KR20080087854A - Ｆｓｈ 변종 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당화(glycosylation) 증가 및 보다 긴 반감기를 나타내는 FSH 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람 환자에서 난포형성(folliculogenesis)을 유도하기 위한 FSH의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사람 생식에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 수정 요법(fertilization therapy)에 관한 것이다.
a. 성선자극호르몬
난포 자극 호르몬 (FSH)은 사람 생식력(fertility)에서 핵심적인 역할을 하는 성선자극호르몬 패밀리의 일원이다. 황체형성 호르몬 (LH) 및 융모성 성선자극호르몬 (CG)를 또한 포함하는 성선자극호르몬은 이종이량체이며, 각각은 공통적인 α-서브유닛(α-subunit) (92개 아미노산) 및 독특한 β-서브유닛 (FSH의 경우 111개 아미노산)으로 구성된다. FSH의 α-서브유닛 및 β-서브유닛의 성숙한 형태의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 제시되어 있다.
사람 FSH는 뇌하수체 및 폐경후여성의 소변(postmenopausal urine) (EP 322,438)으로부터 단리되었고, 포유동물 세포에서 재조합적으로 생성되었다 (US 5,639,640, US 5,156,957, US 4,923,805, US 4,840,896, US 5,767,251, EP 211,894 및 EP 521,586). 또한, 사람 FSH의 재조합적 생성에 관한 문헌에는 사람 FSH β-서브유닛 유전자가 개시되어 있다. US 5,405,945에는 단지 하나의 인트론을 포함하는 변형된 사람 α-서브유닛 유전자가 개시되어 있다.
문헌 [Liu et al., J Biol Chem 1993,15; 268 (2): 21613-7], 문헌 [Grossmann et al., Mol Endocrinol 1996 10 (6): 769-79], 문헌 [Roth and Dias (Mol Cell Endocrinol 1995 1; 109 (2): 143-9], 문헌 [Valove et al., Endocrinology 1994; 135 (6): 2657-61], 문헌 [Yoo et al., JBiol Chem 1993 25; 268 (18): 13034-42)], US 5,508,261 및 문헌 [Chappel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3): 1835]에는 다양한 구조-기능 관계 연구가 개시되어 있고, FSH의 이량체화 및 수용체 결합 및 활성화에 관여하는 아미노산 잔기가 확인되어 있다.
b.
보조 생식 기술에서 성선자극호르몬의 사용
성선자극호르몬은 생식 주기에서 중요한 역할을 하고, 이를 외인 요법(exogenous therapy)에서 사용하는 것은 보조 생식 기술 (ART), 예를 들어 시험관내 수정 (IVF), 세포질내 정자 주입과 결합된 IVF (IVF/ICSI) 및 배아 이식(embryo transfer) (ET)을 위해 필수적일 뿐만 아니라 자연적으로 또는 자궁내 인공수정(intrauterine insemination) (IUI)을 통해 체내 수정하고자 하는 무배란 환자에서 배란 유도 (OI)를 위해 필수적이다.
US 4,589,402 및 US 4,845,077에는 LH를 함유하지 않는 정제된 사람 FSH 및 시험관내 수정을 위해 이를 사용하는 것이 개시되어 있다. EP 322 438에는 LH 활성이 실질적으로 없는 6200 U/mg 이상의 FSH 활성을 지닌 단백질이 개시되어 있고, FSH α-서브유닛 및 β-서브유닛은 각각 야생형 또는 이의 특정 절단형태(truncated form)일 수 있다.
장기간 요법이 치료 효과를 달성하기 위해 필요한데, 요법은 여성에게서 난포형성을 자극하기 위해 전형적으로 연속 8 내지 10일 동안 그리고 때때로 21일 이하 동안 수행되고, 성선기능저하증 남성에게서 정자형성을 유도하기 위해 18개월 이하 동안 수행된다. 재조합 hFSH는 전형적으로 i.m. 또는 s.c. 매일 주사(daily injection)로서 투여되며, 이에 따라 불편함 및 국소 주사 부위 반응의 가능성이 수반된다. 투여 빈도를 감소시키는 것은 요법을 용이하게 하고, 성선자극호르몬이 보다 편리하고, 보다 감내할만 하고, 환자 친화적으로 투여되게 한다.
b. FSH의 당화
성선자극호르몬은 당단백질이며, 각각의 서브유닛은 생체내 활성 및 기능을 위해 중요한 아스파라긴 결합된 (N-결합된) 올리고사카라이드 측쇄를 지닌다. 폴리펩티드로의 탄수화물 첨가 (당화)는 당 사슬을 특정 아스파라긴 (N-결합) 또는 세린/트레오닌 (O-결합)에 첨가시키는 번역후 사건이다. 당단백질의 단백질 부분의 불변 아미노산 서열과 대조적으로, 탄수화물 구조는 가변적인데, 이는 미세이질성(microheterogeneity)으로 일컬어지는 특징이다. 예를 들어, 동일한 단백질상의 N-당화 부위는 상이한 탄수화물 구조를 함유할 수 있다. 또한, 주어진 당단백질상의 동일한 당화 부위에서도, 상이한 탄수화물 구조가 발견될 수 있다. 이러한 이질성은 탄수화물의 주형 유도되지 않은(non-template-directed) 합성의 결과이다.
단백질의 N-당화는 상세하게는 컨센서스 패턴(consensus pattern)인 Asn-Xaa-Ser/Thr에서 일어나고, 보다 적은 정도로 컨센서스 패턴인 Asn-Xaa-Cys에서 일 어나며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 그러나, 컨센서스 트리펩티드(tripeptide)의 존재는 아스파라긴 잔기가 당화됨을 보장하기에 충분하지 않다. 예를 들어, Asn-Pro-Ser/Thr 서열의 N-당화는 Asn-Xaa-Ser/Thr의 다른 컨센서스 패턴 보다 50배 낮은 비율로 일어난다.
사람 FSH는 4개의 N-결합된 당화 부위를 함유하는데, 2개는 공통 α-서브유닛상의 52번 및 78번 위치에 존재하고, 2개는 β-서브유닛상의 7번 및 24번 위치에 존재한다. FSH의 α-서브유닛에 결합된 탄수화물은 이량체 어셈블리, 완전성, 분비 및 신호 전달을 위해 중요하며, β-서브유닛 탄수화물은 이량체 어셈블리, 분비 및 순환으로부터의 이종이량체의 제거를 위해 중요하다.
문헌 [Galway et al., Endocrinology 1990; 127 (1) : 93-100]에는 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제-I CHO 세포주 또는 시알산 수송에 결함이 있는 CHO 세포주에서 생성된 FSH 변이체가 시험관내에서는 야생형 세포에 의해 분비된 FSH 또는 정제된 뇌하수체 FSH 만큼 활성이지만, 아마도 혈청에서 부적절하게 당화된 변이체가 신속히 제거됨으로 인해, 생체내 활성은 결여한다는 것이 입증되어 있다. 문헌 [D'Antonio et al., Human Reprod 1999; 14 (5): 1160-7]에는 혈류중에서 순환하는 다양한 FSH 이소폼(isoform)이 기재되어 있다. 이러한 이소폼은 동일한 아미노산 서열을 지니지만, 번역후 수식의 정도에 있어서 차이가 있다. 아마도 이소폼 간의 시알산 함량의 차이로 인해, 덜 산성인 이소폼 그룹이 산성 이소폼 그룹과 비교하여 보다 신속한 생체내 제거를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 문헌 [Bishop et al. Endocrinology 1995; 136 (6): 2635-40]에는 순환 반감기가 생체내 활성의 주요 결정인자인 것으로 여겨진다고 결론내려져 있다. 이러한 결과는 추가의 당화 부위를 도입시켜서 폴리펩티드의 시알산 함량을 증가시킴으로써 FSH의 반감기가 증가될 수 있다는 가설에 이르게 하였다.
d. FSH 변이체
hCG의 카르복시말단 펩티드 (CTP)를 천연 재조합 사람 FSH (rhFSH)에 융합시킴으로써 증가된 반감기를 지닌 FSH 효능제가 개발되었다. CTP 부분은 아미노산 112번-118번 내지 145번으로 구성되며, 121번, 127번, 132번 및 138번 위치에 4개의 O-결합된 당화 부위가 존재한다. US 5,338,835 및 US 5,585,345에는 C-말단 Glu에서 hCG의 CTP 부분이 이어져 있는 변형된 FSH β-서브유닛이 기재되어 있다. 생성된 변형된 유사체는 천연 FSH의 생물학적 활성을 지니지만 연장된 순환 반감기를 지니는 것으로 설명되어 있다. US 5,405,945에는 hCG β-서브유닛의 카르복시 말단 부분 또는 이의 변이체가 CG, FSH 및 LH의 제거에 대해 현저한 효과를 지닌다고 기재되어 있다.
US 5,883,073에는 CG, TSH, LH 및 FSH에 대한 효능제 또는 길항제 활성을 지닌 2개의 α-서브유닛으로 이루어진 단일 사슬 단백질이 기재되어 있다. US 5,508,261에는 당단백질 호르몬 α-서브유닛 및 비천연 β-서브유닛 폴리펩티드를 포함하며 LH 및 FSH 수용체에 대해 결합 친화성을 지닌 이종이량체 폴리펩티드가 기재되어 있으며, 여기서 β-서브유닛 폴리펩티드는 특정 서열의 목록으로부터 각각 선택된 4개의 결합된 서브시퀀스(subsequence)를 포함하는 아미노산의 사슬이다. 문헌 [Klein et al. (2003)]에는 증가된 반감기를 지닌 FSH의 단일 사슬 유사 체가 기재되어 있으며, 여기서 α-서브유닛 및 β-서브유닛은 2개의 N-결합된 당화 부위를 함유하는 올리고펩티드에 의해 결합된다.
WO 01/58493에는 FSH의 생체내 반감기를 개선시키기 위해 FSH의 α-서브유닛에서 이루어질 수 있는 77개의 돌연변이 및 FSH의 β-서브유닛에서 이루어질 수 있는 51개의 돌연변이가 기재되어 있다. 또한, WO 01/58493에는 하나 이상의 당화 부위가 FSH의 반감기를 개선시키기 위해 FSH의 N-말단에 첨가되거나 FSH 폴리펩티드내의 다양한 부위에서 삽입될 수 있다는 것이 기재되어 있다. WO 01/58493에는 당화 부위가 FSH 폴리펩티드내로 삽입될 수 있다고 기재되어 있지만, 당화 부위를 삽입하여 FSH 활성을 유지할 수 있는 특정 부위(들)에 대해서는 안내되어 있지 않다. 추가로, WO 01/58493에는 변종 α-서브유닛 및 β-서브유닛이 개별적으로 (1개의 추가 당화 부위) 또는 공동으로 (2개의 추가 당화 부위) 사용될 수 있다고 기재되어 있다. hCG 및 FSH의 β-서브유닛 간의 동일성이 단지 32%임에도 불구하고 오로지 hCG의 구조 및 FSH와 hCG의 서열 정렬을 기초로 하여 생성된 FSH의 3D 구조의 50개 모델을 사용하여 128개의 후보 변종이 확인되었다. WO 01/58493에는 당화 부위가 특정 부위 돌연변이유발(site directed mutagenesis)에 의해 도입된 FSH의 임의의 α-서브유닛 또는 β-서브유닛의 생성 또는 시험이 기재되어 있지 않다.
WO 05/020934에는 β E55N/V57T에서의 이중 돌연변이, 즉, 아미노산 55번 위치에서 E 잔기가 N으로 변이되고 아미노산 57번 위치에서 V 잔기가 T로 변이되는 이중 돌연변이를 포함하는 FSH의 α-서브유닛 및 β-서브유닛 둘 모두에서 돌연변이를 지니는 GM1이 기재되어 있다. β E55N/V57T의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3 에 제시되어 있다.
FSH의 치료적으로 관련된 효과의 일부 또는 전부를 제공하고, 현재 이용가능한 FSH 제품과 비교하여 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 현재의 치료법에 의해 수득될 수 있는 수준과 비교하여 보다 안정한 수준의 순환 FSH 활성을 제공하는 제품에 대한 임상적 필요성이 존재한다.
본 발명은 이러한 제품 뿐만 아니라 이러한 제품을 제조하는 수단에 관한 것이다.
개요
본 발명의 변종 FSH 분자에 관한 것이며, 여기서 FSH α-서브유닛은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, FSH β-서브유닛은 SEQ ID NO:3을 포함한다. FSH는 상기 변종 FSH의 0, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아스파라긴 잔기에서 N-당화될 수 있다. 한 가지 구체예에서, SEQ ID NO:4의 변종 α-서브유닛의 N5가 당화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, SEQ ID NO:5의 변종 α-서브유닛의 N5가 당화될 수 있다. 한 가지 구체예에서, SEQ ID NO:3의 변종 β-서브유닛의 N55가 당화될 수 있다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하는 단리된 DNA 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛을 엔코딩하는 단리된 DNA에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 제 1 DNA가 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하고 제 2 DNA가 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛 변종을 엔코딩하는 제 1 DNA 및 제 2 DNA를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 제 1 DNA가 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하고 제 2 DNA가 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛 변종을 엔코딩하는 제 1 DNA 및 제 2 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 제 1 벡터가 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하고 제 2 벡터가 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 제 1 벡터 및 제 2 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 벡터(들)은 발현 벡터일 수 있다. 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 단백질을 당화시킬 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함하여 FSH 변종을 생성시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 세포는 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 제 1 벡터 및 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 제 2 벡터를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 세포는 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 FSH α-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 포함하고, SEQ ID NO:3의 서열을 포함하는 FSH β-서브유닛 변종을 엔코딩하는 DNA를 추가로 포함하는 단일 벡터를 포함한다.
또한, 본 발명은 FSH 변종 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 FSH α-서브유닛은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, FSH β-서브유닛은 SEQ ID NO:3을 포함한다.
또한, 본 발명은 불임을 치료할 필요가 있는 포유동물에게 유효량의 변종 FSH를 투여하는 것을 포함하여 불임 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 FSH α-서브유닛은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, FSH β-서브유닛은 SEQ ID NO:3을 포함한다.
또한, 본 발명은 난포형성을 자극할 필요가 있는 포유동물에게 유효량의 변종 FSH를 투여하는 것을 포함하여 포유동물에서 난포형성을 자극하는 방법에 관한 것이며, 여기서 FSH α-서브유닛은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, FSH β-서브유닛은 SEQ ID NO:3을 포함한다. 또한, 본 발명은 난소 과자극을 유도할 필요가 있는 포유동물에게 유효량의 변종 FSH를 투여하는 것을 포함하여 포유동물에서 난소 과자극을 유도하는 방법에 관한 것이며, 여기서 FSH α-서브유닛은 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, FSH β-서브유닛은 SEQ ID NO:3을 포함한다.
도 1은 GNFT (SEQ ID NO: 4) 및 GNRT (SEQ ID NO:5) α-서브유닛 변종을 FSH의 사람 α-서브유닛 (SEQ ID NO: 1)에 대해 정렬시킨 도면이다. 잔기 번호는 FSH의 사람 α-서브유닛 (SEQ ID NO: 1)을 참조하며, 1번은 성숙 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산이다.
도 2는 변종 FSH α-서브유닛을 야생형 FSH와 비교한 투여량-반응 곡선을 도시한다. 클론(Clone) lOc-αGNRT/GM1β. 클론 11c-αGNFT/GM1β.
FSH의 탄수화물 함량을 증가시키면 생체내 반감기 증가를 초래할 수 있다고 밝혀졌지만, FSH의 반감기를 개선시키는 것은 단순히 추가의 당화 부위를 첨가하는 것 보다 복잡하다. 당화 컨센서스 서열이 탄수화물 첨가를 위해 필요하지만, 이는 탄수화물 첨가 부위가 이용됨을 보장하기에 충분하지 않다. 올리고당류가 주어진 컨센서스 서열 부위에서 결합되는 지의 여부는 생합성 동안의 국소적 단백질 폴딩(folding) 및 입체형태(conformation)와 같은 다른 인자에 의해 결정된다. 또한, 추가의 당화가 생체내 반감기의 증가를 초래하기 위해, 컨센서스 서열은 부위의 당화가 수용체 결합을 간섭하지 않거나 당단백질의 폴딩, 입체형태 또는 안정성을 약화시키지 않도록 하는 위치에 존재해야 한다. 이러한 점에서, 증가된 반감기를 지닌 FSH 유사체는 주로 폴리펩티드의 융합된 부분이 추가의 당화 부위를 포함하는 융합 단백질로 제한되었다.
1. 변종 FSH
추가의 당화 인식 부위를 생성시키도록 변형된 FSH 변종이 제공된다. FSH 변종의 α-서브유닛은 야생형 α-서브유닛과 비교하여 하기 돌연변이 중 하나를 지닐 수 있다: 야생형 α-서브유닛의 3번과 4번 아미노산 잔기 사이로의 아미노산 서열 GNFT의 삽입 또는 야생형 α-서브유닛의 3번과 4번 아미노산 잔기 사이로의 아미노산 서열 GNRT의 삽입. 변종 FSH는 변종 β-서브유닛, 예를 들어 돌연변이 E55N/V57T를 함유하는 βGM1과 조합된 상기 변종 α-서브유닛 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 재조합 FSH의 추가의 당화 부위 중 하나 이상이 당화될 수 있다. 변종 FSH의 하나 이상의 추가의 당화 부위는 시험관내 또는 생체내에서 당화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "GNFT 변종"은 SEQ ID NO:4에 제시된 α-서브유닛 및 SEQ ID NO:3에 제시된 β-서브유닛을 포함하는 변종 FSH를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "GNRT 변종"은 SEQ ID NO:3에 제시된 α-서브유닛 및 SEQ ID NO:3에 제시된 β-서브유닛을 포함하는 변종 FSH를 의미한다.
FSH 변종은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 각각의 FSH 변종을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 구성하고, 적합한 트랜스펙션된(transfected) 숙주에서 아미노산 서열을 발현시키는 것을 포함한다. 또한, FSH 변종은 화학 합성에 의해 생성되거나 화학 합성과 재조합 DNA 기술의 조합에 의해 생성될 수 있다.
FSH 변종은 2개의 사슬이 이량체 폴리펩티드를 형성하도록 생체내에서 이량체화되는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬의 형태로 FSH의 α-서브유닛 및 β-서브유닛을 포함하거나, 펩티드 결합 또는 펩티드 링커에 의해 공유 결합된 2개의 서브유닛을 포함하는 단일 사슬 구성물을 포함할 수 있다. 링커 펩티드의 아미노산 잔기는 FSH 변종의 활성을 현저하게 간섭하지 않는 특성을 나타낼 수 있다.
FSH 변종은 야생형 FSH와 비교하여 증가된 반감기를 지닐 수 있다. 또한, FSH 변종은 야생형 FSH와 비교하여 증가된 안정성을 지닐 수 있다. FSH 변종은 0, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 N-결합된 당화 부위에서 올리고당류를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 FSH 변종 이소폼을 포함할 수 있는 FSH 변종의 집단이 제공되는데, 여기서 각각의 이소폼은 0, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 N-결합된 당화 부위에서 올리고당류를 포함한다.
FSH 변종의 α-서브유닛 또는 β-서브유닛을 엔코딩하는 누클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO:1 및 2에 제시된 아미노산 서열을 지닌 hFSH-알파 또는 hFSH-베타와 같은 모(parent) FSH 서브유닛을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 단리하거나 합성함으로써 구성될 수 있다. 그 후, 누클레오티드 서열은 관련 아미노산 잔기의 치환 또는 삽입을 초래하도록 변화될 수 있다. 누클레오티드 서열은 특정 부위 돌연변이유발에 의해 변형될 수 있다. 대안적으로, 누클레오티드 서열은 화학 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 올리고누클레오티드는 FSH 변종의 특정 아미노산 서열을 기초로 하여 설계된다.
폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열은 재조합 벡터내로 삽입되고, 요망되는 트랜스펙션된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 데에 필요한 조절 서열에 작동적으로 결합된다. 조절 서열은 폴리펩티드의 발현을 위해 필요하거나 이러한 발현을 위해 유리한 임의의 성분일 수 있다. 포유동물 세포에서 전사를 유도하기 위한 적합한 조절 서열의 예로는 SV40 및 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, 예를 들어 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터, MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 및 사람 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 유전자 프로모터 (CMV)가 있다.
당업자라면 과도한 실험없이도 이러한 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있다. 재조합 벡터는 자가 복제성 벡터, 즉, 염색체 복제와 무관하게 복제가 일어나는 염색체외 물질로서 존재하는 벡터, 예를 들어 플라스미드일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포내로 도입되는 경우 숙주 세포 게놈내로 통합되어 이것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다.
벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열이 누클레오티드 서열의 전사를 위해 필요한 추가의 분절(segment)에 작동적으로 결합되어 있는 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래될 수 있다. 본원에 언급된 숙주 세포에서 발현되는 다수의 적합한 발현 벡터는 시판되거나 문헌에 기재되어 있다.
재조합 벡터는 해당 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있게 하는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 (숙주 세포가 포유동물 세포인 경우) SV40 복제 기점이다. 또한, 벡터는 선택가능 마커(selectable marker), 예를 들어 생성물이 숙주 세포의 결함을 보충하는 유전자, 예를 들어 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)을 코딩하는 유전자 또는 약제, 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 히드로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 벡터는 증폭가능 유전자(amplifiable gene), 예를 들어 DHFR을 포함할 수 있어서, 변종 FSH DNA를 포함하는 증폭가능 유전자와 플랭킹 서열(flanking sequence)의 다수의 복사체를 지닌 세포가 적절한 배지상에서 선택되게 할 수 있다.
또한, FSH 변종의 α-서브유닛을 엔코딩하는 DNA가 제공된다. FSH 변종의 알파 및 베타 서브유닛을 엔코딩하는 누클레오티드 서열은, 특정 부위 돌연변이유발, 합성, PCR 또는 다른 방법에 의해 제조되든지 간에, 임의로 신호 펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 폴리펩티드가 이것이 발현되는 세포로부터 분비되어야 하는 경우 존재할 수 있다. 이러한 신호 펩티드는 존재하는 경우 폴리펩티드의 발현을 위해 선택된 세포에 의해 인식되는 것일 수 있다. 신호 펩티드는 폴리펩티드에 대해 동종 (예를 들어, 일반적으로 hFSH 서브유닛과 관련된 것) 또는 이종 (hFSH와는 또 다른 공급원으로부터 유래됨)일 수 있거나 숙주 세포에 대해 동종 또는 이종, 즉, 숙주 세포로부터 일반적으로 발현되는 신호 펩티드 또는 숙주 세포로부터 일반적으로 발현되지 않는 신호 펩티드일 수 있다.
폴리펩티드를 생성시키기 위해 임의의 적합한 숙주가 사용될 수 있는데, 이러한 숙주로는 세균, 진균 (효모를 포함함), 식물, 곤충, 포유동물, 또는 다른 적절한 동물 세포 또는 세포주 뿐만 아니라 형질전환 동물 또는 식물이 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포의 예로는 차이니즈 햄스터(Chinese hamster) 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, CHO-KL; ATCC CCL-61), 그린 멍키(Green Monkey) 세포주 (COS) (예를 들어, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); 마우스 세포 (예를 들어, NSIO), 베이비 햄스터 키드니 (Baby Hamster Kidney) (BI-EK) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL- 1632 또는 ATCC CCL-1O), 및 사람 세포 (예를 들어, BEK 293 (ATCC CRL-1573)) 뿐만 아니라 조직 배양중인 식물 세포가 있다. 추가의 적합한 세포주가 당 분야에 공지되어 있고, 공개 기탁기관, 예를 들어 아메리칸 타입 컬처 콜렉션 (American Type Culture Collection, USA)으로부터 입수가능하다. 외인성 DNA를 포유동물 숙주 세포내로 도입시키기 위한 방법으로는 칼슘 포스페이트 매개된 트랜스펙션, 일렉트로포레이션(electroporation), DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 리포솜 매개된 트랜스펙션 및 바이러스 벡터가 있다.
세포는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드의 생성을 위해 적합한 영향 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 적합한 배지 중에서 그리고 폴리펩티드가 발현되고/되거나 단리될 수 있게 하는 조건하에서 수행되는 진탕 플라스크 배양, 실험실용 또는 산업용 발효기에서의 소규모 또는 대규모 발효 (연속식, 회분식(batch), 유가식(fed-batch), 또는 고체상태 발효를 포함함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당 분야에 공지된 절차를 이용하여 탄소원 및 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 수행된다. 적합한 배지는 상업적 공급업체로부터 구입할 수 있거나 공개된 조성에 따라 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션의 카탈로그에 기재된 조성) 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 영양 배지내로 분비된 경우, 이는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않는 경우, 이는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 본 발명의 FSH 변종을 고수율로 생성시키는 한 가지 방법은 US 특허 번호 4,889,803에 기재된 바와 같이 계속 증가하는 메토트렉세이트 수준의 사용에 의해 DHFR-결함 CHO 세포에서 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 증폭을 사용하는 것을 통한 방법이다.
생성된 변종 FSH 폴리펩티드는 당 분야에 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 변종 FSH 폴리펩티드는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 제조 등전 집중(preparative isoelectric focusing)), 차별적 용해도 (예를 들어, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 당 분야에 공지된 다양한 절차에 의해 정제될 수 있다.
또한, FSH 변종을 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 이러한 약제 조성물은 예를 들어 배란 유도 또는 보조 생식 기술 (ART)과 함께 난포형성을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 FSH 변종이 다수의 난포를 유도하여 발달시키고 성숙시키는 데에 효과적일 수 있으므로, 이는 다수의 난모세포를 수집하는 것이 요망되는 ART에서 사용하기에 특히 적합할 수 있다.
FSH 변종은 체내 수정에 관해 OI를 위한 단일-난포형성(mono-folliculogenesis) 또는 IUI를 위한 소수난포형성(paucifolliculogenesis) (약 3개 이하의 난포)을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 단일-난포형성은 통상적인 FSH 제제와 비교하여 덜 빈번한 투여 또는 감소된 투여량의 FSH 변종으로 달성될 수 있다. 예를 들어, OI의 경우, 본 발명의 FSH 제제는 환자 반응에 따라 3일 마다 225 내지 400 IU로 또는 보다 적은 투여량으로 투여될 수 있다. 환자 반응은 초음파검사에 의해 추적될 수 있다.
본 발명의 FSH 변종은 조절된 난소 과자극 (COH) 방법에서 사용될 수 있다. COH를 위한 표준 방법은 내인성 황체형성 호르몬 (LH)이 성선자극호르몬 방출 호르몬 (GnRH) 효능제의 투여에 의해 하향조절되는 하향조절 단계(down-regulation phase)에 이은 난포 발달 (난포형성)이 일반적으로 약 150 내지 225 IU/일에서 난포 자극 호르몬 (FSH)의 매일 투여에 의해 유도되는 자극 단계(stimulatory phase)를 포함한다. 대안적으로, 자극은 자발적 또는 유도된 월경 후에 FSH로 시작한 후 GnRH-길항제를 투여하는 것일 수 있다 (전형적으로 자극 단계의 약 6일째에서 시작함). 16mm가 넘는 3개 이상의 난포 (1개는 18mm임)가 존재하는 경우, hCG의 단일 볼루스(bolus) (5 내지 10,000 IU)가 천연 LH 급증(surge)을 의태(mimic)하고, 배란을 유도하기 위해 제공될 수 있다. 난모세포 회수는 hCG 주입 이후 36 내지 38시간 동안 이루어도록 시간맞추어질 수 있다.
또한, FSH 변종은 OI 및 IUI를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, FSH 자극은 75 내지 150 IU의 1일 투여량으로 자발적 또는 유도된 월경 후에 시작될 수 있다. 1개 또는 3개의 난포가 16 mm 이상의 직경에 도달한 경우, hCG의 단일 볼루스를 투여하여 배란을 유도할 수 있다. 정액주입은 일상적 성교 또는 IUI에 의해 생체내에서 수행될 수 있다.
FSH 변종이 야생형 FSH 제제에 비해 증가된 반감기를 지닐 수 있기 때문에, 상기 기재된 것과 같은 방법은 FSH의 보다 적은 IU 투여량을 사용할 수 있고/있거나 FSH 자극 기간을 감소시킴으로써 변형될 수 있으며, 난포의 수 및 생존성 면에서 동일하거나 보다 우수한 반응을 달성한다. 예를 들어, 적절한 난포형성은 약 50 내지 150, 50 내지 100 또는 50 내지 75 IU FSH의 매일 투여량 또는 이와 근사한 투여량으로 달성될 수 있다. FSH의 투여는 1일 1회(daily)로 또는 1일 2회(semi-daily)로 이루어질 수 있다. 투여 기간은 약 14일, 12일, 11일 또는 10일이거나 그 미만일 수 있다. OI의 경우, FSH 변종 제제는 일 당 25 내지 150 또는 50 내지 125 IU FSH의 투여량으로 투여될 수 있다. 남성 불임을 치료하는 경우, FSH 변종 제제는 정자주입이 일상적 성교 또는 ART 기술을 통한 정자주입을 위해 적절한 수준에 도달할 때까지 주 당 3 X 150 내지 300 IU로 투여될 수 있다.
변종 FSH의 보다 긴 반감기로 인해, 이는 장기간 작용성 제제로서 투여될 수 있는데, 2일 1회 보다 적은 빈도로 투여될 수 있다. 통상적인 FSH는 2일째 마다 300 IU 또는 이와 근사한 투여량으로 투여될 수 있으며, 150 IU 또는 이와 근사한 투여량으로 매일 투여한 경우와 유사한 결과를 달성한다. 변종 FSH는 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 마다 투여될 수 있으며, 통상적인 FSH의 매일 투여와 유사하거나 이 보다 우수한 결과를 달성한다.
FSH 변종은 질병, 장애 또는 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 일면에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 약제 조성물은 치료가 필요한 포유동물에게 이러한 폴리펩티드 또는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하여 포유동물, 특히 사람을 치료하는 방법에서 사용된다.
폴리펩티드, 제제 또는 조성물의 유효량은 특히 질병, 투여량, 투여 스케줄, 폴리펩티드 또는 제제 또는 조성물이 단독으로 투여되는 지 또는 다른 치료제와 함께 투여되는 지의 여부, 조성물의 혈청 반감기 및 환자의 전반적 건강에 좌우된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 전형적으로, 제제 또는 조성물의 유효량은 치료 효과를 보장하기에 충분하다.
FSH 변종은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이란 투여된 경우 환자에서 임의의 성가신 효과를 일으키지 않는 담체 또는 부형제를 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제는 당 분야에 널리 알려져 있고, 폴리펩티드는 널리 공지된 방법에 의해 약제 조성물로 제형화될 수 있다 (참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)). 폴리펩티드를 포함하는 조성물에서 사용될 수 이는 약제학적으로 허용되는 부형제로는 예를 들어 완충제, 안정화제, 방부제, 등장화제(isotonifier), 비이온성 계면활성제 또는 세정제 "습윤제"), 산화방지제, 벌크제(bulking agent) 또는 충전제, 킬레이트화제 및 보조용매가 있다.
FSH 변종을 포함하는 약제 조성물은 액체, 예를 들어 즉시 사용가능한 용액 또는 현탁액, 겔, 동결건조된 형태 또는 임의의 다른 적합한 형태, 예를 들어 용액을 제조하기에 적합한 분말 또는 결정을 포함하는 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 조성물의 형태는 치료되는 특정 적응증에 따라 달라질 수 있고, 이는 당업자에게 명백하다.
FSH를 포함하는 약제 조성물은 정맥내, 근내, 복강내, 피내, 피하, 설하, 협측, 비내, 경피, 흡입에 의해 또는 예를 들어 파우더젝트(PowderJect) 또는 프로리스 기술(ProLease technology) 또는 펜(pen) 주입 시스템을 사용하여 임의의 다른 허용되는 방식으로 투여될 수 있다. 투여 방식은 치료되는 특정 적응증에 따라 달라질 수 있고, 이는 당업자에게 명백하다. 조성물은 피하 투여될 수 있는데, 이는 환자로 하여금 스스로 투여하게 할 수 있다.
약제 조성물은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 동일한 약제 조성물의 일부로서 포함되거나, 임의의 다른 허용되는 치료 스케줄과 동시에 또는 이러한 스케줄에 따라 폴리펩티드와 별도로 투여될 수 있다. 또한, 폴리펩티드, 제제 또는 약제 조성물은 다른 요법에 대한 보조물로서 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시되는 다수의 일면을 지닌다.
실시예 1
FSH 변종
사람 FSH의 3D 결정 구조를 사용하여 후보 당화 부위가 삽입될 수 있는 FSH 분자의 영역을 확인하였다. 2개의 FSH 분자 (4개의 서브유닛)가 결정 구조의 각각의 비대칭 단위에 존재한다. 2개의 FSH 분자를 겹쳐놓고 비교하는데, 각각의 잔기는 FSH 폴리펩티드의 적절한 폴딩을 붕괴시키지 않거나 FSH 활성을 감소시키지 않는 N-당화 부위가 삽입될 수 있는 잠재적 부위를 확인하기 위해 시각적으로 조사된다. FSH의 결정학적 구조를 FSH/FSHR 수용체 상호작용에 관한 지식과 결합시켜서 잠재적 N-당화 부위의 선택을 추가로 보조하였다. 주요한 설계 기준은 3D 구조의 최소 붕괴, 예측된 결합 및 활성화 부위의 최소 붕괴, 및 당화와 양립할 수 있는 예측가능한 3D 구조였다. 상기 기준을 기초로 하여, 하기 2개의 FSH의 α-서브유닛의 삽입 변종을 제조하였다:
| # | 돌연변이 | SEQ ID NO |
| 1 | GNFT 삽입체 | 4 |
| 2 | GNRT 삽입체 | 5 |
실시예 2
FSH 변종의 형태학적 분석
FSH α-서브유닛 변종 1 및 2의 일시적 발현으로부터의 농축된 배양 상층액의 분액을 유리 α-서브유닛 및 β-서브유닛으로부터 온전한 FSH 이종이량체의 분해를 가능하게 하는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 각각의 변종 이종이량체의 겉보기 분자량을 야생형 FSH의 겉보기 분자량과 비교함으로써, 변종 FSH가 야생형 FSH에 비해 과다당화(hyperglycosylate)되는 지의 여부를 결정할 수 있다. 간단하게는, 전기영동 후에, 단백질을 PVDF로 전기영동적으로 전달하고, FSH의 α-서브유닛에 대해 유도된 세로노(Serono) 항체 9-14를 사용하여 가시화하였다. 대조표준으로서, 야생형 사람 FSH, 변종 GM1, FSH-CTP 및 Gonal F를 또한 분석하였다. 표 1에는 분자량 표준을 기초로 하여 계산된 α-서브유닛 변종 및 야생형 β-서브유닛에 의해 형성된 이종이량체의 겉보기 분자량이 나타나 있다.
표 1
| 샘플 | Mr (kDa) | 농도 배수(Fold Conc.) |
| FSH-CTP | 45.244 | |
| Gonal F | 38.482 | 37x |
| GNFT 삽입체 | 49.375 | 36x |
| GNRT 삽입체 | 49.172 | 35x |
| GM1 | 46.202 | 40x |
| wt FSH | 45.083 | 36x |
표 1에 제시된 바와 같이, 2개의 발현된 FSH 변종, 즉, GNFT 및 GNRT 삽입체 각각은 야생형 사람 FSH와 비교하여 이종이량체의 겉보기 분자량 분포의 이동에 의해 입증되는 바와 같이 증가된 당화를 나타내었다.
실시예 3
FSH 변종의 시험관내 기능
FSH 변종의 활성을 측정하기 위해, 각각의 변종을 사람 FSH 수용체를 재조합 적으로 발현하는 CHO 세포에서 cAMP 생성을 자극하는 능력에 대해 시험하였다. CHO-FSHR 세포를 FSHR 성장 배지 [MEM α(- ) (Gibco, cat# 12561-056) + 10% 투석된 FBS (Gibco, cat#26300-020) + 600 μg/ml 제네티신(Geneticin) (Gibco, cat#10131-035) + 0.02μM MTX]에서 유지시켰다. CHO-FSHR 세포를 lOOμl/웰 중에서 2xlO4개 세포/웰로 시딩(seeding)하고 (2x106개 세포/ 10ml = 1 플레이트), 검정하기 전에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 컨플루언시(confluency)가 70% 이상인 경우 세포를 검정에 사용하였다.
모든 샘플 및 내부 표준 (Gonal F를 내부 표준으로서 사용함)에 대해 67.5 nM에서 출발하여 12점 연속 1:3 희석물을 제조하였다. 모든 희석물을 검정 배지 [DMEM/F12 (페놀 비함유, Gibco, cat #11039-021) + lmg/ml BSA (Sigma, A-6003) + 0.1 mM IBMX (3-이소부틸-1-메틸크산톤 포스포디에스테라아제 억제제, Sigma, cat#I-7018)] 중에서 제조하였다. 성장 배지를 검정 플레이트로부터 분리하고, 25 μl 검정 배지 (MA6000 cAMP MSD 키트와 함께 제공됨; Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 첨가하고, 플레이트를 회수하고, 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 그 후, 웰에 시험 샘플을 25 μl/웰로 넣고, 혼합하고, 플레이트를 회수하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션한 후, 샘플과 배지를 웰로부터 분리하였다. 그 후, 25 μl의 표준 용해 완충액 (MA 6000 메소 스케일 디스커버리 키트 (MA 6000 Meso Scale Discovery kit)와 함께 제공됨)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 실러(plate sealer) (Packard, cat#6005l85)를 사용하여 밀봉하고, 5분간 진탕시켰다. 5분 용해 인큐베이션 후, 25 μl의 용해된 세포 물질을 cAMP 메소 스케일 디스커버리 플레이트(cAMP Meso Scale Discovery plate) (MA6000 MSD 키트와 함께 제공됨)로 옮기고, 약하게 혼합하며 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 25 μl의 cAMP-AP 컨쥬게이트를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합하였다. 그 후, 25 μl의 항-cAMP 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 실러를 사용하여 밀봉하고, 실온에서 30분간 진탕시켰다. 그 후, 플레이트를 자동 플레이트 세척기로 350 μl/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 그 후, 100 μl의 사파이어(Sapphire) II RTU (Ready-To-Use) 기질 인핸서(enhancer)를 각각에 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 실러를 사용하여 덮개를 씌우고, 25℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 높은 신호를 나타내는 저수준의 cAMP 및 낮은 신호를 나타내는 고수준의 cAMP를 사용하여 웰 당 1초로 판독하였다. FSH 변종의 투여량 반응 곡선은 도 2에 도시되어 있다. EC50 값을 계산하였고, 이는 표 2에 제시되어 있다.
도 2 및 표 2에 제시된 바와 같이, FSH 변종 각각은 야생형 FSH의 시험관내 활성에 필적하는 시험관내 활성을 지닌다.
표 2
| 샘플 | EC50M |
| FSH 야생형 | 2.16E-10 |
| 클론 10C-αGNRT/βGM1 | 2.58E-10 |
| 클론 11C-αGNFT/βGM1 | 2.78E-10 |
실시예 4
FSH 변종의 생체내 반감기
2개의 상이한 로트(lot)의 GNFT 변종 및 GNRT 변종을 별개의 약력학적 (PK) 연구에서 분석하였다. 2가지 연구는 동일한 설계를 지녔다: 33마리의 21일령 미성숙 암컷 SD 래트 (체중 약 40g; Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를 5개의 처리군 (n=6) 및 1개의 기선군(baseline group) (n=3)으로 나누었다. 미성숙 암컷 래트의 선택은 FSH 활성의 생체내 생물학적 평가를 위해 이러한 일령 및 성별을 사용하는 것을 기초로 하였다. 처리군의 동물에 4 ug의 GM1 (대조표준), GNFT 변종, GNRT 변종 또는 8 ug의 Gonal-F rhFSH (대조표준)을 피하 (s.c.) 주사하였다. 혈액을 기선군으로부터는 0시간째에 그리고 처리군의 동물로부터는 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 10시간, 24시간, 48시간 및 72시간째에 (n=3/시점; 래트는 2회의 후속 샘플채취 시점에서 채혈되지 않도록 교대로 사용됨) 수집하였다. 약 0.1 ml의 혈액을 각각의 채혈시에 각각의 래트로부터 수집하고, 혈장을 수거하고, ELISA에 의해 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 둘 모두의 연구로부터 혈청에서 FSH 단백질을 측정하기 위해 사용되는 검정은 DSL FSH 코팅된 웰 ELISA(DSL FSH Coated Well ELISA) (Diagnostics Systems Laboratories, Webster, TX) 였다. 혈청 샘플을 각각 삼중으로 분석하였다.
GNFT 변종 및 GNRT 변종의 반감기는 약 17시간인 반면, GM1 및 Gonal-F 대조표준의 반감기는 각각 약 12시간 및 8시간이다. 이는 GNFT 변종 및 GNRT 변종이 야생형 FSH 보다 긴 반감기를 지님을 나타낸다.
실시예 5
생체내 생물학적 활성
GNRT 및 GNFT 변종의 생물학적 활성을 평가하기 위해 사용되는 생체내 모델은 래트 난소 중량 증가 검정이다. FSH 또는 FSH 유사 활성을 지닌 분자, 예를 들어 GNRT 및 GNFT 변종으로 미성숙 21일령 암컷 래트를 처리하면 난포의 성장 및 난모세포의 생성을 유발시킨다. 이러한 성장은 처리 기간의 종료시에 난소 중량을 측정함으로써 용이하게 검출한다. 이러한 모델에서, 시험하려는 물질을 3일간 주사에 의해 투여하고, 최종 투여 후에 난소를 수집하고 중량을 측정한다. 이러한 검정은 표지(label) 목적으로 FSH 효능을 임상 제품에 지정하기 위한 기초로서 수 십년간 사용되었다. 이는 FSH의 관련 생리학적 작용을 측정하며, 임상 제품의 성능에 대해 명료한 상관관계를 지닌다.
GNRT 및 GNFT 변종의 생체내 활성을 야생형 FSH의 생체내 활성과 비교하였다. 모든 투여량은 래트에서의 시험관내 효능 및 반감기를 고려하여 FSH의 예상된 등가성(equivalence)을 기초로 하여 규정되었다. GNRT 및 GNFT 변종은 야생형 FSH와 유사한 정도로 효능있는 FSH 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다.
SEQUENCE LISTING
<110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.
<120> FSH Mutants
<130> 1115 WO
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> Homs sapiens
<400> 1
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro
1 5 10 15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
20 25 30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
35 40 45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
50 55 60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr
65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85 90
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1 5 10 15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
20 25 30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
35 40 45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
50 55 60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65 70 75 80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
100 105 110
<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> beta subunit mutant E55N/V57T
<400> 3
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1 5 10 15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
20 25 30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
35 40 45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
50 55 60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65 70 75 80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
100 105 110
<210> 4
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> alpha subunit insertion mutant GNFT
<400> 4
Ala Pro Asp Gly Asn Phe Thr Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu
1 5 10 15
Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys
20 25 30
Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys
35 40 45
Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys
50 55 60
Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val
65 70 75 80
Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85 90 95
<210> 5
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> alpha subunit insertion mutant GNRT
<400> 5
Ala Pro Asp Gly Asn Arg Thr Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu
1 5 10 15
Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys
20 25 30
Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys
35 40 45
Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys
50 55 60
Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val
65 70 75 80
Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85 90 95
Claims (18)
- FSH의 변종 α-서브유닛(α-subunit)을 엔코딩하는 핵산으로서, 상기 α-서브유닛이 SEQ ID NO:4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 핵산.
- 제 1항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제 1항에 있어서, 벡터가 발현 벡터인 벡터.
- 제 1항에 있어서, 벡터가 SEQ ID NO:3의 서열을 엔코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 벡터.
- 제 1항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 1항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 숙주 세포.
- β-서브유닛이 SEQ ID NO:3의 서열을 포함하고, α-서브유닛이 제 1항의 핵산에 의해 엔코딩되는 서열을 포함하는 변종 FSH.
- 제 1항에 있어서, 0 내지 6개의 아스파라긴 잔기 중 어느 하나가 당화된 것인 변종 FSH.
- 제 7항에 있어서, SEQ ID NO:4이고, N5가 당화된 것인 변종 FSH.
- 제 7항에 있어서, α-서브유닛이 SEQ ID NO:5의 서열을 포함하고, N5가 당화된 것인 변종 FSH.
- (a) 제 1항의 핵산 및 SEQ ID NO:3를 엔코딩하는 제 2 핵산을 포함하는 세포를 제공하고;(b) 제 1 핵산 및 제 2 핵산을 발현시킬 수 있는 조건하에서 세포를 배양하는 것을 포함하여 FHS 변종을 생성시키는 방법.
- 제 1항에 있어서, 세포가 단백질을 당화시킬 수 있는 것인 방법.
- 제 11항에 있어서, 세포가 제 1항의 핵산 및 SEQ ID NO:3를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 단일 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제 11항에 있어서, 세포가 제 1항의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하고, SEQ ID NO:3을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제 1항의 변종 FSH를, 단독으로 포함하거나 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약제 조성물.
- 불임을 치료할 필요가 있는 포유동물에게 제 15항의 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하여 불임 포유동물을 치료하는 방법.
- 난포형성을 자극할 필요가 있는 포유동물에게 제 15항의 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하여 포유동물에서 난포형성을 자극하는 방법.
- 난소 과자극을 유도할 필요가 있는 포유동물에게 제 15항의 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에서 난소 과자극을 유도하는 방법.
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