DE2842612A1

DE2842612A1 - Antigen fuer die schwangerschaftsfruehbestimmung und schwangerschaftsverhuetende vaccine

Info

Publication number: DE2842612A1
Application number: DE19782842612
Authority: DE
Inventors: Om P Prof Bahl
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1978-02-06
Filing date: 1978-09-29
Publication date: 1979-08-09
Also published as: GB2013690B; SE8404250D0; GB2051081B; GB2013690A; BE871107A; CH650593A5; JPS6340770B2; US4234561A; JPS54105224A; FR2416014B1; IT1101251B; SE7809249L; GB2051080B; SE8404250L; AU3987978A; CA1113389A; NL7809347A; GB2051081A; FR2416014A1; AU521868B2

Description

Die Erfindung betrifft aus neuen Antigenen hergestellte Antiseren, die für den Schwangerschaftstest bei Menschen einsetzbar sind, insbesondere Antiseren, die eine immunologische Reaktion mit menschlichem Choriongonadotropin zeigen und wobei die immunologische Kreuzreaktivität mit menschlichem luteinisierendem Hormon verringert oder eliminiert wird. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung von Antigenen zur Herstellung dieser Antiseren, die auch flir die Kontrazeption, um die Schwangerschaft zu beenden, verwendet werden können.

Das menschliche Choriongonadotropin ist ein Hormon, das von der Plazenta während der Schwangerschaft gebildet wird. Die Anwesenheit des Hormons im Serum und im Urin ist ein Anzeichen für die Schwangerschaft. Die Anwesenheit dieses Hormons ist durch dessen Wirkung auf die Ovarien von Tieren und kürzlich durch den Immuntest festgestellt worden.

Da die bisher verwendeten Testmethoden nicht genügend zwischen HCG und den anderen anwesenden Hormonen, z.B. dem lutelnisierenden Hormon, unterscheiden, kann die Anwesenheit von HCG nicht eindeutig vor einigen Wochen nach der Empfängnis bestimmt werden, da der Gehalt an HCG erst dann hoch genug ist, so daß das HCG auch in Gegenwart von Störsubstanzen festgestellt werden kann.

Die Verwendung von empfindlichen Verfahren, z.B. des Radioimmuntests, hat sich praktisch nicht durchgesetzt, weil die bisher erhältlichen Antiseren für das HCG nicht nur reaktiv

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gegenüber dem HCG sind, sondern auch mit den anderen anwesenden Hormonen, z.B. dem menschlichen luteinisierendem Hormon (HLH), follikelstimulierendem Hormon (FSH) und thyroidstimulierendem Hormon reagieren. Dazu kommt es, weil die Isoimmunisation mit dem HCG zu der Herstellung von Antikörpern führt, die mit HLH, follikelstimulierendem Hormon und thyroidstimulierendem Hormon kreuzreagieren. Diese Hormone ähneln einander, da sie aus zwei nicht kovalent gebundenen Untereinheiten, den α- und ß-Untereinneiten bestehen. Während die α-Untereinheiten in all diesen Verbindungen beinahe identisch sind, sind die ß-Untereinheiten hormonspezifisch und strukturmäßig unterschiedlich aufgebaut. Bei der Verwendung einer ß-Untereinheit des HCG (HCG-ß) als Antigen wird ein spezifischer wirkendes Antiserum erzeugt, das jedoch immer noch eine merkbare Kreuzreaktivität mit HLH zeigt. Die molekulare Grundlage für diese Kreuzreaktivität ist die Anwesenheit einer beachtlichen Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz des HCG-ß und HLH-ß, insbesondere im aminoterminaien 75-%-Bereich des Moleküls. Das carboxy-terminale 32-Restepeptid ist spezifisch für HCG-ß. Der aminoterminale 7 5 %-Bereich des Moleküls enthält sechs Intraketten-Disulfidbrücken, die die Konformation des Moleküls bestimmen. Es wird angenommen, daß die Konformation des Moleküls für den größten Teil der Antigenwirksamkeit des HCG wie auch für die immunologische Kreuzreaktivität mit HLH verantwortlich ist.

Neben der Verwendung für die Feststellung der Schwangerschaft ist das HCG auch für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft notwendig. Daher kann die Schwangerschaft beendet werden, wenn das Hormon neutralisiert wird. Die Neutralisation des HCG ist die Grundlage der schwangerschaftsunterbrechenden Vaccine. Die Entstehung des Antikörpers für das HCG ist beim Menschen mit zwei Hauptproblemen verbunden. HCG ist ein menschliches Hormon und

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der Mensch erzeugt normalerweise keinen Antikörper für ein menschliches Hormon. Diese Begrenzung kann durch eine Modifizierung des HCG überwunden werden, und zwar in der Weise, daß es vom menschlichen System nicht als eigenes Hormon registriert wird, sondern als Fremdmaterial. Darüber hinaus besteht noch ein weiteres Problem. Der Antikörper zum HCG würde auch ein anderes Hormon, insbesondere das luteinisierende Hormon (LH) der vorderen Hypophyse (das für den normalen menschlichen Fortpflanzungszyklus notwendig ist) neutralisieren. Diese Schwierigkeit kann zum Teil überwunden werden, indem man eine der beiden Komponenten des HCG-MoIeküls, die als ß-Untereinheit gekennzeichnet ist, verwendet, wobei der Antikörper hierfür überwiegend das HCG neutralisiert. Es mangelt jedoch noch immer an der gewünschten Spezifität.

Aus der US-PS 3 903 262 ist ein Verfahren zur Modifizierung von Serumglobulinen bekannt, bei dem die Disulfidbrücken reduziert und gespalten werden und anschließend die aufgespalteten Disulfidbrücken alkyliert werden, um die Antikomplementaktivität dieser Globuline zu reduzieren. Die obige US-PS enthält jedoch keinen Hinweis über die Modifizierung von Serumglobulinen zur Herstellung eines Antikörpers, der selektiv auf eines von mehreren Hormonen wirkt. Die obige Patentschrift enthält auch keinen Hinweis über die Konjugation von Globulinen mit anderen Proteinen.

Aus Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1976, 73(1), Seiten 218 bis 222, ist ein Verfahren zur Konjugation der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine mit dem Tetanustoxoid zur Verringerung der Kreuzreaktivität mit anderen Hormonen, z.B. dem follikelstimulierenden Hormon, thyroidstimulierendem Hormon und luteinisierendem Hormon bekannt. Diese Druckschrift enthält jedoch keinen Hinweis über die Reduzierung und Spaltung der Disulfidbrücken.

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Aus Biochem. Biophys. Res. Comm. 70, (1976), Seiten 525 bis 532, ist die Modifizierung der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins mittels Reduzierung und Spaltung der Disulfidbrücken und Alkylierung der reduzierten und gespaltenen DlsulfldbrUcken bekannt. Diese Derivate des HCG-ß weisen eine verringerte immunologische Reaktivität mit HCG auf, zeigen jedoch einen größeren Verlust in ihrer immunologischen Kreuzreaktivität mit menschlichem luteinisierendem Hormon. Es wird angegeben, daß diese Derivate, in denen 3 bis 5 der insgesamt 6 Intraketten-Disulfidbrücken reduktiv gespalten sind und alkyliert sind, Antikörper erzeugen, die reaktiv gegen HCG sind. Es wird weiter angegeben, daß das Derivat bei dem alle sechs Disulfidbrücken reduktiv gespalten und alkyliert sind, immunologisch inaktiv i^t. In dieser Druckschrift wird weiterhin darauf verwiesen, daß die Spezifität des HCG,das drei Disulfidbrücken enthält und S-alkyliert ist, durch Konjugation mit Tetanustaxoid verbessert werden kann. Im Gegensatz zu der obigen Literaturstelle Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. wird in dieser Literaturstelle darauf verwiesen, daß die Konjugation des nicht-modifizierten HCG-ß mit Tetanustoxoid die immunologische Kreuzreaktivität mit menschlichem luteinisierendem Hormon nicht bevorzugt reduziert.

Es besteht daher das Bedürfnis nach einem Derivat des menschlichen Choriongonadotropins, das als Antigen die Bildung von Antikörpern, insbesondere für das HCG stimuliert, wobei die Antikörper eine verringerte oder keine immunologische Kreuzreaktivität zu HLH aufweisen sollen. Ein derartiges Derivat könnte sowohl für die Herstellung von Antiseren für die Verwendung beim Schwangerschafttest mittels eines Immuntests und auch als Vaccine für die Verhütung oder Beendigung der Schwangerschaft verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestim-

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mung der Schwangerschaft beim Menschen. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein geeignetes und empfindliches Verfahren für die Feststellung der Schwangerschaft, bei dem die Schwangerschaft bereits kurz nach der Empfängnis festgestellt werden kann. Es soll weiterhin ein Schwangerschaftstest zur Verfügung gestellt werden, der auf die Feststellung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in den Körperflüssigkeiten, wie dem Serum und dem Urin, beruht.

Weiterhin soll ein Antiserum für die Feststellung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin beim Immuntest zur Verfügung gestellt werden. Gegenstand der Anmeldung sind auch Antigene, die für die Herstellung von Antiseren geeignet sind, die spezifisch mit menschlichem Choriongonadotropin reagieren und die eine verringerte oder keine Kreuzreaktivität zum menschlichen luteinisierendem Hormon aufweisen.

Es soll auch ein Verfahren zur Kontrazeption durch Verabreichung eines Antigens, das in der Lage ist, das menschliche Choriongonadotropin zu neutralisieren, zur Verfügung gestellt werden. Gegenstand der Erfindung ist auch die chemische Modifizierung der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins zu solchen Antigenen.

Es wurde festgestellt, daß Antiseren für menschliches Choriongonadotropin mit verringerter immunologischer Kreuzreaktivität zum menschlichen luteinisierendem Hormon und für einen Schwangerschaftstest mittels einer Immununtersuchung hergestellt werden können, indem man Antigene verwendet, die eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins, das durch reduktive Spaltung und Alkylierung aller sechs Intraketten-Disulfidbrücken modifiziert worden ist, enthalten. Das HCG-ß, bei dem alle sechs Disulfidbrücken gespalten und alkyliert sind, kann ge-

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gebenenfalls noch mit einem Protein konjugiert werden, tun seine Immunogenizität zu erhöhen. Nach einer Ausgestaltung der Erfindung betrifft diese ein Antigen, das eine ß-üntereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, bei dem 3 bis 5 der Disulfidbrücken reduktiv gespalten und alkyliert sind und das weiterhin mit einem Protein oder einem Hapten zur Verstärkung seiner immunologischen Spezifität konjugiert ist. Alternativ dazu kann die ß-Untereinheit des HCG auch durch oxidative Spaltung der intraketten-Disulfidbrücken modifiziert sein.

Die erfindungsgemäße Aufgabenstellung wird gelöst durch Antiseren, die im allgemeinen selektiv mit menschlichem Choriongonadotropin in einem unterschiedlichen Ausmaß im Vergleich zum luteinisierendem Hormon reagieren, wobei die Antiseren nach folgendem Verfahren hergestellt werden:

Isolierung der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins (HCG-ß),

Spaltung von 3 bis 6 der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit,

Alkylierung der erhaltenen reduzierten intraketten-Disulfidgruppen,

gegebenenfalls Konjugation der so modifizierten ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, wodurch die Antikörperreaktion gegenüber dem Antigen verstärkt wird, wenn es an ein Lasttier verabreicht wird,

Verabreichung des so hergestellten Antigens an ein Wirtstier, wobei die Antikörper zu dem Antigen in dem Wirtstier erzeugt werden und

Isolierung eines Antiserums enthaltend die Antikörper zu dem verabreichten Antigen aus dem Wirtstier.

Alternativ dazu kann auch die ß-Untereinheit des HCG, das

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durch oxidative Spaltung von 3 bis 6 der Intraketten-Disulfidbrücken modifiziert worden ist und gegebenenfalls mit einem Protein oder Hapten konjugiert worden ist, an das Wirtstier verabreicht werden, um die Antikörper herzustellen, die anschließend aus dem Wirtstier gewonnen werden. Solch ein Antiserum ist für die Verwendung in Standardimmuntestverfahren für die Feststellung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten, z.B. Blut und Urin, geeignet. Die Erfindung erfaßt auch die Verhütung und Beendigung der Schwangerschaft durch Verabreichung eines Antigens an die Frau, wobei das Antigen wie folgt hergestellt wird:

Isolierung der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine (HCG-ß),

Spaltung von 3 bis 6 der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit,

Alkylierung der so reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen,

gegebenenfalls Konjugierung der so modifizierten ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, wodurch die Antikörperreaktion gegenüber dem Antigen verstärkt wird.

Durch Verabreichung des Antigens, das durch oxidative Spaltung der Intraketten-Disulfidgruppen des HCG-ß hergestellt worden ist und das gegebenenfalls mit einem Protein oder Hapten konjugiert ist, kann bei der Frau ebenfalls die Verhütung oder Beendigung der Schwangerschaft erreicht werden.

Das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete menschliche Choriongonadotropin wird nach einer der Standardmethoden hergestellt. Ein entsprechendes Material mit einer relativ niedrigen Reinheit ist im Handel erhältlich. Das HCG wird dann mittels üblicher Verfahren gereinigt. Ein geeig-

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netes Reinigungsverfahren ist in J. Biol. Chem. 244:567, 1969, beschrieben.

Im folgenden wird das Reinigungsverfahren zur Herstellung » des HCG beschrieben:

Das Reinigungsverfahren umfaßt drei Verfahrensschritte der Säulenchromatographie, die bei einer Temperatur von 4⁰C vorgenommen werden. Das rohe im Handel erhältliche HCG wird über eine DEAE-Sephadex A-50-Chromatographiersäule, die mit einem 0,04 M Tris-phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 7,5 äquilibriert worden ist, Chromatograph!ert. Die Eluierung der Säule wird mit dem obigen Äquilibrierungspuffer begonnen und dann in diskontinuierlicher Weise fortgesetzt in einer Reihe von Pufferlösungen mit steigendem Natriumchloridgehalt. Diese von der Säule abgenommene Lösung wird auf Protein durch die Messung der Absorption bei 278 nm und auf die hormonale Potenz mittels einer Radioimmununtersuchung kontrolliert. Die aktivste Fraktion wird dann auf eine andere DEAE-Sephadex A-50-Säule gegeben, die mit einem 0,04 M Trisphosphatpuffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, pH 7,5, äquilibriert worden ist, gegeben. Die Säule wird dann mit einem kontinuierlichen Gradient einer 0,1 bis 0,2 M Natriumchloridlösung in einem 0,04 M Trisphosphatpuffer, pH 7,5, eluiert. Zum Schluß wird die Haupthormonfraktion von der letzten Verfahrensstufe mittels der Chromatographie über eine Sephadex G-100-Säule, die mit einem 0,04 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, äquilibriert ist, gereinigt. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer eluiert. Die aktive Fraktion wird mittels einer Ultrafiltrationszelle (Fa. AMICON) konzentriert, dialysiert und lyophilisiert.

Die ß-Uhtereinheit des HCG wird dann isoliert, indem man das gereinigte HCG abtrennt und nachfolgend sukzessiv

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chromatographiert. Es wird eine schrittweise Chromatographie der kontinuierlichen GradientChromatographie vorgezogen. Dieses Verfahren ist z.B. beschrieben in Biochem. Biophys. Res. Comm. 40:422, 1970 und in Hormonal Proteins and Peptides, C. H. Li, Ed., Acad. Press, Seite 170, 1973.

Für die Isolierung der Proteinfraktionen können übliche Ionenaustauscherkolonnen einschließlich der Carboxymethylcellulose-, Phosphorcellulose-, Carboxymethyl-Sephadex-, SuIfo-propy-Sephadex- und Hydroxyappatita-Säulen verwendet werden. Bei der Verwendung einer stufenweisen Eluierung werden die besten Ergebnisse erhalten. Die Salzkonzentration in der Pufferlösung, die für die Eluierung des HCG-ß verwendet wird, steigt von einer Konzentration von 0,0 M bis auf 3- bzw. 4-M bei der stufenweisen Eluierung an.

Im folgenden wird das Verfahren zur Isolierung der ß-Untereinheit beschrieben:

Die Reinigung des HCG-ß schließt die Dissoziation des HCG in einer 0,1 M Natriumacetatpufferlösung, pH 5,5, in Gegenwart von 8 M hochreinem Harnstoff bei 40⁰C für 1 Std. ein, woran sich die Abtrennung der dissoziierten Untereinheiten auf einer DEAE-Sephadex-Säule anschließt. Vor der Verwendung der Probe wird die Säule mit einer 0,04 M Trisphosphatpufferlösung, pH 7,4, äquilibriert. Die Eluierung der Säule wird mit der Äquilibrierungspufferlösung begonnen und mit einer Pufferlösung von 0,04 M Trisphosphat, pH 7,4, enthaltend steigende Salzkonzentrationen im Bereich von 0,05 M bis 0,3 M. Die α-Untereinheit wird mit der anfänglichen Pufferlösung elulert, da die ß-Untereinheit erst von der Säule eluiert wird mit einer Pufferlösung enthaltend 0,1 bis 0,2 M Natriumchlorid. Die ß-Untereinheit-Fraktion wird weiterhin über eine Chromatographiersäule vom

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Typ Sephadex G-100, die vorher mit einer 0,1 M Natriumacetatpufferlösung, pH 5,0, äquilibriert und eluiert worden ist, gereinigt. Alle Verfahrensschritte auf der Chromatographiersäule werden vorzugsweise bei einer Temperatur von 4⁰C durchgeführt. Um die letzten Spuren des störenden HCG-a oder des HCG von den ß-Untereinheiten zu .entfernen, wird die Fraktion über eine Immunadsorptionssäule gegeben, wobei das Immunadsorptionsmittel hergestellt worden ist durch Behandlung eines gesammelten Anti-HCGof-Serums voiv hyperimmunen Kaninchen mitGlutaraldehyd gemäß der Standardmethode.

Um das undissoziierte HCG und die α-Untereinheit des HCG (HCG-a) zu entfernen, kann das gereinigte HCG-ß mit einem Anti-HCG-a-Immunadsorptionsmittel behandelt werden.

Die Verfahren zur Herstellung der Anti-HCG-a-Immunadsorptionsmittel sind bekannt. Ein Verfahren zur Herstellung dieser Adsorptionsmittel ist z.B. in Immunochemistry, 6:53 (1969), beschrieben.

Die Modifikation des Proteins durch die Spaltung der Disulfidbrücken entweder durch Oxidation oder durch Reduktion zur Herstellung von zwei -SO^H- oder -SH-Gruppen anstelle einer Disulfidbrücke ist ein bekanntes Verfahren, obgleich es bisher noch nicht für die Behandlung von ft-HCG verwendet worden ist. Die üblicherweise verwendeten Oxidationsmittel umfassen z.B. Portnylhydroperoxid, Halogen, H₂O₂, Luftoxidation und Natriumsulfid. Die Oxidationsbedingungen entsprechen denen, die üblicherweise bei der Spaltung von Disulfidbrücken verwendet werden. So kann die Oxidation z.B. in einem wäßrigen Medium bei 0 bis 40⁰C durchgeführt werden. Es können auch niedrigere oder höhere Temperaturen verwendet werden, falls dies wünschenswert ist. Bei der Oxidation werden die Intraketten-Disulfid-

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gruppen der Cystinreste und die Sulfidgruppen in den Methioninreaten des HCG-ß oxidiert. Für die Herstellung des spezifischen Antigens wird jedoch die Reduktion und Alkylierung der Oxidation vorgezogen.

Geeignete Reduktionsmittel sind z.B. Dithiothreit (DTT), Dithloerythrit (DTE), ß-Mercaptoäthanol und Natriumborhydrid. Bevorzugt als Reduktionsmittel werden DTT und DTE. Die Zahl der reduzierten und gespaltenen DisulfidbrUcken wird durch Einstellung der Reaktionsbedingungen kontrolliert, insbesondere durch die Menge des verwendeten Reduktionsmittels, der Konzentration des Proteins in der Reaktionsmischung, die Reaktionszeit, Temperatur und den pH-Wert. Die Reduktion wird vorzugsweise unter milden Bedingungen durchgeführt, so daß die DisulfidbrUcken im Cystinrest selektiv reduziert werden und die Reduktion anderer Aminosäurereste des Proteins z.B. der Tyrosyl-jTrypsyl-, Histidyl- und Methioninreste so gering wie möglich gehalten wird. Dies kann durch Kontrolle der Reaktionstemperatur, des pH-Wertes oder der Reaktionszeit erreicht werden.

Die Reduktion kann bei Raumtemperatur oder bei einer kurz darüber oder darunter liegenden Temperatur, z.B. zwischen 0 und 4O⁰C, durchgeführt werden. Die Reaktion wird vorzugsweise bei etwa 37⁰C durchgeführt.

Die Reduktion wird geeigneterweise unter milden alkalischen Bedingungen, z.B. bei einem pH-Wert von etwa 7,2 bis 9, insbesondere etwa 8 bis 8,6, durchgeführt.

Das Reduktionsmittel kann als Lösung zu der Proteinlösung zugefügt werden oder umgekehrt oder auch als Feststoff zu der Proteinlösung hinzugegeben werden. Alternativ dazu, jedoch weniger geeignet, kann das Protein auch in der Re-

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Cdpv

duktionslösung gelöst werden oder das Reduktionsmittel und das Protein können trocken miteinander vermischt werden und dann gleichzeitig in dem wäßrigen Reaktionslösungsmittel gelöst werden, bis die gewünschte Proteinkonzentration erreicht ist, z.B. wenigstens etwa 1 %, insbesondere etwa 5 bis 18 %.

Das Ausmaß der Umsetzung kann, falls gewünscht, kontrolliert werden, indem die Reaktionsmischung auf nicht-umgesetztes Reaktionsmittel untersucht wird. Wenn kein wei-' teres Reduktionsmittel mehr verbraucht wird, ist die Reaktion beendet.

Die Reaktion kann in Anwesenheit von Luft oder unter einer inerten Atmosphäre, z.B. unter Stickstoff, durchgeführt werden. Die Reduktion wird bevorzugt unter einer Stickstoffatmosphäre vorgenommen.

Die molare Konzentration des Reduktionsmittels für das Protein ist abhängig von der Proteinkonzentration in der Reaktionsmischung, dem pH-Wert, der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur und der Reaktionsatmosphäre. Es ist theoretisch wenigstens ein Mol Äquivalent des Reduktionsmittels für die Reduktion einer Disulfidbrücke pro Mol Protein und zur Herstellung von zwei -SH-Gruppen notwendig. Daher beträgt die theoretische untere Menge des Reduktionsmittels wenigstens 1 Mol Äquivalent für Jede zu reduzierende Disulfidbrücke. Es werden daher wenigstens etwa 3 Mol Äquivalente des Reduktionsmittels für die Herstellung des erfindungsgemäß modifizierten HCG-ß verwendet. Es wird jedoch ein Überschuß des Reduktionsmittels im Bereich der 2- bis 20fachen theoretischen Menge verwendet, um die gewünschte Zahl von DisulfidbrUcken zu reduzieren und zu spalten. Im allgemeinen wird ein relativ großer molarer Überschuß des Reduktionsmittels verwendet,

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wenn eine größere Zahl, z.B. 5 oder 6, der Disulfidbrücken reduziert und gespalten werden sollen.

Das Protein liegt vorzugsweise in einer etwa A χ 10 bis 8 χ 10 molaren Konzentration vor. Wenn die bevorzugten Reduktionsmittel, das Dithiothreit und Dithioerythrit verwendet werden, liegen diese vorzugsweise in einer etwa 5 x 10" bis 9 x 10~^ molaren Konzentration vor.

Für den Fall einer experimentellen Bestimmung der gewünschten Bedingungen für die Reduktion und Spaltung einer bestimmten Zahl von Disulfidbrücken wird die Zahl der zu reduzierenden und zu spaltenden Disulfidbrücken in einem gesonderten Versuch über die Aminosäureanalyse des modifizierten Proteins bestimmt. Diese Analyse wird nach den dem Fachmann bekannten Standardverfahren durchgeführt. Jede gespaltene Disulfidbrücke ergibt zwei Cystein-(halbes '\ysi ein )reste. Die Zahl der gespaltenen Disulfidbrücken in dem Versuch entspricht der halben Zahl der Mole Cystein, dividiert durch die Gesamtmole des Proteins .

Die bei der Reduktion hergestellten Schwefelwasserstoffgruppen müssen geschützt werden, da anderenfalls die Disulfidbrücke zurückgebildet wird. Der notwendige Schutz kann durch eine einfache Alkylierung der Schwefelwasserstoffgruppen mit einem geeigneten Alkylierungsmittel vorgenommen werden. Das Alkylierungsmittel kann eines der üblicherweise verwendeten Alkylierungsmittel sein, vorausgesetzt daß die erhaltene Mercaptogruppe stabil und physiologisch verträglich ist.

Unter dem Ausdruck "Alkylierung", wie er für die Schwefelwasserstoff gruppen, die bei der reduktiven Spaltung der

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- atf -

Disulfidgruppen gebildet werden, verwendet wird, wird der Ersatz des Wasserstoffatoms der Schwefelwasserstoffgruppe durch eine Carboxymethyl-, Carboxamidmethyl-, Aminoäthylgruppe oder eine entsprechenden Gruppe verstanden. Dieses Verfahren ist ein in der Proteinchemie oft verwendetes Verfahren, das nach bekannten Methoden durchgeführt wird.

Die Alkylierung wird geeigneterweise in dem gleichen Reaktionsgefäß vorgenommen, in dem die reduktive Spaltung durchgeführt wurde. Es wird eine ausreichende Menge an Alkylierungsmittel für die Umsetzung mit dem restlichen Reduktionsmittel und zur Umwandlung aller in dem Reduktionsprodukt enthaltenen freien -SH-Gruppen zu alkylierten Mercaptogruppen eingesetzt. Die genaue Struktur des Alkylierungsmittels ist nicht kritisch vorausgesetzt, daß die erhaltene alkylierte Mercaptogruppe stabil und physiologisch unbedenklich ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die alkylierten Mercaptogruppen die folgenden Formeln auf:

-S-CH₂-R, worin R für -H, -CH,, -COOH, -COOR · , -CONH₂, -CONHR¹ , -CON(R¹ )₂ , -C2N, -CH₂C=N, -CH₂NH₂, -COPh, -CH₂OH oder -CH-OH

steht, worin R¹ für eine niedere Alkylgruppe, d.h. eine Gruppe mit 1 bis 4 C-Atomen steht und Ph eine unsubstituierte Phenylgruppe oder eine Phenylgruppe mit 1 bis 3 einzelnen Substituenten, z.B. Niedrigalkyl, Chlor, Brom, Nitro, Amid, Amin, Niedrigalkoxy, Niedrigalkoxycarbonyl bedeutet. Beispiele für derartig substituierte Phenylgruppen sind z.B. p-Toluyl, sym-Xylyl, p-AmidiuophenyI, m-Chlorphenyl und p-Methoxyphenyl. Die alkylierte Mercaptogruppe kann auch eine -S-CH-CH₂-CON(R¹)-C0-Gruppe,

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S-(Niedrigalkoxycarbonyl)R'-Gruppe, z.B. Äthoxycarbonyläthylmercapto- und eine -S-(Carboxy)-R¹-Gruppe, z.B. Äthoxycarbonylmercapto- oder eine andere niedere Alkylmercaptogruppe mit einer funktionellen Gruppe am Kohlenstoffatom der Alkylgruppe sein.

Die Alkylierungsbedingungen sind im wesentlichen die gleichen wie die die bei der Reduktionsstufe verwendet werden. Es können jedoch etwas längere Reaktionszeiten, z.B. 1 bis 2 Stunden, angesetzt werden.

Die Alkylierung der bei der reduktiven Spaltung der Disulfidbrücken hergestellten -SH-Gruppen wird bevorzugt mit Jodacetamid oder Jodessigsäure durchgeführt, um Paare von -SCH₂CONH₂- oder -SCH^OOH-Gruppen herzustellen. Die SH-Gruppen können auch durch die Alkylierung des reduzierten HCG-ß mit anderen Alkylierungsmitteln blockiert werden, um ein modifiziertes HCG-ß herzustellen, das im wesentlichen die gleichen physikalischen und biologischen Eigenschaften aufweist wie das in dem die reduzierten gespaltenen Intraketten-Disulfidbrücken ersetzt sind durch jeweils zwei-SCH₂CONFL,-Gruppen.

Die Alkylierung der SH-Gruppen zu den S-CHp-R-Gruppen, worin R für Wasserstoff oder ein Methyl steht, kann durch Behandlung des reduzierten HCG-ß mit z.B. Methyl- und Äthyljodid, erreicht werden. Substituierte Alkylthioäther können auch hergestellt werden bei Verwendung eines Halogenacetamids, z.B. von Jodacetamid, N-Alkylhalogenacetamid oder Ν,Ν-Dialkylhalogenacetamid, z.B. BrCH₂CONHC₃H₇ oder BrCH₂CON(C₂H₅); Halogenessigsäure oder dessen niederen Alkylestern, z.B. Jodessigsäure, JCH₂CO₂C₂H₅ oder ClCH₂CO₂C₂H₅; Halogenacetonitril, z.B. JCH₂CN; Alkenylnitril, z.B. Acrylnitril; Aralkylhalogenid, z.B.

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kl.

Benzylbromid, Alkylenoxid, z.B. Äthylenoxid; Phenaeylhalogenid, z.B. Phenacylchlorid und Phenacylbromid; N-Alkylmaleimid, z.B. N-Äthylmaleimid; a-Halogen-niedrigalkansäuren mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen und niederen Alkylestern davon, z.B. Äthyl-a-brompropionat und oc-Br ompr op ionsäure und Alkylenimine, z.B. Äthylenimin. Die Alkylierungsreaktionen werden unter milden alkalischen Bedingungen durchgeführt.

Die verwendeten Reaktionsbedingungen entsprechen $enen, die üblicherweise mit dem ausgewählten Alkylierungsmittel verwendet werden. Mit sehr reaktiven Mitteln werden im allgemeinen etwa 5 bis 10 Mol Äquivalente verwendet. Die genaue Menge hängt ab von der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit, der Konzentration des Proteins und des Alkylierungsmittels in der Lösung und der Zahl der freien SH-Gruppen pro Molekül. Mit weniger reaktiven Mitteln, z.B. Äthylenoxid, wird ein großer molarer Überschuß für die gewünschte vollständige Alkylierung aller freien SH-Gruppen eingesetzt.

Für vollständige Alkylierung der Produkte aus der Reduktionsstufe sind üblicherweise wenigstens 2 Mol Äquivalente, berechnet pro Äquivalent des in der Reduktionsstufe verwendeten Reduktionsmittels notwendig. Es wird vorzugsweise ein etwa 10 %iger oder größerer molarer Überschuß verwendet, um eine vollständige Alkylierung aller Reste des Reduktionsmittels und die Umwandlung aller Protein-SH-Gruppen zu-S-CHp-R-Gruppen zu garantieren. Wenn z.B. DTE in einer molaren Anfangskonzentration in der Reaktionsmischung von 8,4 χ 10~ verwendet wird, beträgt die bevorzugte Anfangsmolarität des Alkylierungsmittels in der Reaktionsmischung etwa 1,7 x 10" . Wenn ein gasförmiges Alkylierungsmittel, z.B. Äthylenoxid, verwendet wird, ist ein großer molarer Überschuß z.B. von 10 bis 50 Mol Äqui-

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valenten oder mehr für die vollständige Alkylierung aller freien SH-Gruppen notwendig. Es kann ein großer molarer Überschuß verwendet werden, z.B. bis zu 20 Mol Äquivalenten, ohne daß sich störende Ergebnisse einstellen, wenn der Überschuß des Alkylierungsmittels von dem alkylierten Produkt nach der Alkylierung z.B. durch Präzipitierung des Proteins, Dialyse oder Entsalzung über eine Sephadex-Säule abgetrennt wird.

Es wird bevorzugt mit Jodacetamid, Jodessigsäure oder Äthylenimin alkyliert. Bei Verwendung von Jodacetamid als Alkylierungsmittel wird dieses in einem 4- bis 25fachen Überschuß verwendet. Die Reaktion wird vorzugsweise bei etwa 37⁰C und einem pH-Wert von 8,5 für eine Zeit von etwa 30 Min. durchgeführt. Wenn Jodessigsäure oder Äthylenimin als Alkylierungsmittel eingesetzt werden , werden diese vorzugsweise in einem 50fachen Überschuß unter den oben genannten Bedingungen verwendet. Es wird bevorzugt, einen Puffer, z.B. einen 0,5 M Trissalzsäurepuffer, zu verwenden, um den gewünschten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Besonders geeignet ist eine Pufferlösung enthaltend 8 M Harnstoff und 2 % Äthylendiamintetraessigsäure.

Die Konjugation oder Vernetzung mit einem Protein kann nach üblichen Standardverfahren, z.B. durch Umsetzung des HCG-ß oder seiner Derivate und dem Protein in wäßriger Lösung mit Glutaraldehyd (vgl. Avarameas, S., Immunochemistry, 6:43, 1969) oder mit einem wasserlöslichen Carbodiimid gemäß Cutarcasas, P. und Anfinsen, C.B., Methods of Enzymology, XXII: 343, 1971, durchgeführt werden. Es können auch andere Verfahren eingesetzt werden, bei denen z.B. die folgenden Reagentien verwendet werden: Äthylchlorformiat,bifunktionelle Arylhalogenide, z.B. 1,3- oder 1,4-Difluor- oder-Dichlorbenzol, 2,4-Difluor- oder

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ks-

-Dichlortoluol, 4,4-Difluor- oder -Dichlor-bi-phenyl usw., 1^-Difluor^^-dinitrobenzol, bifunktionelle Isocyanate,

z.B. Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, 4,4 Diisocyanatdiphenylmethan, Hexan-1,6-diisocyanat und bifunktionelle Acylierungsmittel, z.B. Disäurehalogenide, Carbonsäuredianhydride, Dicarbonsäuren und Ester und Diamide und Imidoester, usw.

Die Konjugatio.nsverfahren unter Verwendung von Glutaraldehyd oder eines wasserlöslichen Carbodiimids werden bevorzugt.

Bei «dem bevorzugten Konjugationsverfahren unter Verwendung, von Glutaraldehyd werden das modifizierte HCG-ß oder seine Derivate und das zu konjugierende Protein in einer wäßrigen Phosphatpufferlösung (pH etwa 6,8) miteinander vermischt. Dann wird langsam eine wäßrige Glutaraldehydlösung (etwa 1 %) unter Rühren hinzugefügt und die Mischung wird dann bei Raumtemperatur für etwa 3 Std. stehengelassen. Die Lösung wird dann dialysiert, das polymerisierte Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt (z.B.

!5C) C)OO cj pro 30 Min.) und die übers tobende Phase wird auf eine Chromatographiersäule (z.B. Sephadex G-150) gegeben, um das freie HCG-ß oder seine Derivate von dem konjugierten Produkt abzutrennen.

Bei dem Carbodilmidverfahren wird das HCG-ß oder seine modifizierte Form und das Protein in der wäßrigen Lösung (pH 4,75) mit einem 5fachen Überschuß von Carbodiimid behandelt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von 0,001η HCl konstant gehalten. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 25⁰C für 1 Std. durchgeführt und danach wird die Reaktionsmischung mit Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.

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Die Konjugation mit einem Hapten, z.B. einem Peptidzusatz (Muramyl-alanyl-isoglutamin) wird wie folgt durchgeführt. Das Peptid wird mit Carbodiimid bei pH 4,75 bei 25°C für 15 Min. aktiviert. Dann wird das HCG-ß oder sein Derivat hinzugefügt und dann wird die Reaktionsmischung für 1 Std. bei 25⁰C stehengelassen. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird bei einem Wert von 4,75 mittels Zugabe von 0,001η HCl eingestellt und dann wird die Reaktionsmischung dialysiert und lyophilisiert.

Geeignete Proteine für die Konjugation mit dem HCG-ß oder seiner Derivate sind z.B. Albumin, z.B. Serumalbumin von Rindern, Kaninchen und Menschen, Eialbumin, methyliertes Albumin, im wesentlichen jedes Albumin, Hemacyaninthyroglobulin und Tetanustoxoid. Die Konjugation wird durchgeführt unter Verwendung des Verfahrens, wie es oben bei der Konjugation des HCG-ß beschrieben ist.

Das HCG-ß oder seine Derivate können durch Konjugation mit einem Hapten modifiziert werden. Die Haptene sind im wesentlichen alle Verbindungen, die in der Lage sind, die funktioneilen Gruppen am Protein, insbesondere die Aminogruppen, zu modifizieren. Die Gegenwart des Haptens am Peptid verstärkt die immunologische Spezifität des HCG-ß. Die Haptene fungieren aber auch als Schutzgruppe für die Aminogruppen des Proteins. Geeignete Haptene sind z.B. monofunktionelle Alkylierungsmittel und Acylierungsmittel. Die geeigneten Alkylierungsmittel umfassen z.B. jene, die für die Alkylierung von Schwefelwasserstoffbrücken verwendet werden als auch Verbindungen, wie 2,4-Dinitrofluorbenzol, Chlor- oder Fluorbenzol, Chlor- oder Fluortoluol, d.h. Arylhalogenide und Alkylhalogenlde. Die Acylierungsmittel umfassen saure Anhydride, z.B. Essicjsänreanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, N-Carboxy-α-

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-2O-

aminoanhydride, O-Carbobenzoxytyrosyl-amino-anhydrid, O-Carbobenzoxy-L-tyrosin-N-carboxy-a-amino-anhydrid, Säurehalogenide, Carbonsäuren und deren Ester, Amide usw.

Weiterhin können Peptidhaptene, die die Immunreaktioil· stimulieren, z.B. Muramyl-alanyl-isoglutamin, in das HCG-ß eingearbeitet werden. Es ist nowendig, zusammen mit den Peptidhaptenen eines der üblichen Konjugationsmittel zu verwenden, z.Bj eines der oben beschriebenen, um das Peptidhapten an das HCG-ß oder deren Derivat zu binden. Hierfür wird insbesondere das Carbodiimid verwendet. Es wird kein Konjugationsmittel benötigt, wenn das Hapten eine funktioneile Gruppe enthält, die in der Lage ist, direkt mit dem HCG-ß oder seinem Derivat zu reagieren.

Wenn das HCG-ß oder dessen Derivat mit einem Hapten modifiziert ist, liegen 1 bis 10 Haptenmoleküle pro Mol HCG-ß oder dessen Derivat, insbesondere 1 bis 5 Haptenmoleküle, vorzugsweise 2 bis 3 Haptenmoleküle pro Mol Protein vor. Wenn das HCG-ß oder dessen Derivat entweder als kontrazeptive Vaccine oder für die Einleitung eines Aborts verwendet wird, wird vorzugsweise die Zahl der Tyrosylreste, die in dem Protein eingearbeitet sind, begrenzt. In diesem Fall liegen vorzugsweise nicht mehr als zwei Tyrosylreste im HCG-ß oder in dessen Derivat vor. Wenn das HCG-ß oder dessen Derivat für die Herstellung eines Antiserums verwendet wird, das z.B. für den Schwangerschaftstest eingesetzt wird, ist die Zahl der Tyrosyleinheiten nicht kritisch und kann im Bereich bis zu zehn liegen.

Vor2.igsweise werden die Aminogruppen durch Anhängen von O-Carbobenzoxy-tyrosylreste geschützt. Die Schutzreaktion wird vorzugsweise durchgeführt durch Umsetzung von HCG-ß oder eines Derivats in einer wäßrigen 0,05 M Phosphatpuf-

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•4?·

ferlösung bei einem pH-Wert von etwa 7,2 in einer etwa 6,6 χ ^0~'⁾ molaren Konzentration mit einem 50fachen Überschuß an O-Carbobenzoxy-L-tyrosin-N-carboxy-oc-aminoanhydrid, gelöst in Dioxan in einer etwa 5,0 χ 10 molaren Konzentration. Die Reaktion wird vorzugsweise bei 4⁰C für 24 Std. durchgeführt und danach wird das O-Carbobenzoxytyrosylderivat durch Entsalzen auf einer Sephadex-Säule (z.B. Sephadex G-25) isoliert.

Das HCG-ß oder dessen Derivat können auch durch Kupplung der Carboxylgruppen mit einer nukleophilen Verbindung modifiziert werden, insbesondere solchen nukleophilen Verbindungen, die in der Lage sind, die Carboxylgruppe mit einer Aminogruppe zu blockieren. Geeignete nukleophile Verbindungen umfassen z.B. die Aminosäuren und deren Ester, kleine Peptide, Proteine, z.B. Glycinäthylester, Tyrosinäthylester, Alanyläthylester, Glutamyldiäthylester, Aspartyldiäthylester, Lysinäthylester, Histidinäthylester usw. Im wesentlichen kann jede Verbindung, die eine Aminogruppe enthält, verwendet werden. Die Kupplung kann durch Umsetzung einer wäßrigen Lösung von HCG-ß oder dessen Derivat mit einer nukleophilen Verbindung, z.B. Glycinäthylester-hydrochlorid in Gegenwart von Harstoff vorgenommen werden. Die Reaktion wird durch den Zusatz von Carbodiimid, z.B. 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, beschleunigt. Die Reaktion wird bei einem sauren pH-Wert z.B. einem pH von etwa 4 bis 6 und bei einer Temperatur von 0 bis 50⁰C durchgeführt. Das Reaktionsmedium ist nicht kritisch. Nachdem die Reaktion bereits fortgeschritten ist, kann weiteres Carbodiimid zugefügt werden, um die Reaktion zu vervollständigen.

Die bevorzugten nukleophilen Verbindungen sind Glycinäthylester und Tyrosinäthylester. Vorzugsweise werden diese nukleophilen Verbindungen mit den Carboxylgruppen des HCG-ß oder dessen Derivaten gekuppelt, indem man zu

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einer wäßrigen Lösung von HCG-ß oder dessen Derivat in einer molaren Konzentration von etwa 6 χ 10 eine molare Lösung des Hydrochloridsalzes der nukleophilen Verbindung und eine 7,5 molare Harnstofflösung hinzufügt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid in einer etwa 0,07 molaren Konzentration beschleunigt. Der pH-Wert wird während der Reaktion auf etwa 4,75 mittels 0,1η wäßriger Salzsäurelösung gehalten. Nach etwa 60 Min. wird eine etwa gleiche Menge des Carbodiimids hinzugefügt, um die Endkonzentration auf etwa 0,14 molar einzustellen. Dann wird die Reaktion für etwa weitere 60 Min. fortgesetzt,, und dann wird festes Ammoniumcarbonat hinzugefügt, um die Reaktion abzubrechen.

Das nach den obigen Verfahren hergestellte Antigen kann zur Herstellung von Antikörpern für das HCG entweder in Tieren, in denen ein Antiserum für den Schwangerschaftstest erzeugt wird oder in Menschen, bei denen die Schwangerschaft verhütet oder beendet wird, verwendet werden.

Das Antiserum wird nach bekannten Verfahren, die der Herstellung anderer Antikörperseren dienen, hergestellt. Hierbei wird das Tier, z.B. ein Pferd, eine Ziege, Schaf, Kaninchen, Affe, Schwein oder ein anderes Tier mit dem Antigen in regelmäßigen Abständen injiziert, bis das Blut der Tiere die gewünschte Menge des Antiserums enthält. Die Art der Verabreichung des Antigens ist nicht kritisch, es kann so oft injiziert werden, wie es praktisch möglich ist. Es hat sich in der Praxis erwiesen, daß eine Injektion pro Woche ausreichend ist. Es sind jedoch auch längere oder kürzere Injektions-Zeitabstände möglich. Die verabreichte Dosis des Antigens richtet sich

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nach dem Gewicht des Tieres. Die minimale Dosis ist die, bei der eine Antikörperreaktion im Tier verursacht wird, während die maximale Dosis die ist, bei der keine ungünstigen Nebenreaktionen eintreten. Im allgemeinen sind Dosen von etwa 2 μg/kg bis etwa 50 μg/kg, insbesondere etwa 5 bis 50 μg/kg Körpergewicht, ausreichend.

Die Injektionen werden so lange fortgesetzt, bis die gewünschte Menge an Antiserum im Blutserum vorhanden ist. Im allgemeinen sind Antiserentiter von 1:5000 bis 1:10 ausreichend.

Wenn der gewünschte Titer erreicht ist, wird eine entsprechende Menge Blut vom Tier abgezogen. Der Serumanteil des Blutes wird dann aus dem Blut gewonnen. Die Menge des abgenommenen Blutes ist eine Funktion des Gesamtblutvolumen im Tier. Im allgemeinen werden bis zu etwa 12 Vol.-96 des Blutes zu irgendeiner Zeit entnommen, ohne daß das Tier übermäßig darunter leidet.

Bei Kaninchen als Gasttieren wird etwa eine Menge von 20 bis 40 ml Blut entnommen.

Das Serum wird entnommen, indem man das Blut einfach koagulieren läßt und dann das Blutserum abdekantiert. Das Antiserum kann - falls gewünscht - aus dem Blutserum gewonnen werden. Falls gewünscht,können die Antiseren aus dem Blutserum durch Zugabe von Ammoniumsulfatlösung ausgefällt werden. Auf diese Weise wird ein etwas konzentrierteres Antiserum erhalten. Falls gewünscht kann eine zusätzliche übliche Reinigung des Antiserums vorgenommen werden.

Der Antiserum-Spiegel im Blutserum des Tieres wird dadurch bei der gewünschten Konzentration gehalten, indem man

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'SA-

falls notwendig - zusätzliches Antigen injiziert. Zusätzliches Antiserum kann vom Tier durch wiederholte ßlutabnahme in geeigneten Abständen gewonnen werden.

Ein typisches Immunisierungsverfahren unter Verwendung von Kaninchen wird wie folgt beschrieben. 100 mg des Derivats in 0,5 ml physiologischer Salzlösung werden mit dem gleichen Volumen Freunds-Adjuvants vermischt, um eine Emulsion zu bilden. Die Emulsion wird an 10 bis 20 Stellen intradermal und subkutan injiziert. Die Injektion wird in jeder Woche wiederholt, wobei die Hälfte der Anfangsmenge des Derivats an zwei Stellen subkutan oder intramuskulär verabreicht wird. Die Serumproben werden in jeder Woche aus der Ohrvene gesammelt und darauf untersucht, ob sie ¹²⁵J-HCG und ¹²⁵J-HLH binden.

Eine bevorzugte Methode für das Abziehen des Antikörpers ist in Immunochemistry 6:53» 1969, beschrieben.

Das so hergestellte Antiserum kann für jedes Immuntestverfahren bzw. Immunassay-Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von HCG in Körperflüssigkeiten, die HCG enthalten, wenn die Frau schwanger ist, z.B. im Serum und Urin, verwendet werden.

Die Körperflüssigkeit wird auf die Anwesenheit von HCG untersucht unter Verwendung des nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Antiserums in einem Immuntestverfahren. So kann die Ausfällungsreaktion, die Immundiffusion, die Komplementfixation, Hämagglutinationsinhibierung oder Radioimmunassay für die Bestimmung der Anwesenheit von HCG verwendet werden.

Die bevorzugte Methode ist der Radioimmuntest (RIA) aufgrund seiner großen Empfindlichkeit. Bei diesem Verfahren

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sä.

125 wird ein radioaktives Hormon, z.B. HCG-ß, das mit Na J nach einem Standardverfahren, z.B. dem Chloramin-T-Verfahren (vgl. J. Biol. Chem. 250:3837, 1975) jodiert worden ist, mit einem Antikörper gegen das HCG-ß inkubiert, bis alle Kombinationsstellen des Antikörpers mit radioaktivem HCG-ß(¹²⁵J-HCG-ß) besetzt sind. Die auf die Anwesenheit von HCG zu analysierende Lösung wird dann mit dem ¹²⁵J-HCG-ß-Anti-HCG-ß-Komplex inkubiert. Jedes in der zu

analysierenden Lösung vorhandene HCG wird einige der

125

radioaktiven "V-HCG-ß im Komplex ersetzen. Nach der Inkubation wird der feste Komplex aus der Lösung, z.B. durch Filtration, entfernt. Wenn HCG in der Testlösung anwesend

125

ist, wird radioaktives iJ-HCG-ß in der abgetrennten Lösung gefunden und die Menge kann über die Menge der Radioaktivität in der Testlösung bestimmt werden. Die Menge des in der Testlösung vorhandenen HCG kann von der Menge des

125
ersetzten ^vJ-HCG-ß berechnet werden. Ein geeignetes RIA-Verfahren ist z.B. in Amer. J. Obst. Gynae. 100:118, 1962, beschrieben.

Es kann auch der Festphasenradioimmuntest verwendet werden. Dieses Prüfverfahren wird aufgrund seiner Einfachheit bevorzugt. Dieses Verfahren ist bekannt und das Antiserum des vorliegenden Verfahrens kann direkt in dieses Verfahren unter Verwendung bekannter Verfahren eingesetzt werden. Wegwerfpolystyrolröhrchen werden mit einem entsprechend verdünnten Antikörper beschichtet, indem man die Röhrchen mit dem Antiserum für 30 Min. bei Raumtemperatur lagert. Die Röhrchen werden dann geleert und dreimal mit Normal-Salzlösung gewaschen. Dann werden sie mit einem 10bigen normalen männlichen Serum für 16 Min. behandelt. Die so hergestellten beschichteten Antikörper röhrchen werden dann für den Radioimmuntest eingesetzt. Zu einer Reihe dieser Röhrchen werden serienmäßig verdünnte

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•S3·

HCG-Proben mit einer Konzentration von 4 ng bis 2 000 ng/ Röhrchen in einem Boratpuffer zugegeben. Die Testproben des Serums oder des Urins in dem Boratpuffer werden in zweifacher Ausführung zu einem anderen Paar von Röhrchen gegeben. Nach der Zugabe von ¹²^J-HCG (50 000 cpm) zu Jedem Röhrchen werden die Röhrchen für 15 Min. bei 37⁰C inkubiert, anschließend geleert, dreimal mit Normal-Salzlösung gewaschen und dann im γ-Zähler ausgezählt.

Die Verwendung von Antiseren im Immuntest, insbesondere beim Radioimmunverfahren, ermöglicht die Feststellung von HCG auch in Anwesenheit von LH (luteinisierendem Hormon). Auf diese Weise ist es möglich, eine Schwangerschaft in sehr frühem Stadium festzustellen. Da die Menge des HCG im frühen Stadium der Schwangerschaft geometrisch ansteigt, kann durch die Aufzeichnung der Menge des HCG eine frühzeitige abnormale Schwangerschaft erkannt werden. Wenn das HCG-Niveau entweder arithmet isch ansteigt oder sogar abfällt, ist dies ein Zeichen für eine abnormale Schwangerschaft. Die frühzeitige Erkennung abnormaler Schwangerschaften ist von extremer Bedeutung, insbesondere bei ektopischen Schwangerschaften. Die frühzeitige Feststellung einer ektopischen Schwangerschaft ermöglicht die Vermeidung einer

Salpingotomie, Somit kann also die Gefahr der Beschädigung des Eileiters verhindert oder eingeschränkt werden.

Der HCG-Test kann auch für die Diagnose und Aufzeichnung der Chemotherapie von HCG-absondernden Tumoren, z.B. eines Choriokarzinoms, verwendet werden. Das Testverfahren entspricht dem das beim Schwangerschaftstest verwendet wird. Die Anwesenheit von HCG in der Körperflüssigkeit einer nicht-schwangeren Frau ist ein Anzeichen für ein HCG-absoJiderndes Tumor. Der Behandlung kann sich

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- äff -

• 54·

eine Aufzeichnung des HCG-Niveaus anschließen. Wenn der Gehalt auf Null gesunken ist, hat die Behandlung zur Eindämmung des Tumors geführt.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Antigene zur Verhütung bzw. Beendigung der Schwangerschaft werden die Antigene der Frau verabreicht, um die Bildung von Antikörpern, die das HCG neutralisieren, zu verursachen. Dem Empfänger wird eine wirksame Menge des Antigens mittels Injektion, vorzugsweise intravenös verabreicht. Die gesamt in einer oder mehreren Injektionen zu verabreichende Menge wird durch das Körpergewicht des Empfängers bestimmt. Die Gesamtdosis liegt im allgemeinen bei einigen Milligramm pro kg oder weniger. Die Menge des verabreichten Antigens muß jedoch ausreichen, um die gewünschte Antikörperreaktion auszulösen, sie soll jedoch nicht ausreichen, um Nebenreaktionen auszulösen. Die Dosis liegt normalerweise bei etwa 2 bis 50 μg/kg Körpergewicht, vorzugsweise bei 2 bis 10 μg/kg Körpergewicht. Eine typische Dosis liegt im Bereich von 100 bis 500 μg. Im allgemeinen wird die Dosis wiederholt verabreicht, z.B. zwei- bis viermal, um die notwendige Reaktion zu stimulieren. Das Antigen kann in Form einer Lösung in einem handelsüblich erhältlichen menschlichen Hilfsstoff, z.B. in einer isotonischen Natriumchloridlösung, verabreicht werden.

Es ist auch möglich, das Antigen oral zu verabreichen, wobei das Antigen mit Lipiden kombiniert wird. Bei dieser Verabreichungsform wird das Antigen im Intestlnaltrakt adsorbiert und geht direkt in das Blut über.

Die Verfahren zur Beendigung der Schwangerschaft oder zur Verhütung der Konzeption sind im wesentlichen identisch. Das Antigen auf dem Träger, das Vaccin, wird gemäß dem

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• -fs·

oben angegebenen Verfahren verabreicht. Wenn eine Verhütung der Konzeption gewünscht ist, wird das Antigen periodisch verabreicht, um den notwendigen Antikörperspiegel in der Frau aufrechtzuerhalten.

Nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das Antiserum nach einem Verfahren hergestellt, das gekennzeichnet ist durch die Isolierung der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins, die Reduzierung und Spaltung aller sechs der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit, die Alkylierung der reduzierten Intraketten-Disulfidbrücken und die Isolierung des dabei hergestellten Antigens, die repetitive Verabreichung des Antigens an ein Wirtstier, wobei jede Verabreichung in einer Menge vorgenommen wird, die ausreicht, um eine signifikante Antikörperreaktion auszulösen, Fortsetzung der repetitiven Verabreichung, bis das Tier eine Antikörperreaktion zu dem Antigen zeigt und anschließende Gewinnung des Antiserums aus dem Tier.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines Antiserums, das im allgemeinen selektiv auf menschliches Choriongonadotropin in einem ausreichenden Ausmaß gegenüber dem luteinisierendem Hormon reagiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine erste Menge Antigen an das Tier verabreicht, wobei das erste Antigen durch Isolierung der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins hergestellt worden ist, Reduzierung und Spaltung von fünf der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit, Alkylierung der reduzierten intrakettendisulfidbrücken und Isolierung des dabei hergestellten Antigens und nachfolgende Verabreichung eines zweiten Antigens, das auf die gleiche Weise hergestellt worden ist, Jedoch mit der Ausnahme, daß sechs Intraketten-Disulfid-

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brücken gespalten und alkyliert worden sind, an das gleiche

Wirtstier.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Antigen, das in der Lage ist, wenn es an ein Tier verabreicht wird, die Bildung eines Antikörpers zu induzieren, der im allgemeinen selektiv auf menschliches Choriongonadotropin in ausreichendem Ausmaß neben luteinisierendem Hormon reagiert, wobei das Antigen eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, bei der sechs der Intraketten-Disulfidbrücken reduziert und gespalten worden sind und wobei die gespaltenen DisulfidbrUcken alkyliert worden sind und worin die ß-Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder einem Hapten, das die Antikörperreaktion des Antigens, wenn es an ein Tier verabreicht wird, verstärkt, konjugiert ist.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Antigen weiterhin modifiziert werden, indem man die endständige Carboxylgruppe mit einer nukleophilen Verbindung, vorzugsweise einem Tyrosinäthylester oder Glycinäthylester, umsetzt.

Weiterhin betrifft die Erfindung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein Antigen, das in der Lage ist, wenn es an ein Tier verabreicht wird, einen Antikörper zu bilden, der im allgemeinen in einem ausreichenden Ausmaß selektiv gegenüber menschlichem Choriongonadotropin neben dem luteinisierenden Hormon reagiert, wobei es eine ß-üntereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, bei dem fünf der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die Antikörperreaktion des Antigens, wenn es an _ein Tier verabreicht wird, verstärkt₍konjugiert ist.

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Die bevorzugten Proteine und Heptene sind Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung betrifft ein Antigen, das in der Lage ist, wenn es an ein Tier verabreicht worden ist, die Bildung eines Antikörpers zu induzieren, der im allgemeinen in ausreichendem Maße selektiv gegenüber menschlichem Choriongonadotropin im Verhältnis zum luteinisierenden Hormon ist und der eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, bei dem die vier der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten das die Antikörperreaktion des Antigens, wenn es an ein Tier verabreicht wird, verstärkt₍konjugiert ist. Die bevorzugten Proteine und Haptene sind Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Antigen, das in der Lage ist, wenn es an ein Tier verabreicht wird, einen Antikörper zu bilden, der im allgemeinen selektiv gegenüber menschlichem Choriongonadotropin reagiert, und zwar in einem ausreichendem Ausmaß neben luteinisierendem Hormon, das eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, indem drei der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die Antikörperreaktion des Antigens, wenn es an ein Gasttier verabreicht wird, verstärkt,konjugiert ist. Die bevorzugten Proteine und Haptene sind Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanylisoglutamin.

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. In den folgenden Beispielen wird unter dem Begriff "DEAE-Sephadex" ein handelsübliches Chromatographiermaterial verstanden» das das Diäthylaminoäthylsephadex enthält und das Sephadex G-100 ist ein vernetztes Polydextran-Chromatographiermaterial.

Beispiel 1

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung verschiedener erfindungsgemäßer Antigene.

Herstellung von HCG und dessen Untereinheiten:

Das menschliche Choriongonadotropin (12 000 Iu/mg) wurde aus einer handelsüblichen Zubereitung mit einer Potenz von 4 100 Iu/mg hergestellt» wobei im wesentlichen das Reinigungsverfahren von O.P.Bahl, J. Biol. Chem. 244:567» 1969» mit der Ausnahme eingesetzt wurde, daß der pH-Wert während der Reinigung auf einem Wert von 7»4 gehalten wurde.

Die ß-Untereinheit des HCG wurde durch Dissoziation des HCG mit 10 molarem Harnstoff hergestellt, anschließend wurde sukzessive über eine Säule aus vernetztem Polysaccharid (DEAE-Sephadex) chromatographiert, wobei ein schrittweiser Gradient anstelle eines kontinuierlichen Gradienten verwendet wurde und dann wurde über Sephadex G-100 chromatographiert» gemäß dem Verfahren beschrieben in Biochem. Biophys. Res. Comm. 40:422, 1970.

Behandlung des HCG-ß mit Anti-HCG-a-Immunadsorptionsmitteln:

Zur Entfernung der Restmengen an HCG-a oder HCG» falls überhaupt vorhanden, wird das HCG-ß mit Anti-HCG-ot-Immunadsorbens behandelt. Das Immunadsorbens wurde aus gesammelten Se-

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. 59·

ren von Anti-HCG-α gemäß dem Verfahren von S.Avrameas und T. Ternynck, Immunochemistry 6:53» 1959» hergestellt und auf die Wirksamkeit gemäß der Methode nach Bahl, et al.» Biochem. Biophys. Res. Comm. 70:525» 1976» untersucht. 2 mg des hochreinen HCG-ß in 5 ml Phosphatpuffersalzlösung (PBS) wurden mit 10 g (Naßgewicht) des Immunadsorbens für 2 Std. bei 25⁰C behandelt. Das Adsorptionsmittel wurde zentrifugiert und das Sediment wurde mit 10 ml PBS gewaschen. Die überstehende Phase wird durch Lyophilisierung konzentriert und auf einer Sephadex-G-25-Säule entsalzt.

Eadioligand-Rezeptor-Assay:

Die HCG-ß-Zubereitungen wurden mittels der Radioligand-Rezeptor-Prüfmethode (ERA) auf HCG-Verunreinigungen untersucht . Das Prüfverfahren wurde durchgeführt unter Verwendung von Rattenhodenhomogenaten (vgl. R. Bellisario und O.P. Bahl, J. Biol. Chem. 250:3837. 1975).

Modifikation der Disulfidbrücken bei teilweiser Reduktion des HCG-ß und Carboxamidmethylierung:

0,2 μΜοΙ HCG-ß in 3 bis 5 ml 0,5 M Tris-Salzsäurepuffer, pH 8,5» enthaltend 8 M Harnstoff und 2 $> Äthylendiamintetraessigsäure wurden zu 2 bis 25 μΜοΙ Dithioerythrit gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 37⁰C für 30 Min. unter Stickstoff inkubiert (vgl. R.B. Carlsen, O.P. Bahl und W. Swaminathan, J. Biol. Chem. 248:6810, 1973). Nach der Zugabe von 5 bis 60 μΜοΙ Jodacetamid wurde die Inkubation für weitere 30 Min. fortgesetzt. Die reduzierten und S-Carboxamidomethylderivate des HCG-ß wurden auf einer groben Sephadex G-25-Säule (2,5 x 100 cm) entsalzt und die Fraktionen des Proteinpeaks wurden gesammelt und lyophilisiert. In Tabelle I sind die experimentellen Bedingungen für die verschiedenen Grade der Disulfidbrückenspaltungen und die Alkylierung zusammengefaßt.

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Modifikation der Disulfidbrücken durch. Reduktion und S-Carboxymethylierung oder S-Aminoäthylierung des HCG-ß:

Lie Reduktion der Disulfidbrücken des HCG-ß wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die so hergestellten Schwefelwasserstoffgruppen wurden mit einem 50fachen Überschuß Jodessigsäure für die S-Carboxymethylierung oder mit Äthylenimin für die S-Aminoäthylierung nach dem Verfahren von Carlsen et al. umgesetzt. Die Derivate wurden dann auf einer Sephadex "G-25-Säule entsalzt.

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O CD OO CO

TABELLE I

Bedingungen für die Reduktion und S-Carboxamidmethylierung

Menge des HCG-ß (μΜοΙ)	Volumen der Reaktionsmischung (ml)
0,09	2
0,09	2
0,22	5
0,35	5
0,35	5
0,35	5

Menge des Di- thioerythrit (uMol)	Menge Jod- acetamid (uMol)
1.5	3,0
1.C	2,4
2,5	7,5
4,2	8,4
21,8	48,6
42,3	83,8

■"■bestimmt über die Aminosäureanalyse

Zahl* der S-Carboxyamidmethyl-Cysteinresxe

4,6 6,3 4,9 8,4 9,4 12,2

-J₅- 2642612 •63-

Schutz der Aminogruppen über O-Carbobenzoxytyrosylreste:

1,5 ml einer Lösung von 0,1 μΜοΙ DS,-HCG-ß in 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, wurden zu 5 μΜοΙ O-CBZ-L-Tyrosin-N-carboxy-a-aminoanhydrid» gelöst in 0,1 ml Dioxan, gegeben. Die Reaktion wurde bei 4⁰C für 24 Std. durchgeführt, danach wurde das O-CBZ-Tyr-HCG-ß-Derivat durch Entsalzen der Mischung über eine Sephadex G-25-Säule isoliert.

Dieses Verfahren wurde auch durchgeführt zur Herstellung des DS₃-Tyr₅-HCG-ß.

Konjugation des HCG-ß oder dessen Derivate mit Proteinen:

Die Konjugation des HCG-ß oder dessen Derivate mit Proteinen wurde durchgeführt unter Verwendung einer bifunktionellen Verbindung, z.B. Glutaraldehyd nach dem Verfahren von S. Avrameas, Immunochemistry 6:43» 1969. In einem typischen Versuch wurden 4,0 mg HCG-ß mit 4,0 mg Tetanustoxoid (TT) in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) vermischt. Dann wurde langsam die wäßrige Glutaraldehydlösung (1 #, 0,2 ml) unter Rühren hinzugefügt und dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 3 Std. stehengelassen. Danach wurde dialysiert, das polymerisierte Material wurde durch Zentrifugieren bei 50 000 g während 30 Min. abgetrennt und die überstehende Phase wurde auf eine Sephadex-G-150-Säule (1,5 x 52 cm) gegeben, um das freie HCG-ß oder dessen Derivate von dem TT-Konjugat, TT-HCG-ß, abzutrennen. Der relative Anteil des HCG-ß in dem Konjugat wurde bestimmt, indem man die Menge des HCG-ß, das nach der Reaktion erhalten worden ist, von der insgesamt für die Konjugation verwendeten Menge abzieht.

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Konjugation des HCG-ß oder dessen Derivat mit Kaninchenalbumin unter Verwendung von Glutaraldeyhd:

5,8 mg HCG-ß oder dessen Derivate und 10 mg Kaninchenalbumin in 1,0 ml einer 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung, pH 6,8, wurden in kleinen Mengen zu 100 ml 1$igen Glutaraldehyd gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 3 Std. bei Raumtemperatur gehalten. Das polymerisierte Material wurde durch Zentrifugieren bei 15 000 rpm für 15 Min. abgetrennt. Das unumgesetzte Glutaraldehyd und andere Reste wurden mittels Chromatographie über eine Sephadex G-25-Säule abgetrennt. Ein ähnliches Verfahren kann durchgeführt werden für die Verwendung anderer Proteine, z.B. Hemocyanin und Thyroglobulin.

Konjugation des HCG-ß oder dessen Derivate mit Hemocyanin unter Verwendung des Carbodiimidverfahrens:

5 mg HCG-ß oder dessen Derivat, 10 mg Hemicyanin und Carbodiimid (1 jiMol) wurden in 1 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde auf 4f75 mit 0,001 N HCl eingestellt. Die Reaktion wurde für 60 Min. bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Hemocyanin-HCG-ß-Komplex wurde von dem freien HCG-ß über eine Sephadex G-100-Säule, die mit 0,1 M Ammoniumbicarbonatlösung eluiert wurde, abgetrennt.

Modifikation der Carboxylgruppen des HCG-ß durch Kupplung mit Glycin- und Tyrosinäthylestern:

3,5 ml einer wäßrigen Lösung von HCG-ß (0,2 μΜοΙ) wurden zu Glycinäthylester-hydrochlorid oder Tyrosinäthylesterhydrochlorid (1 M) und Harnstoff (7,5 M) hinzugegeben. Die Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) bis zu einer Konzentration, von 0,07 M. Während der Reaktion wurde der pH-Wert bei einem Wert von 4,75 mittels 0,1n HCl gehalten. Nach 60 Min. wurde die gleiche Menge an Carbodiimid

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hinzugegeben, um die Endkonzentration auf 0,14 M einzustellen. Die Reaktion wurde für weitere 60 Min. fortgesetzt und dann wurde festes Ammoniumcarbonat hinzugegeben, um die Reaktion zu beenden.

Bestimmung der Modifikation mittels Aminosäureanalyse:

Um das Ausmaß der Modifikation der HCG-ß-Derivate (50 bis 150 |ig) zu bestimmen_f wurden diese für die Aminosäureanalyse mit 0,5 bis 1 ml 5»7n HCl in evakuierten abgeschlossenen Röhrchen bei 110⁰C für 24 Std. hydrolysiert. Nach der Entfernung der Säure mittels eines Rotationsverdampfers wurde das Hydrolysat auf einem Aminoeäureanalysator (Spinco Modell 120C Automatic),ausgerüstet mit einem Zeilenspreizer auf dem Registriergerät analysiert. Der Proteingehalt der Proben wurde berechnet aus den Mengen an Asparaginsäure oder Glutaminsäure, die bei der Aminosäureanalyse erhalten wurden und aus der Zahl der Reste, die sich aus der Aminosäuresequenz des HCG-ß ergeben.

Weitere Modifikationen des HCG-ß:

Das HCG-ß wurde zuerst mittels einer der oben angegebenen Verfahren modifiziert. Die erhaltenen einfach modifizierten HCG-ß-Derivate wurden dann weiter modifiziert unter Verwendung anderer Blockierungsmitteln unter den oben beschriebenen geeigneten Bedingungen. Die so erhaltenen doppelt modifizierten Derivate wurden dann mit Tetanustoxoid oder einem anderen Protein unter Verwendung von Glutaraldehyd konjugiert. Alle Derivate wurden in der jeweiligen Verfahrensstufe mittels Aminosäureanalyse bestimmt.

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Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Beurteilung der immunologischen Wirksamkeit der modifizierten ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine.

Herstellung der Antiseren:

Die Antiseren zu HCG-oc, HCG-ß, HCG und HLH wurden in männliche Neuseeland-Kaninchen erzeugt. Daran schloß sich eine Hyperimmunisierung der Kaninchen gemäß dem Verfahren von Avrameas und Ternynck an_t um einen höheren Titer und einen Antikörper mit einer hohen Affinität zu erhalten. FUr den RIA-Test wurden gesammelte Antiseren von mehr als einem Kaninchen verwendet. Der Antikörpertiter wurde un-

125 ter Verwendung von J-markierten Hormonen gemessen.

Radioimmuntest für HCG, HCG-ß und HLH:

HCG, HCG-ß und dessen Analoge für HLH wurden mit Na ^J jodiert unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens nach Bellisario et al. Der Radioimmuntest (RIA) wurde gemäß dem Verfahren nach Y. Tomoda und M.M. Hreshchyshyn, Amer. J. Obst. Gynae., 100:118, 1962, mit der Ausnahme durchgeführt, daß die Inkubationszeit 16 Std. bei 25⁰C oder 2 Std. bei 37⁰C und anschließend 16 Std. bei 4⁰C betrug. Die freien und die Antikörper-gebundenen Hormone wurden mit äthanolischen Ammoniumacetat oder der doppelten Antikörpertechnik unter Verwendung von Schaf-Anti-Kaninchen-y-Globulin abgetrennt (vgl. J.L. Vaitukaitis, et al., Amer. J. Obst. Gynae. 113:751, 1972). Die relativen Wirksamkeiten des HCG-ß und dessen Derivate in dem HCG-ß-Anti-HCG-ß-System (HCG-ß-System) wurden bestimmt durch Peststellung der Möglichkeit 50 # des -³J-HCG-B zu ersetzen. In einigen Fällen wurde auch das HCG-Anti-HCG-System ver-

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wendet. Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität der HCG-ß-Derivate mit HLH wurde das¹²⁵J-HLH-Anti-HLH-System (HLH-System) verwendet.

Die Ergebnisse der Entwicklung des Reduktionseffekts und der Alkylierung der Disulfidbrücken sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt. Dabei sind die besonderen Modifikationen des HCG durch Vorzahlen gekennzeichnet. DS., zeigt an, daß drei "Disulfidbrücken gespalten und mit Carboxyamidmethylgruppen alkyliert sind. Die Vorsilbe DS,-Cm zeigt an, daß vier Disulfidbrücken gespalten und mit Carboxymethylgruppen alkyliert sind. Die Vorsilbe DS,--Ae zeigt an, daß fünf Disulfidbrücken gespalten und mit Äthylenimin alkyliert sind. Die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn man die Disulfidbrücken oxidativ spaltet, sind wiedergegeben durch das DS₁--SuI-HCG-ß, wobei fünf der Disulfidbrücken zu SO^H-Gruppen gespalten sind.

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TABELLE II

Effekt der Reduktion und Alkylierung der Disulfidtrücken auf die immunologische Wirksamkeit des HCG-ß

O
CO
OO
CO

to

*■»

OO
GD

HCG-ß-Derivat Zahl der Alkylierungsmittel gespaltenen Disulfidbrücken

Wirksamkeit (in

HCG-ß

DS_;-HCG-ß*
DS^-HCG-ß
DSρ-HC G-S
DSg-HCG-ß
DS^-Cm-HCG-ß
DSg-Cm-HCG-ß
DSj--Ae-HC G-ß
DS^-Sul-HCG-ß

0,0 2,9 4,2

6,0

4,5 6,0 5,2 4,8

Jodacetamid

Jodessigsäure

HCG-ß-System HLH-System

Äthylenimin 6,6

lOrmylhydroperoxid 0,3

1,8

100 (4,5)**
16 ^C,5 (0,72)
0,2 0,05 (0,01) C
C

5,6

2,0

C₁Cj

(0,25)

(0,09)
(0,001)

Verhältnis HCG-ß/HLE

1,0

2,0

40,0

7,6

10,0

*Die herabgesetzten Zahlen geben die Zahl der modifizierten Disulfidtrücken an; berechnet von dem S-Carboxymethylcystein, S-Aminoäthylcystein und Cysteinsäureresten, erhalten bei der Aminosäureanalyse.

**Die Zahlen in runden Klammern geben die aktuellen Werte der LH-Wirksamkeit des HCG-ß und dessen Derivate in einem ¹25jHLH-Anti-HLH-System, worin das HLH in diesem System mit einer Wirksamkeit von 100 angesetzt ist, an.

-»- 26A2612 GS-

Die Tabelle III zeigt die Mehrfachmodifikationseffekte auf die immunologische Aktivität des HCG-ß. In dieser Tabelle haben die Vorzahlen die gleiche Bedeutung wie in Tabelle II und Tyr kennzeichnet einen O-Carbobenzoxytyrosylsubstituenten. Gee bedeutet eine Glycinäthylestergruppe, Tee bedeutet eine Tyrosinäthylestergruppe und alb bedeutet eine Konjugation mit Albumin.

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TABELLE III

Effekte der Mehxfachmodifikation auf die immunologische Wirksamkeit des HCG-ß

HCG-ß-Derivat

O CO OO Ca) IO

O *~ OO CO

HCG-ß

DS₃-Tyr₅-HCG-ß*

DS^-TYr₅-TT₁-HCG-B

^-TT₁-HCG-B
DS ₅-HC G-B-Hemocyanin
DS₃-TT₁-HCG-B
DS₃-TYr₅-TT₁-HCG-B
Gee₂₀-DS₃-TT₁-HCG-ß
DS₆-HCG-ß-alb

DSg-HCG-ß-Hemocyanin
DSg-HCG-ß-Thyroglobulin

Zahl der gespaltenen Disulfidbindungen

2,9

5,1

5,7

5,0

5,1

6,0

Zahl der modifizierten Amino- oder Carboxygruppen

Aktivität (in

NH

5,2
5,2
1,0
1,2

1,1

5,2

COOH

1,0

20,0 5,2 5,2

20,0

HCG-ß-System HLH-System

1,80*0,1 1,60*0,1 0,28*0,005

O,17±O,O5 18,0 51,0 52,0 52,0 18,0 8,0 8,0

100 (4,5) **

0,10 (0,004)

0,80 (0,005)

0,01 (0,0004)

22,0 7,0

Verhältnis HCG-ß/HLH

1 45

20 28

2,5 4,6

*Die Derivate enthalten Abkürzungen, die die Modifikation wiedergeben. Die herabgesetzteiP* Zahlen geben die Zahlen der modifizierten oder konjugierten Gruppen an. Γ^

**Die Zahlen in runden Klammern haben die gleiche Bedeutung wie in Tabelle II.

Beispiel 3

Dieses Beispiel betrifft das Verfahren zur Herstellung eines Antiserums bei einer sukzessiven Verabreichung von zwei verschiedenen Antigenen.

Es wurde ein Antiserum hergestellt, durch Verabreichung eines ersten Antigens an männliche Neuseeland-Kaninchen, wobei das Antigen hergestellt worden ist durch Isolierung der ß-Untereinheit des HCG, dann wurden fünf der Intrakettendisulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und gespalten, die erhaltenen reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen wurden alkyliert und dann wurde das so hergestellte Antigen (DS₅-HCG-B) isoliert oder das DS₅-HCG-B wurde mit einem Protein oder einem Hapten konjugiert, dann wurde dem gleichen Tier ein zweites Antigen, das auf die gleiche Weise hergestellt worden war, jedoch mit der Ausnahme, daß sechs inLraketten-Disulfidgruppen reduziert und qespalten waren, verabreicht. Das Antiserum wurde von dem Tier isoliert und dann mittels des Radioimmuntestverfahrens geprüft. Das Antiserum enthält 22 % Bindungen in dem ¹²⁵J-HCG-ß-System und keine Bindung in dem ¹²⁵J-HLH-System. Das Bindungsverhältnis HCG-ß/HLH ist demnach unendlich.

Beispiel 4

Es wurden feste Probenröhrchen für den Immuntest wie folgt hergestellt:

1. Wegwerfpolystyrolröhrchen wurden mit einer Pufferlösung, die den Antikörper (das Antiserum) enthielt, beschichtet, wobei Antikörper aus Kaninchen erhalten wurde, die mit dem erfindungsgemäß modifizierten HCG-ß immunisiert worden waren.

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2. Nach einer 1/2 Std. wurden die Röhrchen geleert und dreimal mit einer Normalsalzlösung gewaschen.

3. 10 ml eines 1Obigen männlichen Normalserums in einem Boratpuffer wurden für 10 Min. in die Röhrchen gegeben. Diese Röhrchen können in der Nacht vor dem Versuch vorbereitet werden, vorausgesetzt, daß sie entsprechend gekühlt werden.

4. 10 Standardröhi'chen werden mit 0,6 ml Boratpuffer beschickt. Dann werden 0,6 ml HCG-Standardlösung (2 ng/ml) zu dem ersten Röhrchen hinzugegeben und dann wird dieses Röhrchen serienmäßig verdünnt, so daß die Standardröhrchen von 2000 ng HCG herab zu 4 ng HGG enthalten und das letzte Röhrchen schließlich 0 HCG enthält.

5. Dann werden 0,1 ml des männlichen Normalserums zu jedem Röhrchen hinzugefügt, um das Volumen der Patientenröhrchen auszugleichen.

6. Das Patientenserum bzw. der Urin befinden sich in zwei Röhrchen. Es werden 0,1 ml des Patientenserums zu jedem der beiden Röhrchen hinzugegeben.

7. Weiterhin werden 0,2 ml ¹²^J-HCG (50 000 cpm) hinzugegeben.

8. Diese Röhrchen werden dann für 90 Min. bei 37⁰C inkubiert. Dann werden die Röhrchen geleert, dreimal mit Normalsalzlösung gewaschen und dann in einem γ-Zähler ausgezählt.

Diese Testmethode wurde verwendet für 544 Testuntersuchungen, wobei im wesentlichen vollständige Ergebnisse erhalten wurden. 184 Testproben waren positiv und 360 waren negativ.

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■IS-

Von den 184 Patienten, bei denen der Test positiv verlaufen war, hatten 65 Patienten ihre Schwangerschaft freiweillig beendet. Bei 29 Patienten stellte sich ein spontaner Abort ein. Bei 7 Patienten wurde eine ektopische Schwangerschaft festgestellt. 80 Patienten w rden entlassen und setzten ihre Schwangerschaft fort. Von den verbleibenden drei positiven Testergebnissen ist das Ergebnis der Schwangerschaft unbekannt.

Es wurden keine Fehler bei den positiven Testergebnissen festgestellt. Bei den Negativtests wurden drei Fehler ermittelt. Diese drei Falle waren alle mit einem spontanen Abort verbunden, wobei es innerhalb von 24 Std. nach dem Negativ-HCG-Test zur Fehlgeburt kam. Es wird angenommen, daß in diesen Fällen die Schwangerschaftsunterbrechung vor dem HCG-Test begann und daß die Placenta nicht mehr in der Lage war, HCG zu produzieren. Selbst mit diesen drei Fehl-Negativergebnissen zeigt das Testverfahren eine Sicherheit von 99,5 %.

Dieser HCG-Test erlaubte die Voraussage von 17 der 29 spontanen Aborte aufgrund des niedrigen HCG-Spiegels im Vergleich zu dem Spiegel während der Zeit der Gestation. Es wurde z.B. ein niedrigerHCG-Spiegel bei 4 von 7 ektopischen Schwangerschaften gefunden. Drei von diesen vier Patienten wurden operiert, da die Ektopie nicht aufgebrochen war und bei diesen Patienten wurde eine Salpingektomie verhindert. In zwei Fällen wurde eine Salpingostomie durchgeführt und der Eileiter wieder mit nur einer oder zwei Nähten verschlossen. In einem Fall wurde eine Schwangerschaft einfach aus dem Fimbriaende des Eileiters herausgenommen, wobei der Eileiter an sich nicht eingeschnitten wurde. Die verbleibenden ektopischen Schwangerschaften hatten zur Zeit der Operation alle bereits zu einer Ruptur geführt.

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Es wurden äquivalente Ergebnisse mit den folgenden modifizierten HCG-ß-Proteinen (Tabelle III) erhalten: DSc-HCG-ß-Hemocyanin DS^-HCG-ß-Thyroglobulin ÜSc-HCG-ß-Anti-HLH DSg-HCG-ß-Hemocyanin LSg-IICG-ß-Thyroglobul in DS₆-HGG-HiIfspeptid.

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Claims

P A T E N T A N S P H U C H E

1. Antigen, das in der Lage ist, bei der Verabreichung an ein Wirtstier eine Antikörperx'eakti on zu induzieren, die selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon ist, dadurch gekennzeichnet , daß es eine ß-Untereinheit des mensch! Lehen Choriongonadotropin enthält, die so reduziert ist, daß sechs der Intraketteri-Disul f idbrücken gespalten sind, die gespaltenen Disuli'idbrUcken alkyliert sind und die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder einem Hapten, das die Antikörperreaktion gegenüber dem Antigen verstärkt, konjugiert ist.

~d. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daia das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyrogiobulin und Muramyl-alany1-isoglutamiη.

'j. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch eine Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Vei'l

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4. Antigen nach Anspruch v , dadurch gekennzeichnet, die nukleophile Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

b' Antigen, das in der Lage ist, bei Verabreichung an ein ULitsLiureine Antikörperreaktion zu induzieren, die selektiv ist gegen menschliches Choriongonadotropin ι κ-..-.' π luteinisi(.-i;eiitlt.-ni Hormon, dadurch gekennzeichnet, daß es eine ß-Uritereinheit des menschlichen Choriongonadotropine enthält, dit; so reduziert worden ist, daß fünf der InLrakettun-Disultidbrückon y^apalten sind, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und worin die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt, konjugiert ist.

b. Antigen nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet» daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-i soglutamin.

7. Antigen nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

b. Antigen nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

9. Antigen, das in der Lage ist, bei der Verabreichung an ein VVir Lst ier eine Antikörperreaktion zu induzieren, die

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s<_:li:l-:L Lv gegen menschliches Choriongonadotropin in Relation zum luteinisierenden Hormon ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, die so reduziert ist, daü vier der "I nt raketten-Disu 1 iidbrücken yuspal ton sind, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und worin die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die Antikörperreaktion des Antigens verstärkt, konjugiert ist.

10. Antigen nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyΊ-i soglutamin.

11. AnLigen nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

12. Antigen nach Anspimch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

Γ'. Antigen, das in der Lage ist, bei Verabreichung an ein Gast tier eine Antikörperreaktion zu induzieren, die selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin in Helation zu dem luteinisierendem Hormon ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, die so reduziert ist, daß fünf der Intraketten-üisulfidbrücken

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-A-

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gespalten sind, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt»konjugiert ist, wobei das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

14. Antigen nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch die Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

15. Antigen nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß die-nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

16. Antigen, das in der Lage ist, bei Verabreichung an ein ein Tier eine Antikörperreaktion zu induzieren, die selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin in Eelation zu dem luteinisierenden Hormon ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine enthält, das so reduziert worden ist, daß drei der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind, die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind, und worin die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt,konjugiert ist.

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17. Antigen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

1b. Antigen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Garboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

19. Antigen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

20. Antiserum, das selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, dadurch gekennzeichnet, daß es dadurch hergestellt ist, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins isoliert, reduziert und sechs der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit spaltet, di so reduzierten Intraketten-Disulfidbrücken alkyliert und das dabei hergestellte Antigen isoliert, das Antigen an ein Tier wiederholt verabreicht, wobei jede Verabreichung in einer Menge vorgenommen wird, die ausreicht, um eine signifikante Antikörperreaktion zu induzieren und die wiederholte Verabreichung so lange fortsetzt, bis das Tier eine Antikörperreaktion gegen das Antigen zeigt, und dann das Antiserum von diesem Tier gewinnt.

21. Antiserum, das selektiv auf menschliches Choriongonatropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, da-

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durch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins isoliert, fünf der Intraketten-Disulfidbindungen der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die so reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert und die ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt, konjugiert, wobei entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchgeführt wird, dann das Antigen isoliert, das Antigen an das Tier verabreicht, wobei das Tier einen Antikörper zu dem Antigen bildet und dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

22. Antiserum nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet» daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin» Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

23. Antiserum nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

24. Antiserum nach Anspruch 23» dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem IDyrosinäthylester und Glycinäthylester.

25. Antiserum, das selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben dem luteinisierendem Hormon reagiert und das nach einem Verfahren hergestellt worden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die ß-Uh-

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tereinheit des menschlichen Choriongonadotropine isoliert, vier der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert und die ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt, konjugiert, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchführt, dann das Antigen isoliert, das Antigen an das Wirtstier verabreicht, wobei das Tier einen Antikörper zu dem Antigen bildet und dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

26. Antiserum nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

27. Antiserum nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung in der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

28. Antiserum nach Anspruch 27» dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

29. Antiserum, das selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, dadurch gekennzeichnet, daß es dadurch hergestellt wird, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins isoliert, drei der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert un spaltet, die gespaltenen Intraketten-Disulfidgruppen

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alkyliert und die ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramylalanyl-isoglutamin konjugiert, wobei entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchgeführt wird,sodann das Antigen isoliert und an ein Wirtstier verabreicht wird, wobei das Tier einen Antikörper gegen das Antigen bildet und dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

30. Antiserum nach Anspruch 29» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

31. Antiserum nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

32. Verfahren zur Herstellung des Antiserums nach Ansprüchen 20 bis 31» dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine isoliert» sechs der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten Intraketten-Disulfidbrücken alkylliert und das so hergestellte Antigen isoliert, das Antigen wiederholt an ein Tier verabreicht, wobei jede Verabreichung in einer Menge vorgenommen wird» die ausreicht» um eine signifikante Antikörperreaktion zu induzieren und die wiederholte Verabreichung fortsetzt» bis das Tier einen Antikörper für das Antigen bildet und dann das durch die Verabreichung des Antigens hergestellte Antiserum von dem Tier gewinnt.

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Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die ß-Untereinheit weiterhin konjugiert ist mit einem Protein oder Hapten, das deren immunogenetische Stärke erhöht.

34. Verfahren nach Anspruch 33» dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

ib- Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch eine Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

36. Verfahren nach Anspruch 35» dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

37. Verfahren zur Herstellung des Antiserums nach den Ansprüchen 20 bis 31,dadurch gekennzeichnet, daß man ein erstes Antigen an ein Wirtstier verabreicht, wobei das erste Antigen hergestellt worden ist durch Isolierung der ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins, Reduktion und Spaltung von fünf der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit, Alkylierung der reduzierten Intrakettendisulfidgruppen und Isolierung des so hergestellten Antigens und darin ein zweites Antigen an das gleiche Tier verabreicht, wobei dieses Antigen in der gleichen Weise hergestellt wird, jedoch mit der Ausnahme, daß sechs der Zwischenkettendisulfidgruppen reduziert und gespalten sind und dann

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das Antiaerum, das nach der Verabreichung des ersten und zw-iten Antigens gebildet worden ist, von dem Tier gewinnt.

?ti. Verfahren zur Herstellung des Antiserums nach den Ansprüchen 20 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine isoliert, fünf der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert und die ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt konjugiert,wobei entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchgeführt wird, dann das Antigen isoliert wird, und man dann das Antigen einem Tier verabreicht, wobei das Tier einen Antikörper für das Antigen bildet und man dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

40. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

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42. Verfahren nach Ansprüchen 20 bis 31, dadurch gekennkennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine isoliert, vier der Intrakettendisulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet» die reduzierten Intrakettenüisulfidgruppen alkyliert und die ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt, konjugiert, entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder Konjugation zuerst durchführt, dann das Antigen isoliert und das Antigen an das Tier verabreicht, wobei das Tier einen Antikörper für das Antigen bildet und dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

44. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

46. Verfahren zur Herstellung des Antiserums nach den Ansprüchen 20 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine isoliert, drei der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die

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reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert und die ß-Unterelnheit mit einem Protein oder Hapten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin konjugiert, entweder die Reduktion j Spaltung und Alkylierung oder Konjugation zuerst durchführt und das Antigen isoliert, dann das Antigen an ein Wirtstier verabreicht, wobei das Tier den Antikörper für das Antigen bildet und dann das Antiserum von dem. Tier gewinnt.

47. Verfahren nach Anspruch 46» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

48. Verfahren nach Anspruch 47» dadurch gekennzeichnet,

daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

49. Verfahren zur Herstellung eines Antigens, das geeignet ist, bei der Verabreichung an ein Tier einen Antikörper zu induzieren, der selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit deB menschlichen Choriongonadotropins isoliert» sechs der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten lntra-

ketten-ULsulfidgruppen alkyliert und das so hergestellte Antigen isoliert.

50. Verfahren nach Anspruch 49» dadurch gekennzeichnet» daß

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das Antigen weiterhin konjugiert wird mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Potenz verstärkt, wobei entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchgeführt wird.

51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daü das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

52. Verfahren nach Anspruch 49» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

54. Verfahren zur Herstellung eines Antigens nach Ansprüchen 1 bis 19» dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Ghoriongonadotropins isoliert, fünf der Intruketten-Üisulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten

lntraketten-^isulfidgruppen alkyliert, das Antigen mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität verstärkt, konjugiert, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchführt und dann das hergestellte Antigen isoliert.

55. Verfahren nach Anspruch 54» dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglo-

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bulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

56. Verfahren nach Anspruch 54» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch eine Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

57. Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tyrosinäthylester und Glycinäthylester.

5ü. Verfahren zur Herstellung des Antigens nach Ansprüchen 1 bia 19» dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropine isoliert, vier der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten Intraketten-Dlsulridgruppcn alkyliert, das Antigen mit eine-u Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt, konjugiert, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchführt und dann das hergestellte Antigen isoliert.

59. Verfahren nach Anspruch 5Ü, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin.

60. Verfahren nach Anspruch 59» dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch eine Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

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61. Verfahren nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und dem Glycinäthylester.

62. Verfahren zur Herstellung des Antigens nach Ansprüchen 1 bis 19» dadurch gekennzeichnet, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins isoliert, drei der Intraketten-Disulfidbriicken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert, das Antigen mit einem Protein oder Hapten,ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin konjugiert, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchführt und dann das hergestellte Antigen isoliert.

65. Verfahren nach Anspruch 62, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen weiterhin modifiziert ist durch eine Umsetzung der endständigen Carboxygruppe mit einer nukleophilen Verbindung.

64. Verfahren nach Anspruch 63» dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Tyrosinäthylester und dem Glycinäthylester.

65. Verfahren nach Anspruch 45» dadurch gekennzeichnet, daß die ß-Untereinheit isoliert wird durch eine Trennung des menschlichen Choriongonadotropins in α- und ß-Untereinheiten mit einer 1o molaren wäßrigen Harnstofflösung, das getrennte menschliche Choriongonadotropin sukzessive über eine Säule aus ver-

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netztem modifiziertem Polysaccharid unter Verwendung eines stufenweisen Gradienten und eines vernetzten Polydextrans chromatographiert, wobei die ß-Untereinheit isoliert wird und dann abschließend die isolierte ß-Untereinheit mit einem Immunadsorbens, das in der Lage ist, die α-Untereinheit zu adsorbieren, behandelt.

66. Schwangerschaftsverhütendes Vaccin-Mittel, enthaltend ein Antigen, das geeignet ist, eine Antikörperreaktion auszulösen, die selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, bei dem fünf der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind, die gespaltenen DisulfidbrUcken alkyliert sind und wobei die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt, konjugiert ist, und das Antigen in einer Dosis verabreicht wird, die ausreicht, die Wirksamkeit des menschlichen Choriongonadotropins zu inhibieren.

67. Schwangerschaftsverhütendes Vaccin-Mittel, enthaltend ein Antigen, das in der Lage ist, einen Antikörper zu bilden, der selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, das so weit reduziert ist, daß vier der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind, die gespaltenen DisulfidbrUcken alkyliert sind und wobei die Untereinheit weiterhin mit einem Protein,oder Hapten, das die Antikörperreaktion gegen das Antigen verstärkt, konjugiert ist, und das

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Antigen in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Wirksamkeit des menschlichen Choriongonadotropins zu inhibieren.

68. Schwangerschaftsverhütendes Vaccin-Mittel, enthaltend ein Antigen, das in der Lage ist, einen Antikörper zu bilden, der selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon ist, dadurch gekennzeichnet» daß das Antigen eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, das so weit reduziert ist, daß drei der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind» die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und wobei die Untereinheit weiterhin mit einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt, konjugiert ist, und wobei das Protein oder Hapten ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin, und das Antigen in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Wirksamkeit des menschlichen Choriongonadotropins zu inhibieren.

69. Antigen, das geeignet ist, an ein Wirtstier verabreicht zu werden, um eine Antikörperreaktion zu induzieren, die selektiv gegen menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins enthält, die so weit oxidiert ist, daß drei von sechs der Intraketten-Disulfidbrücken oxidativ gespalten sind.

70. Antigen nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, daß

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die ß-Untereinheit nach der oxidativen Spaltung mit einem Protein oder Hapten, das die Antikörperreaktion des Antigens verstärkt, konjugiert ist.

71. Antikörper, enthaltend ein Antiserum, das selektiv gegen HCG neben LH reagiert, das an einen festen Träger gebunden ist, wobei der Antikörper hergestellt worden ist durch ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins isoliert, drei der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert und die ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin konjugiert, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchführt und dann das hergestellte Antigen isoliert, das Antigen an ein Tier verabreicht, wobei das Tier einen Antikörper für das Antigen bildet und dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

72. Antikörper nach Anspruch 71, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein Polystyrolröhrchen ist.

73. Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, enthaltend ein Antiserum, das selektiv gegen HCG neben LH reagiert, wobei der Antikörper nach einem Verfahren hergestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins isoliert, vier von sechs der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, die reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert und die ß-Untereinheit mit

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einem Protein oder Hapten, das die immunogenetische Spezifität des Antigens verstärkt konjugiert, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchführt und dann das hergestellte Antigen isoliert, das Antigen an ein Tier verabreicht, wobei das Tier den Antikörper gegen das Antigen bildet und dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

74. Antikörper nach Anspruch 73» dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein Polystyrolröhrchen ist.

75. Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, enthaltend ein Antiserum, das selektiv gegen HCG neben LH reagiert, wobei der Antikörper nach einem Verfahren hergestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die ß-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins isoliert, sechs der Intraketten-Disulfidbrücken der ß-Untereinheit reduziert und spaltet, und die reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen alkyliert, das Antigen isoliert und das Antigen an ein Tier verabreicht, wobei das Tier den Antikörper gegen das Antigen bildet und dann das Antiserum von dem Tier gewinnt.

76. Antikörper nach Anspruch 75, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein Polystyrolröhrchen ist.

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77. Verfahren zur Verhütung oder Unterbrechung einer Schwangerschaft, gekennzeichnet durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antigens, welches zur Induzierung einer Antikörperreaktion befähigt ist und selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, wobei das Antigen die ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin umfaßt, welche derart reduziert wurde, daß sechs der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind und wobei die gespaltenen Disulfidbindungen alkyliert sind, so daß die Aktivität des menschlichen Choriongoiiadotropins inhibiert wird.

78. Verfahren nach Anspruch 77, dadurch gekennzeichnet, daß die ß-Untereinheit ferner mit einem Protein oder Hupten konjugiert ist, welches die Antikörperreaktion des Antigens bei der Verabreichung des Antigens steigert.

79. Verfahren zur Verhütung oder Unterbrechung einer Schwangerschaft, gekennzeichnet durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antigens, welches zur Induzierung einer Antikörperreaktion befähigt ist und selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, wobei das Antigen eine ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin umfaßt, welche derart reduziert wurde, daß fünf der Intraketten-Disulfidbindungen gespalten sind und wobei die gespaltenen Disulfidbindungen alkyliert sind und wobei diese ß-Untereinheit ferner mit einem Protein oder Hapten konjuigiert ist, welches die immunogenetische Spezifität des Antigens steigert, so daß die Aktivität des menschlichen Choriongonadotropins inhibiert wird.

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80. Verfahren zur Verhütung oder Unterbrechung einer Schwangerschaft, gekennzeichnet durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antigens, welches zur Induzierung einer Antikörperreaktion befähigt ist und selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, wobei das Antigen eine ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin umfaßt, die derart reduziert wurde, daß vier der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind und wobei die gespaltenen Disulfidbindungen alkyliert sind und wobei diese ß-Untereinheit ferner mit einem Protein oder Hapten konjugiert ist, welches die Antikörperreaktion des Antigens bei Verabreichung des Antigens steigert, so daß die Aktivität von menschlichem Choriongonadotropin inhibiert wird.

81. Verfahren zur Verhütung oder Unterbrechung einer Schwangerschaft, gekennzeichnet durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antigens, welches zur Induzierung einer Antikörperreaktion befähigt ist und welches selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert, wobei das Antigen die ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin umfaßt, welche derart reduziert wurde, daß drei der Intraketten-Disulfidbrücken gespalten sind und wobei die gespaltenen Disulfidbrücken alkyliert sind und wobei diese ß-Untereinheit ferner mit einem Protein oder Hapten konjugiert ist, welches iminunogenetische Spezifizität des Antigens steigert und wobei das Protein oder Hapten aus der Gruppe Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramylalanylisoglutamin ausgewählt ist, so daß die Aktivität des menschlichen Choriongonadotropins inhibiert wird.

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82. Radioimmunassay-Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Körperflüssigkeit mit einem Komplex aus radioaktiv markiertem menschlichem Choriongonadotropin und einem Antikörper kontaktiert und, nachfolgend, den Komplex von der Körperflüssigkeit trennt und die Radioaktivität entweder des Komplexes oder der Körperflüssigkeit mißt, wobei der Antikörper ein Antiserum umfaßt, welches selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert und welches hergestellt wurde durch:
Isolierung der ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin, Reduzierung und Spaltung von drei Intraketten-Disulfidbindungen der ß-Untereinheit; Alkylierung der reduzierten Intraketten-Üisulfidgruppen und Konjugation dieser ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten aus der Gruppe Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Muramyl-alanyl-isoglutamin, wobei entweder die Reduzierung, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugation zuerst durchgeführt wird; isolierung des Antigens;

Verabreichung des Antigens an ein Wirtstier, welches ansprechend auf das Antigen einen Antikörper erzeugt und Gewinnung des Antiserums aus dem Tier.

83. Radioimmunassay-Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Körperflüssigkeiten mit einem Komplex kontaktiert, welcher radioaktiv markiertes menschliches Choriongonadotropin und einen Antikörper umfaßt, worauf der Komplex von der Körperflüssigkeit abgetrennt wird und die Radioaktivität entweder dieses Komplexes oder der Körperflüssigkeit gemessen wird, wobei der Antikörper ein

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Antiserum umfaßt, welches selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert und welches nach folgendem Verfahren hergestellt wurde:

Isolierung der ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin, Reduzierung und Spaltung von vier bis sechs Intraketten-Disulfidbindungen dieser ß-Untereinheit, Alkylierung der reduzierten Intraketten-Disulfidgruppe und Konjugierung der ß-Untereinheit mit einem Protein oder llapten, welches die immunogenetische Spezifizität des Antigens steigert, wobei man entweder die Reduzierung, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugierung zuerst durchführt;
Isolierung des Antigens;

Verabreichung des Antigens an ein Wirtstier, welches ansprechend auf dieses Antigen einen Antikörper erzeugt und
Gewinnung des Antiserums des Wirtstiers.

84. Radioimmunassay-Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten durch Kontaktierung der Körperflüssigkeiten mit einem Komplex von radioaktiv markiertem menschlichem Choriongonadotropin und einem Antikörper, nachfolgende Abtrennung dieses Komplexes von der Körperflüssigkeit und Messung der Radioaktivität entweder dieses Komplexes oder der Körperflüssigkeit, wobei der Antikörper ein Antiserum umfaßt, welches im allgemeinen selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert und nach folgendem Verfahren hergestellt wurde:

Isolierung der ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin, Reduzierung und Spaltung von sechs Intraketten-Disulfidbindungen dieser ß-Untereinheit und Alkylierung der reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen.

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85. Schwangerschaftstest, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Körperflüssigkeit einer Frau dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 82 unterwirft.

8b. Schwangerschaftstest, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Körperflüssigkeit einer Frau dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 83 unterwirft.

87. Schwangerschaftstest, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Körperflüssigkeit einer Frau dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 84 unterwirft.

88. Tumortest bei Patienten, welche menschliches Choriongonadotropin bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Körperflüssigkeit des Patienten dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 82 unterwirft.

89. Tumortest bei Patienten, welche menschliches Choriongonadotropin bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Körperflüssigkeit des Patienten dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 83 unterwirft.

90. Tumortest bei Patienten, welche menschliches Choriongonadotropin bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Körperflüssigkeit des Patienten dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 84 unterwirft.

91. Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens der Schwangerschaft eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß man periodisch den Spiegel des menschlichen Choriongonadotropins des Patienten nach dem

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Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 82 bestimmt.

92. Verfahren zur Überwachung des Fortschrei tens der Schwangerschaft eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß man periodisch den Spiegel des menschlichen Choriongonadotropins des Patienten nach dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 83 bestimmt.

93. Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens der Schwangerschaft eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß man periodisch den Spiegel des menschlichen Choriongonadotropins des Patienten nach dem Radioimmunassay-Verfahren des Anspruchs 84 bestimmt.

94. Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens der Chemotherapie von menschliches Choriongonadotropin bildenden Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß man periodisch den Spiegel des menschlichen Choriongonadotropins des Patienten nach dem Radioimmunassay-Ver-

fahren des Anspruchs 82 bestimmt.

95. Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens der Chemotherapie von menschliches Choriongonadotropin bildenden Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß man periodisch den Spiegel des menschlichen Choriongonadotropins des Patienten nach dem Radioimmunassay-Verfahrens des Anspruchs 83 bestimmt.

96. Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens der Chemotherapie von menschliches Choriongonadotropin bildenden Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß man periodisch den Spiegel des menschlichen Choriongonadotropins des Patienten nach dem Radioimmunassay-Ver-

fahren des Anspruchs 84 bestimmt.

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97. Imuiiinassay-Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antiserum verwendet, welches allgemein selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert und welches nach folgendem Verfahren hergestellt wurde:

Isolierung der ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin, Reduktion und Spaltung von drei der Intraketten-Disulfidbindungen der ß-Untereinheit und Alkylierung der reduzierten Intraketten-Disulf idgruppen sowie Konjugierung dieser ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, welches aus der Gruppe Albumin, Hemocyanin, Thyroglobulin und Murainy 1-alanyl-isoglutamin ausgewählt wurde, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugierung zuerst durchführt; Isolierung des Antigens;

Verabreichung des Antigens an ein Wirtstier, wobei in dem Wirtstier ein Antikörper ansprechend auf das Antigen gebildet wird und
Gewinnung des Antiserums aus dem Tier.

98. Immunassay-Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antiserum verwendet, welches allgemein selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert und welches nach folgendem Verfahren hergestellt wurde:

Isolierung der ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin, Reduktion und Spaltung von vier bis sechs Intraketten-Disulfidbindungen der ß-Untereinheit und Alkylierung der reduzierten

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Intraketten-Disulfidgruppen sowie Konjugierung dieser ß-Untereinheit mit einem Protein oder Hapten, welches die immunogenetische Spezifizität des Antigens steigert, wobei man entweder die Reduktion, Spaltung und Alkylierung oder die Konjugierung zuerst durchführt ;

Isolierung des Antigens;

Verabreichung des Antigens an ein Wirtstier, so daß ein Antikörper ansprechend auf das Antigen gebildet wird und
Gewinnung des Antiserums vom Wirtstier.

99. Immunassay-Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antiserum verwendet, welches allgemein selektiv auf menschliches Choriongonadotropin neben luteinisierendem Hormon reagiert und nach folgendem Verfahren hergestellt wurde:

Isolierung der ß-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin, Reduktion und Spaltung der sechs Intraketten-Disulfidbindungen der ß-Untereinheit und Alkylierung der reduzierten Intraketten-Disulfidgruppen;

Isolierung des Antigens;

Verabreichung des Antigens an ein Wirtstier, wobei das Tier ansprechend auf das Antigen einen Antikörper bildet und
Gewinnung des Antiserums vom Wirtstier.

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