CN101341169A - Fsh突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了具有附加糖基化和更长半衰期的FSH突变体。还描述了FSH突变体诱导人类患者卵泡生成的用途。

Description

FSH突变体
技术领域
本发明涉及人类生殖领域。更具体地说，本发明涉及生育治疗。
发明背景
促性腺激素
卵泡刺激素(FSH)是促性腺激素家族的一员，促性腺激素在人类生育中起着关键作用。促性腺激素，也包括黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)，是异源二聚体，每个分子由一个共有的α-亚基(92个氨基酸)和一个特有的β-亚基(FSH是111个氨基酸)组成。成熟型FSHα-亚基和β-亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
已经从垂体和绝经后尿液中分离出人FSH(EP 322,438)并在哺乳动物细胞中重组生产(US 5,639,640、US 5,156,957、US 4,923,805、US 4,840,896、US 5,767,251、EP 211,894和EP 521,586)。后者文献中也公开了人FSHβ-亚基基因。US 5,405,945公开了一种只含有一个内含子的改构人α-亚基基因。
Liu等人，J Biol Chem 1993，15；268(2)：21613-7，Grossmann等人，Mol Endocrinol1996 10(6)：769-79，Roth and Dias(Mol Cell Endocrinol 1995 1；109(2)：143-9，Valove等人，Endocrinology 1994；135(6)：2657-61，Yoo等人，JBiol Chem 1993 25；268(18)：13034-42)，US 5,508,261和Chappel等人，1998，Human Reproduction，13(3)：1835公开了FSH各种结构-功能关系研究，并且鉴定了参与受体结合和激活以及二聚作用的氨基酸残基。
促性腺激素在辅助生殖技术中的应用
促性腺激素在生殖周期中起着关键作用，在外源性治疗中使用促性腺激素对于辅助生殖技术(ART)也是必不可少的，这些辅助生殖技术例如体外授精(IVF)、IVF联合胞浆内精子注射(IVF/ICSI)和胚胎移植(ET)以及排卵诱导(OI)，OI用于进行自然体内授精或宫腔内人工授精的无排卵患者。
US 4,589,402和US 4,845,077公开了纯化的不含LH的人FSH及其在体外授精中的应用。EP 322 438公开了一种基本上没有LH活性，具有至少6200 U/mg FSH活性的蛋白，其中FSHα-亚基和β-亚基，可能分别是其野生型或截短型。
为了获得治疗效果需要长期治疗，通常，为了刺激女性卵泡发生需要连续8-10天，有时高达21天，而对于低促性腺激素的男性，诱导精子发生需要高达18个月。重组hFSH通常是每天肌肉注射(i.m.)或皮下注射(s.c.)给药，伴生不适并可能产生局部注射部位反应。减少给药频率可促进治疗，使促性腺腺激素给药更方便、更易耐受、更为患者至上。
FSH糖基化
促性腺激素是糖蛋白，每个亚基含有天冬酰胺连接(N-连接)寡糖侧链，该寡糖侧链对于体内活性和功能非常重要。多肽的糖添加(糖基化)是翻译后事件，能使糖链特异性地添加到天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸(O-连接)上。和糖蛋白的蛋白部分不变的氨基酸序列相比，糖结构是可变的，这种特性称之为微异质性。例如，同一蛋白的各个N-糖基化位点可以含有不同的糖结构。而且，即便在某一蛋白的同一糖基化位点，也可能有不同的糖结构。这种异质性是糖非模板引导合成的结果。
蛋白的N-糖基化特异性地发生在一致型模式天冬酰胺-Xaa-丝氨酸/苏氨酸(Asn-Xaa-Ser/Thr)，较少发生在一致型模式天冬酰胺-Xaa-半胱氨酸(Asn-Xaa-Cys)，其中Xaa可以是任何氨基酸残基。然而，一致型三肽的存在并不足以保证天冬酰胺残基糖基化。例如，天冬酰胺-脯氨酸-丝氨酸/苏氨酸(Asn-Pro-Ser/Thr)序列比其他一致型模式Asn-Xaa-Ser/Thr发生N-糖基化率低50倍。
人FSH含有4个N-连接糖基化位点：2个在共有的α-亚基的52位和78位，2个在β-亚基的7位和24位。附加到FSHα-亚基的糖对于二聚体的组装、整合、分泌和信号转导非常关键，而β-亚基糖对于二聚体聚合、分泌和异源二聚体从循环中清除则非常重要。
Galway等人，Endocrinology 1990；127(1)：93-100证实，N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-ICHO细胞系或唾液酸运输缺陷的CHO细胞系产生的FSH突变体，和野生型细胞分泌的或纯化的垂体FSH具有相同的体外活性，但是却没有体内活性，推测是由于糖基化不良的变异体在血清中清除非常迅速。D′Antonio等人，Human Reprod1999；14(5)：1160-7描述了血循环中不同的FSH同工型(isoform)。这些同工型具有相同的氨基酸序列，但翻译后修饰程度不同。据发现，和酸性同工型相比，酸性较弱的同工型体内清除更快，可能是由于同工型间的唾液酸含量不同。另外，Bishop等人Endocrinology 1995；136(6)：2635-40总结，循环半衰期似乎是体内活性的主要决定因素。这些观察导致一种假设，即可以通过引入额外的糖基化位点来提高多肽的唾液酸含量，以延长FSH的半衰期。
FSH变异体
通过将人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)融合到天然重组人FSH(rhFSH)上，开发出了具有更长半衰期的FSH激动剂。羧基末端肽(CTP)基团由112-118到145位氨基酸组成，具有位于121、127、132和138位的4个O-连接糖基化位点。US 5,338,835和US 5,585,345公开了一种改构的FSHβ-亚基，其C-末端谷氨酸(Glu)以hCG的CTP基团延长。据称，得到的改构类似物有天然FSH的生物活性，但却具有较长的循环半衰期。US 5,405,945公开hCGβ-亚基的羧基末端部分或其变异体对于CG、FSH和LH的清除具有重要影响。
US 5,883,073公开了具有CG、TSH、LH和FSH激动剂或拮抗剂活性的并由两个α-亚基组成的单链蛋白。US 5,508,261公开了具有LH和FSH受体结合亲和力的异源二聚体多肽，它含有一个糖蛋白激素α-亚基和一个非天然产生的β-亚基多肽，其中，β-亚基多肽是含有4个合拼亚序列的氨基酸链，该亚序列选自一组特异性序列。Klein等人(2003)公开了一种单链的、半衰期延长的FSH类似物，其中α-和β-亚基通过一个寡肽相连，该寡肽含有两个N-连接糖基化位点。
为了改善FSH的体内半衰期，WO 01/58493公开了可以在FSH的α-亚基进行的77种突变和可以在FSH的β-亚基进行的51种突变。另外，WO 01/58493还公开了可以在FSH的N-末端增加，或者FSH多肽不同位点内插入一个或多个糖基化位点，以改善其半衰期。WO 01/58493虽然描述了糖基化位点可以插入FSH多肽，但是对于在哪个(哪些)位点插入糖基化位点，却仍能保持FSH活性没有给出指导。WO 01/58493进一步公开了突变型α-和β-亚基可以单独(1个额外的糖基化位点)或联合使用(2个额外的糖基化位点)。已经被鉴定的128个候选突变体，是使用FSH三维(3D)结构的50个模型鉴定的，该模型仅仅基于hCG的结构和FSH与hCG的序列比对产生，而hCG和FSH的β-亚基只有32％的一致性。WO 01/58493没有公开通过定点突变而引入糖基化位点的任何FSHα-或β-亚基的生产或测定情况。
WO 05/020934公开了其中FSH的α-和β-亚基都有突变的GM1，包括一个βE55N/V57T的双突变，即氨基酸位点55位的谷氨酸(E)残基突变成天冬酰胺(N)并且氨基酸位点57位的缬氨酸(V)残基突变成苏氨酸(T)。βE55N/V57T的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
临床上需要一种产品，能够提供FSH的部分或全部治疗相关的效果，可以比现有的FSH产品更低频次给药，并且优选地，和现有治疗可达到的循环FSH活性相比，可以提供更稳定的活性水平。
本发明旨在提供这类产品以及这类产品的制备方法。
发明内容
本发明涉及突变的FSH分子，其中FSHα-亚基含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列，并且其中FSHβ-亚基含有序列SEQ ID NO：3。FSH可以是所述的突变体的0、1、2、3、4、5或6位天冬酰胺残基N-糖基化。在一个实施方式中，突变体α-亚基SEQ ID NOS：4的N5可以是糖基化的。在另一个实施方式中，突变体α-亚基SEQ IDNOS：5的N5可以是糖基化的。在一个实施方式中，突变体β-亚基SEQ ID NOS：3的N55可以是糖基化的。
本发明还涉及一种分离的DNA分子，该DNA分子编码含有选自SEQ IDNOS：4-5序列的FSHα-亚基突变体。本发明也涉及一种分离的DNA分子，该DNA分子编码含有SEQ ID NO：3序列的FSHβ-亚基。
本发明还涉及一种载体，该载体含有编码含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列的FSHα-亚基突变体的DNA。该载体可以是表达载体。
本发明还涉及一种载体，该载体含有编码含SEQ ID NOS：3序列的FSHβ-亚基突变体的DNA。该载体可以是表达载体。
本发明还涉及一种载体，该载体含有第一DNA和第二DNA，其中第一DNA编码含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列的FSHα-突变体，并且其中第二DNA编码含有SEQ ID NOS：3序列的FSHβ-突变体。该载体可以是表达载体。
本发明还涉及一种细胞，该细胞含有编码含选自SEQ ID NOS：4-5的序列的FSHα-突变体的DNA的载体。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还涉及一种细胞，该细胞含有编码含SEQ ID NOS：3序列的FSHβ-突变体的DNA的载体。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还涉及一种细胞，该细胞含有含第一DNA和第二DNA的载体，其中第一DNA编码含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列的FSHα-突变体，并且其中第二DNA编码含SEQ ID NOS：3序列的FSHβ-突变体。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还涉及一种细胞，该细胞含有含第一和第二载体，其中第一载体含编码选自SEQ ID NOS：4-5的序列的FSHα-突变体的DNA，并且其中第二载体含有编码含SEQ ID NOS：3序列的FSHβ-突变体的DNA。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还涉及一种FSH突变体的生产方法，包括培养能糖基化蛋白的哺乳动物细胞，其中所述的细胞含有第一表达载体，该载体含编码含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列的FSHα-突变体的DNA，以及第二表达载体，该载体含有编码含SEQ IDNOS：3序列的FSHβ-突变体的DNA。在本发明的另一个实施方式中，所述的细胞含有单一的载体，该载体含有编码选自SEQ ID NOS：4-5的序列的FSHα-突变体的DNA，还进一步含有编码含有SEQ ID NOS：3序列的FSHβ-突变体的DNA。
本发明还涉及一种组合物，该组合物含有FSH突变体和药学可接受的载体或赋形剂，其中FSHα-亚基包括选自SEQ ID NOS：4-5的序列，并且其中FSHβ-突变体含有SEQ ID NO：3。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物不育的方法，包括在需要时给予哺乳动物有效量的FSH突变体的步骤，其中FSHα-亚基含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列，并且其中FSHβ-突变体含有SEQ ID NO：3。
本发明还涉及一种刺激哺乳动物卵泡生成的方法，包括在需要时给予哺乳动物有效量的FSH突变体的步骤，其中FSHα-亚基含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列，并且其中FSHβ-突变体含有SEQ ID NO：3。
本发明还涉及一种诱导卵巢超排卵的方法，包括在需要时给予哺乳动物有效量的FSH突变体的步骤，其中FSHα-亚基含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列，并且其中FSHβ-突变体含有SEQ ID NO：3。
附图说明
图1α-亚基突变体GNFT(SEQ ID NO：4)和GNRT(SEQ ID NO：5)与人FSHα-亚基(SEQ ID NO：1)的比对。残基序数指人FSHα-亚基(SEQ ID NO：1)，并且1指其成熟多肽的第一位氨基酸。
图2FSHα-亚基突变体克隆10c-αGNRT/GM1β和克隆11c-αGNFT/GM1β与野生型FSH量效关系曲线的比较。
具体实施方式
虽然已有证据表明，提高FSH的糖含量可以导致体内半衰期延长，但是改善FSH半衰期比简单地添加额外的糖基化位点更复杂。虽然糖基化一致性序列对于添加糖是必要的，但却不足以保证糖基化位点被利用。其他因素，例如生物合成中的局部蛋白折叠和构象决定着寡糖是否能添加到特定一致性序列。另外，为了以额外的糖基化达到体内半衰期提高的目的，一致性序列必须处于这样的位置，即糖基化位点不会干扰受体结合的部位，或者不危及该糖蛋白的折叠、构象或稳定性的部位。在这一点上，具有更长的半衰期的FSH类似物，最初就被限制于融合蛋白，其多肽融合部分包括额外的糖基化位点。
FSH突变体
本发明提供了一种FSH突变体，经改构可以产生额外的糖基化识别位点。和野生型的α-亚基相比，FSH突变体的α-亚基可以是下列突变中的一种：在野生型α-亚基的氨基酸残基3位和4位之间插入GNFT序列或GNRT序列。FSH突变体可以含有任何的上述突变型α-亚基和突变型β-亚基，例如βGM1含有下述突变：E55N/V57T。重组FSH的一个或多个额外的糖基化位点可以是糖基化的。该一个或多个额外的糖基化位点可以体外糖基化或体内糖基化。此处，“GNFT突变体”一词指含有如SEQ ID NO：3所示的α亚基和如SEQ ID NO：3所示的β亚基的FSH突变体。
FSH突变体可以用任何适合的现有技术已知的方法制备。这些方法包括构建编码相应的FSH突变体的核苷酸序列和在适合的转染宿主中表达氨基酸序列。FSH突变体还可以采用化学合成或者通过联合使用化学合成和重组DNA技术来制备。
FSH突变体可以包括以两个独立多肽链形式的FSHα-和β-亚基，其中两个链在体内二聚化以产生二聚体多肽，或者它可以包括含有通过肽键或连接肽共价结合的两个亚基的单链构建体。连接肽的氨基酸残基可以表现不会明显干扰FSH突变体活性的特征。
FSH突变体和野生型FSH相比，可以具有更长的半衰期。和野生型FSH相比，FSH突变体还可以具有更好的稳定性。FSH突变体可以在N-连接糖基化位点0、1、2、3、4、5或6含有寡糖。本发明也提供了一组FSH突变体，它们可以含有一个或多个同工型FSH突变体，其中每种同工型含有在N-连接糖基化位点0、1、2、3、4、5或6含有寡糖。
编码FSH突变体α-或β-亚基核苷酸序列，例如具有分别如SEQ ID NOS：1和2所示的氨基酸序列的hFSH-α或hFSH-β，可以通过分离来构建，或通过合成编码FSH亚基母链的核苷酸序列来构建。然后可以改变核苷酸序列以实现相应氨基酸残基的取代或插入。核酸序列可以通过定点突变改构。或者，核苷酸序列还可以通过化学合成制备，其中寡核苷酸根据FSH突变体的特异的氨基酸序列设计的。
编码多肽的核苷酸序列可以插入到重组载体，可操作性地连接到在目标宿主细胞表达多肽必需的调控序列。调控序列可以是任何的对于多肽表达必需的或有益的组分。适合的调控序列的例子如指导哺乳动物细胞转录的调控序列，包括SV40和腺病毒早期和晚期启动子，如腺病毒-2主要晚期启动子，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子和人巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。
本技术领域的技术人员不需要过度试验就可以在这些载体、表达调控序列和宿主细胞中进行选择。重组载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体还可以是当其引入宿主细胞时，整合到宿主细胞基因组并同其所整合的一个或多个染色体共同复制的载体。
载体可以是表达载体，在其中编码本发明的多肽的核苷酸序列可以可操作性地连接到其它核苷酸转录所需要的片段上。载体可以来源于质粒或病毒DNA。此处提及的宿主细胞的适合的大量的表达载体是市售或见于文献描述的。
重组载体还可以进一步包括能使载体在所述的宿主细胞中复制的DNA序列。这样的序列的例子，(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40复制起点。载体还可以含有选择标记，例如其产物和宿主缺陷互补的基因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因，或者表达药物抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤抗性基因。
载体还可以包括可扩增基因如DHFR，以便含有多个拷贝的可扩增基因和侧翼序列，包括FSH突变体DNA能在适当的培养上被筛选出来。
本发明还提供了编码FSH突变体α-亚基的DNA。该编码FSH突变体α-亚基和β亚基的核苷酸序列，无论是通过定点突变、合成、PCR或其它方法制备，还可以任选地包括编码信号肽的核苷酸序列。当多肽需要从表达它的细胞中分泌的时候，可以存在该信号肽。这种信号肽，如果存在，可以为选择作为多肽表达的细胞识别。信号肽和多肽可以是同源的(如通常是和hFSH亚基关联的)，也可以是异源的(即来自于hFSH之外的另一种来源)，或者和宿主细胞可以是同源的或异源的，即通常在该宿主细胞表达的信号肽，或通常不在该宿主细胞表达的信号肽。
任何适合的宿主都可以用来生产该多肽，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物，或其它适合的动物细胞系，以及转基因动物和植物。适合的哺乳动物宿主细胞系的例子包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系，(如CHO-KL；ATCCCCL-61)，绿猴细胞系(COS)(如COS 1(ATCC CRL-1650)，COS 7(ATCCCRL-1651))；小鼠细胞系(如NSIO)，幼仓鼠肾(BI-EK)细胞系(如ATCC CRL-1632or ATCC CCL-10)，和人细胞系(如BEK 293(ATCC CRL-1573))，以及组织培养的植物细胞。其它的适合的细胞系对于本技术领域是已知的，可从公共保藏机构如美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection，USA)获得。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染、电穿孔、二乙胺基乙基-右旋糖苷(DEAE-dextron)介导的转染、脂质体介导的转染和病毒载体。
可以采用现有技术，在适合多肽生产的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过摇瓶培养、小规模或较大规模发酵(包括连续、批次、流加或固态发酵)培养细胞，可在实验室或工业发酵罐中，在适合的培养基和允许多肽表达和/或分离的条件下进行。培养在含有碳源、氮源以及无机盐的营养培养基中，采用现有技术已知的程序进行。适合的培养基可由商业供应商提供，或者根据公开的组分制备(如美国模式菌种收集中心的目录)。如果多肽是分泌到营养培养基中的，可以直接从培养基中回收。如果多肽是不分泌的，可以从细胞裂解物中回收。一个高效生产本发明的FSH突变体的方法，是通过使用二氢叶酸脱氢酶(DHFR)在DHFR-缺陷型CHO细胞中扩增，连续增加甲氨蝶呤的浓度实现，如美国No.4,889,80所述。
产生的FSH突变体多肽可以用现有技术已知的方法回收。例如，可以用传统的方法从营养培养基中回收，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。FSH突变体多肽可以用多种现有技术已知的方法纯化，包括但不限于层析(如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和分子排阻)、电泳方法(如制备型等点聚焦)、差异溶解度(如硫酸氨沉淀)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或萃取。
本发明还提供一种含有FSH突变体的药物组合物。该药物组合物可以用于刺激卵泡生成，例如和排卵诱导或辅助生殖技术(ART)联合使用。因为本发明的FSH突变体可以有效诱导多卵泡发育和成熟，所以它可能特别适合用于期望收集多个卵细胞的ART。
FSH突变体可以用于诱发排卵(OI)时诱导单卵泡生成，或者宫腔内人工授精(IUI)时的少量卵泡生成(paucifolliculogenesis，达到大约3个卵泡)，用于体内授精。较之传统FSH制剂，FSH突变体减量或者低频用药可获单卵泡生成。例如，在诱发排卵(OI)，本发明的FSH制剂可以每3天给予225-400IU，或者更低剂量，这取决于患者的反应。患者反应可以用超声图跟踪。
本发明的FSH突变体，可以用于控制性超排卵(COH)方案。COH标准方案包括下调期，在该期，通过给予促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂下调内源性黄体生成素(LH)，随之是刺激期，在该期，通过每天给予卵泡刺激素(FSH)，通常大约150-225IU/天，诱导卵泡发育(卵泡生成)。或者，刺激可以在自发或诱导的月经后，以FSH开始，随后给予GnRH拮抗剂(通常从刺激期第6天前后开始)。当至少3个卵泡＞16厘米(一个18mm)时，给予单剂量推注hCG(5-10,000IU)，模拟天然LH峰(LH surge)，诱导排卵。卵细胞收获定时在hCG注射后36-38小时。
该FSH突变体还可以用于OI和IUI。例如，可以在自发或诱导的月经后开始FSH刺激，每天剂量为75-150IU。当1或3个卵泡达到至少16厘米时，给予单剂量推注hCG诱导排卵。授精可以通过常规性交或IUI体内进行。
因为FSH突变体可以比野生型FSH制剂有更长的半衰期，上述的方案中可以使用较低IU剂量的FSH制剂，和/或可以通过缩短FSH刺激周期来调整方案，而在卵泡的数量和活性方面，能达到同样的或更好的反应。例如，每日剂量为或大约为50-150、50-100或50-75IU的FSH就可以实现足够的卵泡生成。FSH剂量可以是每日或半日为基础的。给药周期可以少于或者大约为14、12、11或10天。对于OI，FSH突变体制剂可以是25-150或50-125IU FSH/天给药。对于男性不育的治疗，FSH突变体制剂可以按照3 X 150到300 IU/周给药，直至精子发生达到足以通过常规性交或ART技术授精的水平。
因为FSH突变体比野生型FSH制剂有较长的半衰期，可以作为长效制剂给药，该制剂可以以低于每两天一次的频率给药。传统FSH可以每两天给药，用量为或大约300IU，或者每天给药，用量为或大约150IU，效果类似。FSH突变体可以3、4、5、6或7天给药，而达到传统FSH类似的或更好的效果。
FSH突变体可以用于生产用来治疗疾病、紊乱或症状的药物。在另一方面，根据本发明的多肽或药物组合物可用在治疗哺乳动物，特别是人类的方法中，包括给予需要该多肽或药物组合物的哺乳动物的步骤。
对于本技术领域的技术人员来讲，显然，一种多肽、制剂或组合物的有效量，无论该多肽、制剂或组合物是单独用药还是和其它治疗药物联合使用，取决于疾病、剂量、给药时间表、该组合物的血清半衰期以及患者的一般健康状况如何。通常，该制剂或组合物的有效剂量足以保证治疗效果。
FSH突变体可以以组合物给药，该组合物包括一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。“药学可接受的”是指一种载体或赋形剂不会使被给予该药物的患者产生任何不良反应。这种药学可接受的载体和赋形剂在本技术领域是众所周知的，该多肽可以按照众所周知的方法制成药物组合物(参见参考书，如：Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company(1990)；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins，S.Frokjaerand L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of PharmaceuticalExcipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。可用于含有该多肽的组合物的药学可接受的赋形剂包括，例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗调节剂(isotonifiers)、非离子表面活性剂或去污剂(“湿润剂”)、抗氧化剂、膨胀剂或填充剂、螯合剂和助溶剂。
含有FSH突变体的药物组合物可以制成各种剂型，包括液体如即用溶液或悬浮液、凝胶、冻干的，或者任何其它适合的剂型，如适合制成溶液的干粉或晶体。组合物的形式可以取决于需要治疗的特异的适应症，这对于本领域的技术人员是显而易见的。
该含有FSH突变体的药物组合物可以经静脉、经肌肉、经腹膜、经皮、经皮下、经舌下、经口腔、经鼻腔、透皮给药，或通过吸入以及任何其它可接受的方式如干粉注射剂(PowderJect)或ProLease封装技术或笔注射系统，给药模式将取决于需要治疗的特异的适应症，这对于本领域的技术人员是显而易见的。该组合物可以经皮下给药，这样病人能够进行自己用药。
该药物组合物可以和其它治疗药物联合使用。这些药物可以混合到该药物组合物中作为其一部分，也可以与多肽分开，同时给药，或者根据其它可接受的治疗方案使用。另外，该多肽、制剂或药物组合物可以作其它治疗的辅助使用。
本发明包括多个方面，由以下的非限制性的例子具体说明。
实施例1
FSH突变体
使用人FSH的3D晶体结构来识别FSH分子上可以插入候选糖基化位点的部位。在每个晶体结构的不对称基团中存在两个FSH分子(四个亚基)。对这两个FSH分子进行了叠加和比较，每个残基在视觉上都可观察，以识别潜在位点，该位点可以插入N-糖基化位点而不会干扰FSH多肽的正确折叠或降低FSH活性的。FSH的晶体图谱结构和关于FSH/FSHR受体相互作用的知识结合，有助于进一步选择潜在的N-糖基化位点。主要的设计标准就是3D结构破坏最小化、预测的结合和活性位点破坏最小化，以及预测的3D结构和糖基化相容。基于以上标准，制备了FSHα-亚基的下述两种插入突变体：
    #     突变     SEQ ID NO
    1     GNFT插入     4
    2     GNRT插入     5
实施例2
FSH突变体的形态学分析
从瞬时表达的FSHα-亚基体变体1-2取浓缩的培养物上清分成若干等份，在非还原条件下进行SDS-PAGE分析，该条件可允许由完整的FSH二聚体不被拆分成游离的α-和β-亚基。通过比较每个突变体二聚体和野生型FSH的表观分子量，可以确定突变体FSH和野生型FSH相比是否为超糖基化的。简言之，电泳后，蛋白被电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用抗FSHα-亚基的雪兰诺(Serono)抗体9-14显影。作为对照，对野生型FSH、突变体GM1、FSH-羧基末端肽(FSH-CTP)和果纳芬(Gonal F)也进行了分析。表1显示基于分子量标准品计算的由α-亚基突变体和野生型α-亚基组成的异源二聚体的表观分子量。
表1
    样品 相对分子量(kDa)     浓缩倍数
    FSH-CTP 45.244
    果纳芬 38.482     37x
    GNFT插入体 49.375     36x
    GNRT插入体 49.172     35x
    GM1 46.202     40x
    野生型FSH 45.083     36x
如表1所示，两个表达的FSH突变体的任一个，即GNFT和GNRT插入体，显示糖基化水平增加，证据是与野生型人FSH相比，该异源二聚体表观分子量分布有变化。
实施例3
FSH突变体的体外功能
为了测定FSH突变体的活性，测定了每个突变体刺激重组表达人FSH受体的CHO细胞产生环磷酸腺苷(cAMP)的能力。CHO-FSH受体(CHO-FSHR)细胞保持在FSHR生长培养基中[基本培养基(MEM)(-)(Gibco，cat#12561-056)+10％透析型胎牛血清(Gibco，cat#26300-020)+600μg/ml抗生素Geneticin(Gibco，cat#10131-035)+0.02μM氨甲喋呤]。CHO-FSHR细胞以2×104细胞/孔接种于100μl/孔，(2×106细胞/10ml＝1皿)，在检测前于37℃孵育24小时。至少70％汇合时的细胞用于测定。
所有样品和内标(Gonal F作为内标)从67.5nM开始进行12-点1∶3系列稀释。所有稀释都在检测培养基[DMEM/F12(不含酚红，Gibco，cat#11039-021)+1mg/ml胎牛血清(Sigma，A-6003)+0.1mM IBMX(3-异丁基-1-甲基呫吨酮-磷酸二酯酶抑制剂，Sigma，cat#I-7018)]中进行。从检测皿中去除生长培养基，加入25μl检测培养基(随MA6000 cAMP MSD试剂盒-Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD提供)，回收培养皿并在37℃孵育15分钟。孔中加入25μl/孔检测样品，混合，回收培养皿并在37℃孵育1小时。孵育1小时后，从孔中去除样品和培养基。然后每孔加入25μl标准裂解缓冲液(随MA 6000 Meso Scale Discovery试剂盒提供)，培养皿加盖(Packard，cat#6005185)摇荡5分钟。5分钟裂解孵育后，将25μl细胞裂解物转移到cAMP Meso Scale Discovery培养皿(随MA6000 MSD试剂盒提供)中，室温温和混合培养30分钟。每孔加入25μl cAMP-碱性磷酸酶组合物，然后每孔加入25μl抗cAMP抗体，培养皿加盖室温摇荡30分钟。培养皿而后用350μl/孔清洗缓冲液在用自动清洗机清洗6次。然后每孔加入100μ Sapphire II RTU(即用型)底物增强剂，培养皿加盖25℃暗处孵育30分钟。然后培养皿每孔1秒读数，低cAMP浓度者显示高信号，高cAMP浓度者显示低信号。FSH突变体的量效关系曲线如图2所示。计算半数有效浓度(EC50)值，见表2。
表2
    样品     EC50M
    FSH野生型     2.16E-10
    克隆10C-αGNRT/β GM1     2.58E-10
    克隆11C-αGNFT/β GM1     2.78E-10
如图2和表2所示，每种FSH突变体都具有与野生型FSH相当的体外活性。
实施例4
FSH突变体的体内半衰期
两个不同批次的GNFT突变体和GNRT突变体，运用独立的药代动力学研究进行分析。两项研究采取相同设计：33只21日龄的未成熟雌性SD大鼠(体重约40g；Charles River Laboratories，Wilmington，MA)随机分成5个治疗组(n＝6)和一个基线组(n＝3)。选择未成熟雌性大鼠是基于要使用该年龄和性别来进行FSH的体内生物学活性测定。治疗组动物接受皮下(s.c.)注射4ug GM1(对照)、GNFT突变体、GNRT突变体或8ug Gonal-F人重组FSH(rFSH)(对照)。0小时从基线组动物，1、2、4、6、10、24、48和72小时从治疗组动物自球后窦取血(n＝3/时间点；大鼠轮流取血以便两个后续的样品点不会出血)。每只大鼠每个出血点大约取血0.1ml，收获血浆，储存于-80℃待ELISA分析。两项研究中所用的检测血清中FSH蛋白的方法是用DSL FSH包被孔板的ELISA(Diagnostics Systems Laboratories，Webster，TX)。每个血清样品重复分析三次。
GNFT突变体和GNRT突变体的半衰期大约为17小时，而GM1和Gonal-F对照分别大约为12小时和8小时。这显示GNFT突变体和GNRT突变体具有比野生型FSH更长的半衰期。
实施例5
体内生物学活性
评价GNRT和GNFT突变体体内生物学活性的模型是大鼠卵巢重量增加法。使用FSH或具有FSH类似活性的分子，如GNRT和GNFT突变体治疗未成熟的21日龄雌性大鼠，触发卵巢卵泡生长和卵细胞产生。这种生长通过测量治疗末期卵巢重量很容易探测。在本模型中，待检测的物质通过注射给药3天，在最后一次给药后取出卵巢称重。该方法作为给临床产品标签FSH活性赋值的目的已经使用了数十年。它能测量FSH的相关生理学作用，和临床产品的表现有明确的相关性。
将GNRT和GNFT突变体与野生型FSH的体内活性进行比较。基于预测的FSH的等价性，并考虑到其体外活性和在大鼠体内的半衰期，来定义所有剂量。发现GNRT和GNFT突变体具有很强的FSH活性，其强度与野生型FSH相似。
序列表
<110>应用研究系统ARS股份公司
<120>FSH突变体
<130>1115 WO
<160>5
<170>专利版本3.3
<210>1
<211>92
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro
1               5                   10                  15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
            20                  25                  30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
        35                  40                  45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
    50                  55                  60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr
65                  70                  75                  80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
                85                  90
<210>2
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
            100                 105                 110
<210>3
<211>111
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>Beta-亚基突变体E55N/V57T
<400>3
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Ash Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
            100                 105                 110
<210>4
<211>96
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>α-亚基插入突变体GNFT
<400>4
Ala Pro Asp Gly Asn Phe Thr Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu
1               5                   10                  15
Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys
            20                  25                  30
Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys
        35                  40                  45
Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys
    50                  55                  60
Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val
65                  70                  75                  80
Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
                85                  90                  95
<210>5
<211>96
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>α-亚基插入突变体GNRT
<400>5
Ala Pro Asp Gly Asn Arg Thr Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu
1               5                   10                  15
Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys
            20                  25                  30
Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys
        35                  40                  45
Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys
    50                  55                  60
Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val
65                  70                  75                  80
Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
                85                  90                  95

Claims (18)

1.一种核酸，该核酸编码FSHα-亚基突变体，其中该α-亚基突变体含有选自SEQ ID NOS：4-5的序列。
2.含有权利要求1所述的核酸的载体。
3.权利要求1所述的载体，其中该载体是表达载体。
4.权利要求1所述的载体，其中该载体进一步含有编码序列SEQ ID NO：3的核酸。
5.含有权利要求1所述的载体的宿主细胞。
6.权利要求1所述的宿主细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞。
7.FSH突变体，其中β-亚基含有序列SEQ ID NO：3，并且其中的α-亚基含有由权利要求1的核酸编码的序列。
8.权利要求1所述的FSH突变体，其中从0-6位的天冬酰胺残基中任何一个都是糖基化的。
9.权利要求7所述的FSH突变体SEQ ID NO：4，其中N5是糖基化的。
10.权利要求7所述的FSH突变体，其中α-亚基含有序列SEQ ID NO：5，并且其中N5是糖基化的。
11.一种FHS突变体的制备方法，包括：
(a)提供含有权利要求1所述的核酸和编码SEQ ID NO：3的第二核酸的细胞；
(b)在允许第一和第二核酸表达的条件下培养该细胞。
12.权利要求1所述的方法，其中的细胞能够糖基化蛋白。
13.权利要求11所述的方法，其中该细胞含有单一的载体，该载体含有权利要求1所述的核酸和编码SEQ ID NO：3的核酸。
14.权利要求11所述的方法，其中该细胞含有含权利要求1所述的核酸的载体，还进一步含有含编码SEQ ID NO：3的核酸的第二载体。
15.一种药物组合物，含有权利要求1所述的FSH突变体，还任选地含有药学可接受的载体或赋形剂。
16.一种治疗哺乳动物不育的方法，包括在需要时给予哺乳动物权利要求15的药学组合物。
17.一种刺激哺乳动物卵泡生成的方法，包括在需要时给予哺乳动物权利要求15的药学组合物。
18.一种诱导卵巢超排卵的方法，包括在需要时给予哺乳动物权利要求15的药学组合物。
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