BRPI0706628A2

BRPI0706628A2 - variante de glicosilação de fsh d3n

Info

Publication number: BRPI0706628A2
Application number: BRPI0706628-7A
Authority: BR
Inventors: Marco Muda; Xuliang Jiang; Sean D Mckenna
Original assignee: Serono Lab
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2011-04-05
Also published as: US20080280832A1; US7956034B2; AU2007207697B2; WO2007084441A2; JP2009523445A; AU2007207697A1; EA013974B1; ATE487738T1; HRP20100610T1; IL192547A; CA2633844A1; CY1110953T1; SI1981908T1; DK1981908T3; CN101370825B; PL1981908T3; AU2007207697A2; WO2007084441A3; ZA200805194B; DE602007010425D1

Abstract

VARIANTE DE GLICOSILAçãO DE FSH D3N. A presente invenção refere-se a FSH mutante com glicosilação aumentada e meia-vida mais longa. Também é descrita a utilização desse mutante de FSH para a indução de foliculogenêse em pacientes humanas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTEDE GLICOSILAÇÃO DE FSH D3N".

Antecedentes da Invenção

1. Campo da invenção

A presente invenção refere-se à reprodução humana. Mais es-pecificamente, a presente invenção refere-se às terapias de fertilização.

2. Descrição da técnica relacionada

a. Gonadotrofinas

O hormônio folículo-estimulante (FSH) é um membro da famíliadas gonadotrofinas que tem uma participação fundamental na fertilidadehumana. As gonadotrofinas, que também incluem o hormônio Iuteinizante(LH) e a gonadotrofina coriônica (CG), são heterodímeros, cada uma consis-tindo em uma subunidade α comum (92 aminoácidos) e uma única subuni-dade β (111 aminoácidos no FSH). As seqüências de aminoácidos das for-mas maduras das subunidades α e β do FSH são mostradas no SEQ ID. N9:1 e SEQ ID. N9: 2, respectivamente.

O FSH humano foi isolado de hipófises e da urina pós-menopausa (EP 322.438), e foi produzido de forma recombinante em célulasde mamíferos (patentes U.S. 5.639.640, U.S. 5.156.957, U.S. 4.923.805,U.S. 4.840.896, U.S. 5.767.251, EP 211.894 e EP 521.586). Essas últimasreferências também descrevem o gene da subunidade β do FSH humano. Apatente U.S. 5.405.945 descreve um gene modificado da subunidade α hu-mana que compreende apenas um íntron.

Liu et ai, J. Biol. Chem. 1993,15; 268 (2): 21.613-7, Grossmannet al., MoL Endocrinol. 1996 10 (6): 769-79, Roth e Dias (Mol. Cell Endocri-nol. 1995 1; 109 (2): 143-9, Valove et al., Endocrinology 1994; 135 (6):2.657-61, Yoo et al., J. Biol. Chem. 1993 25; 268 (18): 13.034-42), patenteU.S. 5.508.261 e Chappel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1.835descrevem vários estudos do relacionamento estrutura-função, e identificamresíduos de aminoácidos envolvidos na ligação e ativação de receptor e nadimerização do FSH.

b. O uso de gonadotrofinas em técnicas de reprodução assistidaAs gonadotrofinas desempenham papéis fundamentais no cicloreprodutivo, e seu uso em terapias exógenas é essencial para técnicas dereprodução assistida (ART) como, por exemplo, a fertilização invitro (IVF),IVF em conjunto com injeção intracitoplasmática de esperma (IVF/ICSI), etransferência de embrião (ET), para indução da ovulação (OI) em pacientesanovulatórias submetidas à fertilização in vivo naturalmente ou através deinseminação intra-uterina (inseminação intra-uterina).

As patentes U.S. 4.589.402 e U.S. 4.845.077 descrevem FSHhumano purificado livre de LH e o uso deste para fertilização in vitro. EP 322438 descreve uma proteína com pelo menos 6.200 U/mg de atividade deFSH que é substancialmente livre de atividade de LH, e em que a subunida-de α e a subunidade β de FSH, respectivamente, podem ser do tipo selva-gem ou formas truncadas especificadas desta.

É necessária uma terapia prolongada para se obter um efeitoterapêutico, tipicamente por 8-10 dias consecutivos e, algumas vezes, até 21dias, para estimular a foliculogenêse em mulheres, e por até 18 meses emhomens hipogonadotrópicos para induzir espermatogênese. hFSH recombi-nante é administrado tipicamente como uma injeção diária intramuscular(i.m.) ou subcutânea (s.c.), com conseqüente desconforto e potencial parauma reação local no lugar da injeção. A diminuição da freqüência de admi-nistração iria facilitar a terapia e tornaria a administração de gonadotrofinamais conveniente, mais tolerável e mais favorável ao paciente,c. Glicosilação do FSH

As gonadotrofinas são glicoproteínas, com cada subunidadetendo cadeias laterais de oligossacarídeo ligadas na asparagina (ligadas aoN) que são importantes para a atividade e a função in vivo. A adição de car-boidrato (glicosilação) aos polipeptídeos é um evento pós-tradução que re-sulta na adição de cadeias de açúcar a aminoácidos asparagina (ligadas aoN) ou serina/treonina (ligadas ao O) específicos. Ao contrário da seqüênciade aminoácidos invariante da porção protéica das glicoproteínas, as estrutu-ras de carboidrato são variáveis, uma característica denominada microhete-rogeneidade. Por exemplo, sítios de N-glicosilação na mesma proteína po-dem conter estruturas de carboidrato diferentes. Além disso, até no mesmosítio de glicosilação em certa glicoproteína podem ser encontradas diferen-tes estruturas de carboidrato. Essa heterogeneidade é uma conseqüência dasíntese de carboidratos não dirigida por modelo.

A N-glicosilação de proteínas ocorre especificamente no padrãode consenso Asn-Xaa-Ser/Thr e, em menor grau, no padrão de consensoAsn-Xaa-Cys1 em que Xaa pode ser qualquer resíduo de aminoácido. Noentanto, a presença de um tripeptídeo de consenso não é suficiente paraassegurar que um resíduo de asparagina será glicosilado. Por exemplo, a N-glicosilação da seqüência Asn-Pro-Ser/Thr ocorre em uma taxa 50 vezesmenor do que outros padrões de consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr.

O FSH humano contém quatro sítios de glicosilação ligada ao N:dois na subunidade α comum nas posições 52 e 78, e dois na subunidade βnas posições 7 e 24. Os carboidratos anexados à subunidade α do FSH sãocruciais para montagem do dímero, integridade, secreção e transdução desinal, enquanto os carboidratos da subunidade β são importantes para mon-tagem do dímero, secreção e depuração do heterodímero da circulação.

Galway et al., Endocrinology 1990; 127 (1): 93-100 demonstramque variantes de FSH produzidos em uma linhagem de células CHO N-acetilglicosamina transferase-l ou uma em linhagem de células CHO comdefeito no transporte de ácido siálico são tão ativos quanto o FSH secretadopor células do tipo selvagem ou FSH hipofisário purificado in vitro, mas sematividade in vivo, presumivelmente por causa da depuração rápida das vari-antes glicosiladas inadequadamente no soro. D1Antonio et al., Human. Re-prod. 1999; 14 (5): 1.160-7 descrevem várias isoformas de FSH que circulamna corrente sangüínea. As isoformas possuem seqüências de aminoácidosidênticas, mas diferem na extensão das modificações pós-tradução. Verifi-cou-se que o grupo menos ácido da isoforma tinha uma depuração mais rá-pida in vivo em comparação com o grupo ácido da isoforma, possivelmentepor causa das diferenças no teor de ácido siálico entre as isoformas. Alémdisso, Bishop et al. Endocrinology 1995; 136 (6): 2.635-40 concluem que ameia-vida circulatória parece ser o determinante primário da atividade in vi-vo. Essas observações levaram à hipótese de que a meia-vida do FSH po-deria ser aumentada pela introdução de sítios de glicosilação adicionais paraaumentar o teor de ácido siálico do polipeptídeo.

d. Variantes de FSH

Agonistas de FSH com meias-vidas aumentadas foram desen-volvidos pela fusão do peptídeo do terminal carbóxi da hCG (CTP) ao FSHhumano nativo recombinante (rhFSH). A porção CTP consiste nos aminoáci-dos 112-118 a 145 com quatro sítios de O-glicosilação localizados nas posi-ções 121, 127, 132 e 138. As patentes U.S. 5.338.835 e U.S. 5.585.345 re-velam uma subunidade β de FSH modificada estendida na Glu do terminal Ccom a porção CTP da hCG. O análogo modificado resultante é definido co-mo tendo a atividade biológica do FSH nativo, mas a meia-vida circulanteprolongada. A patente U.S. 5.405.945 revela que a porção do terminal car-bóxi da subunidade β da hCG ou uma variante desta possui efeitos significa-tivos sobre a depuração de CG, FSH e LH.

A patente U.S. 5.883.073 descreve proteínas de cadeia simplescompostas por duas subunidades α com atividade agonista ou antagonistapara CG, TSH, LH e FSH. A patente U.S. 5.508.261 descreve polipeptídeosheterodiméricos que possuem afinidade de ligação para receptores de LH eFSH que compreendem um polipeptídeo da subunidade α de hormônio deglicoproteína e um polipeptídeo da subunidade β de ocorrência não natural,em que o polipeptídeo da subunidade β é uma cadeia de aminoácidos quecompreende quatro subseqüências unidas, cada uma delas selecionada deuma lista de seqüências específicas. Klein et ai (2003) descrevem um aná-logo de cadeia simples de FSH com uma meia-vida aumentada, em que assubunidades α e β estão ligadas por um oligopeptídeo que contém dois sí-tios de glicosilação ligada ao N.

WO 01/58493 descreve 77 mutações que podem ser feitas nasubunidade α de FSH e 51 mutações que podem ser feitas na subunidade βde FSH em uma tentativa de aumentar a meia-vida in vivo do FSH. Alémdisso, WO 01/58493 descreve que um ou mais sítios de glicosilação podemser adicionados ao terminal N do FSH para aumentar sua meia-vida ou serinseridos em vários sítios dentro do polipeptídeo do FSH. WO 01/58493,embora descreva que possam ser inseridos sítios de glicosilação no polipep-tídeo do FSH, não fornece diretrizes quanto ao(s) sítio(s) específico(s) ondese deve inserir um sítio de glicosilação e manter a atividade do FSH. WO01/58493 ainda descreve que as subunidades α e β mutantes podem serusadas individualmente (1 sítio de glicosilação adicional) ou em combinação(2 sítios de glicosilação adicionais). Os 128 mutantes candidatos foram iden-tificados com a utilização de 50 modelos da estrutura tridimensional do FSHque foram gerados com base exclusivamente na estrutura da hCG, e umalinhamento de seqüências do FSH e hCG mostrou somente 32% de identi-dade entre as subunidades β de hCG e FSH. WO 01/58493 não descreve aprodução ou testes de nenhuma subunidade α ou β do FSH nas quais foiintroduzido um sítio de glicosilação por mutagênese sítio-dirigida.

WO 05/020934 descreve GM1, com mutações tanto na subuni-dade α quanto na subunidade β do FSH, incluindo uma mutação dupla em βE55N/V57T, isto é, o resíduo E na posição de aminoácido 55 mutada para N,e o resíduo V na posição de aminoácido 57 mutada para Τ. A seqüência deaminoácidos de β E55N/V57T é mostrada no SEQ ID. N9: 3.

Clinicamente, há necessidade de um produto que forneça parteou todos os efeitos terapeuticamente relevantes do FSH, e que possa seradministrado em intervalos menos freqüentes, quando comparado com osprodutos de FSH disponíveis atualmente, e que, de preferência, forneça umnível mais estável de atividade de FSH circulante comparado com o nívelobtido pelo tratamento atual.

A presente invenção é dirigida a esses produtos, bem como aosmeios para a sua produção.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se às moléculas mutantes de FSH,em que a subunidade α de FSH compreende o SEQ ID. N9: 4 e em que asubunidade β do FSH compreende o SEQ ID. Ng: 3. O FSH pode ser N-glicosilado nos resíduos 0, 1,2, 3, 4, 5 ou 6 de asparagina do referido FSHmutante. Em uma modalidade, N3 da subunidade α mutante do SEQ ID. N9:4 pode ser glicosilado.

A presente invenção também refere-se às moléculas de DNAisolado que codificam um mutante da subunidade α de FSH que compreen-de a seqüência do SEQ ID. N9: 4. A presente invenção também refere-se aum DNA isolado que codifica uma subunidade β do FSH que compreende aseqüência do SEQ ID. N9: 3.

A presente invenção refere-se a um vetor que compreende umDNA que codifica um mutante da subunidade α de FSH que compreende aseqüência do SEQ ID. N9: 4. O vetor pode ser um vetor de expressão.

A presente invenção refere-se a um vetor que compreende umDNA que codifica um mutante da subunidade β do FSH que compreende aseqüência do SEQ ID. N9: 3. O vetor pode ser um vetor de expressão.

A presente invenção refere-se a um vetor que compreende umprimeiro DNA e um segundo DNA, em que o primeiro DNA codifica um mu-tante da subunidade α de FSH que compreende a seqüência do SEQ ID. N9:4 e em que o segundo DNA codifica um mutante da subunidade β do FSHque compreende a seqüência do SEQ ID. N9: 3. O vetor pode ser um vetorde expressão.

A presente invenção refere-se a uma célula que compreende umvetor que possui um DNA que codifica um mutante da subunidade α de FSHque tem a seqüência do SEQ ID. N9: 4. O vetor pode ser um vetor de ex-pressão. A célula pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célu-la CHO.

A presente invenção refere-se a uma célula que compreende umvetor que possui um DNA que codifica um mutante da subunidade β do FSHque tem a seqüência do SEQ ID. N9: 3. O vetor pode ser um vetor de ex-pressão. A célula pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célu-la CHO.

A presente invenção refere-se a uma célula que compreende umvetor que possui um primeiro DNA e um segundo DNA, em que o primeiroDNA codifica um mutante da subunidade α de FSH que compreende a se-qüência do SEQ ID. N9: 4 e em que o segundo DNA codifica um mutante dasubunidade β do FSH que compreende a seqüência do SEQ ID. N-: 3. Ovetor pode ser um vetor de expressão. A célula pode ser uma célula de ma-mífero, por exemplo, uma célula CHO.

A presente invenção refere-se a uma célula que compreende umprimeiro e um segundo vetor, em que o primeiro vetor compreende um DNAque codifica um mutante da subunidade α de FSH que consiste no SEQ ID.NQ: 4 e o segundo vetor compreende um DNA que codifica um mutante dasubunidade β do FSH que compreende a seqüência do SEQ ID. N5: 3. Ovetor pode ser um vetor de expressão. A célula pode ser uma célula de ma-mífero, por exemplo, uma célula CHO.

A presente invenção também refere-se a um método para a pro-dução de um mutante de FSH que compreende o cultivo de células de ma-míferos capazes de glicosilar proteínas, em que as referidas células com-preendem um primeiro vetor de expressão que compreende um DNA quecodifica um mutante da subunidade α de FSH que compreende a seqüênciado SEQ ID. N5: 4 e um segundo vetor de expressão que compreende umDNA que codifica um mutante da subunidade β do FSH que compreende aseqüência do SEQ ID. N9: 3. Em outra modalidade da presente invenção, asreferidas células compreendem um vetor único que compreende um DNAque codifica um mutante da subunidade α de FSH que compreende a se-qüência do SEQ ID. N2: 4, e que ainda compreende um DNA que codificaum mutante da subunidade β do FSH que compreende a seqüência do SEQID. N9: 3.

A presente invenção refere-se a uma composição que compre-ende um mutante de FSH e um veículo ou excipiente farmaceuticamenteaceitável, em que a subunidade α do FSH compreende a seqüência do SEQID. NQ: 4 e em que a subunidade β do FSH compreende o SEQ ID. N9: 3.

A presente invenção refere-se a um método de tratamento deum mamífero infértil, que compreende a administração a um mamífero quedela necessite de uma quantidade eficaz de um FSH mutante, em que a su-bunidade α do FSH compreende a seqüência do SEQ ID. Ns: 4 e em que asubunidade β do FSH compreende o SEQ ID. Ne: 3.A presente invenção refere-se a um método de estimulação dafoliculogenêse em um mamífero, que compreende a administração a ummamífero que dela necessita de uma quantidade eficaz de um mutante deFSH, em que a subunidade α do FSH compreende a seqüência do SEQ ID.NQ: 4 e em que a subunidade β do FSH compreende o SEQ ID. N9: 3.

A presente invenção refere-se a um método de indução de hipe-restimulação ovariana em um mamífero, que compreende a administração aum mamífero que dela necessita de uma quantidade eficaz de um mutantede FSH, em que a subunidade α do FSH compreende a seqüência do SEQID. N-: 4 e em que a subunidade β do FSH compreende o SEQ ID. N-: 3.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra um alinhamento dos mutantes da subunidade αD3N (SEQ ID. N9: 4) para a subunidade α humana do FSH (SEQ ID. N9: 1).

Os números dos resíduos se referem à subunidade α humana do FSH (SEQID. N9: 1), com 1 sendo o primeiro aminoácido do polipeptídeo maduro.

A figura 2 mostra uma curva de dose-resposta para o mutantede FSH, que compreende uma subunidade α mutante D3N e uma subunida-de β GM-1 que compreende o SEQ ID. N9: 3, comparada com uma curva dedose-resposta do FSH do tipo selvagem. A curva de dose-resposta indica aatividade de FSH em várias diluições do FSH mutante e do tipo selvagem. Oclone 15C refere-se ao mutante D3N. O Clone 14C é um mutante de FSHnão relacionado.

Descrição Detalhada da Invenção

Embora tenha sido demonstrado que o aumento do teor carboi-drato do FSH possa aumentar a meia-vida in vivo, o aumento da meia-vidado FSH é mais complicado do que simplesmente o processo de adição desítios de glicosilação adicionais. Embora seja necessária uma seqüência deglicosilação de consenso para a adição de carboidrato, ela não é suficientepara assegurar que um sítio de adição de carboidrato será utilizado. Outrosfatores como, por exemplo, a dobragem local e a conformação da proteínadurante a biossíntese, determinam se um oligossacarídeo está anexado nosítio de certa seqüência de consenso. Além disso, a fim de que a glicosila-ção adicional leve a um aumento da meia-vida in vivo, a seqüência de con-senso deve estar em uma posição tal que a glicosilação do sítio não interfiracom a ligação ao receptor, ou comprometa a dobragem, conformação ouestabilidade da glicoproteína. Até esse ponto, os análogos de FSH com mei-as-vidas aumentadas limitavam-se basicamente às proteínas de fusão nasquais a porção fundida do polipeptídeo incluía sítios de glicosilação adicio-nais.

1. FSH mutante

É fornecido um mutante de FSH que foi modificado para criarsítios de reconhecimento de glicosilação adicionais. A subunidade α do mu-tante de FSH pode ter uma das seguintes mutações, comparada com a su-bunidade α do tipo selvagem: D3N e Q5T. Um FSH mutante pode compre-ender a subunidade α mutante acima em combinação com uma subunidadeβ mutante, por exemplo, β GM1, contendo a seguinte mutação: E55N/V57T.

Um ou mais dos sítios de glicosilação adicionais do FSH recombinante po-dem ser glicosilados. Aqueles um ou mais sítios de glicosilação adicionais doFSH mutante podem ser glicosilados in vitro ou in vivo.

O mutante de FSH pode ser produzido por qualquer método a-dequado conhecido na técnica. Esses métodos incluem a construção de se-qüências de nucleotídeos que codificam os respectivos mutantes de FSH eque expressam a seqüência de aminoácidos em um hospedeiro transfectadoadequado. O mutante de FSH também pode ser produzido por síntese quí-mica ou por uma combinação de síntese química e tecnologia de DNA re-combinante.

O mutante de FSH pode compreender as subunidades α e β doFSH na forma de duas cadeias polipeptídicas separadas, em que as duascadeias dimerizam in vivo de modo a formar um polipeptídeo dimérico, ouele pode compreender uma construção de cadeia simples que compreendeas duas subunidades ligadas de forma covalente por uma ligação peptídicaou por um Iigante peptídico. Os resíduos de aminoácidos do peptídeo Iigantepodem exibir propriedades que não interferem significativamente com a ati-vidade do mutante do FSH.O mutante de FSH pode ter uma meia-vida aumentada compa-rado com o FSH do tipo selvagem. O mutante de FSH também pode ter es-tabilidade aumentada comparado com o FSH do tipo selvagem. O mutantede FSH pode compreender oligossacarídeos em 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sí-tios de glicosilação ligada ao N. Também é fornecida uma população de mu-tantes de FSH que pode compreender uma ou mais isoformas mutantes deFSH, em que cada isoforma compreende oligossacarídeos em 0, 1, 2, 3, 4, 5ou 6 dos sítios de glicosilação ligada ao N.

A seqüência de nucleotídeos que codifica as subunidades α ou βdo mutante de FSH pode ser construída por isolamento ou síntese de umaseqüência de nucleotídeos que codifica a subunidade de FSH original como,por exemplo, o hFSH-alfa ou hFSH-beta, com as seqüências de aminoáci-dos mostradas nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2, respectivamente. A seqüênciade nucleotídeos pode então ser alterada de modo a efetuar a substituição ouinserção dos resíduos de aminoácidos relevantes. A seqüência de nucleotí-deos pode ser modificada por mutagênese sítio-dirigida. Como alternativa, aseqüência de nucleotídeos pode ser preparada por síntese química, em quesão projetados oligonucleotídeos com base na seqüência de aminoácidosespecífica do mutante do FSH.

A seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo podeser inserida em um vetor recombinante e ligada operacionalmente a umaseqüência de controle necessária à expressão do polipeptídeo na célulahospedeira transfectada desejada. As seqüências de controle podem serqualquer componente que seja necessário ou vantajoso para a expressão deum polipeptídeo. Exemplos de seqüências de controle adequadas para dirigira transcrição em células de mamíferos incluem os promotores iniciais e tar-dios de SV40 e adenovírus, por exemplo, o promotor tardio principal de ade-novírus 2, o MT-1 promotor de (gene de metalotioneína) e o promotor imedi-ato-inicial do gene do citomegalovírus humano (CMV).

Aqueles versados na técnica podem fazer uma seleção dentreesses vetores, seqüências de controle de expressão e hospedeiros, semexperimentação desnecessária. O vetor recombinante pode ser um vetorque se replica de forma autônoma, isto é, um vetor que existe como umaentidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicaçãocromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor podeser de um tipo que, quando introduzido em uma célula hospedeira, seja inte-grado no genoma da célula hospedeira e se replique junto com o cromosso-mo(s) no qual foi integrado.

O vetor pode ser um vetor de expressão no qual a seqüência denucleotídeos que codifica o polipeptídeo da invenção esteja operacionalmen-te ligada a segmentos adicionais necessários à transcrição da seqüência denucleotídeos. O vetor pode ser derivado de plasmídeo ou de DNA viral. Di-versos vetores de expressão adequados à expressão nas células hospedei-ras aqui mencionadas são disponíveis comercialmente ou são descritos naliteratura.

O vetor recombinante pode ainda compreender uma seqüênciade DNA que permite que o vetor se replique na célula hospedeira em ques-tão. Um exemplo de uma seqüência desse tipo (quando a célula hospedeiraé uma célula de mamífero) é a origem de replicação de SV40. O vetor tam-bém pode compreender um marcador selecionável, por exemplo, um genecujo produto complemente um defeito na célula hospedeira como, por exem-pio, o gene que codifica diidrofolato redutase (DHFR) ou um que confira re-sistência a um fármaco, por exemplo, ampicilina, canamicina, tetraciclina,cloranfenicol, neomicina, higromicina ou metotrexato.

O vetor também pode compreender um gene amplificável como,por exemplo, DHFR, de tal forma que as células que possuam múltiplas có-pias do gene amplificável e seqüências flanqueadoras, incluindo o mutantedo DNA de FSH, possam ser selecionadas em meios adequados.

Também é fornecido um DNA que codifica uma subunidade α domutante de FSH, A seqüência de nucleotídeos que codifica as subunidadesalfa e beta do mutante de FSH, seja ela preparada por mutagênese sítio-dirigida, síntese, PCR ou por outros métodos, também pode opcionalmenteincluir uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo sinalizador.

O peptídeo sinalizador pode estar presente quando o polipeptídeo tiver queser secretado pelas células nas quais é expresso. Esse peptídeo sinalizador,se presente, pode ser um peptídeo reconhecido pela célula escolhida paraexpressão do polipeptídeo. O peptídeo sinalizador pode ser homólogo (porexemplo, que está normalmente associado a uma subunidade de hFSH) ouheterólogo (isto é, que se origina de outra fonte que não o hFSH) ao polipep-tídeo, ou pode ser homólogo ou heterólogo em relação à célula hospedeira,isto é, ser um peptídeo sinalizador expresso normalmente pela célula hos-pedeira ou um que não seja normalmente expresso pela célula hospedeira.

Qualquer hospedeiro adequado pode ser usado para a produçãodos polipeptídeos, incluindo bactérias, fungos (incluindo leveduras), plantas,insetos, mamíferos, ou outras células animais ou linhagens de células ade-quadas, bem como animais ou plantas transgênicos. Exemplos de célulashospedeiras mamíferas adequadas incluem linhagens de células de ováriode hamster chinês (CHO) (por exemplo, CHO-KL; ATCC CCL-61), linhagensde células de macaco verde africano (COS) (por exemplo, COS 1 (ATCCCRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de camundongo (por exem-plo, NSIO), linhagens de células de rim de filhote de hamster (BI-EK) (porexemplo, ATCC CRL-1632 ou ATCC CCL-10) e células humanas (por e-xemplo, BEK 293 (ATCC CRL-1573)), além de células de plantas em culturade tecido. Linhagens celulares adequadas adicionais são conhecidas na téc-nica e disponíveis em depósitos públicos como, por exemplo, a "AmericanType Culture Collection", EUA. Os métodos para a introdução de DNA exó-geno em células hospedeiras mamíferas incluem transfecção mediada porfosfato de cálcio, eletroporação, transfecção mediada por DEAE-dextrana,transfecção mediada Iipossomo e vetores virais.

As células podem ser cultivadas em um meio nutriente adequa-do à produção do polipeptídeo com a utilização de métodos conhecidos natécnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agita-do, fermentação em pequena ou larga escala (incluindo fermentações contí-nuas, em batelada, em batelada alimentada ou em estado sólido) em fer^mentadores laboratoriais ou industriais, realizado em um meio adequado esob condições que permitam que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado.O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes decarbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, com o uso de procedimentos co-nhecidos na técnica. Meios adequados são disponíveis por vários fornecedo-res comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições pu-blicadas (por exemplo, em catálogos da "American Type Culture Collection").

Caso o polipeptídeo seja secretado no meio nutriente, ele poderá ser recu-perado diretamente do meio. Caso o polipeptídeo não seja secretado, elepoderá ser recuperado de Iisados celulares. Um método de produção de altorendimento dos mutantes de FSH da invenção é através da utilização deamplificação com diidrofolato redutase (DHFR) em células CHO deficientesem DHFR, pelo uso de níveis sucessivamente crescentes de metotrexato,como descrito na Patente U.S. N2 4.889.803.

O polipeptídeo do mutante de FSH resultante pode ser recupe-rado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, ele pode ser recupe-rado do meio nutriente por procedimentos convencionais que incluem, semlimitação, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, eva-poração ou precipitação. Os polipeptídeos do mutante de FSH podem serpurificados por diversos procedimentos conhecidos na técnica incluindo, semlimitação, cromatografia (por exemplo, por troca iônica, por afinidade, hidro-fóbica, "cromatofocusing" e por exclusão de tamanho), procedimentos deeletroforese (por exemplo, concentração preparatória isoelétrica), solubilida-de diferencial (por exemplo, precipitação por sulfato de amônio), SDS-PAGEou extração.

Também é fornecida uma composição farmacêutica que com-preende o mutante de FSH. Essa composição farmacêutica pode ser usadapara estimular a foliculogenêse, por exemplo, em conjunto com a indução daovulação ou com técnicas de reprodução assistida (ART). Como o mutantede FSH da presente invenção pode ser eficaz na indução do desenvolvimen-to e na maturação de múltiplos folículos, ele pode ser particularmente ade-quado para uso com técnicas de reprodução assistida, em que se desejadacoletar vários oócitos.

O mutante de FSH pode ser usado para induzir monofoliculoge-nêse para a indução da ovulação, ou paucifoliculogenêse (até cerca de trêsfolículos) para inseminação intra-uterina, para fertilização in vivo. A monofo-liculogenêse também pode ser obtida com uma dose reduzida do mutante deFSH, ou com dosagens menos freqüentes, comparadas com preparaçõesconvencionais de FSH. Por exemplo, na indução da ovulação, uma prepara-ção de FSH da invenção pode ser administrada a 225-400 Ul a cada trêsdias, ou em doses menores, dependendo da resposta do paciente. A respos-ta do paciente pode ser acompanhada por ultra-sonografia.

O mutante de FSH da invenção pode ser usado em um regimede hiperestimulação ovariana controlada (COH). Regimes padronizados parahiperestimulação ovariana controlada incluem uma fase de infra-regulaçãona qual o hormônio Iuteinizante endógeno (LH) é infra-regulado pela admi-nistração de um agonista do hormônio de liberação de gonadotrofina (Gn-RH), seguida por uma fase estimulatória na qual o desenvolvimento folicular(foliculogenêse) é induzido por administração diária de hormônio folículo-estimulante (FSH), normalmente em cerca de 150-225 Ul/dia. Alternativa-mente, a estimulação pode ser iniciada com FSH após menstruação espon-tânea ou induzida, seguida por administração de um antagonista de GnRH(tipicamente começando em torno do sexto dia da fase estimulatória). Quan-do houver pelo menos 3 folículos > 16 mm (um de 18 mm), poderá ser ad-ministrado um bolo único de hCG (5-10.000 Ul) para mimetizar a onda natu-ral de LH e induzir a ovulação. A recuperação do oócito pode ser marcadapara 36-38 horas após a injeção de hCG.

O mutante de FSH também pode ser usado para indução da o-vulação e inseminação intra-uterina. Por exemplo, a estimulação de FSH porser iniciada após menstruação espontânea ou induzida, em uma dose diáriade 75-150 Ul. Quando 1 ou 3 folículos tiverem alcançado um diâmetro depelo menos 16 mm, poderá ser administrado um bolo único de hCG parainduzir a ovulação. A inseminação pode ser realizada in vivo, por relaçãosexual regular ou por inseminação intra-uteriná.

Como o mutante de FSH pode ter uma meia-vida aumentadacom relação às preparações de FSH do tipo selvagem, os regimes como,por exemplo, aqueles descritos acima, podem empregar doses de Ul meno-res de FSH e/ou podem ser modificados por diminuição do período de esti-mulação de FSH, obtendo-se a mesma resposta ou uma resposta melhor,em termos de números e viabilidade dos folículos. Por exemplo, a foliculo-genêse adequada pode ser obtida com doses diárias de, ou em torno de, 50-150, 50-100 ou 50-75 Ul de FSH. A posologia do FSH pode ser diária ousemidiária. A duração da dosagem pode ser menor ou em torno de 14, 12,11 ou 10 dias. Para indução da ovulação, a preparação de mutante de FSHpode ser administrada em doses de 25-150 ou 50-125 Ul FSH/dia. Para otratamento de irifertiIidade masculina, uma preparação de mutante de FSHpode ser administrada em 3 X 150 a 300 Ul/semana até que a espermato-gênese alcance níveis adequados à inseminação, tanto através da relaçãosexual regular quanto por técnicas de reprodução assistida.

Em função da meia-vida mais longa do FSH mutante, ele podeser administrado como uma preparação de longa ação, que pode ser admi-nistrada menos freqüentemente do que a cada dois dias. O FSH convencio-nal pode ser administrado em torno de 300 Ul em dias alternados, obtendo-se resultados similares à administração todos os dias ou de cerca de 150 Ul.

O FSH mutante pode ser administrado a cada 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, obtendo-se resultados similares ou melhores do que a administração diária de FSHconvencional.

O mutante de FSH pode ser usado para a fabricação de um me-dicamento para o tratamento de doenças, distúrbios ou condições. Em outroaspecto, o polipeptídeo ou a composição farmacêutica de acordo com a in-venção é usado em um método de tratamento de um mamífero, em particu-lar um ser humano, que compreende a administração ao mamífero que delenecessita desse polipeptídeo ou dessa composição farmacêutica.

Ficará evidente para aqueles versados na técnica que umaquantidade eficaz de um polipeptídeo, preparação ou composição depende,entre outros, da doença, da dose, da posologia de administração, se o poli-peptídeo ou a preparação ou composição é administrada isoladamente ouem conjunto com outros agentes terapêuticos, da meia-vida sérica das com-posições e da saúde geral do paciente. Tipicamente, uma dose eficaz dapreparação ou composição é suficiente para assegurar um efeito terapêutico.

O mutante de FSH pode ser administrado em uma composiçãoque inclui um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis."Farmaceuticamente aceitável" significa um veículo ou excipiente que nãoproduz efeitos adversos nos pacientes nos quais é administrado. Esses veí-culos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos natécnica, e os polipeptídeo podem ser formulados em composições farmacêu-ticas por métodos bem conhecidos (veja, por exemplo, "Remington1S Phar-maceutical Sciences", 18ã edição, A. R. Gennaro, Ed., Mack PüblishingCompany (1990);"Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins", S. Frokjaer e L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); e "Hand-bookof Pharmaceutical Excipients", 3â edição, A. Kibbe, Ed., PharmaceuticalPress (2000). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser u-sados em composições que compreendem o polipeptídeo incluem, por e-xemplo, agentes de tamponamento, agentes estabilizantes, conservativos,agentes de isotonicidade, tensoativos aniônicos ou detergentes "agentesumidificantes", antioxidantes, agentes de volume ou preenchimento, agentesquelantes e co-solventes.

A composição farmacêutica que compreende o mutante de FSHpode ser formulada de diversas formas, incluindo líquidos, por exemplo, so-luções ou suspensões prontas para o uso, géis, liofilizadas, ou qualquer ou-tra forma adequada, por exemplo, pós ou cristais adequados à preparaçãode uma solução. A forma da composição pode depender da indicação espe-cífica tratada e ficará evidente para aqueles habilitados na técnica.

A composição farmacêutica que compreende o mutante de FSHpode ser administrada por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,intradérmica, subcutânea, sublingual, bucal, intranasal, transdérmica, porinalação, ou por qualquer outra forma aceitável, por exemplo, com a utiliza-ção da tecnologia PowderJect ou ProLease ou um sistema de injeção comcaneta. O modo de administração pode depender da indicação específicatratada e ficará evidente para aqueles versados na técnica. A composiçãopode ser administrada por via subcutânea, o que pode permitir que o pacien-te faça a auto-administração.

As composições farmacêuticas podem ser administradas emconjunto com outros agentes terapêuticos. Esses agentes podem ser incor-porados como parte da mesma composição farmacêutica, ou podem seradministrados separadamente dos polipeptídeos, tanto concomitantementequanto de acordo com qualquer outro esquema de tratamento aceitável. A-lém disso, o polipeptídeo, a preparação ou a composição farmacêutica podeser usada como um auxiliar para outras terapias.

A presente invenção possui vários aspectos, ilustrados pelosexemplos não Iimitantes que serão apresentados a seguir.

Exemplo 1

Mutantes de FSH

A estrutura cristal tridimensional do FSH humano foi usada paraidentificar sítios de glicosilação candidatos na subunidade α de FSH ou regi-ões na molécula de FSH onde um sítio de glicosilação candidato pode serinserido. Duas moléculas de FSH (quarto subunidades) estão presentes emcada unidade assimétrica da estrutura cristal. As duas moléculas de FSHforam superpostas e comparadas, com cada resíduo sendo inspecionadovisualmente para identificar sítios de N-glicosilação potenciais. A estruturacristalográfica do FSH foi combinada com o conhecimento da interação F-SH/receptor FSHR para auxiliar ainda mais na seleção de sítios de N-glicosilação potenciais. Os critérios principais do projeto foram ruptura míni-ma da estrutura tridimensional, ruptura mínima dos sítios previstos de liga-ção e ativação, e estrutura tridimensional previsível compatível com a glicosi-lação. Com base nos critérios acima, foi identificado o seguinte mutante paraa seqüência de aminoácidos da subunidade α de FSH:

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Exemplo 2

Análise morfolóqica dos mutantes de FSHAlíquotas de sobrenadantes concentrados de cultura da expres-são transitória dò mutante da subunidade α de FSH foram analisadas porSDS-PAGE sob condições não redutoras que permitem a resolução de hete-rodímeros de FSH intactos de subunidades α e β livres. Comparando-se ospesos moleculares aparentes de cada heterodímero mutante com os do FSHdo tipo selvagem, pode-se determinar se o mutante de FSH está hiperglico-silado em relação ao FSH do tipo selvagem. Resumidamente, após eletrofo-rese, as proteínas foram transferidas eletroforeticamente para PVDF e visua-lizadas com o uso do anticorpo Serono 9-14 dirigido contra a subunidade αdo FSH. Como controle, também foram analisados o FSH humano do tiposelvagem, GM1 mutante, FSH-CTP e Gonal F. A Tabela 1 mostra o pesomolecular aparente do heterodímero formado pelo mutante da subunidade αe pela subunidade β do tipo selvagem, calculado com base nos padrões depeso molecular.

Tabela 1

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 1, o mutante de FSH expresso, ouseja, mutação D3, mostrou glicosilação aumentada, como evidenciado poruma mudança da distribuição do peso molecular aparente do heterodímerocomparado com o FSH do tipo selvagem humano.

Exemplo 3

Função in vitro dos mutantes de FSH

A fim de determinar a atividade dos mutantes de FSH, o mutantefoi testado quanto à habilidade para estimular a produção de cAMP em umalinhagem de células CHO que expressa de forma recombinante o receptorde FSH humano. As células CHO-FSHR foram mantidas em meio de cres-cimento FSHR [MEM a(-) (Gibco, nQ de catálogo 12561-056) + FBS dialisado10% (Gibco, nQ de catálogo 26300-020) + 600 pg/ml de Geneticina (Gibco, nQde catálogo 10131-035) + 0,02 μΜ de MTX]. As células CHO-FSHR foramsemeadas a 2 χ 104 células/cavidade em 100 μΙ/cavidade (2x10® células/10ml = 1 placa), e incubadas a 37°C por 24 horas, antes do ensaio. As célulaseram usadas no ensaio se fossem pelo menos 70% confluentes.

Foi feita uma diluição serial 1:3 de 12 pontos, começando a 67,5nM para todas as amostras e para o padrão interno (Gonal F foi usado comoum padrão interno). Todas as diluições foram feitas em meio de ensaio[DMEM/F12 (sem fenol, Gibco, nQ de catálogo N5 11039-021) + 1 mg/ml deBSA (Sigma, A-6003) + 0,1 mM de IBMX (inibidor de 3-isobutil-1-metilxantona fosfodiesterase, Sigma, nõ de catálogo 1-7018)]. O meio decrescimento foi removido da placa de ensaio, 25 μΙ de meio de ensaio (for-necido com o kit MA6000 cAMP MSD - Meso Scale Discovery, Gaithersburg,MD) foram adicionados, as placas recuperadas e incubadas a 37°C por 15minutos. Os cavidades receberam então doses de 25 μΙ/cavidade da amos-tra de teste, foram misturados, as placas recuperadas e incubadas por 1 ho-ra a 37°C. Após a incubação de 1 hora, a amostra e o meio foram removidosdas cavidades. Foram então adicionados a cada cavidade 25 μΙ de tampãode Iise padrão (fornecido com o kit MA 6000 Meso Scale Discovery), as pla-cas foram cobertas com seladora de placas (Packard, n9 de catálogo6005185) e agitadas por 5 minutos. Após a incubação de Iise de 5 minutos,μΙ de material de Iisado de células foram transferidos para a placa cAMPMeso Scale Discovery (fornecida com o kit MA6000 MSD) e incubados commistura suave em temperatura ambiente por 30 minutos. A seguir, foram a-crescentados 25 μΙ de conjugado cAMP-AP a cada cavidade, e misturados.

Foram então adicionados 25 μΙ de anticorpo anti-cAMP a cada cavidade, asplacas foram cobertas com seladora de placas e agitadas por 30 minutos emtemperatura ambiente. As placas foram então lavadas seis vezes com 350μΙ/cavidade de tampão de lavagem de uma leitora automatizada de placas.Cem μΙ de intensificador de substrato Sapphire Il RTU (pronto para uso) fo-ram então acrescentados a cada cavidade, as placas foram cobertas comseladora de placas e incubadas por 30 minutos no escuro a 25°C. As placasforam então lidas a um segundo por cavidade com níveis baixos de cAMPdemonstrando um sinal elevado, e níveis elevados de cAMP demonstrandoum sinal baixo. A curva de dose-resposta do mutante de FSH é mostrada nafigura 2. Os valores da EC5O foram calculados e são mostrados na tabela 2.

Como mostrado na Figura 2 e na Tabela 2, o mutante de FSHpossui uma atividade in vitro comparável àquela do FSH do tipo selvagem.

Tabela 2

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Exemplo 4

Meia-vida in vivo de mutantes de FSH

Dois lotes diferentes do mutante D3N foram analisados em estu-dos separados de farmacocinética (PK). Os dois estudos possuíram o mes-mo design: 33 fêmeas imaturas de ratos SD com 21 dias de idade (pesocorporal de aproximadamente 40 g; Charles River Laboratories, Wilmington,MA) foram divididas randomicamente em 5 grupos de tratamento (n = 6) e 1grupo de base (n = 3). A escolha de fêmeas imaturas de ratos foi baseadano uso dessa idade e sexo para avaliações biológicas in vivo da atividade deFSH. Os animais nos grupos de tratamento receberam injeções subcutâneas(s.c.) de 4 μg de GM1 (controle), mutante D3N ou 8 μg de Gonal-F rhFSH(controle). O sangue foi coletado do seio retroorbital em 0 hora do grupo debase e em 1, 2, 4, 6, 10, 24, 48 e 72 horas de animais nos grupos de trata-mento (n = 3/ponto no tempo; os ratos foram alternados de modo a não te-rem o sangue coletado em 2 pontos subseqüentes de coleta de amostra).Aproximadamente 0,1 ml de sangue foi coletado de cada rato em cada cole-ta, e o plasma foi colhido e estocado a -80QC até ser analisado por ELISA. Oensaio usado para medir as proteínas de FSH no soro em ambos os estudosfoi o "DSL FSH Coated Well ELISA" (Diagnostics Systems Laboratories,Webster, TX). As amostras de soro foram analisadas em triplicata.

A meia-vida do mutante D3N foi significativamente mais longa doque a do FSH do tipo selvagem.Exemplo 5

Atividade biológica in vivo

O modelo in vivo usado para avaliar a atividade biológica do mu-tante D3N é o ensaio de ganho de peso ovariano de ratos. O tratamento defêmeas imaturas de ratos de 21 dias de idade com FSH ou com moléculascom atividade FSH-//7ce, por exemplo, mutante D3N, desencadeia o cresci-mento de folículos ovarianos e a produção de oócitos. Esse crescimento éfacilmente detectado pela medida do peso ovariano ao final do período detratamento. No modelo, a substância a ser testada é administrada por inje-ção por três dias, e os ovários são coletados e pesados após a última dose.

O ensaio foi usado por várias décadas como a base para atribuir a potênciade FSH a produtos clínicos para fins de rotulagem. Ele mede a ação fisioló-gica relevante do FSH1 e possui uma correlação nítida com o desempenhode produtos na clínica.

A atividade in vivo do mutante D3N foi comparada com a do FSHdo tipo selvagem. Todas as doses foram definidas com base na equivalênciaprevista do FSH, levando-se em conta a potência in vitro e a meia-vida emratos. Verificou-se que o mutante D3N possui atividade de FSH potente comuma magnitude similar àquela do FSH do tipo selvagem.Listagem de Seqüência

<110> Applied Research Systems ars Holding N.v.

<120> "VARIANTE DE GLICOSILAÇÃO DE FSH D3N"

<130> 1128 WO

<160> 4

<170> Patentm version 3.3

<210> 1

<211> 92

<212> PRT

<213> Homs sapiens

<400> 1

Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro15 10 15

Phe Phe ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30

Phe ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45

vai Gln Lys Asn Val Thr ser Glu ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60

Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80

Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asn ser cys Glu teu Thr Asn xle Thr xle Ala ile Glu Lys Glu Glu15 10 IS

Cys Arg Phe cys lie Ser Ile Asn Thr Thr Trp cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg pro Lys Ile Gln35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu vai Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp ser Asp ser Ttiri Asp cys Thr Val85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110

<210> 3<211> 111<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223» Mutante da subunidade beta E55N/V57T<400> 3

Asn Ser cys Glu Leu Thr Asn xle Thr Ile Ala Xle Glu Lys Glu Glu1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile ser Ile Asn Thr Thr Trp cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45

Lys Thr cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr vai Arg vai Pro50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 t 80

Glrt Cys His Cys Gly Lys Cys Asp ser Asp ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 UO

<2l0> 4<211> 92<212> PRT<213> Artificial

<223> Mutante de glicosilação DN3<400> 4

Ala Pro Asn vai Thr Asp cys pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15

Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly cys Cys20 25 30

Phe Ser Arg Ala Tyr pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45vai Gln Lys Asn vai Thr Ser Glu ser Thr Cys cys VaT Ala Lys ser

50 55 60

Tyr Asn Arg Val Thr vai Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr6S 70 75 80

Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys ser85 90

Claims

1. Ácido nucléico que codifica uma subunidade α mutante doFSH em que a subunidade α compreende a seqüência do SEQ ID. N9: 4.

2. Vetor que compreende o ácido nucléico de acordo com a rei-vindicação 1.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, em que o vetor é umvetor de expressão.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 2, em que o vetor aindacompreende um ácido nucléico que codifica a seqüência do SEQ ID. N-: 3.

5. Célula hospedeira que compreende o vetor como definido nareivindicação 2.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, em que acélula é uma célula de mamífero.

7. FSH mutante, em que a subunidade β compreende a seqüên-cia do SEQ ID. N5: 3, e em que a subunidade α compreende uma seqüênciacodificada pelo ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1.

8. FSH mutante de acordo com a reivindicação 1, em que qual-quer um de 0 a 6 resíduos de asparagina são glicosilados.

9. FSH mutante de acordo com a reivindicação 7, em que a su-bunidade α compreende a seqüência do SEQ ID. N9: 4 e em que N5 é glico-silado.

10. Método de produção de um mutante de FSH1 compreendendo:(a) o fornecimento de uma célula que compreende o ácido nu-cléico como definido na reivindicação 1, e um segundo ácido nucléico quecodifica o SEQ ID. N9: 3;(b) o cultivo da célula sob condições que permitam a expressãodo primeiro e do segundo ácidos nucléicos.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula écapaz de glicosilar proteína.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a célulacompreende um vetor único que compreende o ácido nucléico como definidana reivindicação 1 e um ácido nucléico que codifica o SEQ ID. N9: 3.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a célulacompreende um vetor que compreende o ácido nucléico como definido nareivindicação 1 e ainda compreende um segundo vetor que compreende umácido nucléico que codifica o SEQ ID. N9: 3.

14. Composição farmacêutica que compreende o FSH mutantede acordo com a reivindicação 1 e, opcionalmente, um veículo ou excipientefarmaceuticamente aceitável.

15. Método de tratamento de um mamífero infértil que compre-ende a administração da composição farmacêutica de acordo com a reivindi-cação 14 a um mamífero que dela necessite.

16. Método de estimulação da foliculogenêse em um mamíferoque compreende a administração da composição farmacêutica como defini-da na reivindicação 14 a um mamífero que dela necessite.

17. Método de indução de hiperestimulação ovariana em ummamífero, que compreende a administração da composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 14 a um mamífero que dela necessite.