ES2543198T3

ES2543198T3 - Mutantes de FSH

Info

Publication number: ES2543198T3
Application number: ES06851498.3T
Authority: ES
Inventors: Marco Muda; Xuliang Jiang; Sean D. Mckenna
Original assignee: Merck Serono SA
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2015-08-17
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: CN101341169B; AU2006346358B2; BRPI0620223A2; WO2008010840A2; JP5249044B2; US7740862B2; ECSP088646A; EA200870108A1; IL192096A0; AR058615A1; JP2009521222A; UA93893C2; EP1976872A2; CA2630857A1; NZ568475A; AU2006346358A1; CN101341169A; MY145839A; ZA200804677B; WO2008010840A3

Abstract

Un ácido nucleico que codifica una subunidad α mutante de FSH, donde la subunidad α comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4-5.

Description

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aunque sin limitación, la centrifugación, la filtración, la extracción, el secado por pulverización, la evaporación o la precipitación. Los polipéptidos de FSH mutante pueden purificarse mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, aunque sin limitación, cromatografía (p.ej., de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (p.ej., enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (p.ej., precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el mutante de FSH. Dicha composición farmacéutica puede usarse para estimular la foliculogénesis, por ejemplo en combinación con la inducción de la ovulación o con técnicas de reproducción asistida (ART). Puesto que el mutante de FSH de la presente invención puede ser eficaz para inducir a folículos múltiples para que se desarrollen y maduren, puede ser particularmente adecuado para su uso en ART, donde se desea recolectar ovocitos múltiples.

El mutante de FSH puede usarse para inducir la mono-foliculogénesis para OI, o la paucifoliculogénesis (hasta aproximadamente tres folículos) para IUI, para la fertilización in vivo. La mono-foliculogénesis también puede lograrse con una dosis reducida del mutante de FSH, o con una dosis menos frecuente en comparación con las preparaciones de FSH convencionales. Por ejemplo, en OI se puede administrar una preparación de FSH de la invención a 225-400 IU cada tres días, o dosis inferiores, dependiendo de la respuesta del paciente. La respuesta del paciente puede ir seguida de una sonografía.

El mutante de FSH de la invención se puede usar en un régimen de hiperestimulación de ovario controlada (COH). Los regímenes estándar para COH incluyen una fase de regulación a la baja en la que la hormona luteinizante (LH) endógena es regulada a la baja mediante la administración de un agonista de hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) seguida de una fase estimuladora en la que se induce el desarrollo folicular (foliculogénesis) mediante la administración diaria de hormona estimulante de folículo (FSH), normalmente a aproximadamente 150225 IU/día. Alternativamente, la estimulación puede iniciarse con FSH tras una menstruación espontánea o inducida, seguida de la administración de antagonista de GnRH (comenzando típicamente alrededor del día seis de la fase estimulatoria). Cuando hay al menos 3 folículos >16 mm (uno de 18 mm), se puede administrar un único bolo de hCG (5-10.000 IU) para imitar la producción natural de LH e inducir la ovulación. La recuperación de ovocitos se puede programar a las 36-38 horas tras la inyección de hCG.

El mutante de FSH también se puede usar para OI e IUI. Por ejemplo, la estimulación de FSH puede iniciarse tras una menstruación espontánea o inducida, con una dosis diaria de 75-150 IU. Cuando de 1 a 3 folículos hayan alcanzado un diámetro de al menos 16 mm, se puede administrar un único bolo de hCG para inducir la ovulación. La inseminación se puede llevar a cabo in vivo, mediante acto sexual normal o IUI.

Puesto que el mutante de FSH puede presentar una vida media incrementada con respecto a las preparaciones de FSH natural, regímenes como los descritos anteriormente pueden emplear dosis de IU de FSH inferiores, y/o pueden modificarse disminuyendo el periodo de estimulación de FSH, alcanzando una respuesta similar o mejor, en términos de número y viabilidad de folículos. Por ejemplo, se puede lograr una foliculogénesis adecuada con dosis diarias de aproximadamente 50-150, 50-100 ó 50-75 IU de FSH. Las dosis de FSH pueden darse en una base diaria

o semidiaria. El periodo de dosis puede ser inferior a, o aproximadamente, 14, 12, 11 ó 10 días. Para OI, la preparación de mutante de FSH puede administrarse en dosis de 25-150 ó 50-125 IU de FSH/día. Para el tratamiento de la infertilidad masculina, se puede administrar una preparación de mutante de FSH a 3 X 150 a 300 IU/semana hasta que la espermatogénesis alcance niveles adecuados para la inseminación, tanto mediante acto sexual normal como por técnicas ART.

Debido a la mayor vida media de la FSH mutante, se puede administrar como preparación de acción prolongada, que puede administrarse con una frecuencia menor a cada dos días. La FSH convencional se puede administrar a aproximadamente 300 IU cada dos días, alcanzando resultados similares a la administración cada día con aproximadamente 150 IU. La FSH mutante se puede administrar cada 3, 4, 5, 6 ó 7 días, alcanzando resultados similares o mejores que la administración diaria de FSH convencional.

El mutante de FSH puede usarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones. En otro aspecto, el polipéptido o la composición farmacéutica según la invención se usa en un método de tratamiento de un mamífero, en particular un humano, que comprende la administración al mamífero que lo necesite de dicho polipéptido o composición farmacéutica.

Será evidente para los especialistas en la técnica que una cantidad efectiva de un polipéptido, preparación o composición depende de, entre otros, la enfermedad, la dosis, el calendario de administración, si el polipéptido o preparación o composición se administran solos o en combinación con otros agentes terapéuticos, la vida media en suero de las composiciones, y la salud general del paciente. Típicamente, una dosis efectiva de la preparación o composición es suficiente para asegurar un efecto terapéutico.

El mutante de FSH puede administrarse en una composición que incluye uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. “Farmacéuticamente aceptable” significa un vehículo o excipiente que no produce ningún efecto indebido en pacientes a los que se administre. Dichos vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica, y el polipéptido puede formularse en composiciones farmacéuticas

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Tabla 1

Muestra: Mr (kDa) Conc. relativa

FSH-CTP: 45,244

Gonal F: 38,482 37x

Injerto GNFT: 49,375 36x

Injerto GNRT: 49,172 35x

GM1: 46,202 40x

FSH natural: 45,083 36x

Tal y como se muestra en la Tabla 1, los dos mutantes de FSH expresados, es decir, los injertos de GNFT y GNRT, mostraron un aumento de glicosilación, como se evidencia por un desplazamiento de la distribución del peso molecular aparente del heterodímero en comparación con la FSH humana natural.

Ejemplo 3

Función in vitro de los mutantes de FSH

A fin de determinar la actividad de los mutantes de FSH, se evaluó cada mutante para determinar su capacidad de estimular la producción de cAMP en una línea de células CHO que expresa de forma recombinante el receptor de FSH humana. Las células CHO-FSHR se mantuvieron en medio de crecimiento de FSHR [MEM α(-) (Gibco, nº cat. 12561-056) + 10% de FBS dializado (Gibco, nº cat. 26300-020) + 600 μg/mL de Geneticina (Gibco, nº cat. 10131035) + MTX 0,02 μM]. Se sembraron células CHO-FSHR a 2x104 células/pocillo en 100 μL/pocillo (2x106 células/10 mL = 1 placa) y se incubaron a 37ºC durante 24 horas antes del ensayo. Las células se usaron para el ensayo si eran confluentes en al menos un 70%.

Se realizó una dilución en serie 1:3 de 12 puntos comenzando a 67,5 nM para todas las muestras y patrón interno (como patrón interno se usó Gonal F). Todas las diluciones se realizaron en medio de ensayo [DMEM/F12 (libre de fenol, Gibco, nº cat. 11039-021) + 1 mg/mL de BSA (Sigma, A-6003) + IBMX 0,1 mM (inhibidor de 3-isobutil-1metilxantona fosfodiesterasa, Sigma, nº cat. I-7018)]. Se eliminó el medio de crecimiento de la placa de ensayo, se añadieron 25 μL de medio de ensayo (suministrado con MA6000 cAMP MSD Lit-Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD), las placas se recuperaron y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos. A continuación los pocillos se dosificaron con 25 μL/pocillo de la muestra de ensayo, se mezclaron, las placas se recuperaron y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de 1 hora de incubación, la muestra y el medio se retiraron de los pocillos. A continuación se añadieron 25 μL de tampón de lisis estándar (suministrado con MA 6000 Meso Scale Discovery kit) a cada pocillo, las placas se cubrieron con un sellador de placas (Packard, nº cat. 6005185) y se agitaron durante 5 minutos. Tras la incubación de lisis durante 5 minutos, se transfirieron 25 μL de material celular lisado a la placa cAMP Meso Scale Discovery (suministrada con MA6000 MSD kit) y se incubó con agitación suave a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 25 μL de conjugado cAMP-AP a cada pocillo y se mezcló. A continuación se añadieron a cada pocillo 25 μL de anticuerpo anti-cAMP, las placas se cubrieron con un sellador de placa y se agitaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación las placas fueron leídas a un segundo por pocillo, mostrando los niveles bajos de cAMP una señal elevada y los niveles altos de caMP una señal baja. Las curvas de dosis-respuesta de los mutantes de FSH se muestran en la Figura 2. Se calcularon los valores de EC50 y se muestran en la Tabla 2.

Tal como se muestra en la Figura 2 y en la Tabla 2, todos los mutantes de FSH presentan actividad in vitro comparable a la de la FSH natural.

Tabla 2

Muestra: Conc. relativa

FSH natural: 2,16E-10

Clon 10C-α GNRT/β GM1: 2,58E-10

Clon 11C-α GNFT/β GM1: 2,78E-10

GM1: 40x

FSH natural: 36x

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Ejemplo 4

Vida media in vivo de mutantes de FSH

Se analizaron dos lotes diferentes de mutante GNFT y mutante GNRT en estudios farmacocinéticos (PK) separados. Los dos estudios tuvieron el mismo diseño: 33 ratas SD hembras inmaduras de 21 días de edad (aprox. 40 g de peso corporal; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fueron divididas aleatoriamente en 5 grupos de tratamiento (n=6) y un grupo de línea base (n=3). La elección de ratas hembras inmaduras se basó en el uso de esta edad y sexo para las determinaciones biológicas in vivo de actividad de FSH. Los animales de los grupos de tratamiento recibieron inyecciones subcutáneas (s.c.) de 4 μg de GM1 (control), mutante GNFT, mutante GNRT u 8 μg de rhFSH Gonal-F (control). Se tomaron muestras de sangre del seno retro-orbital a las 9 h en el grupo de línea base y a las 1, 2, 4, 6, 10, 24, 48 y 72 h de los animales de los grupos de tratamiento (n=3/cada tiempo; las ratas fueron alternadas de tal modo que no se tomaran muestras de sangre de las ratas en 2 puntos de muestreo consecutivos). Se tomó aproximadamente 0,1 mL de sangre de cada rata en cada toma de muestra, y se recolectó el plasma y se almacenó a -80ºC hasta que se analizó mediante ELISA. El ensayo usado para medir las proteínas de FSH en suero en ambos estudios fue el DSL FSH Coated Well ELISA (Diagnostics Systems Laboratories, Webster, TX). Las muestras de sangre fueron analizadas por triplicado.

La vida media del mutante GNFT y del mutante GNRT es de aproximadamente 17 horas, mientras que la de los controles GM1 y Gonal-F es de aproximadamente 12 h y 8 h, respectivamente.

Ejemplo 5

Actividad biológica in vivo

El modelo in vivo usado para determinar la actividad biológica de los mutantes GNRT y GNFT es el ensayo de ganancia de peso de ovario de rata. El tratamiento de ratas hembras inmaduras de 21 años de edad con FSH o moléculas con actividad de tipo FSH, p.ej. los mutantes GNRT y GNFT, activa el crecimiento de los folículos de ovario y la producción de ovocitos. Este crecimiento se detecta fácilmente a través de la medida del peso de ovario al final del periodo de tratamiento. En el modelo, la sustancia que va a ser evaluada se administra mediante inyección durante tres días y los ovarios son recolectados y pesados tras la última dosis. Este ensayo se ha usado durante varias décadas como base para asignar potencia de FSH a productos clínicos con fines de etiquetado. Mide la acción fisiológica relevante de la FSH y presenta una clara correlación con la acción de los productos clínicos.

La actividad in vivo de los mutantes de GNRT y GNFT se comparó con la de la FSH natural. Todas las dosis fueron definidas en base a la equivalencia predicha de la FSH, teniendo en consideración la potencia in vitro y la vida media en ratas. Se observó que los mutantes de GNRT y GNFT poseen una potente actividad de FSH, en una magnitud similar a la de la FSH natural.

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Claims

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