CN1330665A - 多结构域糖蛋白激素及其使用方法 - Google Patents

多结构域糖蛋白激素及其使用方法 Download PDF

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I·布伊米
D·本－梅纳汉
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Washington University in St Louis WUSTL
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Abstract

本发明公开了作用不同的糖蛋白激素形式。这些化合物具有式:(1)β1－(接头1)m－α－(接头2)n－β2;(2)β1－(接头1)m－β2－(接头2)n－α;(3)α－(接头1)m－β1－(接头2)n－β2;(4)β2≈α－(接头)m－β1;或(5)β1－(接头)m－α≈β2,式中,各β1和β2为脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列,或是该氨基酸序列的变异体。“α”为脊椎动物糖蛋白激素α亚基或其变异体;“接头”指共价相连的部分,它以适当的距离将β1和β2亚基与α亚基,以及将β1和β2亚基相互间隔开。“≈”是非共价键。各m和n独立地为0或1。

Description

多结构域糖蛋白激素及其使用方法
对政府资助的确认
本发明是部分根据国立卫生研究院的NIH合同No.No1-HD-9-2922，在政府资助下完成的。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，具体地，涉及天然形式通常为异二聚体的某些糖蛋白激素的修饰形式。本发明涉及绒毛膜促性腺激素(CG)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的多结构域复合物，其中共价连接于一种β—亚基的α—亚基可与另一种β—亚基结合或可共价连接于两个β—亚基。这些多结构域糖蛋白激素能够提供两种或多种效应或功能，或者能够象天然激素的促效剂和/或拮抗剂起作用。
背景技术
在人体中，四种重要的糖蛋白激素(LH、FSH、TSH和CG)是具有相同α亚基和不同β亚基的异(源)二聚体。这些激素中的三种实际上也几乎存在于所有其它的脊椎动物中；而CG目前仅见于灵长类以及怀孕母马的胎盘和尿中。
PCT申请WO90/09800(1990年9月7日出版，在此引用作为参考)描述了这些激素的许多修饰形式。一种重要的修饰是用人绒毛膜促性腺激素或其变异体的羧基端肽(carboxy terminal peptide，CTP)对β亚基进行C端延伸。也描述了这些激素的其他突变蛋白。CTP是从人绒毛膜促性腺激素β亚基的112-118位中任一位置延伸至145位的氨基酸序列。该PCT申请描述了通过保守性氨基酸置换而获得的CTP延伸变异体，这不破坏CTP的改变该激素清除特性的能力。此外，PCT专利申请WO94/24148(1994年10月27日公布，在此引用作为参考)描述了通过在C末端以外的位置延伸或插入CTP而修饰这些激素，而且CTP片段比从112-118位延伸至145位的序列更短。
FSH的CTP-延伸型β亚基在申请人的两篇文章中也有描述：LaPolt，P.S.等人；Endocrinoloy(1992)131：2514-2520和Fares，F.A.等人，Proc Natl Acad SciUSA(1992)89：4304-4308。这两篇文章在此引用作为参考。
人绒毛膜促性腺激素的晶体结构已发表在几乎同时出版的两篇文章中。一篇是Lapthorn，A.J.等人，Nature(1994)369：455-461，另一篇是wu，H.等人，Structure (1994)2：545-558。这些文章的结果总结于Patel，D.J.Nature(1994)369：438-439中。
PCT申请WO91/16922(1991年11月14日公布)描述了糖蛋白激素的多种嵌合形式及其他修饰形式。一般而言，该文献着重于分别涉及各种α或β链的α亚基或β亚基的嵌合物。该申请中简单地列出而没有给出其他说明的一个构建物，将基本上整个人绒毛膜促性腺激素的β链与α亚基前体蛋白(即含有该亚基的分泌信号序列)融合在一起。
另外两个公布的PCT申请描述了这些糖蛋白激素的单链形式，其中α和β亚基被共价相连，形成如下通式的化合物：
β(接头)nα或
α(接头)nβ
式中n为0或1，而α和β为这些激素的各亚基。Moyle，W.R.，PCT申请WO95/22340(1995年8月24日公布)；以及本发明人的申请WO96/05224(1996年2月22日公布)。这些文献的公开内容也在此引用作为参考。
上述这些激素的单链形式，其中胱氨酸桥连(bridge)被去除的数目，公开于美国申请No.08/933,693(1997年9月19日申请)。该申请在此引用作为参考。
如本申请人在复制研究协会(Society foe the Study of Reproduction)摘要193,1996所公开的，已发现糖蛋白激素单链形式的α—亚基(即CGβ—α)非共价连接于FSHβ亚基。
最近，如本申请人在内分泌协会摘要OR28—3,1998所公开的，已发现单链糖蛋白激素的α—亚基(即FSHβ—α)与GCβ亚基形成非共价连接。
目前已发现，通过将另一种β—亚基共价连接于单链激素或将另一种β—亚基非共价连接于单链激素的栓住的(tethered)α—亚基，从而模拟天然激素的特性和/或控制激素比例，可能采用这些糖蛋白激素，它们有更强的促效剂和/或拮抗剂活性，和/或它们是多功能的。本文公开了这些不同作用的糖蛋白激素以及它们在治疗疾病中的用途，如治疗多囊卵巢病、不育症和卵巢过度刺激症。
本发明公开的内容
本发明提供不同作用的糖蛋白激素，它们含有共价连接于β—亚基的α—亚基而形成一种单链激素，和另一个β—亚基，它共价连接于该单链激素或非共价连接于该单链激素的栓住的α—亚基。本发明的化合物可以是糖基化的或部分糖基化的或非糖基化的，且存在于天然糖蛋白激素或其变异体中融合的α和β链可任选地通过接头部分而连接。特别优选的接头包括羧基端肽(CTP)单元，它或者是完整的单元或者是其一部分所构成的变异体。
如果β亚基是相同的，含有非共价连接的β亚基的化合物可作为促效剂或拮抗剂起作用，但其活性程度将随时间而变化。活性的这种变异是由于共价连接的和非共价连接的β亚基间循环半衰期的差异造成的。非共价连接的β亚基的循环半衰期固有地比共价连接于α亚基的β亚基的短。这是因为在生理环境的一段时间中复合物的分解；而分子的共价连接部分保留了有效的药物功能。
例如，在复合物循环半衰期过程中，包含一个共价连接于α亚基的FSHβ亚基(且该α亚基非共价连接于另一个FSHβ亚基)的化合物将具有较高的活性。但当更短半衰期的非系链的FSHβ亚基耗尽后，化合物的活性将降低。
包含一个共价连接于α亚基(其非共价连接于CGβ亚基)的FSHβ亚基的化合物表现出较长的FSH活性的循环半衰期和较短的CG活性循环半衰期。在较短循环半衰期中，FSHβ和CGβ亚基二者将作用于它们各自的受体。在较长半衰期中，只有共价连接于α亚基的FSHβ亚基具有活性。
在所有情况中，如果β亚基是不同的，化合物是双功能的，可作为促效剂和/或拮抗剂。需要指出的是，增加或减少一种成分相对于另一种成分的促效剂活性，可得到不同比例的活性。例如，采用具有提高的促效剂活性的FSH亚基和/或具有减低的促效剂活性的LH亚基，可提高FSH/LH(活性)的比例。
本发明一方面的内容涉及对需要激素调节的对象提供不同的糖蛋白激素活性的方法。
糖蛋白激素“活性”指发挥相应的天然激素的促效剂或拮抗剂(具有相同或不同生物半衰期)作用的能力。所以，“两种不同糖蛋白激素的活性”指不同的各β亚基以一种或多种方式赋予该化合物的活性。一种可以是促效剂，另一种是拮抗剂；一种可以修饰以提供增强的活性；一种可以修饰以提供减低的活性；一种可相应于LH的活性，而另一种相应于FSH的活性；一种具有长循环半衰期；而另一种循环半衰期较短。所以，在式(1)—(5)的化合物中提供不同的天然β亚基或提供这些β亚基的变异体，可得到各种各样不同的糖蛋白激素活性。
另一方面，本发明涉及一种糖基化或非糖基化的下式蛋白质：
β1-(接头1)m-α-(接头2)n-β2    (1)；
β1-(接头1)m-β2-(接头2)n-α    (2)；
α-(接头1)m-β1-(接头2)n-β2    (3)；
β2≈α-(接头)m-β1             (4)；或
β1-(接头)m-α≈β2             (5)
式中，各β1和β2具有脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列，或是所述氨基酸序列的变异体(其中所述变异体在本文中已有定义)。“α”指脊椎动物糖蛋白激素α亚基或其变异体；“接头”指共价相连的部分，它以合适的距离将β1和β2亚基与α亚基，以及将β1和β2亚基相互间隔开。“≈”指非共价连接。各m和n独立地为0或1。
在所有上述例子中，本发明的化合物保留了构象，因此在化合物中包含整个亚基是不必要的。因此，本发明包括上式(1)—(5)的化合物，它含有α和/或β亚基的片段，其中这些形式保留了含完整亚基的对应形式所表现出的生物活性。
需要指出的是，可进一步修饰式(1)—(5)的化合物，使它们含有其他共价连接的β亚基。所以，式(2)或(3)的化合物可与其他β亚基非共价连接；式(4)或(5)的化合物在共价链中可含有其他β亚基。另外，也可用其他非共价结合，如β—β二聚体与α，或α—α二聚体与β的结合。
另一方面，本发明涉及产生本发明的组合物的方法，涉及含有本发明式(1)—(5)化合物的药物组合物，以及涉及其应用的方法。对这些组合物的特异性抗体也包括在本发明中。
实施本发明的方式
人体中的四种“糖蛋白”激素构成了一个包括人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黄体生成素(LH)和促甲状腺激素(TSH)的家族。如此处所用，在人和其他脊椎动物中，“糖蛋白激素”指该家族的所有成员。所有这些天然激素都是由α亚基和β亚基构成的异二聚体，其中对于某一物种而言在该组中的α亚基氨基酸序列是相同的，而β亚基因视家族成员的不同而不同。因此，一般情况下这些天然糖蛋白激素是由结合的但非共价相连的α和β亚基构成的异二聚体。大多数脊椎动物产生FSH、TSH和LH；绒毛膜促性腺激素只见于包括人在内的灵长类和怀孕母马中。
动物中，各激素的α和β亚基由不同的基因编码，而且分别合成，然后被装配成非共价相连的异二聚体复合物。对本发明的化合物而言，在单链一级结构中至少有一个β亚基直接连于α亚基。由二级和三级结构因素所赋予的三维构象与天然异二聚体形式十分相似，从而使该β亚基所代表的糖蛋白激素的功能得以表现。其他β亚基连接于此单链，可以是共价的(式(1)—(3))或通过栓住的α亚基与另一β亚基非共价连接。
通过β亚基结构的适当变化，本发明的化合物可以具有促效剂和/或拮抗剂活性(“相应于”天然激素的活性)；例如，该化合物可表现出针对某一糖蛋白激素受体的拮抗剂活性，但是又表现出对另一受体的促效剂活性，或者可以对两种受体都有促效剂活性或拮抗剂活性。本发明化合物所表现出的活性谱，将取决于选择的各α和β亚基、所用的变异体、连接部分的性质、以及α和β亚基的取向。
在式(1)、(2)或(3)的化合物中，这三种亚基都是共价连接的；式(4)和(5)的化合物含有单链β—α或α—β共价连接的二聚体。各种情况中的共价连接键靠近各个亚基的N—或C—端，在两种亚基情况下可能是头对头(即靠近两种成分的N—端)、尾对尾(即靠近两种成分的C—端)，或最佳的是头对尾(其中一个亚基的N—端与另一个亚基C—端共价连接)。可用标准重组方法不难制备这种含有头对尾连接键的融合蛋白，只要任何接头和亚基中的所有氨基酸都是由此基因所编码。另外，可用合成方法制备本发明的化合物，其中除头对尾构型外，还可用接头连接亚基使它们靠近于它们各末端。可从Pierce ChemicalCompany，Rockford，Illinois购得双功能接头，包括异双功能类型和同双功能类型接头。可用那些能提供连接两个氨基、或两个羧基、或一个羧基和一个氨基的接头。如果在N—端的连接不精密，则要求在靠近待连接端的位置有一个能提供含侧链官能团的氨基酸。
所以，在本发明的最佳实施例中，式(1)、(2)或(3)化合物是融合蛋白，只有基因编码的氨基酸构成序列时，其中α和β亚基或直接地或通过肽接头而头对尾地相连。这些化合物可用重组方法合成。在本发明的另一个优选实施例中，式(4)和(5)的化合物包括单链形式，其中α和β亚基或直接地或通过肽接头头对尾连接，另一个β亚基非共价地连接于栓住的α亚基，且只有基因编码的氨基酸构成了多结构域复合物。该复合物也可用重组法合成。然而，并不需要将本发明化合物局限于这种方式；α和β亚基以及接头可包括非基因编码的氨基酸。此外，接头可以是肽之外的物质，例如二羧酸或酸酐、二胺、或双功能接头(例如PierceChemical Co.，Rockford，IL出售的)等。此外，单链形式的亚基可以如融合蛋白所需要的那样以头对头或尾对尾构型、以及头对尾构型直接地或通过接头而相连。在这些情况下，用标准活化技术，对于头对头构型而言，两个氨基可以通过酸酐或通过任何二羧酸衍生物而连接；两个羧基可以通过二胺或二醇连接。
但是，为了方便起见，最优选的形式是头对尾构型，其中标准的肽键即够，而且单链形式可以通过重组技术或采用肽合成技术制备成融合蛋白，它或者是诸反应成分的一个序列，或者较佳地，整个序列的各部分连接起来。
不论哪个实例，α和β亚基在靠近其N端和C端的位置处与该分子的其余部分连接。优选的是，这些亚基直接在其末端相连，然而这种连接键也许单纯的是“靠近”型。一般地，“靠近”表示在该末端的10个氨基酸之内，较佳地在5个氨基酸之内，更佳地在2个氨基酸之内的一个位置，最佳地为末端本身。如上所述，当连接键位于N—或C—端本身之外时，必须在靠近合适末端的一个位置提供一侧链功能基团。
亚基组份
如本文所用，共同的α亚基，和FSH、LH、TSH和CG的β亚基以及本发明的化合物具有其常规定义，指具有本领域中所知的氨基酸序列的蛋白质，或其等位基因变异体，而不论其所表现的糖基化方式或氨基酸侧链的其他衍生变化。
这些肽的“天然”形式是指具有从相关脊椎动物组织中分离出的氨基酸序列、而且具有序列本身已知的那些肽的天然形式或其等位基因变异体的天然形式。
这些蛋白质和CTP单元的“变异体”形式，指对应于天然亚基，但通过例如定点突变或其他重组操作而产生的，或者用合成的方法制备，在该天然蛋白质的氨基酸序列中具有故意改变(包括截短)的蛋白质。
产生的“变异体”可作为促效剂或拮抗剂。与天然形式相比，促效剂可具有提高的活性或减低的活性。通过调节本发明组合物所含的两种β亚基的活性水平，可实现这些激素有效比率的诸种变化。例如，通过提供LH活性减低，但FSHβ亚基仍为天然活性或提高的活性，可提高FSH/LH活性比率。
导致产生“变异体”的改变包括1-10、较佳地1-8、更佳地1-5个氨基酸的变化，包括缺失、插入和取代，其中最佳的是保守性氨基酸取代。得到的变异体必须保留活性以影响天然激素的相应活性，即或者它们必须保留其相对应的天然激素的生物学活性从而能起促效剂作用；或者它们必须起拮抗剂的作用，这通常是靠其能与天然激素的受体结合但缺乏实现信号转导的能量而致。
按常规含义，“保守性取代”指这样的取代，其中被取代的残基与进行取代的残基属于同一类氨基酸。如本领域中熟知的那样，氨基酸已分类成几组，例如参见Dayhoff，M.等人，Atlas of Protein Sequences and Structure(1972)5：89-99。通常，酸性氨基酸被归在一组；碱性氨基酸被归在另一组；中性亲水氨基酸被归在一组；等等。更具体的分类情况列于WO96/05224，该文献在此引用作为参考。
一组优选变异体是其中α或β亚基或两者的糖基化位点被改变的变异体。本文所述的激素四成员家族(quartet)的某些有用的变异体在美国专利5,177,193中有描述(1993年1月5日出版，在此引用作为参考)。如其所述，可以通过破坏相关位点，或者通过选择产生蛋白质的宿主细胞而改变糖基化方式。
氨基酸序列的改变也包括插入和缺失。因此，激素的截短形式包括在变异体中，例如缺失C末端85—92位中部分或全部氨基酸的α亚基的突变型。此外还包括缺失N末端的1—10个氨基酸的α亚基。
突变蛋白还包括非关键区域被改变或被去除的突变蛋白。这种缺失和改变可包括整个环，从而缺失或改变的序列远大于10个氨基酸。但是产生的变异体必须至少保留受体结合域和/或涉及信号转导的区域。
有相当多的文献是关于糖蛋白激素变异体的，而且己明确可以制备大量可能具有促效剂和拮抗剂活性的变异体。公开的这些变异体参见Chen，F.等人，MolecEndocrin ol(1992)6：914-919；Yoo，J.等人，J Biol Chem(1993)268：13034-13042；Yoo，J等人，J Biol Chem(1991)266：17741-17743；Puett，D.等人，Glycoprotein Hormones，Lusbader，J.W.等人，EDS，Springer Verlag NewYork(1994)122-134；Kuetmann，H.T.et al(ibid)P103-117；Erickson，L.D.等人，End ocrinology(1990)126：2555-2560；和Bielinska，M.等人，J CellBiol(1990)111：3 30a(Abstract 1844)。
其他的变异体包括其中有一个或多个胱氨酸连接键缺失的变异体，这典型地是通过用中性氨基酸置换一个或两个参与连接的半胱氨酸而实现。特别优选的可被缺失的胱氨酸连接键是位于26位和110位之间以及23位和72位之间的胱氨酸连接键。
此外，已表明，激素四成员家族的β亚基可以以嵌合形式构建从而提供嵌合体两种组份的生物学功能，或者通常提供生物学功能改变的激素。因此，可以按Moyle，Proc Natl Acad Sci(1991)88：760-764；Moyle，Nature(1994)368：251-255描述的方法构建具有FSH和LH/CG活性的嵌合分子。如这些文章中所述，用FSH-β的101-109位氨基酸置换CG-β亚基中的相应残基可得到具有hCG和FSH二者活性的类似物。
如本文所用，“肽”和“蛋白质”可互换使用，因为它们之间的长度区别是任意的。
如上所述，在构成本发明的具有或不具有连接部分的化合物时，用作α和β亚基的“变异体”可以是此二亚基的完整氨基酸序列或仅是其一部分。
“变异体”还包括含有插入在非关键区域的CTP(或变异的CTP)的α和/或β链。
“变异体”可以是含相应天然β亚基的激素的促效剂或拮抗剂，即LHβ亚基的“变异体”指LH的促效剂或拮抗剂活性。促效剂活性可与天然β亚基相同或有所增加或减少。
α和β亚基的“非关键”区域是该分子生物学活性(包括促效剂和拮抗剂活性)非必需的区域。通常可将这些区域从结合位点、前体剪切位点和催化区域中去除。对引导适当折叠、与受体结合和催化活性等至关重要的区域，应加以评估。应注意，二聚体中对α和β相互作用是关键的某些区域在单链单元中会变成非关键的，因为该分子所赋予的构象限制可能会消除这些区域的必须性。非关键区域的确定可以方便地通过缺失或修饰候选区域并对所需活性进行适当的测试即可实现。因修饰而导致活性损失的区域是关键的；而改变导致相同或相似活性(包括拮抗剂活性)的区域被认为是非关键的。
应再次强调，“活性”指对相应天然激素的活性起促效的或拮抗的活性。因此，某些区域对变异体能否起拮抗剂作用至关重要，尽管拮抗剂不能直接提供该激素的生理效应。
例如，对于α亚基，33—59位被认为是信号转导所必需的，而羧基端20个氨基酸的延伸段是信号转导/受体结合所必需的。与β亚基装配的关键残基至少包括残基33—58，尤其是37—40。
当非关键区域“靠近”N末端或C末端时，插入可以位于该末端10个氨基酸中的任何位置，更佳地在5个氨基酸中，最佳地在末端本身。
如本文所用，“CTP单元”指在人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基端发现的、在C末端从氨基酸112—118延伸至残基145的氨基酸序列，或指其一部份。因此，每个“完整”CTP单元含有28—34个氨基酸，其长度取决于CTP的N末端。
“部分”CTP单元指这样的氨基酸序列，它位于位置112—118至145(含145本身)，但是最短的“完整”CTP单元(即从118—145位)中缺失至少一个氨基酸。这些“部分”序列包括在“变异体”的定义内。“部分”CTP单元宜含有至少一个0-糖基化位点。CTP单元含有丝氨酸残基处的4个糖基化位点，分别位于121(位点1)、127(位点2)、132(位点3)和138(位点4)位。用于促效剂的CTP部分形式可含有一个或多个按天然CTP序列中的次序排列的这些位点，尽管可以删去介于中间的部位。这些激素的某些非糖基化形式是拮抗剂，因此可以作为拮抗剂使用。
在某些情况下，可以插入CTP单元或用作串联接头。“串联”插入或延伸表示插入子或延伸段含有至少两个“CTP单元”。每个CTP单元可以是完整的或是片段，可以是天然的或变异体。在串联延伸或插入中的所有CTP单元可以是相同的，也可以互不相同。
“接头”是将α和β序列连接在一起而又不干扰其活性的组成部分，这些活性由作为激素成员的相同α链和β链所表现，或者它发生了改变使其活性从促效剂转变成拮抗剂活性。活性水平可以在合理的范围内变动，但是接头的存在不能使该单链激素丧失其基本的促效剂和拮抗剂活性。单链形式必须表现出与天然激素(天然激素的元件形成其组成)的激素活性相关的活性。
本文所用的“≈”或“非共价键”指共价连接于β1亚基的α亚基与另一β2亚基间存在的非共价键。
不同作用的糖蛋白激素的优选例
本发明的化合物可用重组技术进行最有效和最经济地生产。因此，优选的是那些仅含有基因编码的氨基酸的α和β链、CTP单元和其他接头部分形式的单链蛋白。然而，如上所述，有可能用合成肽技术或其他有机合成技术来构建单链激素的至少某些部分，因此含有非基因编码的氨基酸和非肽型接头的变异体也在本
发明范围之内。
在一优选实例中，β1亚基的C-末端共价地(可任选地通过接头)连于成熟α亚基的N-末端，该α亚基又共价地(可任选地通过接头)连于β2亚基。连接键可以是直接肽键，其中一个亚基的C末端氨基酸与另一亚基的N末端直接通过肽键而相连；然而，在许多情况下，最好在两个末端之间含有一接头部分。在大多数情况下，接头部分在两个链之间至少提供一个β转角。因此，在接头中存在脯氨酸残基也许是有利的。
(应理解，在讨论构成单链形式的亚基末端之间的连接键中，一个或多个末端也可以通过如上所述的取代和/或缺失而改变。)
在一组特别优选的实施例中，连接是头对尾型，接头部分含有一个或多个CTP单元和/或其变异体或截短形式。用于这种接头部分的CTP单元的优选形式在下面描述。
如上所述，CTP和其变异体除了位于接头部分中之外，还可以包含在构成单链激素各亚基的任何非关键区域中。
尽管CTP单元宜包含在接头中，应理解该接头可以是能提供α和β亚基之间适当空间关系的任何合适的共价结合材料。因此，对于头对尾构型，接头一般是二价的，例如含有任意数目的、但通常小于100个、更佳地小于50个的氨基酸的肽，它具有适当的亲水性/疏水性比率以便在溶液中能提供适当的间隔和构象，或者是可赋予这些特性的非肽型接头。通常，接头应有平衡的亲水性，从而位于周围溶液中并且不干扰α和β亚基或者两个β亚基之间的相互作用。较佳地，接头含有通常由肽接头中脯氨酸提供的β转角，或者含有丝氨酸和/或甘氨酸残基。可以使用具有上述正确特性的任何合适的聚合物，其中包括肽接头。
特别优选的本发明单链形式的实施例包括如下头对尾构型：
βFSH-α-βFSH；α-βFSH-βLH；βFSH-α-βLH；
βLH-α-βLH；α-βLH-βFSH；βLH-α-βFSH；
βTSH-α-βTSH；βTSH-βFSH-α；βTSH-α-βFSH；
βCG-α-βCG；α-βCG-βFSH；α-βCG-βTSH；βCG-βFSH-α；βCG-α-βTSH；
βFSH-CTP-αβFSH；α-βFSH-CTP-βLH；βFSH-CTP-α-βLH；
βLH-CTP-αβLH；α-βLH-CTP-β FSH；βLH-α-CTP-βFSH；
βLH(δ115-123)-α-βFSH；βLH(δ115-123)-CTP-α-βFSH；
βCG-CTP-αCTP-βFSH-CTP-CTP；
βTSH-CTP-CTP-αβFSH-CTP-CTP；
βFSH-CTP-CTP-α-βLH；βLH-CTP-CTP-βLH-α；
βCG-CTP-CTP-α-βTSH；βCG-CTP-CTP-βLH-α；
βFSH-CTP-βLH(δ 115-123)-CTP-α；等。人类的亚基形式也是特别优选的。在上述构建物中，“CTP”指CTP或其变异体(包括截短片段)，如WO96/05224中所述。
在一实例中，β1亚基的C—末端任选地通过接头共价地连接于成熟α亚基的N—末端，该α亚基又非共价地连接于另一β2亚基。本发明单链形式中的α和β亚基使另一β亚基非共价连接于栓住的α亚基。特别优选地用于本发明方法的式(4)和(5)的化合物包括头对尾构型(对单链成分而言)：
βFSH-α≈βFSH；βFSH-α≈βCG；βFSH-α≈βLH；βFSH-α≈βTSH
βCG-α≈βCG；βCG-α≈βFSH；βCG-α≈βCG；βLH-α≈βTSH
βLH-α≈βLH；βLH-α≈βFSH；βLH-α≈βCG；βLH-α≈βTSH
βTSH-α≈βTSH；βTSH-α≈βCG；βTSH-α≈βLH；βTSH-α≈βFSH；
βFSH-α≈βFSH；βFSH-α≈βCG；βLH≈α-βFSH；βTSH≈α-βFSH；
βCG≈α-βCG；βFSH≈α-βCG；βLH≈α-βCG；βTSH≈α-βCG；
βLH≈α-βLH；βFSH≈α-βLH；βCG≈α-βLH；βTSH≈α-βLH；
βTSH≈α-βTSH；βCG≈α-βTSH；βLH≈α-βTSH；βFSH≈α-βTSH等。所以，在本发明的一实例中，栓住的β亚基和另一β亚基彼此互不相同。例如，若栓住的β亚基是FSH的β亚基或变异体，而非共价连接的β亚基是CG的β亚基或变异体，则得到的化合物将同时具有作用于FSH和CG受体的能力。非共价连接的β亚基可具有促效剂或拮抗剂活性，这独立于栓住的β亚基的活性。另外，该β亚基的循环半衰期可与栓住的β亚基不同。β亚基循环半衰期的这种差异使得活性程度随着时间变化。
本发明的另一优选实施例中附加的β亚基与栓住的β亚基是相同的或各是彼此的变异体。例如，共价连接的FSHβ亚基和附加的非共价连接的βFSH亚基。这种类型的实施例对增加促效剂或拮抗剂的活性有效。在较短的循环半衰期持续过程中活性最大。由于栓住的β亚基的循环半衰期较长(当β亚基相同时则另当别论)，当非共价连接的β亚基不再有效时，单链形式依旧具有活性，但程度较低。
在本发明的另一实施例中，将一个β亚基突变成比其他β亚基活性高或低的亚基。例如，具有LH拮抗剂活性栓住的β亚基与具有FSH促效剂活性的β亚基相联合，能增加FSH/LH比率的作用，适用于卵泡发育和受精。如果需要较短的LH活性循环半衰期，则栓住的β亚基具有FSH活性，其他β亚基具有LH活性。
应用于人体，人类形式的α和β亚基是理想的。应指出，其他脊椎动物中的对应形式可用于兽医用途。因此，牛、羊、马、猪、猫、犬和其他动物特有的FSH、TSH和LH亚基，适用于影响这些物种自身的各种病症。
在一些实施例中，可以将其他药物包含在接头部分中。这些药物可以是肽或蛋白质，例如类胰岛素生长因子；表皮生长因子；酸性和碱性成纤维细胞生长因子；血小板衍生的生长因子；各种集落刺激因子(CFS)，例如粒细胞CFS、巨噬细胞CFS等；以及各种细胞因子如IL-2、IL-3和多种其他白细胞介素蛋白质；各种干扰素；肿瘤坏死因子等。可以包含用于释放这些药物的合适的切割位点，如某蛋白酶的靶序列，而该蛋白酶的靶位点并不存在于α和β亚基中。肽类或蛋白质类药物的优点是整个构建物可以方便地通过单基因的重组表达而生产。另外，也可以使用小分子药物如抗生素、消炎药、毒素等。
一般，包含在接头中的药物可以是需要在激素通常结合的受体附近发挥作用的药物。还可提供将药物从接头的包含中释放出来的合适方法，例如通过在下面的“制备方法”一节中所述的引入酶催化裂解位点的方法。
此外，如果需要可将药物的活性和循环时间限制在非共价连接的β亚基的较短循环半衰期中。这可通过在非共价连接的β亚基中而不是单链形式中含有药物来实现。
其他修饰
本发明的化合物还可以用公知的方法进一步偶联或衍生从而对氨基酸序列进行衍生变化，例如磷酸化、糖基化、对通常的糖基化形式去糖基化、酰化、对氨基酸侧链进行修饰(如将脯氨酸转变成羟基脯氨酸)，以及与那些翻译后修饰(已发现普遍存在)相类似的修饰。
本发明的激素的糖基化状态尤为重要。这些激素可以以非糖基化形式制备，可在原核宿主中生产，或通过突变亚基和/或CTP单元中通常存在的糖基化位点来制备。非糖基化和部分糖基化的激素可以通过对糖基化位点的操作来制备。当然，糖基化形式也包括在本发明范围之内。
正如本领域中熟知的那样，本发明的化合物也可与标记物、载体、固相载体等偶连，这取决于所需的用途。可以使用其标记形式来跟踪其代谢结果；用于该目的的合适标记物包括(尤其是)放射性同位素标记物如碘131、锝99、铟111等。这些标记物也可在测试系统中用于介导对该单链蛋白质的检测；在这种例子中，可以使用放射性同位素以及酶标记物、荧光标记物、生色标记物等。使用这类标记物可对有关受体进行定位，因为它们可用作这些受体的靶向(targeting)试剂。
本发明的化合物还可与载体偶联以增加其免疫原性来制备与这些新的修饰形式起特异性免疫反应的抗体。用于该目的的合适载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、白喉类毒素等。可以采用标准偶联技术将本发明的修饰肽与载体相连，包括使用双功能接头。
可以使用类似的连接技术及其他技术，将本发明的蛋白质偶联于固相载体。偶联后，可以将这些蛋白质用作亲和试剂，来分离所需的、与其有特异性反应的组份。因此，它们可用于纯化和分离与适当β亚基相互反应的受体。
制备方法
构建本发明的化合物的方法是本领域中所熟知的。如上所述，如果仅含有基因编码的氨基酸，而且单链是头对尾构型，那么目前最实际的方法是通过表达编码所需蛋白质的DNA而重组合成这些材料。本发明化合物包括的含有编码单链形式(包括变异体)的核苷酸序列的DNA可以由天然序列制备，或者从头人工合成，或者组合使用这些技术。定点诱变、连入额外序列、扩增反应(如PCR)和构建合适表达系统的技术目前都是本领域中所熟知的。编码所需蛋白质的部分或全部DNA可以用标准的固相合成技术来构建，最好引入限制性酶切位点以方便连接。可将包含在编码序列中的转录和翻译的合适控制元件提供给DNA编码序列。众所周知，目前已有可与各种不同宿主相容的表达系统，这些宿主包括原核宿主如大肠杆菌或枯草杆菌和真核宿主如酵母、其他真菌(如曲霉和链孢霉属)、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞(如CHO细胞)、鸟类细胞等。
宿主的选择尤其关系到翻译后加工，特别是包括糖基化。糖基化的位置主要由分子内的糖基化位点的性质所控制；然而，占据该位点的糖的性质主要由宿主的性质所决定。因此，本发明激素性质的微调可以通过适当地选择宿主而实现。
对于α亚基部分(其中α亚基是修饰的或非修饰的)的一种特别优选的基因形式是“小基因”(minigene)构建物。如本文所用，α亚基“小基因”指在Matzuk，M.M.，et al，Mol Endocrinol(1988)2：95-100中描述pM2/CGα或pM2/α构建物中所公开的基因构建物。
对于重组生产，可使用已用表达系统修饰的宿主细胞，进行培养从而产生所需的蛋白质。此处使用的术语如下：
“修饰的”重组宿主细胞，即“经修饰从而含有”本发明的重组表达系统的细胞，指这样的宿主细胞：它已经用方便的引入方法(包括转染、病毒感染等)处理从而含有此表达系统。“修饰的细胞”是指细胞含有该表达系统而不论该表达系统是整合入染色体还是位于染色体之外。“修饰的”细胞对于所包含的表达系统而言可以是稳定的，或者该编码序列可被瞬时表达。简而言之，带有本发明的表达系统的“修饰的”重组宿主细胞是指，当天然不含有该表达系统时，通过引入操作而含有该表达系统的细胞，而不论用何种方式实现这种引入。
“表达系统”指含有待表达的编码核苷酸序列及相伴随的、实现该编码序列表达所必需的控制序列的DNA分子。通常，这些控制序列包括：启动子、终止调控序列以及(在某些情况下)操纵子或其他调控表达的机制。控制序列是那些设计用于在特定重组宿主靶细胞中发挥作用的序列，因此必须选择宿主细胞使之与构建的表达系统中的控制序列相容。
通常需要分泌产生的蛋白质。所以还要包含编码信号肽的核苷酸序列，从而产生操作性连接于(operably linked)所需单链激素的信号肽，进而产生前体蛋白，一旦分泌，信号肽被切除释放出成熟的单链激素或所需的β亚基。糖蛋白激素通常是分泌性蛋白质，且所包括的信号序列可能是与激素本身相关的那些或与它们是异源的。虽然不是优选的，但细胞内激素的生产可受到对编码基因作适当操纵的影响。
如本文所用，“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”可互换使用而不必在意其细微区别。在需要区分它们是重要时，会在上下文中清楚地表明。对于都可以表示的场合，所有含义的都包括在内。
产生的蛋白质可以从细胞裂解液中回收获得(如果产生于细胞内)，或者从培养基中获得(如果是分泌的)。从细胞培养物中回收重组蛋白质的技术是本领域所熟知的，而且可以用已知技术如层析、凝胶电泳、选择性沉淀等纯化这些蛋白质。
对式(1)—(3)化合物的重组生产而言，可采用包含编码这些分子式化合物的核苷酸序列的一种表达系统。对式(4)和(5)的化合物而言，通常优选采用两种表达系统，它们都包含在重组宿主中。所以，可将化合物的α—(接头)m—β1或β1—(接头)m—α部分的表达系统构建成含有编码此单链肽的核苷酸序列，且在该细胞中还可包含编码β2的其他表达系统。这两个表达系统可包含在宿主细胞染色体的一个载体中、不同的载体中，或一个表达系统可留在染色体中，另一个则在染色体外复制性载体中。另外，包含两种所需编码核苷酸序列的双顺反子(dicistronic)表达系统可用于染色体外复制性载体中或包含在宿主细胞染色体中。还有一种方法，即可分开制备两种非共价结合的成分，再在体外适当条件下结合。适合式(4)或(5)化合物装配的条件与本领域的那些条件类似，且可模拟细胞内条件。
此外，本发明的全部或部分激素可以用本领域已知的肽合成技术直接合成。合成的部分可以连接起来，而在接头部分中所含药物的释放位点可以用标准化学方法引入。当然，对于那些含有非基因编码的氨基酸的实施例以及采用头对头或尾对尾构型的实施例，合成工作必须至少部分是处于蛋白质水平的。在天然N端或靠近天然N端的位置的头对头连接，可以通过含有与氨基起反应的功能基团的接头如二羧酸衍生物而实现。在C端或靠近C端位置的尾对尾构型，可以通过二胺、二醇或其组合的接头而实现。
抗体
本发明的蛋白质可以用于产生能与本文所公开的多结构域糖蛋白激素起特异性免疫反应的抗体。这些抗体可以用于各种诊断和治疗用途。
抗体一般是用标准免疫方案在哺乳动物如兔、小鼠、羊或大鼠中制备，并且测定多克隆抗血清的抗体效价以保证免疫充分。然后收获多克隆抗血清用于例如免疫试验。宿主的抗体分泌细胞，如脾细胞或外周血白细胞，可以用已知的技术进行永生化处理并筛选，以产生对本发明的蛋白质呈免疫特异性的单克隆抗体。
任何种类动物(包括人)的“抗体”，包括其保留了所需免疫特异性的任何片段，例如Fab，Fab′，F(ab)2，Fv等。因此，抗体也可以用重组技术制备，通常是分离出至少编码单克隆抗体可变区(具有合适的特异性)的核苷酸序列，并构建合适的表达系统。这种方法允许进行任何所需的修饰，例如产生Fv形式、嵌合形式、“人源化”形式等。
“对本发明蛋白质有免疫特异性的”抗体指在确定亲和性或非亲和性所考虑的普通参数内，能特异性地结合本发明的化合物，但不结合天然糖蛋白激素或其亚基本身或仅包括一个β亚基的任何单链单位的抗体。应理解，特异性是一个相对概念，可以选择任意的限度，例如特异性结合可相差100倍或更多。因此，本发明包括的免疫特异性抗体与其针对的多结构域复合物的反应，比与相应天然激素、现有技术的单链形式或各亚基的反应至少强100倍。这些抗体的获得，可以通过例如筛选能与本发明化合物结合的抗体并且弃去也结合天然激素、亚基或现有技术单链形式(描述于WO95/22340和WO96/05224)的那些抗体。
配方和使用方法
可用已知的、相当于相应的异二聚体的方法，来配制和施用本发明的蛋白质。因此，配制和施用方法会随所用的具体激素或激素组合而有所不同。然而，与天然异二聚体相比，施用的剂量水平和频率可能会改变，尤其是如果存在CTP单元，那么生物学半衰期会因其存在而延长。
本发明的蛋白质的配方是典型的用于蛋白质或肽药物的配方，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack Publishing Company，Easton，PA中所见。蛋白质的给药一般通过注射，例如静脉注射、肌内注射、皮下注射、或腹膜内注射，或者使用透粘膜或透皮给药的配方。也可使用其他方式的送递，如栓剂。这些配方一般含有去污剂或渗透剂如胆盐、梭链孢酸等。这些配方还可以以气雾剂或栓剂形式，或者在透皮给药中以皮肤膏药(patch)形式给药。口服给药也是可行的，只要配方能保护本发明的肽在消化道中不被降解。
剂量方案和配方的优化可按常规方法并如本领域中通常进行的那样进行。这些配方也可修改以包含适合兽医应用的那些成分。
本发明的组合物可以用于许多方面，最明显地是作为激素天然形式的替代物。因此，本发明的组合物可用于治疗不育症(作为体外受精技术的辅助剂)以及其他与天然激素或它们亚基相关的治疗方法。这些技术适用于人和其他动物。当然，就其品种衍化物而言组合物的选择取决于对病人采用的方法。应认识到，本发明组合物所反应的不同作用的能力，为以前不能得到的治疗提供了机会。
本发明组合物还可以以类似于天然异二聚体的方式用作试剂。
此外，本发明化合物可用作诊断工具，以检测生物样品中抗体的存在与否，该抗体结合于天然蛋白质的程度达到了结合多结构域化合物相关部分的程度。在评估各种样品中这些激素水平的试剂盒中它们还可以用作对照试剂。评估激素本身的水平或针对它们的抗体的水平的方法是本领域中公知的标准免疫试验方法。可以使用各种涉及放射性同位素标记、荧光标记、酶标记等标记技术的竞争性和直接试验方法。
本发明化合物还可用于检测和纯化与天然激素结合的受体。因此，可将本发明化合物偶联于固相载体，用于受体或抗激素抗体的亲和层析制备。得到的受体本身在治疗和候选试剂的筛选试验中可用于评估作为候选药物的激素活性。当然，当β亚基不同时，必须考虑这些化合物中β亚基的双重特异性。然而，当两个β亚基相同时，它们提供了一种亲和纯化相关受体的强有力的工具。
最后，唯一地与本发明的单链激素反应的抗体可用作纯化工具，用于分离随后制备物中的这些材料。它们还可用于监测这些化合物作为药物给药后的水平。
下列实施例用于阐述本发明，而不是限制本发明。
实施例1
制备CGβ-α-CTP-FSHβ
用现有的编码各亚基相关部分的核苷酸序列制备了编码标题化合物的核苷酸序列。CGβ区域编码人CGβ的145个氨基酸；编码α亚基的核苷酸序列编码人α的92个氨基酸(作为小基因)；编码CTP的序列编码人绒毛膜促性腺激素118-145位的28个氨基酸；而FSHβ的编码区域编码人FSHβ亚基的111个氨基酸。
按Sachais， Biol.Chem(1993)268：2319所述的方式，将含有CGβ外显子3、α小基因、CTP和βFSH的扩增片段插入pM2HA-CGβexon1，2(一种衍生自pM2且含CGβ外显子1，2的表达载体)的SalI位点。含CGβ外显子1，2的pM2在Matzuk，M.M.等人，Proc Natl Acad Sic USA(1987)84：6354-6358和Matzuk，M.M.等人，JCell Biol(1988)106：1049-1059中有描述。首先，将在CGβ外显子3下游含有α小基因的片段插入该载体，从而获得pM2-HACGβα。然后pM2-HACGβα用ScaI进行酶切，再与ScaI限制性消化过的pBIIKS(+)α-CTP-FSH连接。产生的表达载体pM2-HACGβ-α-CTP-FSH，当插入合适宿主时，产生标题化合物。
实施例2
CGβ-α-CTP-FSHβ的产生和活性
将实施例1中构建的表达载体转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，通过放射性标记的蛋白质在SDS凝胶上的免疫沉淀评估该蛋白质的产生情况。
收集培养液，浓缩，然后测试其与人LH受体(预计会结合βCG-α部分)的结合情况。
对于该试验，将编码完整人LH受体的cDNA插入表达载体pCMX中制备LH受体(Oikawa，J.X-C等人，Mol Endocrinol(1991)5：759-768)。将处于指数生长期的293细胞用该载体并用Chen，C.等人，Mol Cell B iol(1987)7：2745-2752的方法进行转染，导致LH受体在表面上表达。
在该试验中，将表达人LH受体的细胞(2×105/管)与1ng标记的hCG一起温育，并与浓度逐渐增加的未标记hCG或数量逐渐增加的待测样品在22℃竞争反应18小时。在样品存在时，标记的下降便表明样品的结合能力。在该试验中，对于293细胞中的人LH受体，异二聚体型hCG具有野生型的活性(这与以前的测定相同)，而含CGβ-α-CTP-FSHβ的培养液也表现出活性。这些结果示于图1。如图所示，异二聚体的hCG(实心方块)和本发明的双功能单链蛋白(实心圆圈)都成功地与标记的hCG竞争LH受体。双功能化合物的效力稍低，因为α亚基羧基末端被修饰。
同样，图1还显示了另一试验的结果，其中测试了衍生自被修饰从而含有两个表达系统的细胞的不同数量的培养上清液。一种表达系统产生了单链FSHβ-α；另一系统产生hCG的β亚基。形成的非共价相连的单链FSHα-β/CGβ复合物(实心三角形)也成功地竞争结合。
以类似方式，还测试了含CGβ-α-CTP-FSHβ的培养基上清液与293细胞中表达的FSH受体的结合情况。该试验按上述方式进行，不同点在于：用表达人FSH受体的细胞替换表达人LH受体的细胞，并采用标记的FSH作为竞争剂。该试验的结果示于图2。
如图所示，单链的标题化合物(实心圆圈)成功地与FSH(实心方块)竞争结合。在另一无关的试验中，同样如图2所示，不同类型复合物(即非共价地连于CGβ的单链FSHβ-α)的混合物(与非复合的过量的单链FSHβ-α(实心三角形)混合而成)，是一种出色的竞争剂。
实施例3
构建其他的表达载体
按与实施例1类似的方式，制备产生单链双功能FSHβ-CTP-α-CGβ、α-FSHβ-CTP-CGβ、CGβ-βFSH-CTP-α和βLH-CTP-βFSH-CTP-α的表达载体，然后转染入CHO细胞。收获培养上清液，并如上所述针对LH受体和FSH受体进行测试。这些化合物也表现出结合两种受体的能力。
实施例4
制备FSHβ—α≈CGβ
为了产生化合物FSHβ—α≈CGβ，制备了产生单链FSHβ—α和人CGβ亚基的表达系统，并采用与本发明发明者的PCT申请WO96/05224(1996年2月22日出版)中公开的方法相类似的方法，将它们共转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。CGβ亚基结合FSHβ—α形成非共价的FSHβ-α≈CG复合物。通过放射性标记的蛋白质在SDS凝胶上的免疫沉淀评估了该非共价FSHβ-α≈CG复合物的产生情况和活性。
收集培养液，浓缩，然后测试其与人LH受体(预计会结合βCG部分)和人FSH受体(预计会结合FSHβ-α)的结合情况。
结果表明非共价FSHβ—α复合物表现出与CG和FSH特异性受体结合。这些数据表明虽然共价结合于FSHβ结构域，栓住的α亚基还能与不同β亚基起反应，这种构型的存在不会消除生物活性。也可用类似的方法产生其他多结构域复合物，如βFSH—α≈βLH、βCG—α≈βLH、βLH-α≈βFSH。
实施例5
用作用不同的化合物调节激素比例
配制作用不同的化合物，并用已知的、相应于它们相应的天然激素的方法给药。
A.通过增加FSH/LH比例和/或增加CG来增加生育力
通过采用式(1)—(5)的化合物，其中一个β亚基具有减弱的LH促效剂活性或LH拮抗剂活性，其他β亚基具有(任选地增加)FSH促效剂活性，来增加FSH/LH比例，可实现提高生育力。通过消除LHβ链的糖基化或点突变，可将LHβ亚基修饰成具有较低的促效剂活性或拮抗剂活性，而FSHβ亚基可以其天然形式使用或经修饰增加其促效剂活性。得到的化合物将具有增加FSH激素水平并同时减低LH水平的能力。当此化合物以治疗剂量给予处于月经周期的卵泡阶段的哺乳动物时，增加了生育力。
另外，它的优点是能使FSH亚基的循环半衰期长于LHβ的循环半衰期。这可用FSHβ—α≈LHβ化合物来辅助。
也可通过给予式(1)—(5)的化合物，其中一个β亚基具有LH拮抗剂活性或LH促效剂活性，其他β亚基具有CG促效剂活性，来增加CG减少水平和减少LH激素水平，来实现提高生育力。另外，可将CGβ亚基经基因工程改造成与CG/LH受体的结合亲和力比LHβ大。当在合适的时间以合适的剂量给药时，FSH/LH的比例将增加到有利于生育力的比例，CG的活性也将增加到有利于怀孕的水平。
同样也可用式(1)—(5)的化合物，其中一个β亚基具有FSH促效剂活性，其他β亚基具有CG促效剂活性，来增加受精。给予这些复合物将增加FSH/LH比例而有利于受精，也将增加CG活性至有利于怀孕的水平。
通过采用式(4)或(5)的化合物的辅助，使一个β亚基的循环半衰期比其他β亚基长也是有利的。
B.减少FSH/LH比例和/或减少CG来诱导不育
通过给予式(1)—(5)的化合物，其中一个β亚基具有LH促效剂活性，其他β亚基具有FSH拮抗剂活性或减弱的FSH促效剂活性，来减少FSH/LH比例，可诱导不育。在该应用中，通过改变LHβ链的糖基化或通过点突变，可将LHβ亚基修饰成具有提高的促效剂活性，而FSHβ亚基可经修饰而具有较低促效剂活性。得到的化合物将具有增加LH活性并同时减少FSH活性的能力，从而将FSH/LH比例降低至不利于受精的水平。
也可通过给予式(1)—(5)的化合物，其中一个β亚基具有LH促效剂活性，其他β亚基具有CG促效剂活性，来降低FSH/LH比例，可诱导不育。给予这种化合物将导致低FSH/LH比例和高CG激素水平，这两者都不利于受精和怀孕。
如上所述，它的优点是用式(4)或(5)的化合物，能使一个β亚基的循环半衰期比其他β亚基更长。这对改变β亚基的结合亲和力也是有利的。
C.降低LH/FSH比例来治疗多囊卵巢综合症
多囊卵巢综合症的特征是卵泡发育不完全和排卵异常。患这种疾病的女性与正常能育女性相比雄激素升高且LH/FSH比例也高。所以，在月经周期中估计卵泡发育正常启动时，给予式(1)—(5)的化合物，其中一个β亚基具有较低的LH促效剂活性或拮抗剂活性，其他β亚基具有FSH促效剂活性，将加速卵泡的发育，诱导排卵。由于给予FSH促效剂有引起过度刺激的危险性，较佳地是FSHβ亚基是非共价连接的β亚基，具有较短的循环半衰期，和/或FSHβ亚基经基因工程改造而具有降低的结合亲和力。

Claims (20)

1.一种向对象提供不同糖蛋白激素活性的方法，其特征在于，所述的方法包括给予需要所述活性的对象下式化合物：
β1-(接头1)m-α-(接头2)n-β2    (1)；
β1-(接头1)m-β2-(接头2)n-α    (2)；
α-(接头1)m-β1-(接头2)n-β2    (3)；
β2≈α-(接头)m-β1             (4)；或
β1-(接头)m-α≈β2             (5)
式中，各β1和β2为脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列，或其变异体；
“α”为脊椎动物糖蛋白激素α亚基的氨基酸序列或其变异体；
“接头”指接头部分；和
“≈”是α和β2间的非共价键；
各m和n独立地为0或1；
其中各个β1和β2赋予所述的化合物不同的活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，β1和β2相应于不同的天然β亚基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，β1和β2表现出不同的生物半衰期。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，β1和β2一个赋予促效剂活性，另一个赋予拮抗剂活性。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对象需要提高生育力。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中β1和β2都赋予所述的化合物FSH促效剂活性；或
其中β1和β2都赋予CG促效剂活性；或
其中β1和β2都赋予LH拮抗剂活性；或
其中β1和β2一个赋予FSH促效剂活性，另一个赋予LH拮抗剂活性或降低的LH促效剂活性；或
其中β1和β2一个赋予FSH促效剂活性，另一个赋予CG促效剂活性；或
其中β1和β2一个赋予LH拮抗剂活性或降低的LH促效剂活性，另一个赋予CG促效剂活性。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对象需要变成不育或维持不育。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中β1和β2二者赋予所述的化合物FSH拮抗剂活性；或
其中β1和β2都赋予CG拮抗剂活性；或
其中β1和β2都赋予LH促效剂活性；或
其中β1和β2一个赋予FSH拮抗剂活性或降低的FSH促效剂活性，另一个赋予LH促效剂活性；或
其中β1和β2一个赋予FSH拮抗剂活性或降低的FSH促效剂活性，另一个赋予CG拮抗剂活性或降低的CG促效剂活性；或
其中β1和β2一个赋予LH促效剂活性，另一个赋予CG拮抗剂活性或降低的CG促效剂活性。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对象需要治疗多囊卵巢病。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中β1和β2一个赋予所述的化合物FSH促效剂活性，另一个赋予LH拮抗剂活性或降低的LH促效剂活性；或
其中β1和β2都赋予FSH促效剂活性；或
其中β1和β2都赋予LH拮抗剂活性。
11.一种下式的糖基化或非糖基化化合物：
β2≈α-(接头)m-β1    (4)；或
β1-(接头)m-α≈β2    (5)
其特征在于，其中各β1和β2为脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列，或其变异体；
“α”为脊椎动物糖蛋白激素α亚基的氨基酸序列或其变异体；
“接头”指接头部分；和
“≈”是α和β2间的非共价键；
m为0或1；
其中各个β1和β2赋予所述的化合物不同的活性；和
附加条件为如果β1是CG则β2不是FSH。
12.一种调节哺乳动物糖蛋白激素浓度的药物组合物，其特征在于，所述的组合物包含与至少一种药学上可接受的赋形剂相混合的有效剂量的下式化合物：
β2≈α-(接头)m-β1    (4)；或
β1-(接头)m-α≈β2    (5)
其中各β1和β2为脊椎动物糖蛋白激素β亚基的氨基酸序列，或其变异体；
“α”为脊椎动物糖蛋白激素α亚基的氨基酸序列或其变异体；
“接头”指接头部分；和
“≈”是α和β2间的非共价键；
各m和n独立地为0或1；
其中各个β1和β2赋予所述的化合物不同的活性；和
附加条件为如果β1是CG则β2不是FSH。
13.一种重组宿主细胞，其特征在于，它经修饰而含有包括第一表达系统的核酸，所述的第一表达系统包含操作性连接于一表达的控制序列的α—(接头)m—β1或β1—(接头)m—α的核苷酸编码序列，和包括第二表达系统的核酸，所述的第二表达系统包含操作性连接于一表达的控制序列的β2的核苷酸编码序列，
其中α、β1、β2、接头和m的定义如权利要求11。
14.如权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述的第一表达系统和第二表达系统具有同样的控制序列。
15.如权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述的第一表达系统和第二表达系统位于分开的染色体外复制载体中。
16.如权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述的第一表达系统和第二表达系统位于宿主细胞的染色体中。
17.如权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述的第一和第二表达系统一个位于所述细胞的染色体中，另一个位于染色体外复制载体中。
18.如权利要求13所述的细胞，其特征在于，第一和第二表达系统都在同一个染色体外复制载体中。
19.一种产生式(4)或(5)化合物的方法，其特征在于，该方法包括；
在产生所述化合物的条件下，培养权利要求13所述的细胞；和
从培养物中回收所述化合物。
20.一种与权利要求11所述的化合物起特异性免疫反应的抗体。
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