PT1981908E - Nova variante de glicosilação d3n da fsh - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NOVA VARIANTE DE GLICOSILAÇÃO D3N DA FSH"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se à reprodução humana. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a terapias de fertilização. 2. Descrição da Técnica Relacionada a. Gonadotropinas A hormona folículo-estimulante (FSH) é um membro da família de gonadotropinas que desempenham papéis chave na fertilidade humana. As gonadotropinas, as quais também incluem a hormona luteinizante (LH) e a gonadotropina coriónica (CG), são heterodímeros, consistindo cada um de uma subunidade (X (92 aminoácidos) e uma única subunidade β (111 aminoácidos em FSH). As sequências de aminoácidos das formas maduras das subunidades α e β da FSH são mostradas nas SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente. A FSH humana foi isolada de glândulas pituitárias e de urina pós-menopáusica (EP 322,438) e foi produzida de modo

recombinante em células de mamíferos (US 5,639, 640, US 5, 156,957, US 4, 923,805, US 4,840,896 , US 5,767, 251, EP 211,894 e EP 521,586). As últimas referências também divulgam o gene da subunidade β da FSH humana . A US 5,405,945 divulga um gene da subunidade α humana modificado compreendendo apenas um intrão.

Liu et al., J Biol Chem 1993,15; 268 (2): 21613-7,

Grossmarm et al., Mol Endocrinol 1996 10 (6): 769-79, Roth e Dias (Mol Cell Endocrinol 1995 1; 109 (2): 143-9, Valove 2 et al., Endocrinology 1994; 135 (6): 2657-61, Yoo et al., J Biol Chem 1993 25; 268 (18): 13034- 42), US 5,508,261 e Chappel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1835 divulgam vários estudos da relação estrutura-função e identificam resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação e activação do receptor e na dimerização de FSH. b. Utilização de Gonadotropinas em Técnicas de Reprodução Assistida

As gonadotropinas desempenham papéis cruciais no ciclo reprodutivo e a sua utilização em terapias exógenas é essencial para as técnicas de reprodução assistida (ART), como fertilização in vitro (IVF), IVF conjuntamente com injecção intracitoplasmática de espermatozóides (IVF/ICSI) e transferência de embrião (ET), bem como para indução da ovulação (01) em doentes anovulatórios submetidos a fertilização in vivo quer naturalmente ou através de inseminação intra-uterina (UII).

As US 4,589,402 e US 4,845,077 divulgam FSH humana purificada que está isenta de LH e a sua utilização para fertilização in vitro. A EP 322 438 divulga uma proteína com pelo menos 6200 U/mg de actividade FSH a qual está substancialmente isenta de actividade LH e em que a subunidade a da FSH e a subunidade β, respectivamente, podem ser de tipo selvagem ou formas truncadas destas especificadas. É necessária terapia prolongada para se conseguir um efeito terapêutico, tipicamente durante 8-10 dias consecutivos e por vezes até 21 dias para estimular a foliculogénese em mulheres, e durante até 18 meses em machos hipogonadotrópicos para induzir espermatogénese. A hFSH recombinante é tipicamente administrada como uma injecção 3

diária i.m. ou s.c., com o desconforto consequente e potencial para reacção local no sitio de injecção. A diminuição da frequência de administração facilitaria a terapia e tornaria a administração de gonadotropina mais conveniente, mais tolerável e amiga do doente.

c. Glicosilação de FSH

As gonadotropinas são glicoproteinas, possuindo cada subunidade cadeias laterais de oligossacáridos ligados a asparagina (ligada por N) que são importantes para a actividade e função in vivo. A adição de hidratos de carbono (glicosilação) a polipéptidos é um evento pós-tradução que resulta na adição de cadeias de açúcar a aminoácidos asparagina (ligada por N) ou serina/treonina (ligada por 0) específicos. Ao contrário da sequência invariante de aminoácidos da parte proteica das glicoproteinas, as estruturas de hidrato de carbono são variáveis, uma característica referida como micro-heterogeneidade. Por exemplo, os sítios de N-glicosilação na mesma proteína podem conter estruturas de hidrato de carbono diferentes. Além disso, até no mesmo sítio de glicosilação de uma dada glicoproteína, podem ser encontradas estruturas de hidrato de carbono diferentes. Este heterogeneidade é uma consequência da síntese não orientada pela cadeia molde de hidratos de carbono. A N-glicosilação de proteínas ocorre especificamente no padrão consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, e em menor extensão no padrão consenso Asn-Xaa-Cys, em que Xaa pode ser qualquer resíduo de aminoácido. No entanto, a presença de um tripéptido consenso não é suficiente para garantir que um resíduo asparagina seja glicosilado. Por exemplo, a N-glicosilação da sequência Asn-Pro-Ser/Thr ocorre numa frequência 50 vezes inferior à de outros padrões consenso de Asn-Xaa-Ser/Thr. 4 A FSH humana contém quatro sítios de glicosilação ligados por N: dois na subunidade α comum nas posições 52 e 78 e dois na subunidade β nas posições 7 e 24. Os hidratos de carbono ligados à subunidade α da FSH são críticos para a formação, integridade, secreção e transdução de sinal do dímero, enquanto os hidratos de carbono da subunidade β são importantes para formação, secreção do dímero e eliminação do heterodímero da circulação.

Galway et al., Endocrinology 1990; 127 (1): 93-100 demonstraram que as variantes de FSH produzidas numa linha de células CHO com N-acetilglucosamina transferase-l CHO ou numa linha de células CHO deficientes no transporte de ácido siálico são tão activas como a FSH segregada pelas células de tipo selvagem ou a FSH pituitária purificada in vitro, mas careciam de actividade in vivo, presumivelmente devido à eliminação rápida das variantes inadequadamente glicosiladas no soro. D'Antonio et al., Human Reprod 1999; 14 (5): 1160-7 descrevem várias isoformas de FSH que circulam na corrente sanguínea. As isoformas têm sequências de aminoácidos idênticas, mas diferem na sua extensão de modificação pós-tradução. Foi constatado que o grupo isofórmico menos ácido tinha uma eliminação in vivo mais rápida em comparação com o grupo isofórmico ácido, provavelmente devido a diferenças no teor de ácido siálico entre as isoformas. Além do mais, Bishop et al. Endocrinology 1995; 136 (6): 2635-40 concluíram que a semivida circulatória parecia ser o determinante principal da actividade in vivo. Estas observações levaram à hipótese que a semivida da FSH poderia ser aumentada pela introdução de sítios de glicosilação adicionais para aumentar o teor de ácido siálico do polipéptido. 5

d. Variantes de FSH

Foram desenvolvidos agonistas de FSH com semividas aumentadas fundindo o péptido carboxi-terminal de hCG (CTP) a FSH humana nativa recombinante (rhFSH) . A unidade CTP consiste dos aminoácidos 112-118 a 145 com quatro sítios de glicosilação ligados por 0 localizados nas posições 121, 127, 132 e 138. As US 5,338,835 e US 5,585,345 divulgam uma subunidade β de FSH modificada prolongada na Glu C-terminal com a unidade CTP da hCG. 0 análogo resultante modificado é apresentado como possuindo a actividade biológica da FSH nativa, mas uma semivida em circulação prolongada. A US 5,405,945 divulga que a porção carboxi-terminal da subunidade β da hCG ou uma variante desta tem efeitos significativos na eliminação de CG, FSH e LH. A US 5,883,073 divulga proteínas monocatenárias constituídas por duas subunidades Oí com actividade agonista ou antagonista para as CG, TSH3 LH e FSH. A US 5,508,261 divulga polipéptidos heterodiméricos possuindo afinidade de ligação para os receptores de LH e FSH compreendendo uma subunidade α de hormona glicoproteica e um polipéptido da subunidade β não natural, em que o polipéptido da subunidade β é uma cadeia de aminoácidos compreendendo quatro subsequências unidas, cada uma das quais é seleccionada de uma lista de sequências específicas. Klein et al. (2003) divulga um análogo de FSH de cadeia simples com uma semivida aumentada, em que as subunidades α e β estão ligadas por um oligopéptido contendo dois sítios de glicosilação ligados por N. A WO 01/58493 divulga 77 mutações que podem ser feitas na subunidade α de FSH e 51 mutações que podem ser feitas na subunidade β de FSH numa tentativa para melhorar a semivida 6 in vivo da FSH. Além disso, a WO 01/58493 divulga que podem ser adicionados um ou mais sitios de glicosilação à extremidade N-terminal da FSH para melhorar a sua semivida ou inse4ridos em vários sitios no polipéptido da FSH. A WO 01/58493, embora descreva que podem ser inseridos sitios de glicosilação no polipéptido da FSH, ela não proporciona qualquer orientação sobre o(s) sitio(s) especifico(s) onde poderia ser inserido o sitio de glicosilação e ser mantida a actividade da FSH. A WO 01/58493 divulga ainda que as subunidades mutantes α e β podem ser utilizadas individualmente (1 sitio de glicosilação adicional) ou em associação (2 sitios de glicosilação adicionais). Os 128 mutantes candidatos foram identificados utilizando 50 modelos da estrutura 3D da FSH que foram gerados com base apenas na estrutura de hCG e em um alinhamento de sequência da FSH e hCG apesar dos apenas 32% de identidade entre s subunidades β das hCG e FSH. A WO 01/58493 não divulga a produção ou ensaio de quaisquer subunidades α ou β de FSH em que um sitio de glicosilação tenha sido introduzido por mutagénese especifica de um locus. A WO 05/020934 divulga GMl, com mutações em ambas as subunidades α e β da FSH, incluindo uma mutação dupla em β E55N/V57T, isto é, o resíduo E na posição de aminoácido 55 mutada para N e o resíduo V na posição de aminoácido 57 mutada para T. A sequência de aminoácido de β E55N/V57T é mostrada na SEQ ID NO:3.

Existe uma necessidade clínica para um produto que proporcione parte ou todos os efeitos terapeuticamente relevantes da FSH, e o qual possa ser administrado em intervalos menos frequentes em comparação com os produtos de FSH presentemente disponíveis, e o qual proporcione preferencialmente um nível mais estável de actividade FSH 7 em circulação em comparação com o que pode ser obtido pelo tratamento actual. A presente invenção é dirigida a tais produtos bem como a meios de preparação de tais produtos.

SUMÁRIO A presente invenção refere-se a moléculas de FSH mutante, em que a subunidade α de FSH compreende a SEQ ID NO:4 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO: 3. A FSH pode ser N-glicosilada em 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos de asparagina da referida FSH mutante. Numa forma de realização, a N3 da subunidade α mutante da SEQ ID NO:4 pode estar glicosilada.

O presente pedido também descreve moléculas de ADN isoladas que codificam um mutante da subunidade α de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:4. O presente pedido também descreve um ADN isolado que codifica uma subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:3.

O presente pedido também descreve um vector compreendendo ADN que codifica um mutante da subunidade a de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:4. O vector pode ser um vector de expressão.

O presente pedido também descreve um vector compreendendo ADN que codifica um mutante da subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:3. O vector pode ser um vector de expressão. 8 A presente invenção também se refere a um vector compreendendo um primeiro ADN e um segundo ADN, em que o primeiro ADN codifica um mutante da subunidade α de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:4 e em que o segundo ADN codifica um mutante da subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID N0:3. 0 vector pode ser um vector de expressão. 0 presente pedido também descreve uma célula compreendendo um vector compreendendo ADN que codifica um mutante da subunidade α de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:4. 0 vector pode ser um vector de expressão. A célula pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula CHO. 0 presente pedido também descreve uma célula compreendendo um vector compreendendo ADN que codifica um mutante da subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:3. 0 vector pode ser um vector de expressão. A célula pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula CHO. A presente invenção também se refere a uma célula compreendendo um vector compreendendo um primeiro ADN e um segundo ADN, em que o primeiro ADN codifica um mutante da subunidade α de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:4 e em que o segundo ADN codifica um mutante da subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:3. 0 vector pode ser um vector de expressão. A célula pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula CHO. A presente invenção também se refere a uma célula compreendendo um primeiro e um segundo vector, em que o 9 primeiro vector compreende adn que codifica um mutante da subunidade α de FSH consistindo de SEQ ID NO:4 e o segundo vector compreende adn que codifica um mutante da subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:3. 0(s) vector (es) pode(m) ser um vector de expressão. A célula pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula CHO. A presente invenção também se refere a um método de produção de um mutante de FSH compreendendo cultivar células de mamíferos capazes de glicosilar proteínas, em que as referidas células compreendem um primeiro vector de expressão compreendendo ADN que codifica um mutante da subunidade α de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:4 e um segundo vector de expressão compreendendo ADN que codifica um mutante da subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:3. Noutra forma de realização da presente invenção as referidas células compreendem um único vector compreendendo ADN que codifica um mutante da subunidade α de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 4 e compreendendo ainda ADN que codifica um mutante da subunidade β de FSH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3. A presente invenção também se refere a uma composição compreendendo um mutante de FSH e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a subunidade α de FSH compreende a sequência de SEQ ID NO:4 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID N0:3. A presente invenção também se refere a um método de tratamento de um mamífero infértil, compreendendo a administração a um mamífero necessitado daquele de uma 10 quantidade eficaz de um mutante de fsh, em que a subunidade a de FSH compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO:3. A presente invenção também se refere a um método de estimulação da foliculogénese num mamífero, compreendendo a administração a um mamífero necessitado daquele de uma quantidade eficaz de uma FSH mutante, em que a subunidade α de FSH compreende a sequência de SEQ ID NO:4 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO:3. A presente invenção também se refere a um método de indução de hiperestimulação ovárica num mamífero, compreendendo a administração a um mamífero necessitado daquele de uma quantidade eficaz de uma FSH mutante, em que a subunidade α de FSH compreende a sequência de SEQ ID NO:4 e em que a subunidade β de FSH compreende a SEQ ID NO:3.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra um alinhamento dos mutantes D3N (SEQ ID NO: 4) da subunidade α com a subunidade α da FSH humana (SEQ ID NO: 1). Os números dos resíduos referem-se à subunidade α da FSH humana (SEQ ID NO: 1), sendo 1 o primeiro aminoácido do polipéptido maduro.

Figura 2 mostra uma curva dose-resposta para a FSH mutante, a qual compreende uma subunidade α mutante D3N e uma subunidade β GM-1 a qual compreende a SEQ ID NO: 3, em comparação com uma curva dose-resposta da FSH de tipo selvagem. A curva dose-resposta indica actividade FSH a várias diluições da FSH mutante e de tipo selvagem. O clone 11 15C refere-se ao mutante D3N. O clone 14C é um mutante de FSH não relacionado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Embora tenha sido demonstrado que o aumento do teor de hidratos de carbono da FSH pode levar a um aumento da semivida in vivo, o melhoramento da semivida de FSH é mais complicado do que simplesmente adicionar sítios de glicosilação adicionais. Embora uma sequência consenso de glicosilação seja necessária para adição de hidratos de carbono, não é suficiente garantir que um sítio de adição de hidratos de carbono será utilizado. Outros factores, como a dobragem e conformação local da proteína durante a biossíntese, determinam se um oligossacárido é ligado a um dado sítio de sequência consenso. Além disso, para a glicosilação adicional levar a um aumento da semivida in vivo a sequência consenso tem de estar numa posição de modo a que glicosilação do sítio não interfira com a ligação ao receptor, ou comprometa a dobragem, conformação ou estabilidade da glicoproteína. A este respeito, os análogos de FSH com maiores semividas restringiram-se principalmente a proteínas de fusão em que a porção fundida do polipéptido incluía sítios de glicosilação adicionais. 1. FSH mutante É proporcionado um mutante de FSH que foi modificado para criar sítios de reconhecimento de glicosilação adicionais. A subunidade α do mutante de FSH pode ter uma das mutações seguintes, em comparação com a subunidade α de tipo selvagem: D3N e Q5T. Uma FSH mutante pode compreender a subunidade α mutante acima em associação com uma subunidade β mutante, por exemplo β GMl contendo a seguinte mutação: E55N/V57T. Um ou mais dos sítios de glicosilação adicionais 12 da FSH recombinante podem estar glicosilados. 0 um ou mais sítios de glicosilação adicionais da FSH mutante podem ser glicosilados in vitro ou in vivo. 0 mutante de FSH pode ser produzido por qualquer método adequado conhecido na técnica. Estes métodos incluem a construção de sequências de nucleótidos que codificam os respectivos mutantes de FSH e expressam a sequência de aminoácidos num hospedeiro transfectado adequado. 0 mutante de FSH também pode ser produzido por síntese química ou por uma combinação de síntese química e tecnologia de ADN recombinante. 0 mutante de FSH pode compreender as subunidades α e β da FSH na forma de duas cadeias de polipéptidos separadas, em que as duas cadeias dimerizam in vivo de modo a formar um polipéptido dimérico, ou pode compreender uma construção de cadeia simples compreendendo as duas subunidades ligadas covalentemente por uma ligação peptídica ou um grupo de ligação peptídico. Os resíduos de aminoácido do péptido de ligação podem exibir propriedades que não interfiram significativamente com a actividade do mutante de FSH. 0 mutante de FSH pode ter uma semivida aumentada em comparação com a FSH de tipo selvagem. 0 mutante de FSH também pode ter uma maior estabilidade em comparação com a FSH de tipo selvagem. 0 mutante de FSH pode compreender oligossacáridos em 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sitios de glicosilação ligados por N. Também é proporcionada uma população de mutantes de FSH, a qual pode compreender uma ou mais isoformas mutantes de FSH, em que cada isoforma compreende oligossacáridos em 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sítios de glicosilação ligados por N. 13 A sequência de nucleótidos que codifica as subunidades α e β do mutante de FSH pode ser construída isolando ou sintetizando uma sequência de nucleótidos que codifica a subunidade de FSH parental, como a hFSH-alfa ou hFSH-beta com as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente. A sequência de nucleótidos pode ser depois modificada de modo a efectuar a substituição o reinserção dos resíduos de aminoácidos relevantes. A sequência de nucleótidos pode ser modificada por mutagénese específica de um locus. Em alternativa, a sequência de nucleótidos pode ser preparada por síntese química, em que os oligonucleótidos são concebidos com base na sequência de aminoácidos específica do mutante de FSH. A sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido pode ser inserida num vector recombinante e operacionalmente ligada a uma sequência de controlo necessária para expressão do polipéptido na célula hospedeira transfectada desejada. As sequências de controlo podem ser qualquer componente que é necessário ou vantajoso para a expressão de um polipéptido. Exemplos de sequências de controlo adequadas para coordenar a transcrição em células de mamíferos incluem os promotores precoce e tardio de SV40 e adenovírus, por exemplo o promotor principal tardio de adenovírus 2, o promotor MT-1 (gene da metalotioneína) e o promotor do gene de expressão precoce do citomegalovírus humano (CMV).

Um especialista na técnica pode fazer uma selecção de entre estes vectores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros sem experimentação excessiva. 0 vector recombinante pode ser um vector que se replica autonomamente, isto é um vector que existe como uma entidade extracromossómica, cuja replicação é independente 14 da replicação cromossómica, por exemplo um plasmídeo. Alternativamente, o vector pode ser um que, quando introduzido numa célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado conjuntamente com o(s) cromossoma(s) nos quais foi integrado. 0 vector pode ser um vector de expressão no qual a sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido da invenção está operacionalmente ligado a segmentos adicionais necessários para transcrição da sequência de nucleótidos. 0 vector pode ser proveniente de ADN de plasmídeo ou virai. Um número de vectores de expressão adequados para expressão nas células hospedeiras aqui mencionadas encontra-se comercialmente disponível ou descrito na literatura. 0 vector recombinante pode compreender ainda uma sequência de ADN que permite que o vector duplique na célula hospedeira em questão. Um exemplo de uma tal sequência (quando a célula hospedeira é uma célula de mamífero) é a origem de replicação de SV40. 0 vector também pode compreender um marcador seleccionável, por exemplo um gene cujo produto complemente um defeito na célula hospedeira, como o gene que codifica a di-hidrofolato-redutase (DHFR) ou um que confira resistência a um fármaco, por exemplo ampicilina, canamicina, tetraciclina cloranfenicol, neomicina, higromicina ou metotrexato. 0 vector também pode compreender um gene amplificável, como DHFR, para que as células que possuam cópias múltiplas do gene amplificável e sequências flanqueadoras, incluindo o ADN da FSH mutante, possam ser seleccionadas num meio apropriado. 15

Também é proporcionado um adn que codifica uma subunidade α do mutante de FSH. A sequência de nucleótidos que codifica as subunidades alfa e beta do mutante de FSH, quer preparada por mutagénese especifica de um locus, síntese, PCR ou outros métodos, também pode incluir opcionalmente uma sequência de nucleótidos que codifica um péptido sinal. 0 péptido sinal pode estar presente quando o polipéptido estiver a ser segregado das células nas quais é expressado. Este péptido sinal, se presente, pode ser um reconhecido pela célula escolhida para expressão do polipéptido. 0 péptido sinal pode ser homólogo (por exemplo, ser o normalmente associado a uma subunidade da hFSH) ou heterólogo (isto é proveniente de outra fonte diferente da hFSH) ao polipéptido ou pode ser homólogo ou heterólogo à célula hospedeira, isto é ser um péptido sinal normalmente expressado na célula hospedeira ou um que não é normalmente expressado na célula hospedeira.

Pode utilizar-se qualquer hospedeiro adequado para produzir os polipéptidos, incluindo células ou linhas de células de bactérias, fungos (incluindo leveduras), plantas, insectos, mamíferos, ou de outros animais apropriados, bem como de animais ou plantas transgénicos. Exemplos de célula hospedeiras de mamíferos adequadas incluem linhas de células de ovário de hamster Chinês (CHO), (por exemplo CHO-KL; ATCC CCL-61), linhas de células de Macaco Verde (COS) (por exemplo COS 1 (ATCC CRL- 1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de rato (por exemplo NSIO), linhas de células de Rim de Cria de Hamster (BI-EK) (por exemplo ATCC CRL-1632 ou ATCC CCL-10) e células humanas (por exemplo BEK 293 (ATCC CRL-1573)), bem como células vegetais em cultura de tecido. Outras linhas de células adequadas são conhecidas na técnica e estão disponíveis de depositários públicos como a American Type Culture Collection, EUA. Os 16 métodos para introduzir ADN exógeno em células hospedeiras de mamífero incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio, electroporação, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas e vectores virais.

As células podem ser cultivadas num meio nutriente adequado para produção do polipéptido utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultura em balão agitado, por fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações continuas, descontinuas, descontinuas alimentadas ou estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizada num meio adequado e em condições que permitam que o polipéptido seja expressado e/ou isolado. A cultura ocorre num meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e azoto e sais inorgânicos, utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados segundo composições publicadas (por exemplo em catálogos da American Type Culture Collection) . Se o polipéptido for segregado para o meio nutriente, ele pode ser recuperado directamente do meio. Se o polipéptido não for segregado, ele pode ser recuperado dos lisados celulares. Um método de produção de rendimento elevado dos mutantes de FSH da invenção é através da utilização da amplificação da di-hidrofolato-redutase (DHFR) em células CHO deficientes em DHFR, através da utilização de níveis sucessivamente crescentes de metotrexato como descrito na Patente US N° 4,889,803. O polipéptido de FSH mutante resultante pode ser recuperado por métodos conhecidos na técnica. For exemplo, aquele pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, 17 centrifugação, filtração, extracção, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação. Os polipéptidos de FSH mutantes podem ser purificados por uma diversidade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo troca iónica, afinidade, hidrófoba, focagem cromatográfica e exclusão molecular), procedimentos electroforéticos (por exemplo focagem isoeléctrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo precipitação com sulfato de amónio), SDS-PAGE ou extracção.

Também é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo o mutante de FSH. Esta composição farmacêutica pode ser utilizada para estimular a foliculogénese, por exemplo conjuntamente com a indução da ovulação ou técnicas de reprodução assistida (ART). Uma vez que o mutante de FSH da presente invenção pode ser eficaz na indução do desenvolvimento e maturação de folículos múltiplos, ele pode ser particularmente adequado para ser utilizado em ART, na qual é desejado recolher múltiplos ovócitos. 0 mutante de FSH pode ser utilizado para induzir mono-foliculogénese para 01, ou paucifoliculogénese (até cerca de três foliculos) para UII, para fertilização in vivo. A mono-foliculogénese também pode ser conseguida com uma dose reduzida do mutante de FSH, ou com uma administração menos frequente comparativamente com as preparações de FSH convencionais. Por exemplo, na 01 pode ser administrada uma preparação de FSH da invenção a 225-400 UI cada três dias, ou doses menores, dependendo da resposta do doente. A resposta do doente pode ser seguida por ecografia. O mutante de FSH da invenção pode ser utilizado num regime de hiperestimulação ovárica (COH) controlada. Os regimes 18 correntes para COH incluem uma fase de regulação negativa na qual a hormona luteinizante endógena (LH) é regulada negativamente pela administração de um agonista da hormona de libertação de gonadotropina (GnRH), seguida de uma fase estimuladora na qual o desenvolvimento folicular (foliculogénese) é induzido por administração diária de hormona folículo-estimulante (FSH), geralmente a cerca de 150-225 Ul/dia. Alternativamente, a estimulação pode ser começada com FSH após menstruação espontânea ou induzida, seguida de administração de um antagonista de GnRH (começando tipicamente cerca do dia seis da fase estimuladora). Quando existem pelo menos 3 foliculos >16 mm (um de 18 mm) pode ser dado um único bolus de hCG (5-10.000 UI) para simular o aumento súbito natural de LH e induzir ovulação. A recuperação dos ovócitos pode ser planeada para 36-38 horas após a injecção de hCG. 0 mutante de FSH também pode ser utilizado para 01 e Ull. Por exemplo, a estimulação com FSH pode ser iniciada após menstruação espontânea ou induzida, a uma dose diária de 75-150 UI. Quando 1 ou 3 foliculos atingiram um diâmetro de pelo menos 16 mm pode administrar-se um único bolus de hCG para induzir ovulação. A inseminação pode ser realizada in vivo, por relação sexual regular ou UII.

Devido ao mutante de FSH poder ter uma semivida aumentada em relação às preparações de FSH de tipo selvagem, os regímenes como os descritos acima podem empregar doses UI de FSH menores e/ou podem ser modificados diminuindo o periodo de estimulação com FSH, enquanto atingem a mesma ou uma resposta melhor, em termos de número e viabilidade de foliculos. Por exemplo, pode ser conseguida uma foliculogénese adequada com doses diárias de, ou cerca de, 50-150, 50-100 ou 50-75 UI de FSH. A administração de FSH pode ser numa base diária ou semidiária. O periodo de 19 administração pode ser inferior a ou de cerca de 14, 12, 11 ou 10 dias. Para 01, a preparação do mutante de FSH pode ser administrada a doses de 25-150 ou 50-125 UI de FSH/dia. Para o tratamento da infertilidade masculina, uma preparação do mutante de FSH pode ser administrada 3 X 150 a 300 UI/semana até se atingirem niveis de espermatogénese adequada para inseminação, quer através de relações sexuais regulares ou técnicas de ART.

Devido à semivida prolongada da FSH mutante, esta pode ser administrada como uma preparação de acção prolongada, a qual pode ser administrada menos frequentemente do que de dois em dois dias. A FSH convencional pode ser administrada a, ou a cerca de, 300 UI a cada dois dias, atingindo-se resultados semelhantes à administração diária de, ou cerca de, 150 UI. A FSH mutante pode ser administrada a cada 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, atingindo-se resultados semelhantes ou melhores do que a administração diária de FSH convencional. O mutante de FSH pode ser utilizado para o fabrico de um medicamento para tratamento de doenças, distúrbios ou condições. Noutro aspecto, o polipéptido ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção é utilizada num método de tratamento de um mamífero, em particular um humano, compreendendo a administração desse polipéptido ou composição farmacêutica ao mamífero necessitado daquele.

Será evidente para os especialistas na técnica que uma quantidade eficaz de um polipéptido, preparação ou composição depende, inter alia, da doença, da dose, do plano de administração, de se o polipéptido ou preparação ou composição é administrado sozinho ou em conjunto com outros agentes terapêuticos, da semivida das composições no soro e do estado físico geral do doente. Tipicamente, uma 20 dose eficaz da preparação ou composição é suficiente para garantir um efeito terapêutico. O mutante de FSH pode ser administrado numa composição incluindo um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. "Farmaceuticamente aceitável" significa um veículo ou excipiente que não provoca quaisquer efeitos inconvenientes nos doentes ao qual é administrado. Tais veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e o polipéptido pode ser formulado em composições farmacêuticas por métodos bem conhecidos (ver por exemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer e L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)). Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados em composições compreendendo o polipéptido incluem, por exemplo, tampões, estabilizantes, conservantes, agentes isotónicos, tensioactivos não iónicos ou detergentes ("humectantes"), antioxidantes, agentes de volume ou enchimentos, quelantes e co-solventes. A composição farmacêutica compreendendo o mutante de FSH pode ser formulada numa variedade de formas, incluindo líquidos, por exemplo soluções ou suspensões prontas a utilizar, geles, preparações liofilizadas ou qualquer outra forma adequada, por exemplo pó ou cristais adequados para preparar uma solução. A forma da composição pode depender da indicação particular a ser tratada e será evidente para um especialista na técnica. A composição farmacêutica compreendendo o mutante de FSH pode ser administrado por via intravenosa, intramuscular, 21 intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, sublingual, bucal, intranasal, transdérmica, por inalação ou de qualquer outro modo aceitável, por exemplo utilizando tecnologia PowderJect ou ProLease ou um sistema de injecção de caneta. 0 modo de administração pode depender da indicação particular a ser tratada e será evidente para um especialista na técnica. A composição pode ser administrada por via subcutânea, a qual pode permitir que o doente realize auto-administração.

As composições farmacêuticas podem ser administradas em conjunto com outros agentes terapêuticos. Estes agentes podem ser incorporados como parte da mesma composição farmacêutica ou podem ser administrados separadamente dos polipéptidos, quer concorrentemente ou segundo qualquer outro plano de tratamento aceitável. Além disso, o polipéptido, preparação ou composição farmacêutica pode ser utilizada como um auxiliar para outras terapias. A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não restritivos.

Exemplo 1 Mutantes de FSH A estrutura cristalina 3D da FSH humana foi utilizada para identificar sítios de glicosilação candidatos na subunidade α da FSH ou regiões na molécula de FSH onde poderia ser inserido um sítio de glicosilação candidato. Estão presentes duas moléculas de FSH (quatro subunidades) em cada unidade assimétrica da estrutura cristalina. As duas moléculas de FSH foram sobrepostas e comparadas, sendo cada resíduo visualmente inspeccionado para identificar potenciais sítios de N-glicosilação. A estrutura 22 cristalográfica da fsh foi combinada com o conhecimento da interacção FSH/receptor de FSHR para auxiliar na selecção de potenciais sitios de N-glicosilação. Os critérios de concepção principais foram a perturbação mínima da estrutura 3D, a perturbação mínima de sítios de ligação e activação previstos, e a estrutura 3D previsível compatível com glicosilação. Com base nos critérios anteriores foi identificado o mutante seguinte da sequência de aminoácidos da subunidade α de FSH: # Mutações SEQ ID NO 1 D3 4

Exemplo 2

Análise Morfológica de Mutantes de FSH

Alíquotas de sobrenadantes de cultura concentrados da expressão transitória do mutante da subunidade α de FSH foram analisadas por SDS-PAGE em condições não redutoras que permite a resolução de heterodímeros de FSH intactos das subunidades α e β livres. Ao comparar as massas moleculares aparentes de cada heterodímero mutante com a da FSH de tipo selvagem, pode-se determinar se a FSH mutante está hiperglicosilada em relação à FSH de tipo selvagem. Resumidamente, após electroforese, as proteínas foram transferidas electroforeticamente para PVDF e visualizadas utilizando anticorpo 9-14 da Serono dirigido contra a subunidade α de FSH. Como um controlo também foram analisadas a FSH humana de tipo selvagem, GM1 mutante, FSH-CTP e Gonal F. 0 Quadro 1 mostra a massa molecular aparente do heterodímero formado pelo mutante da subunidade α e pela 23 subunidade β de tipo selvagem como calculado com base em padrões de massa molecular.

Quadro 1

Amostra Mr (kDa) N° vezes Cone. FSH-CTP 45,244 Gonal F 38,482 37x D3N 46,158 39X GM1 46,202 40X wt FSH 45,083 36x

Como se mostra no Quadro 1, o mutante de FSH expressado, isto é a mutação D3, apresentou uma maior glicosilação como evidenciado por uma deslocação da distribuição da massa molecular aparente do heterodimero em comparação com a FSH humana de tipo selvagem.

Exemplo 3

Função In Vitro de Mutantes de FSH A fim de determinar a actividade dos mutantes de FSH, o mutante foi testado quanto à capacidade para estimular a produção de cAMP numa linha de células CHO que expressa recombinantemente o receptor da FSH humana. As células CHO-FSHR foram mantidas em meio de Crescimento de FSHR [MEM a(-) (Gibco, cat# 12561-056) + 10% FBS submetido a diálise (Gibco, cat#26300-020) + 600 pg/mL de Geneticina (Gibco, cat#10131-035) + mtx 0,02μΜ]. As células CHO-FSHR foram aplicadas a 2xl04 células/poço em 100 μΐ/ρορο (2X106 células/10 mL = 1 placa) e incubadas a 37 °C durante 24 24 horas antes da análise. As células foram utilizadas para análise se pelo menos 70% confluentes.

Foi efectuada uma diluição em série a 1:3 de 12 pontos começando a 67,5 nM para todas as amostras e padrão interno (utilizou-se Gonal F como um padrão interno). Todas as diluições foram efectuadas em meio de ensaio [DMEM/F12 (isento de fenol, Gibco, cat #11039-021) + 1 mg/mL de BSA (Sigma, A-6003) + IBMX 0,1 mM (inibidor da fosfodiesterase 3-isobutil-l-metilxantona, Sigma, cat#I-7018)]. O meio de crescimento foi removido da placa de ensaio, foram adicionados 25 μΒ de meio de ensaio (fornecido com o kit MA6000 cAMP MSD - Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD), as placas recuperadas e incubadas a 37 °C durante 15 minutos. Os poços foram depois administrados com 25 μΒ/poço da amostra de ensaio, misturados, as placas recuperadas e incubadas durante 1 hora a 37 °C. Após a incubação de 1 hora, a amostra e meio foram removidos dos poços. Foram depois adicionados 25 μΒ de tampão de lise corrente (fornecido com o kit MA 6000 Meso Scale Discovery) a cada poço, as placas tapadas com um selante de placa (Packard, cat#6005185) e agitadas durante 5 minutos. Após a incubação de lise de 5 minutos, transferiu-se 25 μΒ de material celular lisado para a placa cAMP Meso Scale Discovery (fornecida com o kit MA6000 MSD) e incubou-se com mistura suave à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 25 μΒ de conjugado de cAMP-AP a cada poço e misturou-se. Adicionou-se então 25 μΒ de anticorpo anti-cAMP a cada poço, as placas foram tapadas com um selante de placa e agitadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas, seis vezes com 350 μΒ/poço de tampão de lavagem num lavador automático de placas. Adicionou-se então 100 μΒ de potenciador de substrato 25

Sapphire II RTU (Pronto a Utilizar) a cada poço, as placas foram tapadas com um selante de placa e incubadas 30 minutos no escuro a 25 °C. As placas foram então lidas durante um segundo por poço, com niveis baixos de cAMP exibindo um sinal elevado e niveis altos de cAMP exibindo um sinal baixo. A curva dose-resposta do mutante de FSH é mostrada na Figura 2. Os valores de EC50 foram calculados e são mostrados no Quadro 2.

Como se mostra na Figura 2 e Quadro 2, o mutante de FSH tem actividade in vitro comparável com a de FSH de tipo selvagem.

Quadro 2

Amostra ECso M fsh de tipo selvagem 1,99E-10 Clone 15C-a ϋ3Ν/β GMl 4,14E-10

Exemplo 4

Semivida in vivo de mutantes de FSH

Dois lotes diferentes de mutante D3N foram analisados em estudos farmacocinéticos (PK) separados. Os dois estudos foram da mesma concepção: 33 ratazanas SD fêmeas imaturas com 21 dias de idade (aprox. 40 g de massa corporal; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram divididas aleatoriamente por 5 grupos de tratamento (n=6) e 1 grupo de referência (n=3). A escolha das ratazanas fêmeas imaturas baseou-se na utilização desta idade e sexo para avaliações biológicas in vivo da actividade FSH. Os animais nos grupos de tratamento receberam injecções subcutâneas (s.c.) de 4 ug de GMl (controlo), mutante D3N ou 8 ug de rhFSH Gonal-F (controlo). Colheu-se sangue do seio nasal retro-orbital às 0 h do grupo de referência e às 1, 2, 4, 26 6, 10, 24, 48 e 72 h de animais nos grupos de tratamento (n=3/ponto no tempo; as ratazanas foram alternadas de modo a não serem sangradas em 2 pontos de amostragem subsequentes). Aproximadamente 0,1 mL de sangue foi colhido de cada ratazana em cada sangramento, e o plasma foi colhido e armazenado a -80 °C até ser analisado por ELISA. O ensaio utilizado para medir as proteínas fsh no soro de ambos os estudos foi o ELISA revestido com DSL FSH (Diagnostics Systems Laboratories, Webster, TX) . As amostras de soro foram analisadas em triplicado. A semivida do mutante D3N foi significativamente mais longa do que a da FSH de tipo selvagem.

Exemplo 5

Actividade Biológica in vivo O modelo in vivo utilizado para avaliar a actividade biológica do mutante D3N é o ensaio do ganho de peso ovárico da ratazana. O tratamento de ratazanas fêmeas imaturas com 21 dias de idade com FSH ou moléculas com actividade tipo FSH, por exemplo mutante D3N, desencadeia o crescimento de folículos ováricos e a produção de ovócitos. Este crescimento é facilmente detectado medindo o peso ovárico no final do período de tratamento. No modelo, a substância a ser testada é administrada por injecção durante três dias e os ovários são colhidos e pesados após a última dose. Este ensaio foi utilizado durante várias décadas como a base para atribuir a potência de FSH a produtos clínicos para efeitos de etiquetagem. Ele mede a acção fisiológica relevante da FSH e tem uma correlação clara com o desempenho dos produtos em clínica. A actividade in vivo do mutante D3N foi comparada com a da FSH de tipo selvagem. Todas as doses foram definidas com 27 base na equivalência prevista de FSH, tendo em consideração a potência in vitro e a semivida em ratazanas. Foi determinado que o mutante D3N possui uma actividade FSH potente com uma grandeza semelhante à da FSH de tipo selvagem. 28

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V. <120> Nova variante de glicosilação D3N da FSH <130> 1128 WO <160> 4

<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Ala ΡΓΟ Asp Vai Gin Asp cys Pro Glu cys Thr Leu Gin Glu Asn pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gin 20 pro Gly Ala Pro Ile 25 Leu Gin cys Met Gly 30 Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr pro Thr pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 55 40 45 vai Gin Lys Asn Vai Thr ser Glu Ser Thr Cys cys val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg vai Thr vai Met Gly Gly Phe Lys val Glu Asn His Thr 65 70 75 80 Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys ser 85 90

<210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 29

Asn ser cys Glu Leu Thr Asn He Thr ile Ala He Glu Lys Glu Glu 15 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cvs 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys ile Gin 35 40 45

Lys Thr cys Thr phe Lys Glu Leu vai Tyr Glu Thr vai Arg Vai pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp ser Leu Tyr Thr Tyr Pro vai Ala Thr 65 70 75 80

Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp ser Asp ser Thr Asp cys Thr vai 85 90 95

Arq Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> subunidade beta mutante <400> 3

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn rle Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu

Cvs Arg Phe Cys ile ser ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg pro Lys ile Gin 35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr vai Arg vai pro 50 55 60 30

Gly Cys Ala His His Ala Asp ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Vai Ala Thr 65 70 75 80

Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp ser Asp ser Thr Asp cys Thr Vai 85 90 os

Arg Gly Leu Gly Pro ser Tyr cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110 <210> 4 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutante de glicosilação D3N <400> 4

Ala Pro Asn vai Thr Asp cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro 1 5 10 15

Phe Phe ser Gin Pro Gly Ala Pro lie Leu Gin Cys Met Gly Cys cys 20 25 30

Phe Ser Arg Ala Tyr pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 35 40 45

Vai Gin Lys Asn vai Thr Ser Glu Ser Thr cys cys vai Ala Lys ser 50 55 50

Tyr Asn Arg Vai Thr vai Met Gly Gly phe t£s Val Glu Asn His l!jr 65 70 75 eu

Ala Cys His Cys ser Thr cys Tyr Tyr His Lys Ser

Lisboa, 16 de Novembro de 2010

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. FSH mutante, em que a subunidade β compreende a SEQ ID NO:3 e em que a subunidade α compreende a SEQ ID NO: 4.

2. FSH mutante da reivindicação 1, em que qualquer um de 0 a 6 resíduos de asparagina (N) estão glicosilados.

3. FSH mutante da reivindicação 1, em que o resíduo N3 da subunidade α está glicosilado.

4. Vector compreendendo um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 e um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

5. Vector da reivindicação 4, em que o vector é um vector de expressão.

6. Célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 4.

7. Célula hospedeira da reivindicação 6, em que a célula é uma célula de mamífero.

8. Método de produção do mutante de FSH da reivindicação 1 compreendendo: (a) proporcionar uma célula compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e um segundo ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) cultivar a célula em condições que permitem a expressão dos primeiro e segundo ácidos nucleicos. 2

9. Método da reivindicação 8, em que a célula é capaz de glicolisar proteínas.

10. Método da reivindicação 9, em que a célula compreende um único vector compreendendo um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 e um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

11. Método da reivindicação 9, em que a célula compreende: (a) um vector compreendendo um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 e (b) um vector compreendendo um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

12. Composição farmacêutica compreendendo o mutante de FSH da reivindicação 1 e opcionalmente um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

13. Composição farmacêutica da reivindicação 12 para tratar um mamífero infértil.

14. Composição farmacêutica da reivindicação 12 para estimular a foliculogénese num mamífero.

15. Composição farmacêutica da reivindicação 12 para induzir hiperestimulação ovárica num mamífero. Lisboa, 16 de Novembro de 2010