KR20010016878A - 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법 - Google Patents

단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20010016878A
KR20010016878A KR1019990032078A KR19990032078A KR20010016878A KR 20010016878 A KR20010016878 A KR 20010016878A KR 1019990032078 A KR1019990032078 A KR 1019990032078A KR 19990032078 A KR19990032078 A KR 19990032078A KR 20010016878 A KR20010016878 A KR 20010016878A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
luteinizing hormone
blh
nucleic acid
group
acid molecule
Prior art date
Application number
KR1019990032078A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100375671B1 (ko
Inventor
민관식
성환후
박진기
장원경
Original Assignee
김강권
대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 김강권, 대한민국(관리부서:농촌진흥청) filed Critical 김강권
Priority to KR10-1999-0032078A priority Critical patent/KR100375671B1/ko
Publication of KR20010016878A publication Critical patent/KR20010016878A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100375671B1 publication Critical patent/KR100375671B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 유전자재조합에 의하여 단일체인으로 형성된 소의 황체형성호르몬, 상기 호르몬을 코딩하는 핵산분자 및 상기 호르몬을 제조하는 방법에 관한 것으로, α단체와 β단체의 2부분으로 구성된 황체형성호르몬을 단일체인으로 형성함으로써 대량의 호르몬을 용이하게 제조할 수 있으며, 본 발명의 단일체인 황체형성호르몬은 천연형의 황체형성호르몬보다 활성이 강하여 동물약으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법{Single chain bovine Luteinizing hormone and producing method thereof}
본 발명은 황체형성호르몬 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전자재조합에 의하여 단일체인으로 형성된 황체형성호르몬 및 그러한 단일체인 호르몬을 제조하는 방법에 관한 것이다.
천연형의 황체형성호르몬(Luteinizing hormone, 이하 "LH"라 함)은 뇌하수체에서 분비되는 성선자극호르몬으로서 당단백질 호르몬계에 속한다.
이 호르몬은 뇌하수체 유래의 난포자극호르몬(FSH), 융모성성선자극호르몬(hCG), 임마혈청성선자극호르몬(eCG)과 마찬가지로 α단체와 β단체가 비공유결합으로 결합하여 구성된다.
소의 황체형성호르몬(bovine Luteinizing hormone, 이하 "bLH"라 함)도 소의 뇌하수체로부터 분비되어 소의 과배란 및 발정유기에 관여하는 성선자극호르몬으로서 α단체와 β단체로 구성된다.
bLH의 α단체는 24개의 아미노산으로 구성된 시그널 펩티드(signal peptide)와 96개의 아미노산으로 구성된 펩티드로 구성되며, 56 및 82번에 N말단결합 당쇄첨가결합부위를 가지고 있다[Biochemistry.22, 4856(1983) 참조]. bLH의 α단체를 코딩하는 cDNA의 핵산염기서열은 서열목록 1에 기재한 바와 같으며, bLH의 α단체의 아미노산서열은 서열목록 2에 기재한 바와 같다.
bLH의 β단체는 20개의 아미노산으로 구성된 시그널 펩티드와 121개의 아미노산으로 구성된 펩티드로 구성되어 있다[JBC. 260, 7072(1985) 참조]. bLH의 β단체를 코딩하는 cDNA의 핵산염기서열은 서열목록 3에 기재된 바와 같으며, bLH의 β단체의 아미노산서열은 서열목록 4에 기재한 바와 같다.
상기와 같은 소의 bLH는 소의 과배란 및 발정유지를 위하여 필요하지만, 종래에는 bLH를 국내에서 생산하지 못하였으므로 수입해서 사용하여야만 한다는 문제점이 있다.
비용절감을 위하여 bLH 대신에 도축장에서 도살된 돼지의 뇌하수체로부터 LH를 정제하여 사용하기도 하지만, LH를 분리 및 정제하는 공정이 복잡하고 수율이 낮아 대량생산이 어려운 문제점이 있다.
상기의 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 유전자재조합에 의하여 단일체인으로 형성되어 발현세포계에서 용이하게 발현되므로 대량생산이 용이하며, 호르몬의 생물활성이 천연형 호르몬에 비하여 우수한 단일체인 소의 황체형성호르몬을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 단일체인 소의 황체형성호르몬을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 α단체의 cDNA와 β단체의 cDNA를 결합시키기 위한 과정을 도시한 것,
도 2는 pcDNA3-bLH의 플라스미드지도.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 유전자재조합에 의하여 소의 황체형성호르몬의 α단체와 β단체를 단일체인으로 만든, 아미노산서열이 서열목록 6에서의 위치 1-237 또는 21-237과 동일하거나 실질적으로 유사한 단일체인 소의 황체형성호르몬에 그 특징이 있다.
본 발명의 재조합 단일체인 bLH의 대표적인 아미노산서열을 서열목록 6에 기재하고 있다.
서열목록 6에 기재한 바와 같이 bLH는 20개의 시그널 펩티드와 217개의 아미노산으로 구성된 펩티드로 구성되며, 21번부터 141번까지의 아미노산은 β단체에 해당하고 142번부터 237번까지의 아미노산은 α단체에 해당한다. 또한 33번의 Asn에는 N-말단결합 당쇄가 결합되고 197번과 223번의 Asn에는 각각 하나의 N-말단결합 당쇄가 결합되어 있다.
그러나 상기 서열목록 6에서 위치 1-237 또는 21-237에 기재된 아미노산서열과 동일한 아미노산서열만이 아니라 실질적으로 유사한 아미노산서열도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명은 상기 단일체인 소의 황체형성호르몬을 코딩하는 핵산염기서열을 가지는 단리된 핵산분자에 그 특징이 있다.
대표적인 핵산분자의 서열을 서열목록 5에 기재하고 있다. 서열목록 5에 기재한 DNA는 714개의 핵산으로 구성되며, 위치 1-60은 시그널 펩티드, 위치 61-711은 펩티드를 코딩하여, 위치 712-714는 터미네이터를 나타낸다. 또한 위치 61-711중 61-423은 β단체에 대한 아미노산서열을 나타내고, 424-711은 α단체에 대한 아미노산서열을 나타낸다.
그러나 상기 서열목록 5에 기재된 핵산염기서열에서 위치 61-711과 동일한 것뿐 아니라 실질적으로 유사한 핵산염기서열도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명은 소의 황체형성호르몬의 α단체 및 β단체를 코딩하는 핵산분자를 중합연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭시키는 단계와; 상기 증폭된 α단체를 코딩하는 핵산분자와 β단체를 코딩하는 핵산분자를 클로닝시키는 단계와; 클로닝된 α단체를 코딩하는 핵산분자와 β단체를 코딩하는 핵산분자를 중합연쇄반응에 의하여 결합시키는 단계와; 상기 결합된 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 형성하는 단계와; 상기 발현벡터를 도입하여 진핵세포를 형질전환하는 단계와; 상기 형질전환된 진핵세포에서 소의 황체형성호르몬을 발현시키는 단계와; 발현된 소의 황체형성호르몬을 분리하는 단계를 포함하는 단일체인 소의 황체형성호르몬의 제조방법에 그 특징이 있다.
상기 방법에서 발현벡터로는 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 발현벡터를 도입하여 호르몬을 발현시키기 위한 숙주세포인 진핵세포는 포유류 동물세포유래의 배양가능한 세포인 것이 바람직하며, CHO-K1세포를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
〈실시예 1〉
단일체인 bLH의 제조
(1) 단일체인 bLH의 전이벡터의 형성
먼저 bLH의 α단체를 코딩하는 DNA와 β단체를 코딩하는 DNA를 연결하기 위하여 도 1에 도시한 바와 같은 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 함)을 실시하였다.
이때 Primer로는 하기와 같은 염기서열을 갖는 4종의 올리고핵산염기를 사용하였다.
Primer-1, M13 RV, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
Primer-2, 5'-TCCATCAGGAAAGAGGAAGAGGATGTC-3'
Primer-3, 5'-ATCCTCTTCCTCTTTCCTGATGGAGAG-3'
Primer-4, M13 M4, 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'
bLH의 α단체의 cDNA 및 β단체의 cDNA{Biochemistry. 22, 4856(1983) 및 PNAS. USA. 83, 6618(1986) 참조}를 PCR로 증폭하였다. β단체의 cDNA에 대한 PCR은 Primer 1과 Primer 2를 사용하여 실행하였으며, α단체의 cDNA에 대한 PCR은 Primer 3와 Primer 4를 사용하여 실행하였다.
PCR에 의하여 증폭된 α단체의 cDNA와 β단체의 cDNA를 pUC119(Takara, Japan)에 클로닝하였다. 클로닝된 DNA를 Primer 1과 Primer 4를 사용하여 PCR을 실행하여 α단체의 cDNA와 β단체의 cDNA가 결합된 단일체인 bLH를 형성하였다.
형성된 단일체인 bLH를 Kpnl/Xbal으로 절단하여, pUC119 벡터의 같은 부위에 연결하였다. 연결한 후 잘못된 염기서열을 확인하기 위하여 전체염기서열을 확인하였다.
염기서열을 확인한 후 Kpnl/Xbal로 절단하고 발현벡터 pcDNA3(Invitro사)의 같은 부위에 연결하여 도 2에 도시한 바와 같은 발현벡터 pcDNA3-bLH를 형성하였다. 발현벡터의 방향을 제한효소로 확인하였다.
(2) 세포배양
상기 발현벡터 pcDNA3-bLH를 리포조움제제인 리포펙트아민을 사용하여 CHO-K1세포에 도입하였다.
50㎍/㎖의 페니실린, 50㎍/㎖의 스트렙토마이신, 2mM의 글루타민(2mM) 및 10FCS를 포함하는 안정한 클론 증식배지인 Ham F-12배지에 800㎍/㎖의 G418을 첨가한 배지에 발현벡터 pcDNA3-bLH가 도입된 CHO-K1세포를 넣고 5CO2와 95공기가 혼합된 분위기 하의 37℃에서 2주간 배양하였다. 배양 후 안정한 세포만을 선별하였다.
(3) 재조합 단일체인 bLH의 발현
선별된 안정세포(1×106)를 50units/ml의 페니실린과 50㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함한 20ml의 CHO-S-SFM-11 배지에 넣고 37℃에서 48시간 배양하였다.
배양후 배양상층을 모아서 100,000xg에서 60분간 원심분리하여 세포찌꺼기 등을 제거하였다. 원심분리한 분획중 상층분획에 단일체인 bLH가 발현된다.
〈실시예 2〉
단일체인 bLH의 활성측정
(1) RIA를 이용한 단일체인 bLH의 정량
천연형 bLH와 본 발명의 단일체인 bLH를 폴리클로날항체(A558/P1H)를 사용하여 RIA(Radio Immuno Assay)에 의하여 정량하였다.
200㎕의 0.02M 인산버퍼[0.017M Na2HPO4·12H2O, 0.003M KH2PO4, 0.9(w/v) NaCl, 0.5(w/v)BSA, 0.02(w/v) NaN3], 100㎕의 천연형 bLH 표준품(0.09, 0.19, 0.390, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50ng), 100㎕의 토끼의 항bLH 폴리클로날항체(7㎍/ml) 및 100㎕의 클로라민-T방법에 따라 표식한125I bLH 탐식자(20,000cpm/100㎕)를 각 튜브에 첨가하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다.
배양한 후 500㎕의 항토끼침강항체를 각 튜브에 넣고 다시 30분간 배양하였다. 30분간 배양한 후 2ml의 인산버퍼를 첨가하고 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층을 제거한 후 카운터로 측정하여 정량하였다.
(2) 세포내 cAMP 정량에 의한 재조합 bLH의 활성측정
난포자극호르몬의 수용체를 발현하는 세포(HEK293-FSHR:HEK293-FSHR)를 이용하여 재조합호르몬의 생리활성을 확인하였다.
6개 배양조(well)에 3×105세포를 넣고 인큐베이터에서 약 72시간동안 배양한 후 WA/BSA배양액으로 2회 세척하였다. WA/BSA 배양액으로 세척한 후 0.5mM MIX 1ml를 첨가하고 천연형 및 재조합 bFSH 0.075-250ng을 첨가하여 30분간 배양하였다.
배양이 완료된 후 얼음 위에 두고 최종농도 5가 되도록 트리클로로아세트산을 첨가하고 분석시까지 -20℃에 보관하였다.
cAMP는 cAMP 효소 면역분석 키트(Cayman Chemical, MI, USA)를 사용하여 정량하였다.
즉, 먼저 각 배양조에 버퍼 50㎕, 시료 50㎕, cAMP 아세틸콜린에스테라제 탐식자(Cyclic AMP Acetylcholinesterase Tracer) 50㎕, cAMP 항혈청(Cyclic AMP Antiserum) 50㎕를 첨가하여 18시간 배양한 후 배양조를 세척용 버퍼로 5회 세척하였다. 세척 후 200㎕의 엘만시약(Ellman's Reagent)을 첨가하여 60분간 방치한 후 405nm에서 플레이트를 읽어 cAMP의 활성을 측정하였다.
활성을 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
유전자재조합 bLH의 생리활성
시료양(ng/ml) 0.075 0.75 2.5 7.5 25 75 250
방출 cAMP량(pMol/106cells) 천연형 bLH 0.31 10.20 38 110 250 345 390
재조합 bLH 0.41 15.43 46 154 301 389 451
상기와 같은 본 발명은 α단체와 β단체의 2부분으로 구성된 황체형성호르몬을 단일체인으로 형성함으로써 대량의 호르몬을 용이하게 제조할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명의 단일체인 황체형성호르몬은 천연형의 황체형성호르몬보다 활성이 강하여 동물약으로서 유용하게 이용될 수 있다.
〈110〉 REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
〈120〉 Single chain bovine Luteinizing hormone and producing method ther
eof
〈160〉 6
〈170〉 KOPATIN 1.5
〈210〉 1
〈211〉 363
〈212〉 DNA
〈213〉 bovine
〈220〉
〈221〉 sig_peptide
〈222〉 (1)..(64)
〈220〉
〈221〉 mat_peptide
〈222〉 (65)..(360)
〈220〉
〈221〉 terminator
〈222〉 (361)..(363)
〈400〉 1
atggattact acagaaaata tgcagctgtc attctgacca ttttgtctct gtttctgcaa 60
attctccatt cctttcctga tggagagttt acaatgcagg gctgtcctga atgcaagcta 120
aaagaaaaca aatacttctc caagccagat gctgcaatct atcagtgcat ggggtgctgc 180
ttctccaggg cataccccac tccagcgagg tctaagaaga caatgttggt ccccaagaac 240
atcacctcgg aagctacatg ctgtgtggcc aaagcattta ccaaggccac agtgatggga 300
aatgtcagag tggagaacca caccgagtgc cactgcagca cttgttatta tcacaaatcc 360
taa 363
〈210〉 2
〈211〉 120
〈212〉 PRT
〈213〉 bovine
〈220〉
〈221〉 SIGNAL
〈222〉 (1)..(24)
〈220〉
〈221〉 PEPTIDE
〈222〉 (25)..(120)
〈400〉 2
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Val Ile Leu Tyr Ile Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Gln Ile Leu His Ser Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met
20 25 30
Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys
35 40 45
Pro Asp Ala Ala Ile Tyr Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala
50 55 60
Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn
65 70 75 80
Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala
85 90 95
Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys
100 105 110
Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
115 120
〈210〉 3
〈211〉 426
〈212〉 DNA
〈213〉 bovine
〈220〉
〈221〉 sig_peptide
〈222〉 (1)..(60)
〈220〉
〈221〉 mat_peptide
〈222〉 (61)..(423)
〈220〉
〈221〉 terminator
〈222〉 (424)..(426)
〈400〉 3
atggagatgt tccagggact gctgctgtgg ctgctgctgg gcgtggccgg ggtgtgggct 60
tccagggggc cactgcggcc gctgtgccag cccatcaacg ccaccctggc ggctgagaag 120
gaggcctgcc ctgtctgtat cactttcacc accagcatct gcgccggcta ctgccccagc 180
atgaagcggg tgctgcctgt catcctgccg cccatgcccc agcgggtgtg cacctaccat 240
gagctgcgct tcgcctccgt tcggctcccc ggctgcccac ctggagtgga cccaatggtc 300
tccttccccg tggccctcag ctgtcactgt ggaccctgcc gcctcagcag cactgactgc 360
gggggtccca gaacccaacc cttggcctgt gaccaccccc cgctcccaga catcctcttc 420
ctctaa 426
〈210〉 4
〈211〉 141
〈212〉 PRT
〈213〉 bovine
〈220〉
〈221〉 SIGNAL
〈222〉 (1)..(20)
〈220〉
〈221〉 PEPTIDE
〈222〉 (21)..(141)
〈400〉 4
Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Trp Leu Leu Leu Gly Val Ala
1 5 10 15
Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Gln Pro Ile
20 25 30
Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Val Cys Ile Thr
35 40 45
Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Lys Arg Val
50 55 60
Leu Pro Val Ile Leu Pro Pro Met Pro Gln Arg Val Cys Thr Tyr His
65 70 75 80
Glu Leu Arg Phe Ala Ser Val Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val
85 90 95
Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro
100 105 110
Cys Arg Leu Ser Ser Thr Asp Cys Gly Gly Pro Arg Thr Gln Pro Leu
115 120 125
Ala Cys Asp His Pro Pro Leu Pro Asp Ile Leu Phe Leu
130 135 140
〈210〉 5
〈211〉 714
〈212〉 DNA
〈213〉 bovine
〈220〉
〈221〉 sig_peptide
〈222〉 (1)..(60)
〈220〉
〈221〉 mat_peptide
〈222〉 (61)..(711)
〈220〉
〈221〉 terminator
〈222〉 (712)..(714)
〈400〉 5
atggagatgt tccagggact gctgctgtgg ctgctgctgg gcgtggccgg ggtgtgggct 60
tccagggggc cactgcggcc gctgtgccag cccatcaacg ccaccctggc ggctgagaag 120
gaggcctgcc ctgtctgtat cactttcacc accagcatct gcgccggcta ctgccccagc 180
atgaagcggg tgctgcctgt catcctgccg cccatgcccc agcgggtgtg cacctaccat 240
gagctgcgct tcgcctccgt tcggctcccc ggctgcccac ctggagtgga cccaatggtc 300
tccttccccg tggccctcag ctgtcactgt ggaccctgcc gcctcagcag cactgactgc 360
gggggtccca gaacccaacc cttggcctgt gaccaccccc cgctcccaga catcctcttc 420
ctctttcctg atggagagtt tacaatgcag ggctgtcctg aatgcaagct aaaagaaaac 480
aaatacttct ccaagccaga tgctgcaatc tatcagtgca tggggtgctg cttctccagg 540
gcatacccca ctccagcgag gtctaagaag acaatgttgg tccccaagaa catcacctcg 600
gaagctacat gctgtgtggc caaagcattt accaaggcca cagtgatggg aaatgtcaga 660
gtggagaacc acaccgagtg ccactgcagc acttgttatt atcacaaatc ctaa 714
〈210〉 6
〈211〉 237
〈212〉 PRT
〈213〉 bovine
〈220〉
〈221〉 SIGNAL
〈222〉 (1)..(20)
〈220〉
〈221〉 PEPTIDE
〈222〉 (21)..(237)
〈400〉 6
Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Trp Leu Leu Leu Gly Val Ala
1 5 10 15
Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Gln Pro Ile
20 25 30
Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Val Cys Ile Thr
35 40 45
Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Lys Arg Val
50 55 60
Leu Pro Val Ile Leu Pro Pro Met Pro Gln Arg Val Cys Thr Tyr His
65 70 75 80
Glu Leu Arg Phe Ala Ser Val Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val
85 90 95
Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro
100 105 110
Cys Arg Leu Ser Ser Thr Asp Cys Gly Gly Pro Arg Thr Gln Pro Leu
115 120 125
Ala Cys Asp His Pro Pro Leu Pro Asp Ile Leu Phe Leu Phe Pro Asp
130 135 140
Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu Lys Glu Asn
145 150 155 160
Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Ala Ile Tyr Gln Cys Met Gly Cys
165 170 175
Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys Lys Thr Met
180 185 190
Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Lys
195 200 205
Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val Glu Asn His
210 215 220
Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
225 230 235

Claims (7)

  1. 소의 황체형성호르몬의 α단체와 β단체를 단일체인으로 만든, 아미노산서열이 서열목록 6에서의 위치 1-227 또는 21-227과 동일하거나 실질적으로 유사한 단일체인 소의 황체형성호르몬.
  2. 상기 제1항에 따른 단일체인 소의 황체형성호르몬을 코딩하는 핵산염기서열을 가지는 단리된 핵산분자.
  3. 제2항에 있어서, 핵산분자는 서열목록 5에서의 위치 1-711 또는 61-711과 동일하거나 실질적으로 유사한 핵산염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  4. 소의 황체형성호르몬의 α단체 및 β단체를 코딩하는 핵산분자를 중합연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭시키는 단계와;
    상기 증폭된 α단체를 코딩하는 핵산분자와 β단체를 코딩하는 핵산분자를 클로닝시키는 단계와;
    클로닝된 α단체를 코딩하는 핵산분자와 β단체를 코딩하는 핵산분자를 중합연쇄반응에 의하여 결합시키는 단계와;
    상기 결합된 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 형성하는 단계와;
    상기 발현벡터를 도입하여 진핵세포를 형질전환하는 단계와;
    상기 형질전환된 진핵세포에서 소의 황체형성호르몬을 발현시키는 단계와;
    발현된 소의 황체형성호르몬을 분리하는 단계를 포함하는 단일체인 소의 황체형성호르몬의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 발현벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 단일체인 소의 황체형성호르몬의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 진핵세포는 포유류 동물세포유래의 배양가능한 세포인 것을 특징으로 하는 단일체인 소의 황체형성호르몬의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 진핵세포는 CHO-K1인 것을 특징으로 하는 단일체인 소의 황체형성호르몬의 제조방법.
KR10-1999-0032078A 1999-08-05 1999-08-05 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법 KR100375671B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1999-0032078A KR100375671B1 (ko) 1999-08-05 1999-08-05 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1999-0032078A KR100375671B1 (ko) 1999-08-05 1999-08-05 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010016878A true KR20010016878A (ko) 2001-03-05
KR100375671B1 KR100375671B1 (ko) 2003-03-15

Family

ID=19606255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1999-0032078A KR100375671B1 (ko) 1999-08-05 1999-08-05 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100375671B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101493957B1 (ko) 2014-11-06 2015-02-24 대한민국 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드, 이를 발현하는 재조합 누에 배큘로바이러스 및 이의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR100375671B1 (ko) 2003-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Urbanek et al. Functional characterization of the alternatively spliced, placental human growth hormone receptor.
Haefliger et al. Amphibian albumins as members of the albumin, alpha-fetoprotein, vitamin D-binding protein multigene family
JPH074249B2 (ja) インシユリン受容体
JPH09133679A (ja) ペプチド類
Gainer Precursors of vasopressin and oxytocin
Lustbader et al. Characterization of the expression products of recombinant human choriogonadotropin and subunits.
Reddy et al. Expression of human choriogonadotropin in monkey cells using a single simian virus 40 vector.
Ivell et al. Vasopressin and oxytocin precursors as model preprohormones
JP4593106B2 (ja) 着床前因子の新しいアッセイ方法および着床前因子ペプチド
CN101370825B (zh) 新颖的fsh糖基化突变体d3n
KR100375671B1 (ko) 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법
Heikoop et al. Expression of a bioactive, single‐chain choriogonadotropin in Dictyostelium discoideum
EP0974599A1 (en) Recombinant single-stranded equine chorionic gonadotropin
KR100375672B1 (ko) 단일체인 소의 난포자극호르몬 및 그 제조방법
Chopineau et al. Expression of horse and donkey LH in COS-7 cells: evidence for low FSH activity in donkey LH compared with horse LH
CN101341169B (zh) Fsh突变体
KR20010023749A (ko) 딕티오스텔리움에서 성선 자극 호르몬의 발현
JPH03502525A (ja) ゴナドトロピンおよびｔｓｈのスーパーアゴニストの製造方法並びに該製造方法で製造したスーパーアゴニスト
CN107827987B (zh) 一种促黄体激素类似物及其制备方法
Roth et al. Follitropin Conformational Stability Mediated by Loop 2β Effects Follitropin− Receptor Interaction
CA1341022C (en) Prepro-lhrh c-terminal peptide
Karn et al. The amino acid sequence of the alpha subunit of mouse salivary androgen-binding protein (ABP), with a comparison to the partial sequence of the beta subunit and to other ligand-binding proteins
CN1395580A (zh) 人类胱氨酸结多肽
KR20010077538A (ko) 단일체인 융모성성선자극호르몬 및 그 제조방법
US6355466B1 (en) Motor proteins and methods for their use

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
EXPY Expiration of term