MXPA06011898A - Superagonistas de hormona foliculoestimulante - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona análogos superactivos de la FSH que demuestran mejor bioactividad tanto in vitro como in vivo en comparación con la FSH natural. En particular, los análogos de la invención demuestran al menos un incremento de diez veces en la potencia o al menos un incremento del diez por ciento en la eficacia máxima en comparación con la proteína natural. Los análogos son particularmenteútiles para tratar a sujetos que muestren una baja expresión de receptor de FSH o una pobre respuesta del receptor de FSH, y para el tratamiento de condiciones asociadas con la actividad de la hormona glicoproteica.

Description

SUPERAGONISTAS DE HORMONA FOLICULOESTIMUIANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona, de manera general, con hormonas foliculoestimulantes (FSH, por sus siglas en inglés) . modificadas que tienen actividad superagonsita, y con el uso de las mismas en el tratamiento de condiciones asociadas con la actividad de la hormona glicoproteínica. De manera más específica, esta invención se relaciona con moléculas de FSH modificada que contiene dos o más sustituciones de aminoácido en comparación con la FSH natural, donde esas moléculas de FSH modificadas exhiben mejores propiedades farmacológicas en comparación con la FSH natural.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La folitropina (hormona foliculoestimulante, FSH) y las gonadotropinas coriónicas, (CG) , lutropina (hormona luteinizante, LH) , y tirotropina (hormona estimulante de la tiroides, TSH) comprenden la familia de las hormonas glicoproteínicas . Cada hormona es un heterodímero de dos subunidades ligadas no covalentemente;' alfa y beta. Dentro de la misma especie, la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa es idéntica a todas las hormonas, mientras que la secuencia de la subunidad beta es específica de la hormona (Pierce, J. G. and Parsons, T. F. "Glycoprotein hormones: Ref. 176463 structure and function." Ann. Rev. Biochem. 50:465-495 (1981) ) . El hecho de que las secuencias de las subunidades estén altamente conservadas de peces hasta mamíferos implica que esas hormonas han evolucionado de una proteína ancestral común (Fontaine Y-A. and Burzawa-Gerard, E. "Esquisse de 1' evolution des hormones gonadotopes et thyreotropes des vertebres." Gen. Comp. Endocrinol. 32:341-347 (1977)). La folitropina recombinante ha sido usada en ciertas terapias, como en el tratamiento de pacientes que padecen de infertilidad (Lathi and Milki, "Recombinant gonadotropins, " Curr omens Health Rep. l(2):157-63 (2001)). La hormona ha sido usada en mujeres para inducir la ovulación, y también en hombres para inducir la espermatogénesis (Bouloux et ah, "Induction of sper atogenesis by recombinant follicle- stimulating hormone (puregon) in hypogonadotropic azoospermic men who failed to respond to human chorionic gonadotropin alone," J Androl. 24 (4): 604-11 (2003)), mejorar estructuras de esperma alteradas (Haidl et al, "Drug treatment of male fertility disorders, " Asian J Androl. 2(2):81-5 (2000)), y tratar condiciones asociadas con los niveles disminuidos de testosterona (véanse las Patentes Estadounidenses Nos. 5,574,011 y 6,562,790, cada una incorporada aquí como referencia) . La respuesta de las mujeres a la terapia de FSH exógena, ha mostrado ser variable, con algunas demostrando una pobre respuesta al protocolo de terapia estándar (requiriendo el ajuste de la dosis de FSH) , y otras demostrando síndrome de hiperestimulación ovárica (Pérez et ah, "Ovarían response to follicle-stimulating hormone (FSH) stimulation depends on the FSH receptor genotype, " J Clin Endocrinol Metab. 85(9): 3365-9 (2000) ) . Lo que se necesita son derivados modificados de la FSH que tengan mayor actividad, para facilitar el tratamiento de quienes responden pobremente permitiendo a la vez regímenes de terapia a dosis más bajas de pacientes propensos a la hiperestimulación ovárica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención abarca proteínas FSH modificadas y ácidos nucleicos que codifican para las mismas, donde las bíoactividades in vivo e ín vitro de las proteínas modificadas están sustancialmente incrementadas con la FSH natural. En particular, los análogos modificados de la invención demuestran propiedades farmacológicas sorprendentemente mejoradas incluyendo la potencia y V ax (eficacia), en comparación con la FSH natural. Además, los análogos modificados de la invención proporcionan un incremento dramático en la cantidad y calidad de los ovocitos, blastocítos y embriones de animales tratados. Los análogos de la invención proporcionan de este modo una solución por mucho tiempo esperada para un amplio espectro de pacientes que padecen de infertilidad, incluyendo mujeres que demuestran una respuesta pobre después de la fertilización in vitro (IVF) , mujeres que han sido descalificadas para la IVF, mujeres que demuestran un bajo número de receptores de FSH y mujeres con estimulaciones del receptor de FSH que conducen a infertilidad. Las moléculas de FSH modificadas de la invención contienen al menos una subunidad a modificada que contiene una combinación de al menos dos mutaciones en las espiras periféricas de la FSH, lo cual conduce a una FSH modificada que tiene mayor potencia sobre la FSH natural o proteínas modificadas que comprenden las mutaciones específicas únicamente. Típicamente, las proteínas FSH modificadas de la invención muestran al menos aproximadamente un incremento de 10 veces en la potencia sobre la FSH natural, con las mutaciones en la subunidad a preferida comprendiendo al menos dos aminoácidos básicos en posiciones correspondientes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81 de la SEQ ID No. 1. Las proteínas FSH modificadas de la invención pueden comprender además una subunidad ß modificada, particularmente una subunidad ß modificada que comprende al menos un aminoácido básico en una posición correspondiente a cualquiera de las posiciones 2, 4, 14, 63, 64, 67 y 69 de la SEQ ID No. 2. Las proteínas FSH modificadas de la invención también pueden demostrar un incremento o disminución de la vida media en plasma en comparación con la FSH natural o la disminución de la vida media en plasma en comparación con la FSH. Un incremento en la vida media en plasma puede ser facilitado por la pegilación, por la inclusión de un sitio de glicosilación potencial o por otros medios. La invención también incluye métodos para ayudar a al reproducción en un sujeto, que comprende administrar una cantidad auxiliar de FSH modificada de la invención, por ejemplo en un protocolo de fertilización in vi tro o protocolo de inseminación artificial, u otro protocolo en el cual se induzca la ovulación o espermatogénesis. También se incluyen métodos de diagnóstico y tratamiento de condiciones asociadas con la actividad de la hormona glicoproteínica en mujeres, incluyendo, pero sin limitarse a disfunción ovulatoria, defecto de la fase lútea, concepción limitada por el tiempo, baja expresión del receptor de FSH en folículos en crecimiento, baja sensibilidad del receptor de FSH, deficiencia y/o acoplamiento del receptor de FSH, falla o lesión de la pituitaria, infertilidad inexplicable y carcinoma ovárico. Las proteínas FSH modificadas de la invención son particularmente útiles para tratar mujeres propensas a la hiperestimulación ovárica, donde los análogos con una vida media más prolongada pueden ser aplicados al inicio del ciclo y aquéllos con vida media más corta al final del ciclo para prevenir o reducir la posibilidad del síndrome de hiperestimulación ovárica (OHHS) . También se incluyen métodos de diagnóstico con y tratamiento de las condiciones asociadas con la actividad de la hormona glicoproteínica en hombres, incluyendo pero sin limitarse a la infertilidad del factor masculino, falla o lesión de la pituitaria, calvicie masculina, carcinoma testicular y cualquier condición asociada con los niveles deficientes de producción de testosterona.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1E son gráficas que muestran una comparación del efecto de varias mutaciones individuales sobre la bioactividad de la FSH in vi tro en comparación con la natural (WT) , de acuerdo a lo medido usando la transfección transitoria de células CHO-FSHR. La Figura 2 es una gráfica que muestra el efecto de la mutación E4R beta de la producción de hFSH en células CHO-FSHR transfectadas. Las Figuras 3A y 3B son gráficas que muestran una comparación del efecto de varias mutaciones combinadas sobre la bioactividad de la FSH in vi tro, de acuerdo a lo medido usando la transfección transitoria de células CHO-FSHR. Las Figuras 4A y 4B son gráficas que muestran la comparación de la reactividad cruzada de LHR de rata y humano con la FSH análoga y la FSH natural. La Figura 4A muestra la reactividad cruzada entre la FSH TR-4402 y el receptor de la hormona luteinizante de rata. La Figura 4B muestra que no existe reactividad cruzada entre la FSH TR-4402 y la hormona luteinizante humana. La Figura 5 es un diagrama de la estructura de la FSH que muestra las espiras en las subunidades alfa y beta. Las Figuras 6A y 6B son gráficas que muestran la producción de AMPc en células CHO en respuesta a la TR-4402 análoga purificada contra la FSH natural y la TR-4401 análoga purificada contra la FSH natural, respectivamente. La Figura 7 es una gráfica que muestra la producción de AMPc en células KGN en respuesta a la TR-4402 análoga purificada contra la FSH natural . La Figura 8 es una gráfica que muestra la producción de AMPc en células GLHR-15 en respuesta a la TR-4402 análoga purificada contra la FSH natural. La Figura 9 es una gráfica que muestra la sobrevivencia de los folículos en presencia de hFSH natural (compuesto #3) y la TR-4402 análoga (compuesto #4), observada durante un bioensayo de folículos in vi tro . La Figura 10 es una gráfica que muestra la formación del antro en presencia de hFSH natural (compuesto #3) y TR-4402 análoga (compuesto #4), observada durante un bioensayo de folículos in vi tro . La Figura HA es un gráfica que muestra la ucificación de COC en presencia de hFSH natural (compuesto #3) y TR-4402 análoga (compuesto #4), observada durante un bioensayo de folículos in vi tro . La Figura 11B es ana gráfica que muestra el % de liberación de ovocitos tras la estimulación con hCG en presencia de hFSH natural (compuesto #3) y TR-4402 análoga (compuesto #4) , observada durante un bioensayo de folículos in vi tro . La Figura 12 es una gráfica de la maduración nuclear de los ovocitos de acuerdo a lo medido por extrusión con PB en presencia de hFSH natural (compuesto #3) y TR-4402 análoga (compuesto #4) , observada durante un bioensayo de folículos in vi tro . Las Figuras 13A y 13B son gráficas que muestran la producción de progesterona en presencia de hFSH natural (compuesto #3) (13A) y TR-4402 análoga (compuesto #4) (13B) , observada durante un bioensayo de folículos in vi tro . Las Figuras 14A-14D muestran los resultados de un Bioensayo de Steelman-Pohley efectuado usando Ratas Hembra Sprague-Dawley inmaduras (Steelman and Pohley, 1953) . Las gráficas en las Figuras 14A, 14C y 14D muestran diferencias en peso del ovario medidas en respuesta a TR-4402 en comparación con la natural (Follistim) . La gráfica en la Figura 14B compara los niveles en suero de TR-4402 y FSH natural durante el bioensayo . La Figura 15 es una gráfica que muestra el contenido de estradiol intraovárico de ratas tratadas con FSH natural (Follistim) en comparación con ratas tratadas con. la TR-4 02 análoga. La Figura 16 es una gráfica que muestra los niveles de inhibina B en el suero de ratas después de la estimulación con dosis correspondientes de FSH natural (Follistim) y la TR-4 02 análoga. Las Figuras 17A y 17B son gráficas que muestran la eliminación y absorción de las análogas de FSH TR-4901, TR4401, y TR-4402 contra la FSH natural. La Figura 18 muestra las extensiones N-terminales que pueden ser usadas para prolongar la vida media de las análogas de FSH (SEQ. ID Nos . 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, y 12). La Figura 19 es una gráfica que muestra la producción de AMPc en células CHO en respuesta a LAl-4402 (TR-4402 modificada adicionalmente para incrementar la vida media en suero de la FSH) contra LAl FSH (FSH modificada para incrementar la vida media en suero de la FSH), TR-4402, y FSH natural. La Figura 20 es una gráfica que muestra un incremento en el número de ovocitos ovulados producidos in vivo en respuesta a la LAl-4402 (TR-4402 modificada para incrementar la vida media en suero) contra la FSH natural (Follistem) y hCG únicamente. La Figura 21 es una gráfica ue muestra el incremento en el número total de ovocitos producidos in vivo después de la administración de TR 4401 contra FSH natural (Gonal F) . La Figura 22 es una gráfica que muestra el incremento de la velocidad de fertilización de los ovocitos después de la administración in vivo de TR 4401 contra la FSH natural (Gonal F) . La Figura 23 es una gráfica que muestra el incremento en la tasa de formación de blastocitos después de la administración in vivo de TR 4401 contra FSH natural (Gonal F) . La Figura 24 es una gráfica que muestra el incremento en el número total de embriones después de la administración in vivo de TR 4401 contra FSH natural (Gonal F) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas de FSH "superactivas" modificadas que muestran una potencia sorprendentemente mejorada en comparación con la FSH natural. Por "modificada" se entiende que, aunque la proteína contiene una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la FSH natural, la secuencia no ha sido cambiada, de modo que es idéntica a la secuencia de FSH conocida de otras especies. "La superactividad" puede ser evaluada de acuerdo a una variedad de parámetros, de acuerdo a la potencia y eficacia. La "potencia" es un parámetro de bioactividad que es determinado midiendo la respuesta máxima media. Las diferencias en la "potencia" son determinadas comparando el valor de la respuesta de la FSH de la análoga a la mitad del camino entre la línea basal y el máximo (CE50) contra la de la FSH natural. Las respuestas de la FSH pueden ser medidas in vitro usando proteínas purificadas, o pueden ser estimadas después de la transfección transitoria de un ácido nucleico que codifique para la proteína modificada. Las respuestas de FSH también pueden ser medidas in vivo, es decir en un animal que responda a la FSH análoga. Esas respuestas abarcan cualquier respuesta celular o biológica y cuantitativa o cualitativa conocida de la unión de la FSH a su receptor, es decir, la protección de AMPc, síntesis de proteínas como la progesterona, tasa de fertilización, tasa de formación de blastocitos, desarrollo de embriones por ovocito fertilizado, etc. La "eficacia" (Vmax) o respuesta máxima es otro parámetro de la bioactivídad. Como se discute aquí, los parámetros de bioactividad pueden variar dependiendo del número de receptores y acoplamiento del receptor en la línea celular ensayada. En sistemas con números más bajos de receptor o acoplamiento dañado, las diferencias son las más discernibles en términos de la Vmax (eficacia) . En sistemas donde los receptores están sobreexpresados, las diferencias en la potencia son más visibles. Los parámetros cuantitativos y cualitativos in vivo como la cantidad de ovocitos, tasas de fertilización y tasas de formación de blastocitos y embriones pueden ser medidos a la dosis efectiva máxima por el número de ovocitos. La dosis efectiva máxima por número de ovocitos es la cantidad óptima de FSH superactiva para la calidad y cantidad de ovocitos. La dosis efectiva máxima para el número de ovocitos depende del peso y la velocidad del metabolismo del animal. Por ejemplo, la dosis efectiva máxima para un animal más grande con una velocidad de metabolismo más lenta es mayor que la dosis efectiva máxima para un animal más pequeño con una velocidad de metabolismo más alta. La dosis efectiva máxima es determinada empíricamente para cada animal. Sin embargo, sin importar el sistema usado, las proteínas FSH superactivas modificadas de la invención demuestran al menos aproximadamente un incremento de 10 veces la- potencia, de manera más preferible un incremento de al menos aproximadamente un 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, o aún el 100 veces, en la potencia en comparación con la FSH natural, o un incremento de aproximadamente el 10% en eficacia máxima, de manera preferible de al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o aún 100% de incremento en la eficacia máxima en comparación con la FSH natural. Los análogos superactivos de la invención también pueden proporcionar un incremento de aproximadamente 5 a 10 veces en la potencia o un incremento del 5% al 10% en eficacia máxima en comparación con la FSH natural. Algunas de las proteínas modificadas de la invención demuestran al menos aproximadamente un incremento de 30 a 50 veces en la potencia o un incremento del 30% al 50% en eficacia máxima en comparación con la natural. De este modo, las proteínas FSH modificadas de la presente invención son particularmente útiles para tratar pacientes con un bajo número de receptores o deficiencias en la respuesta del receptor, puesto gue las proteínas modificadas de la invención mantienen un incremento de al menos 10 veces en la potencia o un incremento del 10% en la eficacia máxima aún en sistemas con un bajo número o respuesta del receptor. La velocidad de absorción de una FSH superactiva modificada puede dar como resultado un incremento o disminución de la duración de la acción. Un análogo de la FSH modificada con un incremento en la velocidad de absorción y una disminución de la duración de la acción puede ser benéfica para pacientes hipersensibles en riesgo de síndrome de hiperestímulación. La velocidad de absorción es medida por la a. La velocidad de eliminación es medida por la Ke. Las moléculas de FSH modificadas de la invención incluyen proteínas modificadas de especies seleccionadas del grupo que consiste de humanos, bovinos, equinos, porcinos, ovinos, murinos, ratas, conejos, primates, peces, etc. La FSH de pez (también conocida como GTH-1) puede ser usada en acuacultura, es decir para hacer crecer especies en peligro o de otros peces en cautiverio. Otras especies de FSH modificadas encuentran uso en la producción agrícola, y el escenario de laboratorio para probar los efectos de las diferentes mutaciones combinadas sobre varias condiciones relacionadas con la hormona glicoproteína en machos y hembras. Las moléculas de FSH modificada de otras especies tienen sustituciones en posiciones correspondientes a aquéllas en las moléculas de FSH humana modificada descritas aquí, las cuales pueden ser identificadas usando cualquier programa de alineación, incluyendo pero sin limitarse a los programas DNASIS, ALIONment, SIM y GCG como Gap, BestFit, FrameAlign y Compare . Las moléculas de FSH humana modificada de la presente invención comprenden al menos una subunidad a modificada, donde la subunidad alfa comprende al menos dos aminoácidos básicos como aquéllos en las posiciones correspondientes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81 de la FSH alfa humana natural (SEQ ID No. 1). Las proteínas modificadas también pueden contener una subunidad beta modificada, donde la subunidad beta comprende al menos un aminoácido básico en las posiciones correspondientes a las posiciones 2, 4, 14, 63, 64 y 69 de la FSH beta humana natural (SEQ ID No. 2) . Las proteínas modificadas de la invención también pueden contener sustituciones adicionales, particularmente sustituciones conservativas que no alteran las propiedades mejoradas de la proteína. Típicamente, sin embargo, esas proteínas modificadas contendrán menos de cinco sustituciones en posiciones diferentes a aquellas listadas anteriormente, y pueden exhibir una identidad de secuencia de aminoácidos completa con las subunidades alfa y beta en la FSH natural correspondientes en posiciones diferentes a las posiciones listadas anteriormente. Los aminoácidos básicos comprenden los aminoácidos lisina, arginina e histidina y cualquier otro aminoácido básico que pueda hacer una modificación a cualquiera de esos' tres aminoácidos, aminoácidos básicos sintéticos, normalmente no encontrados en la naturaleza, o cualquier otro aminoácido que esté cargado positivamente a un pH neutro. Los aminoácidos básicos preferidos, entre otros, son seleccionados del grupo que consiste de lisina y arginina. Las moléculas de FSH modificadas ejemplares que tienen dos sustituciones de aminoácido básico incluyen, pero no se limitan a proteínas con sustituciones en las posiciones 14 y 66 de la subunidad a, particularmente de E14R y N66R, las posiciones 14 y 73 de la subunidad a, particularmente E14R y G73R, las posiciones 16 y 20 de la subunidad a, particularmente P16R y Q20R, y las posiciones 20 y 21 de la subunidad a, particularmente Q20R y P21R. Las proteínas FSH modificadas de la invención también pueden tener una subunidad que comprenda tres sustituciones de aminoácido básico en posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, '22, 66, 68, 73, 74 y 81. Esas proteínas modificadas incluyen, pero no se limitan a proteínas con sustituciones combinadas en las posiciones 16, 20 y 21, particularmente P16R, Q20R y P21R, las posiciones 14, 20 y 73, particularmente E14R, Q20R y G73R, las posiciones 66, 73 y 81, particularmente N66K, G73K y A81K, las posiciones 14, 66 y 73, particularmente E14R, N66R y G73R, y las posiciones 14, 21 y 73 particularmente E14R, P21R y G73R. Las proteínas de FSH modificadas de la invención también pueden tener una subunidad a que comprenda cuatro sustituciones de aminoácido básico en posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81. Esas proteínas modificadas incluyen, pero no se limitan a proteínas con sustituciones combinadas en las posiciones 13, 14, 16 y 20, particularmente la combinación de Q13R, E14R, P16R y Q20R y la combinación de Q13K, E14K, P16K y Q20K. Las proteínas FSH modificadas de la invención también pueden tener una subunidad a que comprenda cinco sustituciones de aminoácido básico en posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81. Esas proteínas modificadas incluyen pero no se limitan a las proteínas con sustituciones combinadas en las posiciones 14, 20, 21, 66 y 73, particularmente E14R, Q20R, P21R, N66R y G73R, y las posiciones 14, 16, 20, 66 y 73, particularmente E14R, P16R, Q20R, N66R y G73R. Las proteínas FSH modificadas de la invención también pueden tener una subunidad a que comprenda seis sustituciones de aminoácido básico en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81. Esas proteínas modificadas incluyen pero no se limitan a proteínas con sustituciones combinadas en las posiciones 13, 14, 16, 20, 66 y 73, particularmente Q13K, E14K, P16K, Q20K, N66K y G73K y las posiciones 14, 16, 20, 21, 66 y 73, particularmente E14R, P16R, Q20R, P21R, N66R y G73R. Una subunidad ß modificada particularmente efectiva de la invención comprende un aminoácido básico en una posición correspondiente a la posición 4 de la SEQ ID No. 2, y de manera más particular, E4R. Esta sustitución da como resultado un incremento único en la potencia y nivel de expresión de la FSH. Los inventores han encontrado que esta mutación da como resultado una producción 2-3 veces mayor de FSH recombinante cuando se usa en combinación con las otras sustituciones descritas aquí.

Diseño de Super agonistas de FSH Los superagonistas abarcados por la presente invención pueden ser diseñados comparando las secuencias de aminoácidos con la FSH alfa y beta de interés, de modo que otras especies identifiquen los residuos básicos en las proteínas FSH de otras especies. Esos métodos son descritos en la U.S. 6^361,992, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. También puede darse consideración a la actividad biológica relativa de la FSH de varias especies como aquellas especies para elegir la comparación de sustitución. Además, el modelaje de homología basado en la estructura de las hormonas glicoprotéicas es útil para identificar aminoácidos residuales expuestos en la superficie. En consecuencia, la presente invención también proporciona una proteína FSH modificada que tiene una potencia incrementada sobre la FSH natural de la misma especie, donde la FSH modificada comprende un aminoácido básico sustituido en una posición correspondiente a la misma posición del aminoácido en la proteína FSH de otra especie que tiene mayor potencia sobre la proteína FSH natural. Pudiendo ser la glicoproteína modificada para incrementar la potencia de una especie no humana. Por ejemplo, puede compararse la FSH porcina con la FSH bovina, diseñar proteínas FSH porcinas con sustituciones de aminoácidos en posiciones donde las secuencias porcinas y bovinas sean diferentes, construir proteínas FSH porcinas con los cambios seleccionados, y administrar la FSH porcina modificada a animales porcinos. De manera alternativa, la FSH modificada puede ser bovina. La presente invención también proporciona una FSH modificada que tiene mayor potencia sobre la FSH natural de la misma especie, donde la FSH modificada comprende un aminoácido básico sustituido en una posición correspondiente a la posición del mismo aminoácido en una hormona glicoproteica diferente de la misma especie que tiene una potencia incrementada sobre la hormona glicoproteica natural. Por ejemplo, las subunidades beta de la FSH humana y la gonadotropina coriónica humana pueden ser comparadas y pueden hacerse sustituciones de aminoácido a la subunidad beta de la FSH sobre la base de cualquier divergencia de la secuencia. Naturalmente, únicamente aquellos cambios que incrementen de manera general la potencia de la FSH modificada son contemplados puesto que la especificidad del receptor de la hormona necesitará aún retenerse. Para modificar posiciones de aminoácidos adicionales, las secuencias de hormona glicoproteica de humano y no humano pueden ser alineadas usando programas de computadora estándar como el DNASIS (Hitachi Software Engineering Co. Ltd.) o cualquiera de los otros programas de alineación listados anteriormente, incluyendo pero sin limitarse a los programas ALIONment, SIM y GCG como Gap, BestFit, FrameAlign y Compare. Los aminoácidos residuales que difieren entre la hormona glicoproteica humana y no humana pueden entonces ser sustituidos usando una de las técnicas mencionadas anteriormente, y la hormona glicoproteica resultante ensayada por su potencia usando uno de los ensayos mencionados aquí. La presente invención también abarca fragmentos de los análogos descritos aquí que tienen actividad superagonista o antagonista. Por ejemplo, los fragmentos de las cadenas alfa modificadas de la invención pueden ser usadas solo en combinación con un fragmento o cadena beta de longitud completa para crear compuestos superagonistas . De igual modo, pueden ser usados fragmentos de las cadenas beta modificadas de la invención solos o en combinación con cualquier fragmento o cadena alfa de longitud completa para crear compuestos superagonistas. En algunos casos, también pueden ser usados fragmentos de las moléculas de FSH modificadas de la invención como antagonistas, por ejemplo, para limitar la duración de la actividad de una FSH terapéutica después de que ha sido administrada. La presente invención también abarca análogos de una sola cadena y proteínas quiméricas que incorporan las regiones mutantes de los análogos descritos aquí. Por ejemplo, los inventores de la presente han encontrado que la incorporación de sustituciones superpotentes dentro de la subunidad alfa de gonadotropina de doble actividad da como resultado un incremento de 3-5 veces en las actividades luteotrópicas y folitrópicas, indicando que las actividades intrínsecas de las gonadotropinas de doble actividad pueden ser mejoradas aún más por las sustituciones combinadas de lá presente invención. La construcción de las gonadotropinas de doble actividad es descrita en la US 4,237,224, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Caracterización de Superagonistas de FSH El efecto- de la modificación o modificaciones a la FSH natural descrita aquí puede ser determinado en cualquier número de formas. Por ejemplo, la producción de AMP cíclico (AMPc) en células transfectadas con un ácido nucleico que codifique para la glicoproteína modificada puede ser medida y comparada con la producción de AMPc de células similares transfectadas con un ácido nucleico que codifique para la hormona glicoproteica natural. De manera alternativa, la producción de progesterona y células transfectadas con glicoproteína modificada puede ser medida y comparada con la producción de progesterona de células similares transfectadas con la hormona glicoproteica natural. De manera alternativa, la actividad de la hormona glicoproteica modificada puede ser determinada a partir de ensayos de unión del receptor, de ensayos de absorción de timidina, o de ensayos de secreción de T4. Los ejemplos específicos de esos ensayos para determinar la actividad de hormonas glicoproteicas modificadas se exponen en la sección de Ejemplos contenida aquí. Un ejemplo en la técnica puede determinar fácilmente cualquier ensayo apropiado a emplear para determinar la actividad de una hormona glicoproteica natural o modificada. En una modalidad de la presente invención, la hormona glicoproteica modificada tiene una potencia la cual está incrementada sobre la potencia de la hormona glicoproteica natural en al menos aproximadamente 10 veces. Este incremento en la potencia puede ser evaluado por cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente y descritas en el ejemplo contenido aquí, o en cualquier otro ensayo apropiado como es fácilmente determinado por un experto en la técnica. El incremento en la potencia no tiene que ser consistente de ensayo a ensayo, o de línea celular a línea celular, puesto que esas por supuesto, variarán. Las moléculas de FSH modificadas de la invención pueden demostrar un incremento en la potencia de al menos aproximadamente 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o aún de 100 veces sobre la natural usando líneas celulares que expresen receptores de FSH sensibles a niveles variables. En otra modalidad de la presente invención, la hormona glicoproteica modificada tiene una eficacia máxima la cual está incrementada sobre la eficacia máxima de la hormona glicoproteica natural en al menos aproximadamente 10%. Esta eficacia máxima incrementada puede ser evaluada por cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente y descritas en el ejemplo contenido aquí, o en cualquier otro ensayo apropiado como es fácil determinado por un experto en la técnica. La eficacia máxima incrementada no tiene que ser consistente de ensayo a ensayo o de línea celular a línea celular, puesto que esas por supuesto, variarán. Las moléculas de FSH modificadas de la invención pueden demostrar un incremento en la eficacia máxima de al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%, sobre la natural usando líneas celulares que expresen receptores de FSH sensibles a varios niveles. Otros ensayos adecuados para caracterizar los análogos descritos aquí son descritos en la PCT/US99/05908, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Por ejemplo, pueden ser usados varios inmunoensayos, incluyendo pero sin limitarse a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas como los radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos de emparedado, ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ, técnicas o análisis western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. Las mejoras en calidad y cantidad de ovocitos pueden ser evaluadas por ensayos in vitro e ín vivo . Es común que las mejoras en la cantidad y calidad de ovocitos sean determinadas usando diferentes puntos finales del proceso de fertilización in vitro como la formación de ovocitos, fertilización de ovocitos y formación de blastocitos. Los experimentos de fertilización in vitro pueden seguir un "protocolo de superovulación" en el cual los sujetos son tratados con un análogo de FSH superactivo de acuerdo a la presente invención, lo cual conduce a la liberación y maduración de ovocitos múltiples. En los experimentos de fertilización in vitro, la FSH (FSH superactiva y FSH natural recombinante) puede ser administrada con hCG para activar la ovulación. Puede ser usado un animal control que reciba únicamente hCG o gonadotropina del suero de yegua preñada (PMSG) . La calidad de los ovocitos puede ser mejorada incrementando la tasa de fertilización de los ovocitos en un animal. La tasa de fertilización de una hormona foliculoestimulante superactivo puede ser determinada in vivo o in vi tro comparando la tasa de fertilización lograda con la FSH superactiva con la tasa de fertilización lograda con la misma cantidad de FSH natural recombinante. Puede ser usado un animal control que reciba hCG. La tasa de fertilización puede ser medida por el por ciento de embriones de dos células que se desarrollen por el número total de ovocitos. Si la fertilización toma lugar in vi tro, los embriones de dos células pueden ser encontrados en discos de fertilización. En ratones, los embriones de dos células se desarrollan aproximadamente 24 horas después de la fertilización. La tasa de fertilización varía sobre la base de la cantidad de FSH superactiva administrada. Un animal puede recibir dosis múltiples de FSH superactiva. La velocidad de fertilización se incrementa en al menos aproximadamente 10 por ciento como resultado de la administración de FSH superactiva a una dosis efectiva máxima para el número de ovocitos. La tasa de fertilización puede incrementarse en al menos aproximadamente 20 por ciento, de manera preferible al menos 30 por ciento, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% como resultado de la administración de FSH superactiva a la dosis efectiva máxima para el número de ovocitos. La hormona foliculoestimulante superactiva puede mejorar la calidad de los ovocitos mejorando la tasa de formación de blastocitos por ovocitos fertilizados. La tasa de formación de blastocitos puede ser medida determinado el - porcentaje de embriones de dos células que formen blastocitos . La tasa de formación de blastocitos se incrementa si los blastocitos se forman in vivo o in vitro . La tasa de formación de blastocitos depende de la cantidad de hormona foliculoestimulante superactiva administrada. La tasa de formación de blastocitos se incrementa al menos aproximadamente 10 por ciento como resultado de la administración de una hormona foliculoestimulante superactiva a la dosis- efectiva máxima para el número de ovocitos . La tasa de formación de blastocitos puede incrementarse en al menos aproximadamente 20%, de manera preferible al menos 30%, 40%, 50%, 60% , 10% , 80%, 90%, o 100% como resultado de la administración de FSH superactiva por el número de ovocitos. La hormona foliculoestimulante superactiva puede mejorar la calidad de los ovocitos incrementando el número total de los embriones por ovocito fertilizado. El incremento en el número total de embriones por ovocito fertilizado se incrementa si la fertilización ocurre in vivo o ín vitro . El incremento en el número total de embriones por ovocito fertilizado depende de la cantidad de hormona folículo estimulante superactiva administrada. El número total de embriones por ovocito fertilizado se incrementa en al menos aproximadamente 10% como resultado de la administración de una hormona foliculoestimulante superactiva a la dosis efectiva máxima por el número de ovocitos. El número total de embriones por ovocito fertilizado puede incrementarse en al menos aproximadamente 20%, de manera preferible al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% como resultado de 1 administración de FSH superactiva a la dosis efectiva máxima por el número de ovocitos. La FSH superactiva puede ser usada para mejorar la calidad y cantidad de ovocitos de animales, incluyendo pero sin limitarse a humanos, ratones, ratas, primates, conejos, cerdos, caballos, ovejas y perros. Preferiblemente se administra una FSH superactiva a una FSH humana.

Análogos de FSH con Vida Media en Suero Incrementada Las proteínas FSH modificadas de la invención, también pueden ser modificadas adicionalmente, de modo que la vida media en plasma se incremente en comparación con la FSH natural. Por ejemplo, las proteínas FSH modificadas de la invención pueden comprender además al menos una secuencia con un sitio de glicosilación potencial, incluyendo secuencias que comprendan sitios de N-glicosilación y/u O-glicosilación sobre cualquier cadena alfa o beta. Las secuencias que proporcionan sitios de reconocimiento de glicosilación potenciales pueden ser una extensión N-terminal o C-terminal sobre cualquiera de la cadena alfa o beta. Las proteínas modificadas ejemplares contienen una extensión N-terminal sobre la cadena que es seleccionada del grupo que consiste de ANITV (SEO ID No. 3) y ANITVNITV (SEQ ID No. 4). Otras proteínas modificadas ejemplares contienen una sustitución adicional en la cadena ß, donde la sustitución es seleccionada del grupo que consiste de Y58N y V78N. La vida media incrementada también puede ser proporcionada por pegilación o conjugación de otros grupos químicos apropiados o construyendo proteínas de fusión que tengan una vida media incrementada por cualquier otro método. Esos métodos son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,612,034, Patente Estadounidense No. 6,225,449, y Patente Estadounidense No. 6,555,660, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad. La vida media también puede incrementarse, incrementando el número de residuos cargados negativamente dentro de la molécula, por ejemplo, el número de residuos de glutamato y/o aspartato. Esa alteración puede ser lograda por mutagénesis dirigida al sitio, con alteraciones preferidas seleccionadas del grupo que consiste de sustituciones de la subunidad alfa A85E y A85D, entre otras. Esa alteración también puede ser lograda vía una inserción de una secuencia de aminoácidos que contenga uno o más residuos cargados negativamente en la FSH modificada, incluyendo inserciones seleccionadas del grupo que consiste de GEFT (SEQ ID No. 5) y GEFTT (SEQ ID No. 6), entre otras. En una modalidad, la inserción es en la subunidad alfa, y se selecciona del grupo que consiste de APD-GEFT- VQDC (SEQ ID No. 7) y APD-GEFTT-QDC (SEQ ID No. 8), entre otras . La vida media de una proteína es una medición de la estabilidad de la proteína e indica el tiempo necesario para una reducción de la vida media en la concentración de la proteína. La vida media en suero de las moléculas de FSH modificadas descritas aquí puede ser determinada por cualquier método adecuado para medir los niveles de FSH en muestras de un sujeto con el tiempo, por ejemplo, pero sin limitarse a, inmunoensayos usando anticuerpos anti-FSH para medir los niveles de FSH en muestras de suero tomadas durante un periodo de tiempo después de la administración de la FSH modificada, o por la detección de moléculas de FSH marcadas, es decir, moléculas marcadas radioactivamente, muestras tomadas de un sujeto después de la administración de la FSH marcada .

Expresión y/o Síntesis de los Super agonistas de FSH La presente invención también incluye ácidos nucleicos que codifican para las subunidades OÍ y ? de FSH modificadas de la invención, así como vectores y células anfitriones para expresar los ácidos nucleicos. Los promotores apropiados para la expresión de ácidos nucleicos en diferentes células anfitrionas son bien conocidos en la técnica, y fácilmente intercambiados dependiendo del sistema vector- anfitrión usado para la expresión. Los vectores y células anfitrionas ejemplares se describen en la U.S. 6,361,992, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Por ejemplo, es construido, modificado o aislado un ácido nucleico que codifica para una hormona glicoproteica particular de interés, o una región de ese ácido nucleico, de modo que el ácido nucleico pueda entonces ser clonado en un vector ^apropiado, el cual pueda dirigir la síntesis in vivo o ín vítro de esa hormona glicoproteica natural y/o modificada. Se contempló que el vector tenga los elementos funcionales necesarios que dirijan y regulen la transcripción del gen insertado, o gen híbrido. Esos elementos funcionales incluyen, pero no se limitan a, un promotor, regiones en dirección 5' o dirección 3' del promotor, como mejoradores que puedan regular la actividad transcripcional del promotor, un origen de replicación, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación de insertos adyacentes al promotor, genes de resistencia a antibióticos u otros marcadores que puedan servir para seleccionar células que contengan el vector o vector que contenga el inserto, uniones de empalme de ARN, una región de terminación de transcripción, o cualquier otra región que pueda servir para facilitar la expresión del gen insertado o gen híbrido (Véase, de manera general Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989)). Existen numerosos vectores de expresión de E. coli (Escheri chia coli) conocidos por los expertos en la técnica que son útiles para la expresión de insertos de -ácido nucleico. Otros anfitriones microbianos adecuados para usarse incluyen bacilos como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriaceae, como Salmonella , Serratia , y varias especies de Pseudomonas . En esos anfitriones procarióticos también pueden producirse vectores de expresión, los cuales típicamente contendrán secuencias de control de expresión compatibles con la célula anfitriona (por ejemplo, un origen de replícación) . Además, estará presente cualquier número de una variedad de promotores bien conocidos, como el sistema protomor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (Trp) un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor de fago lambda. Los promotores típicamente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tendrán secuencias del sitio de unión ribosomal, por ejemplo, para iniciar y completar la transcripción y traducción. Si es necesario, puede ser proporcionada una metionina aminoterminal por la inserción de un codón de Met 5' y en el marco con el inserto de ácido nucleico en dirección 3' . También, la extensión carboxi terminal del inserto de ácido nucleico puede ser removida usando procedimientos de mutagénesis oligonucleotídica estándar.

Adicionalmente, puede ser usada la expresión de levadura. Existen varias ventajas de los sistemas de expresión de levadura. En primer lugar, existen evidencias de que las proteínas producidas en sistemas de secreción de levadura exhiben el apareamiento disulfuro correcto. En segundo lugar, la glicosilación postraslacional es llevada a cabo de manera eficiente por sistemas secretores de levadura. La región líder del factor previo proalfa de Saccharomyces cerevisiae (codificada por el gen MF"-1) es usada de manera rutinaria para dirigir la secreción de proteína de levadura (Brake, et al, " .varíes . -Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins ín Saccharomyces cerevisiae." Proc. Nat. Acad. Sci., 81:4642-4646 (1984)). La región líder del factor pre-pro-alpha contiene un péptido señal y prosegmento que incluye una secuencia de reconocimiento para una proteasa de levadura codificada por el gen KEX2 : esta enzima escinde la proteína precursora sobre el lado del carboxilo de una secuencia señal de escisión del dipéptido Lys-Arg. La secuencia que codifica para la FSH puede ser fusionada en el cuadro a la región líder del factor pre-pro-alfa. Este plásmido recombinante o constructo es entonces colocado bajo el control de un fuerte promotor de la transcripción, como el promotor de alcohol deshidrogenasa I o un promotor glicolítico. La secuencia que codifica para el ácido nucleico es seguida por un codón de terminación de la traducción el cual es seguido por señales de terminación de la transcripción. De manera alternativa, las secuencias que codifican para el ácido nucleico pueden ser fusionadas a una segunda secuencia codificadora de proteína, como la Sj26 o beta-galactosidasa, la cual puede ser usada para facilitar la purificación de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad. La inserción de los sitios de escisión de proteasa para separar los componentes de la proteína de fusión es aplicable a los plásmidos recombinantes usados para la expresión en levadura. La glicosilación y expresión postraslacíonal eficiente de las proteínas recombinantes también pueden ser logradas en sistemas de Baculovirus . Las células de mamífero permiten la expresión de proteínas en ambientes que favorecen modificaciones postraslacionales importantes como el repliegue y apareamiento de cisteína, la adición de estructuras de carbohidratos complejas, y la secreción de proteína activa. Los vectores útiles para la expresión de proteínas activos en células de mamíferos se caracterizan por la inserción de la secuencia que codifica para la proteína entre un promotor viral fuerte y una señal de poliadenilación. Los vectores pueden contener genes que confieran resistencia a la higromicina, resistencia a la gentamicina u otros genes o fenotipos adecuados para usarse como marcadores seleccionables, o resistencia al metotrexato para la amplificación del gen. La secuencia que codifica para la proteína quimérica puede ser introducida en una línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) usando un vector que codifique la resistencia al metotrexato, u otra línea celular usando marcadores de selección adecuados. La presencia de un ADN de vector en células transformadas puede ser confirmada por el análisis Southern blot. La producción de ARN correspondiente a la secuencia que codifica por el inserto puede ser confirmada por análisis Northern blot. Un número de otras líneas celulares anfitrionas adecuadas capaces de secretar proteínas humanas intactas ha sido desarrollado en la técnica, e incluye líneas celulares CHO, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células de Jurkat, etc. Los vectores de expresión para esas células pueden incluir secuencias de control de expresión, como un origen de replicación, un promotor, un mej orador y sitios de procesamiento de información necesaria, como sitios de unión ribosomal, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Las secuencias de control de expresión ejemplares son promotores derivados de genes de inmunoglobulina SV40, Adenovirus, Virus del Papiloma Bovino, etc. Los vectores que contienen dos segmentos de ácido nucleico de interés pueden ser transferidos en la célula anfitriona por métodos bien conocidos, los cuales varían dependiendo del tipo de anfitrión celular. Por ejemplo, la transformación de cloruro de calcio es utilizada comúnmente para células procarióticas, mientras que el fosfato de calcio, DEAE dextrano, o transfección mediada por lipofectina o electroporación pueden ser usadas para otros anfitriones celulares . Los vectores alternativos para la expresión de genes en células de mamífero, aquellos similares a los desarrollados para la expresión de gamma-interferón humano, activador de plasminógeno tisular, factor de la coagulación VIII, antígeno de la superficie del virus de la hepatitits B, proteasa Nexinl, y proteína básica principal de los eosinófilos, pueden ser empleados. Además, el vector puede incluir secuencias promotoras de CMV y una señal de poliadenilación disponible para la expresión de los ácidos nucleicos insertados en células de mamíferos (como COS-7) . La expresión del gen o gen híbrido puede ser in vivo o in vitro . La síntesis in vivo comprende la transformación de células procarióticas o eucarióticas que pueden servir como células anfitrionas para el vector. De manera alternativa, la expresión del gen puede ocurrir en un sistema de expresión ín vi tro . Por ejemplo, los sistemas de transcripción ín vitro se encuentran comercialmente disponibles, y son usados de manera rutinaria para sintetizar cantidades relativamente grandes de ARNm. En esos sistemas de transcripción in vítro, el ácido nucleico que codifica para la hormona glicoproteica sería clonado en un vector de expresión adyacente a un promotor de la transcripción. Por ejemplo, los vectores de clonación y expresión Bluescript II contienen sitios de clonación los cuales están flanqueados por promotores de la transcripción procariótica ' poderosos. (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif.). Están disponibles equipos que contienen todos los reactivos necesarios para la síntesis in vitro de un ARN a partir de un molde de ADN como los vectores Bluescript. (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif.). El ARN producido in vitro por un sistema como éste puede entonces ser trasladado ín vitro para producir la hormona glicoproteica deseada. (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif). Otro método para producir una hormona glicoproteica es ligar dos péptídos o polipéptidos juntos por técnicas de química de proteínas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos pueden ser sintetizados químicamente usando el equipo de laboratorio actualmente disponible usando la química del Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) o Boc (ter-butiloxicarbonilo) .

(Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.). Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que un péptido o polipéptido correspondiente a una hormona glicoproteica híbrida puede ser sintetizado por reacciones químicas estándar. Por ejemplo, un péptido o polipéptido puede ser sintetizado y no escindido de su resina de síntesis mientras que el otro fragmento de un péptido híbrido puede ser sintetizado y posteriormente escindido de la resina, exponiendo por lo tanto el grupo terminal, el cual está funcionalmente bloqueado sobre otro fragmento. Por reacciones de condensación peptídico, esos dos fragmentos pueden ser unidos covalentemente vía un enlace peptídico en su carboxilo y aminoterminales, respectivamente, para formar un péptido híbrido. (Grant, G. A., "Synthetic Peptides: A User Guide," W. H. Freeman and Co., NY. (1992) and Bodansky, M and Trost, B., Ed. , "Principies of Peptide Synthesis," Springer- Verlag Inc., NY. (1993)). De manera alternativa, el péptido o polipéptido puede ser sintetizado de manera independiente in vivo como se describió anteriormente. Una vez aislados, esos péptidos o polipéptidos independientes pueden ser ligados para formar una hormona glicoproteica vía reacciones de condensación peptídica similares. Por ejemplo, la ligación enzimática o química de los segmentos peptídicos clonados o sintetizados puede permitir que los fragmentos peptídicos relativamente cortos sean unidos para producir fragmentos peptídicos más grandes, polipéptidos o dominios de proteína completos (Abrahmsen, L., et al, Biochemistry, 30:4151 (1991) ; Dawson, et al, "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation, " Science, 266:776-779 (1994)). La invención también proporciona fragmentos de hormonas glicoproteica modificadas que tienen actividad superagonista o antagonista. Los fragmentos polipeptídicos de la presente invención pueden ser proteínas 'recombinantes obteniplas clonando ácidos nucleicos que codifiquen para el polipéptido en un sistema de expresión capaz de producir los fragmentos polipeptídicos de los mismos. Por ejemplo, puede determinarse un dominio activo de una proteína FSH modificada la cual, junto con la subunidad beta, puede interactuar con un receptor de hormona glicoproteica y producir un efecto biológico asociado con la hormona glicoproteica. En un ejemplo, los aminoácidos encontrados que no contribuyen a la actividad o la especificidad o afinidad de unión de la hormona glicoproteica pueden ser suprimidos sin una pérdida de la actividad respectiva. Por ejemplo, los aminoácidos amino o carboxitermínales pueden ser removidos secuencialmente de la hormona glicoproteica nativa o modificada y la actividad respectiva probada en uno de los muchos ensayos disponibles descritos anteriormente. En otro ejemplo, las proteínas modificadas de la invención pueden tener una porción de aminoácidos aminoter inales o carboxiterminales, o aún una región interna de la hormona, reemplazada por un fragmento polipeptídico u otra porción, como la bíotína, que facilite la purificación de la hormona glicoproteica modificada. Por ejemplo, una glicoproteína modificada puede ser fusionada a una proteína de unión de maltosa, a través de la química de péptidos o clonación de los ácidos nucleicos respectivos que codifiquen para los fragmentos de dos polipéptidos en un vector de expresión, de modo que la expresión de la región codificadora dé como resultado un polipéptido híbrido. El polipéptido híbrido puede ser purificado por afinidad haciendo pasar éste sobre una columna de afinidad de amilosa, y la glicoproteína modificada puede entonces ser separada de la región de unión de maltosa escindiendo el polipéptido híbrido con el factor de proteasa específico Xa (véase, por ejemplo, New England Biolabs Product Catalog, 1996, pg. 164) . Los fragmentos activos de las moléculas de FSH de la invención también pueden ser sintetizados directamente u obtenidos por perturbación química o mecánica de la hormona glícoproteica más grande. Un fragmento activo se define como una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 5 aminoácidos consecutivos derivados de la secuencia de aminoácidos natural, que tiene la actividad relevante, por ejemplo actividad de unión o reguladora. Los fragmentos, ya sea unidos a otras secuencias o no, también pueden incluir inserciones, supresiones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o aminoácidos residuales específicos, siempre que la actividad del péptido no se altere o dañe significativamente en comparación con la hormona glicoproteica modificada. Esas modificaciones pueden proporcionar alguna propiedad adicional, como la remoción y/o adición de aminoácidos capaces de formar enlaces disulfuro, para incrementar su biolongevidad. En cualquier caso, el péptido debe poseer una propiedad bioactiva, como una actividad de unión, regulación de la unión en el dominio de unión, etc. Las regiones funcionales o activas de la hormona glicoproteica pueden, ser identificadas por la mutagénesis de la región específica de la hormona, seguida por la expresión y prueba del polipéptido expresado. Esos métodos son fácilmente evidentes a un experto en la técnica y pueden incluir la mutagénesis específica del sitio del ácido nucleico que codifique para el receptor Zoller, M. J. et al) . La presente invención también abarca proteínas de fusión y proteínas quiméricas que comprenden las mutaciones descritas aquí, incluyendo por ejemplo, fusiones al dominio de CTEP de las proteínas LH o CG. Esa proteína de fusión puede ser producida ligando las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifiquen para las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por métodos conocidos en la técnica, en el marco de la codificación apropiada y la expresión de la proteína de fusión por cualquiera de los medios descritos anteriormente. De manera alternativa, esa proteína de fusión puede ser producida por técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos. Los análogos de una sola cadena y proteínas quiméricas de la invención pueden incorporar un enlazante peptídico entre las subunidades alfa y beta, o entre las diferentes porciones de la proteína quimérica.

Métodos de Tratamiento Los superagonistas FSH modificados de la presente invención pueden ser usados para tratar cualesquier condiciones asociadas con la actividad de la hormona glicoproteica. Las condiciones "asociadas con la actividad de la hormona glicoproteica" son aquéllas que son causadas completa o parcialmente por la respuesta de la hormona glicoproteica alterada, o que se benefician de la administración de la hormona glicoproteica. Por ejemplo, esas condiciones incluyen, pero no se limitan a la disfunción ovulatoria, defectos de la fase lútea, infertilidad inexplicable, infertilidad del factor masculino, concepción limitada por el tiempo, baja expresión del receptor de FSH, baja sensibilidad del receptor de FSH, deficiencias en la unión del receptor de FSH, deficiencias en el acoplamiento del receptor de FSH, baja producción de testosterona, calvicie masculina, y falla o daño de la pituitaria, En particular, la cantidad y calidad de los ovocitos puede ser mejorada administrando un análogo de FSH superactivo como se describe aquí a un animal. Por ejemplo, como se reporta aquí, las solicitantes también han encontrado de manera sorprendente que administrando una FSH superactiva que contenga una subunidad alfa modificada con aminoácidos básicos en las posiciones 13, 14, 16 y 20 se obtiene un incremento dramático en la cantidad ' y calidad de los ovocitos. Los efectos de una FSH superactiva sobre la cantidad y calidad de los ovocitos pueden ser mejorados aún más incrementando la vida media en suero de la FSH de la FSH superactiva. La vida media en suero de la FSH puede ser incrementada modificando adicionalmente la FSH superactiva. Pueden ser usadas modificaciones adicionales, incluyendo pero sin limitarse a aquellas previamente descritas, para incrementar la vida media en suero de la FSH. Por ejemplo, puede usarse una extensión de ANITV (SEQ ID No. 3) para prolongar la vida media en suero de la FSH. De acuerdo a la U.S. 5,574,011, incorporada aquí como referencia en su totalidad, la FSH estimula a las gónadas para producir esteroides, como la testosterona. En consecuencia, los análogos de FSH de la invención podrían ser usados para tratar cualesquier condiciones asociadas con la baja producción de esteroides, y particularmente la baja producción de testosterona. De acuerdo a la Patente U.S. 6,562,790, incorporada aquí como referencia, el bloqueo de la arteria coronaria es tratable con testosterona. Por lo tanto, los análogos de la presente invención pueden ser usados para elevar los niveles de testosterona en pacientes que exhiban la enfermedad de la arteria coronaria. Los análogos de la presente invención también pueden ser usados en regímenes terapéuticos de reproducción asistida en sujetos masculinos o femeninos, que comprende la administración de una cantidad auxiliar de la FSH modificada al sujeto. En esos métodos, los análogos pueden ser administrados solos o en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a citrato de Clomifeno, GnRH (hormona liberadora de gonadotropina) y LH (hormona luteinizante) . Por ejemplo, en un sujeto con deficiencia de gonadotropina aislada (IGD) , la administración de FSH modificada y LH puede ser efectuada al sujeto para reestablecer la función normal de las gónadas. Es ampliamente sabido en la técnica que las hormonas glicoproteicas como la FSH y LH están integradas a la fisiología reproductiva femenina, y esas hormonas glicoproteicas pueden ser administradas a un sujeto para superar un número de trastornos reproductivos y por lo tanto ayudar a la reproducción. Los análogos de la invención son particularmente útiles para tratar mujeres propensas a la hiperestimulación ovárica, por ejemplo usando análogos que tengan diferentes vidas medias en suero en un régimen combinado. Esos métodos pueden incluir (a) administrar una cantidad auxiliar de una primera FSH modificada de acuerdo a la invención, donde la vida media en plasma de la primera FSH modificada es incrementada en comparación con la FSH natural, y (b) administrando posteriormente una cantidad auxiliar de una segunda FSH modificada de acuerdo a la invención, donde la vida media en plasma de la segunda FSH modificada es menor en comparación con la de la primera FSH modificada. Por ejemplo, los análogos que demuestren una vida media disminuida en comparación con la FSH natural, es decir TR-4401, pueden ser útiles para tratar mujeres propensas a la hiperestimulación ovárica. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad efectiva de la hormona glicoproteica a administrar y dependerá de factores como el peso, talla, severidad, y condición específica, y el tipo de sujeto en sí. La cantidad terapéuticamente efectiva puede ser fácilmente determinada por procedimientos de optimización de rutina. La presente invención proporciona hormonas glicoproteicas con mayor potencia en relación a la hormona glicoproteica natural. Esas hormonas glicoproteicas modificadas permitirán a un experto en la técnica administrar una dosis más baja de una hormona glicoproteica modificada en relación a las hormonas glicoproteicas naturales para lograr un efecto terapéutico similar, o de manera alternativa, administrar una dosis de la hormona glicoproteica modificada similar a la dosis de la hormona glicoproteica natural para lograr un mayor efecto terapéutico. Dependiendo de si la hormona glicoproteica es administrada oralmente, parenteralmente, o de otro modo, la administración de la prostaglandina puede ser en forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas o líquidas, por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, líquidos, cremas y suspensiones, y similares, preferiblemente en una forma de dosificación unitaria adecuada para proporcionar una dosis precisa. La hormona glicoproteica puede incluir una cantidad efectiva de la hormona glicoproteica seleccionada en combinación con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable y, además, puede incluir otros agentes medicinales, agentes terapéuticos, excipientes o vehículos, adyuvantes, diluentes, etc. "Farmacéuticamente aceptable" significa un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir que el material puede ser administrado a un individuo junto con la hormona glicoproteica seleccionada sin causar efectos biológicos inaceptables o interactuar en una forma inaceptable con la hormona glicoproteica. Los métodos actuales para preparar esas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición (Mack Pubiishing Co., Easton, Pa.). La terapia genética es otro método de tratamiento de trastornos hormonales con las hormonas glicoproteicas modificadas de la presente invención. En este método, puede ser introducido un gen que codifique para la hormona glicoproteíca modificada en una célula, como una célula de línea germinal o célula somática, de modo que el gen sea expresado en la célula y generaciones posteriores de aquellas células que sean capaces de expresar el gen introducido. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifique para una proteína • FSH modificada de la invención puede ser insertado en una célula de ovario, o su precursora para mejorar la ovulación. Los vectores adecuados para liberar la secuencia codificadora son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el vector podría ser viral, como adenoviral, virus adenoasociado, retrovirus o no viral, como liposomas catiónicos. Los análogos de la presente invención tienen mejor actividad sobre la proteína natural y por lo tanto son particularmente adecuados para proporcionar agentes a las células que expresen receptores de hormona glicoproteica. En consecuencia, la presente invención proporciona además un método para proporcionar un agente a una célula que exprese un receptor de glicoproteína en un sujeto que necesite del mismo usando las hormonas glicoproteicas modificadas de la invención. El método de liberar o proporcionar un agente a una célula (es decir, liberación dirigida) puede emplear cualquier agente adecuado, dependiendo de la naturaleza de la enfermedad del sujeto o la enfermedad sospechosa. El agente puede ser un compuesto citoprotector, anticuerpo, fármaco, sensibilizador, modificador de respuesta biológica, radionúclido, toxina o combinación de los mismos. En ciertas modalidades, los métodos de liberación dirigida son para el tratamiento de un sujeto con un trastorno o trastorno sospechoso asociado con expresión del receptor de la glicoproteína anormal. En ciertas modalidades, los métodos de liberación dirigida son para el diagnóstico o detección de un trastorno asociado con la expresión anormal del receptor de la glicoproteina. En ciertas modalidades, los métodos de liberación dirigida pueden ser usados en conjunto con otras terapias, procedimientos de diagnóstico o modalidades clínicas, incluyendo la radiación y/ cirugía. En una modalidad, el método proporciona la liberación dirigida de un agente, donde el agente es un compuesto citoprotector. Los compuestos citoprotectores son aquellos compuestos que actúan para proteger o hacer disminuir la incidencia o severidad del daño a una célula. Los compuestos citoprotectores comercialmente disponibles incluyen al mesna (MESNEX®, Bristol-Myers Squibb) , amifostina (ETHYOL®, Alza), dexrazoxana (ZINECARD®, Pharmacia & Upjohn) y leucovorina (fabricantes múltiples) . En una modalidad, el agente puede ser cualquier droga o fármaco usado para tratar las diferentes formas del cáncer como, por ejemplo, estrógenos naturales o sintéticos, moduladores del receptor de estrógeno, progestinas, andrógenos, hormonas liberadoras de gonadotropina, inhibidores de andrógeno, bifosfonatos, glucocorticoides, hormonas tiroideas, agentes antitiroideos, agentes con yodo, bromocriptina, agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes antimitóticos, epipodofilotoxinas, antibióticos antineoplásicos, hormonas antineoplásicas, agentes complejos de coordinación de platino, antracendionas, ureas sustituidas, derivados de metilhidracina, inhibidores de la ADN topoisomerasa, retinoides, porfimer, mitotano o combinaciones de los mismos. En una modalidad, el agente puede ser cualquier droga o fármaco usado para tratar el cáncer de los sistemas reproductores masculino o femenino (por ejemplo, cáncer endometríal, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer de mama, cáncer testícular) . En una modalidad preferida, el agente puede ser el clomifeno, finasterida, propiltiouracilo, metimazol, bleomicina, vincristina, vinblastina, cisplatino, mitomicina, ifosfamida, ciclofosfamida, doxorrubícina, paclitaxel, fluorouracilo, carboplatino, epirrubicina, altretamina, vinorelbina, mitoxantrona, prednisona o combinaciones de los mismos. Las drogas o fármacos que se sabe mejoran el efecto citotóxico de ciertos fármacos anticáncer y radiofármacos también pueden ser usados . Esos fármacos son comúnmente referidos como sensibilizadores. Los ejemplos de sensibilizadores que mejoran la actividad de varios fármacos terapéuticos (por ejemplo, fármacos anticáncer) son la butionin sulfoximina y bloqueadores del canal de calcio como el verapamil, y diltiazem. (Véase, la Patente Estadounidense No. 4,628,047 e Important Advances in Oncology 1986, DeVita, et al, Eds., J. B. Lippincott Co . , Philadelphia, páginas 146- 157 (1986) , incorporadas aquí como referencia en su totalidad. ) Otros sensibilizadores conocidos en la técnica son el metronidazol, misonidazol, ciertos derivados de ácido 2-sulfamil-6-nitrobenzoico, derivados sustituidos en las posiciones 2,6 de la 3-nitropiracina, y ciertos compuestos de isoindoldiona. (Véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,647,588; 4,654,369; 4,609,659 y 4,494,547, incorporadas aquí como referencia en su totalidad) . En ciertas modalidades, el agente puede ser un modificador de la respuesta biológica. Puede ser usado cualquier modificador de la respuesta biológica en el alcance de la invención. Los ejemplos de modificadores de la respuesta biológica útiles en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a interferón-a, interferón-/?, interferón-y, factor de la necrosis tumoral, linfotoxina, interleucina-1, interleucina-2, ínterleucina-3, interleucina-4, interleucina-5, interleucina-6 o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, el agente puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o fragmentos de anticuerpos funcionales incluyendo, por ejemplo, Fabl, Fab2, etc. Los ejemplos de toxinas que pueden ser empleadas en los métodos de la invención son la ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas, proteínas inactivantes ribosomales, y micotoxinas; por ejemplo, tricotecenos . Los tricotecenos son una especie de micotoxinas producidas por hongos del suelo de la clase de los hongos imperfectos o aislados de Baccharus egapotamica (Bamburg, Proc. Molec. Subcell Bio. 1983, 8:41-110, Jarvis and Mazzola, Acc. Chem. Res. 1982, 15:338-395, incorporadas aquí como referencia en su totalidad) . Pueden ser usadas toxinas modificadas terapéuticamente efectivas o fragmentos de las mismas, como aquellas producidas a través de técnicas de ingeniería genética o de ingeniería de proteínas. Pueden ser empleados cualesquier medios de acoplamiento o enlace de un agente a una hormona glicoproteica modificada. Por ejemplo, ha sido descrito previamente un número de diferentes enlazantes escindibles. Véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,618,492; 4,542,225; y 4,625,014, incorporadas aquí como referencia en su totalidad. Los mecanismos para la liberación de un agente de esos grupos enlazantes incluyen la irradiación de un enlace fotolábil, e hidrólisis catalizada con ácido. La Patente Estadounidense No. 5,563,250, incorporada aquí como referencia en su totalidad, describe inmunoconjugados que comprenden enlazantes de una estructura química específica, donde el enlace es escindido in vivo, liberando el compuesto (radiofármaco, fármaco, toxina, etc.) en su forma nativa. El enlazante susceptible a la escisión a pH moderadamente ácido y se cree que es escindido durante el transporte hacia el citoplasma de una célula blanco, liberando el compuesto biológicamente activo dentro de una célula blanco. La Patente Estadounidense No. 4,671,958, incorporada aquí como referencia en su totalidad, incluye una descripción de inmunoconjugados que comprenden enlazantes los cuales son escindidos en el sitio blanco in vivo por las enzimas proteolíticas del sistema del complemento de la patente. Han sido descritos otros medios de acoplamiento o enlace. Por ejemplo, las moléculas enlazantes se encuentran comercialmente disponibles, como aquéllos disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois . (Véase Pierce 1986-87 General Catalog, páginas 313-354, incorporada aquí como referencia en su totalidad) . Los medios para el acoplamiento a un anticuerpo, (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,671,958 y la Patente Estadounidense No. 4,659,839, incorporadas aquí como referencia en su totalidad) y medios de enlace o acoplamiento de quelatos de metal de radionúclido, toxinas y fármacos a proteínas son conocidos. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 188,256; Patentes Estadounidenses Nos. 4,671,958; 4,659,839, 4,414,148; 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; y 4,590,071; Borlinghaus et al. Canc. Res. 47:4071-4075, Ago. 1, 1987, Foran, Best Pract . Res. Clin. Haematol. 2002, 15(3): 449-65 and Fotiou, et al, Eur. J. Gynaecol. Oncol. 1988, 9(4): 304-7 incorporadas aquí como referencia en su totalidad. En vista del gran número de métodos que han sido reportados para acoplar una variedad de compuestos de radiodiagnóstico, radiofármacos, drogas o fármacos, toxinas y otros agentes a proteínas, un experto en la técnica podrá determinar un método adecuado para unir un agente dado a una glicoproteína modificada.

Métodos de Formación de Imágenes Los análogos de la presente invención tienen mejor actividad sobre la proteína natural y por lo tanto son particularmente adecuados para formar imágenes de células que expresen receptores de hormona glicoproteica. En consecuencia, en una modalidad, la invención proporciona además métodos para formar imágenes de células que comprenden un receptor de hormona glicoproteica usando las hormonas glicoproteicas modificadas de la presente invención. El método de formación de imágenes y detección de la hormona puede ser cualquier método conocido por un experto en la técnica. Los métodos comúnmente usados para la formación de imágenes incluyen, por ejemplo, formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) , rayos X, tomografía computarizada (CT) , tomografía de emisión positrónica (PET) , mamografía y ultrasonido.

Han sido descritos métodos de formación de imágenes objetivo que usan técnicas radiológicas básicas, por ejemplo, "Textbook of Radiology and Imaging, " Sutton and Livingstone, 7ma Edición, (2 Volume set) , Churchill Livingstone (Elsevier Sciences), London, 2002, "A Concise Textbook of Radiology," Armstrong and astie (eds.) Arnold Publíshing (The Thomson Corporation) , Scarborough, Ontario, Canadá, 2001, "Walter & Miller's Textbook of Radiotherapy," Bomford and Knuckler, 6th Edition, Churchill Livingstone (Elsevier Sciences) , London, 2001, incorporados aquí como referencia en su totalidad. Véase también Bottomley, Comput . Radiol. 1984, 8(2): 57-77, Dixon, Radiology 1984, 153 (1) : 189-94, Daley and Cohén, Cáncer Res. 1989, 49(4):770-9, Ellis, et al, Clin. Radiol. 2001, 56(9): 691-9, Paushter, et al, Med. Clin. North Am. 1984, 68(6): 1393-421, Blecher, Aust . Fam. Physician 1983 12 (6) :449-50, 452, Bragg, Cáncer 1977, 40(1 Suppl) : 500-8, Moseley, Br . Med. J. (Clin. Res. Ed. ) 1982, 28 (6323) : 1141-4, Lentle and Aldrich, Lancet 1997, 350 (9073) : 280-5, Weber, et al, Strahlenther Onkol. 1999, 75 (8) : 356-73, Hanbídge, Can. J. Gastroenterol. 2002, 16(2):101-5, Miles, Eur. Radiol. 2003, Suppl 5:M134-8, Prigent- Le Jeune, et al, Eur. J. Nucí. Med. Mol. Imaging 2004, Feb 19 [Epub ahead of print], DeSimone, et al, Gynecol. Oncol. 2003, 89(3):543-8 and Goldenberg, et al, J. Clin. Oncol. 1987, 5 (11) : 1827-35, incorporadas aquí como referencia en su totalidad.

Pueden ser empleados cualesquier medios adecuados para la formación de imágenes o detección dependiendo, ínter alia , de la naturaleza del trastorno objetivo o trastorno sospechoso, el tejido cuya imagen va a ser formada y si se desean imágenes funcionales (fisiológicas) o estructurales (anatómicas) . En algunas modalidades, entre otros, los métodos de formación de imágenes proporcionan la detección de una cantidad de una hormona glicoproteica modificada marcada en un sujeto o la detección del incremento de los niveles de una hormona glicoproteica modificada en un sujeto indica la presencia de un trastorno autoinmune o un trastorno canceroso seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer de mama, cáncer testicular o tumor pituitario. Los métodos de formación de imágenes pueden ser categorizados de manera amplia como aquéllos que proporcionan información con respecto a la estructura o anatomía de un sujeto o aquéllos que proporcionan las funciones o fisiología de un sujeto. La formación de imágenes estructurales proporciona la forma de un hueso o tejido componente para determinar si existen formaciones anormales o destrucción de ciertos elementos . Los tumores o la presencia de células cancerosas pueden aparecer como cambios estructurales. Un tipo más nuevo de formación de imágenes estructurales proporciona la composición química de las diferentes partes de un tejido para determinar si existe un daño en curso o procesos bioquímicos anormales (por ejemplo, presencia o crecimiento de células cancerosas). Véase, por ejemplo, Bonilha, et al, Med. Sci. Monit . 2004, 10 (3) : RA40-6, epub 2004 Mar 01, Ballmaier, et al, Psychiatry Res. 2004, 15;130 (1) :43-55, Ballmaier, et al, Biol. Psychiatry, 2004) 55(4):382-9, Cha, Magn. Reson. Imaging Clin. N. Am. 2003, 11 (3):403-13 and Kopelman, et al , Híppocampus, 2003; 13 (8) : 879- 91, incorporadas aquí como referencia en su totalidad. La formación de imágenes funcionales es una técnica relativamente novedosa que busca determinar si tejidos u órganos particulares están efectuando tareas funcionales particulares. Esta técnica puede capitalizar sobre un número de procesos fisiológicos, incluyendo, por ejemplo, el flujo sanguíneo y la actividad asociada con cambios en el flujo sanguíneo (es decir presencia o crecimiento neoplásico) y la verificación de respuestas a la quimioterapia. Véase, por ejemplo, Takeuchi, et al, J. Med. Invest. 2004, 51 (1-2) : 59-62, Otsuka, et al, J. Med. Invest. 2004, 51 (1-2) : 14-9, Martincich, et al, Breast Cáncer Res. Treat. 2004, 83(l):67-76, Cohén and Goadsby, Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 2004, 4(2):105-10 y Lewis, et al, Eur. J. Neurosci. 2004, 19 (3) : 755-60, incorporadas aquí como referencia en su totalidad. En general, los métodos radiológicos como, por ejemplo, la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) , rayos X, tomografía computarizada (CT) , mamografía y ultrasonido proporcionan información estructural o anatómica con respecto a un sujeto. Los métodos radiológicos como, por ejemplo, la medicina nuclear, formación de imágenes con radionúclidos y tomografía de emisión positrónica (PET) proporcionan información funcional o fisiológica con respecto a un sujeto. Ambos métodos de formación de imágenes estructurales y funcionales están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad de la invención, los métodos de formación de imágenes proporcionan una hormona glicoproteica modificada marcada (es decir que _ se usa un agente de contraste) . Puede ser usada cualquier marca o agente de contraste. Véase, Minato, et al J. Comput . Assist. Tomogr. 2004, 28(1) :46-51, Antoch, et al, JAMA 2003, 290 (24) : 3199- 206, Brinker, Rev. Cardiovasc. Med. 2003;4 Suppl 5:S19- 27, el-Diasty, et al, J. Urol. 2004, 171(1) :31-4, Williams, et al, Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 2003, 32 (6): 651-2, Folien, et al, Cáncer 2003, 98(9 Suppl) : 2028-38, Behrenbruch, et al, Med. Image Anal. 2003, 7(3) .-311-40, Knopp, et al, Mol. Cáncer Ther. 2003, 2(4):419~26, incorporadas aquí como referencia en su totalidad. La marca puede ser cualquier marca conocida por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad, marca puede ser una marca radioopaca, una marca radioactiva, una marca fluorescente o una marca paramagnética .

Los radionúclídos generalmente emiten radiación (ß) o gamma (y) . El 1131 emite aproximadamente 90% de radiación ß y aproximadamente 10% de partículas y y tiene una vida media física de aproximadamente 8 días. El Tc99m emite radiación y y tiene una vida media de aproximadamente 6 horas. Después de la administración de, por ejemplo, una proteína marcada con Tc99m puede ser detectada la biodistribución del radionúclido barriendo al paciente con una cámara gamma usando procedimientos conocidos. Las acumulaciones del Tc99m en el sitio objetivo son de este modo fácilmente convertidas en imágenes. Véase, Toohey, Radiographics . 2000;20:533-546, Kostakoglu, et al, RadioGraphics 2003, 23:315-340, Saremi, et al, RadioGraphics 2002, 22:477-490, Intenzo, et al, RadioGraphics 2001, 21:957-964, Ranger, RadioGraphics 1999, 19:481-502, Simpkin, RadioGraphics 1999, 19:155-167, Janoki and Kerekes, Acta Physiol. Hung. 1992, 79 (2) : 183-96, Hoefhagel, Anticancer Drugs 1991, 2(2):107-32, Hoemagel, Eur. J. Nucí. Med. 1991,18 (6) :408-31, Gatley, et al, Acta Radiol. Suppl. 1990, 374:7-11, Ott, Br. J. Radiol. 1989, 62(737) : 421- 32, Andersen, Cerebrovasc. Brain Metab. Rev. 1989, 1(4):288-318 y Miraldi, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1986, 12(7): 1033-9, incorporadas aquí como referencia en su totalidad. Además del 1131 o el Tc99m, puede ser empleado cualquier radioisótopo conocido por aquellos expertos en la técnica en los métodos de la invención. Otros radionúclidos y quelatos pueden incluir, por ejemplo, Co57, Co58, Cr51, F18 FDG, Ga67, cloruro de Inlll, pentetato de Inlll (DTPA), Inlll oxiquinolina (oxina) , pendetiuro de Inlll Capromab, pentetato de Inlll Imciroma, Inlll, pentetreotiuro, pendetiuro de Inlll satumomab, I 123, iotalamato de 1125, 1125 albúmina de suero humano (RISA) , yodohipurato de 1131, 1131 yodometil- norcolesterol (NP-59) , 1131 metayodobencilguanidina (MIBG) , Kr81m gaseoso, fosfato crómico P32, fosfato de sodio P32, Ru82, Sm 153 lexidronam (Sm-153 EDTMP) , Sr89, TI 201 y Xel33.

Ensayos de Diagnóstico La presente invención proporciona además, la detección de analitos que interfieren con la unión de las hormonas glicoproteicas modificadas de la invención a un receptor de hormona glicoproteica. En una modalidad, los métodos proporcionan la detección de un analito que interfiere con la unión de un receptor de hormona glicoproteica modificada en una muestra biológica, el método comprende (I) poner en contacto la muestra con una hormona glicoproteica modificada de acuerdo a la presente invención y (II) detectar una señal donde la presencia o cantidad de la señal detectada indica la presencia o ausencia de un analito que interfiere con la unión de una hormona glicoproteica modificada con receptor de glicoproteína. r En una modalidad, el " método de detección de un analito es un ensayo de unión competitivo. Un ensayo de unión competitivo es un ensayo basado en la competencia entre un ligando marcado y un ligando no marcado en la reacción con un agente de unión del receptor (por ejemplo anticuerpo, receptor, proteína de transporte) . IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 1997, 2da edición, "Competitive Protein Binding Assays" Odell and Daughaday, W.H. Lippincott, 1972 y "Principies of Competitive Protein-binding Assays" Odell and Franchimont, P. John Wiley & Sons Inc., 1983, incorporadas aquí como referencia en su totalidad. Véase también la Patente Estadounidense No. 6,537,1760, incorporada aquí como referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, la señal es la presencia o cantidad de la hormona glícoproteica modificada unida con el receptor de glicoproteína en la muestra. En ciertas modalidades, el método emplea la detección de una señal secundaria, como, por ejemplo, la detección de la presencia o cantidad de AMPc o un esferoide (por ejemplo progesterona) En ciertas modalidades, los métodos emplean el uso de células completas en la muestra biológica. En ciertas modalidades, los métodos emplean solo partes de las células, por ejemplo, las membranas celulares. En ciertas modalidades, el ensayo puede ser efectuado en solución. En ciertas modalidades, uno o más componentes del ensayo pueden ser inmovilizados sobre una fase sólida. Las superficies de plástico, micropartículas, partículas magnéticas, filtros, materiales de geles poliméricos y otros sustratos en fase sólida pueden ser usados como fases sólidas. Véase, por ejemplo, 6,664,114; 6,589,798; 6,479,296 y 6,294,342, incorporadas aqt?í como referencia en su totalidad. Es posible automatizar los métodos de ensayo proporcionados en la invención.

Métodos de Diseño de Agonistas y Antagonistas del Receptor y Glicoproteína Usando Superagonistas de FSH La presente invención también proporciona métodos para diseñar nuevos agonistas y antagonistas del receptor sobre la base de la interacción de las proteínas FSH de la invención y un receptor connato. Esos métodos implican predecir las interacciones de motivos cargados en las proteínas FSH de la invención con aminoácidos residuales complementarios dentro de un receptor cognado. Por ejemplo, ese método puede implicar comparar las diferencias en la interacción en términos de la unión y bioactividad de la FSH a receptores de especies evolutivamente distantes, por ejemplo, LH humana contra receptor de LH de rata, localizar aminoácidos cargados dentro de dominios extracelulares y/o ciclos extracelulares que estén presentes únicamente en una de las dos secuencias receptoras, efectuar la exploración de alanina y mutagénesis inversa de la carga para validar mejor la predicción dada, construir un modelo de complejo de hormona- receptor que incorpora interacciones validadas, y diseñar nuevos análogos de hormona y antagonistas del receptor usando el modelo. Los nuevos análogos de hormonas incluyen aquéllos que se predijo se unirán al receptor usando el modelo. Los nuevos antagonistas incluyen aquéllos que son diseñados de dominios y/o ciclos de la proteína receptora y se predijo se unirán a análogos de FSH usando el modelo. Por ejemplo, se ha encontrado que uno de los análogos de la invención (TR-4402, que comprende las sustituciones alfa (E14R + Q20R + G73R) + betaE4R) , interactúa con el receptor de LH de rata (?EQ ID No. 23, Acceso NCBI No. NP_037110) a altas concentraciones, pero no el receptor de LH humana (SEQ ID No. 24, Acceso NCBI No. NP_000224, no es muestran los datos) . Sobre la base de la diferencia en la especificidad de la TR-4402 en esos receptores, la Argl4, Arg20 y Arg73 deberán interactuar con los residuos cargados negativamente Asp y Glu en el receptor de LH de rata. Los residuos cargados negativamente presentes en el receptor de rata pero ausentes en el receptor humano son Asp 312 y Glu 314 (sobre la base de la secuencia de aminoácidos del receptor de LH humana con el péptido señal (Ser y Lys, respectivamente, en el receptor de LH humana) . Los residuos correspondientes en el receptor de FSH humana (SEQ ID No. 22, Acceso NCBI No. AAA52477) son Glu316, Asp317 y Glu319. Por lo tanto se predijo que este grupo de aminoácidos, interactuará con Argl4, Arg20 y Arg73 de la subunidad alfa de la TR-4402. Esta información deberá permitir un mejor modelaje de las interacciones de la hormona glicoproteica, y contribuirá al diseño de nuevos análogos de glicoproteína, incluyendo a antagonistas peptídicos/proteínicos que contengan la secuencia correspondiente a los 298-338 del receptor de FSH humana e incluyendo Glu300 y Asp302. Los siguientes ejemplos se proporcionaron para describir e ilustrar la presente invención. Como tales no deben construirse para limitar el alcance de la invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que muchas otras modalidades también caerán dentro del alcance de la invención, como se describió anteriormente y en las reivindicaciones.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Producción y Caracterización de los Superagonistas de FSH. Mutagénesis dirigida al sitio. La mutagénesis dirigida al sitio del ADNc de la subunidad alfa humana (SEQ ID No. 1) y beta (SEQ ID No. 2) de la FSH se efectuó usando el Equipo de Mutagénesis QuickChange de Stratagene. Los análogos se diseñaron de acuerdo a los métodos descritos en la Patente Estadounidense No. 6,361,992, incorporada aqui como referencia en su totalidad.

Después de subclonar en los vectores de expresión, todos los productos de la PCR de todos los plásmidos recombinantes o constructos fueron secuenciados para verificar las mutaciones y para determinar cualesquier errores de polimerasa indeseables. Expresión Transitoria. Los análogos fueron expresados transitoriamente en células de ovario de hámster Chino (CH0-K1) . Las células fueron cotransfectadas transitoriamente en discos de cultivo en 60 ó 100 mm con ADNc de la subunidad natural o mutante (FSH alfa y beta) , usando un protocolo de transfección transitoria basado en una formulación de liposoma (reactivo LipofectAMINE, Gibco BRL) . Después de recuperar durante 12 horas en medio de cultivo regular, las células transfectadas fueron cultivadas en medio libre de suero en CHO- (CHO-SFM, Gibco BRL) durante 72 horas. Posteriormente, los medios acondicionados, incluyendo el medio control de transfecciones con mock usando plásmidos de expresión sin insertos genéticos, fueron cosechados, concentrados con concentradores Centriprep 10 (Amicon, Beverly, MA) y almacenados a -70 °C. Los análogos fueron cuantificados con un panel de diferentes anticuerpos monoclonales y policlonales que reconocen a diferentes epítopes de la FSH. Ensayo de Bioactividad de la FSH. La actividad folitrópica de los análogos fue evaluada por su capacidad para inducir la producción de AMPc en células CHO que expresan receptores de hFSH. Las células de CHO que expresan de manera estable el receptor hFSH se hicieron crecer hasta la confluencia en placas de cultivo tisular de 96 pozos. Posteriormente, las células fueron incubadas en condiciones libres de sal (2h) o con medios fisiológicos (Ih) a 37 °C, 5% de C02 con diluciones en serie de FSH natural y mutante así como medio control de transfecciones con mock. La cantidad de AMPc producido fue determinada por radioinmunoensayo. Las mutaciones de FSH que muestran la bioactividad más alta in vitro y no tienen efectos adversos sobre la producción de FSH fueron elegidas para cepas combinadas. La Figura 1 incluye las gráficas que muestran una comparación del efecto de varias mutaciones individuales sobre la bioactividad de la FSH in vi tro, de acuerdo a lo medido usando la transfección transitoria de células CHO-FSHR. Las mutaciones individuales que muestran la más alta potencia incluyeron sustituciones básicas en las posiciones alfa Q13, E14, V68, P21 y G73, y en la posición beta E4. Una sustitución de arginina en F18 dio como resultado una pérdida de la bioactividad. La beta E4R en particular dio como resultado un aumento en la producción de FSH (véase la Figura 2) . El efecto sinérgico sobre la bioactividad de varias sustituciones combinadas se muestra en la Figura 3. En total, se probaron 26 mutaciones individuales en la subunidad alfa y 23 mutaciones individuales en la subunidad beta, y las mutaciones superiores en cada subunidad fueron seleccionadas para construir análogos líder con sustituciones combinadas. La Tabla 1 siguiente muestra las mutaciones combinadas con un incremento probado en la bioactividad in vi tro .

Tabla 1. Sustituciones Combinadas que dieron como Resultado un Aumento de la Potencia Como es sabido en la técnica, un fármaco o droga particular puede exhibir diferentes eficiencias dependiendo del sistema usado. Véase Kenakin, "Predicting Therapeutic Valué in the Lead Optimization Phasé of Drug Disclovery, " Nature Rev. 2: 429-38 (2003). Por lo tanto, la bioactividad de los análogos de la invención también fue probada usando células granulosas de ratas que expresan bajas cantidades de receptor de FSH (células GLHR-15) . Como se muestra en las gráficas de la Figura 4, los análogos de la invención dieron como resultado respuestas de AMPc significativas, en comparación con el FSH natural y la cadena alfa libre, las cuales no mostraron una respuesta significativa dependiente de la dosis .

Ejemplo 2. Purificación y Caracterización del Análogo TR-4402 El análogo TR-4402 fue elegido para su purificación y caracterización adicional. El TR-4402 es un análogo de FSH que contiene dos mutaciones en la espira alfa Ll (aE14R y aQ20R) , y una mutación en la espira alfa L3 (c¿G73R) , y una mutación en la espira beta Ll (ßE4R) . Véase la Figura 5. La línea celular que produce TR-4402 fue establecida por cotransfección de un vector pED modificado que contiene el ADNc de la subunidad alfa humana y el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) , y un vector pIRES modificado que contiene el ADNc de la subunidad beta de FSH, separada por una secuencia de IRES y el marcador genético amplificable, adenosina desaminasa (ADA), en CHO-DHFR(-) por el método de la lipofectamina. Las células transfectadas fueron cultivadas en medio de selección (MEMa deficiente en ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos con 10% de FBS dializado) . Para la producción estable de análogos de hFSH en un doble mutante de supresión en CHO (dhfr-/dhfr-) , la línea celular CHO-DG44 fue amablemente proporcionada por el Dr. L. Chasin (Columbia University, New York, N. Y.). Las líneas clónales celulares que secretan FSH#4402 fueron cultivadas en concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta 2µM. La amplificación de DHFR se basó en los incrementos sistemáticos de MTX en medio sin nucleósidos agregados. Las células calificaron para el siguiente paso de amplificación después de considerar su morfología poligonal (2-3 semanas) . Puesto que la concentración de MTX se incrementó aproximadamente 80Ox (de aproximadamente 0.005 uM hasta aproximadamente 4 µM) el proceso de amplificación tomó aproximadamente 4 meses. Las clonas con el nivel de secreción más alto también fueron sometidas a un segundo tratamiento, que implica la utilización de desoxiformicina, dirigida a la amplificación del gen marcador ADA. Las clonas individuales fueron probadas por su expresión usando inmunoensayo de FSH establecido para la detección de FSH#4402. Una línea celular estable (ID de clona: H-2-3) , transfectada con pED-análogo a + pIRES-ADA-análogo b (relación molar de a:b = 1:5, 5 mg de ADN total), fue seleccionada y propagada en medio esencial alfa mínimo (a-MEM: Cat #: 12561-056, Lote # 1141509, con L-glutamina, sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos); GIBCO, Grand Island, N.Y.), suplementado con 10% de suero bovino fetal dializado (Gibco, Cat No: 26400-044) y metotrexato de 2 mM (MTX; ICN, Cat. No: 102299, Aurora, Ohío) . Preparación del inoculo del biorreactor. Cuando las células CHO-DG44 fueron de >90% confluentes en los matraces T de 500 cm2, las células fueron tripsinizadas, centrifugadas a 400 g durante 5 min a 4°C. Las células totales (1.6 '109/500 ml de medio de cultivo de a-MEM) fueron inoculadas en un Biorreactor Celligen plus alimentando la suspensión celular en una botella de plástico de 2 L. Después de la amplificación, la línea celular productora de la más alta cantidad de FSH#4402 se hizo crecer en matraces múltiples. Las células fueron propagadas adicionalmente usando el modo de perfusión en el Biorreactor Packed-Bed Bioreactor de 3.5 L con un dispositivo de retención interno (canasta) y sistema de mezclado vertical (Celligen Plus, New Brunswick Scientific, Edison, NJ) . Las células fueron capturadas sobre discos de Fibracel localizados dentro del montaje de retención. El oxigeno disuelto se mantuvo a una saturación del 50%. La temperatura fue de 37 °C. La agitación fue de 100 rpm. El pH de 7.2 se mantuvo usando el sistema de mezclado de cuatro gases por inyección automática de bicarbonato de sodio. La perfusión se ajustó para mantener el nivel de glucosa por encima de 1.5 g/L y lactato por debajo de 1.5 g/L. Proceso de privación de FBS y producción del análogo FSH-TR 4402 en el biorreactor Celligen plus. Se usó CHO III A (Gibco, Formula No.: 97-0147DK, Lote No.: 1147268) suplementado con suplemento de hipoxantína-timidina (Gibco, 100'), penicilina-estreptomicina (Gibco, 100'; Cat #: 15140-122, Lote #: 1161387), glutamax-1 (Gibco, 100'; Cat #: 35050-061, Lote #: 1163550), 10% de pluronic F-68 (Gibco, 100', Cat #: 24040-032, Lote #: 1153058), y 1% de suero bovino fetal dializado (Gibco) para privar al suero en el biorreactor. En el día 17 de operación del biorreactor, el medio de cultivo CHO-III A cambió al libre de proteína de CHO, medio libre de componentes animales (Sigma, Cat #: C-8730 Lote No.: 122K8401) hasta el día 23 (véase el funcionamiento del biorreactor resumido SLIDE) . Se cosechó, centrifugó, filtro (membrana de 0.45 µm) y se concentró el medio del biorreactor usando concentradores Millipore. Purificación. El TR-4402 fue purificado usando in unoafinidad (Ac monoclonal ME.112 de Maine Biotechnology Services, Inc.) y cromatografía de interacción hidrofóbica. La pureza fue evaluada sobre SDS-PAGE (~85%) . El análogo TR-4402 modificado fue caracterizado usando bioensayos in vitro empleando líneas celulares CHO, tumor similar a granulosa humano (KGN) y granulosa de rata (GLHR- 15) que expresan receptor de FSH humana y la producción de AMPc total como un punto final (véanse las Figuras 6-8) . Usando células CHO-FSHR, el TR-4402 mostró un incremento de 30 veces en la potencia y un incremento de la potencia de 17% en la Vmax en comparación con Follistim (FSH natural) . Usando KGN-FSHR, TR-4402 también mostró un incremento de 30 veces en la potencia en comparación con FSH natural. El TR-4402 también fue probado por la unión a los receptores LH y TSH para confirmar la especificidad del análogo de FSH, y se empleó enfoque isoeléctrico para confirmar la heterogeneidad de la cadena carbohidratada, es decir la presencia de las subunidades alfa y beta (no se muestran los datos) . El efecto del TR-4402 en comparación con la FSH natural también fue probado en folículos de ratón in vitro usando el bioensayo de folículos in vitro EggCentris. Este ensayo estudia el crecimiento y desarrollo de folículos preantrales tempranos hasta la etapa ovulatoria. El papel en el proceso in vitro imita estrechamente la fisiología de la foliculogenesis in vivo . El sistema de cultivo comienza con el aislamiento de una clase homogénea de folículos preantrales de ratón de entre 100 y 130 µM de diámetro. Los folículos fueron cultivados individualmente y cultivados durante 12 días con 1, 3 y 9 mlU/mL de natural ("compuesto 3") y TR-4402 ("compuesto 4"). El bioensayo de los folículos indicó que la calidad de los ovocitos mejoró después de la exposición de TR-4402 en comparación con Follistim (natural) como lo mostró el aumento de la sobrevivencia de los folículos (Figura 9) , aumento de formación de antro (Figura 10) , aumento de la mucificación de COC (Figura 11), aumento de la maduración nuclear (Figura 12) y aumento de la producción de progesterona (Figura 13) . Esas diferencias pudieron ser relacionadas con la presencia de una acción antiapoptótica del receptor de FSH en la membrana celular del ovocito (véase, por ejemplo, Meduri et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 87(5): 2266-76), e indican que los superagonistas modificados de la invención pueden ser usados para mejorar el desempeño de los ovocitos en pacientes que buscan terapia reproductiva auxiliada.

Ejemplo 3. Estudios In vivo utilizando TR-4402 Los estudios in vivo de TR4402 se efectuaron usando ratas hembra Sprague-Dawley de 21 días de edad, inmaduras. La inyección de FSH se efectuó subucutáneamente una vez al día durante 3 días (O, 24 y 48h) . A las 72 h se recolectaron muestras de sangre y se efectuó la autopsia. Se midió el peso de ambos ovarios. Los niveles de FSH e inhibina B fueron determinados en suero usando el inmunoensayo de FSH ICN-IRMA. Se determinó el contenido de estradiol intraovárico después de la homogenización de la ovarios usando el equipo 17 beta- estradiol CT (ICN Pharmaceuticals, Inc.). Un incremento del peso del ovario también ha sido previamente correlacionado con la dosis inyectada de FSH (Steelman and Pohley, 1953) . La FSH estimula el crecimiento de los folículos (proliferación de células granulosas, hiperaemia, producción de estradiol e inhibina B) . Se observaron diferencias estadísticamente significativas en el peso del ovario (Figuras 14A, C y D) , contenido de estradiol intraovárico (Figura 15) y niveles de inhibina B en suero (Figura 16) después de la estimulación con las dosis correspondientes de TR-4402 y Follistim. Esa ventaja de la TR-4402 sobre la FSH natural en términos del peso del ovario, producción de inhibina y estradiol fue observada a pesar de un nivel menor de 40-50% de TR-4402 que Follistim remanente en el suero al final del cada experimento (véase la Figura 14B) . • Puesto que los estudios en roedores son generalmente considerados como buenos indicadores de la eficacia clínica de preparaciones de FSH en humanos, se espera que el TR-4402 deberá mostrar una ventaja considerable sobre el Follistim para el tratamiento de pacientes humanos. Además, una FSH superactiva con una velocidad de eliminación más rápida, (como el TR-4402) deberá tener aplicaciones inmediatas en la segunda fase del protocolo de IVF y dará como resultado una disminución de la ocurrencia del síndrome de hiperestimulación ovárica (OHSS) .

Ejemplo 4. Fertilización In vitro, Desarrollo d'el Embrión y Estudios de Nacimientos Vivos que Comparan los Análogos de FSH con la FSH Natural. Ratones hembras B6D2F1 de 23 dias de edad (grupos de 5) recibieron una inyección subcutánea de 10 Ul de TR- 4401, 10 Ul de TR-4901, 10 Ul de FSH natural (Follistim), o 20 Ul de FSH natural (Follistim) al día uno del experimento. Se administró una dosis ovulatoria de hCG por inyección intraperitoneal en al menos un animal como control. 72 horas después de la inyección de FSH, se recolectó esperma y ovocitos y ocurrió la fertilización. Se recolectó el esperma de ratones B6D2 y CB6F1 macho de más de 2 meses de edad. Los ratones macho fueron sacrificados por dislocación cervical. Se hizo una incisión en el área inferior del abdomen, y se disecaron los epidídimos y los vasos deferentes y se colocaron en un disco de esperma. Los epidídimos y los vasos deferentes fueron cortados de 3 a 5 veces, y el esperma fue suavemente exprimido de los órganos sobre el disco de esperma. El disco de esperma con el esperma fue colocado en una incubadora a 37 °C y 5% de C02 y se dejó capacitar de 30 a 90 minutos. Los ovocitos fueron recolectados de ratones hembra superovulantes los cuales habían recibido TR-4401, TR-4901, o FSH natural (Follistim) sacrificando los ratones hembra y disectando los oviductos. Los oviductos fueron colocados en una gota de medio HTF y las ampollas fueron desgarradas para liberar los racimos de huevos. Los ramicos de huevos intactos fueron transferidos a discos de fertilización y contados. La tabla 2 proporciona el conteo de ovocitos por grupos de 5 ratones. Los análogos de FSH TR-4401 y TR-4901 produjeron más ovocitos a la dosis de 10 Ul que la FSH natural recombinante (Follistem) a dosis de 10 Ul y 20 Ul. Posteriormente los ovocitos fueron colocados en los discos de fertilización, se les agregaron alícuotas de esperma (IxlO6 a 2xl06 esperma/ml) a cada disco de fertilización. Los discos de fertilización fueron colocados en la incubadora a 37 °C y 5% de C02 durante un mínimo de cuatro horas para permitir que ocurriera la fertilización. Después de 4 horas de incubación, los huevos fertilizados fueron transferidos de los discos de fertilización a los discos de lavado donde se lavaron al menos dos veces en gotas de 250 µl de medio HTF para remover restos. Los ovocitos fueron almacenados en gotas de HTF en los discos en el incubador a 37 °C y 5% de C02 durante la noche. Veinticuatro horas después de la fertilización, las células fueron removidas del incubador. Se contaron las células de dos embriones (Tabla 2, columna titulada "número de embriones de 2 células"), y se determinó la tasa de fertilización por el porcentaje de ovocitos que se desarrollaron en embriones de dos células (Tabla 2, columna "% de células de 2 embriones") . El número de embriones de dos células resultante fue mayor para los grupos de ratones tratados con los análogos de FSH TR-4401 y TR-4901. La tasa de fertilización para todos los grupos (análogos de FSH y FSH natural recombinante) fue alta. Los embriones de dos células fueron transferidos posteriormente a discos de cultivo para su desarrollo adicional (Tabla 2, columna titulada "número de embriones de 2 células restantes en cultivos") o implantados en hembras pseudopreñadas (Tabla 2, columna titulada "número de embriones de 2 células transferidas") . Los embriones que permanecieron en los discos de cultivo fueron observados por la formación de blastocitos al cuarto día después de la fertilización. El número de blastocitos en desarrollo es proporcionado en la Tabla 2 en la columna titulada "número de blastocitos al desarrollo" . La Tabla 2 proporciona el número total de blastocitos y el número de blastocitos que se incubaron. Los embriones con dos células que fueron implantados para su fertilización fueron implantados en hembras CDl entre las seis y ocho semanas de edad. Se implantaron 60 embriones de dos células en cada grupo de prueba de tras ratones con la excepción del grupo con TR-4401 el cual tuvo 40 embriones de dos células implantados. Los ratones fueron anestesiados con una solución de cetamina/zilazina por inyección intraperitoneal. Una vez anestesiados, cada ratón fue afeitado, y se hizo una pequeña incisión caudal (0.5 cm) en el reborde y en el primer tercio del dorsal al ventral. Se hizo otra incisión en la pared corporal para proporcionar acceso a la abdominal . Se usaron fórceps para sujetar el apéndice de grasa del ovario y retirar suavemente el ovario, el oviducto y el extremo proximal del útero a través de la pared corporal . El ovario y el oviducto fueron colocados sobre un hisopo de algodón para crear un ángulo sobre la unión ovario-oviducto. Se identificó el infundíbulo bajo un estereomicroscopio, y se usaron dos pares de fórceps superfinos para hacer un orificio en el saco . Los embriones fueron transferidos pipeteando un volumen mínimo de medio M2 con los embriones en el inf ndibulo. Los órganos fueron entonces reubicados en la pared corporal y suturados con uno o dos puntos. La incisión en la piel fue cerrada con una o dos grapas para heridas . Los ratones fueron observados diariamente. Después de diez días, los ratones receptores fueron verificados para ver si estaban preñados. La tabla 2, columna de "preñez de transferencia de embriones de 2 células" proporciona el número de embarazos resultantes por grupos de prueba. El análogo de FSH TR-4901 produjo la mayoría de los embarazos. Se efectuó un experimento similar que compara la TR-4401 con la FSH natural recombinante usando el nacimiento como el punto final. Los ratones hembra (3 ratones/grupo) fueron inyectados con 1 Ul de hCG y 3 Ul de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) como control, 1 Ul de FSH natural (Gonal F) , 3 Ul de FSH natural (Gonal F) , 1 Ul de TR- 4401, o 3 Ul TR-4401. Los ratones fueron inyectados 48 horas posteriormente con una dosis ovulatoria de 5 Ul de hCG. 24 horas después de la dosis ovulatoria, fueron contados los ovocitos y se permitió que tomara lugar la fertilización in vitro como se describió anteriormente. Posteriormente se implantaron 20 embriones de dos células en madres pseudopreñadas. La tabla 3 proporciona los resultados del experimento. Los grupos de prueba que recibieron 1 Ul o 3 Ul de TR-4401 lograron los conteos de ovocitos más grandes, las tasas más altas de desarrollos de blastocitos y las tasas de alumbramiento más altas en comparación con el grupo control y los grupos de prueba tratados con FSH natural recombinante.

Tabla 2. Fertilización in vitro y Experimentos de Transferencia de Embriones Comparando el TR-4401 y el TR-4901 con FSH Natural Recombinante (Follistim) 15 Tabla 3. Fertilización in vitro, Desarrollo del Embrión y Experimentos de Alumbramientos Vivos que Compara TR-4401 con FSH Natural Recombinante (Gonal-F) y PMSG (control) 00 s 0 Ejemplo 5. Comparación de la Cantidad y Calidad de los Ovocitos de Ratón Tratados con Análogo de FSH TR-4401 y FSH Natural Recombinante (Gonal F) Los ovocitos de ratones B6CBAF1 fueron evaluados cuantitativa y cualitativamente después del tratamiento in vivo con un control o varias dosis de FSH natural recombinante o análogo de FSH TR-4401 como se describe en la Tabla 4. La fertilización in vi tro toma lugar el día 1 (72 horas después del tratamiento) de acuerdo al protocolo previamente descrito.

Tabla 4. Grupos de tratamiento (3 ratones/grupo) Tabla . Grupos de tratamiento (3 ratones/grupo) (Continuación) Se encontró que el tratamiento con TR-4401 incrementa significativamente el número de ovocitos producidos. La Figura 21 proporciona el número total de ovocitos por grupo al momento del lavado del esperma (inmediatamente antes de la fertilización in vitro) . La Figura muestra que el TR-4401 produjo más ovocitos a todas las dosis (0.5 Ul, 1 Ul, y 3 Ul) que los grupos de prueba tratados con hormona foliculoestimulante natural recombinante. El tratamiento con TR-4401 incrementó el número total de embriones resultantes de la fertilización ín vi tro . La Figura 24 proporciona el número total de embriones de 2 células por grupo. La Figura muestra que el TR-4401 produjo más embriones de 2 células a todas las dosis (0.5 Ul, 1 Ul, y 3 Ul) en los grupos de prueba tratados con FSH natural recombinante.

En un experimento similar, los grupos de prueba recibieron tres dosis de 0.5, 1, o 3 IU de TR-4401 o FSH natural recombinante (Gonal F) combinadas con 1 IU de hCG. Un grupo control recibió 3 dosis de 1 IU hCG. El día 3, todos los grupos se les proporcionó una dosis ovulatoria de IU hCG. La fertilización in vitro se efectuó en ratones como se describió anteriormente. La Figura 22 muestra que los ratones tratados con análogo de FSH TR-4401 presentaron las tasas de fertilización más alta a todas las dosis (3x (0.5, 1, 3 IU) + .1 Ul hCG) que los ratones tratados con FSH natural recombinante (Gonal F) o el control. Además, los ovocitos de los ratones tratados con la dosis más baja es de TR-4401 (3x 0.5 TR-4401 + 1 Ul hCG) mostraron una tasa de fertilización más alta que aquellos de ratones tratados con dosis más altas de TR-4401. La Figura 23 muestra que los embriones de ratones tratados con análogo de FSH TR-4401 (todas las dosis) presentaron tasas de formación de blastocitos más altas que los embriones de los grupos de prueba tratados con FSH natural recombinante. Los embriones de los ratones tratados con la dosis más baja de TR-4401 (3x 0.5 TR-4401 + 1 Ul hCG) mostraron una tasa de formación de blastocitos más alta que los embriones de los ratones tratados con las dosis más altas de TR-4401.

Ejemplo 6. Comparación Farmacocinética de los Análogos de FSH . Los experimentos farmacocinéticos se efectuaron para determinar las velocidades de absorción y eliminación de los análogos de FSH TR-4401, TR-4402, y TR-4901 comparados con la FSH natural recombinante. El ensayo de eliminación de FSH se efectuó para determinar la cantidad de FSH en suero en mlU/ml con el tiempo para TR-4401, TR-4402, y TR-4901 en comparación con le FSH natural recombinante. La Figura 17A proporciona los resultados del ensayo. La Figura muestra la eliminación retrasada del análogo de FSH TR-4401 en comparación con TR- 4402 y TR-4901. El análogo de FSH TR-4402 exhibió una corta duración de la acción en comparación con otros análogos . De manera similar, la Figura 17B muestra la velocidad de eliminación (En [suero FSH mUI/ml] sobre el tiempo) para los análogos de FSH TR-4401, TR-4402, y TR-4901 en comparación con la FSH natural recombinante. El TR-4402 fue eliminado a una velocidad más rápida que los otros análogos -y FSH natural recombinante (Follistim) . La Tabla 5 proporciona los datos del experimento farmacocinético. Los datos confirman que la velocidad de eliminación (Ke) y la velocidad de absorción (Ka) fueron más grandes para el análogo de FSH TR-4402. Como se esperaba, la vida media en suero (Tl/2) fue menor para el TR-4402 en comparación con los otros análogos y la FSH natural recombinante.

Tabla 5. Datos Farmacocinéticos de los Análogos de FSH TR- 4901, TR-4401, y TR-4402 y FSH Natural Recombinante (Follistem) La farmacocinética puede tener un efecto dramático sobre como reacciona un paciente a un análogo de FSH. Los pacientes hipersensibles en riesgo de síndrome de hiperestimulación pueden beneficiarse por un análogo de la FSH como el TR-4402 el cual actúa más rápido y durante un tiempo más corto que los otros análogos. Otros pacientes igualmente se beneficiarían de un análogo de la FSH como el TR-4401 el cual demuestra una acción farmacocinética prolongada.

Se efectúan experimentos farmacocinéticos adicionales que compara la TR-4401 con la FSH natural recombinante (Gonal F) . En un experimento los ratones fueron inyectados con una sola dosis de FSH natural recombinante o TR-4401. Los niveles terminales en sangre fueron determinados en 68 horas después de la inyección en la necropsia. Los valores terminales de FSH en sangre fueron al menos 5-6 mayores con TR-4401 en comparación con la FSH natural recombinante. La tabla 6 proporciona los datos de dosificación y terminales de FSH en sangre.

Tabla 6. Datos de FSH Terminal en Sangre para FSH (Gonal F) TR-4401 0.22 µg todos los animales menos de 2.5 mUI/ml TR-4401 2.2 µg todos los animales entre 12- 15 mUI/ml Ejemplo 7. Modificaciones para Incrementar la Vida Media en Sueros de Análogos de FSH . El análogo de FSH TR-4 02 fue modificado adicionalmente por una extensión N-terminal como se describió anteriormente para incrementar la vida media en suero. Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden mejorar la vida media en suero para análogos de FSH son proporcionados en la Figura 18. Los estudios de estimulación de AMPc in vitro usando células CHO fueron conducidos para comparar al TR-4402 modificado en N-terminal (LA1 -4402), FHS modificada N- terminal "natural" (LAl-Wt) , TR-4402, y FSH natural recombinante (Follistem) . La Figura 19 muestra que las modificaciones prolongaron la vida media en suero de la FSH para el análogo de FSH TR-4402 y la FHS natural recombinante. Se condujo un ensayo de ovulación in vivo en ratones B6D2F1 híbridos para comparar al TR-4402 modificado en N-terminal con la FSH natural recombinante. Los ratones tratados con TR-4402 modificada N-terminal produjeron más ovocitos que aquellos tratados con FSH natural recombinante o hCG (control) para dosis de 0.5 Ul, 1.0 Ul, 2.5 Ul, 5.0 Ul, y 10 Ul . Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 20. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente discutidas en esta solicitud se incorporan aquí como referencia. Aunque en la especificación anterior esta invención ha sido descrita en relación a ciertas modalidades preferidas de la misma, y han sido expuestos muchos detalles para propósitos de ilustración, será evidente que aquellos expertos en la técnica qué la invención es susceptible a modalidades adicionales y que ciertos detalles descritos aquí pueden variar considerablemente sin apartarse de los principios., básicos de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (137)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una hormona folículo estimulante (FSH) modificada que contiene una secuencia de aminoácidos, la cual difiere de la FSH natural, la FSH modificada está caracterizada porque comprende una subunidad a modificada, donde la potencia de la FSH modificada se incrementa en al menos aproximadamente diez veces en comparación con la FSH natural.
2. 2. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la potencia de la FSH modificada se incrementa en aproximadamente 30 veces en comparación con la FSH natural .
3. 3. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la potencia de la hormona glicoproteica modificada se incrementa en aproximadamente 50 veces en comparación con la FSH natural.
4. 4. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la FSH modificada es seleccionada del grupo que consiste de humana, bovina, equina, porcina, ovina, murina, primate, pez, etc.
5. 5. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la FSH modificada es humana.
6. 6. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la subunidad a modificada comprende al menos dos aminoácidos básicos en las posiciones correspondientes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81 de la SEQ ID No. 1.
7. 7. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la subunidad a están en las posiciones 14 y 66.
8. 8. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R y N66R.
9. 9. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la subunidad están en las posiciones 14 y 73.
10. 10. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 9 , caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R y G73R.
11. 11 . La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6 , caracteri zada porque los aminoácidos básicos de la subunidad a están en las posiciones 16 y 20 .
12. 12 . La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada porque los aminoácidos básicos son P16R y Q20R.
13. 13. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la subunidad están en las posiciones 20 y 21.
14. 14. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque los aminoácidos básicos son Q20R y P21R.
15. 15. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la subunidad a además comprende un tercer aminoácido básico en una posición seleccionada del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
16. 16. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la subunidad están en las posiciones 16, 20 y 21.
17. 17. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque los aminoácidos básicos son P16R, Q20R y P21R.
18. 18. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la subunidad a están en las posiciones 14, 20 y 73.
19. 19. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R, Q20R y G73R.
20. 20. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la súbunidad a están en las posiciones 66, 73 y 81.
21. 21. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque los aminoácidos básicos son N66K, G73K y A81K.
22. 22. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la subunidad están en las posiciones 14, 66 y 73.
23. 23. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R, N66R y G73R.
24. 24. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los aminoácidos básicos de la subunidad a están en las posiciones 14, 21 y 73.
25. 25. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R, P21R y G73R.
26. 26. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la subunidad a comprende además un cuarto aminoácido básico en una posición seleccionada del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
27. 27. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque los aminoácidos básicos la subunidad a están.en las posiciones 13, 14, 16 y 20.
28. 28. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque los aminoácidos básicos son Q13R, E14R, P16R y Q20R.
29. 29. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque los aminoácidos básicos son Q13K, E14K, P16K y Q20K.
30. 30 . La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la subunidad comprende además un quinto aminoácido básico una posición seleccionada del grupo consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
31. 31. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque los aminoácidos básicos la subunidad están en las posiciones 14, 20, 21, 66 y 73.
32. 32. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R, Q20R, P21R, N66R y G73R.
33. 33. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque los aminoácidos básicos la subunidad a están en las posiciones 14, 16, 20, 66 y 73.
34. 34. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R, P16R, Q20R, N66R y G73R.
35. 35. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la subunidad a comprende además un sexto aminoácido básico una posición seleccionada del grupo consiste de las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
36. 36. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque los aminoácidos básicos la subunidad a están en las posiciones 13, 14, 16, 20, 66 y 73.
37. 37. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque los aminoácidos básicos son Q13K, E14K, P16K, Q20K, N66K y G73 .
38. 38. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque los aminoácidos básicos la subunidad a están en las posiciones 14, 16, 20, 21, 66 y 73.
39. 39. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque los aminoácidos básicos son E14R, P16R, Q20R, P21R, N66R y G73R.
40. 40. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los aminoácidos básicos son seleccionados del grupo que consiste de lisina y arginina.
41. 41. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una subunidad ß modificada.
42. 42. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la subunidad ß modificada comprende al menos un aminoácido básico en una posición correspondiente a las posiciones 2, 4, 14, 63, 64, 67 y 69 de la SEQ ID No. 2.
43. 43. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el aminoácido básico es E4R.
44. 44. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para subunidad de la FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1.
45. 45. Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el vector es adecuado para expresar el ácido nucleico .
46. 46. Una célula anfitriona que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la célula anfitriona es adecuada para expresar el ácido nucleico.
47. 47. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la FSH modificada tiene menos de cinco sustituciones de aminoácido en la subunidad a en posiciones diferentes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
48. 48. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la FSH modificada tiene menos de cuatro sustituciones de aminoácido en la subunidad a en posiciones diferentes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
49. 49. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la FSH modificada tiene menos de tres sustituciones de aminoácido en la subunidad a en posiciones diferentes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66 , 68 , 73, 74 y 81.
50. 50. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la FSH modificada tiene menos de dos sustituciones de aminoácido en la subunidad a en posiciones diferentes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
51. 51. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la FSH modificada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos con la FSH natural correspondiente en la subunidad en posiciones diferentes a las posiciones 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 66, 68, 73, 74 y 81.
52. 52. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la vida media en plasma se incrementa en comparación con la FSH natural.
53. 53. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la FSH modificada comprende además al menos una secuencia con un sitio de glicosilación potencial seleccionado del . grupo que consiste de una secuencia que comprende un sitio de N- glicosilación y una secuencia que comprende un sitio de 0- glicosilación.
54. 54. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porgue 'al menos una secuencia con un sitio de reconocimiento de glicosilación potencial es una extensión N-terminal sobre la cadena .
55. 55. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque la extensión N-terminal es seleccionada del grupo que consiste de ANITV (SEQ ID NO. 3) y ANITVNITV (SEQ ID No . 4) .
56. 56. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque al menos una secuencia con un sitio de reconocimiento de glicosilación potencial es una sustitución en la cadena ß.
57. 57. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porgue la sustitución es seleccionada del grupo que consiste de Y58N y V78N.
58. 58. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la FSH modificada está pegilada.
59. 59. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porgue la FSH modificada es alterada para incrementar el número de residuos cargados negativamente dentro de la molécula para incrementar la vida media en plasma.
60. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque los residuos cargados negativamente son seleccionados del grupo que consiste de glutamato y aspartato .
61. 61. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porgue la alteración es seleccionada del grupo que consiste de las sustituciones de la subunidad alfa A85E y A85D.
62. 62. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la alteración es una inserción de una secuencia de aminoácidos que contiene uno o más residuos cargados negativamente en la FSH modificada .
63. 63. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque la inserción es seleccionada del grupo que consiste de GEFT (SEQ ID No. 5) y GEFTT (SEQ ID NO. 6) .
64. 64. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque la inserción está en la subunidad alfa.
65. 65. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque la inserción es acompañada por una supresión de uno o más aminoácidos .
66. 66. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque la inserción es seleccionada del grupo que consiste de APD-GEFT-VQDC (SEQ ID No. 7) y APD-GEFTT-QDC (SEQ ID No . 8).
67. 67. Un método para ayudar a la reproducción, en un a sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad auxiliar de La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1.
68. 68. Un método de diagnóstico y/o tratamiento de una condición asociada con la actividad de una hormona glicoproteica en un paciente, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1 al paciente.
69. 69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición es la disfunción ovulatoria.
70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición es un defecto de la fase lútea.
71. 71. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición es infertilidad inexplicable.
72. 72. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición es factor infertilidad masculino .
73. 73. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición es la concepción limitada por el tiempo.
74. 74. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el paciente demuestra baja expresión del receptor de FSH en folículos en crecimiento.
75. 75. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el paciente demuestra baja sensibilidad del receptor FSH.
76. 76. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el paciente demuestra deficiencia en la unión del receptor de FSH.
77. 77. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el paciente demuestra deficiencia en el acoplamiento del receptor de FSH.
78. 78. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el paciente demuestra calvicie masculina.
79. 79. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el paciente demuestra niveles deficientes de producción de testosterona.
80. 80. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el paciente demuestra falla o lesión de la pituitaria.
81. 81. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición es el carcinoma ovárico.
82. 82. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición es el carcinoma testicular.
83. 83. Un método para reducir el síndrome de hiperestimulación en una paciente sometida a terapia de reproducción auxiliada, caracterizado porque comprende: (a) administrar una cantidad auxiliar de una primera FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1 donde la vida media en plasma de la primera FSH modificada se incrementa en comparación con la FSH natural, y (b) posteriormente administrar una cantidad auxiliar de una segunda FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1 donde la vida media en plasma de la segunda FSH modificada está disminuida en comparación con la primera FSH modificada,, donde la hiperestimulación ovárica se reduce en comparación con cuando a la misma paciente se le administra únicamente la primera FSH modificada durante la terapia de reproducción auxiliada.
84. 84. Un método para mejorar la calidad de los ovocitos en un animal, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de una hormona folículo estimulante superactiva al animal, donde la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad a con un aminoácido básico en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, y 20.
85. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, donde la mejora en la calidad de los de ovocitos se caracteriza por una mejora en la tasa de fertilización de los ovocitos en el animal en comparación con un animal que reciba la misma cantidad de FSH natural recombinante.
86. 86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque la tasa de ovocitos fertilizados se incrementa al menos aproximadamente 10 % como resultado de la administración de la hormona folículo estimulante superactiva a la dosis efectiva máxima para el número de ovocitos.
87. 87. El método de conformidad con la reivindicación 84, donde la mejora en la calidad de los ovocitos caracterizado porque es una mejora en la tasa de formación de blastocitos por ovocito fertilizado en el animal en comparación con un animal similar que reciba la misma cantidad de FSH natural recombinante.
88. 88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la tasa de formación de blastocitos se incrementa al menos aproximadamente 10 % como resultado de la administración de la hormona folículo estimulante superactiva a la dosis efectiva máxima por el número de ovocitos .
89. 89. El método de conformidad con la reivindicación 84, donde la mejora en la calidad de los ovocitos está caracterizada porque es una mejora en el número total embriones por ovocito fertilizado del animai en comparación con un animal similar que reciba la misma cantidad de FSH natural recombinante.
90. 90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el número total de embriones por ovocito fertilizado se incrementa al menos aproximadamente 10% como resultado de la administración de la hormona folículo estimulante superactiva a la dosis máxima efectiva por el número de ovocitos .
91. 91. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porgue el aminoácido básico de la subunidad alfa es una arginina, una lisina, una histidina, o una modificación de los mismos .
92. 92. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porgue el aminoácido básico de la subunidad alfa está cargado positivamente aun pH neutro.
93. 93. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la FSH superactiva contiene una arginina en las posiciones 13, 14, 16, y 20.
94. 94. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una lisina en las posiciones 13, 14, 16, y 20.
95. 95. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la subunidad alfa contiene una modificación para prolongar la vida media.
96. 96. El método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque la modificación para prolongar la vida media es una extensión de ANITV.
97. 97. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva es una hormona folículo estimulante superactiva humana.
98. 98. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el animal es seleccionada del grupo que consiste de humanos, ratones, ratas, primates, conejos, cerdos, vacas, caballos, ovejas, y perros.
99. 99. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva es administrada por inyección o ingestión.
100. 100. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque comprende además administrar hCG.
101. 101. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad alfa natural.
102. 102. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad alfa con un aminoácido básico en la posición 4.
103. 103. Un método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el aminoácido básico es una arginina, una lisina, una histidina o una modificación de los mismos .
104. 104. Un método para inducir la superovulación en un animal caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de hormona folículo estimulante superactiva al animal, donde la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad alfa con un aminoácido básico en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las de posiciones 13, 14, 16, y 20.
105. 105. El método de conformidad con la reivindicación 104, donde la superovulación está caracterizada porque es un incremento en el número de ovocitos en comparación con un animal similar que reciba la misma cantidad de FSH natural recombinante .
106. 106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el número promedio de ovocitos se incrementa al menos aproximadamente 10% como resultado de la administración de la hormona folículo estimulante superactiva a la dosis efectiva máxima para el número de ovocitos.
107. 107. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el aminoácido básico de la subunidad a es una arginina, una lisina, una histidina, o a modificación de los mismos.
108. 108. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porgue el aminoácido básico de subunidad a está cargado positivamente a un pH neutro.
109. 109. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la FSH superactiva contiene una arginina en las posiciones 13, 14, 16, y 20.
110. 110. EL método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una lisina en las posiciones 13, 14, 16, y 20.
111. 111. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la subunidad alfa contiene una modificación para prolongar la vida media.
112. 112. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque la modificación para prolongar la vida media es una extensión de ANITV (SEQ ID No. 3) .
113. 113. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva es una hormona folículo estimulante superactiva humana .
114. 114. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el animal es seleccionado del grupo que consiste de un humano, ratón, rata, primate, conejo, cerdo, vaca, caballo, oveja, y perro.
115. 115. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva es administrada por inyección o ingestión.
116. 116. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porgue comprende además administrar hCG.
117. 117. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad alfa natural.
118. 118. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad alfa con un aminoácido básico en la posición 4.
119. 119. El método de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado porque el aminoácido básico es una arginina, una lisina, una histidina, o una modificación de los mismos.
120. 120. Un método para aumentar la fertilización in vi tro, caracterizado porgue comprende: administrar una cantidad efectiva de hormona folículo estimulante superactiva al animal, donde la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad alfa con un aminoácido básico en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 13, 14, 16, y 20.
121. 121. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el aminoácido básico de la subunidad alfa es una arginina, una lisina, una histidina, o una modificación de los mismos .
122. 122. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el aminoácido básico de la subunidad alfa está cargado positivamente a pH neutro.
123. 123. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la FSH superactiva contiene una arginina en las posiciones 13, 14, 16, y 20.
124. 124. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una lisina en las posiciones 13, 14, 16, y 20.
125. 125. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la subunidad alfa contiene una modificación para prolongar la vida media.
126. 126. El método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque la modificación para prolongar la vida media es una extensión de ANITV (SEQ ID No. 3) .
127. 127. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva es una hormona folículo estimulante superactiva humana .
128. 128. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el animal es seleccionado de un grupo que consiste de un humano, ratón, rata, primate, conejo, cerdo, vaca, caballo, oveja, y perro.
129. 129. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva es administrada por inyección o ingestión.
130. 130. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque comprende además administrar hCG.
131. 131. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactíva contiene una subunidad alfa natural .
132. 132. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque la hormona folículo estimulante superactiva contiene una subunidad alfa con un aminoácido básico en la posición 4.
133. 133. El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado porque el aminoácido básico es una arginina, una lisina, una histidina, o una modificación de los mismos .
134. 134. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la vida media plasma está disminuida en comparación con la FSH natural.
135. 135. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque existe una' disminución en la absorción en comparación con la FSH natural .
136. 136. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque existe un incremento en la absorción en comparación con la FSH natural.
137. 137. La FSH modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque existe un incremento en la afinidad de unión a un receptor de FSH en comparación con la FSH natural.