DD297976A5

DD297976A5 - Biologisch aktive peptide

Info

Publication number: DD297976A5
Application number: DD90341221A
Authority: DD
Inventors: Stephen James
Original assignee: ��@��@��@��k��
Priority date: 1989-06-03
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 1992-01-30
Also published as: WO1990015073A1; ATE120467T1; TW199100B; GB8912837D0; ES2069688T3; MY106188A; KR920701245A; PT94233A; IE70741B1; EP0405763B1; HU904240D0; DE69018141D1; CS272790A2; DK0405763T3; IE901965L; NZ233902A; EP0405763A1; AU5732690A; LV10629A; HUT61034A

Abstract

Die Erfindung betrifft biologisch aktive Peptide. Ein Peptid mit primaerer struktureller Homologie zu einer Sequenz von Aminosaeureresten des Wachstumshormon-freisetzenden Faktors (GRF) in dem die Positionen 28-44 umfassenden Bereich oder antigen oder immunologisch aequivalente Peptide desselben oder Salze desselben koennen in einer Antigenformulierung genutzt werden, um bei einem Wirbeltier die Wirkungen von Wachstumshormon zu verstaerken.{biologisch aktive Peptide; Aminosaeureester; Wachstumshormon-freisetzender Faktor (GRF); Antigenformulierung; Wachstumshormon; Wirbeltier}

Description

Anwendungsgeblei der Erfindung

Die Erfindung betrifft biologisch aktive Peptide.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Zahlreiche Polypeptid-Hormone, wie z. B. Wachstumshormone, sind in der Medizin oder der Viehhaltung von Bedeutung.

Wachstumshormone kommen in allen Vertebraten vor, und es ist bekannt, daß sie z. B. das Wachstum (Somatogenese) und die Milchproduktion (Lactogenese) steigern.

Die Steuerung und Freisetzung des Wachstumshormons (GH) ist von anderen Hormonen oder „Faktoren" abhängig, die bei einem Wirbeltier entweder erhöhte oder verminderte Wachstumshormonmengen bewirken können. Die Freisetzung von Wachstumshormon ist eine Reaktion auf die Wirkung eines Wachstumshormon-freisetzenden Peptids, das als Wachstumshormon-freisetzender Faktor (GRF), Wachstumshormon-freisetzendes Hormon oder Somatocrimn bekannt ist.

In zwei Originalberichten vom SaIk Institute wurde ein Warhstumshormon-freisetzendes Peptid von bis zu 44 Aminosäuren aus Tinem humanen Bauchspeicheldrüsentumor (hp) beschrieben (Rivier u.a. 1982; Guillemin u.a. 1982). Es setzt speziell ^ ' 'chstumshormone in physiologischen Dosen frei, und es wurde nachgewiesen, daß es mit dem normalerweise vom Hypothalamus sezernierten GH-freisetzenden Hormon identisch ist und daß seine Aktivität in den somatotropen Zellen der Hypophyse entfaltet. Es wurde die Ansicht vertreten, daß das Gleichgewicht von Somatostatin (Somatotropin-hemmenden Faktor) und GRF die Hypophyse am stärksten beeinflußt und so das charakteristische GH-Freisetzungsprofil der Säugetiere ergibt.

Es wurde die Aminosäuresequenz des GRF bei einer Reihe von Arten beschrieben (Felix u.a. 1985). Es handelt sich um 44 Aminosäurepeptide; der am stärksten konservierte Bereich umfaßt die Reste 1-27, und die meisten Variationen sind in den Resten 31-44 angesiedelt. Die vollständige Sequenz weist eine beträchtliche Aktivität zwischen verschiedenen Arten (crossspecies activity) auf. So löst z. B. hpGRF-44 bei Ziegen eine gute Reaktion aus (Hart u. a. 1984). Außerdem scheint die Aktivität des Moleküls hauptsächlich in dem Bereich 1-27 angesiedelt zu sein, und eine Reihe von Analoga dieses Bereichs wiesen in Modellspezies eine verbesserte Aktivität auf (Lance u.a. 1984). Wie beim Menschen kann die Verabreichung von hpGRF an Rinder den Milchertrag steigern (Enright u. a. 1986) und die Stickstoffretention mittels seiner GH-freisetzenden Aktivität erhöhen (Moseley u.a. 1987).

Artspezifische Sequenzen (aus Felix u. a. 1985)

1-27 gemeinsame Sequenz: YADAIFINSYRKVLGQLSARKLLQDIM 28-44 Mensch: GRF: SRQQGESNQERGARARL-NH₂

Schwein: GRF: SRQQGERNQEQGARVRL-NH₂

Rind: GRF: NRQQGERNQEQGAKVRL-NH₂

Ziege: GRF: NRQQGERNQEQGAKVRL-Nh₂

Schaf: GRF: NRQQGERNQEQGAKVRL-NH₂

(Die Buchstaben sind Ein-Buchstaben-Standardcodes für Aminosäuren - siehe Anlage I).

Es wurde berichtet, daß die Aktivität von Hormonen durch Antikörper, die gegen sio gebildet wurden, beeinflußt werden kann. Nach EP-A-137-234 bewirken isolierte und Tieren verabreichte Antikörper gegen Wachstumshormon eine erhöhte Aktivität des Hormons. Diese Antikörper können auch in situ erzeugt werden, indem das Wirtstier mit in geeigneter Form dargebotenen Fragmenten des in Frage kommenden Hormons geimpft wird, wie in EP A284-406 und in EP A-303-488 dargelegt wurde. Armstrong u.a. (1989) haben jedoch berichtet, daß die Immunisierung gegen das gesamte GRF-Molekül die Aktivität dieses Hormons hemmt. Ferner haben Reynolds u.a. (1989) gezeigt, daß die Immunisierung gegen bestimmte Fragmente des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CFR) dessen Aktivität aufhebt, wie anhand der verminderten Glucocorticoidkonzentration im Blutkreislauf nachgewiesen werden konnte.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Im Gegensatz dazu wurde jetzt gefunden daß die Aktivität von GRF in einem Wirbeltier potenziert werden kann, wenn diesem Wirbeltier ein bestimmtes Fragment des GRF verabreicht wird, das Antikörper gegen den intakten GRF produziert. Es wird angenommen, daß diese Potenzierung des GRF das Wachstum, die Schlachtkörperzusammensetzung, die Milchleistung und andere biologische Wirkungen des GH in dem Wirbeltier stimuliert. Es versteht sich, daß der Ausdruck „Fragment" hier den Bezug zum gesamten GRF-Molekül ausschließt.

In einem ersten Aspekt macht die Erfindung demzufolge eine Methode zur Potenzierung (Erhöhung oder Steigerung) der Aktivität des Wachstumshormon-freisetzenden Faktors in einem Wirbeltier verfügbar, indem dem Wirbeltier ein Fragment verabreicht wird, das primäre strukturelle Homologie mit dem Bereich aufweist, der die 28-44-Aminosäuresequenz des GRF (insbesondere den Bereich, der die 31-44-Aminosäuresequenz des GRF umiaßt) oder Teile derselben oder antigen oder immunogen äquivalente Peptide oder Moleküle oder Salze derselben umfaßt. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „potenzieren", daß das Fragment die Aktivität des Hormons unmittelbar oder mittelbar erhöht oder steigert.

Das Peptid kann vom nativen Protein stammen, chemisch synthetisiert oder als rekombinantes Genprodukt eines geeigneten Expressionssystems unter Nutzung der auf dem Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt worden sein.

Beim hpGRF umfaßt der Bereich 31 bis 44:

Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu unter „primärer struktureller Homologie" werden Peptide verstanden, die genaue Kopien entsprechender Bereiche von GRF-Molekülen anderer Arten und anderer Peptide, die „konservative Substitutionen" in einer oder mehreren Aminosäuren aufweisen, sind, so daß die Eigenschaften der auf diese Weise auf der Basis das Peptids produzierten Antikörper im wesentlichen unverändert sind. (Wobei der Ausdruck „konservative Substitution" funktionell wie im vorhergehenden Satz definiert ist.) Beispiele für Substitutionen, die in diesem Zusammenhang

konservativ sein können, schließen diejenigen ein, die im wesentlichen die gleiche Hydrophobizität, Größe, Ladung und/oder Aromatizität wie der ursprüngliche Aminosäurerest aufweisen. Alle derartigen Substitutionen und Modifikationen sind im allgemeinen Personen, die über Kenntnisse auf dem Gebiet der Pepticichomie verfügen, gut bekannt. In Frage kommende Substitutionen schließen folgende ein: Prolin für Glycin und umgekehrt; Alanin oder Valin für Glycin und umgekehrt; Isoleucin für Leucin oder Methionin und umgekehrt; Tryptophan für Tyrosin und umgekehrt; Histidin für Lysin und umgekehrt; Serin für Asparagin und umgekehrt; Threosin für Cystein und umgekehrt; Serin oder Alanin für Threonin und umgekehrt und Glutamin für Asparagin und umgekehrt.

Der Ausdruck „antigen äquivalent" bedeutet ein Peptid oder sein Äquivalent, das spezifisch von bestimmten Antikörpern erkannt wird, die, wenn sie gegen erfindungsgemäße Peptide oder Teile derselben gebildet werden, die biologische Aktivität einesWachstumshormon-freisetzendon Faktors in diesem oder einem ähnlichen Wirbeltier potenzieren.

Der Ausdruck „immunogen äquivalent" bedeutet, daß das Peptid in geeigneter Formulierum verwendet werden kann, um in einem Wirbaitier Antikörper zu bilden, wobei die Antikörper die Potenzierung der Wirbel de 3 Freisetzungsfaktors in diesem Wirbeltier bewirken.

Insbesondere können antigen oder immunogen äquivalente Peptide genutzt werden, die etwas kurzer oder langer als der genannte Bereich sind oder die sich im wesentlichen mit diesem Bereich überlappen. Insbesondere können antigen äquivalente Peptide, die kürzer als das Fragment sind, genutzt werden. Abweichungen von der Sequenz des dem Tier eigenen GRF können eine stärkere Immunreaktion auslösen und trotzdem Antikörper ergeben, die in der Lage sind, den eigenen GRF des Tieres oder gezielten GRF (z. B. einen über ein Implantat exogen eingeführten Faktor) zu erkennen. Folglich kann es von Vorteil sein, ein kleines erfindungsgemäßes Peptid von einer anderen Tierart als derjenigen, der das Tier angehört, dem das Peptid verabreicht wird (z. B. Verabreichung von Schafpeptiden an Schweine), zu verabreichen oder unnatürliche oder nicht-konservative Aminosäuresubstituenten in dem verabreichten Peptid zu kombinieren.

Ferner können Peptide, in denen ein oder mehrere Aminosäureresto vor oder nach der Synthetisierung des Peptids chemisch modifiziert werden, verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Funktion des Peptids - nämlich die Produktion der spezifischen Antikörper in vivo - im wesentlichen unverändert bleibt. Derartige Modifikationen schließen die Bildung von Salzen mit Säuren und Basen, speziell, mit physiologisch annehmbaren organischen oder anorganischen Säuren und Basen, die Bildung eines Esters oder Amide einer terminalen Carboxylgruppe und die Anfügung von Aminosäureschutzgruppen, z. B. N-t-Butoxycarbonyl, ein. Derartige Modifikationen können das Peptid gegen den In-vivo-Stoffwechsel schützen. Die Peptide können als einfache oder mehrfache Kopien vorhanden sein, z.B. als Tandemwiederholungen wie (31-44) + (31-44) oder (31-44) + (44-31). Solche Tandem- oder Mischfachwiederholungen können selbst genügend antigen sein, so daß die Verwendung eines Carriers überflüssig ist.

Es kann vorteilhaft sein, wenn das Peptid Schleifenform aufweist, wobei das N-terminale und das C-terminale Ende miteinander verbunden sind, oder an einem Ende einen oder mehrere Cysteinreste anzufügen, um die Antigenität zu erhöhen und/oder die Bildung von Disulfidbrückenbindungen zu ermöglichen. Wenn das Peptid kovalent mit einem Carrier, vorzugsweise einem Polypeptid, verknüpft ist, ist die Anordnung vorzugsweise so, daß das erfindungsgemäße Peptid eine Schleife bildet.

Geeigneterweise sind die Peptide am C-terminalen Ende amidiert, und eine zusätzliche Aminosäure, z. B. Cystein, wird am N-terminalen Ende angefügt, um die Konjugation zu erleichtern oder die potentielle Immunogenität zu verbessern.

In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische antigene Zusammensetzung zur Verfugung gestellt, die ein oder mehrere Peptid(e) des ersten Aspektes der Erfindung mit Mitteln zur Verfügbarmachung von Carrier- und Adjuvansfunktionen umfaßt.

Entsprechend derzeitigen immunologischen Theorien sollte jede immunogene Formulierung eine Carrierfunktion aufweisen, um das Immunsystem zu stimmulieren oder die Stimulierung desselben zu verstärken. Es wird angenommen, daß Carrier ein Helfer-T-Zellen-Epitop darstellen (oder gemeinsam mit dem Antigen schaffen). Die Peptide können z. B. durch Quervernetzung mit einem getrennten Carrier verbunden sein, z. B. mit Serumalbuminen, Myoglobinen, bakteriellen Toxciden und Keyhole Limpet Haemocyanin.

Zu den in jüngster Zeit entwickelten Carriern, die die Hilfe von T-Zellen bei der Immunreaktion induzieren, zählen Hepatitis-B-Core-Antigen (auch als Nucleocapsidprotein bekannt), mutmaßliche T-Zellen-Epitope wie z.B. Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, Betagalactosidase und das 163-171-Peptid von Interleukin-I. Letztere Verbindung kann entweder als Carrier oder als Adjuvans oder als beides betrachtet werden. Als Alternative können mehrere Kopien des gleichen oder unterschiedlicher erfindungsgemäßer Peptide miteinander vernetzt werden; in einer solchen Situation existiert kein getrennter Carrier an sich, sondern eine Carrierfunktion kann durch eine derartige Vernetzung zur Verfügung gestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel schließen diejenigen ein, die in den Katalogen von Sigma and Pierce aufgelistet sind, z.B. Glutaraldehyd, Carbodiimid und Succinimidyl,4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, wobei letzteres Agens die-SH-Gruppe auf dem C-terminalen Cysteinrest (sofern vorhanden) ausnutzt.

Vernetzt oder konjugiert wird geeigneterweise unter Verwendung von MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid) oder Glutaraldehyd, z. B. an ein Polypeptid; oder an die Peptide selbst, an ein T-Zellen-Epitop oder am geeignetsten an Keyhole Limpet Haemocyanin.

Wenn das Peptid durch Expression einer geeigneten Nucleotidsequenz in einem geeigneten Wirt gebildet wird, kann es vorteilhaft sein, das Peptid als Fusionsprodukt mit einer Peptidsoquenz zu exprimieren, die die Hilfe von T-Zellen verfügbar macht und als Carrier wirkt. Kabigens „Ecosec"-System ist ein Beispiel für eine solche Anordnung. „Ecosec" ist ein Handelsname.

Geeignete Adjuvanzien sind Fachleuten für Vakzinforschung bekannt, z. B.: komplettes oder inkomplettes Freundsches

Adjuvans, Aluminiumhydroxid, Saponin, DEAE-Dextran, Muramyldipeptid, Mineralöle, neutrale Öle (z. B. Miglyol), pflanzliche Öle (z. B. Erdnußöl), „Iscoms", Liposome, Novasome oder ähnliche Techniken, „Pluronic"-Polyole oder das Ribi-Adjuvanssystem (siehe z. B. GB-A-2189141). „Pluronic" ist ein eingetragenes Warenzeichen.

Die erfindungsgemäßen Peptide können zur Erzielung einer Doppelwirkung mit anderen Antigenen verknüpft sein. So kann das Peptid z.B. mit einem Teil oder dem gesamten Somatostatininolekül verknüpft sein, um zusätzlich zu Anti-GRF-Antikörpern wachstumsfördernde Anti-Somatostatin-Antikörper zu bilden, oder es kann mit einem Teil oder dem gesamten Geschlechtshormonmolekül verbunden sein, um gleichzeitig Immunkastration zu bewirken, oder mit einem Teil oder dem

gesamten lutuinisierenden Hormon-Freisetzungshormon (LHRH) verbunden sein, oder es kann mit einem Teil oder dem gesamten Wachstumshormonmolekül verknüpft sein, um für eine gleichzeitige Potenzierung der Wirkung des Wachstumshormons zu sorgen oder es kann mit einem anderen am Wachstum und der Anpassung der Schlachtkörperzusammensetzung beteiligten Peptidhormone verknüpft sein.

Die Peptide und Adjuvanzien und/oder Carrier können in jeder geeigneten Weise, die von Fachleuten unter Anwendung bekannteroder noch zu entdeckender Abgabevehikel und Kriterien entwickelt werden, formuliert werden. Insbesondere können die Formulierungen auf biologisch abbaubaren Polymeren, z. B. Lactidglycolid-Copolymeren wie z. B. denjenigen, die in EP-A-58481 (ICI) beschrieben sind, basieren. Die erfindungsgemäßen Peptide (unabhängig davon, ob sie mit anderen Antigenen verknüpft sind oder nicht) können zur Verstärkung anderer Peptide in Kombination mit anderen Immunisierungsprozeduien (z. B. gegen Bakterien, Virus- oder Parasiteninfektionen) genutzt werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung macht Anti-GRF-Antikörper, die gegen GRF-Sequenzen aus dem 28-44-Bereich gerichtet sind (insbesondere Anti-GRF-Antikörper, die gegen das GRF-Fragment 31-44 oder 35-44 gerichtet sind) oder ein antigen oder immunologisch äquivalentes Peptid oder Salze desselben verfügbar. Diese Anti-GRF-Antikörper können geeigneterweise mit erfindungsgemäßen GRF oder GRF-Fragmenten komplexiert werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eins Methode zur Behandlung eines normalen oder anomalen Wirbeltieres mit einem kleinen Peptid oder einer wie vorstehend beschriebenen antigenen Zusammensetzung oder Anti-GRF-Antikörpern (möglichst Anti-GRF-Antikörpern, die mit GRF oder GRF-Fragmenten präkomplexiert wurden), um die biologischen Mc ι kmale des Wirbeltieres, insbesondere die mit GH in Zusammenhang stehenden biologischen Wirkungen, zu verändern. So kann z. B. das Wachstum dieses Wirbeltieres über das Normalmaß hinaus gesteigert oder beschleunigt werden oder anomal niedrige Werte können an die Norm herangeführt werden. Ebenso kann die Milchleistung zusammen mit anderen, mit GH in Zusammenhang stehenden biologischen Wirkungen, z. B. der Schlachtkörperzusammensetzung, gesteigert oder verstärkt werden. So kann z. B. die Stickstoffretention und das Verhältnis von Muskelfleisch zu Fett ebenfalls durch solche Methoden verbessert werden. Der Ausdruck „Wirbeltier" schließt Menschen und andere Vertebraten ein.

Die e.'findungsgemäßen kleinen Peptide und Antigenzusammensetzungen werden gewöhnlich intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht, obwohl für einige erfindungsgemäße Formulierungen die intranasale, transdermale, orale und rektale Route ebenfalls geeignet sein kann. Die Verabreichung des Antigens ist ferner durch Expression in Form eines Fusionsproteins durch ein genetisch manipuliertes Bakterium, ein Virus oder eine Hefe, die sich im Wirtstier replizieren, möglich. Insbesondere können erfindungsgemäße Peptide und Antigene unter Nutzung eines bakteriellen Carriers dargeboten werden, wobei im Fachgebiet bekannte Methoden angewendet werden, z.B. unter Verwendung der doppelten Aro-Mutante von Salmonella (siehe Internationale Patent-Anmeldung PCT/GB88/01143, veröffentlicht als Internationale Publikation WO89/ 05856). Die Formulierung ist normalerweise steril und (zur parenteralen Anwendung) im wesentlichen nicht pyrogen, und eine Einheitsdosis umfaßt im typischen Fall 1 bis 1000 pg des erfindungsgemäßen kleinen Peptide, besser 10 bis 500 pg, vorzugsweise 50pg oder weniger.

Wie im Fachgebiet der Immunologie bekannt ist, können eine oder mehrere Wiederholungsimmunisierungen vorteilhaft sein. Die Formulierungen können im allgemeinen von einem Arzt oder Tierarzt aufgrund seiner Kennii.isse und Fertigkeiten hergestellt und/oder verabreicht werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung macht ein Verfahren zur Herstellung eines der vorstehend genannten Peptide nach bekannten Methoden der Peptidsynthese oder durch geeignete Spaltung des nativen GRF-Moleküls verfügbar. Die Peptidsynthese kann nach der allgemeinen Methode von Stewart u.a. (1969) oder nach den von Marglin und Merrifiold 1970 sowie in späteren Artikeln beschriebenen Methoden vorgenommen werden.

Eingeführte Methoden der Festphasen-Peptidsynthese oder ähnliche Techniken sind normalerweise für die Großproduktion nicht geeignet (obwohl das künftig durchaus der Fall sein kann), und folglich müßte die kommerzielle Produktion der Peptide normalerweise durch Züchtung eines geeigneten Organismus erfolgen, der mit einer das gewünschte Peptid codierenden Polynucleotidsequenz transformiert wurde. Aus diesem Grunde schließen weitere Aspekte der Erfindung solche Polynucleotide, Transformations- und Expressionsvektoren, die solche Polynucleotide tragen, mit denselben transformierte Organismen und Verfahren zur Züchtung solcher Organismen ein.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt nichthumane Vertebraten ein, deren Merkmale durch erfindungsgemäße Methoden verändert wurden.

Ausführungsbeispiele

Es werden nachfolgend Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen

Figur 1 die attenuierte GRF-Reaktion bei mit Anti-GRF-1-14-Antiseren immunisierten Schafen zeigt; Figur 2 die potenzierende Reaktion bei mit Anti-GRF-31-44-Antiseren immunisierten Schafen zeigt; Figur 3 die GRF-potenzierende Reaktion bei Schafen zeigt, die mit Anti-35-44-Antiseren immunisiert wurden; Figur 4 eine Titrationskurve ist, die die Entwicklung einer Anti-GRF-Reaktion bei einem immunisierten Tier veranschaulicht; Figur 5 die Wirkung von Antikörpern gegen GRF1-14,31-44 oder 35-44 auf die biologische Reaktion von Schafen auf GRF während eines Zeitraumes von 4 Stunden zusammenfaßt;

Figur 6 die Wirkung von Antikörpern gegen GRF 1-14,31-44 oder 35-44 während der ersten 60 Minuten veranschaulicht.

ALLGEMEINE METHODEN

1. Herstellung von Peptiden

Wenn nicht anders vermerkt, wurden alle Peptide nach dem Fmoc-Polyamid-Verfahren der Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. Zeitweiliger N-a-Aminogruppenschutz wird von der S-FluorenylmethyloxycarbonylfFmocl-Gruppe gewährt. Diese hochgradig basenlabile Schutzgruppe wird unter Verwendung von 20% Piperidin in Ν,Ν-Dimethylformamid mehrmals gespalten.

Die Seitenkettenfunktionalitäten sind als ihre Butylether (im Falle von Serin, Threonin und Tyrosin), Butylester (bei Glutaminsäure und Asparagin), Butyloxycarbonylderivat (bei Lysin und Histidin) Tritylderivat (bei Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonylderivat (bei Arginin) geschützt. Wo Glutamin oder Asparagin C-terminale Reste sind, wie die 4,4'-Dimethoxybenzhydrylgruppe zum Schutz der Amidofunktionalitäten der Seitenkette genutzt.

Der in fester Phase vorliegende Träger basiert auf einem Polydimethylacrylamidpolymer, das von den drei Monomeren Oimethylacrylamid (Skelettmonomer), bis-Acryloylethylendiamin (Vernetzer) und Acryloylsarcosinmethylester (funktiorialisierendes Agens) gebildet wird. Das verwendete Peptid-zu-Harz spaltbare verkettete Agens ist das säurelabile 4-Hydroxymethy!-phenoxyessigsäurederivat.

Alle Aminosäurederivate werden in Form ihrer vorgeformten symmetrischen Anhydridderivate zugesetzt; eine Ausnahme bilden Asparagin und Glutamin, die unter Verwendung eines umgekehrten N.N-Dicyclohexylcarbodiimid/I-Hydroxybenzotriazol-vermittelten Kupplungsverfahrens zugegeben werden.

Alle Kupplungs- und den Schutz aufhebenden (deprotecticn) Reaktionen werden mittels Ninhydrin-, Trinitrobenzolsulfonsäure- oder Isotin-Prüfvdrfahren überwacht.

Nach Beendigung der Synthese werden die Peptide durch Behandlung mit 95%iger Trifluoressigsäure, die ein 5%iges Spülmittelgemisch enthält, vom Harzträger unter gleichzeitiger Entfernung der Seitenkettenschuizgruppen abgespalten. Zu den gewöhnlich verwendeten Spülmitteln zählen Ethandithiol, Phenyl, Anisol und Wasser, wobei die Auswahl von den Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptids abhängt.

Trifluoressigsäure wird durch Vakuumverdampfung entfernt, wobei die nachfolgende Verreibung mit Diethylether das Rohpeptid ergibt. Etwa vorhandene Spülmittel werden durch ein einfaches Extraktionsverfahren entfernt, das bei Lyophilisierung der wäßrigen Phase das Spülmittelfreie Rohpeptid ergibt.

Die Reinigung kann durch jede beliebige oder eine Kombination von chromatographische(n) Methode(n) erfolgen, z.B. durch Größenausschlußchromatographie, lonenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie (z. B. unter Verwendung eines geeigneten monoklonalen Antikörpers) und durch Umkehrphasen-HPCL. Die Analyse der Peptide kann mittels Dünnschichtchromatographie, Umkehrphasen-HPLC, Aminosäureanalyse im Anschluß an Säurehydrolyse und massespektrometrische Analyse unter Beschüß mit schnellen Atomen (FAB) erfolgen.

2. Konjugation von Peptiden (i) Konjugation an Ovalbumin

3,0mg Peptid wurden in 300μΙ Dimethylformamid gelöst. 150μΙ 10mg/ml Ovalbumin in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurden zugegeben und gründlich vermischt. 250 μΙ frisch zubereitetes 0,04 M Glutaraldehyd wurden unter Rühren während eines Zeitraumes von 10 Minuten langsam zugefügt und dann bei Raumtemperatur weitere 60 Minuten unter ständigem Vermischen stehengelassen (SPIRAMIX, Denley Instruments). 1,0ml PBS und danach weitere ΙΟΟμΙ 0,04M Glutaraldehyd wurden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zugegeben. Das Gemisch wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen, bevor es über Nacht bei +4⁰C gegen PBS dialysiert wurde, (ii) Konjugation an Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH)

Mit Hilfe der m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-Technik- MBS - (Lerner, R. A., u.a. 1981), die von Pierce and Warriner (UK) Ltd, Chester, England, geliefert wird, oder mittels der Glutaraldehyd-Zufallsmethode wurden 5 mg Peptid an Keyhole Limpet Haemocyanin konjugiert. Die letztere Methode wurde folgendermaßen realisiert: 5mg hpGRF-Peptid wurden in 250μΙ PBS (Dulbecco) gelöst und 500μΙ KLH 10mg/rr;l in PBü wurden vermischt. 500μΙ 0,04 M Glutaraldehyd (Sigma) wurden unter Rühren tropfenweise zugegeben. Diese Mischung wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur bewegt. Weitere 1,5ml PBS, danach 500 μΙ 0,04 M Glutaraldehyd wurden wie vorstehend beschrieben zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde mittel!, einer „Spectropor" Dialysemembran mit 1 kDa CUTOFF über Nacht gegen 100 Volumeneinheiten PBS dialysiert.

3. Vernetzung

1,4mg Peptid wurden in 140μΙ Dimethylformamid gelöst, und 170μΙ 0,04M Glutaraldehyd wurden wie vorstehend beschrieben zugefügt. Dio weiteren Versuchsbedingungen entsprachen der vorstehenden Beschreibung. Wenn keine Vernetzung oder Konjugation erforderlich war, wurde das Peptid in Dimethylformamid gelöst, in PBS dispergiert, jedoch nicht dialysiert. Negative Kontrollen

Negative Kontrollreihen zu den vorstehend beschriebenen wurden hergestellt, indem das Peptid bei Ovalbumin (oder KLH) weggelassen wurde oder indem Polylysin (relative Molekülmasse 1000-2 000Da) verwendet und die Vernetzung wie vorstehend beschrieben vorgenommen wurde.

4. Freundsche Adjuvanzlen uno' die Verabreichung derselben

Nach der Dialyse wurden Jie Volumen der vorstehend beschriebenen Präparate mit FBS und „Wasser-in-ÖT-Emulsionen, die unter Verwendung von zwei Volumen von komplettem Freundschen Adjuvans (FCA) (Difco oder Sigma) hergestellt worden waren, auf 4,5 ml aufgefüllt. Das geschah durch Beschallung in der Kälte oder mittels eines Potter-Elvehjen-Homogenisators. Die Emulsionen wurden anhand der Dispersion (bzw. der Abwesenheit derselben) auf einer Wasseroberfläche getestet. Die Injektionen wurden Cheviot-Schafen (9-12 Monate alt, kastrierte Böcke, 30-35 kg) subkutan an zwei Stellen (jeweils eine an einer Flanke) verabreicht. An jeder Injektionsstelle betrug die verabreichte Menge 1 ml. Eine zweite entsprechende Immunisierung wurde 28-42 Tage später unter Verwendung eines frisch hergestellten Peptids, das auf gleiche Weise

konjugiert, jedoch in inkomplettem Freundschen Adjuvans (FIA Difco oder Sigma) emulgiert war, vorgenommen. Alle weiteren Immunisierungen erfolgten annähernd gleich, jedoch in Abständen von 28 Tagen. Mäuse erhielten in entsprechenden Zeitabständen 0,1 ml des Präparats intraperitoneal.

5. Andere Adjuvanzien und Verabreichung derselben

DEAE-Dextran (über Nacht in zweimal destilliertem Wasser vollständig hydratisiert;, Pharmacia), Saponin (Sigma) und Aluminiumhydroxid („Al-hydrogel") wurden entweder allein oder in Kombination verwendet. Nach der Dialyse wurde folgendes zugegeben: 3,1 ml PBS plus 7ml 5%iges DEAE-Dextran (Dd) plus 2,8ml 5mg/ml Saponin; oder 5,9ml PBS plus 7ml 5%iges Dd; oder 10,1 ml PBS plus 2,8 ml 5mg/ml Saponin. Aluminiumhydroxid („AIOH") wurde, wo geeignet, in einer Endkonzentration von 1 ,Omg/ml verwendet. Die Emulgierung war nicht erforderlich, es wurde jedoch sorgfältig darauf geachtet, daß die Bestandteile in homogener Suspension gehalten wurden. Den Schafen wurde 1 ml wie vorstehend beschrieben verabreicht. Die Immunisierungen wurden in den gleichen Abständen vorgenommen.

6. Blutproben (Schafe)

Den in den Test einbezogenen Schafen wurden durch Punktion der Jugularvene Blutproben von 10 ml unmittelbar vor der Verabreichung und in bestimmten Abständen danach entnommen. Nachdem sich bei Raumtemperatur ein Blutgerinnsel gebildet hatte (etwa 3-5 Stunden), wurde das Serum nach dem Zentrifugieren zum Nachweis von Antikörpern durch Radioimmuntest entnommen. Größere Serumproben wurden auf gleiche Weise von etwa 150-20OmI Blut gewonnen und bei -2O⁰C zur späteren Fraktionierung der IgG-Fraktion zur Verwendung in Tests eingefroren. Blutproben (Mäuse)

Kleine Blutproben (0,25-0,5ml) wurden retroorbital oder durch Sektion der Schwanzvene entnommen und Wie für Schafe ι, hen behandelt. Größere Proben wurden nicht entnommen.

7. Radioimmuntest

Wenn nicht anders angegeben, wurden Antikörper gegen Peptide, die sich ebenfalls an den Wachstumshormon-freisetzenden Faktor binden wurden. ·^!ί bereits beschrieben (Aston u.a. 1985; Chard, 1987) durch Flüssigphasen-Direktuindung nachgewiesen.

EXPERIMENTE Entwicklung von Antiseren

1A Immunisierung von Mäusen und Schafen gegen hpGRF 31-44 und Nachweis von hpGRF-Antlkörpern Methode

Die folgende Sequenz wurde von der Fa. Cambridge Research Biochemical, Cambridge, England, synthetisiert und durch HPLC gereinigt. Sie ergab ein Peptid mit einer Reinheit von über 80%.

30 35 40 44

Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NHj

Zu beachten ist, daß dieses Peptid in Position 44 amidiert ist und ein Cysteinrest in Position 30 eingefügt wurde, um die Konjugation mittels MBS (siehe unten) zu erleichtern oder die potentielle Immunogenität zu verbessern.

5 mg Peptid wurden mittels der m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-Technik und der Glutaraldehyd-Zufallsmethode an Keyhole Limpet Haemocyanin konjugiert. Das Volumen beider Konjugationen wurde auf 5ml eingestellt. 10ml komplettes Freundsches Adjuvans (FCA, Sigma) wurden zugefügt. Das Gemisch wurde auf 0°C gekühlt und durch Beschallung mit einer vorgekühlten Sonde emulgiert.

Die kompletten Präparate wurden zur Immunisierung von zwei Gruppen von Mäusen und Schafen genutzt. Die letzteren erhielten 1 ml an zwei subkutanen Injektionsstellen an der Flanke, wodurch die Gesamtpeptiddosis 667 Mg/Schaf betrug. Pro Präparat wurden fünf 18 Monate alte North Cheviot-Hammel verwendet. Sechs Mäuse (Balb/C) wurden pro Präparat verwendet, und jede erhielt intraperitoneal 100μ9 Peptid in FCA.

Vier Wochen danach wurden allen Tieren Blutproben entnommen, und sie erhielten unmittelbar darauf eine Booster-Dosis, die der vorstehend beschriebenen bis auf die Tatsache entsprach, daß die Gesamtpeptidlast halbiert war und die Emulsion mit inkomplettem Freundschen Adjuvans (FIA, Sigma) hergestellt wurde.

Allen Tieren wurden nach 15 Tagen und danach wöchentlich (nur Schafe) Blutproben entnommen. Alle Tiere erhielten 28 Tage nach der ersten Booster-Dosis eine weitere Booster-Dosis in FIA.

Die aus diesen Blutproben gewonnenen Seren wurden mittels eines kompetitiven Radioimmuntests unter Verwendung von 3-[¹²⁵Il lodtyrosyl¹⁰ Wachstumshormon-freisetzendem Faktor 1-44-Amid (Amersham, Bucks, UK) und Anti-Maus oder Anti-Schaf Sac-Cel (Immunodiagnostics Ltd. Northampton, UK) auf das Vorhandensein von Anti-GRF-Antikörpern getestet. Ein Kaninchen-Anti-GRF-Antikörper (Metachem Diagnostics Ltd. Northampton, UK) mit Anti-Kaninchen-Sac- CeI wurde in diesem System als vorläufige positive Kontrolle verwendet. Zu geeigneten Zeitpunkten wurden den Schafen große Blutproben zur Gewinnung von IgG und zur nachfolgenden Untersuchung der Eigenschaften entnommen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der Tabelle unter Angabe des Prozentsatzes der überlebenden Tiere dargestellt, bei denen bei mindestens zwei Blutentnahmen eine positive Antikörperreaktion festgestellt wurde.

Konjugationsmethode Balb/c Mäuse Cheviot-Schafe

(Überlobende) (Überlebende)

MBS 33% 40%

(6/6) (5/5)

Glutaraldehyd 40% 60% (5/6) (5/5)

1 B. Immunisierung von Schafen gegen eine Reihe von GRF-abgeleiteten Aminosäuresequenzen Methode

Die folgenden Sequenzen wurden von dor Fa. Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, England synthetisiert und mittels HPLC gereinigt. Sie ergaben Peptide mit einer Reinheit von über 80%.

(I) Cys-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Vai-Leu 15-27+Cys²⁸:

(II) Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Cys Cys²¹+22-35:

(III) Cys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn Cys³⁰+31-44NH₂:

(IV) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂ Cys^+SI-Sg:

(V) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly 31-39:

(VI) Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly Cys³⁵+35-44NH₂:

(VII) Cys-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NHj Cys^N+30-^3+Lys⁴⁴NH₂:

(VIII) Cys-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Lys-NHj

Diese Peptide wurden alle in 5OmM phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2, PBS) aufgelöst und mittels der vorstehend beschriebenen Glutaraldehyd-Zufallsmethode an eine gleiche Masse Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH; Sigma, Poole, England) konjugiert. Dieses Präparat wurde in komplettem Freundschen Adjuvans emulgiert und Schafen (South Down x Kent) subkutan verabreicht, wobei 1 ml auf zwei Injektionsstellen an der Flanke jedes Schafs aufgeteilt wurde. Die gesamte Initialdosis betrug etwa 500pg Peptid pro Schaf. Jede Behandlungsgruppe, einschließlich der negativen Kontiollgruppe, die nur KLH erhielt, bestand aus 5 Schafen. Weitere ähnliche Immunisierungen wurden 28 und 70 Tage nach Verabreichung der Initialdosis vorgenommen. Dabei wurden etwa 50 bzw. 5\ig Peptid pro Schaf verabreicht.

Von allen Tieren wurden durch Punktion der Jugularvene an den Tagen -5, +14, +27, +35, +42, +56, +63, +70, +84, +98 und + 112 (in bezug auf die erste Immunisierung) Blutproben in „Monovette"-Serumröhrcheri aufgefangen. Darüber hinaus wurden an geeigneten Zeitpunkten größere Mengen von bis zu 200 ml zur nachfolgenden Herstellung von Antikörpern abgenommen.

Von allen Proben wurden die Seren abgetrennt und bei -20°C gelagert, bevor sie mittels des vorstehenden beschriebenen kompetitiven Radioimmuntests auf das Vorhandensein von Anti-(Human)-GRF-Antikörpern geprüft wurden.

Ergebnisse

Alle Schafe überlebten die Immunisierungen. Die Tabelle verzeichnet die Anzahl der Tiere, die bei mindestens zwei Testblutproben eine positive Antikörperreaktion aufwiesen.

Peptid	Positive Reaktion %
I	40
Il	20
III	40
IV	60
V	40
Vl	20
VII	60
VIII	0
negative Kontrolle	0

Peptid VIII weicht beträchtlich von der Human-GRF-Sequenz ab und ähnelt stärker den Schaf'/Ringer-ZSchweine-GRF-Sequenzen. Das Tropfen-Autoradiogramm (Harlow und Lane, 1988) zeigte, daß 60% der Tiere Antikörper gegen dieses Antigen gebildet hatten und daß die Antikörper wahrscheinlich GRF vom Schaf und anderen Tieren erkennen würden.

Schlußfolgerungen

Antikörper können gegen eine Reihe von Peptiden aus der GRF-Sequenz gebildet werden, und diese erkennen das intakte Molekül, von dem sie abgelenkt wurden und/oder das ursprüngliche Immunogen.

2. In vitro GRF-potenzierende Aktivität der Antiseren

Methode

Mittels eines In-vitro-Systems, das auf dem von Machlin u.a. (1974) beschriebenen beruht, bei dem jedoch Hypophysen von Schafen verwendet werden, wurde die Wirkung von GRF mit oder ohne verschiedene Typen von Schaf-Antiseren untersucht. GH im Testmedium wurde nach der von Hart u.a. (1975) entwickelten Methode mit der Ausnahme analysiert, daß die Standards in dem geeigneten In-vitro-Medium gelöst wurden und daß Anti-Meerschweinchen-„Sac-cel" (Cellcome Diagnostics) anstatt des beschriebenen Träger-/Doppelantikörpersystems verwendet wurde.

Antiserum (5 μΙ), das hpGRF in einer Konzentration von 1000 pg/ml und weniger - wie erforderlich - enthielt (oder nicht), wurde in vier Vertiefungen gegeben, die konfluente Hypophysenzellen und 1 ml frisches Medium enthielten, in dem das fötale Kalberserum weggelassen worden war. Das Medium wurde nach 4 Stunden bei 37⁰C entfernt und für den späteren GH-Test bei -20°C eingefroren.

Ergebnisse

Die Tabelle zeigt die GH-Mengen, die mittels Radioimmuntests in den In-vitro-Medien nachgewiesen wurden. Sie sind als pgGH/ml/5 Stunden Medium mit Standardabweichungen ausgewiesen.

Schaf GRF1-44 zugegeben (pg/ml) in Antiserum

Antiseren

gegen 0 1,0 10,0 100,0 1000,0

hpGRF1-29 <1,0 <1,0 <1,0 14,9±11,0 25,6±9,4

Glutaralde-

hydkonjuga-

tionan

Ovalbumin

NurCarrier

Glutaralde- <1,0 30,2 ±7,9 61,7 + 8,6 82,9 + 16,0 103,4 ±11,1

hydmit

Ovalbumin

vernetzt

hpGRFCys+

30-44-NH₂ <1,0 63,1 ±9,1 79,2 ±10,9 101,3 ±10,1 99,7 ±14,3

MBS-Konjuga-

tionan

Ovalbumin

Schlußfolgerungen

Diese Ergebnisse zeigen, daß Antikörper gegen den Bereich 30-44 des GRF-Moleküls die Aktivität desselben in vitro verstärken können, während diejenigen, die gegen den Bereich 1-29 gebildet werden, die Aktivität des zugeführten GRF vermindern. Die aus diesen Daten hervorgehende Verstärkung beträgt etwa das Sieben- bis Zehnfache.

3. Reinigung von Antikörpern von Antiseren

Das aus dem Blut, das ausgewählten Schafen in größeren Mengen entnommen worden war, gewonnene Serum wurde gereinigt und ergab eine vor allem aus Antikörpern bestehende Fraktion, die in einem nachfolgenden In-vivo-Experiment eingesetzt werden konnte. Es beruhte auf dem von Harlow und Lane (1988) beschriebenen Experiment: Eine zweistufige Ammoniumsulfatfraktionierung ergab eine halbreine Fraktion, die gegen 5mM Natriumphosphat (pH6,5) diaiysiert wurde, bevor sie mittels einer DEAE-Matrixbatch-gereinigt wurde. Das fertige Präparat wurde erneut auf seine Aktivität getestet und in PBS ohne Konservierungsmittel bei -2O⁰C eingefroren gelagert.

4. In vivo GRF-potenzlerende Aktivität von Antl-GRF-Antlkörpern Methode

Fünfzehn Schafe (ungedeckte weibliche schottische Mischlingsschafe) mit einem mittleren Lebendgewicht von 48kg wurden 24 Stunden vor dem ersten Versuch auf eine Körperseite mit Dauerkathetern in der Karotis und Jugularvene versehen. Seit zwei Wochen erhielten sie eine 16% Rohprotein enthaltende Kraftfutterration, deren Menge 3,5% ihres Lebendgewichtes entsprach. 18 Stunden vor sowie während der Blutabnahme erhielten die Tiere kein Futter.

Der Grundansatz für die Reihenfolge der Behandlung jedes Schafs hatte die Form eines lateinischen Quadrats, das drei Grundbehandlungen umfaßte. Es handelte sich dabei um folgende:

(1) GRF(Human-1-44-Amid, Cambridge Research Biochemicals] allein in einer Dosis von 1 pg/kg;

(2) Nur Antikörper (entspricht etwa dem Zehnfachen der GRF-Dosis);

(3) GRF in einer Dosis von 1pg/kg, der zuvor mit Antikörpern (zehnfache Menge wie vorstehend beschrieben) durch schonendes Istündiges Mischen bei Raumtemperatur komplexiert worden war.

Es wurden Antikörper aus drei verschiedenen Antiseren verwendet, die gegen die GRF-Sequenzen 1-14,31-44 bzw. 35-44 gerichtet waren; sie wurden den zu testenden Schafen - jeweils 5 Tiere pro Gruppe - nach dem Zufallsprinzip verabreicht.

Vor der Verabreichung (und der Infusion) von GRF und/oder Antiserumpräparaten über den Karotiskatheter zum Zeitpunkt 0 wurden in zehnminütigen Abständen Blutproben über den Venenkatheter entnommen. Sechs weitere Venenblutproben wurden in fünfminütigen Abständen (bis +30min) bzw. in zehnminütigen Abständen (bis +60min) entnommen und schließlich wurden acht Proben in dreißigminütigen Abständen (bis +240min) entnommen. Die ersten 2 ml wurden verworfen, die folgenden 5ml Venenblut wurden in heparinisierte Reagenzgläser gefüllt. Die Proben wurden zentrifugiert und das Plasma abgetrennt und bei -2O⁰C gelagert, bis die Wachstumshormonspiegel mittels Radioimmuntests (Hart u. a. 1975) untersucht wurden. Weitere Behandlungen entsprechend dem Versuchsansatz wurden 7 und 14 Tage später durchgeführt.

Statistik: Der Mittelwert der individuellen GH-Spiegel wurde für jeden Zeitpunkt errechnet und durch Varianzanalyse und einen F-geschützten T-Test analysiert. Die Fläche unter jeder Kurve (oder Teile derselben) wurde mittels der Simpsonschen Integrationsregel berechnet; diese Flächen wurden ebenso verglichen (SAS, 1985).

Ergebnisse

Die gemittelten Reaktionen jeder Behandlungsgruppe auf die Verabreichung jedes der Antikörperpräparate gegen GRF 1-14, 31-44 und 35-44 w jrden in Fig. 1 bis 3 dargestellt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden statistische Parameter weggelassen.

Es ist ersichtlich, daß GRF innerhalb weniger Minuten nach Verabreichung eine GH-Reaktionskurve bewirkt, die innerhalb der Testdauer in die Nähe der Kontrollspiegel zurückkehrt. Die GRF-1-14-Antikörper weisen diese Reaktion in dem komplexierten Präparat nicht mehr auf und scheinen, wenn sie allein verabreicht werden, nicht mit einer bedeutenden Episode der Freisetzung

von GH einherzugehen. In auffälligem Gegensatz dazu ergibt der Komplex von GRF und Antikörpern gegen Sequenz 31-44 oder 35-44 einen GH-Plasmaspiegel, der durchweg höher ist als wenn nur GRF verabreicht werden. Darüber hinaus können diese erhöhten Spiegel auch langer anhalten, in Fig.3 etwa 90 bis 210 Minuten.

Die Entwicklung einer Anti-GRF-Reaktion wird durch die in Fig.4 abgebildeten Titrationskurven für ein immunisiertes Tier veranschaulicht.

Figur 5 faßt diese Aktivitätsverläufe als Mittelwerte der Flächen unter den Kurven in den Figuren 1-3 für jedes in den Test einbezogene Tier zusammen. Diese Figur unterstreicht ferner die Fähigkeit der Antikörper gegen GRF35-44, von sich aus einen GH-PuIs auszulösen.

Figur 6 veranschaulicht die Aktivität während der ersten 60 Minuten nach der Behandlung und verdeutlicht den signifikanten Unterschied (p < 0,01) der mittleren GH-Plasmaspiegel zwischen den Antiseren 1-14 und 31-44 sowie die ähnlichen Verstärkungswirkungen des GRF, der mit Antikörpern gegen 31-44 und 35-44 komplexiert worden war. Diese Wirkungen waren ebenfalls statistisch außerordentlich signifikant (p < 0,01).

Gesamtschlußfolgerungen

Antikörper gegen den Bereich 1-14 der GRF-Sequenz hemmen die Wirkung von GRF. In überraschendem Gegensatz dazu weisen jedoch diejenigen, die gegen Bereiche des GRF-Moleküls zwischen den Resten 31 und 44 gebildet werden, nicht nur keine hemmende Wirkung auf, sondern sind sogar in der Lage, die biologische Aktivität des GRF zu verstärken. Diese Antikörper können zur Steigerung der Wachstumshormon-freisetzenden Fähigkeiten von GRF entweder endogenen Ursprungs oder durch exogene Verabreichung, einschließlich der Nutzung in Vorrichtungen zur Langzeitfreisetzung usw. oder in transgenen Tieren, die zusätzliche GRF- oder GH-Gene exprimieren, genutzt werden.

Anhang I

Codes der Aminosäuren

Aminosäure Drei-Buchstaben-Code Ein-Buchstaben-Code

Alanin Ala A

Arginin Arg R

Asparagin Asn N

Asparaginsäure Asp D

Cystein Cys C

Glutamin Gin Q

Glutaminsäure GIu E

Glycin GIy G

Histidin His H

Isoleucin He I

Leucin Leu L

Lysin Lys K

Methionin Met M

Phenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonin Thr T

Tryptophan Tr₁O W

Tyrosin Tyr Y

Valin VaI V

LlUreturangaben J.D.Armstrong, K. L. Esbenshf de, M. T. Coffrey, E. Heimer, R. Campbell, T.Mowles und A.Felix. Biotechnology ir> Growth Regulation, Herausg. R. B.Heap, C.G.Prosser und G. E. Lamming. Veröffentlicht von Butterworth & Co. Ltd. 1989. R. Aston, L. Cooper, A.T.Ho'oer, J.lvanyi und M.A.Preece, Molec. Immunol. Bd.22, (1985) S.271-275. T.Chard. An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques. 3. Au flg. Elsevier, Amsterdam, 1987. W. J.Enright, L.T.Ciiapin, VV.M.Moseley, S.A.Zinn und H.Allen Tucker, Journal of Dairy Science, Bd.69 (1986) S.344-351. A. M. Felix, E. P.Hoimer und T.F. Mowles. Annual Reports in Medicinal Chemistry, Bd.20 (1985), S. 185-192. R.Guillemin, P.Braieau, P.Bohlen, K.Esch, N.Ling und W.B.Wehrunberg. Science, Bd.218 (1982), S.585-587. E.Harlow und D.,'.ane. Antibodies: A Laboratory Manual. Herausg. vom Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988. I.C.Hart, D.S. Flux, P.Andrews und A.S.McNeilly Hormone and Metabolie Research, Bd.7 (1), (1975), S.35-40. I.C.Hart, S.James, B.N.Perry und A.D.Simmonds. Journal of Endocrinology. Bd. 103 (1984), S. 173-178. V. A. Lance, W. A. Murphy, J. SueirasDiaz und D. H. Coy. Biochemical and Biophysical Communication, Bd. 119 (1) (U>84), S. 265-272. R. A. Lerner, N. Green, H. Meander, F.-T. Uu, J. G. Sutcliffe und T. M. Shinnick,'Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 78 (1S81). S. 3403-3407. L. J. Machlin, L. S. Jacobs, N. Cirulis, R. Kimes und R. Miller. Endocrinology, Bd.95 (1974), S. 1350-1357. Marglin und Merrifield. Ann. Rev. Biochem. Bd.19 (1970), S.841-866, speziell S.862. W. M. Moseley, J. Huisman und E. J. Weerden, Domestic Animal Endocrinology, Bd. 4 (1987) (1), S. 51-59. C. M. M. Reynolds, P. J. Buttery, N. B. Haynes und N. Huskisson, Biotechnology in Growth Regulation. Herausg. von R. B. Heap, C. G. Presser und G. E. Lamming. Veröffentlicht von Butterworth & Co. Ltd., 1989. J. Rivier, J. Spiess, M. Thorner und W Vaie, Nature, London Bd. 300 (1982), S. 276-278. SAS. SAS User's Guide: Statistics, Version 5. Veröffentlicht von SAS Institute Inc., Cary, N.C, USA, 1985. Stewart u.a. in: Solid Phase Peptide Synthesis. Veröffentlicht von W. H. Freeman, San Francisco, 1969.

Claims

1. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein natürliches oder synthetisches Fragment eines Wachstumshormon-freisetzenden Faktors (GRF) eines Wirbeltieres aus dem Bereich umfaßt, der die Positionen 28-44 desselben aufweist oder antigen oder immunologisch äquivalente Peptide oder Salze davon.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es primäre strukturelle Homologie mit einer Sequenz von Aminosäureresten des Wachstumshormon-freisetzenden Faktors in dem die Positionen 28-44 umfassenden Bereich aufweist, oder antigen oder immunologisch äquivalente Peptide desselben oder Salze davon.

3. Peptid, das folgendem Fragment des GRF entspricht

(a) GRF 31-44 oder

(b) GRF 35-44

dadurch gekennzeichnet, daß der GRF von Menschen, Rindern, Schafen, Schweinen, Ziegen, Pferden, Hunden, Katzen, Vögeln oder Lachsen stammt, oder antigen oder immunologisch äquivalente Peptide selben oder Salze davon.

4. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es primäre strukturelle Homologie mit einem Peptid nach Anspruch 3 oder einem Salz desselben aufweist.

5. Peptid nach jedem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen zusätzlichen Rest umfaßt, der die Konjugation verstärkt/erleichtert und/oder die potentielle Immunogenität verbessert.

6. Peptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der zusätzliche Rest ein terminaler Cysteinrest ist.

7. Peptid nach jedem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an ein Antigen konjugiert ist.

8. Peptid nach jedem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an (a) sich selbst, (b) ein anderes Peptid nach jedem der vorstehenden Ansprüche, (c) ein T-Zellen-Epitop oder (d) einen Teil oder alle Somatostatin-oder Wachstumshormonmoleküle konjugiert ist.

9. Polynucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.

10. Pharmazeutische Antigenformulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid nach einem der vorstehenden Ansprüche und Mittel zur Bereitstellung von Adjuvans- und Carrierfunktionen umfaßt.

11. Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid an einen Carrier gebunden ist.

12. Formulierung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-gleichgültig, ob es an einen Carrier gebunden ist oder nicht - mit einem Adjuvans vermischt ist.

13. Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid nach einem der vorstehenden Ansprüche umfaßt, das an ein von einem Mikroorganismus codiertes Protein fusioniert ist.

14. Anti-GRF-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie gegen die GRF-Sequenzen aus dem Bereich 28-44 derselben gerichtet sind, oder antigen oder immunologisch äquivalentes Peptid oder Salze davon.

15. Anti-GRF-Antikörper, gekennzeichnet dadurch, daß sie gegen das Fragment von GRF 31-44 oder 35-44 gerichtet sind, oder antigen oder immunologisch äquivalente(s) Peptid oder Salze davon.

16. Anti-GRF-Antikörper nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit GRF oder Fragmenten von GRF nach Anspruch 1,2,3 oder 4 komplexiert sind.

17. Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 10 bis 16zur Herstellung einer Präparation zur Steigerung der Somatogenese, Lactogenese oder Schlachtkörperzusammensetzung.

18. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dies durch chemische Peptidsynthese oder durch Züchtung eines in geeigneterWeise transformierten Organismus geschieht.

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