azon nem kritikus területekkel kapcsolatban is, amelyek megváltoztatása és/vagy kiiktatása nem hat a biológiai aktivitásra, amint ezt fentebb leírtuk.

Az alábbiakban ismertetjük az alkalmazható gyógyszereket.

Az alkalmas gyógyszerek között, amelyek a kapcsolótag gyökben részt vehetnek, találjuk a peptideket vagy fehérjéket, mint például az inzulinszerű növekedési faktorokat, felhám (epidermisz) növekedési faktorokat, savanyú és bázisos fibroblaszt növekedési faktorokat, vérlemezke-eredetű növekedési faktorokat, különböző telepstimuláló faktorokat (CSF), mint például a granulocita-CSF-et, makrofág-CSF-et és hasonlókat, valamint a különböző citokineket, mint például az IL-2-t, IL-3-at, és további interleukin fehérjék sokaságát, különböző interferonokat, tumornekrózis-faktort és hasonlókat. A peptid- vagy fehérjealapú gyógyszereknek az az előnye, hogy ezek belefoglalhatok az egyedi láncba, és így a teljes konstrukciót könnyen el lehet készíteni egyetlen gén rekombináns kifejezésével. Alkalmazhatók továbbá kis molekulák is, mint például antibiotikumok, toxinok és hasonlók.

Általában a kapcsolótag gyökön belül elhelyezkedő gyógyszerek olyanok, amelyeknek azon receptornak a közelségében kívánatos tevékenykedniük, amelyekhez a hormonok rendszeresen kötődnek. Megfelelően gondoskodni kell arról, hogy a gyógyszer a kapcsolótagon belüli bezártságból ki tudjon szabadulni például úgy, hogy enzimmel katalizálható lízishelyeket is építenek be, amint ezeket majd a későbbiekben az előállítási eljárásoknál leírjuk.

Az alábbiakban beszámolunk a további módosítási lehetőségekről.

A találmány szerinti egyláncú fehérjéket tovább párosíthatjuk, vagy származékokat készíthetünk belőlük olyan módokon, amelyek az aminosavszekvenciák származékképzésénél általában használatosak; ilyenek például a foszforilezés, glikozilezés, a rendesen glikozilezett formák deglikozilezése, az aminosav-oldalláncok módosítása (például a prolin átalakítása hidroxi-prolinná) és hasonló módosítások, amelyek analógok azokkal a transzláció utáni eseményekkel, amelyekről ismeretes, hogy általában elő szoktak fordulni.

A találmány szerinti hormonok glikozilezési státusa különösen fontos. A hormonokat nem glikozilezett formában elő lehet állítani vagy úgy, hogy prokarióta gazdaszervezetben állítjuk elő ezeket, vagy úgy, hogy a nor alegységekben és/vagy bármely jelen lévő CTP egységben normálisan jelen lévő glikozilezőhelyeket mutáljuk. A hormonoknak mind nem glikozilezett, mind részlegesen glikozilezett változatait előállíthatjuk a glikozilezési helyek manipulálásával. Normálisan a glikozilezett változatok természetesen a találmány oltalmi körén belül vannak.

Amint a szakterületen általánosan ismert, a találmány szerinti egyláncú fehérjék jelölőkhöz, hordozókhoz, szilárd rögzítőanyagokhoz és hasonlókhoz is kapcsolhatók. A jelzett formákat alkalmazhatjuk a metabolikus pálya követésére; az erre a célra alkalmas jelzések között találjuk elsősorban a radioizotóp jelzéseket, például a jód-131-et, a technécium-99-et, az indium11 -et és hasonlókat. A jelzések alkalmazhatók az egyláncú kimutatásának közvetítésére vizsgálati rendszerekben; ebben az esetben is alkalmazhatók a radioizotópok, de az enzimes jelzések, fluoreszcens jelzések, kromogén jelzések és más hasonlók is. Az ilyen jelzések alkalmazása különösen hasznos ezeknél a fehérjéknél, mivel ezek a receptor ligandum ágenseket célozzák meg.

A találmány szerinti fehérjék összekapcsolhatók hordozókkal is, hogy fokozzuk ezek immunogenicitását olyan antitestek készítésében, amelyek fajlagosan immunreaktívak ezekkel az új, módosított formákkal. Az erre a célra alkalmas hordozók között találjuk a kulcslyuk kagyló (keyhole limpet) hemocianint (KLH), a szarvasmarha-szérumalbumint (BSA), a diftéria toxoidot és hasonlókat. A találmány szerinti módosított peptidek kapcsolásához alkalmas standard kapcsolási technikákat alkalmazhatnak, ideértve a kétfunkciós kapcsolótagok felhasználását.

Hasonló kapcsolási technikák, de mások is alkalmazhatók a fehérjék kapcsolására szilárd rögzítőanyagokhoz. Amikor ezekhez hozzákapcsoltuk, a fehérjéket affinitásos reagensként alkalmazhatjuk olyan kívánt komponensek elkülönítésére, amelyekkel fajlagos reakciót mutatnak.

Az alábbiakban ismertetjük az előállítási eljárásokat.

Azok az eljárások, amelyekkel a találmány szerinti fehérjék megalkothatok, a szakterületen jól ismertek. Amint fentebb ismertettük, ha a fehérje csak génnel kódolható aminosavakat tartalmaz, és az egyedi lánc fejfarok konfigurációjú, a legpraktikusabb megközelítés jelenleg, ha ezeket az anyagokat rekombináns eljárással szintetizáljuk a kívánt fehérjét kódoló DNS kifejezésével. Az egyláncú formát, beleértve a variánsokat is, kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-t natív szekvenciákból állíthatjuk elő. A helyre irányuló mutagenezisnek, a további szekvenciák ligálásának, a PCR-nek és a megfelelő kifejezőrendszerek megalkotásának technikái mostanra már mind jól ismertek a szakterületen. A kívánt fehérjét kódoló DNS egészét vagy részét szintetikusan alkothatjuk meg standard szilárd fázisú technikákkal előnyösen úgy, hogy restrikciós helyek is legyenek benne a ligálás megkönnyítésére. A zárt kódoló szekvencia transzkripciójához és transzlációjához megfelelő szabályozóelemeket építhetünk be a DNS kódolószekvenciákhoz. Amint ismeretes, most már állnak rendelkezésre kifejezőrendsze10

HU 227 311 Β1 rek, amelyek gazdaszervezetek széles választékával kompatibilisek, a gazdaszervezetek közé értve a prokarióta gazdaszervezeteket, mint például a baktériumokat, és az eukarióta gazdaszervezeteket, mint az élesztőket, növényi sejteket, rovarsejteket, emlőssejteket, madársejteket és hasonlókat.

A gazdaszervezet kiválasztását különösen a transzláció utáni eseményekre, elsősorban a glikozilezésre figyelemmel kell elvégezni. A glikozilezési helyeket a molekulán belüli glikozilezési helyek természete szabályozza; az ezeket a helyeket elfoglaló cukrok természetét viszont nagymértékben a gazdaszervezet természete szabályozza. Következésképpen a találmány szerinti hormonok tulajdonságainak finom beállítását a gazdaszervezet megfelelő kiválasztásával érhetjük el.

Az α-alegység rész génjének különösen előnyös formája - az α-alegység akár módosított, akár nem módosított - a „minigén” konstrukció.

Ahogyan itt alkalmazzuk, az α-alegység „minigén arra a génkonstrukcióra vonatkozik, amelyet Matzuk M. M. és munkatársai írnak le az alábbi irodalmi helyen: Mól. Endocrinol. 2, 95-100 (1988); ebben a pM²/CG a és a pM²/a megalkotását írják le. Ezt a minigént az jellemzi, hogy csak a 3. exon és a 4. exon közti intron őrződik meg benne, az összes „upstream” intron viszont ki van iktatva. A leírt konstrukcióban az N-terminális kódolószekvenciákat, amelyek a 2. exonból és a 3. exon egy részéből származnak, a cDNS szolgáltatja, és ezt közvetlenül ligáljuk egy Xbal restrikciós helyen keresztül a 3. exon kódolószekvenciájába úgy, hogy az

I. és II. exonok közti és a II. és lll. exonok közti intronok nincsenek jelen. A lll. és IV. exonok közti intron, valamint a kódolószekvencia 3’-szignáljai azonban megőrződnek. Az így létrejövő minigén könnyen beiktatható mint BamHI/BglII szegmentum. Egy hasonló minigén megalkotásához természetesen más eszközök is lehetségesek, és a meghatározás nem korlátozódik az adott konstrukcióhoz, ahol a kódolószekvenciák egy Xbal hely révén vannak ligáivá. A gén konstrukciójához azonban ez kényelmes eljárás, és más megközelítéseknek, mint például a gén szintetikus vagy részben szintetikus előállításának nincs különösebben előnye. A meghatározás magában foglalja az α-alegység azon kódolószekvenciáit, amelyek megőrzik a lll. és IV. exonok közti intront, vagy bármilyen más intront, és előnyösen semmiféle más intront.

A rekombináns termeléshez megfelelő kifejezőrendszereket használó módosított gazdasejteket alkalmazunk, és ezt tenyésztjük, hogy a kívánt fehérjéket termeljük. Az alábbiakban a következő kifejezéseket használjuk.

Egy „módosított” rekombináns gazdasejt, vagyis olyan sejt, amely „módosított tartalmú” a találmány szerinti rekombináns kifejezőrendszerrel, olyan gazdasejtre utal, amelyet megváltoztattak ennek a kifejezőrendszernek a befogadására valamilyen alkalmas bevezetőeljárással, ideértve az átfertözést, vagyis transzfekciót, vírusfertőzést, és így tovább. A „módosított” kifejezés olyan sejtekre utal, amelyek azt a kifejezőrendszert tartalmazzák, legyen a rendszer akár a kromoszómába integrálva, akár extrakromoszomális. A „módosított” sejtek lehetnek stabilak a kifejezőrendszer bezárása szempontjából, de lehetnek nem stabilak is. Röviden összefoglalva, a „módosított” rekombináns gazdasejtek, amelyek a találmány szerinti kifejezörendszerrel bírnak, olyan sejtekre vonatkoznak, amelyek ezt a kifejezőrendszert valamilyen manipuláció révén fogadták be, mivel natív formában ezzel nem rendelkeztek. Ennek a meghatározásnak a szempontjából nem kell tekintetbe venni, hogy a leépítés milyen módon történt.

A „kifejezőrendszer” kifejezés olyan DNS-molekulára utal, amely magában foglal egy kifejezendő kódoló nukleotidszekvenciát és azokat a kísérő szabályozószekvenciákat, amelyek szükségesek a kódolószekvencia kifejezésének végrehajtására. Ezek a szabályozóelemek magukban foglalnak egy promotort, terminációs szabályozószekvenciákat és bizonyos esetekben valamilyen operátort vagy más mechanizmust, amely szabályozza a kifejeződést. A szabályozó- (kontroll-) szekvenciák olyanok, amelyeket egy adott rekombináns célgazdasejtben terveztek működőképessé, ezért a gazdasejtet úgy kell megválasztanunk, hogy kompatibilis legyen a megalkotott kifejezőrendszerben levő szabályozószekvenciákkal.

Amennyiben a termelt fehérje kiválasztása (szekréciója) kívánatos, további nukleotidszekvenciák jelenléte is szükséges, amelyek valamely szignálpeptidet kódolnak; így olyan terméknek kell kialakulnia, amelyben a szignálpeptid működőképesen kapcsolódik a kívánt egyláncú hormonhoz; ez a termék az előfehérje, más néven preprotein. A kiválasztódáshoz a szignálpeptid lehasad, és kibocsátja az érett egyláncú hormont.

A leírásban a „sejt”, „sejttenyészet” és „sejtvonal” kifejezések egymással cserélhető módon alkalmazhatók, különösebb figyelem nélkül a jelentés finom árnyalataira. Ahol közöttük a megkülönböztetés fontos, az világos lesz a szövegösszefüggésből. Ahol bármelyik jelentés alkalmazható, mindegyiket bele kívánjuk érteni a szövegbe.

A termelt fehérjét a sejtek lizátumából nyerhetjük ki, ha intracellulárisan termeltük, vagy a tápközegből, ha kiválasztottuk oda. A rekombináns fehérjék sejttenyészetekből való kinyeréséhez alkalmas technikák jól ismertek a szakterületen, és ezeket a fehérjéket ismert technikák alkalmazásával tisztíthatjuk; ilyenek például a kromatográfia, gélelektroforézis, szelektív kicsapás és hasonlók.

A találmány szerinti hormonok egy részét vagy egészét közvetlenül is lehet szintetizálni a szakterületen jól ismert peptidszintézis-technikákkal. A szintetizált részeket ligálhatjuk, és a kapcsolótag gyökben található bármilyen gyógyszer kiszabadításához alkalmas helyeket is kialakíthatunk standard kémiai eljárásokkal. Azoknál a kiviteli formáknál, amelyek génnel nem kódolható aminosavakat tartalmaznak, és azoknál a kiviteli formáknál, amelyeknél fej-fej vagy farok-farok konfigurációt alkalmazunk, a szintézist legalább részben fehérjeszinten kell végezni. A fej-fej csatlakozásokat a természetes N-terminálisoknál vagy a természetes

HU 227 311 Β1

N-terminálisokhoz proximális helyeknél olyan kapcsolótagok segítségével létesíthetjük, amelyek aminocsoportokkal reaktív funkcionális csoportokat tartalmaznak; ilyenek például a dikarbonsavszármazékok. A farok-farok konfigurációkat a C-terminálisoknál vagy a C-terminálisokhoz proximális helyeknél olyan kapcsolótagok révén alakíthatjuk ki, mint például diaminok, diolok, vagy ezek kombinációi.

Az alábbiakban az új vegyületek ellen kialakítható antitestekkel foglalkozunk.

A találmány szerinti fehérjék alkalmasak arra, hogy ezekkel az új vegyületekkel fajlagosan immunreaktív antitesteket váltsanak ki. Ezek az antitestek sokféle diagnosztikai és terápiás alkalmazásban lehetnek hasznosak. így például amikor a találmány szerinti egyláncú formát terápiásán alkalmazzuk ember- vagy állatgyógyászatban, a gyógyszer szintjét ilyen antitesteket alkalmazva követhetjük, hagyományos immunassay technikákat alkalmazva. Ezenkívül, mivel az ezen egyláncú formák által kiváltott antitestek közül néhányan keresztreaktívak a heterodimerrel, ezeket lehet alkalmazni a heterodimer természetben előforduló szintjeinek diagnosztizálására.

Az antitesteket általában standard immunizációs munkamenet alkalmazásával állítjuk elő emlősökben, például nyulakban, egerekben, juhokban vagy patkányokban, és az antitesteket mint poliklonális antiszérumokat titráljuk, hogy biztosítsuk a megfelelő immunizálást. A poliklonális antiszérumokat azután ilyen formában nyerjük ki és használjuk fel például immunassay vizsgálatokhoz. A gazdaszervezetből származó antitestkiválasztó sejteket, például lépsejteket vagy perifériás vér leukocitákat halhatatlanná tesszük, más szóval immortalizáljuk ismert technikákat alkalmazva, és megvizsgáljuk a találmány szerinti fehérjékkel immunfajlagos monoklonális antitestek termelésére.

A „fehérjékre immunspecifikus (vagy immunfajlagos)” kifejezés olyan antitestekre utal, amelyek immunfajlagosak az egyláncú fehérjékre, de nem fajlagosak a heterodimerekkel magukkal azokon az általános paramétereken belül, amelyeket az „affinitás” vagy „nem affinitás” meghatározására alkalmasnak tekintünk. Meg kell értenünk, hogy a fajlagosság relatív fogalom, és ki kell választanunk egy önkényes határvonalat - ilyen lehet például a 100-szoros vagy nagyobb különbség az immunreaktivitásban. így egy találmány szerinti immunfajlagos antitest legalább 100-szor reaktívabb az egyláncú fehérjével, mint a megfelelő heterodimerekkel.

Az alábbiakban megtárgyaljuk a találmány szerinti fehérjék kiszerelési formáit.

A találmány szerinti fehérjék olyan eljárások segítségével szerelhetők ki és adhatók be, amelyek az egyláncú formának megfelelő heterodimereknél már ismertek. így a kiszerelési és beadási eljárások változnak az alkalmazott hormontól függően. Az adagolási szint és gyakoriság azonban változhat a heterodimerekhez viszonyítva, különösen ha CTP egységek is vannak jelen. Ezek jelenléte ugyanis megnyújtott biológiai félélettartamot eredményezhet neki.

A találmány szerinti fehérjék kiszerelési eljárásai általában olyanok, mint amelyeket tipikusan használnak a fehérje- vagy peptidgyógyszereknél. Ilyeneket találhatunk például a már sokszor kiadott Remington’s Pharmaceutical Sciences legutóbbi kiadásában (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania). A fehérjék általában beadhatók injekció, tipikusan intravénás, intramuszkuláris, szubkután vagy intraperitoneális injekció formájában, vagy olyan kiszerelési módokat alkalmazva, amelyek nyálkahártyán vagy bőrön keresztüli bevezetést tesznek lehetővé. Ezek a kiszerelések általában tartalmaznak valamilyen detergenst vagy behatolást elősegítő segédanyagot, például epesavakat, fuzidinsavat vagy hasonlókat. Ezek a kiszerelési formák bevezethetők aeroszolként vagy végbélkúpként, vagy bőrön keresztüli bevezetés esetén bőrtapaszként.

Szájon keresztüli bevezetés is lehetséges, feltéve, hogy a kiszerelés megfelelően védi a találmány szerinti peptideket az emésztési rendszer lebontóhatásától.

Az adagolási rend és a kiszerelés optimalizálását rutinmódon végezhetjük, ahogyan ezt általában a szakterületen szokták végezni.

Az alábbiakban ismertetjük az alkalmazási eljárásokat.

A találmány szerinti egyláncú peptideket számos módon alkalmazhatjuk, legnyilvánvalóbban a hormonok heterodimer formáinak helyettesítésére. így a találmány szerinti egyláncú hormonok agonista formái a heterodimerekhez hasonlóan alkalmazhatók a meddőség kezelésére, mint segítőanyagok az in vitro termékenyítési technikákban, továbbá más gyógyászati eljárásokban, amelyek a natív hormonokkal kapcsolatban lehetnek, mind emberekben és állatokban.

Az egyláncú hormonok reagensként is alkalmazhatók a heterodimerek alkalmazásához hasonló módon.

Ezenkívül a találmány szerinti egyláncú hormonok diagnosztikai eszközként is alkalmazhatók biológiai mintákban a natív fehérjékre kiváltott antitestek jelenlétének vagy távollétének kimutatására. Ezek ellenőrző reagensként is alkalmazhatók olyan vizsgálókészletekben, amelyek ezen hormonok szintjének a mérésére készülnek. Maguk a hormonok vagy az ellenük kialakuló antitestek szintjeinek mérésére szolgáló munkamenet standard immunassay munkamenet, amely a szakterületen jól ismert. Alkalmazhatunk versengő és közvetlen vizsgálati eljárásokat, ideértve sokféle jelölési technikát is, mint például radioizotóp jelölést, fluoreszcens jelölést, enzimes jelölést és hasonlókat.

A találmány szerinti egyláncú hormonok alkalmazhatók az olyan receptorok kimutatására és tisztítására is, amelyekhez a natív hormonok kötődnek. így a találmány szerinti egyláncú hormonok hozzákapcsolhatók szilárd rögzítőanyagokhoz, és alkalmazhatók receptorok vagy hormonellenes antitestek affinitáskromatográfiás készítményeiben. Az így létrejövő receptorok maguk alkalmasak a hormonaktivitás mérésére gyógyszerjelölteknél a gyógyászati és reagens jelöltek alkalmassági sorozatvizsgálatában.

Végül a találmány szerinti hormonokkal fajlagosan reaktív antitestek alkalmazhatók tisztítási segédanyag12

HU 227 311 Β1 ként ezen anyagok izolálásához a későbbi készítményeknél. Ezek alkalmazhatók a gyógyszerként beadott egyláncú hormonok szintjeinek mérésére.

Az ezután következő példák célja a részletesebb bemutatás, de semmiképpen a találmány oltalmi körének korlátozása.

1. példa

CGp-a-f kódoló DNS előállítása

Az 1. ábra mutatja be egy beiktatás megalkotását egy olyan kifejezővektornál, ahol a humán CG β láncának C-terminálisa hozzá van kapcsolva az érett humán α-alegység N-terminálisához.

Amint az 1. ábrán bemutatjuk, a polimeráz-láncreakciót (PCR) alkalmazzuk a két alegység összekötéséhez a Οΰβ 3. exonja és az a-alegység 2. exonja között úgy, hogy a CGβ karboxiterminális aminosavához tartozó kodon közvetlenül egy leolvasókeretben legyen fuzionálva az α-alegység N-terminális aminosavának kodonjához. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy egy hibrid prímért alkalmazunk, így amplifikálunk egy olyan fragmentumot, amely tartalmazza a Οΰβ 3. exonját; ez a hibrid primer tartalmaz egy „faktort”, amely az a-alegység N-terminális szekvenciáját kódolja. A létrejött amp20 lifikált (kibővített) fragmentum így tartalmazza a 2. exonnak a humán CGa-t kódoló részét.

Ettől függetlenül a primerek egyikeként alkalmazunk egy hibrid prímért, amely az α-alegység N-terminális szekvenciáját kódolja a CGβ C-terminálisának megfelelő kodonokhoz fuzionálva; így lesz amplifikálva az a minigén. A két amplifikált (kibővített) fragmentumot, amelyeknek most mindegyike tartalmaz átfedő részleteket, amelyek a másik egységet kódolják, együtt amplifikáljuk tovább két további primerrel, amelyek befedik a teljes távolságot; így kapjuk meg a Sáli beiktatást.

Az 1. ábra reakciósémája részletesebben is bemutatja annak a fragmentumnak az előállítását, amely tartalmazza a CGβ 3. exonját és az érett α-alegység első négy aminosavát, valamint egy Sáli helyet az 5’ felé kódoló szekvenciától. Ezt úgy kaphatjuk meg, hogy a CGβ genomikus szekvenciájának egy részletét amplifikáljuk. Ezt a genomikus szekvenciát az alábbi irodalmi helyek ismertetik: Matzuk Μ. M. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6354-6358 (1987); Policastra P. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 258, 11492-11499 (1983).

Az 1. primer szolgáltatja a Sáli helyet, és az alábbi szekvenciával bír:

5-GGA GGA AGG GTG GTC GAC CTC TCT GGT-3’ Sáli

A másik primer, a 2. primer, komplementer az C-terminálisának öt szekvenciájával, és az alábbi szekN-terminális szekvencia négy aminosavával és a CGβ 30 venciával bír:

5’-CAC ATC AGG AGC | TTG TGG GAG GAT CGG-3’ < >|β >

Az így létrejött amplifikált szegmentum, amely az I. reakcióterméke, így rendelkezik egy Sáli hellyel 5’-irányban a fuzionált kódolóterülettől.

All. reakcióban analóg fuzionált kódolóterületet kapunk a fentebb leírt a minigénből. A 3. primer olyan hibrid primer, amely tartalmazza a β-alegység négy kodonját és az α-alegység öt kodonját, és az alábbi szekvenciával bír:

5’-ATC CTC CCA CAA | GCT CCT GAT GTG CAG-3’ 4—β| oc—>

A 4. primer tartalmaz egy Sáli helyet és komplementer az a-alegység 4. exonjának kiterjesztésével. 45 A 4. primer szekvenciája az alábbi:

5’-TGA GTC GAC ATG ATA ATT CAG TGA TTG TTG AAT-3’ Sáli így az I. és II. reakciók termékei átfednek, és amikor PCR-nek vetjük alá 1. és 4. primer jelenlétében, a kívánt Sáli termék termelődik, amint ez a lll. reakcióban látható.

A ΰΰβ 3. exonját és az a minigént tartalmazó amplifikált fragmentumot beiktatjuk a pM² HA-CGfj exon 1,2 kifejezővektor Sáli helyébe; ez a kifejezővektor a CGβ exonokat tartalmazó pM²-ből származik az alábbi irodalmi helyen leírt módon: Sachais B., Snider R. M., Lowe J.,

Krause J.: J. Bioi. Chem. 268 2319 (1993). A CGβ 1. és

2. exonjait tartalmazó pM² az alábbi irodalmi helyeken van leírva: Matzuk Μ. M. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6354-6358 (1987); és Matzuk Μ. M. és munkatársai: J. Cell. Bioi. 106, 1049-1059 (1988).

Ez a kifejezővektor azután termeli a humán CG egyláncú formáját, ahol a β-alegység C-terminálisa közvetlenül hozzá van kapcsolva az α-alegység N-terminálisához.

HU 227 311 Β1

2. példa

Az egyláncú humán CG termelése és aktivitása

Az 1. példában megalkotott kifejezővektort kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekbe fertőzzük át, és a fehérje termelését nátrium-dodecil-szulfát (SDS) gélen lévő radioaktív fehérje immunkicsapásával felbecsüljük. A tenyésztőközeget összegyűjtjük, és az egyláncú fehérje biológiai aktivitását a humán LH receptorhoz való versengő kötési vizsgálattal összehasonlítjuk a heterodimerrel. Ebben a vizsgálatban a teljes humán LH receptort kódoló cDNS-t beiktatjuk a pCMX kifejezővektorba, amelyről az alábbi irodalmi helyen olvashatunk: Oikawa J. X-C. és munkatársai: Mól. Endocrinol. 5, 759-768 (1991). Ezzel a vektorral 293 exponenciálisan növekedő sejtet fertőzünk át Chen C. és munkatársai eljárását alkalmazva, amely az alábbi irodalmi helyen olvasható: Mól. Cell. Bioi. 7, 2745-2752 (1987).

A vizsgálatban a humán LH receptort kifejező sejteket (2*10⁵/csö) inkubálunk 1 ng jelzett hCG-vel, versenyben a vizsgálati mintával, 22 °C hőmérsékleten 18 órán át. A mintákat ezután ötszörösére hígítjuk hideg Dulbecco-féle PBS-sel (2 ml), amely 0,1% szarvasmarha-szérumalbuminnal van kiegészítve, és centrifugálunk 800xg-nél 15 percen át. Az üledéket azután kétszer mossuk Dulbecco-féle PBS-sel, és meghatározzuk a radioaktivitást gamma-számlálóval. A fajlagos kötés a minta távollétében beadott teljes jelzett (jódozott) hCG 10-12%-a. A jelzés csökkenése a minta jelenlétében méri a mintában a kötési képességet. Ebben a vizsgálatban 293 sejtben lévő humán LH receptorra viszonyítva a vad típusú hCG-nek az ED₅₀-értéke 0,47 ng, míg az egyláncú fehérje ED₅₀-értéke 1,1 ng.

Egy további, agonista aktivitásra vonatkozó vizsgálatban megmérjük a cAMP-termelés stimulálását. Ebben az esetben humán LH receptorokat kifejező 293 sejtet (2x10⁵/cső) inkubálunk heterodimer hCG vagy egyláncú hCG különböző koncentrációival és 18 órán át tenyésztünk. Az extracelluláris cAMP-szinteket fajlagos radioimmunassay-vel meghatározzuk, amint ez az alábbi irodalmi helyen olvasható: Davoren J. B. és munkatársai: Bioi. Repród. 33, 37-52 (1985). Ebben a vizsgálatban a vad típus ED₅₀-értéke 0,6 ng/ml, míg az egyláncú forma ED₅₀-értéke 1,7 ng/ml. (Az ED₅₀ a hatásos dózis 50%-a.) így a vad típus és az egyláncú formák viselkedése minden esetben hasonló.

3. példa

További aktivitási vizsgálatok

A fjFSH-CTP-α egyláncú konstrukcióhoz tartozó kifejezővektorok átfertőzött CHO sejtekből származó tápközegét kinyerjük, és a 2. példában leírtak szerint vizsgáljuk. Az FSH receptorhoz való kötődés versengő vizsgálatának eredményeit a 3. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt jelzik, hogy az egyláncú forma hatékonyabb, mint akár a vad típusú FSH, akár a β láncnál CTP kiterjesztést tartalmazó FSH, az FSH-nak magának a receptorhoz való kötődésének gátlásában. Az ED₅₀-érték az egyláncú formában mintegy mIU/ml (IU=nemzetközi egység), míg az ED₅₀-érték a kiterjesztett heterodimerben valamivel a 100 mIU/ml fölött van. Ez a vad típusú FSH-nál mintegy 120 mIU/ml.

A szignáltranszdukció eredményeit a 4. ábrán mutatjuk be. Az FSH mindhárom típusának hatékonysága hasonló.

4. példa

További kifejezővektorok megalkotása

Az 1. példában leírtakhoz hasonló módon kifejezővektorokat állítunk elő egyszálú FSH, TSH és LH termelésére ^FSH-a, βΡΞΗ-ΟΤΡ-α, βΤΞΗ-α, βΤΞΗ-ΟΤΡ-α, βύΗ-α, βύΗ-ΰΤΡ-α), és átfertőzzük ezeket CHO sejtekbe. Az így létrejövő hormonok hasonló aktivitásokat mutatnak a vad típusú formák aktivitásához, amikor ezeket a 2. példában leírtak szerint vizsgáljuk.

Hasonlóképpen, az 1. példával analóg módon állítunk elő kifejezővektorokat a „két-β” típusú egyláncú formákhoz, ezeket a vektorokat kifejezzük, és a termékeket a 2. példában leírtak szerint vizsgáljuk.

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Glikoprotein hormon agonisták vagy antagonisták, amely agonisták vagy antagonisták glikozilezett vagy nem glikozilezett proteinek, amelyek α-β, β-α vagy β-β kapcsolt alegységeket tartalmaznak, ahol a glikoprotein hormon luteinizáló hormon (LH), tüszőstimuláló hormon (FSH), pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH) vagy korion gonadotropin hormon (CG), az a és β vagy β és β alegységek kovalensen kapcsolódnak, adott esetben egy linkeren keresztül, a a glikoprotein hormonokban vagy variánsaiban általános alegység természetes aminosavszekvenciája és β vagy mindegyik β egymástól függetlenül a glikoprotein hormon vagy variánsa β-alegységét jelenti, ahol az a és β alegység variánsa az adott alegység módosított formája, amely 1-10 deléciót vagy szubsztitúciót tartalmaz, ahol a szubsztitúciók konzervatív szubsztitúciók, a linker hidrofil csoport, amely az a és β vagy β és β alegységekhez azok aktivitásának változása nélkül kapcsolódik, azzal a feltétellel, hogy a linker a downstream alegységektől közvetlenül upstream irányban elhelyezkedő szignálpeptidtől eltérő, és ha a β-alegység a korion gonadotropinnak egy α-alegységéhez kapcsolódó β-alegysége, a linker nincsen jelen, vagy 1-16 aminosavat tartalmazó linkertől eltérő.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti agonista vagy antagonista, ahol a protein α-β alegységeket tartalmaz.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti agonista vagy antagonista, ahol a protein β-α alegységeket tartalmaz.
4. 4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti agonista vagy antagonista, ahol az a és β alegységek humán a és β alegységek vagy ezek variánsai.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti agonista vagy antagonista, ahol a linker egy teljes karboxiterminális peptid (CTP) vagy annak egy variánsa, ahol a tel14

   HU 227 311 Β1 jes CTP a humán korion gonadotropin 112-118-tól a 145-ös helyig lévő aminosavainak felel meg; és ahol az említett CTP variáns egy 1-5 deléciót és/vagy szubsztitúciót tartalmazó CTP módosított változata, ahol bármely szubsztitúció egy konzervatív aminosavat jelent; vagy az említett linker egy részleges CTP, amely legalább a hCG 112-132; 115-132; 116-132; vagy 118-132; vagy 112-127; 115-127; 116-127 vagy 118-127 pozícióit tartalmazza.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti agonista vagy antagonista, ahol az a és β vagy β és β alegységek valamelyike vagy mindkettő továbbá egy teljes CTP-nek vagy variánsának megfelelő inzerciót tartalmaz az említett a vagy β alegység egy nem kritikus régiójában, ahol az említett CTP variáns egy 1-5 deléciót és/vagy szubsztitúciót tartalmazó CTP módosított változata, ahol bármely szubsztitúció egy konzervatív aminosavat jelent; vagy az említett linker egy részleges CTP, amely legalább a hCG 112-132; 115-132; 116-132; vagy 118-132; vagy 112-127; 115-127; 116-127 vagy 118-127 pozícióit tartalmazza, és ahol az említett inzerció öt aminosavon belül található az kivagy C-terminustól.
7. 7. Gyógyászati készítmény, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti agonistát vagy antagonistát tartalmazza egy megfelelő gyógyászati segédanyaggal együtt.
8. 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti agonistára vagy antagonistára immunspecifikus antitestek.
9. 9. Izolált DNS- vagy RNS-molekula, amely egy, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.
10. 10. Expressziós rendszer a glikoprotein hormon agonistájának vagy antagonistájának előállítására, amely expressziós rendszer az alábbiakat tartalmazza: egy első nukleotidszekvencia, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti proteint kódolja működőképesen kapcsolva olyan kontrollszekvenciákhoz, amelyek kiváltják az említett nukleotidszekvencia expresszióját.
11. 11. A 10. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely tartalmaz továbbá egy második nukleotidszekvenciát, amely egy szignálpeptidet kódol működőképesen kötve az említett első nukleotidszekvencia által kódolt proteinhez.
12. 12. Gazdasejt, amely úgy módosított, hogy tartalmazza a 10. vagy 11. igénypont szerinti expressziós rendszert.
13. 13. Eljárás a glikoprotein hormon aktivitás antagonistájának vagy antagonistájának előállítására, amely eljárás során a 12. igénypont szerinti sejteket úgy tenyésztjük, hogy az említett agonistát vagy antagonistát előállítsák, majd az említett agonistát vagy antagonistát a tenyészetből kinyerjük.