EA013975B1 - Мутантный fsh и способы его применения - Google Patents
Мутантный fsh и способы его применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA013975B1 EA013975B1 EA200870108A EA200870108A EA013975B1 EA 013975 B1 EA013975 B1 EA 013975B1 EA 200870108 A EA200870108 A EA 200870108A EA 200870108 A EA200870108 A EA 200870108A EA 013975 B1 EA013975 B1 EA 013975B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- fsh
- mutant
- subunit
- vector
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims abstract description 4
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 2
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 167
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 167
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 161
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 29
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 28
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 14
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 10
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 10
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 7
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 7
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 6
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 6
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 101100167365 Caenorhabditis elegans cha-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108010006578 follitropin alfa Proteins 0.000 description 5
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 5
- 229940057854 gonal f Drugs 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 4
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 4
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 102000002287 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Human genes 0.000 description 2
- 108010000732 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Proteins 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 201000005670 Anovulation Diseases 0.000 description 1
- 206010002659 Anovulatory cycle Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000651298 Homo sapiens TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099471 Phosphodiesterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011990 Sirtuin Human genes 0.000 description 1
- 108050002485 Sirtuin Proteins 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 102100027651 TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Human genes 0.000 description 1
- -1 TSH Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 231100000552 anovulation Toxicity 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011037 discontinuous sequential dilution Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 201000003368 hypogonadotropic hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к мутантному ФСГ, в котором β-субъединица содержит последовательность SEQ ID NO:3, а α-субъединица содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:4 или 5. Кроме того, настоящее изобретение относится к мутантному ФСГ, описанному выше, в котором любой из шести аспарагиновых остатков гликозилирован. Также заявлены способ получения мутантного ФСГ, нуклеиновая кислота, кодирующая α-субъединицу мутантного ФСГ, соответствующий вектор и клетка-хозяин. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей мутантный ФСГ, а также к способу лечения инфертильных млекопитающих, к способу стимуляции фолликулогенеза у млекопитающего и к способу индукции овариальной гиперстимуляции у млекопитающего, в которых млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, содержащую указанный мутантный ФСГ.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к репродукции человека. Более точно, настоящее изобретение относится к фертилизирующей терапии.
Описание предшествующего уровня техники
а. Гонадотропины
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) является членом семейства гонадотропинов, которое играет ключевые роли в фертильности человека. Гонадотропины, которые также включают лютеинизирующий гормон (ЛГ) и хорионический гонадотропин (ХГ), представляют собой гетеродимеры, каждый состоит из общей α-субъединицы (92 аминокислоты) и уникальной β-субъединицы (111 аминокислот в ФСГ). Аминокислотные последовательности зрелых форм α- и β-субъединиц ФСГ представлены в БЕР ΙΌ N0:1 и БЕр ΙΌ N0:2 соответственно.
ФСГ человека был выделен из мозговых придатков и из постменопаузной мочи (европейский патент № 322438) и был получен рекомбинантным путем в клетках млекопитающих (патент США № 5639640, патент США № 5156957, патент США № 4923805, патент США № 4840896, патент США № 576725, европейский патент № 211894 и европейский патент № 521586). Последняя ссылка также описывает ген β-субъединицы ФСГ человека. Патент США № 5405945 описывает модифицированный ген человеческой α-субъединицы, содержащий только один интрон.
Ьш е! а1., 1 Βΐοΐ. СДет. 1993,15; 268 (2): 21613-7, Огоззтаии е! а1., Мо1. ЕиДоегтоЕ 1996 10 (6): 76979, Ко1Д аиД Э1аз (Мо1. Се11 ЕиДоегтоЕ 1995 1; 109 (2): 143-9, Уа1оуе е! а1., ЕпДосппо1оду 1994; 135 (6): 2657-61, Уоо е! а1., 1 Вю1. СДет. 1993 25; 268 (18): 13034-42, патент США № 5508261 и СДарре1 е! а1., 1998, Нитап КергоДиеДои, 13 (3): 1835 описывают разнообразные исследования взаимосвязи структуры и функции и определяют аминокислотные остатки, участвующие в связывании с рецептором и его активации и в димеризации ФСГ.
Д. Применение гонадотропинов во вспомогательных репродуктивных технологиях
Гонадотропины играют решающую роль в репродуктивном цикле, и их применение в экзогенной терапии является существенным для вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), таких как оплодотворение ίη уДго (ЭКО), ЭКО в сочетании с интрацитоплазматическим впрыскиванием спермы (ЭКО/ИКСИ) и пересадкой эмбриона (ПЭ), а также для стимуляции овуляции (0Ι) у пациентов с ановуляцией, подвергающихся оплодотворению ίη у1уо, или естественным путем, или посредством внутриматочного осеменения (ВМО).
Патент США № 4589402 и патент США № 4845077 описывают очищенный ФСГ человека без примеси ЛГ и его применение для оплодотворения ίη уйго. Европейский патент № 322438 описывает белок с по меньшей мере 6200 ед. активности ФСГ на мг, у которого практически отсутствует активность ЛГ и у которого α-субъединица и β-субъединица ФСГ, соответственно, могут быть дикого типа или его определенных процессированных форм.
Для достижения терапевтического эффекта необходимо продолжительное лечение обычно в течение 8-10 последовательных дней, а иногда вплоть до 21 дня, чтобы стимулировать фолликулогенез у женщин, и в течение вплоть до 18 месяцев у мужчин с гипогонадотропизмом, чтобы стимулировать сперматогенез. Рекомбинантный чФСГ обычно вводят в виде внутримышечной или подкожной ежедневной инъекции, что влечет дискомфорт и возможность локальной реакции в месте инъекции. Уменьшение частоты применения облегчило бы лечение и сделало бы введение гонадотропина более удобным, более переносимым и безвредным для пациента.
с. Гликозилирование ФСГ
Гонадотропины представляют собой гликопротеины, у которых к каждой субъединице присоединены аспарагин-связанные (Ν-связанные) олигосахаридные боковые цепи, которые существенны для активности и функционирования ίη угуо. Присоединение углеводов (гликозилирование) к полипептидам представляет собой посттрансляционное событие, которое приводит к присоединению цепи сахаров к определенным аминокислотам, аспарагину (Ν-связанные) или серину/треонину (О-связанные). В противоположность неизменной аминокислотной последовательности белковой части гликопротеинов, углеводные структуры изменчивы, эта особенность называется микрогетерогенностью. Например, Νсвязанные сайты гликозилирования того же самого белка могут нести различные углеводные структуры. Более того, даже на том же сайте гликозилирования данного гликопротеина могут быть обнаружены различные углеводные структуры. Данная гетерогенность является следствием нематричного синтеза углеводов.
Ν-гликозилирование белков происходит специфически по консенсусной последовательности АзпХаа-Бег/ТДг. и в меньшей степени по консенсусной последовательности Ази-Хаа-Суз, где Хаа может представлять собой любой аминокислотный остаток. Однако наличие консенсусного трипептида еще недостаточно для того, чтобы гарантировать, что остаток аспарагина будет гликозилирован. Например, Ν-гликозилирование последовательности Ази-Рго-Бег/ТДг происходит со скоростью в 50 раз более низкой, чем других консенсусных последовательностей Азп-Хаа-Бег/ТДг.
ФСГ человека содержит четыре Ν-связанных сайта гликозилирования: два в общей α-субъединице
- 1 013975 в положениях 52 и 78 и два в β-субъединице в положениях 7 и 24. Углеводы, присоединенные к αсубъединице, ФСГ существенны для образования и целостности димера, секреции и передачи сигнала, тогда как углеводы β-субъединицы важны для образования димера, секреции и выведения гетеродимера из циркуляции.
СаБгау е! а1., Епйоспио1о§у 1990; 127 (1): 93-100 продемонстрировал, что варианты ФСГ, получаемые в клеточной линии СНО с №ацетилглюкозаминтрансферазой-1 или клеточной линии СНО с дефектом в транспорте сиаловой кислоты, являются столь же активными ίη νίίτο, как и ФСГ, секретируемый клетками дикого типа, или очищенный гипофизный ФСГ, но им недостает активности ίη νίνο, предположительно из-за быстрого выведения неадекватно гликозилированных вариантов в сыворотке. Ό'Άηΐοηίο е! а1., Нитаи Вергой 1999; 14 (5): 1160-7 описали различные изоформы ФСГ, циркулирующие в кровотоке. Изоформы имеют идентичные аминокислотные последовательности, но различаются степенью посттрансляционной модификации. Установлено, что группа менее кислотных изоформ быстрее выводится ίη νί\Ό по сравнению с группой кислотных изоформ, вероятно из-за различий в содержании сиаловой кислоты между изоформами. Более того, ВЫюр е! а1. Епйосппо1о§у 1995; 136 (6): 2635-40 пришли к выводу, что циркуляционное время полужизни является первостепенным определяющим фактором активности ίη νί\Ό. Данные наблюдения привели к предположению, что время полужизни ФСГ может быть увеличено путем введения дополнительных сайтов гликозилирования, чтобы увеличить содержание сиаловой кислоты в полипептиде.
й. Варианты ФСГ
Агонисты ФСГ с увеличенным временем полужизни были получены путем слияния карбоксиконцевого пептида чХГ (СТР) с нативным рекомбинантным ФСГ человека (рчФСГ). Фрагмент СТР состоит из аминокислот 112-118 до 145 с четырьмя О-связанными сайтами гликозилирования, расположенными в положениях 121, 127, 132 и 138. Патент США № 5338835 и патент США № 5585345 описывают модифицированную β-субъединицу ФСГ, удлиненную по С-концевой С1и СТР-фрагментом чХГ. Полученный в результате модифицированный аналог начал демонстрировать биологическую активность нативного ФСГ, но с увеличенным циркуляционным временем полужизни. Патент США № 5405945 раскрывает, что карбоксиконцевая часть β-субъединицы чХГ или ее вариант оказывает значительный эффект на выведение ХГ, ФСГ и ЛГ.
В патенте США № 5883073 описаны одноцепочечные белки, состоящие из двух α-субъединиц с агонистической или антагонистической активностью по отношению к ХГ, ТТГ, ЛГ и ФСГ. В патенте США № 5508261 описаны гетеродимерные полипептиды с аффинностью связывания с рецепторами ЛГ и ФСГ, содержащие α-субъединицу гликопротеинового гормона, и не встречающийся в природе полипептид β-субъединицы, где полипептид β-субъединицы представляет собой цепочку аминокислот, содержащую четыре объединенные подпоследовательности, каждую из которых выбирают из списка определенных последовательностей. К1ет е! а1. (2003) описывает одноцепочечный аналог ФСГ с увеличенным временем полужизни, в котором α- и β-субъединицы соединены олигопептидом, несущим два Νсвязанных сайта гликозилирования.
В \УО 01/58493 описано 77 мутаций, которые могут быть произведены в α-субъединице ФСГ, и 51 мутация, которые могут быть произведены в β-субъединице ФСГ, с целью улучшения времени полужизни ФСГ ίη νί\Ό. Кроме того, в \УО 01/58493 раскрыто, что один или несколько сайтов гликозилирования можно добавить к Ν-концу ФСГ, для того чтобы улучшить время его полужизни, или встроить в различных участках полипептида ФСГ. В \УО 01/58493, при том, что в ней раскрыто, что сайты гликозилирования могут быть встроены в полипептид ФСГ, не дано таких рекомендаций, как указание определенного участка (участков), в котором можно вставить сайт гликозилирования и поддержать активность ФСГ. В \УО 01/584 93, кроме того, раскрыто, что мутантные α- и β-субъединицы можно применять по отдельности (1 дополнительный сайт гликозилирования) или в сочетании (2 дополнительных сайта гликозилирования). 128 возможных мутантов идентифицировали при помощи 50 моделей трехмерной структуры ФСГ, которые были созданы только на основании структуры чХГ и сравнительного анализа последовательностей ФСГ и чХГ, несмотря на только 32% идентичности между β-субъединицами чХГ и ФСГ. \УО 01/58493 не описывает получение или тестирование ни одной α- или β-субъединицы ФСГ, в которой сайт гликозилирования был бы введен с помощью сайтнаправленного мутагенеза.
В \УО 05/020934 описан СМ1 с мутациями как в α-, так и в β-субъединицах ФСГ, включая двойную мутацию в β Ε55Ν/ν57Τ, т.е. остаток Е в аминокислотном положении 55 мутировал в Ν, а остаток V в аминокислотном положении 57 мутировал в Т. Аминокислотная последовательность β Ε55Ν/ν57Τ показана в 8ЕО Ш NО:3.
Существует клиническая потребность в продукте, который бы обеспечил часть или все терапевтические эффекты ФСГ и который можно было бы вводить с более редкими интервалами по сравнению с доступными в настоящее время продуктами ФСГ, и который предпочтительно обеспечил бы более стабильный уровень активности циркулирующего ФСГ по сравнению с тем, который удается получить с помощью доступных в настоящее время способов лечения.
Настоящее изобретение относится к таким продуктам, а также к способам получения таких продуктов.
- 2 013975
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к мутантным молекулам ФСГ, в которых α-субъединица ФСГ включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0:4-5, и в которых βсубъединица ФСГ включает 8Е0 ΙΌ N0:3. ФСГ может быть Ν-гликозилирован по 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остаткам аспарагина указанного мутантного ФСГ. В одном из вариантов осуществления N5 мутантной α-субъединицы 8Е0 ΙΌ N0:4 может быть гликозилирован. В другом варианте осуществления N5 мутантной α-субъединицы 8Е0 ΙΌ N0:5 может быть гликозилирован. В одном из вариантов осуществления N55 мутантной β-субъединицы 8Е0 ΙΌ N0:3 может быть гликозилирован.
Настоящее изобретение также относится к выделенным молекулам ДНК, кодирующим мутанты αсубъединицы ФСГ, выбранные из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5. Настоящее изобретение также относится к выделенной ДНК, кодирующей β-субъединицу ФСГ, содержащую последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3.
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему ДНК, кодирующую мутант αсубъединицы ФСГ, выбранный из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5. Такой вектор может представлять собой вектор экспрессии.
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему ДНК, кодирующую мутант, содержащий β-субъединицы ФСГ, последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3. Такой вектор может представлять собой вектор экспрессии.
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему первую ДНК и вторую ДНК, где первая ДНК кодирует мутант α-субъединицы ФСГ, выбранный из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, и где вторая ДНК кодирует мутант β-субъединицы ФСГ, содержащий последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3. Такой вектор может представлять собой вектор экспрессии.
Настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей вектор, содержащий ДНК, кодирующую мутант α-субъединицы ФСГ, выбранный из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5. Такой вектор может представлять собой вектор экспрессии. Клетка может представлять собой клетку млекопитающего, например клетку СН0.
Настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей вектор, содержащий ДНК, кодирующую мутант β-субъединицы ФСГ, содержащий последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3. Вектор может представлять собой вектор экспрессии. Клетка может представлять собой клетку млекопитающего, например, клетку СНО.
Настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей вектор, содержащий первую ДНК и вторую ДНК, где первая ДНК кодирует мутант α-субъединицы ФСГ, выбранный из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, и где вторая ДНК кодирует мутант β-субъединицы ФСГ, содержащий последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3. Вектор может представлять собой вектор экспрессии. Клетка может представлять собой клетку млекопитающего, например клетку СНО.
Настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей первый и второй векторы, где первый вектор содержит ДНК, кодирующую мутант α-субъединицы ФСГ, выбранный из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, а второй вектор содержит ДНК, кодирующую мутант β-субъединицы ФСГ, содержащий последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3. Вектор (векторы) может представлять собой вектор экспрессии. Клетка может представлять собой клетку млекопитающего, например, клетку СНО.
Настоящее изобретение также относится к способу получения мутанта ФСГ, включающему культивирование клеток млекопитающего, способных к гликозилированию, где указанные клетки содержат первый вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую мутант α-субъединицы ФСГ, выбранный из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, и второй вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую мутант β-субъединицы ФСГ, содержащий последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки содержат один вектор, содержащий ДНК, кодирующую мутант α-субъединицы ФСГ, выбранный из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, и, кроме того, содержащий ДНК, кодирующую мутант β-субъединицы ФСГ, содержащий последовательность 8ЕС ΙΌ N0:3.
Настоящее изобретение также относится к композиции, включающей мутант ФСГ и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, в которой α-субъединица ФСГ содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, и в которой β-субъединица ФСГ содержит 8ЕС ΙΌ N0:3.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения инфертильных млекопитающих, включающему введение млекопитающему, при необходимости, эффективного количества мутанта ФСГ, в котором α-субъединица ФСГ содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, и в котором β-субъединица ФСГ содержит 8ЕС ΙΌ N0:3.
Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции фолликулогенеза у млекопитающих, включающему введение млекопитающему, при необходимости, эффективного количества мутанта ФСГ, в котором α-субъединица ФСГ содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0:4-5, и в котором β-субъединица ФСГ содержит 8ЕС ΙΌ N0:3. Настоящее изобретение также
- 3 013975 относится к способу вызывания овариальной гиперстимуляции у млекопитающих, включающему введение млекопитающему, при необходимости, эффективного количества мутанта ФСГ, в котором αсубъединица ФСГ содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0:4-5, и в котором β-субъединица ФСГ содержит 8Е0 ΙΌ N0:3.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан сравнительный анализ мутантов α-субъединицы ΟΝΕΤ (8Е0 ΙΌ N0:4) и ΟΝΚΤ (8Е0 ΙΌ N0:5) с α-субъединицей ФСГ человека (8Е0 ΙΌ N0:1). Нумерация остатков относится к αсубъединице ФСГ человека (8Е0 ΙΌ N0:1), причем 1 является первой аминокислотой зрелого полипептида.
На фиг. 2 показана кривая зависимости от дозы для мутантных α-субъединиц ФСГ по сравнению с ФСГ дикого типа. Клон 10с - α СЯКТ/СМ1 β. Клон 11с - α СХЕТ/СМ1 β.
Подробное описание изобретения
Несмотря на то, что было показано, что увеличение содержания углеводов в ФСГ может вести к увеличению времени полужизни ίη νίνο, улучшение времени полужизни ФСГ является более сложным, чем простое добавление дополнительных сайтов гликозилирования. Несмотря на то, что гликозилирование консенсусной последовательности необходимо для присоединения углеводов, этого недостаточно для гарантии того, что сайт присоединения углевода будет использован. Другие факторы, такие как локальная укладка и конформация белка во время биосинтеза, определяют, присоединится ли олигосахарид в данном сайте консенсусной последовательности. Кроме того, для того чтобы дополнительное гликозилирование привело к увеличению времени полужизни ίη νίνο, консенсусная последовательность должна быть в таком положении, чтобы гликозилирование сайта не мешало связыванию с рецептором или не нарушало укладку, конформацию или стабильность гликопротеина. До сих пор аналоги ФСГ с увеличенным временем полужизни главным образом представляли собой слитые белки, в которых слитая часть полипептида включала дополнительные сайты гликозилирования.
1. Мутантный ФСГ
Предложен мутант ФСГ, который был модифицирован, для создания дополнительных сайтов распознавания для гликозилирования. α-Субъединица мутанта ФСГ может содержать одну из следующих мутаций по сравнению с α-субъединицей дикого типа: вставку аминокислотной последовательности СМЕТ между аминокислотными остатками 3 и 4 α-субъединицы дикого типа или вставку аминокислотной последовательности СПКТ между аминокислотными остатками 3 и 4 α-субъединицы дикого типа. Мутантный ФСГ может содержать любую из вышеуказанных мутантных α-субъединиц в сочетании с мутантной β-субъединицей, например с β СМ1, содержащей следующую мутацию: Е55N/V57Τ. Один или несколько дополнительных сайтов гликозилирования рекомбинантного ФСГ могут быть гликозилированы. Такие один или несколько дополнительных сайтов гликозилирования рекомбинантного ФСГ могут быть гликозилированы ίη νίΐτο или ίη νίνο. Как применяется здесь, термин мутант СПЕТ относится к мутантному ФСГ, содержащему α-субъединицу, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0:4, и βсубъединицу, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0:3. Как применяется здесь, термин мутант СПКТ относится к мутантному ФСГ, содержащему α-субъединицу, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0:5, и β-субъединицу, как представлено в 8Е0 ΙΌ N0:3.
Мутант ФСГ может быть получен любым подходящим способом, известным в данной области. Такие способы включают конструирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих соответствующие мутанты ФСГ и экспрессирующих аминокислотные последовательности в подходящем трансфицированном хозяине. Мутант ФСГ может также быть получен при помощи химического синтеза или при помощи комбинации химического синтеза и технологии рекомбинантной ДНК.
Мутант ФСГ может содержать α- и β-субъединицы ФСГ в виде двух отдельных полипептидных цепочек, где две цепочки димеризуются ίη νίνο таким образом, что образуют димерный полипептид, или он может содержать одноцепочечную конструкцию, содержащую две субъединицы, ковалентно связанные пептидной связью или пептидным линкером. Аминокислотные остатки линкерного пептида могут проявлять свойства, которые не по существу влияют на активность мутанта ФСГ.
Мутант ФСГ может обладать увеличенным временем полужизни по сравнению с ФСГ дикого типа. Мутант ФСГ может также обладать увеличенной стабильностью по сравнению с ФСГ дикого типа. Мутант ФСГ может содержать олигосахариды в 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 N-связанных сайтах гликозилирования. Также предлагается популяция мутантов ФСГ, которая может включать одну или несколько изоформ мутанта ФСГ, где каждая изоформа содержит олигосахариды в 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 N-связанных сайтах гликозилирования.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая α- или β-субъединицы мутанта ФСГ, может быть сконструирована путем выделения или синтеза нуклеотидной последовательности, кодирующей исходную субъединицу ФСГ, такую как чФСГ-альфа или чФСГ-бета, с аминокислотными последовательностями, показанными в 8Е0 ΙΌ N0:1 и 2, соответственно. Нуклеотидная последовательность затем может быть изменена так, чтобы воздействовать на замещение или вставку соответствующих аминокислотных остатков. Нуклеотидная последовательность может быть модифицирована при помощи сайтнаправлен
- 4 013975 ного мутагенеза. В качестве альтернативы нуклеотидная последовательность может быть получена путем химического синтеза, в котором олигонуклеотиды конструируют на основании определенной аминокислотной последовательности мутанта ФСГ.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, может быть встроена в рекомбинантный вектор и функционально связана с контрольной последовательностью, необходимой для экспрессии полипептида в желаемой трансфицированной клетке-хозяине. Контрольные последовательности могут представлять собой любой компонент, который необходим или благоприятен для экспрессии полипептида. Примеры подходящих контрольных последовательностей для направления транскрипции в клетках млекопитающих включают ранний и поздний промоторы 8У40 и аденовирусов, например главный поздний промотор аденовируса 2, промотор МТ-1 (гена металлотионеина) и промотор предраннего гена цитомегаловируса человека (СМУ).
Специалист в данной области может сделать выбор среди указанных векторов, последовательностей контроля экспрессии и хозяев без лишних экспериментов. Рекомбинантный вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т. е. вектор, который существует в виде экстрахромосомной единицы, репликация которой не зависит от репликации хромосом, например плазмиды. В ином случае, вектор может представлять собой такой вектор, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), в которую он интегрирован.
Вектор может представлять собой вектор экспрессии, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, функционально связана с дополнительными сегментами, необходимыми для транскрипции нуклеотидной последовательности. Вектор может быть получен из плазмиды или вирусной ДНК. Ряд подходящих векторов экспрессии для экспрессии в клеткаххозяевах, отмеченных в настоящем описании, являются коммерчески доступными или описаны в литературе.
Рекомбинантный вектор может, кроме того, содержать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицироваться в исследуемой клетке-хозяине. Примером такой последовательности (когда клетка-хозяин является клеткой млекопитающего) является точка начала репликации 8У40. Вектор может также содержать селектируемый маркер, например ген, продукт которого восполняет дефект клеткихозяина, такой как ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР), или такой, который придает устойчивость к препарату, например ампициллину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, неомицину, гидромицину или метотрексату.
Вектор может также содержать амплифицируемый ген, такой как ДГФР, так что клетки, несущие множественные копии амплифицируемого гена и фланкирующие последовательности, включая ДНК мутантного ФСГ, можно селектировать в соответствующей среде.
Также предлагается ДНК, кодирующая α-субъединицу мутанта ФСГ. Нуклеотидная последовательность, кодирующая субъединицы альфа и бета мутанта ФСГ, если она получена при помощи сайтнаправленного мутагенеза, синтеза, ПЦР или другими способами, может необязательно включать нуклеотидную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид. Сигнальный пептид может присутствовать в процессе секреции полипептида клетками, в которых он экспрессируется. Такой сигнальный пептид, если он присутствует, может распознаваться клеткой, выбранной для экспрессии полипептида. Сигнальный пептид может быть гомологичным (например, таким, который обычно связан с субъединицей чФСГ) или гетерологичным (т. е. происходящим из иного источника, чем чФСГ) полипептиду или может быть гомологичным или гетерологичным клетке-хозяину, т.е. представлять собой сигнальный пептид, обычно экспрессируемый клеткой-хозяином, или пептид, который обычно не экспрессируется клеткойхозяином.
Для получения полипептидов можно использовать любого подходящего хозяина, включая клетки или клеточные линии бактерий, грибов (включая дрожжи), растений, насекомых, млекопитающих или других подходящих животных, а также трансгенных животных или растений. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО), (например, СНО-КЬ; АТСС ССЬ-61), клеточные линии зеленой мартышки (СО8) (например, СО8 1 (АТСС СКВ1650), СО8 7 (АТСС СКЬ-1651)); клетки мышей (например, N810), клеточные линии почек новорожденного хомячка (ΒΙ-ΕΚ) (например, АТСС СКЬ-1632 или АТСС ССЬ-10) и клетки человека (например, ВЕК 293 (АТСС СКЬ-1573)), а также клетки растений в тканевой культуре. Дополнительные подходящие клеточные линии хорошо известны в данной области и доступны в открытых хранилищах, таких как Американское собрание культур штаммов, США. Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяев, происходящие от млекопитающих, включают опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, электропорацию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, опосредованную липосомами трансфекцию и вирусные векторы.
Клетки можно культивировать в питательной среде, подходящей для получения полипептида, способами, хорошо известными в данной области. Например, клетки можно культивировать при помощи культивирования во встряхиваемой колбе, маломасштабного или крупномасштабного культивирования (включая непрерывное, периодическое, периодическое с подпиткой или твердофазное культивирование)
- 5 013975 в лаборатории или промышленных ферментерах, проводимого в подходящей среде и в условиях, делающих возможными экспрессию и/или выделение полипептида. Культивирование проводят в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, способами, хорошо известными в данной области. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах Американского собрания культур штаммов).
Если полипептид секретируется в питательную среду, то его можно выделить непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется, то его можно выделить из клеточных лизатов. Одним способом получения мутантов ФСГ по настоящему изобретению с высоким выходом является получение посредством применения амплификации дигидрофолатредуктазы (ДГФР) в клетках СНО, дефектных по ДГФР, с применением последовательно возрастающего уровня метотрексата, как описано в патенте США № 4889803.
Полученный в результате мутантный полипептид ФСГ можно выделить способами, известными в данной области. Например, его можно выделить из питательной среды общепринятыми способами, включающими, но ими не ограничивающимися, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, сушку распылением, выпаривание или преципитацию. Мутантные полипептиды ФСГ могут быть очищены при помощи разнообразных способов, известных в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирование и размерноэксклюзионную), электрофоретические способы (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (например, фракционирование сульфатом аммония), ДСНПААГ или экстракцию.
Также предлагается фармацевтическая композиция, включающая мутант ФСГ. Такую фармацевтическую композицию можно применять для стимуляции фолликулогенеза, например, в сочетании со стимуляцией овуляции или вспомогательными репродуктивными технологиями (ВРТ). Поскольку мутант ФСГ по настоящему изобретению может эффективно стимулировать развитие и созревание многочисленных фолликул, то он может оказаться особенно эффективным для применения в ВРТ, при которых требуется получить много ооцитов.
Мутант ФСГ можно применять для стимуляции монофолликулогенеза для 01, или пауцифолликулогенеза (вплоть до приблизительно трех фолликул) для ВМО, для оплодотворения ίη νίνο. Монофолликулогенез можно также получить при помощи уменьшенной дозы мутанта ФСГ или менее частом применении по сравнению с общеупотребительными препаратами ФСГ. Например, при 01 препарат ФСГ по настоящему изобретению можно применять по 225-400 МЕ каждые три дня или в более низкой дозе, в зависимости от реакции пациента. За реакцией пациента можно следить с помощью сонографии.
Мутант ФСГ по настоящему изобретению можно применять в процедуре контролируемой овариальной гиперстимуляции (КОГ). Стандартные схемы применения для КОГ включают стадию отрицательной регуляции, на которой эндогенный лютеинизирующий гормон (ЛГ) подавляется путем применения агониста гонадотропин-высвобождающего гормона (ΟηΚΗ), за чем следует стадия стимуляции, на которой развитие фолликул (фолликулогенез) стимулируют посредством ежедневного применения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), обычно приблизительно по 150-225 МЕ/день. В ином случае стимуляция может быть начата с ФСГ после спонтанной или индуцированной менструации, за чем следует применение антагониста ΟηΚΗ (обычно начиная приблизительно с шестого дня стадии стимуляции). Когда появляются по меньшей мере 3 фолликулы >16 мм (одна 18 мм), может быть введен отдельный болюс чХГ (5-10000 МЕ), чтобы имитировать природный выброс ЛГ и стимулировать овуляцию. Образование ооцитов может происходить в течение 36-38 ч после введения чХГ.
Мутант ФСГ можно также применять для 01 и ВМО. Например, начало стимуляции с помощью ФСГ можно проводить после спонтанной или индуцированной менструации с ежедневной дозой 75-150 МЕ. Когда 1 или 3 фолликулы достигнут диаметра по меньшей мере 16 мм, то может быть введен отдельный болюс чХГ для стимуляции овуляции. Оплодотворение может быть произведено ίη νίνο путем обычного полового контакта или ВМО.
Поскольку мутант ФСГ может обладать увеличенным временем полужизни по сравнению с препаратами ФСГ дикого типа, в схемах применения, таких как описанная выше, можно использовать более низкие МЕ дозы ФСГ и/или их можно модифицировать, уменьшив период стимуляции с помощью ФСГ, при этом достигая такой же или лучшей реакции в отношении количества и жизнеспособности фолликул. Например, достаточный фолликулогенез может быть достигнут с ежедневными дозами, равными или приблизительно равными 50-150, 50-100 или 50-75 МЕ ФСГ. Дозирование ФСГ можно осуществлять на ежедневной или полуежедневной основе. Период дозирования может составлять меньше или приблизительно 14, 12, 11 или 10 дней. Для 01 препарат мутанта ФСГ можно применять в дозах 25-150 или 50125 МЕ ФСГ/день. Для лечения мужского бесплодия препарат мутанта ФСГ можно применять в количестве 3-х 150-300 МЕ в неделю, до тех пор, пока сперматогенез не достигнет уровня, достаточного для оплодотворения, или посредством обычных половых отношений, или технологии ВРТ.
Из-за более продолжительного времени полужизни мутантного ФСГ его можно применять в качестве препарата пролонгированного действия, который можно применять менее часто, чем каждые два
- 6 013975 дня. Обычный ФСГ можно применять в количестве, равном или приблизительно равном 300 МЕ каждый второй день, достигая тех же результатов, что и при применении каждый день в количестве, равном или приблизительно равном 150 МЕ. Мутантный ФСГ можно применять каждые 3, 4, 5, 6 или 7 дней, достигая тех же или лучших результатов, что и при ежедневном применении обычного ФСГ.
Мутант ФСГ можно применять для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, нарушений или патологических состояний. В другом аспекте полипептид или фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением применяют в способе лечения млекопитающего, в частности человека, включающем введение млекопитающему, при необходимости, таких полипептида или фармацевтической композиции.
Специалисту в данной области ясно, что эффективное количество полипептида, препарата или композиции зависит помимо прочего от заболевания, дозы, графика применения, того, применяют ли полипептид или препарат, или композицию отдельно или в сочетании с другими терапевтическими средствами, времени полужизни композиций в сыворотке и общего состояния здоровья пациента. Обычно эффективная доза препарата или композиции достаточна для того, чтобы гарантировать терапевтический эффект.
Мутант ФСГ можно применять в композиции, включающей один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Фармацевтически приемлемый обозначает носитель или эксципиент, который не оказывает никаких нежелательных воздействий на пациентов, у которых он используется. Такие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны в данной области, и полипептид может быть включен в фармацевтические композиции благодаря хорошо известным способам (см., например, РеттдЮп'к Рйагтасеибса1 8с1епсек, 18111 οάίΐίοη. А. В. Оепиаго, Еб., Маск РиЫкЫид Сотрапу (1990); Рйаттасеибса1 Ротти1абоп Оеуе1ортеп1 οί Рерббк апб Рго1ешк, 8. Ргок)аег апб Ь. Ноудаатб, Ебк., Тау1ог & Егапак (2000); апб НапбЬоок ок Рйаттасеибса1 Ехс1р1еп1к, 3гб ебйюп, А. К1ЬЬе, Еб., Рйагтасеибса1 Ргекк (2000)). Фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые можно применять в композициях, содержащих полипептид, включают, например, буферные вещества, стабилизаторы, консерваторы, изотонирующие средства, неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (увлажняющие средства), антиоксиданты, наполняющие средства или наполнители, хелатирующие агенты и сорастворители.
Фармацевтическая композиция, содержащая мутант ФСГ, может быть составлена в различных формах, включая жидкости, например готовые к применению растворы или суспензии, гели, лиофилизированную или любую другую подходящую форму, например порошок или кристаллы, подходящие для получения раствора. Форма композиции может зависеть от конкретных показаний к лечению и ясна для специалиста в данной области.
Фармацевтическая композиция, содержащая мутант ФСГ, может применяться внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, сублингвально, буккально, интраназально, трансдермально, путем ингаляции или любым другим приемлемым способом, например, при помощи технологии Ро\\бег1ес1 или РтоЬеаке или системы для впрыскивания карандашного типа. Способ применения может зависеть от конкретных показаний к лечению и будет ясен специалисту в данной области. Композицию можно применять подкожно, что может позволить пациенту проводить самовведение.
Фармацевтические композиции можно применять в сочетании с другими терапевтическими средствами. Эти средства могут быть введены в ту же самую фармацевтическую композицию как ее часть или могут применяться отдельно от полипептидов, или одновременно, или в соответствии с любым другим приемлемым графиком лечения. Кроме того, полипептид, препарат или фармацевтическая композиция могут применяться в качестве вспомогательного вещества к другим способам лечения.
Настоящее изобретение включает многочисленные аспекты, иллюстрируемые следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Мутанты ФСГ
Кристаллическую трехмерную структуру ФСГ человека использовали, для того чтобы определить участки молекулы ФСГ, в которых можно вставить возможный сайт гликозилирования. В каждой асимметричной единице кристаллической структуры присутствуют две молекулы ФСГ (четыре субъединицы). Две молекулы ФСГ наложили и сравнили, причем каждый остаток визуально исследовали, для того чтобы определить возможные участки, где можно вставить сайт Ν-гликозилирования, не нарушив при этом соответствующую укладку полипептида ФСГ или не уменьшив активность ФСГ. Кристаллографическую структуру ФСГ объединили со знаниями о взаимодействии ФСГ/ФСГР рецептора, для того чтобы облегчить выбор возможных сайтов Ν-гликозилирования. Принципиальными критериями конструирования были минимизация нарушения трехмерной структуры, минимизация нарушения расчетных сайтов связывания и активации и прогнозируемой трехмерной структуры, совместимой с гликозилированием. На основании вышеуказанных критериев были получены следующие два вставочных мутанта αсубъединицы ФСГ:
- 7 013975
| № | Мутация | ЗЕО Ю ΝΟ |
| 1 | вставка СМЕТ | 4 |
| 2 | вставка СИРТ | 5 |
Пример 2. Морфологический анализ мутантов ФСГ
Аликвоты концентрированного культурального супернатанта от транзиторной экспрессии мутантов 1-2 α-субъединицы ФСГ анализировали посредством ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях, что позволяет отделить интактные гетеродимеры ФСГ от свободных α- и β-субъединиц. Путем сравнения наблюдаемых молекулярных весов каждого мутантного гетеродимера с молекулярным весом ФСГ дикого типа можно определить, является ли мутантный ФСГ гипергликозилированным по отношению к ФСГ дикого типа. Коротко говоря, после электрофореза белки электрофоретически переносили на ПВДФ и визуализировали при помощи антитела 8егоио 9-14, направленного против α-субъединицы ФСГ. В качестве контроля также анализировали ФСГ человека дикого типа, мутантный СМ1, ФСГ-СТР и Гонал Ф. В табл. 1 показан наблюдаемый молекулярный вес гетеродимера, образованного мутантами αсубъединицы и β-субъединицы дикого типа, рассчитанный по стандартам молекулярного веса.
Таблица 1
| Образец | Мг (кДа) | Кратность концентр ации |
| ФСГ-СТР | 45,244 | |
| Гонал Ф | 38,482 | 37х |
| Вставка СМЕТ | 49, 375 | Збх |
| Вставка ΟΝΚΤ | 49,172 | 35х |
| СМ1 | 46,202 | 40х |
| ФСГ д.т. | 45,083 | 36х |
Как показано в табл. 1, каждый из двух экспрессируемых мутантов ФСГ, т.е. со вставками ΟΝΕΤ и ΟΝΚΤ, демонстрирует увеличенную степень гликозилирования, что доказывает сдвиг распределения наблюдаемого молекулярного веса гетеродимера по сравнению с ФСГ человека дикого типа.
Пример 3. Функционирование мутантов ФСГ ίη νίίτο
Для того чтобы определить активность мутантов ФСГ, каждый мутант тестировали на способность стимулировать производство цАМФ в клеточной линии СНО, которая рекомбинантно экспрессирует рецептор ФСГ человека. Клетки СНО-ФСГР выдерживали в ФСГР среде для выращивания [МЕМ α(-) (С1Ьео, каталожный № 12561-056)+10% диализированной БВ8 (С1Ьео, каталожный № 26300-020)4-600 мкг/мл генетицина (С1Ьео, каталожный №10131-035)+0,02 мкМ МТХ]. Клетки СНО-ФСГР посеяли по 2х104 клеток на лунку в 100 мкл на лунку (2х106 клеток/10 мл=1 планшет) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч до анализа. Клетки использовали для анализа, если по меньшей мере 70% сливались.
Производили 12-кратное последовательное разбавление 1:3, начиная с 67,5 нМ, для всех образцов и внутреннего стандарта (в качестве внутреннего стандарта применяли Гонал Ф). Все разбавления проводили в среде для анализа [ΌΜΕΜ/Ρ12 (без фенола, С1Ьео, каталожный № 11039-021)+1 мг/мл БСА (8щша. А-6003)+0,1 мМ ИБМК (ингибитор фосфодиэстеразы 3-изобутил-1-метилксантин, 81дша, каталожный № 1-7018)]. Среду для выращивания удаляли из планшета для анализа, добавляли 25 мкл среды для анализа (дополненной набором МА6000 сАМР Μ8Ό, Мезо 8са1е ^^зсονе^у, ОаййегзЬигд, ΜΌ), планшет возвращали и инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Затем в лунки добавляли по 25 мкл на лунку тестируемого образца, перемешивали, планшет возвращали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После 1 ч инкубации образец и среду удаляли из лунок. Затем добавляли 25 мкл стандартного лизирующего буфера (дополненного набором МА 6000 Мезо 8са1е ^^зсονе^у) в каждую лунку, планшет закрывали с помощью приспособления для заклеивания планшетов (Раскагб, каталожный № 6005185) и встряхивали в течение 5 мин. После 5-минутной лизирующей инкубации 25 мкл лизированного клеточного материала переносили в планшет сАМР Мезо 8са1е ^^зсονе^у (дополненный набором МА6000 М8Э) и инкубировали при осторожном встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли 25 мкл конъюгата цАМФ-АР в каждую лунку и перемешивали. Затем добавляли по 25 мкл антитела против цАМФ в каждую лунку, планшет закрывали с помощью приспособления для заклеивания планшетов и встряхивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем планшет промывали шесть раз в автоматической машине для мойки планшетов с помощью 350 мкл на лунку буфера для промывания. Затем добавляли 100 мкл усилителя субстрата 8аррЫге II КТИ (готового к использованию) в каждую лунку, планшет закрывали с помощью приспособления для заклеивания планшетов и инкубировали в течение 30 мин в темноте при 25°С. Затем планшет считывали со скоростью 1 с на лунку, причем низкий уровень цАМФ давал высокий сигнал, а высокий уровень цАМФ давал низкий сигнал. Кривые дозовой зависи
- 8 013975 мости мутантов ФСГ показаны на фиг. 2. Значения ЕС50 были вычислены и показаны в табл. 2.
Как показано на фиг. 2 и в табл. 2, каждый из мутантов ФСГ обладает активностью ίη νίίτο, сравнимой с активностью ФСГ дикого типа.
Таблица 2
| Образец | ЕС5о, М |
| ФСГ дикого типа | 2,16Е-10 |
| Клон ЮС - α ΟΝΚΤ/β СМ1 | 2,58Е-Ю |
| Клон 11С - а ΟΝΕΤ/β СМ1 | 2,78Е-10 |
Пример 4. Время полужизни мутантов ФСГ ίη νίνο
Две различные партии мутанта ΟΝΕΤ и мутанта ΟΝΚΤ анализировали в отдельных фармакокинетических (ФК) исследованиях. Два исследования были проведены по одной схеме: 33 неполовозрелых самки крысы 8Ό возраста 21 день (вес тела приблизительно 40 г; Сйаг1ез Κίνβτ ЬаЬогаФпез, \νί1ιηίη§1οη. МА) случайным образом разделили на 5 экспериментальных групп (η=6) и 1 контрольную группу (η=3). Выбор неполовозрелых самок крысы основан на использовании данного возраста и пола для биологического определения активности ФСГ ίη νίνο. Животные в экспериментальных группах получали подкожные (п/к) инъекции по 4 мкг ΟΜ1 (контроль). мутанта ΟΝΕΤ. мутанта ΟΝΚΤ или 8 мкг Гонала-Ф рчФСГ (контроль). Кровь из ретроорбитального синуса собирали через 0 ч у контрольной группы и через 1. 2. 4.
6. 10. 24. 48 и 72 ч у животных из экспериментальных групп (в один момент времени η=3; крыс заменяли так. чтобы они не отдавали кровь в 2 последовательных момента отбора проб). Приблизительно 0.1 мл крови собирали у каждой крысы за каждое кровопускание. плазму собирали и сохраняли при -80°С до тех пор. пока не проводили анализ с помощью ТИФА. Для измерения белков ФСГ в сыворотке в обоих исследованиях применяли анализ О8Б Б8Н Сοаΐеά Vе11 ЕБ18А (Όίαβηοδίίοδ 8уз1етз Ε;ώοπιΙοι^5. ’№еЬз1ет. ΤΧ). Каждый образец сыворотки анализировали в трех параллелях.
Время полужизни мутанта ΟΝΕΤ и мутанта ΟΝΚΤ составило приблизительно 17 ч. тогда как для контрольных ΟΜ1 и Гонала-Ф оно приблизительно составило. соответственно. 12 и 8 ч. Это указывает на то. что мутант ΟΝΕΤ и мутант ΟΝΚΤ обладают большим временем полужизни. чем ФСГ дикого типа.
Пример 5. Биологическая активность ίη νίνο
Ιη νίνο модель. использованная для того. чтобы определить биологическую активность мутантов ΟΝΚΤ и ΟΝΕΤ. представляет собой анализ увеличения веса яичников крыс. Обработка неполовозрелых самок крысы возраста 21 день ФСГ или молекулами с ФСГ-подобной активностью. например. мутантами ΟΝΚΤ и ΟΝΕΤ. вызывает рост овариальных фолликул и производство ооцитов. Данный рост легко может быть детектирован при помощи измерения веса яичников в конце периода обработки. В данной модели тестируемую субстанцию вводят при помощи инъекции в течение трех дней. яичники собирают и взвешивают после последней дозы. Данный анализ применяли в течение нескольких десятилетий как основу для установления ФСГ-активности для клинических продуктов в целях классификации. Он измеряет соответствующее физиологическое действие ФСГ и прямо коррелирует с эффективностью продуктов в клинике.
Ιη νίνο активность мутантов ΟΝΚΤ и ΟΝΕΤ сравнивали с активностью ФСГ дикого типа. Все дозы определяли на основании расчетной эквивалентности ФСГ. принимая в расчет активность ίη νίίτο и время полужизни в крысах. Было обнаружено. что мутанты ΟΝΚΤ и ΟΝΕΤ обладают высокой ФСГактивностью с величиной. близкой к ФСГ дикого типа.
- 9 013975
Список последовательностей
| <110> | Αρρίιβά РезеагсЬ | ЗузЬетз | ||||
| <120> | Мутанты ФСГ | |||||
| <130> | 1115 | ИО | ||||
| <160> | 5 | |||||
| <170> | РаСепЫп | уегзюп | 3.3 | |||
| <210> <211> <212> е213> | 1 52 БЕЛОК Нота еархепз | |||||
| <400> | 1 | |||||
| А1а Рго 1 | ι Азр | Ча1 | 61п 5 | Азр | Суз | Рго |
| РЬе РЬе | 5ег | (31п 20 | Рго | С1у | А1а | Рго |
| РЬе Зег | Агд 35 | А1а | Туг | Рго | ТЬг | Рго 40 |
| Уа1 61п 50 | ι Ьуз | Азп | Уа1 | ТЬг | Зег 55 | С1и |
| Туг Азп 65 | . Агд | ча1 | ТЫ | Ча1 70 | МеС | С1у |
| А1а Суа | ΗΪ3 | Суз | Зег 85 | ТЬг | Суз | Туг |
| <210> <211> <212> <213> | 2 111 БЕЛОК Ното зархепз | |||||
| <400> | 2 | |||||
| Азп Зег 1 | Суз | С1и | Ьеи 5 | ТЫ | Азп | 11е |
| Су5 Агд | РЬе | Суз 20 | 11е | Зег | 11е | Азп |
| Туг ТЬг | Агд 35 | Азр | Ьеи | Ча1 | Туг | Ьуз 40 |
| Ьуз ТЬг 50 | Суз | ТЬг | РЬе | Ьуз | О1и 55 | Ьеи |
АКЗ Но1<Нпд Ν.ν.
| С1и | Суз 10 | ТЬг | Ьеи | С1п | О1и | Азп 15 | Рго |
| 11е 25 | Ьеи | С1п | Суз | мен | <31у 30 | Суз | Суз |
| Ьеи | Агд | Зег | Ьуз | Ьуз 45 | ТЬг | МеЪ | Ьеи |
| Зег | ТЫ | Суз | Суз 60 | Уа1 | А1а | Ьуз | Зег |
| С1у | РЬе | Ьуз 75 | Уа1 | 61и | Азп | Н13 | ТЬг 80 |
| Туг | ΗΪ3 90 | Ьуз | Зег |
ТЬг Не А1а 11е 61и Ьуз 61и О1и
| 10 | 15 | ||||||
| ТЬг 25 | ТЬг | Тгр | Суз | А 1а | О1у 30 | Туг | Суз |
| Азр | Рго | А1а | Агд | Рсо 45 | Ьуз | Не | С1п |
| Уа1 | Туг | <31и | ТЬг 60 | Ча1 | Агд | Уа1 | Рго |
- 10 013975
| С1у 65 | Суз А1а | Н18 Н13 | А1а Азр Зег Ьеи Туг ТЬг | Туг | Рго Уа1 А1а | ТЬг 80 | |||||||||
| 70 | 75 | ||||||||||||||
| 61п | Суз | Н13 | Суз | 61у | Ьуз | Суз | Азр | Зег | АВр | Зег | ТЬг | Азр | Суз | ТЬг | Уа1 |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Агд | С1у | Ьеи | С1у | Рго | Зег | Туг | Суз | Зег | РЬе | 61у | С1и | ме£ | Ьуз | 01и | |
| 100 | 105 | 110 |
| <210> | 3 | |||||||||||||
| <211> | 111 | |||||||||||||
| <212> | БЕЛОК | |||||||||||||
| <213> | Искусственная | |||||||||||||
| <220> | ||||||||||||||
| <223> | бета | субъединица | мутанта | Ε55Ν/Υ57Τ | ||||||||||
| <400> | 3 | |||||||||||||
| Азп Зег | Суз | <31и | Ьеи | ТЬг | Азп | Не | ТЫ | Не | А1а | 11е | С1и | Ьуз | С1и | О1и |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Суз Агд | РЬе | Суз | Не | Зег | Не | АЗП | ТЫ | ТЫ | Тгр | Суз | А1а | <31у | Туг | Суз |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| г-ν, ъл | тг.. Ί | Г 1 т | 71 | Λ Ί | 7к | П»-л | т » »<-. | т1 | ||||||
| А XXX | Ах* Су | Азр | хи с и | ν ах | Туг | ыу 0 | XXV | ηχα | Г1Х у | XXV | XI2* о | XXV | ихл | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ьуз ТЬг | Суз | ТЬг | РЬе | Ьуз | Азп | Ьеи | ТЫ | Туг | 61и | ТЬг | Уа1 | Агд | Уа1 | Рго |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| С1у Суз | А1а | Н13 | Н15 | А1а | Азр | Зег | Ьеи | Туг | ТЫ | Туг | Рго | Уа1 | А1а | ТЬг |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
| <31п Суз | Н18 | Суз | <Э1у | Ьуз | Суз | Азр | Зег | Азр | Зег | ТЬг | Азр | Суз | ТЫ | Уа1 |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| Агд С1у | ьеи | С1у | Рго | Зег | Туг | Суз | Зег | РЬе | С1у | С1и | МеЬ | Ьуз | С1и | |
| 100 | 105 | НО |
<210> 4 <211. 96 <212 > БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<22 3> альфа субъединица мутанта со вставкой СМЕТ <400> 4
А1а Рго Азр С1у Азп РЬе ТЬг 7а1 <31п Азр Суз Рго С1и Суз 15 10
ТЬг Ьеи
- 11 013975
| СЬп СЬи | Азп Рго 20 | РЬе | РЬе Зег СЬп Рго СЬу АЬа 25 | Рго | I1е Ьеи 30 | СЬп | Суз | ||||||||
| Меб | СЬу | Суз | Суз | РЬе | Бег | Агд | АЬа | Туг | Рго | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | Зег | Ьуз |
| ЗБ | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ьуз | ТЬг | Меб | Ьеи | УаЬ | СЬп | Ьуз | Азп | УаЬ | ТЬг | Зег | СЬи | Зег | ТЬг | Суз | Суз |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| УаЬ | АЬа | Ьуз | Зег | Туг | Азп | Агд | УаЬ | ТЬг | УаЬ | Меб | СЬу | СЬу | РЬе | Ьуз | УаЬ |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| СЬи | АЗП | ΗΪ3 | ТЬг | АЬа | Суз | НЬз | Суз | Зег | ТЬг | Суз | Туг | Туг | НЬз | Ьуз | Зег |
| 85 | 90 | 95 |
<210> 5 <211> 96 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> альфа субъединица мутанта со вставкой СМЕТ <400? 5
| АЬа 1 | Рго Азр | СЬу Азп Агд 5 | ТЬг УаЬ | СЬп Азр Суз 10 | Рго СЬи Суз | ТЬг Ьеи 15 | |||||||||
| СЬп | СЬи | Азп | Рго | РЬе | РЬе | Зег | СЬп | Рго | СЬу | АЬа | Рго | Ые | Ьеи | СЬп | Суз |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| МеС | СЬу | Суз | Суз | РЬе | Зег | Агд | АЬа | Туг | Рго | ТЬг | Рго | ьеи | Агд | Зег | Ьуз |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ьуз | ТЬг | меь | ьеи | УаЬ | СЬп | Ьуз | Азп | УаЬ | ТЬг | Зег | СЬи | Зег | ТЬг | Суз | Суз |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| УаЬ | АЬа | Ьуз | Зег | Туг | АЗП | Агд | УаЬ | ТЬг | УаЬ | меб | СЬу | 51У | РЬе | ьуз | УаЬ |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| СЬи | Азп | НЬз | ТЬг | АЬа | Суз | НЬз | Суз | Зег | ТЬг | Суз | Туг | Туг | НЬз | Ьуз | зег |
| 85 | 90 | 95 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (18)
1. Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантную α-субъединицу ФСГ, где α-субъединица содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕР ΙΌ Ν0:4-5.
2. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1.
3. Вектор по п.2, который представляет собой вектор экспрессии.
4. Вектор по п.2, дополнительно содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую β-субъединицу ФСГ, содержащую последовательность БЕр ΙΌ Ν0:3.
5. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.2.
6. Клетка-хозяин по п.5, которая представляет собой клетку млекопитающего.
7. Мутантный ФСГ, в котором β-субъединица содержит последовательность ΙΌ Ν0:3 и αсубъединица кодируется нуклеиновой кислотой по п.1 и содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из БЕр ΙΌ Ν0:4-5.
8. Мутантный ФСГ по п.7, в котором любые из 1-6 остатков аспарагина гликозилированы.
9. Мутантный ФСГ по п.7, в котором α-субъединица содержит последовательность ΙΌ Ν0:4, в которой Ν5 гликозилирован.
10. Мутантный ФСГ по п.7, в котором α-субъединица содержит последовательность БЕр ΙΌ Ν0:5,
- 12 013975 в которой N5 гликозилирован.
11. Способ получения мутантного ФСГ, включающий:
(a) получение клетки, содержащей нуклеиновую кислоту по п.1 и нуклеиновую кислоту, кодирующую β-субъединицу ФСГ, содержащую 8ЕО ГО N0:3;
(b) культивирование клетки в условиях, которые делают возможной экспрессию первой и второй нуклеиновых кислот;
(c) получение мутантного ФСГ.
12. Способ по п.11, в котором клетка способна гликозилировать белок.
13. Способ по п.11, в котором клетка содержит один вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.1 и нуклеиновую кислоту, кодирующую β-субъединицу ФСГ, включающую 8Е0 ГО N0:3.
14. Способ по п.11, в котором клетка содержит вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.1, и, кроме того, содержит второй вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую βсубъединицу ФСГ, включающую 8Е0 ГО N0:3.
15. Фармацевтическая композиция, включающая мутантный ФСГ по п.7 и, при необходимости, фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
16. Способ лечения инфертильных млекопитающих, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в указанном лечении, фармацевтической композиции по п.15.
17. Способ стимуляции фолликулогенеза у млекопитающих, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в указанной стимуляции, фармацевтической композиции по п.15.
18. Способ индукции овариальной гиперстимуляции у млекопитающих, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в указанной индукции, фармацевтической композиции по п.15.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75363705P | 2005-12-22 | 2005-12-22 | |
| PCT/US2006/048898 WO2008010840A2 (en) | 2005-12-22 | 2006-12-21 | Fsh mutants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200870108A1 EA200870108A1 (ru) | 2009-12-30 |
| EA013975B1 true EA013975B1 (ru) | 2010-08-30 |
Family
ID=38875495
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200870108A EA013975B1 (ru) | 2005-12-22 | 2006-12-21 | Мутантный fsh и способы его применения |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7740862B2 (ru) |
| EP (1) | EP1976872B1 (ru) |
| JP (1) | JP5249044B2 (ru) |
| KR (1) | KR20080087854A (ru) |
| CN (1) | CN101341169B (ru) |
| AR (1) | AR058615A1 (ru) |
| AU (1) | AU2006346358B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0620223A2 (ru) |
| CA (1) | CA2630857A1 (ru) |
| EA (1) | EA013975B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP088646A (ru) |
| ES (1) | ES2543198T3 (ru) |
| IL (1) | IL192096A (ru) |
| MX (1) | MX2008008322A (ru) |
| MY (1) | MY145839A (ru) |
| NZ (1) | NZ568475A (ru) |
| UA (1) | UA93893C2 (ru) |
| WO (1) | WO2008010840A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200804677B (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509121B (zh) | 2012-11-22 | 2015-01-28 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途 |
| KR101947340B1 (ko) * | 2017-05-05 | 2019-02-12 | 주식회사 유비프로틴 | FSHα 반감기를 증가시키는 방법 |
| KR101947341B1 (ko) * | 2017-05-05 | 2019-02-12 | 주식회사 유비프로틴 | FSHβ 반감기를 증가시키는 방법 |
| CN114213523B (zh) * | 2021-11-15 | 2024-07-09 | 广州源博医药科技有限公司 | 一种用于重组蛋白的高糖基化修饰序列及其重组猪促卵泡激素和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991016922A1 (en) * | 1990-05-08 | 1991-11-14 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Analogs of glycoprotein hormones having altered immunological characteristics, efficacy and/or receptor specificity |
| WO2001058493A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | Conjugates of follicle stimulating hormones |
| WO2004050679A2 (en) * | 2001-10-22 | 2004-06-17 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Mutant glycoproteins |
| WO2005020934A2 (en) * | 2003-09-02 | 2005-03-10 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Fsh glycosylation mutant |
| WO2007084441A2 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Laboratoires Serono S.A. | Novel fsh glycosylation variant d3n |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9403600D0 (en) * | 1994-02-24 | 1994-04-13 | Univ Glasgow | Three dimensional hormone structure |
| RU2006136919A (ru) * | 2004-03-19 | 2008-04-27 | Трофоджен, Инк. (Us) | Суперагонисты фолликулостимулирующего гормона |
-
2006
- 2006-12-21 ES ES06851498.3T patent/ES2543198T3/es active Active
- 2006-12-21 EA EA200870108A patent/EA013975B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-12-21 AR ARP060105722A patent/AR058615A1/es not_active Application Discontinuation
- 2006-12-21 CA CA002630857A patent/CA2630857A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-21 BR BRPI0620223-3A patent/BRPI0620223A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-12-21 KR KR1020087018024A patent/KR20080087854A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-12-21 UA UAA200808445A patent/UA93893C2/ru unknown
- 2006-12-21 NZ NZ568475A patent/NZ568475A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-12-21 JP JP2008547571A patent/JP5249044B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-21 CN CN2006800481289A patent/CN101341169B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-21 AU AU2006346358A patent/AU2006346358B2/en not_active Ceased
- 2006-12-21 US US12/096,125 patent/US7740862B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-21 EP EP06851498.3A patent/EP1976872B1/en active Active
- 2006-12-21 MX MX2008008322A patent/MX2008008322A/es active IP Right Grant
- 2006-12-21 WO PCT/US2006/048898 patent/WO2008010840A2/en active Application Filing
- 2006-12-21 ZA ZA200804677A patent/ZA200804677B/xx unknown
- 2006-12-21 MY MYPI20082262A patent/MY145839A/en unknown
-
2008
- 2008-06-12 IL IL192096A patent/IL192096A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-07-22 EC EC2008008646A patent/ECSP088646A/es unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991016922A1 (en) * | 1990-05-08 | 1991-11-14 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Analogs of glycoprotein hormones having altered immunological characteristics, efficacy and/or receptor specificity |
| WO2001058493A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | Conjugates of follicle stimulating hormones |
| WO2004050679A2 (en) * | 2001-10-22 | 2004-06-17 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Mutant glycoproteins |
| WO2005020934A2 (en) * | 2003-09-02 | 2005-03-10 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Fsh glycosylation mutant |
| WO2007084441A2 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Laboratoires Serono S.A. | Novel fsh glycosylation variant d3n |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FURUHASHI M. ET AL.: "Effect of additional N-glycosylation signal in the N-terminal region on intracellular function of the human gonadotropin alpha-subunit", ENDOCRINE JOURNAL, TOKYO, JP, vol. 50, no. 3, June 2003 (2003-06), pages 245-253, XP002439749, ISSN: 0918-8959, the whole document * |
| PERLMAN S. ET AL.: "Glycosylation of an N-terminal extension prolongs the half-life and increases the in-vivo activity of follicle stimulating hormone", JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, ENDOCRINE SOCIETY, CHEVY CHASE, MD, US, vol. 88, no. 7, July 2003 (2003-07), pages 3227-3235, XP002390383, ISSN: 0021-972X, the whole document * |
| WEENEN C. ET AL.: "Long-acting follicle-stimulating hormone analogs containing N-linked glycosylation exhibited increased bioactivity compared with 0-linked analogs in female rats", JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, ENDOCRINE SOCIETY, CHEVY CHASE, MD, US, vol. 89, no. 10, October 2004 (2004-10), pages 5204-5212, 5196, XP002439750, ISSN: 0021-972X, the whole document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101341169B (zh) | 2012-09-05 |
| AU2006346358B2 (en) | 2012-01-19 |
| BRPI0620223A2 (pt) | 2011-11-01 |
| WO2008010840A2 (en) | 2008-01-24 |
| JP5249044B2 (ja) | 2013-07-31 |
| US7740862B2 (en) | 2010-06-22 |
| ECSP088646A (es) | 2008-08-29 |
| EA200870108A1 (ru) | 2009-12-30 |
| ES2543198T3 (es) | 2015-08-17 |
| IL192096A0 (en) | 2008-12-29 |
| AR058615A1 (es) | 2008-02-13 |
| JP2009521222A (ja) | 2009-06-04 |
| UA93893C2 (en) | 2011-03-25 |
| EP1976872A2 (en) | 2008-10-08 |
| CA2630857A1 (en) | 2008-01-24 |
| NZ568475A (en) | 2010-10-29 |
| AU2006346358A1 (en) | 2008-01-24 |
| CN101341169A (zh) | 2009-01-07 |
| MY145839A (en) | 2012-04-30 |
| ZA200804677B (en) | 2009-10-28 |
| WO2008010840A3 (en) | 2008-03-20 |
| IL192096A (en) | 2012-02-29 |
| AU2006346358A2 (en) | 2008-07-31 |
| KR20080087854A (ko) | 2008-10-01 |
| MX2008008322A (es) | 2008-10-01 |
| US20090018070A1 (en) | 2009-01-15 |
| EP1976872B1 (en) | 2015-06-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2017513853A (ja) | 改良された組換えヒト卵胞刺激ホルモンを用いた制御された卵巣過剰刺激 | |
| CN107405385A (zh) | 用于治疗不育的组合物 | |
| US7956034B2 (en) | FSH glycosylation variant D3N | |
| EA013975B1 (ru) | Мутантный fsh и способы его применения | |
| RU2668174C2 (ru) | Суперагонисты гликопротеинового гормона длительного действия | |
| EA012175B1 (ru) | Рекомбинантный мутантный fsh, способ его получения, композиция, содержащая мутантный fsh, и способы лечения бесплодия, стимуляции фолликулогенеза и индукции гиперстимуляции яичников у млекопитающего | |
| CN103619358A (zh) | 药物制剂 | |
| JP4310275B2 (ja) | 変異体糖タンパク質 | |
| ES2353432T3 (es) | Nueva variante de glicosilación d3n de la fsh. | |
| Jiang et al. | Muda et al. | |
| MX2008009199A (en) | Novel fsh glycosylation variant d3n | |
| CN102549011B (zh) | 包含重组hcg的药物制剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |